KR900008739B1 - 생체 유기조직의 냉동보존방법 - Google Patents

생체 유기조직의 냉동보존방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

생체 유기조직의 냉동보존방법
본 발명은 일반적으로 과일, 야채, 동물질 및 유기조직의 냉동보존에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 저장, 운송, 장기보존 및 생물학적 활성의 완전 또는 부분 현탁액이 요구된 다른 다양한 용도를 목적으로 하는 세포체의 냉동에 관한 것으로 세포구조를 보존하여 재구성하에 원래조건으로 완전복귀시키는 것이다.
신선한 식물류 및 살아있는 동물세포의 냉동은 인간소비용으로서의 야채 및 과일류의 저장과 운송으로부터 외과적인 조직회복용 또는 의료용 또는 과학관찰용으로서의 생물학적 활성 현탁액까지의 다양한 유용성을 지니고 있다. 그러나, 불행하게도 대부분의 세포구조는 얼음결정의 형성으로 야기된 세포벽망에 의해 손상을 입었던바, 용적이 팽창하고 연(edge)이 예리해져 세포액에 구멍이 생기고 세포가 파괴되었다.
그 결과, 조직팽만감 및 천역액이 손실되었다. 과일 및 야채류에 있어서는 용해된후에 식용이 가능하나 이미 맛을 잃은 상태로 되며, 동물계에 있어서는 신진대사에 파괴가 일어나 자주 죽게된다. 부언하면, 냉동후 방취된 가스에 의해 형성된 기포 또는 색전(emboli)들이 용해된 후 혈류속으로 방출된다. 혹독한 고통 및 면역학적 파괴가 일어나며 심장이나 뇌의 색전증으로 인해 죽게된다. 이러한 문제를 극복하기 위한 공지방법으로서 일반적으로 유기세포를 탈수화시켜 얼음결정의 형성을 수반하는 팽창여유를 제공하였다. 대표적인 방법은 람브에 의한 미합중국 특허 제3,219,463호(1965년 11월 23)에 기술되어 있다.
람브법은 고진공도(절대압력 4.6토르이하)를 요하는 2단계법이다. 용해하에 상기물질을 재구성하기 위해서는 물을 비동증발시켜 고체해야 한다. 복합 또는 조밀 세포구조에서, 본 방법으로 균일한 분포도를 얻는다는 것은 어려운 일이다. 더욱이, 섬세한 세포구조의 조직은 탈수화 및 재구성시에 세포벽을 통과하여 다량의 물질을 수반하는 응력을 견디지 못한다. 세포내의 세포형성 유체로부터 적어도 용해가스의 일부를 제거해내므로서, 상기 형성상의 냉동 및 재구성하에 세포구조 또는 색전들이 형성됨에 있어 실질적인 손상이 없게 되었다. 따라서, 본 발명의 방법은 용해하에 완전한 생존성을 복귀시킬 수 있는 광범위한 유기조직의 생명력있는 현탁액을 제공하는 것이다.
본 발명의 방법에 따라, 세포형성에 의한 유기물질은 점차 감압되어 냉동 또는 차냉동온도를 냉각된다. 감압은 세포내 유체에 용해된 가스의 농도를 감소시킬 정도로 수행되나, 증발에 의한 유체자체의 실질적 손실을 피하고 있다. "가스성" 또는 "가스성물질"이란 온도 및 압력이 표준대기조건에 있는 가스상태의 물질을 말한다. 용해된 가스량의 감소는 세포내 유체가 냉동될 때 발생하는 비용적 증가의 감소에 상응한다. 따라서, 본 발명은 냉동용적을 충분히 감소시켜 그렇지 않은 경우 얼음결정의 형성을 수반하는 세포벽의 손상을 저지시켰던 것이다.
감압은 유체증발을 피할 수 있는 속도로 수행된다. 상기 속도는 그렇지 않은 경우라도 큰 영향을 주지 않으며 광범위하게 변화한다. 일반적으로, 감압속도는 약 1.0-약 10.0킬로파스칼/분(7.1-77.0토르/분)이 가장 용이하며, 바람직한 감압속도는 약 3.0-약 7.0킬로파스칼/분(23.0-53.6토르/분)이고, 가장 바람직한 것은 약 5.0-53.6토르/분이고, 가장 바람직한 것은 약 5.0-약 6.0킬로파스칼/분(38.3-46.0토르/분)이다. 감압시, 압력은 세포유체의 상당량이 증발되지 않고 용해된 가스함량의 상당량이 용액으로부터 빠져나와 세포벽을 통과하는 점으로 낮아진다. 실제적인 감압도는 중요치 않으며 포함된 유기조직, 용해된 가스람량, 세포벽구조 및 세포유체의 성질에 따라 광범위하게 변한다.
바람직하게, 적어도 용해된 가스함량의 약절반이 방출된다. 대부분의 유기물질에 대한 분해는 대기압이라 약 90-약 60킬로파스칼(절대압 70-300토르)에서 가장 효율적이다. 이 범위내에서, 즉, 대기압이하 약 80-60킬로파스칼(절대압 150-약 260토르)이 바람직하다.
최적 감압도는 유기물질형태 및 유기물질이 성장한 고도나 기후에 따라 변화한다. 특히 이것은 높은 고도 또는 비교적 냉하거나 온화한 환경에서 성장한 야채 및 과실류 등의 식물에 있어서 그러하다. 높은 고도에서 성장한 식물들에 발생하는 비교적 연약한 세포벽은 더욱 파열되기 쉽고 가스 및 증기확산에 더욱 침투성인 세포구조를 갖는다. 상기 경우에서 특별히 주의해야 할 것은 세포구조를 본래대로 유지함은 물론 세포의 탈수화를 지지시키는 것이다. 이것은 감압도의 감소와 감압속도에 의해 완성된다. 유사한 조절로서 냉하거나 온화한 기후에서 성장한 식물들이 필요하다. 이는 세포내 유체에 존재하는 용해가스량에 변화가 있기 때문이다. 특히, 두껍거나 강한 세포벽이 존재할 때, 감압에 대한 세포반응도 초기감압-재압순환에 의해 증강되어 세포벽이 부드러워(temper)진다. 순환상의 감압 및 재압은 상기 지시된 속도로 수행되나 보다 적은 차의 압력이 사용된다. 일반적으로 대기압이하 약 20-약 40킬로파스칼(절대압 450-600토르)내의 압력으로 감압시키므로서 효율적인 부드러움이 이루어진다. 감압은 냉각전후에 행해진다. 바람직하게, 감압 및 냉각이 동시에 수행되어 최적조절이 이루어져 가스가 빠져나오며, 반면에 물의 손실이 방지된다. 동시에 수행된 경우, 냉각 및 감압의 속도는 플래쉬를 방지하고 가스가 빠져나가기 전에 얼음결정의 형성을 방지할 정도이어야 한다. 적합한 속도는 통상적인 실험으로 용이하게 결정된다. 냉동물질의 융해 및 재구성하에서, 파열된 세포구조에 의한 것은 이들의 팽만감결핍에 의해 용이하게 결정되며, 탈수화에 의한 것은 농도상의 현저한 변화와 팽만감의 손실을 나타낸다. 종래 냉각장치의 사용과 특성화된 상기 속도에서의 감압에 의하면 세포파열과 탈수화가 방지되어 효율적인 결과를 용이하게 얻는다. 최종온도는 세포내 유체가 고체를 냉동시킨 온도일 것이다.
이것은 용매성질 및 용매농도에 따라 변화하며 포함된 유지조직형태에 의해서도 변화한다. 일반적으로, 물의 표준냉동온도로부터 약 -10℃까지의 온도가 충분하다. 냉각은 종래기술에 의해 완성된다. 냉각 및 감압이 동시에 행해질 경우, 상기와 같이 냉각속도를 적합하게 조절하여 실질적인 결정이 형성되기전에 용액으로부터 가스가 빠져나가게하는 것이 필요하다.
이에따라, 플래쉬 냉동이 바람직하게 방지된다.
본 발명의 방법에 의한 바람직한 면을 볼 때, 냉각 및 감압은 세포조직의 교반 및/또는 진동에 의해 수행되어 세포내부에 바람직하게는 커다란 결정상에 작은 얼음 결정군의 형성을 증진시킨다. 작은 결정들은 보다 작은 용적을 갖는바, 세포형태를 적게 뒤틀리게하고 세포벽에 구멍을 낼 수 있는 예리한 연이나 점들을 감소시킨다. 교반이나 진동의 속도 및 정도는 중요하지 않으며 작은 결정들이 마멸 또는 세포조직에 대한 다른 손상없이 형성된 경우 변화하여 여전히 용해된 가스가 빠져나간다.
조직내의 분자이동을 유발시킬 수 있는 장치는 결정형성을 파괴하거나 재유기화시킬 정도로 충분해야 한다. 이것은 완화한 교반으로부터 음성주파수에 의한 진동까지의 범위에서 이루어진다. 가장 좋은 결과는 완화한 교반에 의해 이루어지며 세포구조내의 모든 유체가 고체를 냉동시킬 때까지 정상속도로 계속된다. 대부분의 경우, 약 1.0-약 10.0인치(2.5-25.0㎝)의 변위진폭에 의한 약 25-약 100사이클 속도의 축음진동에 의해 최상의 결과를 얻는다. 조밀물질이나 용적물질이 본 발명의 방법에 따라 처리될 경우 전체군을 통해 냉동이 일어나도록 주의해야 한다. 열전달제한으로 인하여, 상치속같은 내부부는 외부세포층이나 근처에 있는 부위보다 더 서서히 결정화된다. 따라서, 일단 최종온도와 감압수준에 도달하면, 오랜시간동안 냉동을 완결시키기 위해 필요에 따라, 교반을 계속함은 물론 상기 조건들을 유지시켜야 한다. 더우기, 습기가 있거나 포화된 공기를 냉동될 물질주위에 순환시켜 탈수화 방지수단을 형성해야 한다. 알맞은 순환수단은 흔히 냉각장치로 통합된다. 어떤 경우에는 지극히 건조한 상태에서의 냉각을 피해야 한다. 살아있는 동물류를 본 발명의 방법에 따라 냉동 및 감압시킨 현탁액에 방치할 경우 불쾌감을 덜어주고 감금을 용이하게 하기위해 이산화탄소나 다른 효과적인 마취제를 사용한다. 감압시 마취제가 방출되면 동물은 용배하에 완전히 회복된다. 부언하면, 조직이 급속히 냉각하면 헬륨-산소 혼합물의 사용에 의해 냉각실로의 탈기가 증강된다. 일단 용해된 가스의 바람직한 양이 빠져나가고 조직이 완전히 냉동되면 유기물질은 용해된 가스가 방출된 상태의 부분 진공이나 대기압하에 냉동조건에서 무한정 저장된다. 세포구조는 융해없이 재냉동된 경우 원상태로 유지된다. 유기물질은 본래의 상태로 복귀시키고자할 때 환경온도에서 물질을 점차 가온시키므로서 용이하게 이루어진다. 물질이 가온됨에 따라 세포구조가 용융되고 대기가스는 이들의 평형농도까지 세포유체에서 재용해한다.
물질에 압력을 대기압보다 약간 높게 부가하므로서 완전한 팽만감이 이루어지고 본래조건으로 복귀된다. 특히, 이것은 유기물질이 동물세포 또는 현탁액중의 모든 동물류로 구성될 때 바람직하다. 가장 바람직한 실례를 통해 볼 때, 초대기압 조절은 세포내부를 유체상태로 복귀시키기에 앞서 세포내 압력을 재확립시키는 융해전에 행해진다.
과압은 세포구조에 스스로 손상을 주지 않는 경우에는 중요하지 않다. 대부분의 적용에 있어서 약 5-약 10%의 압력이면 충분하다.
제압속도로 별반 중요치 않으며 감압시에 필요한 압박감에 따르지도 않는다. 이와같이, 감압에 사용된 것보다 다소 빠른 속도가 침투성이 있는바, 전형적인 상기 속도는 약 5-약 킬로파스칼/분(38-77토르/분)이다. 일단 완전융해되면 물질은 환경온도로 복귀되며 세포내의 과량가스가 방출된다.
본 발명의 방법은 하기와 같은 식물성이나 동물성물질을 냉동 및 재생시키는데 알맞은 것이다 : 즉, 과일, 야채, 비식용식물, 씨앗, 식용고기, 생체세포 및 조직, 동물 및 인체기관, 모든 동물 및 인간등이다. 과일류나 식물류등의 야채물질이 사용될 경우, 상기 물질들은 가능한한 수확후 곧 처리할 때 가장 좋은 결과를 얻는다.
본 발명의 방법은 야채류나 동물류의 개선된 저장 및 운송에 의료용 및 과학적 보존 및 세포, 조직, 기관 및 복합유기체에 손상되거나 분해하는 조직 및 외과나 일단 의료용을 목적으로 하는 유기계들의 의료용 현탁액에, 그리고 생물학적 보존을 목적으로 하는 생체세포 및 복합계들의 현탁활성에 유용하다. 다음 실시예들은 본 목적을 예시하는 것으로 어떤 방법으로도 제한을 받거나 한정되지 않는다.
[실시예 1]
6마리의 표준실험쥐와 6군의 로마인 상치를 -4℃로 개방식 2.2ft3(0.06㎥)휴대용 냉동기 세트에 방치하고 진동용량을 갖는 고 고도 시뮬레이터내부에 교대로 방치한다. 탈기식 고진공펌프를 사용하여 시뮬레이터내의 압력을 약 20분에 걸쳐 정상속도로 37000ft(절대압 164토르 또는 -78.2킬로파스칼)의 고도에 상당하게 낮춘다. 감압시, 대략 3인치(7.6㎝)의 변위와 60-70사이클/분의 속도를 갖는 장치로 측음진동을 부가한다. 일단 진공이 붕괴되면 냉동기는 닫히고 진동은 1시간 45분간 계속된다. 진동이 중단되면 냉동기는 다시 열리고 압력은 20분간에 걸쳐 점진적인 속도로 대기압으로 복귀된다.
그후, 시뮬레이터에서 0.1부가 대기압을 감소시키면 씨이일이 방출되고 문이 용이하게 열린다. 따라서, 쥐와 상치는 다시 움직인다. 생명력이 없는듯한 상기 쥐를 만져보았더니 굳어 있었다. 이는 쥐가 확실히 냉동되었음을 나타낸다. 각 우리바닥에 깔아놓았던 의류와 함께 상기 쥐를 우리에게 옮겼다. 그후, 쥐와 우리를 관찰용으로 두꺼운 종이상자에 방치했다. 감압실로부터 옮긴후 대략 45분쯤에 1마리의 쥐가 한숨을 내쉬었다. 다음 15분쯤에 4마리의 쥐가 약간 움직임을 나타낸 것으로 보아 생명기능이 회복된 것으로 보인다. 6마리의 쥐가 움직임을 나타낸 것은 대략 10분후이다. 감압실로부터 옮긴후 대략 1시간쯤에 모든 쥐들에게 물과 음식을 주었다. 그후, 모든 쥐들은 건강상태가 양호해져 정상운동과 식욕을 나타내었다. 진공실로부터 옮겨낸 상치도 마찬가지로 완전히 냉동되어 굳어있었다. 상치들을 종이타올 위에 놓고 융해하여 세포파열에 기인한 모든 누출현상을 검침했다. 15분쯤에 상치는 상당히 융해되어 세포성분의 누출이 없었다. 재생되지 못한 소지역들이 잎의 끝부분에 나타났다. 이것은 냉동전의 잎의 파열에 의한 것이다. 그러나, 상치의 주요군은 완전한 팽만감으로 재생되었다.
[실시예 2]
실시예 2-6에 사용된 장치들은 화학교반기상에 놓여진 투명한 진공실로 구성되며 이들 모두는 워크인 냉동기내부에 장치된다. 감압은 설정부에 있는 게이지로부터 취해진 압력읽음에 따라 소형진공펌프를 사용하므로서 이루어진다. 일군의 샐러드용접시의 상치를 진공실내부의 오하우스 스케일상에 놓고 실험초기의 상치중량을 505g으로 한다. 상기실을 20분간에 걸쳐 77킬로파스칼의 진공으로 점차 감압시켜 샘풀을 냉각시킨다. 상기동안에, 교반기는 대략 3인치(7.6㎝)의 측변위에 따라 대략 50사이클/분으로 작동시킨다. 냉동기 온도는 대략 -7℃이다. 감압시, 상치의 중량은 10g±2정도로 떨어진다.
일단, 진공수단이 바람직한 수준으로되면, 상기 조건을 4시간더 유지시킨다. 그후, 진공실을 탈기시키면 점차 압력이 상승하여 대기압으로 복귀된다. 재압속도는 5-6킬로파스칼/분이다. 그후, 상치를 진공실과 냉동기에서 빼내어 융해가 일어나는 종이타올(실험실내에 있는)위에 놓는다. 실험실온도는 68℉(20℃)이다. 비교를 목적으로, 동일한 상치군 2개를 더 실험했다. 그러나, 이중 하나는 감압이나 교반이 없는 냉동기에 놓았고 다른 것은 교반하에 감압냉동시켰다. 그렇지만, 진행과정을 동일하게 했다. 냉동기에서 옮겨낸후 10분쯤에 첫 번째 비교샘플(감입이나 교반없이 냉동된)은 타올에 얼룩을 나타낸바, 이는 세포가 파열되고 손상을 입은 것이다.
두 번째 비교샘플(교반없이 감압에 의해 냉동된)은 타올에 얼룩을 나타내지 않았으나, 팽만감이 손실되고, 축늘어지고 해초나 켈프같았다.
나머지 샘플(감압 및 교반에 의해 냉동된)은 융해하에 팽만감이 완전 유지되었고 유체누출이 없었다. 마찬가지로, 잎의 일부가 재생되지 못하였는데 이는 상기 부위를 살려주는 모세관에 홈과 작은 파열이 생겼기 때문이다.
[실시예 3]
3군의 샐러드용 접지상의 상치를 실험용으로 하는 바, 하나는 정원에서 당일 채취한 것이고 다른것들은 채취후 적어도 4일이 지난 것을 상인으로부터 얻는 것이다. 상기 상치 모두를 실시예 2의 감압실에 넣었다. 실시예 2의 방법에 따라, 상기 상치들을 점차 감압하고 교반시켰다. 안정된 부분진공수준으로 교반한지 45분후, 상치들은 완전 냉동되지 않았다. 그후, 저압으로 2시간15분간 더 교반시킨결과 완전 냉동되었다. 그후, 20분에 걸쳐 점차 재가압하고 3군 모두를 감압실과 냉동기에서 빼내어 상기 실험실내의 종이타올위에 놓는다.
상기가 융해됨에 따라, 상기실의 측면과 접촉했던 잎으로부터 세포유체가 누출되었다. 내부잎에는 누출이 없었다. 당일 채취한 실험용군은 완전한 팽만감으로 복귀되었다. 채취한지 4일 지난 군들은 부분만이 팽만감으로 복귀되었다.
[실시예 4]
개화도되고 개아도되는 살아있는 2개의 국화를 포함하는 일련의 4인치(10.2㎝)포트를 감압실에 방치하고 실시예 2의 과정에 따라 처리한다.
한 포트내의 한 국화는 실의 내부높이보다 약간 크므로 냉동시 실정부와 접하게 된다. 2시간동안 교반하에 최종부분 진공조건을 유지시키고 재가압하고 상기실과 냉동기로부터 실험실로 옮겨 융해시킨다.
1시간내에, 완전히 융해되었다. 잎들은 실험전과 같이 동일구조와 팽만감을 나타냈으나 색깔이 약간 짙어졌다. 그후, 상기 식물들을 4주간에 걸쳐 관찰한바, 실정부와 접한줄기만을 제외하고 모두 계속 성장하여 본래대로 개화되었고 씨앗들도 꽃을 피웠다.
[실시예 5]
신선한 것으로 채취한 체리 토마토 4개, 비푸스테이크 토마토 2개 및 이탈리안토마토 2개를 실시예 2의 감압실에 방치하고 전술한 바와 같이 처리했다. 부가해서, 신선하게 채취된 체리토마토 2개와 이탈리안 토마토 2개를 비교용으로 감압실밖의 교반기에 방치했다. 최종적으로, 4-6일 일찍 수확한 꽃상치를 감압실에는 방치했다.
토마토가 고함량의 수분을 갖고 있으므로 4시간 교반하에 최종부분 진공조건을 유지시킨다. 상기 야채류를 재가압하고 상기실과 냉동기로부터 실험실내의 융해용 종이타올에 방치한다. 융해하에, 비교용 토마토(감압되지않고 교반된)는 세포파열과 표면주름이 생겼으며 부드럽고 펄프같은 성질을 지녔다. 나머지 토마토들은 가온대기에 급작스럽게 노출되어 표면상의 작은물방울에 의해 본래의 형태와 단단함을 유지했다. 가장 잘익은 토마토 몇 개는 원래보다 색깔이 짙어졌다. 융해하의 꽃상치는 혼합반응을 나타냈다. 몇몇잎들은 재생없이 시들었으나 다른것들은 완전히 팽만상태로 복귀되었다.
[실시예 6]
2500-4000ft(760-1220m)로 성장한 2개의 로마인과 2개의 붉인잎군들을 포함하는 멕시칸상치 4군을 실시예 2와 같이 처리했다.
상기군들의 융해하에, 세포파열 및 유체누출이 없었다. 그러나, 팽만감은 감소되었고 잎들은 원래 같지 않은 고무같은 조직과 표면을 가졌다. 동일한 형태의 상치 4군을 유사하게 처리했다. -70킬로파스칼(217토르 절대압)의 수준에서 감압시킴을 제외하고 오히려 -77킬로파스칼에서 감압시켰다. 상기군들은 융해하여 완전히 팽만되어 냉동전과 같은 조직과 표면을 나타내었다. 전술된 기술은 오직 본 발명을 위한 것이다. 본 발명은 기술된 특성이나 실례에 대한 제한을 가하려 하지 않는바, 본 기술에 숙련된 자들은 본 발명의 영역내에서 수많은 수정과 변화를 가할 수 있다.

Claims (12)

  1. (a) 유기 조직과 접하는 대기압을 낮추어서 상기 조직내의 수분을 실질적으로 증발시킴이 없이 조직내에 용해된 적어도 대부분의 가스 물질을 상기 조직으로부터 방출시키고, 및 (b) 상기 조직을 냉동점 또는 그 이하의 온도로 냉각시키는 것을 포함하는 유기조직의 냉동방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)와 (b)가 실질적으로 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계(a)와 (b)를 실질적으로 도시에 수행시킨 후, 냉동시 결정형성을 방해하기에 충분한 상기 조직내의 분자운동이 유발하도록 상기 조직을 동시에 교반 또는 진동시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 (a)와 (b)가 동시에 수행시킨 후, 상기 조직을 약 25 내지 약 100싸이클/분의 속도로 동시에 교반시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계(a)에서 이루어진 최소압력이 대기압이하 약 90 내지 약 60킬로파스칼인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계(a)에서 이루어진 최소압력이 대기압 이하 약 80 내지 약 65킬로파스칼인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 약 -3∼약 -7킬로파스칼/분의 속도로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 단계(a)가 약 -5∼약 -7킬로파스칼/분의 속도로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조직에 용해된 유기물질의 적어도 절반이 방출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 유지조직이 식물성이고, 상기 방법이 수확한지 약 하루이내에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 유지조직과 접하는 대기압을 약 -3 내지 약 -7킬로파스칼/분의 속도로 최소압력 대기압 이하 약 90 내지 약 60킬로파스칼까지 낮추어서 상기 조직내의 수분을 실질적으로 증발시킴이 없이 조직내에 용해된 적어도 약 절반의 가스물질을 상기 조직으로부터 방출시키고, 상기 조직을 약 -10 내지 약 0℃로 냉각시키고 약 25 내지 약 100싸이클/분의 속도로 교반시키는 것을 포함하는 유기조직의 냉동방법.
  12. 유기조직과 접하는 대기압을 약 -5 내지 약 -6킬로파스칼/분의 속도로 최소압력 대기압이하 약 80내지 약 65킬로파스칼까지 낮추어서 상기 조직내의 수분을 증발시킴이 없이 조직내에 용해된 적어도 약 절반의 가스물질을 상기 조직으로부터 방출시키고, 상기 식물성물질을 약 -10℃ 내지 약 0℃로 냉각시키고 약 25∼약 100싸이클/분의 속도로 교반시키면서 상기 방법을 상기 식물성물질을 수확한지 약 하루이내에 수행하는 것을 포함하는 식물성물질의 냉동방법.
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