NO343721B1

NO343721B1 - Sammensetning omfattende anti-TNF-alfa-antistoff for behandling av reumatoid artritt

Info

Publication number: NO343721B1
Application number: NO20120288A
Authority: NO
Inventors: Joachim Kempeni; Roberta Weiss; Steven A Fischkoff
Original assignee: Abbvie Biotechnology Ltd
Priority date: 2001-06-08
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2019-05-20
Also published as: PT2940044T; PE20160999A1; SK288509B6; EP1406656B1; KR101142825B1; PL399491A1; US20120177596A1; HU230947B1; SA02230384B1; US20150017175A1; IL212419A; JP2009167193A; KR101497363B1; SI2940044T1; JP2012184242A; NO20035426D0; US20150165023A1; BG66936B1; CZ200420A3; PT1406656E

Description

Tumor nekrosefaktor α (TNF α) er et cytokin dannet av flere celletyper, innbefattende monocytter og makrofager som opprinnelig ble identifisert basert på deres kapasitet til å indusere nekrose av visse musetumorer (se f.eks. Old, L. (1985) Science 230:630-632). Deretter ble en faktor cachectin assosiert med cachexia, vist å være det samme molekyl som TNF α. TNF α har vært implikert i å fremskaffe sjokk (se f.eks. Beutler, B. og Cerami, A. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:505-518; Beutler, B. og Cerami, A. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7:625-655). Videre har TNF α vært implikert i patofysiologien av en rekke andre humane sykdommer og lidelser, innbefattende sepsis, infeksjoner, autoimmune sykdommer, transplantatavstøtning og transplantat mot vertssykdom (se f.eks. Vasilli, P. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:411-452; Tracey, K.J. og Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503).

På grunn av den skadelige rolle av humant TNF α (hTNF α) i en mengde humane lidelser har terapeutiske strategier blitt utarbeidet til å inhibere eller motvirke hTNF α-aktivitet. Spesielt har antistoff som binder til og nøytraliserer hTNF α blitt søkt som en mulighet til å inhibere hTNF α-aktivitet. Enkelte av de tidligste av slike antistoff var monoklonale museantistoff (mAbs) utskilt av hybridomer fremstilt fra lymfocytter av mus immunisert med hTNF α (se f.eks. Hahn T., et al., (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 3814-3818; Liang, C-M., et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137:847-854; Hirai, M., et al. (1987) J. Immunol. Methods 96:57-62; Fendly, B.M., et al. (1987) Hybridoma 6:359-370; Möller, A., et al. (1990) Cytokine 2:162-169; U.S. Patent nr. 5.231.024 til Moeller et al.; Europeisk patentpublikasjon nr. 186 833 B1 til Wallach, D.; Europeisk patentsøknad publikasjon nr. 218 868 A1 til Old et al.; Europeisk patentpublikasjon nr. 260 610 B1 til Moeller, A., et al.). Selv om disse anti-hTNF α museantistoff ofte oppviste høy affinitet for hTNF, (for Kd ≤ 10-9M) og var i stand til å nøytralisere hTNF α-aktivitet, kan deres anvendelse in vivo være begrenset av problemet assosiert med administrasjon av museantistoff til mennesker så som kort serum halveringstid, at de er ute av stand til å sette i gang visse humane effektorfunksjoner og fremskaffelse av en uønsket immunrespons mot museantistoffet i et menneske (den ”human antimus antistoff” (HAMA)reaksjonen).

I et forsøk på å overvinne problemene assosiert med anvendelse av fullstendig murine antistoff i mennesker har murine anti-hTNF α-antistoff generelt blitt manipulert til å bli mer ”humanlignende”. For eksempel har chimeriske antistoff hvor de variable områder av antistoffkjedene er murinavledet og de konstante områder av antistoffkjedene er humanavledet, blitt fremstilt (Knight, D.M, et al. (1993) Mol.

Immunol. 30:1443-1453; PCT publikasjon nr. WO 92/16553 til Daddona, P.E., et al.). I tillegg har humaniserte antistoff hvor de hypervariable domener av de variable områder hos antistoffet er murinavledet, men resten av de variable områder og de konstante områder av antistoffet er humanavledet, også blitt fremstilt (PCT publikasjon nr. WO 92/11383 til Adair, J.R., et al.). Imidlertid, fordi disse chimeriske og humaniserte antistoff fremdeles har enkelte murine sekvenser, kan de fremdeles fremskaffe en uønsket immunreaksjon, den humane antichimeriske antistoff (HACA) reaksjon, spesielt når administrert over lengre perioder, f.eks. for kroniske indikasjoner, så som reumatoid artritt (se f.eks. Elliott, M.J., et al. (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliot, M.J., et al. (1994) Lancet 344:1105-1110).

Et foretrukket hTNF α inhibitorisk middel til murine mAbs eller derivater derav (f.eks. chimeriske eller humaniserte antistoff) ville være et fullstendig humant anti-HTNF α-antistoff siden et slikt middel ikke ville fremskaffe HAMA-reaksjonen selv om det ble brukt over lengre perioder. Humane, monoklonale autoantistoff mot hTNF α har blitt fremstilt ved å bruke humane hybridomteknikker (Boyle, P., et al. (1993) Cell. Immunol. 152:556-568; Boyle, P., et al. (1993) Cell. Immunol. 152:569-581; Europeisk patentsøknad publikasjonsnr. 614 984 A2 til Boyle, et al.). Imidlertid ble disse hybridomavledede, monoklonale autoantistoff rapportert å ha en affinitet for hTNF α som var for lav å regne ut med konvensjonelle metoder, var ute av stand til å binde oppløselig hTNF α og var ute av stand til å nøytralisere hTNF α-indusert cytotoksisitet (se Boyle, et al.; supra). Videre avhenger suksessen av den humane hybridomteknikk av den naturlige tilstedeværelse i humant perifert blod av lymfocytter som danner autoantistoff som er spesifikke for hTNF α. Visse studier har påvist serum autoantistoff mot hTNF α i mennesker (Fomsgaard, A., et al. (1989) Scand. J. Immunol. 30:219-223; Bendtzen, K., et al. (1990) Prog. Leukocyte Biol.

10B:447-452), mens andre ikke har dette (Leusch, H-G., et al. (1991) J. Immunol. Methods 139:145-147).

Alternativt til naturlig forekommende, humane anti-hTNF α-antistoff ville være rekombinante hTNF α-antistoff. Rekombinante, humane antistoff som binder hTNF α med relativt lav affinitet (det vil si Kd ~10-7M) og en rask avhastighet (det vil si Koff ~ 10-2 sec-1) har blitt beskrevet (Griffiths, A.D., et al. (1993) EMBO J.

12:725-734). Imidlertid, på grunn av deres relativt raske dissosiasjonskinetikk behøver disse antistoff ikke være egnet for terapeutisk bruk. I tillegg har et rekombinant, humant anti-hTNF α blitt beskrevet som ikke nøytraliserer hTNF α-aktivitet, men i stedet øker binding av hTNF α til overflaten av celler og øker internaliseringen av hTNF α (Lidbury, A., et al. (1994) Biotechnol. Ther. 5:27-45; PCT-publikasjon nr. WO 92/03145 til Aston, R. et al.).

I både WO 1997029131 og artikkelen Rau R. et al. «Erfahrungen mit D2E7, Akt Rheumatol, 2000, Vol. 25, s. 83-88 er det kjent sekvensen og anvendelser av anti-TNF α�antistoffet D2E7. Imidlertid er et to-ukentlig doseringsregime verken beskrevet eller antydet i noen av disse skriftene alene eller tatt sammen.

Rekombinante, humane antistoff som binder oppløselig hTNF α med høy affinitet og sakte dissosiasjonskinetikk og som har kapasiteten å nøytralisere hTNF α-aktivitet, innbefattende hTNF α-indusert cytotoksisitet (in vitro og in vivo) og hTNF α-indusert celleaktivering, har også blitt beskrevet (se U.S. patent nr. 6.090.382). Typiske metoder for å administrere antistoff blir utført intravenøst på en ukentlig basis. Ukentlig dosering med antistoff og/eller ethvert medikament kan være kostbar, tungvint og resultere i en økning i antallet bieffekter grunnet administrasjonsfrekvensen. Intravenøs administrasjon har også begrensninger ved at administrasjonen vanligvis foretas av noen med medisinsk trening.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer en sammensetning som angitt i krav 1, som er egnet for to-ukentlige doseringsregimer for behandlingen av TNF α-assosierte lidelser, fortrinnsvis via en subkutan rute. To-ukentlig dosering har mange fordeler i forhold til ukentlig dosering, innbefattende, men ikke begrenset til, lavere antall totale injeksjoner, minsket antall injeksjonsstedreaksjoner (f.eks. lokal smerte og hevelse), øket pasientsamarbeid (det vil si grunnet mindre hyppige injeksjoner) og mindre omkostninger for pasienten så vel som helsearbeideren. Subkutan dosering er fordelaktig fordi pasienten selv kan administrere en terapeutisk substans, f.eks. et humant TNF α-antistoff som er passende for både pasienten og helsearbeideren.

Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan anvendes i kombinasjonsterapi hvor humane antistoff blir administrert til et individ sammen med et annet terapeutisk middel, så som et eller flere ytterligere antistoff som binder andre målmaterialer (f.eks. antistoff som binder andre cytokiner eller som binder celleoverflatemolekyler), et eller flere cytokiner, oppløselig TNF α-reseptor (se f.eks. PCT-publikasjon nr. WO/06476) og/eller et eller flere kjemiske midler som inhiberer hTNF α-produksjon eller aktivitet (så som cykloheksanylidenderivater som beskrevet i PCT-publikasjon nr. WO 93/19751), fortrinnsvis metotreksat. Antistoffene er fortrinnsvis rekombinante, humane antistoff som spesifikt binder til human TNF α. De aktuelle antistoffene er særpreget ved å binde til hTNF α med høy affinitet og sen dissosiasjonskinetikk og ved å nøytralisere hTNF α-aktivitet innbefattende hTNF αindusert cytotoksisitet (in vitro og in vivo) og hTNF α-indusert cellulær aktivering. Antistoffene kan være av full lengde (f.eks. et IgG1 eller IgG4 antistoff) eller kan omfatte kun en antigenbindende del (f.eks. et Fab, F(ab’)2, scFv-fragment eller enkelt domene). De mest foretrukne, rekombinante antistoff ifølge oppfinnelsen, betegnet D2E7, har et lettkjedet CDR3-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 3 og et tungkjede CDR3-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 4 (angitt i vedlegg B). Fortrinnsvis har D2E7-antistoffet et lettkjede variabelt område (LCVR) omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 1 og et tungkjede variabelt område (HCVR) omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr.

2. Disse antistoff er beskrevet i U.S. patent nr. 6.090.382, innbefattet i sin helhet heri per referanse.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen er nyttig for å behandle lidelser hvor TNF αaktivitet er skadelig ved å inhibere human TNF α-aktivitet med subkutan to-ukentlig administrasjon av et anti-TNF α-antistoff slik at lidelsen blir behandlet hvor lidelsen er reumatoid artritt, og hvor sammensetningen administreres som angitt i krav 1.

Det aktuelle anti-TNF α-antistoffet administreres sammen med metotreksat slik at lidelsen blir behandlet. I et aspekt blir metotreksat administrert sammen med anti-TNF α-antistoffet. I et annet aspekt blir metotreksat administrert før administrasjonen av anti-TNF α-antistoffet. I enda et annet aspekt blir metotreksat administrert etterfølgende administrasjonen av anti-TNF α-antistoffet.

Til tider blir det aktuelle anti-TNF α-antistoffet benyttet for å behandle lidelser hvor TNF α-aktivitet er skadelig. Enda mer foretrukket opptrer behandling med toukentlig subkutan administrasjon av et isolert, humant antistoff eller en antigenbindende del derav. Antistoffet dissosierer fortrinnsvis fra human TNF α med en a Kd på 1 x 10-8 M eller mindre og en Koff hastighetskonstant på 1 x 10-3 s-1 eller mindre, begge bestemt med overflate plasmonresonans, og nøytraliserer human TNF α cytotoksisitet i et standard in vitro L929-assay med en IC50 på 1 x 10-7 M eller mindre. Mer foretrukket dissosierer det isolerte, humane antistoff eller antigenbindende del derav fra human TNF α med en Koff på 5 x 10-4 s-1 eller mindre, eller enda mer foretrukket, med en Koff på 1 x 10-4 s-1 eller mindre. Mer foretrukket nøytraliserer det isolerte, humane antistoff eller antigenbindende del derav, human TNF α cytotoksisitet i et standard in vitro L929-assay med en IC50 på 1 x 10-8 M eller mindre, enda mer foretrukket med en IC50 på 1 x 10-9 M eller mindre og enda mer foretrukket, med en IC50 på 1 x 10-10 M eller mindre.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen gjør det også mulig å behandle lidelser hvor TNF α-aktivitet er skadelig ved to-ukentlig subkutan administrasjon til individet av et humant antistoff eller antigenbindende del derav. Antistoffet eller den antigenbindende del derav, har fortrinnsvis de følgende særtrekk:

a) dissosierer fra human TNF α med en Koffpå 1 x 10-3 s-1 eller mindre som bestemt med overflate plasmonresonans;

b) har et lettkjede CDR3-domene som omfatter aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 3 eller modifisert fra SEQ ID nr. 3 med en enkel alaninsubstitusjon ved posisjon 1, 4, 5, 7 eller 8 eller ved en til fem konservative aminosyresubstitusjoner ved posisjoner 1, 3, 4, 6, 7, 8 og/eller 9;

c) har et tungkjede CDR3-domene som omfatter aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 4 eller modifisert fra SEQ ID nr. 4 med en enkel alaninsubstitusjon ved posisjon 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 eller 11 eller med en til fem konservative aminosyresubstitusjoner ved posisjoner 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 og/eller 12.

Mer foretrukket dissosierer antistoffet eller den antigenbindende del derav, fra human TNF α med en Koffpå 5 x 10-4 s-4 eller mindre. Enda mer foretrukket dissosierer antistoffet eller den antigenbindende del derav, fra human TNF α med en Koffpå 1 x 10-4 s-1 eller mindre.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen gjør det også mulig å behandle lidelser hvor TNF α-aktivitet er skadelig. Slik behandling innbefatter en to-ukentlig subkutan administrasjon til individet av et humant antistoff eller en antigenbindende del derav. Antistoffet eller den antigenbindende del derav, inneholder fortrinnsvis et LCVR som har CDR3-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 3 eller modifisert fra SEQ ID nr. 3 med en enkel alaninsubstitusjon ved posisjon 1, 4, 5, 7 eller 8, og med et HCVR som har et CDR3-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 4 eller modifisert fra SEQ ID nr. 4 med en enkel alaninsubstitusjon ved posisjon 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 eller 11. Mer foretrukket har LCVR videre et CDR2-domene som omfatter aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 5 og HCVR har videre et CDR2-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 6. Enda mer foretrukket har LCVR videre CDR1-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 7 og HCVR har et CDR1-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr.

8.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen gjør det også mulig å behandle lidelser hvor TNF α-aktivitet er skadelig ved subkutant å administrere til individet to-ukentlig et isolert, humant antistoff eller en antigenbindende del derav. Antistoffet eller den antigenbindende del derav inneholder fortrinnsvis et LCVR omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 1 og et HCVR omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 2. I visse utførelsesformer har antistoffet en IgG1 tungkjede konstant område eller et IgG4 tungkjede konstant område. I enda ytterligere utførelsesformer er antistoffet et Fab-fragment, et F(ab’)2-fragment eller et enkeltkjede Fv-fragment.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen gjør det også mulig å behandle lidelser hvor administrasjonen av et anti-TNF α-antistoff er gunstig ved subkutant å administrere til individet to-ukentlig, et eller flere anti-TNF α-antistoff som angitt i krav 1. Antistoffet inneholder fortrinnsvis et LCVR som har CDR3-domene omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID nr. 3, SEQ ID nr. 11, SEQ ID nr. 12, SEQ ID nr. 13, SEQ ID nr. 14, SEQ ID nr. 15, SEQ ID nr. 16, SEQ ID nr. 17, SEQ ID nr. 18, SEQ ID nr. 19, SEQ ID nr. 20, SEQ ID nr. 21, SEQ ID nr. 22, SEQ ID nr. 23, SEQ ID nr. 24, SEQ ID nr. 25, SEQ ID nr. 26 eller med et HCVR som har et CDR3-domene omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID nr. 4, SEQ ID nr. 27, SEQ ID nr. 28, SEQ ID nr. 29, SEQ ID nr. 30, SEQ ID nr. 31, SEQ ID nr. 32, SEQ ID nr. 33, SEQ ID nr. 34 og SEQ ID nr. 35.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1A og 1B viser The American College of Rheumatology 20 (ACR20)- og ACR50-responser for pasienter som lider av reumatoid artritt (RA) etter subkutan dosering med antistoffet D2E7 hver uke over et totale på tolv uker (1A) eller subkutan dosering med antistoffet D2E7 og metotreksat hver annen uke (1B) over et totale på tjuefire uker. Disse data indikerer at dosering hver annen uke er like effektiv som dosering hver uke.

Figur 2 viser ACR20-, ACR50- og ACR70-responser for pasienter som lider av RA etter subkutan dosering med antistoffet D2E7 og metotreksat hver annen uke ved tjuefire uker.

Figur 3A og 3B viser tidsforløp av antall ømme ledd (3A) og antall ledd med hevelse (3B) over tjuefire uker for pasienter som lider av RA etter subkutan dosering med D2E7 og metotreksat hver annen uke ved tjuefire uker.

Figur 4 viser resultater fra en kortform helseovervåking (SF-36) fra pasienter som lider av RA etter subkutan dosering med antistoffet D2E7 og metotreksat hver annen uke ved tjuefire uker. RP, fysisk rolle; PF, fysisk funksjon; BP, kroppssmerte; GH, generell helse; V, vitalitet; SF, sosial funksjon; RE, emosjonell rolle og ME, mental helse.

Figur 5 viser prosentdelen av ACR-reaksjon etter en enkel intravenøs injeksjon av antistoffet D2E7 og metotreksat i pasienter som lider av RA.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår sammensetninger omfattende 40 mg av et isolert humant anti-TNFα antistoff for anvendelse ved behandling av reumatoid artritt hos et menneske, hvor sammensetningen skal administreres subkutant til personen i et to-ukentlig doseringsregime på 40 mg hver 14. dag, hvor nevnte humane antistoff har et lettkjede variabelt område (LCVR) omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID NO: 1, et tungkjede variabelt område (HCVR) omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID NO: 2, et IgG1 tungkjede konstant område og et kappa lettkjede konstant område, og hvor sammensetningen skal administreres i kombinasjon med metotreksat.

For at foreliggende oppfinnelse skal bli lettere forstått blir visse uttrykk først definert.

Uttrykket ”dosering” som benyttet heri, refererer til administrasjonen av en substans (f.eks. et anti-TNF α-antistoff) for å oppnå et terapeutisk mål (f.eks. behandlingen av en TNF α-assosiert lidelse).

Uttrykkene ”to-ukentlig doseringsregime” ”to-ukentlig dosering” og ”to-ukentlig administrasjon” som benyttet heri, refererer til tidsforløpet av administrasjonen av en substans (f.eks. et anti-TNF α-antistoff) til et individ for å oppnå et terapeutisk mål (f.eks. behandlingen av en TNF α-assosiert lidelse). Det to-ukentlige doseringsregimet er ikke ment å innbefatte et ukentlig doseringsregime. Foretrukket blir substansen administrert hver 9-19. dag, mer foretrukket hver 11.-17. dag, enda mer foretrukket, hver 13.-15. dag og mest foretrukket, hver 14. dag.

Uttrykket ”kombinasjonsterapi” som benyttet heri, refererer til administrasjonen av to eller flere terapeutiske substanser, f.eks. et anti-TNF α-antistoff og medikamentet metotreksat. Metotreksatet kan bli administrert samtidig med, før eller etter administrasjonen av et anti-TNF α-antistoff.

Uttrykket ”human TNF α” (forkortet heri som hTNF α eller enkelt hTNF), som benyttet heri, er ment å referere til et humant cytokin som eksisterer som en 17 kD utskilt form og en 26 kD membranassosiert form hvorav den biologiske aktive form består av en trimer av ikke kovalent bundne 17 kD-molekyler. Strukturen av TNF α er videre beskrevet i f.eks. Pennica, D., et al. (1984) Nature 312:724-729; Davis, J.M., et al. (1987) Biochemistry 26:1322-1326; og Jones, E.Y., et al. (1989) Nature 338:225-228. Uttrykket human TNF α er ment å innbefatte rekombinant human TNF α (rhTNF α), som kan bli fremstilt ved standard rekombinante ekspresjonsmetoder eller innkjøpt kommersielt (R & D Systems, katalog nr. 210-TA, Minneapolis, MN).

Uttrykket ”antistoff” som benyttet heri, er ment å referere til immunoglobulinmolekyler bestående av fire polypeptidkjeder, to tunge (H) kjeder og to lette (L) kjeder sammenbundet med hverandre via disulfidbindinger. Hver tunge kjede består av et tungkjede variabelt område (forkortet heri som HCVR eller VH) og et tungkjede konstant område. Det tunge kjede konstante området består av tre domener, CH1, CH2 og CH3. Hver lette kjede består av et lett kjede variabelt område (forkortet heri som LCVR eller VL) og et lett kjede konstant område. Det lette kjede konstante området består av at domene, CL. VH- og VL-områdene kan bli ytterligere delt i områder med hypervariabilitet betegnet komplementaritetsbestemmende områder (CDR) som er oppdelt med områder som er mer konserverte, betegnet rammeverkområder (FR). Hver VH og VL består av tre CDR og fire FR, arrangert fra aminoterminalen til karboksyterminalen i følgende rekkefølge: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Uttrykket ”antigenbindende del” av et antistoff (eller enkelt ”antistoffdel”), som benyttet heri, refererer til et eller flere fragmenter av et antistoff som opprettholder egenskapen spesifikt å binde til et antigen (f.eks. hTNF α). Det har blitt vist at den antigenbindende funksjon av et antistoff kan bli utført med fragmenter fra et fulllengdet antistoff. Eksempler på bindende fragmenter omfattet innenfor uttrykket ”antigenbindende del” av et antistoff innbefatter (i) et Fab-fragment, et monovalent fragment bestående av VL-, VH-, CL- og CH1-domenene, (ii) et F(ab’)2-fragment, et bivalent fragment bestående av to Fab-fragmenter bundet med en disulfidbro ved hengselsområdet, (iii) et Fd-fragment bestående av VH- og CH1-domenene, (iv) et Fv-fragment bestående av VL- og VH-domenene av en enkel arm av et antistoff, (v) et dAb-fragment fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546) som består av et VH-domene, og (vi) et isolert komplementaritetsbestemmende område (CDR). Videre, selv om de to domener av Fv-fragmentet, VL og VH, er kodet for at separate gener kan de bli forbundet med hverandre ved å bruke rekombinante metoder med en syntetisk linker som tillater dem å bli dannet som en enkel proteinkjede hvor VL- og VH-områdene pardanner for å danne monovalente molekyler (kjent som enkeltkjedet Fv (scFv), se f.eks. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; og Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Slike enkeltkjedede antistoff er også ment å være omfattet innenfor området ”antigenbindende del” av et antistoff. Andre former av enkeltkjedede antistoff, så som diastoff, er også omfattet. Diastoff er bivalente, bispesifikke antistoff hvor VH- og VL-domenene er uttrykt på en enkel polypeptidkjede, men ved å bruke en linker som er for kort til å tillate pardannelse mellom de to domener på samme kjede, for derved å tvinge domenene til å pardanne med komplementaritetsdomenene av en annen kjede, og danne to antigenbindende seter (se f.eks. Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Enda videre kan et antistoff eller antigenbindende del derav, være del av et større immunoadhesjonsmolekyl dannet ved kovalent eller ikke-kovalent assosiasjon av et antistoff eller antistoffdel med et eller flere andre proteiner eller peptider. Eksempler på slike immunoadhesjonsmolekyler innbefatter anvendelse av streptavidin kjerneområde for å danne et tetramert scFv molekyl (Kipriyanov, S.M., et al.

(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) samt anvendelse av et cysteinresiduum, et markørpeptid og en C-terminal polyhistidinmarkør for å danne bivalente og biotinylerte scFv-molekyler (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Antistoffdeler, så som Fab og F(ab’)2-fragmenter, kan bli fremstilt fra hele antistoff ved å bruke konvensjonelle teknikker, så som henholds vis papain- eller pepsinspaltning av hele antistoff. Videre kan antistoff, antistoffdeler og immunoadhesjonsmolekyler bli fremstilt ved å bruke standard rekombinante DNA-teknikker som beskrevet heri.

Uttrykket ”humant antistoff” som benyttet heri, er ment å innbefatte antistoff som har variable og konstante områder avledet fra humane kjønnscelle immunoglobulinsekvenser. De humane antistoff kan innbefatte aminosyreresiduer ikke kodet av humane kjønnscelle immunoglobulinsekvenser (f.eks. mutasjoner innført ved tilfeldig eller setespesifikk mutagenese in vitro eller ved somatisk mutasjon in vivo), f.eks. i CDR og spesielt CDR3. Imidlertid er uttrykket ”humant antistoff” som benyttet heri, ikke ment å innbefatte antistoff hvor CDR-sekvensene er avledet fra kjønnscellene hos en annen pattedyrart, så som en mus, har blitt podet inn i humane rammeverksekvenser.

Uttrykket ”rekombinant humant antistoff” som benyttet heri, er ment å innbefatte alle humane antistoff som blir fremstilt, uttrykt, dannet eller isolert på rekombinant måte, så som antistoff uttrykt ved å bruke en rekombinant ekspresjonsvektor transfektert i en vertscelle (beskrevet ytterligere i del II nedenfor), antistoff isolert fra et rekombinant, kombinatorisk humant antistoffbibliotek (beskrevet ytterligere i del III nedenfor), antistoff isolert fra et dyr (f.eks. en mus) som er transgent for humane immunoglobulingener (Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res.

20:6287-6295) eller antistoff fremstilt, uttrykt, dannet eller isolert på enhver annen måte som involverer spleising av humane immunoglobulin gensekvenser til andre DNA-sekvenser. Slike rekombinante, humane antistoff har variable og konstante områder avledet fra humane kjønnscelle immunoglobulinsekvenser. I visse utførelsesformer blir imidlertid slike rekombinante, humane antistoff utsatt for in vitro mutagenese (eller når et dyr som er transgent for humane Ig-sekvenser, blir brukt in vivo somatisk mutagenese) og således er aminosyresekvensene av VH- og VL-områdene av de rekombinante antistoff sekvenser som, selv om de er avledet fra og relatert til humane kjønnscelle VH- og VL-sekvenser, ikke naturlig behøver å eksistere innenfor det humane antistoff kjønnscellerepertoar in vivo.

Et ”isolert antistoff” som benyttet heri, er ment å referere til et antistoff som i hovedsak er fritt for andre antistoff som har forskjellige antigeniske spesifisiteter (f.eks. et isolert antistoff som spesifikt binder hTNF α, er i hovedsak fritt for antistoff som spesifikt binder antigener som er forskjellige fra hTNF α). Et isolert antistoff som spesifikt binder hTNF α kan imidlertid ha kryssreaktivitet med andre antigener, så som hTNF α-molekyler fra andre arter (diskutert i større detalj nedenfor). Videre kan et isolert antistoff i hovedsak være fritt for annet cellulært materiale og/eller kjemikalier.

Et ”nøytraliserende antistoff” som benyttet heri, (eller et ”antistoff som nøytraliserer hTNF α-aktivitet”) er ment å referere til et antistoff hvis binding til hTNF α resulterer i inhibering av den biologiske aktivitet av hTNF α. Denne inhibering av den biologiske aktivitet av hTNF α kan bli undersøkt ved å måle en eller flere indikatorer for biologisk hTNF α-aktivitet, så som hTNF α-indusert cytotoksisitet (enten in vitro eller in vivo), hTNF α-indusert cellulær aktivering og hTNF α-binding til hTNF αreseptorer. Disse indikatorer for biologisk hTNF α-aktivitet kan bli undersøkt med et eller flere standard in vitro eller in vivo assays som er kjent innen faget (se eksempel 4). Fortrinnsvis blir egenskapen hos et antistoff til å nøytralisere hTNF α-aktivitet undersøkt ved inhibering av hTNF α-indusert cytotoksisitet på L929-celler. Som en ytterligere eller alternativ parameter av hTNF α-aktivitet kan egenskapen til et antistoff til å inhibere hTNF α-indusert ekspresjon av ELAM-1 på HUVEC som et mål på hTNF α-indusert cellulær aktivering, bli undersøkt.

Uttrykket ”overflate plasmonresonans” som benyttet heri, refererer til et optisk fenomen som tillater analyse av biospesifikke interaksjoner i samtid ved påvisning av endringer i proteinkonsentrasjoner innen en biosensormatrise, f.eks. ved å bruke BIAcore-systemet (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sverige og Piscataway, NJ). For videre beskrivelser se eksempel 1 og Jönsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin.

51:19-26; Jönsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; og Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

Uttrykket ”Koff” som benyttet heri, er ment å referere til av-hastighetskonstanten for dissosiasjon av et antistoff fra antistoff/antigenkomplekset.

Uttrykket ”Kd” som benyttet heri, er ment å referere til dissosiasjonskonstanten av en spesiell antistoff-antigen-interaksjon.

Uttrykket ”nukleinsyremolekyl” som benyttet heri, er ment å innbefatte DNA-molekyler og RNA-molekyler. Et nukleinsyremolekyl kan være enkeltkjedet eller dobbeltkjedet, men er fortrinnsvis dobbeltkjedet DNA.

Uttrykket ”isolert nukleinsyremolekyl” som benyttet heri, under henvisning til nukleinsyrer som koder for antistoff eller antistoffdeler (f.eks. VH, VL, CDR3) som binder hTNF α, er ment å referere til et nukleinsyremolekyl hvor nukleotidsekvensene som koder for antistoffet eller antistoffdelen, er fri for andre nukleotidsekvenser som koder for antistoff eller antistoffdeler som binder antigener andre enn hTNF α, hvilke andre sekvenser naturlig kan flankere nukleinsyren i humant genomisk DNA. Således inneholder en isolert nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, som koder for et VH-område av et anti-hTNF α -antistoff ingen andre sekvenser som koder for andre VH-områder som binder antigener andre enn hTNF α.

Uttrykket ”vektor” som benyttet heri, er ment å referere til et nukleinsyremolekyl som er i stand til å transportere en annen nukleinsyre til hvilken den har blitt bundet. En type vektor er et ”plasmid” som refererer til en sirkulær dobbeltkjedet DNA-løkke i hvilken ytterligere DNA-segmenter kan bli ligert. En annen type vektor er en viral vektor hvor ytterligere DNA-segmenter kan bli ligert inn i det virale genom. Visse vektorer er i stand til autonom replikasjon i en vertscelle inn i hvilken de har blitt innført (f.eks. bakterielle vektorer som har et bakterielt replikasjonsstartpunkt og episomale pattedyrvektorer). Andre vektorer (f.eks. ikke-episomale pattedyrvektorer) kan bli integrert i genomet hos en vertscelle ved introduksjon i vertscellen og blir derved replikert sammen med vertsgenomet. Videre er visse vektorer i stand til å dirigere ekspresjonen av gener til hvilke de er operativt forbundet. Slike vektorer blir referert til heri som ”rekombinante ekspresjonsvektorer” (eller enkelt ”ekspresjonsvektorer”). Generelt er ekspresjonsvektorer som er anvendelige i rekombinante DNA-teknikker ofte i form av plasmider. I foreliggende beskrivelse kan ”plasmid” eller ”vektor” bli benyttet om hverandre ettersom plasmidet er den vanligst brukte form for vektor. Imidlertid er uttrykket ment å innbefatte andre slike former for ekspresjonsvektorer, så som virale vektorer (f.eks. replikasjonsdefektive retrovirus, adenovirus og adenoassosierte virus) som har tilsvarende funksjoner.

Uttrykket ”rekombinant vertscelle” (eller enkelt ”vertscelle”) som benyttet heri, er ment å referere til en celle inn i hvilken den rekombinante ekspresjonsvektor har blitt innført. Det bør bli forstått at slike uttrykk er ment å referere ikke bare til en spesiell, aktuell celle, men til avkommet fra en slik celle. Fordi visse modifikasjoner kan inntreffe i etterfølgende generasjoner grunnet enten mutasjon eller miljømessige påvirkninger, behøver slikt avkom faktisk ikke å være identisk med opphavscellen, men er fremdeles innbefattet innenfor omfanget av uttrykket ”vertscelle” som benyttet heri.

Forskjellige aspekter av oppfinnelsen er beskrevet i større detalj i de følgende avsnitt.

I. Humane antistoff som binder humant TNF α

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer sammensetninger for å behandle lidelser hvor administrasjonen av et anti-TNF α-antistoff er gunstig. Disse behandlinger innbefatter to-ukentlig subkutan administrasjonen av isolerte, humane antistoff som angitt i krav 1 som binder til human TNF α med høy affinitet, en lav spaltningshastighet og høy nøytraliserende kapasitet. Fortrinnsvis er de humane antistoff rekombinante, nøytraliserende, humane anti-hTNF α-antistoff. Det mest foretrukne rekombinante, nøytraliserende antistoff ifølge oppfinnelsen, blir referert til heri som D2E7 (aminosyresekvensen av D2E7 VL-området er vist i SEQ ID nr. 1, aminosyresekvensen av D2E7 VH-område er vist i SEQ ID nr. 2). Egenskapene av D2E7 har blitt beskrevet i Salfeld et al., U.S. patent nr. 6.090.382.

I et aspekt angår oppfinnelsen en sammensetning for å behandle lidelser hvor administrasjonen av et anti-TNF α-antistoff er gunstig. Disse behandlinger innbefatter den to-ukentlige, subkutane administrasjon av D2E7-antistoff, D2E7-relaterte antistoff og andre humane antistoff med ekvivalente egenskaper som D2E7 med sammensetning som angitt i krav 1, så som høyaffinitetsbinding til hTNF α med lav dissosiasjonskinetikk og høy nøytraliserende kapasitet. I en utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen en sammensetning med et slikt isolert humant antistoff, som dissosierer fra humant TNF α med en Kdpå 1 x 10-8 M eller mindre og en Koffhastighetskonstant på 1 x 10-3 s-1 eller mindre, begge bestemt med overflate plasmonresonans og nøytraliserer human TNF α cytotoksisitet i et standard in vitro L929-assay med en IC50på 1 x 10-7 M eller mindre. Mer foretrukket dissosierer det isolerte, humane antistoff fra human TNF α med en Koffpå 5 x 10-4 s-1 eller mindre, eller enda mer foretrukket, med en Koffpå 1 x 10-4 s-1 eller mindre. Mer foretrukket nøytraliserer det isolerte, humane antistoff eller antigenbindende del derav, human TNF αcytotoksisitet i et standard in vitro L929-assay med en IC50på 1 x 10-8 M eller mindre, enda mer foretrukket med en IC50på 1 x 10-9 M eller mindre og enda mer foretrukket med en IC50på 1 x 10-10 M eller mindre.

Det er velkjent innen faget at antistoff tunge- og lettkjede CDR3-domener spiller en viktig rolle i bindingsspesifisiteten/affiniteten av et antistoff for et antigen. Følgelig angår oppfinnelsen i et annet aspekt, sammensetninger for å behandle reumatoid artritt hvor administrasjonen av et anti-TNF α antistoff er gunstig ved subkutan administrasjon av slike humane antistoff som har sen dissosiasjonskinetikk for assosiasjon med hTNF α og som har lette og tunge CDR3 kjededomener som strukturelt er identiske med eller relatert til dem av D2E7. Posisjon 9 av D2E7 VL CDR3 kan bli opptatt av Ala eller Thr uten vesentlig påvirkning av Koff. Følgelig omfatter et konsensusmotiv av D2E7 VL CDR3 aminosyresekvensen: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID nr. 3). I tillegg kan posisjon 12 av D2E7 VH CDR3 være opptatt av Tyr eller Asn uten vesentlig å påvirke Koff. Følgelig omfatter et konsensusmotiv for D2E7 VH CDR3 aminosyresekvensen: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID nr. 4). Videre, som vist i eksempel 2, er CDR3-domenet av D2E7 tunge og lette kjeder mottakelig for substitusjon med et enkelt alaninresiduum (ved posisjon 1, 4, 5, 7 eller 8 innen VL CDR3 eller ved posisjon 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 eller 11 innen VH CDR3) uten vesentlig å påvirke Koff. Enda videre vil fagpersonen forstå at gitt manipuleringsvilligheten av D2E7 VL og VH CDR3-domenene for substitusjoner med alanin, kan substitusjon av andre aminosyrer innen CDR3-domenene være mulige mens det fremdeles opprettholdes en lav av-hastighetskonstant for antistoffet, spesielt substitusjoner med konservative aminosyrer. En ”konservativ aminosyresubstitusjon” som benyttet heri, er en hvor et aminosyreresiduum blir erstattet med et annet aminosyreresiduum som har en lignende sidekjede. Familier av aminosyreresiduer som har lignende sidekjeder, har blitt definert innen faget, innbefattende basiske sidekjeder (f.eks. lysin, arginin, histidin), sure sidekjeder (f.eks. asparaginsyre, glutaminsyre), uladede, polare sidekjeder (f.eks. glysin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tyrosin, cystein), ikke-polare sidekjeder (f.eks. alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalamin, metionin, tryptofan), betaforgrenede sidekjeder f.eks. treonin, valin, isoleucin) og aromatiske sidekjeder (f.eks. tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Fortrinnsvis blir ikke mer enn en til fem konservative aminosyresubstitusjoner foretatt innen D2E7 VL og/eller VH CDR3-domenene. Mer foretrukket blir ikke mer enn en til tre konservative aminosyresubstitusjoner foretatt innen D2E7 VL og/eller VH CDR3-domenene. I tillegg bør konservative aminosyresubstitusjoner ikke bli foretatt ved aminosyreposisjoner som er kritiske for binding til hTNF α. Posisjoner 2 og 5 av D2E7 VL CDR3 og posisjoner 1 og 7 av D2E7 VH CDR3 synes å være kritiske for interaksjon med hTNF α og således blir konservative aminosyresubstitusjoner fortrinnsvis ikke foretatt ved disse posisjoner (selv om en alaninsubstitusjon ved posisjon 5 av D2E7 VL CDR3 er aksepterbar, som beskrevet ovenfor) (se U.S. patent nr. 6.090.382).

Følgelig fremskaffer, i en annen utførelsesform, oppfinnelsen sammensetninger for å behandle reumatoid artritt hvor administrasjonen av et anti-TNF α-antistoff er gunstig ved to-ukentlig, subkutan administrasjon av et isolert, humant antistoff eller antigenbindende del derav. Antistoffet eller den antigenbindende del derav, inneholder fortrinnsvis de følgende særtrekk:

a) dissosierer fra human TNF α med en Koffhastighetskonstant på 1 x 10-3 s-1 eller mindre, som bestemt med overflate plasmonresonans;

b) har et lettkjede CDR3-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 3 eller modifisert fra SEQ ID nr. 3 med en enkel alaninsubstitusjon ved posisjon 1, 4, 5, 7 eller 8 eller med en til fem konservative aminosyresubstitusjoner ved posisjoner 1, 3, 4, 6, 7, 8 og/eller 9;

c) har et tungkjede CDR3-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 4 eller modifisert fra SEQ ID nr. 4, med en enkel alaninsubstitusjon ved posisjon 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 eller 11, eller med en til fem konservative aminosyresubstitusjoner ved posisjoner 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 og/eller 12.

Mer foretrukket dissosierer antistoffet fra human TNF α med en Koffpå 5 x

10-4 s-1 eller mindre. Enda mer foretrukket dissosierer antistoffet fra humant TNF α med en Koffpå 1 x 10-4 s-1 eller mindre.

I enda en annen utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen sammensetninger for å behandle reumatoid artritt hvor administrasjonen av et anti-TNFα-antistoff er gunstig ved to-ukentlig subkutan administrasjon av et isolert humant antistoff sammen med metotreksat. Antistoffet eller den antigenbindende del derav inneholder fortrinnsvis et lettkjede variabelt område (LCVR) som har et CDR3-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 3, eller modifisert fra SEQ ID nr. 3 med en enkel alaninsubstitusjon ved posisjon 1, 4, 5, 7 eller 8, og med et tungkjede variabelt område (HCVR) som har et CDR3-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 4, eller modifisert fra SEQ ID nr. 4 med en enkel alaninsubstitusjon ved posisjon 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 eller 11. Fortrinnsvis har LCVR videre et CDR2-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 5 (dvs. D2E7 VL CDR 2) og HCVR har videre et CDR2-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr.

6 (dvs. D2E7 VH CDR 2). Enda mer foretrukket har LCVR videre CDR1-domene om fattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 7 (dvs. D2E7 VL CDR1) og HCVR har et CDR1-domene omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 8 (dvs. D2E7 VH CDR1). Rammeverkområdene for VL er fortrinnsvis fra VĸI human kjønnscellefamilien med foretrukket fra A20 human kjønnscelle Vk-gen og mest foretrukket fra D2E7 VL rammeverksekvensene vist i figurer 1A og 1B av U.S. patent nr.

6.090.382. Rammeverkområdene for VH er fortrinnsvis fra VH3 human kjønnscellefamilien, mer foretrukket fra DP-31 human kjønnscelle VH-gen og mest foretrukket fra D2E7 VH rammeverksekvensene visst i figurer 2A og 2B i U.S. patent nr.

6.090.382.

I enda en annen utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen sammensetninger for å behandle reumatoid artritt hvor administrasjonen av et anti-TNFα-antistoff som angitt i krav 1 er gunstig ved to-ukentlig subkutan administrasjon av et slikt isolert humant antistoff. Antistoffet inneholdende fortrinnsvis et lettkjede variabelt område (LCVR) omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 1 (dvs. D2E7 VL) og et tungkjede variabelt område (HCVR) omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID nr.

2 (dvs. D2E7 VH). Det tungkjede konstante område er et IgG1 tungkjede konstant område. Videre kan antistoffet omfatte et lettkjede konstant område, enten et kappalettkjede konstant område eller et lambdalettkjede konstant område. Fortrinnsvis omfatter antistoffet et kappalettkjede konstant område.

I atter andre utførelsesformer fremskaffer oppfinnelsen sammensetninger for å behandle reumatoid artritt hvor administrasjonen av et anti-TNFα-antistoff som angitt i krav 1 er gunstig ved to-ukentlig subkutan administrasjon av et slikt isolert humant antistoff. Antistoffet eller den antigenbindende del derav inneholder fortrinnsvis D2E7-relaterte VL og VH CDR3-domener, f.eks. antistoff eller antigenbindende deler derav, med et lettkjede variabelt område (LCVR) som har et CDR3-domene omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen omfattende SEQ ID nr. 3, SEQ ID nr. 11, SEQ ID nr. 12, SEQ ID nr. 13, SEQ ID nr. 14, SEQ ID nr. 15, SEQ ID nr.

16, SEQ ID nr. 17, SEQ ID nr. 18, SEQ ID nr. 19, SEQ ID nr. 20, SEQ ID nr. 21, SEQ ID nr. 22, SEQ ID nr. 23, SEQ ID nr. 24, SEQ ID nr. 25 og SEQ ID nr. 26 eller med et tungkjede variabelt område (HCVR) som har et CDR3-domene omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID nr. 4, SEQ ID nr. 27, SEQ ID nr. 28, SEQ ID nr. 29, SEQ ID nr. 30, SEQ ID nr. 31, SEQ ID nr. 32, SEQ ID nr. 33, SEQ ID nr. 34 og SEQ ID nr. 35.

Et antistoff benyttet i sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan bli derivatisert eller bundet til et annet funksjonelt molekyl (f.eks. et annet peptid eller protein). Følgelig er disse antistoffene ment å innbefatte derivatiserte og på annen måte modifiserte former av de humane anti-hTNFα-antistoff beskrevet heri, innbefattende immunoadhesjonsmolekyler. For eksempel kan et slikt antistoff bli funksjonelt bundet (ved kjemisk kobling, genetisk fusjon, ikke-kovalent assosiasjon eller på annen måte) til en eller flere andre molekylære enheter, så som et annet antistoff (f.eks. et bispesifikt antistoff eller et diastoff), et påviselig middel, et cytotoksisk middel, et farmasøytisk middel, og/eller et protein eller peptid som kan fremme assosiasjon av antistoffet eller antistoffdelen med et annet molekyl (så som et streptavidin kjerneområde eller en polyhistidinmarkør).

En type derivatisert antistoff blir dannet ved å kryssbinde to eller flere antistoff (av samme type eller av forskjellige typer, f.eks. for å danne bispesifikke antistoff). Passende kryssbinderer innbefatter slike som er heterobifunksjonelle, som har to distinkt reaktive grupper avskilt med en passende avstandsgruppe (f.eks. mmaleimidobenzoyl-N-hydroksysuksimidester) eller homobifunksjonell forbindelse (f.eks. disuksinimidylsuberat). Slike sammenbindende bindere er tilgjengelige fra Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

Anvendelige påviselige midler med hvilket et antistoff benyttet i sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan bli derivatisert, innbefatter fluorescente forbindelser. Eksempelvise fluorescente påviselige midler innbefatter fluorescin, fluourescinisotiocyanat, rodamin, 5-dimetylamin-1-naftalensulfonylklorid, fykoerytrin og lignende. Et antistoff kan også bli derivatisert med påviselige enzymer, så som alkalisk fosfatase, pepperrot peroksidase, glukoseoksidase og lignende. Når et antistoff er derivatisert med et påviselig enzym, blir dette påvist ved å tilsette ytterligere reagenser som enzymet bruker for å danne et påviselig reaksjonsprodukt. For eksempel når det påviselige middel pepperrot-peroksidase er til stede, fører tilsetningen av hydrogenperoksid og diaminobenzidin til et farget reaksjonsprodukt, som er påviselig. Et antistoff kan også bli derivatisert med biotin, og påvist via indirekte måling av avidin eller streptavidinbinding.

II. Ekspresjon av antistoff

Et antistoff benyttet i sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt ved rekombinant ekspresjon av immunoglobulin lett- og tungkjede gener i en vertscelle.

For å uttrykke et antistoff rekombinant, blir en vertscelle transfektert med en eller flere rekombinante ekspresjonsvektorer som bærer DNA-fragmenter som koder for de aktuelle immunoglobulin lette og tunge kjeder av antistoffer slik at de lette og tunge kjeder blir uttrykt i vertscellen og, fortrinnsvis skilt ut i mediet hvor vertscellene blir dyrket, fra hvilket medium antistoffene kan bli gjenvunnet. Standard rekombinante DNA-metoder blir benyttet for å oppnå antistoff tunge- og lettekjede gener ved å inkorporere disse gener i rekombinante ekspresjonsvektorer og innføre vektorene i vertsceller, så som dem beskrevet i Sambrook, Fritsch og Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, annen utgave, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1989), og i U.S. patent nr. 4.816.397 til Boss et al.

For å uttrykke D2E7 eller et D2E7-relatert antistoff blir DNA-fragmenter som koder for de lette- og tungekjede variable områder først fremskaffet. Disse DNA-materialene kan bli dannet ved amplifikasjon og modifikasjon av kjønnscelle lette og tunge variable kjedesekvenser ved å bruke polymerasekjedereaksjonen (PCR). Kjønnscelle DNA-sekvenser for humane tunge og lette variable kjedeområdegener er kjent innen faget (se f.eks. ”Vbase” human kjønnslinjesekvens database; se også Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, femte utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr.

91-3242; Tomlinson, I.M., et al. (1992) ”The Repertoire of Human Germline VHSequences Reveals about Fifty Groups of VHSegments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227: 776-798; og Cox, J.P.L. et al. (1994) ” A Directory of Human Germ-line V78Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836). For å oppnå et DNA-fragment som koder for et tungkjede variabelt område av D2E7, eller et D2E7-relatert antistoff blir et medlem av VH3-familien av humane kjønnscelle VH-gener amplifikert med standard PCR. Mer foretrukket blir DP-31 VH-kjønnslinjesekvensen amplifikert. For å oppnå et DNA-fragment som koder for det lette kjede variable område av D2E7, eller et D2E7-relatert antistoff blir et medlem av VĸI-familien av humane kjønnscelle VL-gener amplifikert med standard PCR. Mest foretrukket blir A20 VL kjønnscellesekvensen amplifikert. PCR-primere er egnet for anvendelse i amplikasjon av DP-31-kjønnscelle VH og A20-kjønnscelle VL-sekvenser kan bli utformet basert på nukleotidsekvensene beskrevet i referansene angitt ovenfor ved å bruke standard metoder.

Når kjønnscelle VH- og VL-fragmentene er oppnådd, kan disse sekvenser bli mutert til å kode for D2E7 eller de D2E7-relaterte aminosyresekvensene beskrevet heri.

Aminosyresekvensene kodet av kjønnscelle VH og VL DNA-sekvensene blir først sammenlignet med D2E7 eller D2E7-relaterte VH og VL-aminosyresekvenser for å identifisere aminosyreresiduer i den D2E7 eller D2E7-relaterte sekvens som er forskjellige fra kjønnscelle. Derpå blir de passende nukleotider av kjønnscelle DNA-sekvensene mutert slik at de muterte kjønnscellesekvenser koder for den D2E7 eller D2E7-relaterte aminosyresekvens, ved å bruke den genetiske kode til å bestemme hvilke nukleotidendringer som bør bli foretatt. Mutagenese av kjønnscellesekvensene utføres med standard metoder, så som PCR-mediert mutagenese (hvor de muterte nukleotider blir inkorporert i PCR-primerne slik at PCR-produktet inneholder mutasjonene) eller seterettet mutagenese.

Når DNA-fragmenter som koder for D2E7 eller D2E7-relaterte VH- og VL-segmenter er oppnådd (ved amplikasjon og mutagenese av kjønnscelle VH- og VL-gener, som beskrevet ovenfor), kan disse DNA-fragmenter bli ytterligere manipulert med standard rekombinante DNA-teknikker, f.eks. for å omdanne de variable områdegener til antistoff kjedegener av full lengde til Fab-fragmentgener eller til et scFV-gen. I disse manipulasjoner blir et VL- eller VH-kodende DNA-fragment operativt forbundet til et annet DNA-fragment som koder for et annet protein, så som et antistoff konstant område eller en fleksibel linker. Uttrykket ”operativt forbundet”, som benyttet til denne sammenheng, er ment å bety at de to DNA-fragmenter blir føyd sammen slik at aminosyresekvensene kodet av de to DNA-fragmenter forblir i leseramme.

Det isolerte DNA som koder for VH-området kan bli omdannet til et tungkjede-gen med full lengde ved operativt å forbinde det VH-kodende DNA til et annet DNA-molekyl som koder for tungkjede konstante områder (CH1, CH2 og CH3). Sekvensene av humane tungkjede konstante områdegener er kjent innen faget (se f.eks. Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, femte utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr. 91-3242) og DNA-fragmenter som omfatter disse områder kan bli oppnådd med standard PCR-amplifikasjon. Det tungkjede konstante området er et IgG1 konstant område. For et Fab-fragment tungkjede gen kan det VH-kodende DNA bli operativt forbundet til et annet DNA-molekyl som koder for kun det tungkjede CH1 konstante område.

Det isolerte DNA som koder for VL-området kan bli omdannet til et full-lengdet lettkjede-gen (så vel som et Fab lettkjede-gen) ved operativt å forbinde det VLkodende DNA til et annet DNA-molekyl som koder for det lettkjede konstante område CL. Sekvensene av human lettkjede konstante områdegener er velkjent innen faget (se f.eks. Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, femte utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr. 91-3242) og DNA-fragmenter som omfatter disse områder kan bli oppnådd med standard PCR-amplikasjon. Det lettkjede konstante området kan være et kappa eller lambda konstant område, men er mest foretrukket et kappa konstant område.

For å danne et scFV-gen, blir de VH- og VL-kodende DNA-fragmenter operativt forbundet til et annet fragment som koder i fleksibel linker, f.eks. som koder for aminosyresekvensen (Gly4-Ser)3, slik at VH- og VL-sekvensene kan bli uttrykt som et sammenhengende enkeltkjede protein, med VL og VH-områdene sammenbundet av den fleksible linker (se f.eks. Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554).

For å uttrykke antistoffene benyttet i sammensetningen ifølge oppfinnelsen, blir DNA-sekvenser som koder for delvise eller fullengdede lette og tunge kjeder oppnådd som beskrevet ovenfor, satt i inn ekspresjonsvektorer slik at genet er operativt forbundet til transkripsjonelle og translasjonelle kontrollsekvenser. I denne sammenheng er uttrykket ”operativt forbundet” ment å bety at et antistoffgen er ligert inn i en vektor slik at de transkripsjonelle og translasjonelle kontrollsekvenser innenfor vektoren oppfyller sin tiltenkte funksjon med å regulere transkripsjonen og translasjonen av antistoffgenet. Ekspresjonsvektoren og ekspresjonskontrollsekvensene er valgt til å være kompatible med den anvendte uttrykkende vertscelle. Antistoff lettkjede-genet og antistoff tungkjede-genet kan bli satt inn i separate vektorer, men blir mer typisk satt inn i samme ekspresjonsvektor. Antistoffgenene settes inn i ekspresjonsvektoren med standard metoder (f.eks. ligering av komplementære restriksjonsseter på antistoffgen-fragmentet og vektoren, eller buttendet ligering dersom intet restriksjonssete er til stede). Før innsetning av D2E7 eller D2E7-relaterte lette eller tunge kjedesekvenser, kan ekspresjonsvektoren allerede bære antistoff konstante områdesekvenser. For eksempel er en tilnærmingsmåte til å omdanne D2E7 eller D2E7-relaterte VH- og VL-sekvenser til fullengdede antistoffgener å sette dem inn i ekspresjonsvektorer som allerede koder for henholdsvis tungkjede konstante og lettkjede konstante områder, slik at VH-segmentet er operativt forbundet til CH-segment(ene) innenfor vektoren og VL-segmentet er operativt forbundet til CL-segmentet innenfor vektoren. I tillegg eller alternativt, kan den rekombinante ekspresjonsvektor kode for et signalpeptid som letter utskillelse av antistoffkjeden fra vertscellen. Antistoff kjedegenet kan bli klonet inn i vektoren slik at signalpeptidet er bundet i leseramme til aminoterminalen av antistoff kjedegenet. Signalpeptidet kan være et immunoglobulin signalpeptid eller et heterologt signalpeptid (det vil si et signalpeptid fra et ikke-immunoglobulinprotein).

I tillegg til antistoff kjedegenene bærer de aktuelle rekombinante ekspresjonsvektorer regulatoriske sekvenser som kontrollerer ekspresjonen av antistoff kjedegener i en vertscelle. Uttrykket ”regulatorisk sekvens” er ment å innbefatte promoterer, forsterkere og andre ekspresjons kontrollelementer (f.eks. polyadenyleringssignaler) som kontrollerer transkripsjonen eller translasjonen av antistoffkjedegenene. Slike regulatoriske sekvenser er f.eks. beskrevet i Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Det vil bli forstått av fagpersonen at utformingen av ekspresjonsvektoren, innbefattende utvelgelsen av regulatoriske sekvenser, kan avhenge av slike faktorer som valg av vertscellen som skal bli transformert, nivået av ekspresjon av det ønskede protein, etc. Foretrukne regulatoriske sekvenser for pattedyr vertscelle-ekspresjon innbefatter virale elementer som delegerer høye nivåer av proteinekspresjon i pattedyrceller, så som promoterer og/eller forsterkere avledet fra cytomegalovirus (CMV) (så som CMV promoter/forsterker), Simian Virus 40 (SV40) (så som SV40 promoter/forsterker), adenovirus (f.eks. adenovirus sen hovedpromoter (AdMLP)), og polyoma. For ytterligere beskrivelse av regulatoriske virale elementer, og sekvenser derav, se f.eks. US patent nr. 5.168.062 til Stinski, U.S. patent nr.

4.510.245 til Bell et al. og U.S. patent nr. 4.968.615 til Schaffner et al.

I tillegg til antistoff kjedegenene og regulatoriske sekvenser, kan de aktuelle rekombinante ekspresjonsvektorer bære ytterligere sekvenser, så som sekvenser som regulerer replikasjon av vektoren i vertsceller (f.eks. replikasjons startpunkt) og utvelgbare markørgener. Det utvelgbare gen letter utvelgelse av vertsceller inn i hvilken vektoren har blitt innført (se f.eks. U.S. patent nr. 4.399.216, 4.634.665 og 5.179.017, alle tilhørende Axel et al.). For eksempel gir typisk det utvelgbare markørgen resistens mot medikamenter, så som G418, hygromycin eller metotreksat, til en vertscelle innen hvilke vektoren har blitt innført. Foretrukne utvelgbare markørgener innbefatter dihydrofolat reduktase (DHFR) genet (for anvendelse i dhfrvertsceller med metotreksat utvelgelse/amplifikasjon) og neo-genet (for G418-utvelgelse).

For ekspresjon av lette og tunge kjeder blir ekspresjonsvektoren(e) som koder for det lette og tunge kjeder transfektert i en vertscelle med standard teknikker. De forskjellige former av uttrykket ”transfeksjon” er ment å omfatte en mengde teknikker som vanligvis benyttes for innføringen av eksogent DNA i en prokaryot eller eukaryot vertscelle, f.eks. elektorporering, kalsiumfosfatutfelling, DEAE-dekstran transfeksjon og lignende. Selv om det er teoretisk mulig å uttrykke de aktuelle antistoffene i enten prokaryote eller eukaryote vertsceller, er ekspresjonen av antistoff i eukaryote celler, og mest foretrukket pattedyrvertsceller, det mest foretrukne fordi slike eukaryote celler, og spesielt pattedyrceller er mer sannsynlige enn prokaryote celler til å sette sammen og skille ut et riktig foldete og immunologisk aktive antistoff. Prokaryotekspresjon av antistoffgener har vært rapport å være ineffektivt for produksjon av høye utbytter av aktivt antistoff (Boss, M.A. og Wood, C.R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

Foretrukne pattedyr vertsceller for ekspresjon av de aktuelle rekombinante antistoff innbefatter Kinesisk Hamster ovarier (CHO-celler) (innbefattende dhfr—CHO-celler, beskrevet i Urlaub og Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, benyttet med en DHFR utvelgbar markør, f.eks. som beskrevet i R.J. Kaufman og P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), NSO-myelomceller, COS-celler og SP2-celler. Når rekombinante ekspresjonsvektorer som koder antistoffgener blir innført i pattedyr vertsceller, blir antistoffene dannet ved å dyrke vertscellene over en tidsperiode som er tilstrekkelig til å tillate ekspresjon av antistoffet i vertscellene, eller mer foretrukket, utskillelse av antistoffet i dyrkningsmediet, hvori vertscellene blir dyrket. Antistoffer kan bli gjenvunnet fra dyrkningsmediet ved å bruke standard proteinopprenskningsmetoder.

Vertsceller kan også bli brukt for å danne deler av intakte antistoff, så som Fabfragmenter eller scFV-molekyler. Det vil bli forstått at variasjoner av de ovennevnte prosedyrer ligger innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan det være ønskelig å transfektere en vertscelle med DNA som koder for enten den lette kjede eller den tunge kjede (men ikke begge deler) av et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Rekombinant DNA-teknologi kan også bli brukt for å fjerne noe eller alt av DNA-materiale som koder for enten en eller begge av de lette og tunge kjeder som ikke er nødvendig for binding til hTNFα. I tillegg kan bifunksjonelle antistoff bli dannet hvor en tung og en lett kjede er et antistoff og den andre tunge og lette kjede er spesifikke for et antigen som er forskjellig fra hTNFα ved kryssbinding av et antistoff til et andre antistoff med standard kjemiske kryssbindingsmetoder.

I et foretrukket system for rekombinant ekspresjon av et antistoff benyttet i sammensetningen ifølge oppfinnelsen, blir en rekombinant ekspresjonsvektor som koder for både den antistoff tunge kjede og den antistoff lette kjede innført i dhfr-CHO-celler med kalsiumfosfatmediert transfeksjon. Inne i den rekombinante ekspresjonsvektor er de antistoff tunge og lette kjedegener hver operativt forbundet til CMV forsterker/AdMLP-promoter regulatoriske elementer for å drive høye nivåer av transkripsjon av genene. Den rekombinante ekspresjonsvektor bærer også et DHFR-gen som tillater for utvelgelse av CHO-celler som har blitt transfektert med vektoren ved å bruke metotreksatutvelgelse/-amplifikasjon. De utvalgte transformante vertsceller blir dyrket for å tillate ekspresjon av de antistoff tunge og lette kjeder og intakt antistoff gjenvinnes fra dyrkningsmediet. Standard molekylære biologiteknikker blir brukt for å danne den rekombinante ekspresjonsvektor, transfektere vertscellene, velge ut for transformanter, dyrking av vertscellene og gjenvinning av antistoffet fra dyrkingsmediet.

III. Utvelgelse av rekombinante, humane antistoff

Rekombinante, humane antistoff benyttet i sammensetningene ifølge oppfinnelsen, i tillegg til D2E7 eller en antigenbindende del derav, eller D2E7-relaterte antistoff beskrevet heri, kan bli isolert ved undersøkelse av et rekombinant, kombinatorisk antistoffbibliotek, fortrinnsvis et scFv fagoppvisningsbibliotek fremstilt ved å bruke humane VL og VH cDNA fremstilt fra mRNA avledet fra humane lymfocytter. Metoder for fremstilling og undersøkelse av slike bibliotek er kjent innen faget. I tillegg til kommersielt tilgjengelige sett for å danne fagoppvisningsbibliotek (f.eks.

Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, katalog nr. 27-9400-01 og Stratagene SurfZAPTM fagoppvisningssett, katalog nr. 240612), eksempler på metoder og reagenser som er spesielt egnet for anvendelse ved dannelse og undersøkelse av antistoff oppvisningsbibliotek, kan f.eks. bli funnet i Ladner et al. U.S. patent nr.

5.223.409; Kang et al. PCT-publikasjon nr. WO 92/18619; Dower et al. PCT-publikasjon nr. WO 91/17271; Winter et al. PCT-publikasjon nr. WO 92/20791; Markland et al. PCT-publikasjon nr. WO 92/15679; Breitling et al. PCT-publikasjon nr. WO 93/01288; McCafferty et al. PCT-publikasjon nr. WO 92/01047; Garrard et al. PCT-publikasjon nr. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; og Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982.

I en foretrukket utførelsesform for å isolere humane antistoff med høy affinitet og en lav avkoblingshastighetskonstant for hTNF α blir et murint anti-hTNF α�antistoff som har en høy affinitet og en lav avkoblingshastighetskonstant for hTNF α (f.eks. MAK 195 som er hybridomet som har deponeringsnummer ECACC 87 050801) først brukt til å velge ut humane tunge og lette kjedesekvenser som har lignende bindingsaktivitet overfor hTNF α ved å bruke epitopmerkemetoden beskrevet i Hoogenboom et al., PCT-publikasjon nr. WO 93/06213. Antistoffbibliotekene benyttet i denne metode er fortrinnsvis scFv-bibliotek fremstilt som beskrevet i McCafferty et al., PCT-publikasjon nr. WO 92/01047, McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; og Griffiths et al., (1993) EMBO J 12:725-734. scFv antistoffbibliotekene blir fortrinnsvis undersøkt ved å bruke rekombinant TNF α som antigenet.

Når initiale, humane VL- og VH-segmenter er valgt ut, blir ”bland og tilpass” forsøkt hvor forskjellige par av de initialt utvalgte VL- og VH-segmenter blir undersøkt for hTNF α-binding utført for å velge ut foretrukne VL/VH parkombinasjoner. I tillegg, for ytterligere å forbedre affiniteten og/eller senke avkoblingshastighetskonstanten for hTNF α-binding kan VL- og VH-segmentene av de foretrukne VL-/VH-par bli tilfeldig mutert, fortrinnsvis innen CDR3-området av VH og/eller VL i en prosess som er analog med den in vivo somatiske mutasjonsprosess som er ansvarlig for affinitetsmodning av antistoff i løpet av en naturlig immunrespons. Denne in vitro affinitetsmodning kan bli oppnådd ved å amplifikere VH- og VL-områder ved å bruke PCR-primere som er komplementære med henholdsvis VH CDR3 eller VL CDR3, hvilke primere har blitt ”tilført” en tilfeldig blanding av de fire nukleotidbaser ved visse posisjoner slik at de resulterende PCR-produkter koder for VH- og VL-segmenter inn i hvilke tilfeldige mutasjoner har blitt innført i VH og/eller VL CDR3-områdene. Disse tilfeldig muterte VH- og VL-segmenter kan bli undersøkt på nytt for binding til hTNF α og sekvenser som oppviser høy affinitet og en lav avkoblingshastighet for hTNF α-binding kan bli valgt ut.

Etter undersøkelse og isolering av et anti-hTNF α-antistoff, fra et rekombinant immunoglobulinoppvisningsbibliotek kan nukleinsyrer som koder for utvalgte antistoff bli gjenvunnet fra oppvisningspakken (f.eks. fra fag-genomet) og subklonet i andre ekspresjonsvektorer med standard rekombinante DNA-teknikker. Om ønsket kan nukleinsyren bli videre manipulert for å danne andre antistofformer ifølge oppfinnelsen, (f.eks. bundet til nukleinsyre som koder for ytterligere immunoglobulindomener, så som ytterligere konstante områder). For å uttrykke et rekombinant, humant antistoff isolert ved utvelgelse fra et kombinatorisk bibliotek blir det DNA som koder for antistoffet klonet inn i en rekombinant ekspresjonsvektor og innført i pattedyrvertsceller som beskrevet i ytterligere detalj i del II ovenfor.

IV. Farmasøytiske sammensetninger og farmasøytisk administrasjon

De aktuelle antistoffene kan bli inkorporert i farmasøytiske sammensetninger som er egnet for administrasjon til et individ for metodene beskrevet heri, f.eks. toukentlig subkutan dosering. Typisk omfatter den farmasøytiske sammensetning et antistoff metotreksat og et farmasøytisk akseptabelt bæremateriale. Som benyttet heri innbefatter ”farmasøytisk akseptabelt bæremateriale” ethvert og alle oppløsningsmidler, dispersjonsmedier, belegg, antibakterielle og antifungale midler, isotone og absorpsjonsforsinkende midler og lignende som er fysiologisk kompatible og er egnet for administrasjon til et individ for metodene beskrevet heri. Eksempler på farmasøytisk akseptable bærematerialer innbefatter en eller flere av vann, fysiologisk saltvann, fosfatbufret fysiologisk saltvann, dekstrose, glyserol, etanol og lignende så vel som kombinasjoner derav. I mange tilfeller vil det være foretrukket å innbefatte isotone midler, f.eks. sukkere, polyalkoholer, så som mannitol, sorbitol eller natriumklorid i sammensetningen. Farmasøytisk akseptable bærematerialer kan videre omfatte mindre mengder av tilleggsstoffer, så som fuktende eller emulgerende midler, preservativer eller buffere som øker oppbevaringstiden eller effektiviteten av antistoffet eller antistoffdelen.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan være i en mengde former. Disse innbefatter f.eks. flytende, semifaste og faste doseringsformer, så som flytende oppløsninger (f.eks. injiserbare og infuserbare oppløsninger som skal administreres subkutant til personen i et to-ukentlig doseringsregime på 40 mg hver 14. dag, eksempelvis i form av dispersjoner eller suspensjoner, og liposomer).

Terapeutiske sammensetninger kan typisk være sterile og stabile under forhold ved fremstilling og lagring. Sammensetningen kan bli formulert som en oppløsning, mikroemulsjon, dispersjon, liposom eller annen ordnet struktur som er egnet for høy medikamentkonsentrasjon. Sterile, injiserbare oppløsninger kan bli fremstilt ved å inkorporere den aktive forbindelse (det vil si antistoff) i den krevde mengde i et passende oppløsningsmiddel med et eller en kombinasjon av ingredienser som er oppsummert ovenfor etter behov fulgt av filtrert sterilisering. Generelt blir dispersjoner fremstilt ved å inkorporere den aktive forbindelse i en steril vehikkel som inneholder et grunnleggende dispersjonsmedium og de nødvendige andre bestanddeler fra dem oppsummert ovenfor. I tilfellet med sterile pulvere for fremstillingen av sterile injiserbare oppløsninger, er de foretrukne fremstillingsmetoder, vakuumtørking og frysetørking som gir et pulver av den aktive bestanddel pluss enhver annen ønsket ingrediens fra en på forhånd sterilfiltrert oppløsning derav. Den passende fluiditet av en oppløsning kan bli opprettholdt f.eks. ved bruken av et belegg, så som lecitin, ved fremstillingen av den ønskede partikkelstørrelse i tilfelle med dispersjon og ved anvendelse av overflateaktive midler. Forlenget absorpsjon av injiserbare sammensetninger kan bli fremskaffet ved å inkludere i sammensetningen et middel som forsinker absorpsjon, f.eks. monostearatsalter og gelatin.

De aktuelle antistoffene kan bli administrert via subkutan injeksjon. Slik det vil bli forstått av fagpersonen vil administrasjonsruten og/eller måten være avhengig av de ønskede resultater. I visse utførelsesformer kan den aktive forbindelse bli fremstilt med bæremateriale som vil beskytte forbindelsen mot rask frigjøring. Bionedbrytbare biokompatible polymerer kan bli brukt, så som etylenvinylacetat, polyetylenglykol (PEG), polyanhydrider, polyglykolsyrer, kollagen, polyortoestere og polyeddiksyre. Mange metoder for fremstilling av slike formuleringer er patentert eller generelt kjent for fagpersonen. Se f.eks. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Supplementære aktive forbindelser kan også bli inkorporert i sammensetningene. I visse utførelsesformer blir et aktivt antistoff formulert samtidig med og/eller administrert samtidig med et eller flere andre ytterligere terapeutiske midler. For eksempel kan et slikt anti-hTNF α -antistoff bli ko-formulert og/eller ko-administrert med metotreksat, et eller flere ytterligere antistoff som binder andre målmaterialer (f.eks. antistoff som binder andre cytokiner eller som binder celleoverflatemolekyler), et eller flere cytokiner, oppløselig TNF α-reseptor (se f.eks. PCT-publikasjon nr. WO 94/06476) og/eller et eller flere kjemiske midler som inhiberer hTNF α-produksjon eller aktivitet (så som cykloheksanylidenderivater som beskrevet i PCT-publikasjon nr. WO 93/19751). Videre kan et eller flere slike antistoff bli brukt i kombinasjon med to eller flere av de foregående terapeutiske midler. Slike kombinasjonsterapier kan fortrinnsvis anvende lavere doseringer av de administrerte, terapeutiske midler for således å unngå mulige toksisiteter eller komplikasjoner assosiert med de forskjellige monoterapier. Bruken av de aktuelle antistoffene, i kombinasjon med andre terapeutiske midler, er diskutert videre i underdel IV.

Ikke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for reumatoid artritt hvormed et antistoff kan bli kombinert, innbefatter de følgende: ikke-steroide antiinflammatoriske medikament(er) (NSAIDs); cytokine suppressive anti-inflammatoriske medikament(er) (CSAIDs); CDP-571/BAY-10-3356 (humanisert anti-TNF αantistoff; Celltech/Bayer); cA2 (chimerisk anti-TNF α -antistoff; Centocor); 75 kdTNFR-IgG (75 kD TNF reseptor-IgG fusjonsprotein; Immunex; se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (55 kD TNF reseptor-IgG fusjonsprotein; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (ikke-fjernende primatisert anti-CD4 antistoff; IDEC/SmithKline; se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, S185); DAB 486-IL-2 og/eller DAB 389-IL-2 (IL-2 fusjonsproteiner; Seragen; se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); Anti-Tac (humanisert anti-IL-2R α; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (anti-inflammatorisk cytokin; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; rekombinant IL-10, anti-inflammatorisk cytokin; DNAX/Schering); IL-4; IL-10 og/eller IL-4 agonister (f.eks. agonist antistoff); IL-1RA (IL-1 reseptorantagonist; Synergen/Amgen); TNF-bp/s-TNFR (oppløselig TNF-bindende protein; se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, s. 37-42); R973401 (fosfodiesterase Type IV inhibitor; se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S282); MK-966 (COX-2 Inhibitor; se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S81); Iloprost (se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S82); metotreksat; talidomid (se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S282) og talidomide-relaterte medikamenter (f.eks. Celgen); leflunomid (anti-inflammatorisk og cytokin inhibitor; se f.eks.

Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, s. 103-107); tranexaminsyre (inhibitor for plasminogenaktivering; se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S284); T-614 (cytokin-inhibitor; se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S282); prostaglandin E1 (se f.eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S282); Tenidap (ikke-steroid antiinflammatorisk medikament; se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S280); Naproxen (ikke-steroid anti-inflammatorisk medikament; se f.eks., Neuro Report (1996) Vol. 7, s. 1209-1213); Meloxicam (ikke-steroid antiinflammatorisk medikament); Ibuprofen (ikke-steroid anti-inflammatorisk medikament); Piroxicam (ikke-steroid anti-inflammatorisk medikament); Diclofenac (ikkesteroid anti-inflammatorisk medikament); Indomethacin (ikke-steroid antiinflammatorisk medikament); Sulfasalazin (se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S281); Azathioprin (se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S281); ICE inhibitor (inhibitor av enzymet interleukin-1β konverterende enzym); zap-70 og/eller lck inhibitor (inhibitor for tyrosin kinase zap-70 eller lck); VEGF-inhibitor og/eller VEGF-R-inhibitor (inhibitorer for vaskulær endotelialcelle vekstfaktor eller vaskulær endotelialcelle vekstfaktor reseptor; inhibitorer for angiogenese); kortikosteroide anti-inflammatoriske medikamenter (f.eks. SB203580); TNF-konvertaseinhibitorer; anti-IL-12 antistoff; interleukin-11 (se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S296); interleukin-13 (se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S308); interleukin-17-inhibitorer (se f.eks. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, nr. 9 (supplement), S120); gull; penicillamin; klorokin; hydroksyklorokin; klorambucil; cyklofosfamid; cyklosporin; total lymfoid bestråling; antitymocyttglobulin; anti-CD4 antistoff; CD5-toksiner; oralt administrerte peptider og kollagen; dinatrium lobenzarit; Cytokine regulerende midler (CRAs) HP228 og HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1 antisens fosforotioat oligodeoksynukleotider (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); oppløselig komplement reseptor 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); prednison; orgotein; glycosaminoglykan polysulfat; minocyklin; anti-IL2R antistoff; marine og botaniske lipider (fiske- og plantefrøfettsyrer; se f.eks. DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); auranofin; fenylbutazon; meklofenaminsyre; flufenaminsyre; intravenøs immunglobulin; zileuton; mykofenolsyre (RS-61443); takrolimus (FK-506); sirolimus (rapamycin); amiprilose (terafektin); kladribin (2-klordeoksyadenosin); og azaribin.

De farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen, kan innbefatte en ”terapeutisk effektiv mengde” eller en ”profylaktisk effektiv mengde” av et antistoff eller antistoffdel ifølge oppfinnelsen. En ”terapeutisk effektiv mengde” refererer til en mengde som er effektiv ved doser og over tidsperioder som er nødvendige for å oppnå det ønskede terapeutiske resultat. En terapeutisk effektiv mengde av antistoffet eller antistoffdelen kan variere ifølge faktorer, så som sykdomsstadium, alder, kjønn og vekt av individet og egenskapen til antistoffet eller antistoffdelen til å fremskaffe en ønsket respons hos individet. En terapeutisk effektiv mengde er også en hvor alle toksiske eller skadelige effekter av antistoffet eller antistoffdelen blir overskygget av de terapeutisk gunstige resultater. En ”profylaktisk effektiv mengde” refererer til en mengde som er effektiv ved dose og over slike tidsperioder som er nødvendige for å oppnå det ønskede profylaktiske resultat. Typisk, siden en profylaktisk dose blir benyttet i individer før eller ved et tidligere stadium av sykdommen, vil den profylaktisk effektive mengde være mindre enn den terapeutisk effektive mengde.

Doseringsregimer kan bli justert for å gi den optimale, ønskede respons (f.eks. en terapeutisk eller profylaktisk respons). For eksempel kan en enkel bolus bli administrert, flere oppdelte doser kan bli administrert over tid eller dosen kan bli forholdsmessig redusert eller øket som indikert av forholdene ved den terapeutiske situasjon. Det er spesielt fordelaktig å formulere parenterale sammensetninger i enhetsdoseringsform for letthet ved administrasjon og uniformitet av doseringen. Enhetsdoseform som benyttet heri, refererer til fysisk, diskrete enheter som regnet som enhetsdoser for pattedyrindividene som skal behandles hvor hver enhet inneholder en på forhånd bestemt mengde av aktiv forbindelse utregnet til å gi den ønskede, terapeutiske effekt i assosiasjon med det nødvendige farmasøytiske bæremateriale. Spesifikasjonen for enhetsdoseformene er diktert av og direkte avhengig av (a) de enestående karakteristika av den aktive forbindelse og den spesielle terapeutiske eller profylaktiske effekt som skal bli oppnådd og (b) begrensningene som er iboende innen faget for å utforme en slik aktiv forbindelse til behandling av sensitivitet i individer.

Et område for en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde av et antistoff er omkring 40 mg.

V. Anvendelser av de aktuelle antistoffene

Gitt deres egenskap å binde til hTNF α kan anti-hTNF α-antistoffene bli brukt til å påvise hTNF α (f.eks. i en biologisk prøve, så som serum eller plasma) ved å bruke et konvensjonelt immunoassay, så som et enzymtilknyttet immunosorbentassay (ELISA), eller radioimmunoassay (RIA) eller vevsimmunohistokjemi. Det er således mulig å påvise hTNF α i en biologisk prøve omfattende å sette en biologisk prøve i kontakt med et slikt antistoff, og påvise enten antistoffet bundet til hTNF α eller ubundet antistoff for derved å påvise hTNF α i den biologiske prøven. Antistoffet er direkte eller indirekte merket med et påvisbart stoff for å lette påvisningen av det bundne eller ubundne antistoff. Egnede påvisbare stoff inkluderer forskjellige enzymer, prostetiske grupper, fluorescente materialer, luminiscente materialer og radioaktive materialer. Eksempler på egnede enzymer inkluderer pepperrot peroksidase, alkalinfosfatase, β-galaktosidase eller acetylcholinesterase, eksempler på egnede prostetiske gruppekomplekser innbefatter streptavidin/biotin og avidin/ biotin, eksempler på egnede fluorescente materialer innbefatter umbelliferon, fluorescein, fluorescein isotiocyanat, rodamin, diklortriazinylamin, fluorescein, dansyl klorid eller fykoerytrin, et eksempel på et luminiscent materiale innbefatter luminol og eksempler på egnede radioaktive materialer innbefatter 125I, 131I, 35S eller 3H.

Alternativt til merking av antistoffet kan hTNF α bli påvist i biologiske vesker med et konkurrerende immunoassay som benytter rhTNF α-standarder merket med en påviselig substans og et umerket anti-hTNF α-antistoff. I dette assay blir den biologiske prøve, de merkede rhTNF α-standarder og anti-hTNF α-antistoffet kombinert og mengden av merket rhTNF α-standard bundet til det umerkede antistoff blir bestemt. Mengden av hTNF α i den biologiske prøve er inverst proporsjonal med mengden av merket hTNF α-standard som er bundet til anti-hTNF α-antistoffet.

Et D2E7 antistoff kan også bli brukt til å påvise TNF α fra arter andre enn mennesker, spesielt TNF α fra primater (f.eks. sjimpanser, bavianer, marmoset, cynomologer og resus), gris og mus siden D2E7 kan binde til ethvert av disse TNF α-typer.

Antistoffene er i stand til å nøytralisere hTNF α-aktivitet både in vitro og in vivo (se U.S. patent nr. 6.090.382). Videre kan minst enkelte av antistoffene, så som D2E7, nøytralisere hTNF α-aktivitet fra andre arter. Følgelig kan antistoffene bli brukt til å inhibere hTNF α-aktivitet, f.eks. i en cellekultur inneholdende hTNF α i mennesker eller i andre pattedyr som har TNF α med hvilke et slikt antistoff kryssreagerer (f.eks. sjimpanse, bavian, marmoset, cynomologer og resus, gris eller mus). Det er således mulig å inhibere TNF α-aktivitet omfattende å sette TNF α i kontakt med et slikt antistoff, slik at TNF α-aktivitet blir inhibert. Foretrukket er TNF α-materialet human TNF α. For eksempel kan, i en cellekultur inneholdende eller mistenkt for å inneholde TNF α, et slikt antistoff bli tilsatt til dyrkingsmediet for å inhibere TNF αaktivitet i kulturen.

I en foretrukket utførelsesform blir antistoffet administrert subkutant i et toukentlig skjema, og foretrukket subkutant før, i løpet av eller etter administrasjon av metotreksat. Fortrinnsvis er individet et menneske. Alternativt kan individet være et pattedyr som uttrykker en TNF α med hvilket et aktuelt antistoff kryssreagerer. Enda videre kan individet være et pattedyr inn i hvilket det har blitt introdusert hTNF α (f.eks. ved administrasjon av hTNF α) eller ved ekspresjon av et hTNF αtransgen. Et aktuelt antistoff ifølge oppfinnelsen, kan bli administrert til et menneske for terapeutiske formål (diskutert videre nedenfor).

Foreliggende oppfinnelse er ytterligere illustrert av de følgende eksempler.

Behandling med et anti-TNF α-antistoff

D2E7-effektivitet etter subkutan administrasjon

I foreliggende studium ble tjuefire pasienter med aktiv RA behandlet med ukentlige doser på 0,5 mg/kg D2E7 (n=18) eller placebo (n=6) med s.c. injeksjon over tre måneder. Pasienter som deltok i dette studium hadde en gjennomsnittlig sykdomsvarighet på 10,1 år med en sykdomsaktivitetsverdi (DAS) på 4,87 og et gjennomsnitt på 3,4 DMARD (sykdomsmodifiserende anti-revmatiske medikamenter) før studiets inngang, noe som igjen reflekterer stor sykdomsaktivitet. De som reagerte på behandlingen fortsatte åpen etikettbehandling med D2E7, mens pasienter som ikke reagerte på 0,5 mg/kg-dosen eller som tapte en DAS-respons på 0,5 mg/kgdosen ble opptrappet til å motta 1 mg/kg ved s.c. injeksjon etter uke 12 av studien.

De første pasienter som ble innskrevet mottok opptil seksti injeksjoner og var følgelig seksti uker på det undersøkte medikament. Effektiviteten med s.c. dosering var lik i.v. injeksjoner. Opptil 78 % av pasienter nådde en DAS- og ACR20-respons i løpet av de første uker av behandlingen. Subkutan D2E7 ved en dose på 0,5 mg/kg/uke reduserte en leddhevelse (SWJ)-verdi med 54 %, øm leddverdi (TJC) med 61 % og CRP med 39 % over tolv uker sammenlignet med basislinjen, mens alle parametre økte i placebogruppen. Etter avslutning av den placebokontrollerte periode av dette studium fortsatte pasientene behandling i opptil fjorten måneder med vedvarende effektivitet. Disse resultater indikerer at subkutan D2E7 ved en dose på 0,5 mg/kg/uke følgelig kan bli sikkert selvadministrert med en god lokal tolerabilitet.

Administrasjon av D2E7 og metotreksat

I dette studium mottok pasienter s.c. eller i.v. placebo eller D2E7 ved en dose på 1 mg/kg i tillegg til deres pågående behandling med (metotreksat) MTX. Femtifire pasienter ble lagt inn i studiet og atten pasienter mottok i.v. D2E7 og s.c. placebo, atten pasienter mottok i.v. placebo og s.c. D2E7 og atten pasienter mottok placebo i.v. og s.c. Pasientene mottok deres andre dose kun etter at de mistet sin blindresponsstatus, ikke tidligere enn fire uker etter den første dose. Deretter mottok alle pasienter åpenetikett to-ukentlige s.c. injeksjoner av D2E7.

Demografiske karakteristika av studiepopulasjonen i dette studium innbefattet en gjennomsnittlig varighet av RA på 11,1 år før eksponering til et gjennomsnitt på 3,6 DMARD (andre enn MTX) og en gjennomsnittlig DAS ved en studiumsinngang på 4,81. På dag tjueni hadde 72 % av i.v. D2E7-behandlede pasienter og 44 % av s.c. D2E7-behandlede pasienter oppnådd en respons per DAS-kriterium sammenlignet med kun 28 % av placebobehandlede pasienter (angitt i figur 5). Av de som reagerte i dette studium opprettholdt 28 % av placebobehandlede pasienter en ACR20-respons opptil dag 29, sammenlignet med 72 % av i.v.-behandlede D2E7-pasienter og 67 % av s.c.-behandlede D2E7-pasienter som opprettholdt sin reaksjon på mellom en og tre måneder.

Total kroppsdose av et subkutant administrert anti-TNF α-antistoff

Ukentlig, subkutan administrasjon av D2E7

Dette stadium omfattet tohundreogåttifire pasienter med RA og ble utformet til å bestemme den optimale totale kroppsdose av subkutant administrert D2E7. Pasienter ble randomisert til å motta enten 20, 40 eller 80 mg D2E7 eller placebo ukentlig over tolv uker, hvorpå placebobehandlede pasienter ble byttet blindt til 40 mg D2E7/uke.

Omtrent 49 % av pasienter nådde ACR20 ved 20 mg, 55 % av pasienter nådde ACR20 ved 40 mg og 54 % av pasienter nådde ACR20 ved 80 mg, mens kun 10 % av pasienter som mottok placebo nådde ACR20 (angitt i figur 1A). Omtrent 23 % av pasienter nådde ACR50 ved 20 mg, 27 % av pasienter nådde ACR50 ved 40 mg og 20 % av pasienter nådde ACR50 ved 80 mg og kun 2 % av pasienter som mot tok placebo nådde ACR50. Disse data illustrerer at subkutan D2E7, spesielt ved en dose på 40 mg/uke, gir en god respons.

To-ukentlig, subkutan administrasjon av et anti-TNF α-antistoff

To-ukentlig, subkutan administrasjon av D2E7

De kliniske effekter, sikkerhet, immunogenisitet og toleranse av RA-pasienter med partielle responser overfor MTX etter annenhver uke subkutane (s.c.) injeksjoner av placebo eller D2E7 ved flere dosenivåer opptil tjuefire uker i sammenheng med fortsatt MTX-behandling ble undersøkt.

Studiumsutforming

Et placebokontrollert, dobbeltblindt, randomisert, multisenter studium i pasienter med RA som hadde utilstrekkelig effektivitet eller tolerabilitet overfor MTX ble utført. I løpet av forsøksforløpet ble pasienter fortsatt på en stabil dose av MTX med doseområder angitt i inklusjonskriteriene beskrevet nedenfor.

Dette studium besto av to deler: 1) en ”utvaskingsperiode” på fire uker før administrasjonen av den første dose medikament under hvilken tid DMARD (bortsett fra for MTX) ble holdt tilbake, og 2) en ”placebokontrollert periode” under hvilken tid pasienter ble randomisert til en av fire grupper på sekstisyv pasienter til å motta placebo, 20, 40 eller 80 mg D2E7 (som en total kroppsdose) gitt annenhver uke s.c. i opptil 24 uker. Hver dose av studiumsmedikament ble administrert som to s.c. injeksjoner på 1,6 ml hver. Pasientenes første dose ble administrert av medisinsk personell som del av pasientens trening. Etterfølgende doser ble selvadministrert av pasienten med studiet under direkte observasjon av trenet personell i de første fire uker. Deretter ble doser administrert utenfor studieområdet av pasienten, et trenet individ utpekt av pasienten eller av medisinsk personell. Medisinering i fire til fem uker ble utført etter hver kliniske undersøkelse. Pasienter ble undersøkt serielt i uke en, to, tre, fire, seks, åtte, tolv, seksten, tjue og tjuefire av studien hvor leddundersøkelser ble utført av en utenforstående vurderer uavhengig av den behandlende lege.

Dette studium inkluderte tohundreogsyttien pasienter med RA. Denne studiumspopulasjonen var representativ for den moderate til alvorlige RA-populasjon i NordAmerika: omtrent 70 % kvinner og i hovedsak over 40-års alder. Populasjonen ble valgt ved å bruke på forhånd bestemte inklusjons- og eksklusjonskriterier som er kjent for fagpersonen, f.eks. må en pasient ha fått en diagnose av RA som definert av de 1987-reviderte American College of Rheumatology (ACR)-kriterier (angitt i vedlegg A).

Resultater

Figur 1B og 2-4 indikerer at subkutan, to-ukentlig D2E7-behandling kombinert med metotreksat var vesentlig bedre enn placebo til å redusere tegnene og symptomene på RA ved tjuefire uker. Alle tre doser av D2E7 var statistisk signifikant mer effektive enn placebo gitt ukentlig. Videre hadde D2E7 ved 40 mg og 80 mg bedre effektivitet enn 20 mg dosen.

VEDLEGG A

ACR-definisjon av RA

De tre kriterier og funksjoner for reumatoid artritt (RA) ifølge 1987-klassifiseringen

*En pasient er hevdet å ha RA dersom han/hun er innbefattet i en av de 5RA undersett opplistet i tabell 7 og har en klinisk diagnose på RA av sin lege. Kriterium 1, 2 og 3 må ha vært til stede i minst 6 uker.

Arthritis & Rheumatism, Vol. 31, nr. 3 (mars 1988).

Claims

Patentkrav

1. Sammensetning omfattende mengden 40 mg av et isolert humant anti-TNFα antistoff for anvendelse ved behandling av reumatoid artritt hos et menneske, hvor sammensetningen skal administreres subkutant til personen i et to-ukentlig doseringsregime på 40 mg hver 14. dag, hvor nevnte humane antistoff har et lettkjede variabelt område (LCVR) omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID NO: 1, et tungkjede variabelt område (HCVR) omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID NO: 2, et IgG1 tungkjede konstant område og et kappa lettkjede konstant område, og hvor sammensetningen skal administreres i kombinasjon med metotreksat.