CS241142B2 - Organic tissues freezing method - Google Patents

Description

Vynález se týká konzervace ovoce, zeleniny, živočišných produktů a obecně organických tkání mražením. Zejména sé vynález týká mražení buněčných útvarů za účelem skladování, dopravy, dlouhodobé konzervace a různých jiných účelů, kde se žádá úplné nebo částečné zastavení biologické aktivity při zachování nebo uchování buněčné struktury, aby se při rekonstituci vrátila úplně do původního stavu.

Mražení čerstvých rostlin a živých živočišných buněk se těší širokému rozsahu použitelnosti od skladování a dopravy ovoce a zeleniny pro lidskou konzumaci k zastavení biologické aktivity pro usnadnění chirurgického ošetření tkání nebo pro lékařské a vědecké pozorování.

Většina buněčných struktur však není schopna vydržet poškození buněčných blan, vyvolané tvorbou krystalků ledu, jejichž větší objem a ostré hrany způsobují protržení buněčných stěn a popraskání buněk.

Důsledkem toho je jak ztráta turgoru tkáně, tak ztráta přírodních tekutin. V případě ovoce a zeleniny může být tato materie po roztátí sice jedlá, často však nebývá chutná ani přitažlivá.

V živočišných tkáních dochází k těžkým metabolickým poruchám, které mají často za následek smrt. Kromě toho jsou během tání uvolňovány do krevního řečiště vzduchové bublinky nebo emboly, které vznikly při mražení z rozpuštěných plynů.

Proto může dojít ke značným bolestem a imunologickým poruchám, a srdeční nebo plicní embolie může způsobit smrt.

Známé způsoby snažící se odstranit tento problém spočívají obecně v částečném dehydrování organických buněk, aby vzniklo dost místa pro expandování tekutin, které doprovázejí tvorbu krystalků ledu.

Typický způsob tohoto druhu podle amerického patentu č. 3 219 463 je dvoustupňový postup, který vyžaduje vysoký stupeň vakua, až do absolutního tlaku 4,6 torrů. Aby se materiál po roztátí rekonstituoval, odpařená voda se musí nahradit.

Ve složitých hustých buněčných strukturách je obtížnost dosáhnout tímto způsobem rovnoměrného rozdělení a mimoto tkáně s jemnou buněčnou ' strukturou nejsou často schopné vydržet namáhání vyvolané průchodem velkého množství materiálu buněčnými blanami při dehydrování a rekonstituci.

Podle vynálezu bylo zjištěno, že odstranění alespoň části rozpuštěných plynů z nitrobuněčné tekutiny buněčného útvaru umožňuje zmražení a rekonstituci útvaru bez podstatného poškození struktury buněk a bez tvorby embolů.

Způsob podle vynálezu tedy umožňuje dokonalé dočasné přerušení životních funkcí ve velkém rozsahu organických tkání a úplný návrat k poživatelnosti při roztátí.

Podstata způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že organický materiál ve formě buněčného útvaru se podrobuje postupné dekompresi a chladí na teplotu mražení nebo podmražení. Dekomprese se provádí do té míry, aby se podstatně snížila koncentrace plynů rozpuštěných v nitrobuněčné tekutině, čímž se zabrání větší ztrátě této tekutiny vypařením.

Pod pojmem plyny nebo plynný materiál ae rozumí látky, které jsou v normálních atmosférických podmínkách teploty a tlaku v plynné fázi.

Snížením obsahu rozpuštěných plynů se kompenzuje zvyšování jmenovitého objemu, ke kterému dochází při zmražení v nitrobuněčné tekutině. Vynález spočívá na poznatku, že toto zmenšení objemu při zmražení stačí k tomu, aby zabránilo poškození buněčných stěn, jež normálně doprovází tvorbu ledových krystalků.

Dekomprese se provádí rychlostí, která zabraňuje vypaření buněčné tekutiny. Rychlost není jinak kritická a může se měnit ve velkém rozmezí. Obecně je velmi výhodná rychlost dekomprese v rozmezí 1 až 10 kPa za minutu, výhodné rychlosti dekomprese spadají do rozmezí 3 až 7 kPa za minutu a nejvýhodnější je rozsah rychlosti dekomprese od 5 do 6 kPa za minutu.

Během dekomprese . se tlak snižuje na hodnotu, při které podstatné množství rozpuštěných plynů nuceně . uniká z roztoku a prochází buněčnými stěnami,'aniž by vyvolávalo vypaření většího množství buněčné tekutiny.

Skutečná hodnota dekomprese není kritická a kolísá v širokém rozmezí v závislosti na typu organické tkáně, na obsahu rozpuštěného plynu, na struktuře buněčných blan a na povaze buněčné tekutiny.

S výhodou se uvolňuje nejméně polovina rozpuštěného plynu. Pro většinu organických materiálů dává nejlepší výsledky dekomprese v rozmezí 90až 60 kPa pod atmosférický tlak. Uvnitř tohoto rozmezí je nejvýhodnější rozsah 80 až 65 kPa pod’atmosférickým tlakem.

Optimální hodnota dekomprese se mění nejen podle druhu organické látky, nýbrž i podle . výšky nebo podnebí, ve kterém organická látka vyrostla. To platí zejména pro rostliny, jako je zelenina a ovoce, pěstované ve velkých výškách nebo v poměrně chladném nebo teplém podnebí.

Poměrně křehké buněčné stěny, vyskytující se v rostlinách pěstovaných ve velkých výškách, způsobují, že buněčná struktura je náchylnější na porušení a propustnější pro difundující plyny a páry. V takových případech je třeba dbát obzvláště na to, aby nedošlo k dehydrování buněk a aby buněčná struktura zůstala neporušena.

Toho lze dosáhnout snížením stupně dekomprese a rychlostí, při které dekomprese probíhá. Podobná opatření bývají často nezbytná při zpracování rostlin pěstovaných v chladném nebo teplém podnebí, protože množství rozpuštěných plynů v buněčných tekutinách je u nich různé.

Když jsou buněčné stěny obzvláště silné a mají velkou tloušťku, lze reakci buněk na dekompresi podpořit předběžným cyklem dekomprese a rekomprese za účelem temperování buněčných stěn. Dekompresní a rekompresní fáze tohoto cyklu se provádějí při shora uvedených rychlostech, avšak při nižším úbytku tlaku.

Obecně lze účinného temperování dosáhnout dekompresí na tlak 20 až'40 kPa pod atmosférickou hodnotou. Dekompresi lze provádět bud před chlazením nebo během chlazení. S výhodou se dekomprese a chlazení provádí současně, což dává optimální možnost regulace úniku plynů bez ztráty vody.

Když se oba pochody provádějí současně, relativní rychlosti chlazení a dekomprese musejí být sladěny tak, aby se zabránilo prudkému odpaření a současně tvorbě ledových krystalů před uniknutím rozpuštěného plynu. '

Vhodný rychlosti se snadno zjistí pokusně. Při roztátí a rekonstituci zmraženého materiálu se látky s porušenou buněčnou strukturou snadno rozeznají podle nedostatku turgoru, zatímco látky dehydrované vykazují pozorovatelnou změnu konsistence a částečnou ztrátu turgoru.

Při použití běžného chladicího zařízení a při dekompresi shora uvedenými rychlostmi se dosáhne velmi dobrých výsledků a zabrání se i porušení buněčných stěn i dehydrování.

Konečnou teplotou je jakákoliv teplota, při které jsou nitrobuněčné tekutiny zmrzlé na tuhou látku. Tato teplota se mění podle povahy a koncentrace rozpuštěných látek a tedy podle druhu organické tkáně.

• ^Obecn^ě s^ta^{čí t}e^plo^ta od normáln^ího bo^du tuhnutí vod^{y d}o teplot^y asi' -10 °C. Chlazení lze provádět jakoukoliv běžnou technikou. Když chlazení a dekomprese probíhá současně, je nezbytné omezit rychlosti chlazení, aby spolehlivě došlo k uniknutí plynu z tekutiny dřív, než dojde k větší tvorbě krystalů ledu. Nemá se tedy provádět mražení prudkým rozprášením.

Podle výhodného provedení vynálezu je chlazení a dekomprese doprovázena protřepáváním a/nebo vibracemi buněčné tkáně, aby se podpořila tvorba velkého množství malých krystalů ledu uvnitř buněk místo velkých krystalů. Malé krystalky zabírají menší objem, způsobují menší deformaci tvaru buněk a mají méně ostrých hran nebo bodů, které by mohly protrhnout buněčné stěny.

Rychlost a stupeň protřepávání nebo vibrací nejsou kritické a mohou kolísat v širokém rozsahu za předpokladu, že malé krystalky vznikají bez poškození buněčné struktury abrazí a přitom je zajištěno unikání rozpuštěných plynů.

Lze použít jakéhokoliv zařízení, které je schopné vyvolávat pohyb molekul uvnitř tkáně do té míry, aby se přerušila tvorba krystalů. To může zahrnovat rozmezí od mírného protřepávání až do vibrací zvukovou frekvencí.

Nejlepších výsledků se dosahuje mírným protřepáváním, které pokračuje ustálenou rychlostí tak dlouho, až veškerá tekutina v buněčné struktuře zmrzne. Ve většině případů přináší nejlepší výsledky oscilace prováděné rychlostí 25 až 100 cyklů za minutu s amplitudou 2,5 až 25 cm.

Když se způsobem podle vynálezu zpracovávají tlusté nebo objemné materiály, je třeba dbát na to, aby mražení probíhalo uvnitř celé hmoty. Následkem omezeného přenosu tepla krystalizují vnitřní části, například srdíčka salátu, pomaleji než části ležící na vnější části nebo blízko vnější části předmětu.

Když se tedy dosáhne konečné teplota a hodnoty dekomprese, bývá často nezbytné udržovat tyto podmínky a současně pokračovat v protřepávání po dostatečně dlouhou dobu, aby se zajistilo úplné zmražení.

Podle další možnosti vynálezu se může kolem zmrazovaného předmětu prohánět vlhký nebo saturovaný vzduch, což představuje další opatření zabraňující dehydrování. Vhodné cirkulační ústrojí bývá většinou součástí konstrukce chladicích zařízení. Za všech okolností se má zabránit chlazení v příliš suchém prostředí.

Když se má přechodně přerušit životní pochod živých zvířat způsobem mrazení a dekomprese podle vynálezu, lze použít kysličníku uhličitého nebo jakéhokoliv jiného účinného plynného anestetika, aby se omezily na nejmenší míru pocity zmražovaného zvířete a usnadnilo uvolnění.

Anestetikum se během dekomprese uvolní, takže živočich po roztátí plně ožije. Navíc J.ze rychlé ochlazení tkání podporovat použitím směsi helia a kyslíku k proplachování chladicí komory.

Jakmile uniklo požadované množství rozpuštěných plynů a tkáně jsou úplně zmražené, lze organické látky ve zmraženém stavu skladovat po neomezenou dobu bud při atmosférickém tlaku nebo při částečném vakuu, při kterém byly uvolněny rozpuštěné plyny.

Buněčná struktura zůstane zcela intaktní za předpokladu, že nedochází k rozmražení následovanému opětným zmražením.

Když se má organický matetlál vráLit do svého původního stavu, nechá se roztát postupným ohříváním na okolní teplotu. Rohem ohříváni tají krystalky ledu uvnitř buněčné struktury a atmosférické plyny so znovu rozpouštějí v buněčné tekutině až do rovnovážné koncentrace.

Dosažení plného turgoru a návrat do původního' stavu lze podpořit tím, že se na materiál působí tlakem nepatrně vyšším než je tlak atmosférický. To je obzvláště výhodné tehdy, když je órganická látka tvořena živočišnými buňkami nebo celými zvířaty, jejichž životní funkce byly dočasně přerušeny.

Podle nejvýhodnějšího provedení podle vynálezu se stlačení nad atmosférický tlak provádí před rozmražením, aby nitrobuněčný tlak se zvýšil dřív, než se vnitřky buněk stanou kapalnými.

Velikost tohoto přetlaku není kritická za předpokladu. Že sám nezpůsobí poškození buněčné struktury. Pro většinu případů stačí tlak o 5 % až 10 % nad atmosférický tlak. Rychlost rekomprese rovněž není kritická ani nepodléhá omezením, která jsou nezbytná při dekompresi.

Lze tedy bez nebezpečí použít o něco větší rychlosti než při dekompresi, přičemž typická rychlost leží v rozmezí 5 až 10 kPa/min. Po úplném rozmražení lze materiál vrátit na teplotu okolí, čímž se uvolní přebytečné plyny v buňkách.

Způsob podle vynálezu je použitelný ke zmražení a oživení jakéhokoliv rostlinného nebo živočišného materiálu, což zahrnuje ovoce, zeleninu, nejedlé rostliny, semena, maso, živé buňky a tkáně, zvířecí a lidské orgány, celá zvířata a lidi.

Když se pracuje s rostlinným materiálem, jako je ovoce nebo zelenina, nejlepších výsledků se dosahuje, když se tyto materiály zpracují co nejdřív po sklizni. Způsob podle vynálezu ' umožňuje zlepšení skladování a transport rostlinných a živočišných materiálů, lékařskou a vědeckou konzervaci buněk, tkání, orgánů a celých organismů, dočasné přerušení životních pochodů v poškozených nebo rozkládajících se tkáních a organických systémech za účelem chirurgických a jiných lékařských zásahů, a přechodné zastavení životních pochodů živých buněk a složitých systémů za účelem biologické konzervace.

Následující příklady slouží pouze k vysvětlení a nijak neomezují ani nedefinují vynález.

Příklad 1 standardních laboratorních myší a 6 hlávek lociky bylo umístěno do otevřeného přenosného mrazicího ^prostoru s o^bjemem 0,06 m ^{3 ,} nas^taven^ého na t.e^plotu -⁴ °C, který b^yl umístěn do simulátoru velké výšky schopného vibrací.

Proplachovanou vývěvou na vysoké vakuum se snižoval tlak v simulátoru na hodnotu odpovídající výšce 11 m, tedy na -78,2 kPa, ustálenou rychlostí po dobu asi 20 minut. Během dekomprese byla soustava uváděna do bočních vibrací s amplitudou asi -7,6 cm a frekvencí 60 až 70 sec/min.

Jakmile bylo dosaženo stanoveného vakua, byl mrazicí prostor uzavřen a vibrace pokračovaly po 1 hod 45 min.

Potom byly vibrace přerušeny, mrazicí prostor byl otevřen a tlak se zvýšil na atmosférickou hodnotu postupně během intervalu 20 minut. V simulátoru pak byl vytvořen přídavný tlak 0,1 atm., aby bylo možno uvolnit těsnění a otevřít dveře. Myši i lociky pak byly z mrazicího prostoru vyjmuty.

Myši neprojevovaly známky života a byly na omak tuhé, což jasně dokazovalo, že jsou zmražené. Myši byly vyňaty z klecí společně s látkou, která byla položena na dno každé klece. Myši a látka pak byly umístěny na pozorování do lepenkových krabic.

Přibližně 45 minut po vynětí z dekompresní komory jedna z myší se nadechla. Během dalších minut 4 další myši projevovaly menší pohyby, což dokazovalo návrat k životním funkcím, šestá myš se začala pohybovat přibližně o 10 minut později.

Přibližně hodinu po vyjmutí z dekompresní komory byla všem myším podána voda a potrava. Během další hodiny projevovaly myši dobrý zdravotní stav, normální chování a chuť k jídlu.

Locika byla po vynětí z vakuové komory rovněž úplně tuhá a plně zmražená. Hlávky byly položeny na papírové ubrousky, aby bylo vidět jakékoliv unikání tekutin způsobené při tání poškozením buněk.

Během 15 minut locika silně roztála a nebylo pozorováno unikání obsahu buněk. V blízkosti okrajů většího množství listů se objevily malé plochy, . které neožily. Bylo to pravděpodobně způsobeno poškozením listů před zmrazením. Větší část hmoty lociky však ožila s plným turgorem.

Příklad 2

Zařízení použité v příkladech 2 až 6 sestávalo z transparentní vakuové komory uložené na chemickém nátřasném zařízení, a celá soustava byla umístěna v mrazicím boxu. Dekomprese byla prováděna pomocí malé vývěvy a hodnoty tlaku byly odečítány na stupnici na komoře.

Hlávka salátové lociky byla umístěna na Ohausově váze, která ukázala, že locika váží na začátku pokusu 505 g. Vakuová komora byla postupně dekomprimována na vakuum -77 kPa během 20 minut, a během této doby bylo nátřasné zařízení v činnosti rychlostí asi 50 cyklů za minutu s ampli^tu^dou p^řibl. ^7,6 cm. Tep^lo^ta v mraz^ím boxu ^byla ^přibl. ^-7 °C. B^ěhem ^de^kom^prese poklesla hmotnost hlávky o 10 g + 2 g.

Po dosažení žádaného stupně vakua byly stejné podmínky udržovány během dalších 4 hodin. Potom byla vakuová komora propláchnuta plynem k postupnému zvýšení teploty na atmosférickou hodnotu a na atmosférický tlak.

Rychlost rekomprese byla 5 až 6 kPa/min. Locika pak byla vyjmuta z vakuové komory a z mrazicího boxu a položena v laboratoři na papírovou podložku, kde roztála. Teplota v labora^toř^{i byl}a ²0 °C.

Pro srovnání byly jako kontrolní vzorky podobně zpracovány dvě další hlávky stejného druhu lociky. Jedna z nich však byla jednoduše položena do mrazicího prostoru bez dekomprese a protřepávání, a druhá byla dekomprimována a zmražena bez natřásání. Jinak byly postupy stejné.

minut po vyjmutí z mrazicího prostoru první kontrolní vzorek, zmražený bez dekomprese a třepání, vytvořil skvrny na podložce, což dokazuje poškození a protržení buněk. Druhý kontrolní vzorek, zmražený s dekompresí, ale bez protřepávání, sice neudělal skvrny na papírové podložce, ale projevoval ztrátu turgoru, měl měkký vzhled a podobal se řasám nebo chaluhám.

Zbývající vzorek, zmražený s dekompresí a protřepáváním, si po rozmražení zachoval úplný turgor a neunikala z něj tekutina. I v tomto případě neožila malá plocha jednoho listu, zřejmě v důsledku poškození a přetržení kapilár, zásobujících tuto plochu.

Příklad 3

Pro pokus byly zvoleny 3 hlávky salátové lociky, z nichž jedna byla utržena na zahradě v den pokusu a dvě další byly zakoupeny u producenta alespoň 4 dny po utržení. Všechny 3 hlávky byly uloženy utěsněné do dekompresní komory podle příkladu 2.

Hlávky byly podrobeny postupné dekompresi a natřásány způsobem popsaným . v příkladu .2. Po 45 minutách třepání při stabilizovaném a částečném vakuu bylo vizuálně zjištěno, že hlávky ještě nejsou úplně zmrzlé. Potom se pokračovalo v natřásání při nízkém tlaku po dobu’dalších 2 hod.15 min, kdy došlo k úplnému zmražení.

Potom se během 20 minut prováděla postupná rekomprese. Všechny 3 hlavičky byly pak vyjmuty z dekompresní komory a z mrazicího boxu a položeny na papírovou podložku v laboratoři. Během tání bylo pozorováno unikání buněčné tekutiny z listů, které se dotýkaly stěn vakuové komory.

Z vnitřních listů tekutina neunikala. Hlávka utržená v den pokusu měla po rozmražení plný turgor. Turgor hlávek sklizených 4 dny před pokusem byl pouze částečný.

Příklad 4

Rada květináčů o průměru 10,2 cm, z nichž každý obsahoval dvě živé rostliny chrysantémy s rozkvetlými květy a poupaty, byla vložena do dekompresní komory a zpracována způsobem popsaným v příkladu 2.

Jedna rostlina v jednom květináči mela stonek nepatrně delší než byla vnitřní výška vakuové komory a dotýkala se tedy stropu vakuové komory během mražení.

Po dobu 2 hodin byly udržovány podmínky částečného vakua s protřepáváním, pak byly rostliny rekomprimovány a vyjmuty z vakuové komory a z mrazicího boxu, aby mohly roztát v laboratoři. Během jedné hodiny byly všechny rostliny úplně rozmraženy.

Listy měly stejnou texturu a turgor jako před pokusem, třebaže jejich zbarvení bylo nepatrně tmavší. Rostliny pak byly pozorovány po dobu 4 týdnů, a s výjimkou stonku, který byl ve styku se stropem vakuové komory, pokračovaly všechny v růstu s neporušenými květy a s rozvíjejícími se poupaty.

Příklad 5 třešňová rajčata, 3 bifteková rajčata a 2 italská rajčata, všechna čerstvě utržená, byla umístěna do dekompresní komory podle příkladu 2 a zpracována popsaným způsobem. Kromě toho byla 2 třešňová rajčata a dvě italská rajčata, rovněž čerstvě utržená, umístěna na nátřasné zařízení, avšak vně dekompresní komory, ke srovnávacím účelům.

Nakonec byla do dekompresní komory vložena endivie, která byla sklizena před 4 až 6 dny. Po dobu 4 hodin bylo udržováno konečné částečné vakuum při současném potřásání, protože rajčata obsahují velké množství vody. Potom byla rajčata rekomprimována, vyjmuta z komory a z mrazicího boxu a položena v laboratoři na papírovou podložku, aby roztála.

Při rozmražení jevila kontrolní rajčata, to znamená rajčata podrobená potřásání, ale bez dekomprese, známky protržení buněk a svraštění slupky a měla měkkou a kašovitou konsistenci. Ostatní rajčata si zachovala původní tvar a pevnost a na jejich povrchu se vytvořily kapky vody následkem náhlého působení teplého vzduchu. Několik nejzralejších rajčat mělo tmavší barvu než původně.

Endivie reagovala při rozmražení smíšeně. Některé listy uvadly bez oživení a jiné získaly plný turgor.

Příklad 6 hlavičky mexické lociky a to 2 druhu salát římský a dvě s červenými listy, vypěstované ve výši 760 až 1 220 m, byly zpracovány postupem podle příkladu 2. Během rozmražení hlaviček nebyla pozorována ani ruptura buněk ani unikání tekutiny. Turgor se však zmenšil a listy měly pryžovitou texturu a lesklý povrch, který původně neměly.

Další 4 hlávky stejného druhu lociky byly zpracovány podobně, avšak dekomprese byla provedena pouze do -70 kPa místo do -77 kPa. Tyto hlávky měly po roztátí plný turgor a jejich

I textura a povrchový vzhled stejný jako před zmražením. Předchozí popis slouží pouze k vysvětlení vynálezu, který není omezen pouze na popsaná provedení. Naopak lze v rámci vynálezu provádět nerůznější obměny.

Claims (1)

1. Způsob mražení organických tkání, vyznačený tím, že z tkáně uložené v uzavřeném prostoru se při zachování obsahu vody postupně odčerpá nejméně polovina objemu rozpuštěných plynů snížením tlaku obklopující plynné atmosféry na hodnotu 90 až 60 kPa pod atmosférický tlak rychlostí 3 až 7 kPa za minutu a současně nebo poté se tkáně zchladí na teplotu ležící při teplotě mrznutí nebo pod ní, přičemž současně se snižováním tlaku a chlazením se tkáň podrobí vibracím s rychlostí 25 až 100 kmitů za minutu.