NO843193L - Fremgangsmaate for frysing av organisk materiale - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører frysing og konservering av frukt, grønnsaker, animalsk materiale og organisk vev generelt.

Spesielt vedrører oppfinnelsen frysing av cellulære formasjoner

for formålene med å lagre, transportere, langtidskonservere,

samt en rekke andre anvendelser hvor det ønskes komplett eller delvis suspensjon av biologisk aktivitet, med konservering eller bevaring av cellestrukturen slik at det blir mulig med full retur til den opprinnelige tilstand etter rekonstituering.

Frysing av friske planter og levende animalske celler finner et bredt område av nytte, fra lagring og transport, av frukter og vegetabiler for human fortæring til suspensjon av biologisk aktivitet for å forenkle kirurgisk vevreparering eller for medisinsk eller vitenskapelig observasjon. Dessverre er de fleste cellestrukturer ute av stand til å motstå den skade på celleveggnettverket som forårsakes av dannelse av iskrystaller, hvis ekspanderte volum og skarpe kanter forårsaker punktering av celleveggene og at cellene brister. Resultatet er både tap av vev-turgor og tap av de naturlige væsker. Når det gjelder frukt og grønnsaker, kan gjenstanden være spiselig etter tining, men det kan være at den ikke lenger er smakelig eller attraktiv.

I animalske systemer inntreffer alvorlig metabolisk oppbrytning, hvilket hyppig resulterer i død. Dessuten frigjøres luftbobler eller emboli som er dannet av innfangede gasser under frysingen, til blodstrømmen under tining. Resultatet kan bli sterk smerte og immunologisk oppbrytning, og embolisme i hjertet eller hjerne kan forårsake død.

Kjente metoder for å overvinne dette problem involverer generelt delvis dehydrering av organiske celler slik at det skaffes rom for den ekspansjon som ledsager iskrystalldannelse.

En typisk prosess er åpenbart av Lamb i US-patent nr. 3.219.463 (23. november 1965). Lamb-prosessen er en to-trinns. metode som krever høyt nivå av vakuum (ned til et absolutt trykk på 4,6 torr). For å rekonstituere materialet etter tining må det vann som er kokt bort, erstattes.

I komplekse eller tette cellulære strukturer er det vanskelig å oppnå jevn fordeling på denne måte. Videre er vev av delikat cellestruktur ofte ute av stand til å motstå den påkjenning som ledsager en stor mengde av materiale som passerer gjennom celleveggene under både dehydratisering og rekonstituering.

Det er nå oppdaget at fjerning av minst en del av de oppløste gasser fra det intracellulære fluid i en celleformasjon tillater frysing og rekonstituering av formasjonen uten vesentlig skade på cellestrukturen eller dannelse av emboli. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen tilveiebringer således en fremgangsmåte for oppnåelse av full livstidssuspensjon av et vidt område av organisk vev, hvilket tillater retur til full levedyktighet etter tining.

Ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse utsettes organisk materiale i form av en celleformas jon for gradvis dekomprimering og avkjøles til fryse- eller subfryse-temperatur. Dekomprimering utføres i en utstrekning av vesentlig reduksjon av konsentrasjonen av gasser som er oppløst i det intracellulære fluid, samtidig som vesentlig tap av selve fluidet ved fordampning unngås. Betegnelsene "gasser" eller "gassformig materiale" brukes her om materialer som er i gassformig tilstand under normale atmosfæriske betingelser for temperatur og trykk.

Reduksjon av innholdet av oppløst gass produserer en tilsvarende reduksjon avøkningen i spesifikt volum som inntreffer når det intracellulære fluid fryses. Foreliggende oppfinnelse beror på den oppdagelse at denne reduksjon i frosset volum er tilstrekkelig til å forhindre skade på celleveggen som ellers ledsager dannelse av iskrystaller.

Dekomprimering utføres i en takt som unngår fluidfordampning. Takten er ellers ikke kritisk og kan variere over et bredt område. Generelt vil en dekomprimeringstakt som faller innen området fra ca. 1,0 til ca. 10,0 kilopascal pr. minutt (7,1-77,0 torr pr. minutt) være mest bekvemt. Foretrukne dekomprimeringstakter er slike som faller.innen området fra ca. 3,0 til ca. 7,0 kilopascal pr. minutt (23,0-53,6 torr pr. minutt), og fra ca. 5,0 til ca. 6,0 kilopascal pr. minutt (38,3-46,0 torr pr. minutt) foretrekkes, helst.

Under dekomprimeringen senkes trykket til et punkt hvor en vesentlig mengde av innholdet av oppløst gass bevirkes å unnslippe fra løsningen og passerer gjennom celleveggene, uten å bevirke at en vesentlig mengde av cellefluidet fordamper. Det aktuelle dekomprimeringsnivå er ikke kritisk og kan variere over et bredt område, avhengig av typen av organisk vev som er involvert, innholdet av oppløst gass, celleveggstrukturen og naturen av det cellulære fluid. Fortrinnsvis frigjøres minst ca. halvparten av innholdet av oppløst gass. Hos de fleste organiske materialer vil dekomprimering til et nivå som varierer fra ca. 90 til ca. 60 kilopascal under atmosfæreverdi (70-300 torr absolutt) gi de beste resultater. Innen dette område foretrekkes et område fra ca. 80 til ca. 65 kilopascal under atmosfæreverdi (150 til ca. 260 torr absolutt).

Det optimale dekomprimeringsnivå varierer ikke bare med typen av organisk materiale, men med høyden eller klimaet som det organiske materiale dyrkes i. Dette er spesielt tilfelle når det gjelder slikt plantemateriale som grønnsaker eller frukter som dyrkes i stor høyde eller i relativt kalde eller varme omgivelser. De relativt skjøre cellevegger som-opptrer hos planter som dyrkes i stor høyde, gjør cellestrukturen mer tilbøyelig til å bryte opp og mer gjennomtrengelig for diffusjon av gasser og damper. I slike tilfeller må man være spesielt omhyggelig med å unngå dehydratisering av cellene såvel som å holde cellestrukturen intakt. Dette kan foretas ved en reduksjon i graden av dekomprimering og den takt som dekomprimeringen opptrer med. Lignende justeringer er ofte nødvendig for planter som dyrkes i kaldt eller varmt klima, på grunn av variasjoner i mengden av oppløste gasser som er til stede i de cellulære fluider.

Når spesielt tykke eller sterke cellevegger er til stede, kan celleresponsen på dekomprimering forsterkes ved en foreløpig dekomprimering/rekomprimeringssyklus for å herde celleveggene. Dekomprimerings- og rekomprimeringsdelene av syklusen gjøres begge ved de takter som er antydet ovenfor, selv om det anvendes et mindre trykkfall. Generelt kan effektiv herding oppnås ved dekomprimering til et trykk innen området fra ca. 20 til ca. 40 kilopascal under atmosfæreverdi (450-600 torr absolutt).

Dekomprimering kan gjøres enten før eller under kjøle-prosessen. Fortrinnsvis gjøres dekomprimering og kjøling samtidig, slik at det blir optimal regulering med hensyn til å tillate gasser å unnslippe samtidig som vanntap unngås. Når dette gjøres samtidig, må de relative kjøle- og dekomprimerings- hastigheter være slik at flashing og dannelse av iskrystaller unngås før gassen tillates å unnslippe. Passende hastigheter bestemmes lett ved rutine-eksperimentering. Etter tining og rekonstituering av det frosne materiale er de som har en oppbrutt cellestruktur lette å bestemme på grunn av mangel på turgor,

mens de som har dehydratisering viser en bemerkelsesverdig endring i konsistens og delvis tap av turgor. Med anvendelse av konven-sjonelt kjøleutstyr og med dekomprimering ved de hastigheter som er spesifisert ovenfor, oppnås det lett effektive resultater, med unngåelse av både celleoppbrytning og dehydratisering.

Den endelige temperatur vil være hvilken som helst temperatur ved hvilken de intracellulære fluider er frosset til fast stoff. Dette vil variere med naturen av soluténe og solute-konsentrasjonen, og derfor med typen av organisk vev som er involvert. Generelt vil en temperatur som varierer fra det normale frysepunkt for vann og til ca. -10°C være tilstrekkelig.

Kjøling kan foretas ved enhver konvensjonell teknikk. Når kjøling og dekomprimering foretas samtidig, er det nødvendig,

som angitt ovenfor, å moderere avkjølingshastigheten for å tillate gasser å unnslippe fra løsningen før det kan inntreffe vesentlig krystalldannelse. Således unngås fortrinnsvis flash-frysing.

I en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ledsages avkjøling og dekomprimering av agitering og/eller vibrering av cellevevet, i den hensikt å påskynne dannelse av masser av små iskrystaller i cellenes indre, til preferanse for store krystaller. Små krystaller opptar mindre volum, de forårsaker mindre ødeleggelse av celleformen og har færre skarpe kanter eller punkter som kan punktere celleveggene. Hastigheten og graden av agitering eller vibrering er ikke kritisk og kan variere sterkt forutsatt at små krystaller dannes uten å bevirke slitasje eller annen skade på cellestrukturen,

men allikevel tillate at oppløste gasser unnslipper. Enhver innretning med evne til å indusere molekylær bevegelse i vevet i tilstrekkelig grad til å bryte opp eller reorganisere krystalldannelse kan anvendes. Dette kan variere fra forsiktig agitering til vibrering ved lydfrekvens. De beste resultater oppnås ved forsiktig agitering, fortsatt i jevn hastighet inntil alt fluid i cellestrukturen er frosset til fast stoff. Ved de fleste

anvendelser vil en lateral oscillering i en hastighet av mellom ca. 25 og ca. 100 cykler pr. minutt med en forskyvningsamplitude på fra ca. 1,0 til ca. 10,0 tommer (2,5-25,0 cm) gi de beste resultater.

Når tette eller voluminøse materialer behandles ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, må man være omhyggelig med å sikre at frysing inntreffer gjennom hele massen. På grunn av varmeoverføringsbegrensninger krystalliserer innerste deler, f.eks. salathjerter, langsommere enn deler ved eller nær det utvendige cellesjikt. Derfor er det, så snart slutt-temperaturen og dekomprimeringsnivået er oppnådd, ofte nødvendig å opprett-holde disse betingelser, såvel som å fortsette agiteringen når dette anvendes, i et tilstrekkelig tidsrom til å sikre fullstendig frysing.

Som et ytterligere alternativ kan fuktig eller mettet luft sirkuleres rundt gjenstanden som fryses, for å tilveiebringe et ytterligere hjelpemiddel for å forhindre dehydratisering. Egnede sirkuleringsmidler inkorporeres ofte i konstruksjonen til kjøle-innretninger. I alle tilfeller bør avkjøling i et særlig tørt miljø unngås.

Når levende dyr anbringes i liv-suspensjon ved frysing og dekomrimering ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, kan karbondioksyd eller et annet effektivt gassformig anestetikum anvendes for å redusere diskomfort til et minimum og lette tvang. Anestetikumet vil så bli frigjort under dekomprimering, hvorved dyret tillates å komme seg fullstendig etter tining. Videre kan den hurtige avkjøling av vev forsterkes ved anvendelse av en helium/oksygen-blanding for å ventilere kjølekammeret.

Så snart denønskede mengde av oppløste gasser er tillatt

å unnslippe og vevet er fullstendig frosset kan det organiske materiale lagres ubegrenset i frossen tilstand, enten ved atmosfæretrykk eller under det partielle vakuum som de oppløste gasser ble frigjort under. Cellestrukturen vil forbli intakt, forutsatt at det ikke er noen tining fulgt av gjenfrysing.

Når det er ønskelig å returnere det organiske materiale til sin opprinnelige tilstand, foretas opptining lett ved en gradvis oppvarmning av materialet til omgivelsestemperatur. Når materialet tillates å oppvarme seg, smelter iskrystallene i celle strukturen, og atmosfæregasser gjenoppløses i cellefluidet opp til sin likevektskonsentrasjon.

Etableringen av full turgor og retur til den opprinnelige tilstand kan forsterkes ved å anbringe et trykk på materialet svakt i overkant av atmosfæretrykk. Dette foretrekkes spesielt hvis det organiske materiale består av animalske celler eller hele dyr i liv-suspensjon. I den mest foretrukne praksis gjøres superatmosfærisk trykksetting før opptining for å re-etablere intracellulært trykk før retur av cellenes indre til den fluide tilstand.

Mengden av overskuddstrykk er ikke kritisk, forutsatt at den ikke i seg selv forårsaker skade på cellestrukturen. Et trykk som varierer fra ca. 5% til ca. 10% over omgivelsetrykk, er tilstrekkelig for de fleste anvendelser. Takten av re-trykksetting er likeledes ikke kritisk, og heller ikke er den utsatt for tvang som er nødvendig under dekomprimering. Således er det tilatt med noe hurtigere takt enn den som anvendes for dekomprimering, og en slik typisk takt er i området fra ca. 5 til ca. 10 kilopascal pr. minutt (38-77 torr pr. min.). Så snart fullstendig opptining har inntruffet, kan materialet returneres til omgivelsestemperatur, hvoretter overskuddsgasser i celleveggene vil bli frigjort.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er anvendelig mot frysing og gjenopplivelse av hvilket som helst vegetativt eller animalsk materiale, inklusive frukt, grønnsaker, uspiselige planter, frø, konsumentkjøtt, levende celler og vev, dyre- og menneskeorganer, hele dyr og mennesker. Hvis slikt vegetativt materiale som frukt eller grønnsaker anvendes, oppnås de beste resultater når slike materialer forarbeides så snart som mulig etter innhøsting. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen har nytte ved forbedret lagring og transport av vegetativt og animalsk materiale, ved medisinsk og vitenskapelig konservering av celler, vev, organer og komplekse organismer, ved medisinsk suspensjon av ødelagt eller desintegrerende vev og organiske systemer for formål med operasjon eller generell medisinsk pleie, og ved den suspenderte animering av levende celler og komplekse systemer for biologisk konservering.

De følgende eksempler gis for illustrerende formål og er hverken ment å begrense eller definere oppfinnelsen på noen måte.

Eksempel 1

Seks standard laboratoriemus og seks hoder av "romaine" salat ble anbragt.i en åpen, 2,2 kubikkfot (0,06 m 3) portabel fryser som var innstilt på -4°C, som på sin side var anbragt inne i en simulator for stor høyde med vibrasjonskapasitet. En ventilert høyvakuum-pumpe senket trykket i simulatoren til det som er ekvivalent med en høyde på 37.000 fot (164 torr absolutt eller -78,2 kilopascal) i jevn takt over et tidsrom på ca. 20 minutter. Under dekomprimering ble en lateral vibrering pålagt systemet med en forskyvning på tilnærmet 3 tommer (7,6 cm) og en takt av 60-70 cykler pr. minutt. Så snart det bestemte vakuum ble oppnådd, ble fryseren lukket og vibreringen fortsatt i 1 time og 4 5 minutter.

Vibreringen ble så stoppet, fryseren gjenåpnet og trykket tillatt å returnere til atmosfæretrykk i en gradvis takt over en 20 minutters periode. Ytterligere 0,1 atmosfære trykk ble så indusert i simulatoren for å frigjøre forseglingene og lette åpningen av dørene. Musene og salaten ble så tatt ut.

Musene viste ingen vitale tegn og var stive ved berøring, hvilket tydelig indikerte at de var frosne. Musene ble tatt ut av sine bur sammen med de kleder som ble anvendt for å fore bunnen av hvert bur. Musene og kledene ble så anbragt i papp-esker for observasjon. Tilnærmet 4 5 minutter etter fjerning fra dekomprimeringskammeret viste én av musene seg å sukke. I løpet av de neste 15 minutter viste fire av de resterende mus små bevegelser, hvilket indikerte retur av vitalfunksjon. Den sjette mus viste bevegelse tilnærmet 10 minutter senere.

Vann og for ble ført til alle musene tilnærmet 1 time etter at de var tatt ut av dekomprimeringskammeret. I løpet av den neste time viste alle seks mus seg å være i god helse, idet de viste normal oppførsel og spisemønstre.

Salaten var, etter at den var tatt ut av vakuumkammeret, likeledes stiv og fullstendig frossen. Hodene ble anbragt på papirhåndklær slik at det var mulig å påvise eventuell lekasje som skyldtes cellebrudd etter tining.

I løpet av 15 minutter var salaten signifikant tint, og ingen lekkasje av celleinnhold ble observert. Små områder som ikke ble gjenopplivet, viste seg nær kantene på flere av bladene. Dette viste seg å være forårsaket av knusing av bladene før frysing. Hovedmassen av salaten ble imidlertid gjenopplivet med full turgor.

Eksempel 2

Den apparatur som ble anvendt i eksemplene 2 til 6 bestod

av et transparent vakuumkammer anbragt på en kjemisk agitator,

alle plassert inne i en walk-in-fryser. Dekomprimering ble utført ved anvendelse av en liten vakuumpumpe, hvor trykkavlesningene ble tatt fra et manometer på toppen av kammeret.

Et salathode ble anbragt på en Ohaus-vekt inne i vakuumkammeret , idet vekten indikerte at salaten veide 505 gram ved begynnelsen av forsøket. Kammeret ble gradvis dekomprimert til et vakuum på -77 kilopascal over en 20 minutters periode mens prøven ble avkjølt, og i dette tidsrom var agitatoren i drift med tilnærmet 50 cykler pr. minutt med en lateral forskyvning på tilnærmet 3 tommer (7,6 cm). Frysetemperaturen var tilnærmet -7°C. Under dekomprimeringen falt vekten av salaten med 10 gram -2.

Så snart det ønskede vakuumnivå var nådd, ble betingelsene op<p>rettholdt i ytterligere 4 timer. Vakuumkammeret ble så ventilert for gradvis å heve trykket og returnere det til atmosfæretrykk. Rekomprimeringstakten var 5-6 kilopascal pr. minutt. Salaten ble så tatt ut både av vakuumkammeret og fryseren og anbragt i laboratoriet på papirhåndklær hvor det fikk tine. Temperaturen i laboratoriet var 68°F (20°C).

For sammenligningsformål ble to hoder til av samme variant

av salat likeledes forarbeidet som kontrollprøver. Ett av disse ble imidlertid simpelthen anbragt i fryseren uten dekomprimering eller agitering, og det andre ble dekomprimert og frosset uten agitering. Ellers var fremgangsmåtene identiske.

I løpet av 10 minutter fra uttak fra fryseren viste^.den første kontrollprøve (frosset uten dekomprimering eller agitering) flekkdannelse på papirhåndkleet hvilket indikerte cellebrudd og skade. Den annen kontrollprøve (frosset med dekomprimering, men uten agitering) viste ikke flekkdannelse, men viste tap av turgor, og det var slapt og lignet sjøgress eller tang. Den gjenværende prøve (frosset med både dekomprimering og agitering) opprettholdt full turgor etter tining og viste ingen fluidlekkasje. Igjen var det en liten seksjon av ett blad som ikke lot seg gjenopplive, øyensynlig på grunn av at det var blitt klemt og hadde fått et lite brudd i kapillærene som førte til seksjonen.

Eksempel 3

Tre salathoder ble valgt ut for eksperimentering, hvorav det ene var tatt fra en have på.dagen for eksperimentet, og de andre var oppnådd fra en produsent som selger sine varer minst 4 dager etter innhøsting. Alle tre hoder ble stuet forsiktig inn i dekomprimeringskammeret fra eksempel 2.

Hodene ble utsatt for gradvis dekomprimering og agitering på den måte som er beskrevet i eksempel 2. Etter 4 5 minutters agitering ved det stabiliserte '.partielle vakuumnivå indikerte en visuell inspeksjon at hodene ikke var fullstendig frosset. Agitering ved det lave trykk ble så fortsatt i ytterligere 2 timer og 15 minutter, hvoretter fullstendig frysing var oppnådd.

Gradvis rekomprimering ble så tillatt å foregå over en 20 minutters periode. Alle tre hoder ble så tatt ut av dekomprimeringskammeret og fryseren og anbragt på papirhåndklær i laboratoriet som beskrevet ovenfor. Etterhvert som salaten tinte, ble cellefluidlekkasje fra de blader som hadde vært i kontakt med kammersiden, observert.Innerblader viste ikke lekkasje.

Det hode som var innhøstet på eksperimentdagen returnerte til full turgor. De hoder som var høstet for 4 dager siden, returnerte til bare partiell turgor.

Eksempel 4

En rekke med 4 tommers (10,2 cm) potter som hver inneholdt

2 levende krysantemum-planter med både åpne blomster og knopper, ble anbragt i dekomprimeringskammeret og behandlet i henhold til fremgangsmåten fra eksempel 2. Én plante i én potte hadde en stilk som var noe høyere enn kammerets innvendige høyde og var derfor i kontakt med toppen av kammeret under frysing.

Endelige partielle vakuumbetingelser ble opprettholdt med agitering i 2 timer, ved hvilket tidspunkt plantene ble rekomprimert. og tatt ut både.av kammeret og fryseren for å tillate tining i laboratoriet. I løpet av 1 time var alle plantene fullstendig opptint. Bladene viste samme tekstur og turgor som de hadde før eksperimentet, selv om deres farve var noe mørkere.

Plantene ble så observert over et tidsrom på 4 uker, og, med unntagelse av stilken som hadde vært i kontakt med kammer-toppen, fortsatte alle å vokse med blomstene intakte og knoppene som sprang ut.

Eksempel 5

Fire kirsebærtomater, tre bifftomater og to italienske tomater, alle nylig plukket, ble anbragt i dekomprimeringskammeret fra eksempel 2 og behandlet som beskrevet. I tillegg ble to kirsebærtomater og to italienske tomater, også nylig'plukket, anbragt på agitatoren, men utenfor dekomprimeringskammeret, for sammenligningsformål. Endelig ble en endivie-salat som var innhøstet 4-6 dager tidligere, også anbragt i dekomprimeringskammeret.

De endelige partielle vakuumbetingelser ble opprettholdt med agitering i 4 timer på grunn av tomatenes høye vanninnhold. Grønnsakene ble deretter rekomprimert, tatt ut av kammeret og fryseren og anbragt i laboratoriet på papirhåndklær for opptining.

Etter tining viste kontrolltomatene (agitert, men ikke dekomprimert) tegn på cellebrudd og rynking av skinnet og hadde en myk og pastaaktig konsistens. De resterende tomater bevarte sin opprinnelige form og fasthet, med vanndråper på overflaten, som skyldtes den plutselige eksponering for varm luft. Flere av de mest modne tomater var mørkere i farve enn de var opprinnelig.

Endiviesalaten viste etter tining blandet respons. Noen blader visnet uten gjenopplivelse mens andre returnerte til full turgor.

Eksempel 6

Fire hoder av meksikansk salat, inklusive to "romaine" og to rødbladhoder, som var dyrket i en høyde av 2500-4000 fot (760-1220 meter), ble behandlet som beskrevet i eksempel 2. Etter opptining av hodene ble det ikke observert noen cellebrudd eller fluidlekkasje. Turgor var imidlertid sterkt redusert, og bladene hadde en gummilignende tekstur og en overflateglans som ikke var til stede opprinnelig.

Ytterligere fire hoder av de samme typer salat ble behandlet på samme måte, med unntagelse av at dekomprimering bare ble gjort til et nivå av -70 kilopascal (217 torr.absolutt), istedenfor -77 kilopascal. Disse hoder returnerte etter tining til full turgor, med tekstur og overflateutseende identisk med hva som var tilfellet før frysing.

Foranstående beskrivelse er ment utelukkende for illustra-sjonsformål. Oppfinnelsen er ikke ment å skulle være begrenset til de spesielle trekk eller utførelsesformer som er beskrevet. Tallrike modifikasjoner og variasjoner av ovenstående som fremdeles faller innen ånden og rammen av oppfinnelsen vil tydelig fremgå for fagmannen på området.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for frysing av organisk vev som omfatter: (a) å senke trykket til atmosfæren som er i kontakt med nevnte vev for å frigjøre fra nevnte vev minst en vesentlig del av det gassformige materiale som er oppløst deri, uten vesentlig fordampning av vann fra vevet, og (b) avkjøle vevet til en temperatur ved eller under dets frysepunkt.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat trinnene (a) og (b) utføres i det vesentlige samtidig.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat trinnene (a) og (b) utføres i det vesentlige samtidig, og at vevet samtidig agiteres eller vibreres for å indusere molekylær bevegelse i vevet tilstrekkelig til å opp-bryte krystallformasjonen etter frysing.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat trinnene (a) og (b) utføres i det vesentlige samtidig, og vevet agiteres samtidig i en hastighet av fra ca. 25 til ca. 100 cykler pr. minutt.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat det minste trykk som oppnås i trinn (a) er fra ca. 90 til ca. 60 kilopascal under atmosfæretrykk.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat det minste trykk som oppnås i trinn (a) er fra ca. 80 til ca. 65 kilopascal under atmosfæretrykk.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat trinn (a) utføres i en hastighet av fra ca. -3 til ca. -7 kilopascal pr. minutt.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat trinn (a) utføres i en hastighet av fra ca. -5 til ca. -6 kilopascal pr. minutt.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat minst ca. halvparten av det gassformige materiale som er oppløst i vevet, frigjøres.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat det organiske vev er vegetativt materiale og at fremgangsmåten utføres innen ca. én dag etter.innhøsting.

11. Fremgangsmåte for frysing av organisk vev, som omfatter å senke trykket i atmosfæren som er i kontakt med vevet, i en hastighet av fra ca. -3 til ca. -7 kilopascal pr. minutt til et minste trykk på fra ca. 90 til ca. 60 kilopascal under atmosfæretrykk for å frigjøre fra nevnte vev minst ca. halvparten av det gassformige materiale som er oppløst deri, uten vesentlig fordampning av vann fra vevet, mens vevet avkjøles til en temperatur av fra ca. -10°C til ca. 0°C, og agitere vevet i en hastighet av fra ca. 25 til ca. 100 cykler pr. minutt.

12. Fremgangsmåte for frysing av vegetativt materiale, som omfatter å senke trykket til atmosfæren som er i kontakt med nevnte materiale, i en hastighet av fra ca. -5 til ca. -6 kilopascal pr. minutt til et minste trykk på fra ca. 80 til ca. 65 kilopascal under atmosfæretrykk, for å frigjøre fra nevnte materiale minst ca. halvparten av det gassformige materiale som er oppløst deri, uten vesentlig fordampning av vann fra nevnte vegetative materiale, mens det vegetative materiale avkjøles til en temperatur på fra ca. -10°C til ca. 0°C, og agitere nevnte vegetative materiale ved en hastighet av fra ca. 25 til ca. 100 cykler pr. minutt, hvorved fremgangsmåten utføres innen ca. én dag etter innhøstning av det vegetative materiale.