NO341491B1 - Sammensetninger omfattende ornitin og fenylacetat eller fenylbutyrat for å behandle hepatisk encefalopati - Google Patents

Abstract

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av ornitin i fremstilling av et medikament for anvendelse i kombinasjon med minst en av fenylacetat og fenylbutyrat for å forebygge eller behandle leverdekompensasjon eller hepatisk encefalopati. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av minst en av fenylacetat og fenylbutyrat i fremstilling av et medikament for anvendelse i kombinasjon med ornitin for å forebygge eller behandle leverdekompensasjon eller hepatisk encefalopati.

Description

Område for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører forebygging eller behandling av hyperammonemi ved kronisk leversykdom eller leversvikt ved anvendelse av ornitin i kombinasjon med minst én av fenylacetat og fenylbutyrat, som angitt i krav 1.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Kronisk leversykdom karakteriseres ved den gradvise ødeleggelsen av levervev over tid, hvorved friskt og regenererende levervev sakte erstattes med arr- og nekrotisk vev. Dette er kjent som leverchirrose. Normal leverfunksjon forringes og arrvevet reduserer progressivt blodgjennomstrømning gjennom leveren. Ettersom normalt regenererende levervev forsvinner, prosesseres ikke næringsstoffer, hormoner, legemidler og toksiner på en effektiv måte.

Dette kan resultere i symptomer inklusive unormal fjerning av proteiner absorbert gjennom fordøyelseskanalen, ledende til akkumulering av ammoniakk; unormal utskillelse, ledende til en akkumulering av bilirubin i blodet, produserende gulsott; økt sinusoidalt trykk, ledende til fluidakkumulering i abdomen (ascites); og portal hypertensjon (og portosystemisk skift) hvori arret levervev virker som en barriere for blodgjennomstrømning, ledende til økt portalt blodtrykk og spiserørsåreknuter.

Pasienter med kronisk leversykdom kan være i en relativt stabil klinisk tilstand og utvise få eller ingen symptomer. Dog har slike pasienter risiko for en plutselig forverring i sin tilstand, hvilket kan føre til akutt-på-kronisk leversvikt. Denne overgangen fra en “kompensert” tilstand, hvor leveren er i stand til å fungere, om enn ved et redusert nivå, til en “dekompensert” tilstand, hvor leverfunksjonen svikter, involverer effekten av utløsende hendelser. Utløsende hendelser forbundet med kronisk leversykdom innbefatter gastrointestinal blødning, infeksjon (sepsis), portal venetrombose og dehydrering.

For eksempel har 50 % av pasienter med leverchirrose spiserørsbyller og i en tredjedel av disse pasientene, vil spiserørsbyllene sprekke og forårsake gastrointestinal blødning innen to år etter diagnose (Grace ND (1992) Gastroenterol Clin North Am 21: 149-161). En øvre gastrointestinal blødning er kjent for å øke mottakeligheten for livstruende komplikasjoner slik som bakteriell peritonititt, sepsis, nyresvikt og hepatisk encefalopati (Teran et al. (1997) Gastroenterology 112: 473-482; Garden et al. (1985) Br J Surg 72: 91-95; Pauwels et al. (1996) Hepatology 24: 802-806; Bleichner et al. (1986) Br J Surg 73: 724-726) hvilket fører til død av omtrent 30 % av pasientene til tross for tilstrekkelig kontroll av blødningen (Grace 1992 supra).

Hepatisk encefalopati (HE) er en kompleks neuropsykiatrisk forstyrrelse som forekommer i forskjellige kliniske situasjoner slik som akutt eller kronisk leversykdom og spontan portosystemisk venøs skift. I de tidlige stadiene av hepatisk encefalopati forekommer subtile mentale endringer slik som dårlig konsentrasjon, forvirring og desorientering. I alvorlige tilfeller kan hepatisk encefalopati føre til stupor, koma, hjerneoppsvulming (cerebral ødem) og død. I tilfelle pasienter som utvikler HE som et resultat av kronisk leversykdom, er inntreden av HE ofte resultatet av en klinisk utløsende hendelse slik som gastrointestinal blødning, sepsis (infeksjon), portal venetrombose eller dehydrering.

Gastrointestinal blødning og portosystemisk skift tillater toksiske substanser, som vanligvis metaboliseres av leveren, til å forbigå leveren, gå inn i sirkulasjonssystemet og krysse blod-hjernebarrieren og utøve direkte eller indirekte nevrotoksiske effekter på sentralnervesystemet. Ammoniakkakkumulering antas å spille en viktig rolle ved fremskridelse av hepatisk encefalopati og multiorgansvikt (respiratorisk svikt, hjerte-kar–svikt, nyresvikt). I tillegg til ammoniakk er septikemi (eller bakteriell peritonititt), som utvikles raskt etter en gastrointestinal blødning, også sannsynligvis en bidraende faktor til hepatisk encefalopati.

Leverdekompensasjon kan deretter føre til multiorgansvikt og hepatisk encefalopati. I de tidlige stadiene av hepatisk encefalopati forekommer subtile mentale endringer slik som dårlig konsentrasjon eller den manglende evnen til å konstruere enkle objekter. I alvorlige tilfeller kan hepatisk encefalopati føre til stupor, koma, hjerneoppsvulming og død.

Prognosen for pasienter med kronisk leversykdom er vanskelig å estimere fordi tilstanden har mange årsaker. Preventative tiltak for å minimere progresjon fra den kompenserte tilstanden til den dekompenserte tilstanden innbefatter å unngå ytterligere kausative midler som vil forverre tilstanden, slik som totalavhold fra alkohol og vaksinering mot hepatitt A og B.

Dog, når leverdekompensasjon forekommer, reduseres mulighetene for overlevelse og levertransplantasjon er den eneste behandlingen som kan forlenge livet. Siden det er leverdekompensasjon som fører til en redusert forventet levealder, er det høyst ønskelig å forhindre leverdekompensasjon fra å forekomme.

En vanlig behandling for pasienter med hepatisk encefalopati involverer strategier for å redusere ammoniakkonsentrasjonen. Disse inkluderer restriksjon av kostholdsproteininntak; administrering av laktulose, neomycin, L-ornitin L-aspartat (LOLA), eller natriumbenzoat; og rensende klyster.

Sammenfatning av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelsen av ornitin og minst en av fenylacetat og fenylbutyrat for å forhindre eller behandle leverdekompensasjon eller hepatisk encefalopati (HE) i pasienter. Isoleucin kan også administreres til de pasientene som videre har en isoleucinmangel tilskrevet, f.eks., gastrointestinal blødning. Som det følger av dette tilveiebringer oppfinnelsen:

- anvendelse av ornitin innen fremstilling av et medikament for anvendelse i kombinasjon med minst én av fenylacetat og fenylbutyrat for å forebygge eller behandle leverdekompensasjon eller hepatisk encefalopati;

- anvendelse av minst én av fenylacetat og fenylbutyrat i fremstilling av et medikament for anvendelse i kombinasjon med ornitin for å forebygge eller behandle leverdekompensasjon eller hepatisk encefalopati;

- anvendelse av ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat i fremstilling av et medikament for å forebygge eller behandle leverdekompensasjon eller hepatisk encefalopati;

- produkter inneholdende ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat for samtidig, separat eller sekvensiell anvendelse for å forebygge eller behandle leverdekompensasjon eller hepatisk encefalopati;

- en farmasøytisk sammensetning omfattende ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat;

- et middel for å forebygge eller behandle leverdekompensasjon eller hepatisk encefalopati, omfattende ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser at neutrofilfunksjon endres i pasienter med chirrose og forverres med økende alvorlighet av leversykdom.

Figur 2 viser at ammoniakk reduserer neutrofil fagocyttose.

Figur 3 viser at ammoniakk reduserer neutrofil kjemotaksis.

Figur 4 viser at effekten av ammoniakk på neutrofil fagocyttose kan reverseres ved intervensjoner.

Figur 5 viser at en simulert gastrointestinal blødning reduserer neutrofil kjemotaksis som delvis kan reverseres ved administrering av isoleucin.

Figur 6 viser at en simulert blødning reduserer proteinsyntese og stimulerer isoleucinoksidasjon på upassende måte.

Figur 7 viser at administrering av isoleucin i løpet av en simulert blødning høyner proteinsyntese, men reduserer ikke ammoniakkonsentrasjon.

Figur 8 viser at administrering med LOLA reduserer ammoniakkonsentrasjon, men tillater ammoniakk å regenerere.

Figur 9 viser at aktiv fjerning av glutamin forhindrer den sekundære stigningen i ammoniakkonsentrasjon.

Figur 10 viser at fenylacetat binder glutamin og lager en utskillbar forbindelse og forhindrer den sekundære stigningen i ammoniakk.

Figur 11 viser effekten av ornitin og fenylbutyrat på ammoniakknivåer i pasienter med fremskreden chirrose.

Figur 12 viser effekten av ornitin og fenylbutyrat på glutaminnivåer i pasienter med fremskreden chirrose.

Figur 13 viser endringene i mental tilstand av pasienter behandlet med placebo, O, P eller O+P.

Figur 14 viser effekten av ornitin, fenylbutyrat og isoleucin på ammoniakknivåer i pasienter med fremskreden chirrose.

Figur 15 viser effekten av ornitin, fenylbutyrat og isoleucin på glutaminnivåer i pasienter med fremskreden chirrose.

Figur 16 viser effekten av ornitin, fenylbutyrat og isoleucin på glysinnivåer i pasienter med fremskreden chirrose.

Figur 17 viser effekten av ornitin, fenylbutyrat og isoleucin på isoleucinnivåer i pasienter med fremskreden chirrose.

Figur 18 viser effekten av ornitin, fenylbutyrat og isoleucin på ornitinnivåer i pasienter med fremskreden chirrose.

Figur 19 viser effekten av ornitin og fenylbutyrat på arteriell ammoniakk i gallegangligert rottemodell.

Figur 20 viser effekten av ornitin og fenylbutyrat på plasmaornitin i gallegangligert rottemodell.

Figur 21 viser effekten av ornitin, fenylbutyrat og isoleucin på arterielle plasma ammoniakknivåer i en hyperammonaemisk akutt leversvikt-rottemodell.

Figur 22 viser dempet arteriell ammoniakkøkning i den devaskulariserte grisemodellen av akutt leversvikt med OP-behandling.

Figur 23 viser at ammoniakk tas fra blodet av muskelen i de O- og OP-behandlede dyrene (prøver ble tatt fra den femorale venearterie). I motsetning viser placeboog P-alene dyrene en økning i ammoniakkproduksjon av muskelen.

Figur 24 viser at ammoniakk produseres av tarmen i alle dyr foruten de OP-behandlede dyrene (prøver ble tatt fra den portalt tappede viscera-arterien).

Figur 25 viser at muskel glutaminfrigjøring økes av O, men ikke P anvendt isolert. OP forårsaket en markert større frigjøring av muskelglutamin (derved fangende ammoniakk som glutamin i muskelen).

Figur 26 viser at tarmglutaminopptak forsterkes av O, men reduseres av OP (derved reduserende generering av ammoniakk i tarmen).

Figur 27 viser at arterielle ornitinnivåer øker i de to dyrene (O alene og OP grupper) til hvilke det administreres.

Figur 28 viser at arterielle glutaminnivåer stiger med O, men mindre med OP.

Figur 29 viser at kombinasjonen av OP forhindrer økningen i den ammoniakkgene aminosyren glysin.

Figur 30 viser at ornitin alene forårsaket en økning i hjernevann, fenylacetat induserte en liten reduksjon i hjernevann, mens disse midlene i kombinasjon frembringer en substansiell reduksjon i hjernevann (%-kontroll).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Gjennom den foreliggende patentbeskrivelse og de medfølgende kravene skal ordene "omfatter" og "innbefatter" og variasjoner slik som "omfattes", "omfattende", "innbefatter" og "inklusive" tolkes inkluderende. Det vil si, disse ordene er ment å uttrykke den mulige inklusjonen av andre elementer eller integrere slike ikke spesifikt beskrevet, der hvor konteksten tillater.

Individer som skal behandles

Den foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av ornitin som angitt i krav 1 ved forebygging eller behandling av leverdekompensasjon eller hepatisk encefalopati. Individets lever kan derfor være i den kompenserte tilstanden. Individet kan ha kronisk leversykdom. Individet kan ha leverchirrose. Individet kan ha akutt leversvikt. Individet som skal behandles kan ha hepatisk encefalopati.

Inntreden av både akutt og kronisk leversykdom kan være på grunn av en xenobiotisk årsak. For eksempel kan individet ha blitt eksponert for en kjemikalie, legemiddel eller et annet middel som forårsaker leverskade. Individet kan ha en reaksjon mot et reseptfritt, foreskrevet eller “rekreasjons”-legemiddel som forårsaker leverskade. Individet kan ha tatt RezulinTM (troglitazone; Parke-Davis), SerzoneTM (nefazodone; Bristol-Myers Squibb) eller andre legemidler antatt å forårsake leverskade. Individet kan være en som har hatt en overdose av et spesielt legemiddel eller overskredet den anbefalte dose av et legemiddel i stand til å forårsake leverskade. For eksempel kan individet ha tatt en overdose av paracetamol. Individet kan ha blitt eksponert for kjemikalier som kan forårsake leverskade slik som, f.eks., ved deres arbeidssted. For eksempel, kan individet ha blitt eksponert til slike kjemikalier i en industriell- eller landbrukssammenheng. Individet kan ha konsumert planter som inneholder forbindelser som kan forårsake leverskade, i særdeleshet kan dette være tilfelle hvor individet er et dyr, slik som en herbivor. For eksempel kan individet ha konsumert en plante inneholdende pyrrolizidinalkaloid slik som svineblom. Individet kan ha blitt eksponert for miljøtoksiner antatt å forårsake leversykdom.

Legemiddelrelatert levertoksisitet omfatter mer enn 50 % av alle tilfeller med akutt leversykdom (akutt leversvikt). Acetaminofen- (også kjent som paracetamol og N-acetyl-p-aminofenol) toksisitet er den vanligste årsaken til akutt leversvikt i USA og Storbritannia. Langtids moderate til tunge alkoholbrukere som tar acetaminofen i terapeutiske eller svakt overdrevne doser har risiko for alvorlig hepatisk skade og eventuelt akutt leversvikt. Alkoholbruk forsterker de toksiske effektene av acetaminofen. Idiosynkratisk legemiddeltoksisitet bidrar også til akutt leversvikt. Idiosynkratisk legemiddeltoksisitet antas å være en hypersensitivitetsrespons hvori individet reagerer på et legemiddel på en farmakologisk unormal måte. Denne unormale responsen kan føre til akutt leversvikt.

Den akutte leversvikten eller kroniske leversykdommen kan forårsakes av infeksjon med en patogen organisme. For eksempel kan leversykdommen skyldes viral infeksjon. I særdeleshet kan individet være infisert, eller ha vært infisert, med et virus som forårsaker hepatitt. Individet kan ha kronisk viral hepatitt. Viruset kan, f.eks., være hepatitt B-, C- eller D-virus. I enkelte tilfeller, og i særdeleshet hvor individet har viral hepatitt, kan individet også være infisert med HIV-I eller II. Individet kan ha AIDS. Det er mulig at individet kan ha vært, eller er, infisert med andre organismer som forårsaker leversykdom og i særdeleshet de som er til stede i leveren i løpet av et eller annet stadium av deres livssyklus. For eksempel, kan individet ha, eller ha hatt, leverikte.

Individet kan ha en arvelig sykdom som forårsaker, eller øker risikoen for, kronisk leversykdom. For eksempel kan individet ha én eller flere av hepatisk hemochromatose, Wilsons sykdom eller α-1-antitrypsindefisiens. Individet kan ha en arvelig forstyrrelse som forårsaker én eller annen type strukturell eller funksjonell unormalitet i leveren hvilket øker sannsynligheten for leverfibrose. Individet kan være genetisk predisponert for å utvikle en autoimmun forstyrrelse som skader leveren og som følgelig kan bidra til leverfibrose.

Den kroniske leversykdommen kan være alkoholindusert. En mann eller kvinne som skal behandles kan være, eller ha vært, en alkoholiker. Han eller hun kan konsumere, eller ha konsumert, i gjennomsnitt 50 eller flere alkoholenheter per uke, 60 eller flere alkoholenheter per uke, 75 eller flere alkoholenheter per uke og til og med 100 eller flere alkoholenheter per uke. Mannen eller kvinnen kan konsumere, eller ha konsumert, i gjennomsnitt opp til 100 alkoholenheter per uke, opp til 150 alkoholenheter per uke og så mye som opp til 200 alkoholenheter per uke. Målingen av en alkoholenhet varierer fra land til land. Her er en enhet lik 8 gram etanol i overensstemmelse med standarden i Storbritannia.

Mannen eller kvinnen kan ha konsumert slike alkoholnivåer i 5 eller flere år, 10 eller flere år, 15 eller flere år eller 20 eller flere år. Individet kan ha konsumert slike alkoholnivåer i opp til 10 år, opp til 20 år, opp til 30 år og til og med opp til 40 år. I tilfeller av alkoholindusert leverchirrose kan individet være av alderen, f.eks., 25 år eller over, 35 år eller over, 45 år eller over og til og med over 60 år.

Individet kan være en mann eller en kvinne. Kvinner kan være mer mottagelige for de negative effektene av alkohol enn menn. Kvinner kan utvikle alkoholisk kronisk leversykdom innen en kortere tidsramme og fra mindre mengder av alkohol enn menn. Det synes ikke å være en enkelt faktor som forårsaker økt følsomhet for alkoholisk leverskade i kvinner, men effekten av hormoner på alkoholmetabolismen kan spille en viktig rolle.

I andre utførelsesformer av oppfinnelsen, kan individet ha en eller flere av et antall andre tilstander kjent å resultere i leverskade slik som, f.eks., primær biliær chirrose, autoimmun kronisk aktiv hepatitt, og/eller schistosomiasitt (parasittisk infeksjon). Individet kan ha eller ha hatt en gallegangblokkering. I enkelte tilfeller kan den underliggende årsaken til kronisk leversykdom være ukjent. For eksempel kan individet ha blitt diagnostisert som innehaende kryptogenisk chirrose. I en utførelsesform kan individet mistenkes å ha hvilken som helst av tilstandene opplistet heri.

Fremgangsmåter for å diagnostisere kronisk leversykdom, akutt leversvikt og hepatisk encefalopati er velkjent innen faget og i særdeleshet for klinikere og veterinærer i feltet. Fortrinnsvis vil individet ha blitt diagnostisert til å inneha en leversykdom og hepatisk encefalopati, f.eks. av en medisinsk eller veterinærmedisinsk fagperson. Individet kan fremvise ett eller flere symptomer forbundet med leversykdom slik som ett eller flere av gulsott, ascites, hudendringer, væskeretensjon, negleendringer, lett for å få blåmerker, neseblødninger, spiserørsåreknuter, og menn kan ha forstørrede bryster. Individet kan fremvise utmattelse, tretthet, appetittap, kvalme, svakhet og/eller vekttap. Individet kan også fremvise ett eller flere symptomer forbundet med hepatisk encefalopati slik som én eller flere av forvirring, desorientering, demens, stupor, koma, cerebral ødem, multiorgansvikt (respiratorisk svikt, hjerte- og karsvikt eller nyresvikt), muskel stivhet/rigiditet, anfall eller taleforringelse. Individet som skal behandles kan eller kan ikke ta andre legemidler for å behandle leversykdom. Individet som skal behandles, kan ha risiko for å utvikle hepatisk encefalopati.

Leversykdommen kan være konfirmert, eller konfirmeres, ved helsesjekk inklusive teknikker slik som ultralyd. Leverbiopsier kan være tatt for å se etter oppbygging av fibrose, nekrotiske celler, cellulær degenerering og/eller betennelse og andre karakteristiske egenskaper av leversykdom. Leverfunksjon kan ha blitt vurdert i individet for å bestemme hvorvidt denne er kompromittert. Karakteren og den underliggende årsaken av leversykdommen kan karakteriseres. Enhver historie av eksponering for kausative midler av leversykdom kan bestemmes.

Individet som skal behandles kan ha en risiko for hepatisk encefalopati-episoder, f.eks. pasienter som venter på levertransplanter, kirurgiske og/eller portal hypertensjonspasienter. En person med risiko for hepatisk encefalopati-episoder er en person som ikke har gjennomgått noen hepatiske encefalopati-episoder eller som ikke har gjennomgått noen hepatisk encefalopati-episode over en forlenget tidsperiode (omtrent 12 uker eller lengre), men har en forstyrrelse eller medisinsk tilstand som skaper en risiko for hepatiske encefalopati-episoder. En hepatisk encefalopati-episode er en klinisk tilstand karakterisert ved tilstedeværelse av cerebral dysfunksjon i pasienter med leversykdom eller dysfunksjon. Det er et bredt spekter av mentale forstyrrelser i hepatisk encefalopati som er i området fra minimal, hvor hovedeffektene er en reduksjon i livskvaliteten, til alvorlige, som fører til koma og ultimativt død.

Poengsystemer kan brukes for å vurdere alvorligheten av leversykdom og hepatisk encefalopati og også prognosen av individene. Child-Pugh, West Haven Criteria, Glasgow Coma Scale eller modifisert Child-Pugh poengsystem kan brukes. Alternativt kan (APACHE) II-poengsystemet brukes. Poeng tilskrives parametere, inklusive serum bilirubinnivåer, serum albuminnivåer og til kjennetegn, inklusive nærvær av ascites eller encefalopati. Individer som skal behandles kan klassifiseres i Child-Pugh klasse A, B eller C. Generelt klassifiseres individer som skal behandles i Child-Pugh klasse C.

En mann eller kvinne som skal behandles kan være i alderen, f.eks. fra 25 til 80 år. I en utførelsesform er mannen eller kvinnen i alderen fra 45 til 70 år. I en annen utførelsesform er mannen eller kvinnen i alderen fra 25 til 44 år. I en videre utførelsesform er mannen eller kvinnen over 65 år.

Oppfinnelsen har dog veterinærmedisinsk anvendelse. Individet som skal behandles kan være et gårdsdyr f.eks., en ku eller okse, sauer, gris, kveg, geit eller hest eller kan være et husdyr slik som en hund eller katt. Individet kan, eller kan ikke, være en dyremodell for leversykdom. Dyret kan være av hvilke som helst alder, men vil ofte være et modent, voksent individ.

Sammensetning

Aminosyrene anvendt i den foreliggende oppfinnelse kan være rene krystallinske aminosyrer. Generelt er aminosyrene i L-formen, heller enn D-formen, eller en blanding av D og L. Isolerte former av aminosyrene anvendes typisk. Enhver aktiv form av aminosyren kan brukes for å forhindre eller behandle leverdekompensasjonen eller den hepatiske encefalopatien. En farmasøytisk akseptabel form av aminosyren kan brukes. Aminosyrene kan benyttes som frie aminosyrer eller aminosyre salter eller derivater.

Ornitin kan være i ren krystallinsk aminosyreform. Generelt er ornitin i L-formen, heller enn D-formen, eller en blanding av D og L. Isolerte former av ornitin anvendes typisk. Enhver aktiv form av ornitin kan brukes eller en farmasøytisk akseptabel form av ornitin kan brukes. Ornitin kan benyttes som en fri aminosyre eller et aminosyresalt eller derivat.

Typisk anvendes ornitin som en enkelt, monomerisk aminosyre. Ornitin kan brukes i saltform, f.eks. kan ornitinhydroklorid brukes. Ornitin kan være i form av et fysiologisk akseptabelt salt i fri form. Derfor er ornitinet eller ornitinsaltet typisk ikke kjemisk bundet, eller kovalent bundet til noe annet middel.

Derivater av ornitin kan brukes. For eksempel kan keto- eller hydroksyanaloger av ornitin administreres som natrium- eller kalsiumsalter. Ketosyrer av ornitin innbefatter ornitin ketoglutarat, ornitin ketoleucin og ornitin ketovalin. Salter eller derivater av ornitin kan brukes i stedet for eller i tillegg til fri ornitin.

Minst en av fenylacetat og fenylbutyrat kan brukes. Fenylacetat og/eller fenylbutyrat kan være i fysiologisk akseptabel saltform, slik som et alkalimetall eller alkalisk jordmetallsalt. Saltet kan være natriumfenylacetat eller natriumfenylbutyrat. Saltformen av fenylacetat og fenylbutyrat kan være i fri form. Derfor er fenylacetatet og fenylbutyratet eller fenylacetatsaltet og fenylbutyratsaltet typisk ikke kjemisk bundet, eller kovalent bundet til noe annet middel.

Valgfritt anvendes isoleucin. Isoleucin kan være i ren krystallinsk aminosyreform. Generelt er isoleucin i L-formen, heller enn D-formen, eller en blanding av D og L. Isolerte former av isoleucin anvendes typisk. Enhver aktiv form av isoleucin kan brukes eller en farmasøytisk akseptabel form av isoleucin kan brukes. Isoleucin kan benyttes som en fri aminosyre eller et aminosyresalt eller derivat.

Typisk anvendes isoleucin som en enkelt, monomerisk aminosyre. Isoleucin kan brukes i saltform, f.eks. kan isoleucin hydroklorid brukes. Isoleucin kan være i form av et fysiologisk akseptabelt salt i fri form. Derfor er isoleucinet eller isoleucinsaltet typisk ikke kjemisk bundet, eller kovalent bundet til noe annet middel.

Farmasøytiske sammensetninger

Ornitinet og fenylacetatet og/eller fenylbutyratet formuleres typisk for administrering med en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel. Ornitinet og fenylacetatet og/eller fenylbutyratet kan således formuleres som et medikament med en standard farmasøytisk akseptabel bærer(e) og/eller eksipient(er) som er rutine innen legemiddelfaget. Den eksakte naturen av formuleringen vil være avhengig av flere faktorer inklusive den ønskede administreringsruten. Typisk formuleres ornitin og fenylacetatet og/eller fenylbutyratet for oral, intravenøs, intragastrisk, intravaskulær eller intraperitonal administrering.

Legemiddelbæreren eller fortynningsmiddelet kan være, f.eks., en isoton løsning slik som fysiologisk saltløsning. Faste orale former kan inneholde, sammen med den aktive forbindelse, fortynningsmidler, f.eks. laktose, dekstrose, sakkarose, cellulose, maisstivelse eller potetstivelse; smøremidler, f.eks. silika, talkum, stearinsy re, magnesium eller kalsiumstearat, og/eller polyetylenglykoler; bindemidler; f.eks. stivelser, tyggedrops arabic, gelatin, metylcellulose, karboksymetylcellulose eller polyvinylpyrrolidon; disaggregerende midler, f.eks. stivelse, alginsyre, alginater eller natrium stivelseglykolat; bruseblandinger; fargestoffer; søtningsmidler; våtgjørere, slik som lecitin, polysorbater, laurylsulfater; og, generelt, ikke-toksiske og farmakologisk inaktive substanser anvendt i farmasøytiske formuleringer. Slike farmasøytiske preparater kan fremstilles på kjent måte, f.eks., ved hjelp av blanding, granulering, tablettering, sukkerovertrekking, eller filmovertrekkingsprosesser.

Væskedispersjoner for oral administrering kan være siruper, emulsjoner eller suspensjoner. Sirupene kan inneholde som bærere, f.eks., sakkarose eller sakkarose med glyserin og/eller mannitol og/eller sorbitol.

Suspensjoner og emulsjoner kan inneholde som bærer, f.eks. en naturlig gummi, agar, natriumalginat, pektin, metylcellulose, karboksymetylcellulose, eller polyvinylalkohol. Suspensjonene eller løsningene for intramuskulære injeksjoner kan inneholde, sammen med ornitin og minst en av fenylacetat og fenylbutyrat, en farmasøytisk akseptabel bærer, f.eks. sterilt vann, olivenolje, etyloleat, glykoler, f.eks. propylenglykol, og hvis ønskelig, en passende mengde av lidocain hydroklorid.

Medikamenter av oppfinnelsen kan omfatte ornitin som den eneste aminosyrekomponenten. Medikamenter av oppfinnelsen kan omfatte ornitin og isoleucin som de eneste aminosyrekomponentene. Medikamentet kan bestå i all vesentlighet av ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat. Medikamentet kan bestå i all vesentlighet av ornitin, isoleucin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat.

Medikamentet kan bestå i all vesentlighet av ornitin, fenylacetat og/eller fenylbutyrat og en farmasøytisk akseptabel bærer. Et slikt medikament inneholder derfor hovedsakelig ingen annen aminosyre i tillegg til ornitin. Medikamentet kan bestå i all vesentlighet av ornitin, isoleucin, fenylacetat og/eller fenylbutyrat og en farmasøytisk akseptabel bærer. Et slikt medikament inneholder derfor hovedsakelig ingen annen aminosyre i tillegg til ornitin og isoleucin.

Fenylacetatet kan være til stede i en mengde fra 5 til 100 %, f.eks. fra 10 til 50 %, eller 20 til 40 %, (vektprosent) av vekten av ornitin. Fenylbutyratet kan være til stede i en mengde fra 5 til 100 %, f.eks. fra 10 til 50 %, eller 20 til 40 %, (vektprosent) av vekten av ornitin.

Dog kan medikamentet omfatte fri aspartat, glutamat eller arginin i ikkepeptidform, typisk i en ubetydelig mengde. Generelt overgår ikke mengden (vektprosent) av aspartat, glutamat eller arginin, mengden (vektprosent) av ornitin. Med en ubetydelig mengde menes det at mengden (vektprosent) av aspartat, glutamat eller arginin, eller en kombinasjon av disse aminosyrene, ikke overstiger 20 % (vektprosent) av ornitin. Derfor kan medikamentet omfatte hovedsakelig ingen aspartat. I en utførelsesform omfatter ikke sammensetningen aspartat, glutamat eller arginin. Spormengder av aspartat, glutamat eller arginin kan være til stede i sammensetningen. Med spormengde menes det at mengden (vektprosent) av aspartat, glutamat eller arginin, eller en kombinasjon av disse aminosyrene, ikke overstiger 1 % (vektprosent) av ornitin. Fortrinnsvis overstiger ikke mengden (vektprosent) av aspartat, glutamat eller arginin 0,5 % (vektprosent) av ornitin.

I en annen utførelsesform kan sammensetningen omfatte ytterligere andre aminosyrer i ikke-peptidform, typisk som den frie aminosyren eller et fysiologisk akseptabelt salt derav i fri form. Mengden av disse andre aminosyrene overstiger generelt ikke mengden (vektprosent) av ornitin. For eksempel kan de andre aminosyrene være til stede i en mengde(vektprosent) opp til 20 %, f.eks. fra 5 til 20 %, av vekten av ornitin. Slike andre aminosyrer som kan være tilstede i sammensetningen innbefatter essensielle og ikke-essensielle aminosyrer. Sammensetningen kan omfatte andre forgrenet-kjede aminosyrer (BCAAer). BCAAer innbefatter isoleucin, valin og leucin. Således kan en sammensetning av oppfinnelsen videre omfatte isoleucin og/eller valin og/eller leucin.

Behandling

Ornitin og minst en av fenylacetat og fenylbutyrat administreres i kombinasjon til et individ for å forebygge eller forsinke inntreden av leverdekompensasjon eller hepatisk encefalopati. Ornitin og minst en av fenylacetat og fenylbutyrat kan således administreres i kombinasjon for å forbedre tilstanden av et individ, f.eks. et individ lidende av kronisk leversykdom etterfølgende en utløsende hendelse. Ornitin og minst en av fenylacetat og fenylbutyrat kan administreres i kombinasjon for å lindre symptomene hos et individ, f.eks. symptomene forbundet med kronisk leversykdom i et individ etterfølgende en utløsende hendelse. Ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat kan administreres i kombinasjon for å bekjempe eller forsinke inntreden av leverdekompensasjon eller hepatisk encefalopati.

Ornitin og minst en av fenylacetat og fenylbutyrat kan administreres i kombinasjon til et individ for behandling av hepatisk encefalopati. Ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat kan administreres i kombinasjon for å forbedre tilstanden av en pasient lidende av hepatisk encefalopati. Ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat kan administreres i kombinasjon for å lindre symptomene forbundet med hepatisk encefalopati. Ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat kan administreres i kombinasjon for å bekjempe hepatisk encefalopati. Ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat kan administreres i kombinasjon for å forhindre en begynnende hepatisk encefalopati-episode i en person som risiko for hepatisk encefalopati-episoder. Ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat kan administreres i kombinasjon for å redusere alvorligheten av en begynnende hepatisk encefalopati-episode i en person med risiko for hepatisk encefalopati-episoder. Ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat kan administreres i kombinasjon for å forsinke en begynnende hepatisk encefalopati-episode i en person med risiko for hepatisk encefalopati-episoder.

Utvikling av leverdekompensasjon og hepatisk encefalopati involverer “utløsende hendelser” (eller “akutte angrep”). Slike utløsende hendelser innbefatter gastrointestinale blødninger, infeksjon (sepsis), portal vene trombose og dehydrering. Inntreden av et slikt akutt angrep fører sannsynligvis til innleggelse. Pasienten kan lide av ett av disse akutte angrepene eller en kombinasjon av disse akutte angrepene.

Et individ som mistenkes å ha hatt et akutt angrep, behandles i henhold til oppfinnelsen med ornitin og fenylacetat og/eller fenylbutyrat i kombinasjon for å forhindre progresjon av leveren til den dekompenserte tilstanden. Oppfinnelsen kan derfor forhindre de medisinske konsekvenser av leverdekompensasjon slik som hepatisk encefalopati. Ornitinet og fenylacetatet og/eller fenylbutyratet kan brukes for å preservere leverfunksjon. Anvendelse av ornitin og fenylacetat og/eller fenylbutyrat kan således forlenge livet av en pasient med leversykdom. I en utførelsesform forhindres de metabolske konsekvenser av en gastrointestinal blødning slik som hyperammonemi, hypoisoleucemi og redusert proteinsyntese i postblødningsperioden.

Typisk kan behandling av individer begynne så raskt som mulig etter inntredenen eller den mistenkte inntredenen av en utløsende hendelse (akutt angrep). Fortrinnsvis begynner behandling av individet før gjentatte akutte angrep. Mer fortrinnsvis begynner behandling av individet etterfølgende det første akutte angrepet.

Behandling gis typisk omgående etter starten av et akutt angrep. Behandling kan begynne etter symptomet(ene) av et akutt angrep, eller mistenkt akutt angrep, er påvist f.eks. av en medisinsk person slik som en lege, en førstehjelper eller en sykesøster. Behandling kan begynne ved innleggelse av individet. Behandling kan således begynne innen 6 timer, innen 3 timer, innen 2 timer eller innen 1 time etter at symptomet(ene) av et akutt angrep, eller mistenkt akutt angrep, er påvist. Behandling av individet kan derfor begynne fra 1 til 48 timer, f.eks. fra 1 til 36 timer eller fra 1 til 24 timer etter symptomet(ene) av et akutt angrep, eller mistenkt akutt angrep, er påvist.

Behandling kan foregå i opp til 8 uker, f.eks. opp til 6 uker, opp til 4 uker eller opp til 2 uker etter at symptomet(ene) av et akutt angrep, eller mistenkt akutt angrep, er påvist. Behandling kan derfor foregå i opp til 48 timer, f.eks. i opp til 36 timer eller i opp til 24 timer etter symptomet(ene) av et akutt angrep, eller mistenkt akutt angrep, er påvist. Typisk foregår behandling inntil tidspunktet når tilfriskning fra den akutte utløsende hendelse er åpenbar.

Individet behandles med ornitinet og fenylacetatet og/eller fenylbutyratet. Ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat kan administreres i kombinasjon i et enkelt medikament, eller separat i to eller tre forskjellige medikamenter. Hvor ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat skal administreres i et kombinert medikament, kan kombinasjonen fremstilles umiddelbart før administrering, eller kan lagres som et kombinert medikament.

Hvor ornitinet og fenylacetatet og/eller fenylbutyratet skal administreres separat, kan medikamentene administreres samtidig eller sekvensielt over en tidsperiode. To eller tre separate medikamenter kan administreres over en tidsperiode.

Hvor to medikamenter administreres, kan ornitin administreres først, etterfulgt av administrering av fenylacetatet og fenylbutyratet, fenylacetatet eller fenylbutyratet. Alternativt kan fenylacetatet og fenylbutyratet, fenylacetatet eller fenylbutyratet administreres først, etterfulgt av ornitin. I en annen utførelsesform kan en kombinasjon av ornitin og fenylacetat administreres først, etterfulgt av administrering av fenylbutyrat. Alternativt kan en kombinasjon av ornitin og fenylbutyrat administreres først, etterfulgt av administrering av fenylacetat. I en annen utførelsesform kan fenylacetat administreres først, etterfulgt av administrering av en kombinasjon av ornitin og fenylbutyrat. Alternativt kan fenylbutyrat administreres først, etterfulgt av administrering av en kombinasjon av ornitin og fenylacetat.

Hvor tre medikamenter administreres, administreres ornitin, fenylacetat og fenylbutyrat ved separate tilfeller. Ornitin kan administreres først, som nummer to eller som nummer tre. Hvor ornitin administreres først, kan fenylacetat eller fenylbutyrat administreres som nummer to, etterfulgt av administrering av fenylbutyrat eller fenylacetat. Hvor ornitin administreres som nummer to, administreres fenylacetat eller fenylbutyrat først, og fenylbutyrat eller fenylacetat administreres som nummer tre. Hvor ornitin administreres som nummer tre, administreres fenylacetat eller fenylbutyrat først, og fenylbutyrat eller fenylacetat administreres som nummer to.

Det andre medikamentet kan administreres opp til 5 timer, slik som opp til 2 timer eller opp til 1 time, etterfølgende administrering av det første medikamentet. Det andre medikamentet kan således administreres fra 15 minutter til 5 timer, f.eks. fra 30 minutter til 4 timer eller fra 1 time til 3 timer, etterfølgende administrering av det første medikamentet.

Det tredje medikamentet kan administreres opp til 5 timer, slik som opp til 2 timer eller opp til 1 time, etterfølgende administrering av det andre medikamentet. Det tredje medikamentet kan således administreres fra 15 minutter til 5 timer, f.eks. fra 30 minutter til 4 timer eller fra 1 time til 3 timer, etterfølgende administrering av det andre medikamentet.

Medikamentene av oppfinnelsen kan administreres ved det samme stedet eller ved forskjellige steder. Medikamentene av oppfinnelsen kan administreres via den samme rute eller ved forskjellige ruter. Et medikament av oppfinnelsen kan administreres ved enhver passende rute. Fortrinnsvis administreres det ved orale, intravenøse, intragastriske, intraperitonale eller intravaskulære ruter. For eksempel, når ornitin og minst én av fenylacetat og fenylbutyrat administreres separat, kan de alle administreres oralt eller de kan alle administreres intravenøst eller ornitin kan administreres oralt og fenylacetatet og/eller fenylbutyratet kan administreres intravenøst, eller fenylacetatet og/eller fenylbutyratet kan administreres oralt og ornitin kan administreres intravenøst.

Terapeutisk effektive mengder av ornitin, fenylacetatet og/eller fenylbutyratet og det eventuelle isoleucinet administreres til individet. Dosene av ornitinet, fenylacetatet og/eller fenylbutyratet og isoleucinet kan bestemmes i henhold til forskjellige parametere slik som alderen, vekten og tilstanden av individet som skal behandles; typen og alvorligheten av leversykdom; administreringsruten; og det nødvendige regimet.

En typisk dose av ornitin, av fenylacetat eller fenylbutyrat, eller av isoleucin er fra 0,02 til 1,25, f.eks. fra 0,1 til 0,5, g per kg kroppsvekt, avhengig av slike parametere. Følgelig kan en dosering av ornitin, av fenylacetat eller fenylbutyrat, eller av isoleucin være fra 1 g til 50 g slik som fra 5 g til 30 g. Doseringen av ornitin kan være 10 til 30 g. Dosen av isoleucin kan være 5 til 15 g. Ornitinet og fenylacetatet/fenylbutyratet kan administreres i et vektsforhold fra 10:1 til 1:10 slik som fra 5:1 til 1:5 eller fra 2:1 til 1:2 eller omtrent 1:1. En lege vil være i stand til å bestemme den nødvendige dosering av ornitin og av fenylacetat eller fenylbutyrat og av det eventuelle isoleucinet for ethvert spesifikt individ.

En enkelt dose av ornitin og en enkelt dose av fenylacetat og/eller fenylbutyrat kan administreres. Valgfritt kan en enkelt dose av isoleucin også administreres. Alternativt kan multiple doser, f.eks. to, tre, fire eller fem doses, av ornitin og/eller av fenylacetatet og/eller fenylbutyratet og/eller av det eventuelle isoleucinet administreres. Slike multiple doser kan administreres over en periode av en måned eller to uker eller en uke. I en annen utførelsesform kan en enkelt dose eller multiple doser slik som to, tre, fire eller fem doser av ornitin og/eller av fenylacetat og/eller fenylbutyrat administreres daglig.

Andre aminosyrer kan administreres til et individ som bemerket ovenfor. Den ene, eller hver slik annen aminosyre kan administreres i det samme medikamentet som ornitinet og/eller fenylacetatet og/eller fenylbutyratet, eller kan administreres separat. Når administrert separat kan den ene, eller hver slik annen aminosyre gis samtidig med, eller ved et annet tidspunkt slik som opp til 5 timer, opp til 2 timer eller opp til 1 time før eller etter administreringen av ornitin og/eller fenylacetat og/eller fenylbutyrat. Den ene, eller hver slik annen aminosyre administreres typisk oralt eller intravenøst.

En terapeutisk effektiv mengde av den ene, eller hver slik annen aminosyre administreres til individet. Dosen vil være avhengig av forskjellige parametere slik som de bemerket ovenfor for ornitin, fenylacetat og fenylbutyrat. En typisk dose av den ene, eller hver slik annen aminosyre er fra 0,02 til 1,25, f.eks. fra 0,1 til 0,5, g per kg av kroppsvekt. En dosering av den ene, eller hver slik annen aminosyre kan derfor være fra 1 g til 50 g slik som 5 g til 30 g.

En enkelt dose av den ene, eller hver slik annen aminosyre kan administreres. Alternativt kan multiple doser, f.eks. to, tre, fire eller fem doser administreres. Slike multiple doser kan administreres over en periode av en måned eller to uker eller en uke. I en annen utførelsesform kan en enkelt dose eller multiple doser slik som to, tre, fire eller fem doser administreres daglig.

De følgende eksemplene illustrerer oppfinnelsen

Eksempel 1: Neutrofilfunksjon endres i pasienter med chirrose og forverres med økende alvorlighet av leversykdom

Fremgangsmåter for måling av neutrofil fagocyttose og oksidativ brist

Fagotest: Heparinisert helblod ble inkubert med opsonisert FITC-merket E coli og CD16. Cellene ble deretter analysert ved strømningscytometri (FACScan Becton Dickinson), portstyrt gjennom fremlengs og side scatter og deretter vurdert på basis av R-phycoerythrin- (PE) [Immunotech, Marseille, Frankrike] fluorokromekspresjon for å identifisere CD16-positive celler. Den styrte populasjonen ble deretter vurdert for tilstedeværelse av FITC-merkede bakterier.

Fagoburst: Heparinisert helblod ble inkubert med opsonisert E coli-suspensjon for å stimulere oksidativ brist. En substratløsning ble tilsatt for å bestemme omdanningen av dihydrorhodamin (DHR) 123 til den flurogene forbindelsen Rhodamin (R) 123. Reaksjonen ble stoppet og fiksert før inkubering med CD16-antistoff for positiv neutrofilidentifisering. Analyse ble deretter gjennomført ved strømningscytometre.

Neutrofil kjemotaksis: Neutrofil kjemotaksis ble målt ved anvendelse av en modifisert Boyden-kammer fremgangsmåte ved anvendelse av interleukin-8 som kjemosignalstoff for å stimulere kjemokinese.

Pasienter og fremgangsmåter

Vi studerte 30 pasienter med chirrose (alkoholisk chirrose; gjennomsnittsalder 53,2 (SEM 4,6) og 20 friske frivillige. Pasienter med chirrose ble klassifisert som de med superimposert alkoholisk hepatitt (AH+) og de med dekompenserte eller kompenserte levere. Fagotest ble anvendt for å bestemme den fagocyttiske kapasiteten og fagoburst ble anvendt til å bestemme hvorvidt cellene var i stand til å frembringe oksidativ brist når eksponert for E coli.

Resultater

Vi observerte at neutrofiler fra chirrose-pasienter hadde en signifikant redusert evne til å fagocyttere bakterier. Vi fant også at pasienter med chirrose hadde en redusert kapasitet til å respondere til stimulering av neutrofilene ved E coli i betydning av økning av genereringshastigheten av oksidativ brist (figur 1). Denne reduksjonen i kapasitet korrelerte med alvorligheten av leversykdom indikerende at jo mer fremskredet stadium av leversykdom, jo mindre evne til å respondere til og mestre infeksjon.

Eksempel 2: Ammoniakk reduserer fagocyttisk kapasitet i neutrofiler

Fremgangsmåter for måling av neutrofil fagocyttose og oksidativ brist

Som i eksempel 1.

Pasienter og fremgangsmåter

Blod ble samlet fra friske frivillige (n=15) og inkubert i 1 time med økende konsentrasjoner av ammoniakk. Neutrofilenes evne til å fagocyttere bakterier ble målt ved anvendelse av fagotest- og neutrofil kjemotaksis-assayene. 10 ng/ml IL-8 ble anvendt i neutrofil kjemotaksis-assayen.

Resultater

Med inkubering av økende konsentrasjoner av ammoniakk, var det en signifikant reduksjon i neutrofil fagocyttose (figur 2) og også i neutrofil kjemotaksis (figur 3).

Eksempel 3: Effekten av ammoniakk på neutrofil fagocyttose kan reverseres ved intervensjoner

Fremgangsmåter for måling av neutrofil fagocyttose og oksidativ brist

Som i eksempel 1.

Pasienter og fremgangsmåter

Blod ble samlet fra friske frivillige (n=15) og inkubert i 1 time med ammoniakk og valgte aminosyrer. Evnen av neutrofilene til å fagocyttere bakterier ble målt ved anvendelse av fagotest-assayen.

Resultater

Vi observerte at den ammoniakk-induserte reduksjonen i neutrofil fagocyttose delvis kunne reverseres ved ornitin og glutamin (figur 4). Dog ble neutrofil fagocyttose forverret ved ko-inkubering av ammoniakk med aspartat, men forble uendret med L-ornitin L-aspartat.

Eksempel 4: En simulert gastrointestinal blødning reduserer neutrofil kjemotaksis som delvis kan reverseres ved administrering av isoleucin

Fremgangsmåter

Ti metabolsk stabile pasienter som hadde fastet over natten, med biopsi-bevist chirrose av leveren [9 hankjønn og 1 hunkjønn; middelverdi 49,6 år (SEM 9,1); middelverdi Child-Pugh poengsum av 7,8 (SEM 1,2)] ble studert før og to timer etter en oral administrering av 75 gram av en aminosyreblanding som etterligner hemoglobinmolekylet (Nutricia, Cuijk, Netherlands). I sju andre pasienter [4 hankjønn og 3 hunkjønn; middelverdi 51,4 år (SEM 6,7); middelverdi Child-Pugh poengsum av 8,1 (SEM 1,4)] ble, etterfølgende administrering av aminosyreblandingen, isoleucin administrert intravenøst over en 2 timers periode (iso-osmotisk løsning inneholdende 40 mg/l av isoleucin ved en hastighet av 100 ml/hr). Neutrofil kjemotaksis (se eksempel 1 for fremgangsmåte) og plasmaammoniakk ble målt i perifere venøse blodprøver.

Resultater

Neutrofil kjemotaksis var signifikant lavere i disse chirrose-pasientene sammenlignet med alderspassende kontroller (53,3 SEM 4,6) og var signifikant redusert etter simulert blødning fra 31 (±4,2) til 8 (±5,4) celler/høykraftsfelt (p<0,0001) (figur 5). Plasmakonsentrasjon av ammoniakk økte signifikant fra 75,1 (±4,2) til 124 (±8,5) (p<0,001). Endringen i ammoniakkonsentrasjonen korrelerte med endringen i neutrofil kjemotaksis (r=0,65 og p <0,05). Reduksjonen i neutrofil kjemotaksis observert med den simulerte blødningen ble opphevet i gruppen av pasienter behandlet med isoleucin 25,4 (±6,0) celler/høykraftsfelt.

Eksempel 5: En simulert blødning reduserer proteinsyntese og stimulerer isoleucinoksidasjon på upassende måte

Fremgangsmåter

Fem pasienter med leverchirrose som hadde fastet over natten ble rekruttert. En blodprøve ble samlet og utåndet luft ble prøvetatt før starten av infusjonen av de stabile isotopene for måling av bakgrunnsisotopanrikning. Deretter mottok pasientene en primet kontinuerlig intravenøs infusjon av [1-13C]-isoleucin (1 mg/kg bw/h) inntil slutten av forsøket (t=480 min).

Resultater

Figur 6 viser middelverdi helkropp tilsynekomsthastighet av isoleucin (Wb Ra) og isoleucinoksidasjon under den siste tiden av saline- (sorte stolper) og aminosyre-(grå stolper) infusjon (verdier i middelverdi ± SEM; # representerer p <0,05). En øvre GI-blødning i pasienter med chirrose førte til en reduksjon i isoleucin og senket markert helkropp proteinsyntese. Fraksjonen av isoleucinstrøm anvendt for oksidasjon ikke ble endret etter den simulerte blødningen foruten den markerte reduksjonen i isoleucinkonsentrasjon, visende til forekomst av BCAA-antagonisme.

Eksempel 6: Administrering av isoleucin under en simulert blødning høyner proteinsyntese, men reduserer ikke ammoniakkonsentrasjon

Fremgangsmåter

Seksten metabolisk stabile pasienter med biopsi-bevist leverchirrose ble studert. Pasienter ble randomisert enten til supplementering med isoleucin (40 mg/L løsning; 50 ml/hr) eller placebo under en simulert blødning over en 4-timers periode. Proteinsyntese (målt ved anvendelse av primet kontinuerlig infusjon av L-[ring-2H5]fenylalanin), L-[ring-2H4]tyrosin og L-[ring-2H2 ]tyrosin) og ammoniakk.

Resultater

Resultatene viste at infusjon av isoleucin under en simulert blødning i pasienter med leverchirrose gjenoppretter forringet proteinsyntese av lever og muskel hvilket fører til en netto anabolisk tilstand i disse organene (tabell 1). Ammoniakkonsentrasjon økte signifikant i begge grupper, men var ikke signifikant forskjellig mellom de administrert med isoleucin eller placebo (figur 7).

Eksempel 7: Aspartatakkumulering etterfølgende infusjon av L-ornitin L-aspartat i pasienter med fremskreden chirrose

Fremgangsmåter

5 pasienter med fremskreden chirrose som ventet på levertransplantasjon (alder: 59; 3 hankjønn, Child-klasse C-sykdom, alvorlig ascites, kreatinin 102 umol/L) undergikk behandling med 40 g/dag av L-ornitin L-aspartat.

Resultater

Over en 3-dagers periode var det en signifikant og progressiv økning i aspartatkonsentrasjonen hvilket øker til 5 ganger den basale verdien (tabell 2).

Tabell 2

Tabell 1

Proteinkinetikk bestemt ved anvendelse av Phe-modellen ved t= 0 timer og ved studiens slutt

Tid Proteinsyntese P Proteinnedbrytning P

Lever SB-salin 0 415 ± 120 263 ± 50

Slutt 274 ± 250 0,445 108 ± 162 0,366 SB- 0 218 ± 37 109 ± 25 isoleucin

Slutt 839 ± 221 0,038 157 ± 204 0,412

Ben SB-salin 0 117 ± 52 137 ± 51

Slutt 372 ± 211 0,189 288 ± 175 0,232 SB- 0 -31 ± 201 196 ± 61 isoleucin

Slutt 377 ± 135 0,209 159 ± 100 0,535

Dataen er midlere verdier ± SEM i nmol/kg kroppscellemasse/min. Sluttverdiene representerer de midl 5 men av aminosyreinfusjonen. Proteinsyntesedataen for lever og nyre er korrigert for hydro ksylasjon (jf verdier for Mann-Whitney-U-test for forskjeller innen grupper; ingen signifikante forskjeller ble funnet g Eksempel 8: Administrering med LOLA reduserer ammoniakkonsentrasjon, men tillater ammoniakk å regenereres

Pasienter og fremgangsmåter

Åtte pasienter med chirrose (alder 56 (5,6), 5M, ALD-6; Grad 2 HE: 4; Grad 3-4 HE: 4) ble behandlet med en infusjon av LOLA (40 g over 8 timer). Blod ble prøvetatt for måling av ammoniakk og glutamin.

Resultater

Resultatene viste at administrering av LOLA førte til en signifikant reduksjon i ammoniakkonsentrasjon med en ledsagende økning i glutaminkonsentrasjon (figur 8). Denne reduksjonen i ammoniakk hadde fordelaktig effekter på alvorligheten av HE. Dog, når LOLA ble stoppet, var det en økning tilbake i de sirkulerende ammoniakknivåene, hvilket fører til gjenopptreden av HE i 3 av de 6 pasienter som hadde tilfrisknet.

Eksempel 9: Aktiv fjerning av glutamin forhindrer den sekundære økningen i ammoniakkonsentrasjon

Pasienter og fremgangsmåter

3 pasienter (alder 45 (4,1) 2M, ALD, alle HE-grad 3, HRS alle 3) som undergikk heamofiltrering (CVVH) ble behandlet med en infusjon av LOLA (40 g over 8 timer). Blod ble prøvetatt for måling av ammoniakk og glutamin.

Resultater

Resultatene viste at LOLA førte til en reduksjon i ammoniakkonsentrasjon, men tilføyelse av dialyse forhindret ledsagende økning i glutaminkonsentrasjon (figur 9). Derfor tror vi at det var en vedvarende reduksjon i ammoniakkonsentrasjon.

Eksempel 10: Fenylacetat binder glutamin for å danne en utskillbar forbindelse og forhindrer den sekundære økningen i ammoniakk

Pasienter og fremgangsmåter

6 pasienter med akutt leversvikt (5 ikke-A ikke-B hepatitt) og alvorlig encefalopati (Grad 3-4) ble behandlet med LOLA og fenylacetat (40 g/dag over 8 timer).

Resultater

Det var ingen signifikant økning i glutaminkonsentrasjon og ammoniakknivåer ble redusert med den kombinerte behandlingen (figur 10). Ingen økning tilbake i ammoniakk ble observert.

Eksempel 11: Effekten av ornitin og fenylbutyrat i humane pasienter med hepatisk encefalopati

Pasienter

1. Grupper-3 pasienter per gruppe. Total 12.

2. Inklusjonskriterier

- voksne pasienter i alderen 18-80 år, - leverchirrose dokumentert ved histologi eller kliniske kriterier

- HE type C, - ammoniakkonsentrasjon av > 80 umol/L, informert konsent/samtykke

3. Eksklusjonskriterier

- annen ledsagende neurologisk forstyrrelse, - anvendelse av et annet spesifikt ammoniakksenkende legemiddel, - respiratorisk svikt fordrende mekanisk ventilasjon og beroligende behandling, - ukontrollert gastrointestinal blødning, - hypotoni fordrende inotroper, overt nyresvikt (kreatinin >2 mg/dl), hemodialyse, - ekstrakorporeal leverstøtte, kjent hypersensitivitet overfor hvilke som helst av legemidlene i studien, - graviditet.

Vurdering av mental tilstand

Gradering av hepatisk encefalopati (West Haven-kriterier)

Fremgangsmåter

I en åpen merket studie inkluderte vi 8 pasienter med chirrose og hyperammonemi. De var tilpasset for alvorligheten av leversykdom (se tabell 3). De ble behandlet med et av de følgende regimer i en 3-dagers periode og observasjoner ble gjort i 5 dager. Studiegruppene var:

(i) Placebo: 5 % dekstrose i 4 timer;

(ii) Ornitin alene: 20 g i 500 ml, 5 % dekstrose mellom 0800 og 1200; (iii) Fenylbutyrat: 10 g to ganger daglig, oralt (0800 og 1600); og (iv) Ornitin fenylbutyrat: 20 g i 500 ml, 5 % dekstrose mellom 0800 og 1200 10 g to ganger daglig, oralt (0800 og 1600).

Pasienter ble fastet natten over mellom 0000 midnatt og 0800 am. De ble matet intragastrisk med en diett av 25 KCal/kg som inkluderte 1 g/kg protein, dietten begynte 0800 og avsluttet ved midnatt. Blod ble prøvetatt ved 0730 og deretter ved 1800 for målingen av ammoniakk og glutamin. Pasienter ble grundig overvåket for bieffekter. Legemiddelet ble godt tolerert i hver av gruppene og ingen ugunstige hendelser ble observert.

Tabell 3. Pasientdemografi

SBP: spontan bakteriell peritonititt, Ikke-alkoholisk steatohepatitt, ICU: Intensivbehandlingsstøtte nødvendig, HRS: hepatorenalt syndrom

Resultater

Figur 11 viser at gjennomsnittsammoniakknivåene i høy grad forble uendret i behandlingsperioden i placebogruppen. I L-ornitin og fenylbutyratgruppen, økte ammoniakkonsentrasjonen fra grunnlinjeverdier. I gruppen behandlet med både L-ornitin og fenylbutyrat, var det en substansiell reduksjon av ammoniakk. Den postprandiale økningen i ammoniakk ble redusert i de OP-behandlede dyrene i tillegg til reduksjonen i ammoniakkonsentrasjonene. Begge pasientene i OP-gruppen hadde forbedret sine encefalopati-poeng med 2 grader ved dag 3, hvilket ikke ble observert i noen av de andre 6 pasientene.

Figur 12 viser at gjennomsnittsglutaminnivåer i høy grad forble uendret i behandlingsperioden i OP-gruppen til tross for en reduksjon i ammoniakk. Det var en reduksjon i glutamin i fenylbutyratgruppen, som godt kan være skadelig. I L-ornitinog placebo-gruppene var det en økning i glutaminkonsentrasjoner hvilket var merkbart aksentuert i det postprandiale stadiet.

Figur 13 viser endringene i mental tilstand i gruppene behandlet med placebo, O, P og OP.

Eksempel 12: Effekten av ornitin, fenylbutyrat og isoleucin i humane pasienter med hepatisk encefalopati

Pasienter

1. Grupper- 2 pasienter per gruppe. Totalt 6

2. Inklusjonskriterier

- Voksne pasienter i alderen 18-80 år, leverchirrose dokumentert ved histologi eller kliniske kriterier, Child B eller C, nylig gastrointestinal blødning fra varices (<6 timer etter presentering), informert samtykke/bifall.

3. Eksklusjonskriterier

- annen ledsagende neurologisk forstyrrelse, - anvendelse av et annet spesifikt ammoniakksenkende legemiddel, - respiratorisk svikt fordrende mekanisk ventilasjon og beroligende behandling, - ukontrollert gastrointestinal blødning, - hypotoni fordrende inotroper, overt nyresvikt (kreatinin >2 mg/dl), hemodialyse, - ekstra korporal leverstøtte, kjent hypersensitivitet overfor hvilke som helst av legemidlene i studien, - graviditet/laktasjon.

Fremgangsmåter

I en åpen merket studie, inkluderte vi 6 pasienter med chirrose og som var innlagt for behandling variceal blødning. De var tilpasset for alvorligheten av leversykdom (se tabell 4). De ble behandlet med et av de følgende regimer i en 3-dagers periode og observasjoner ble gjort i 5 dager. Studiegruppene var:

i. Placebo: 5 % dekstrose i 4 timer (250 ml)

ii. Isoleucin alene: 10 gm IV i 250 ml 5 % dekstrose i 2 timer i to oppdelte doser.

iii. Isoleucin ornitin fenylbutyrat: Isoleucin:10 gm IV i 250 ml 5 % dekstrose i 2 timer i to oppdelte doser; Ornitin: 20 g i 250 ml, 5 % dekstrose (t=0; 24, 48 hr); Fenylbutyrat:10g to ganger daglig, oralt (t=0, 12, 24, 36, 48 hr).

Pasienter fastet natten over mellom 0000 midnatt og 0800 am. De ble matet intragastrisk med en diett av 25 KCal/kg som inkluderte 1g/kg proteindiett begynnende ved 0800 og avsluttende ved midnatt. Blod ble prøvetatt ved 0730 og deretter ved 1800 for måling av ammoniakk og glutamin. Pasienter ble overvåket grundig for bieffekter. Legemiddelet ble godt tolerert i hver av gruppene og ingen ugunstige hendelser ble observert. Fordi pasientene mottok beroligende middel for deres initielle endoskopi, var vurderingen av mental tilstand umulig å tolke. En pasient hver i placebo- og isoelucingruppene døde fra multiorgansvikt på sykehuset. Resten av pasientene overlevde.

Tabell 4

SBP: spontan bakteriell peritonititt, Ikke-alkoholisk steatohepatitt, ICU: Intensivbehandlingsstøtte nødvendig, HRS: hepatorenalt syndrom

Resultater

Figur 14 viser at ingen signifikante endringer i ammoniakkonsentrasjoner i placeboog isoleucin-gruppene. I gruppen behandlet med OIP, var det en vesentlig reduksjon i ammoniakkonsentrasjon.

Figur 15 viser at glutaminnivåene ikke signifikant endres av administrering av verken isoleucin, placebo eller OIP. Kun i OIP-gruppen var ammoniakken vesentlig redusert.

Figur 16 viser et alternativ ved hvilket OIP kan virke er gjennom en reduksjon i den ammoniakkgene aminosyren, glysin. Vesentlig reduksjon i glysin observeres kun i OIP-gruppen.

Figur 17 viser isoleucinnivåene er svært lave til å begynne med i hver av gruppene, men øker til to ganger normale verdier i de isoleucinbehandlede gruppene. Konsentrasjonen i placebogruppen forblir lav og uendret.

Figur 18 viser endringene i ornitinnivåene i pasientene over behandlingsforløpet som viser markert vedvarende økning i konsentrasjonene av ornitin som signifikant reduseres til basale verdier ved stopp av legemiddelet, indikerende opptak i de forskjellige vev.

Eksempel 13: Effekten av ornitin og fenylbutyrat i gallegangligert rotte

Fremgangsmåter

Indusering av chirrose ved gallegangligering (BDL)

Sprague-Dawley rotter av hannkjønn (200-250 g) ble anvendt for denne prosedyren. Etterfølgende anestisering ble en midt-linje laparotami utført, gallegangen ble eksponert, trippelt ligert med 4,0 silkesutur, og avkuttet mellom den andre og tredje ligatur. Såret ble stengt i lag med adsorberbar sutur, og dyret tillat å komme seg i et stille rom før det ble returnert til dyrelagringsfasiliteten. Dyr ble holdt ved en konstant temperatur (20 °C) i en 12-timers lys/mørke syklus med tilgang til vann og standard gnagerfôr ad libitum.

Etter fem uker post-BDL (eller blindprosedyre) ble dyrene skiftet fra gnagerfôr til en komplett væskediett (Liquidiet, Bio-Serv, Frenchtown NJ, USA) til hvilket det ble tilsatt en aminosyreblanding etterlignende sammensetningen av hemoglobin (2,8 g/kg/dag, Nutricia Cuijk, Nederland, produkt nr. 24143). Ved seks uker ble, under anestesi, et høyre carotid arterielt kateter innsatt og anvendt til å samle gjentatte blodprøver. Etterfølgende denne prosedyren ble en grunnlinjeprøve samlet før administrering av studiesammensetningene ved IP-injisering. Studiegruppene var: BDL-kontroll saline (n=5), BDL ornitin (0,22 g/kg, n=6) i saline IP, BDL fenylbutyrat (0,3 g/kg, n=7) i saline IP, BDL OP (0,22 g/kg/0,3 g/kg, n=7) i saline IP.

Blodprøver ble samlet i for-kjølede heparinserte rør og lagret på is før prosessering. Plasma ble samlet etterfølgende sentrifugering (3000 rpm, 10 min) og lagret ved -80 °C før analyser.

Ammoniakk, glukose, laktat og urea ble målt ved anvendelse av en COBAS Mira S i henhold til produsentens instruksjoner. Aminosyrer ble kvantifisert ved HPLC med fluorescensdeteksjon.

Resultater

I den cirrhotiske gallegangligerte rottemodellen er det en vesentlig økning i det arterielle plasma ammoniakknivået (205 ± 11 μmol/L, middelverdi ± SEM) sammenlignet med friske kontroller (25,6 ± 2 μmol/L, p<0,001 data, ikke vist). I denne modellen fant vi at det ikke var noen endring i det arterielle plasma ammoniakknivået over tre timer i den saline-behandlede placebogruppen.

Figur 19 viser endringen i arterielle plasma ammoniakknivåer i BDL cirrhotiske rotter etterfølgende IP-injeksjoner av saline (BDL kontroll, n=5), ornitin (Orn, 0,22 g/kg, n=6), fenylbutyrat (PB, 0,3 g/kg, n=7) og ornitin fenylbutyrat (OP, 0,22 g/kg 0,3 g/kg, n=7). * betegner p<0,05 for OP vs Orn ved 3 timer (2-veis ANOVA).

Denne figuren viser at det i ornitinbehandlede dyr ble påvist en liten nedgang i ammoniakkonsentrasjon, selv om denne ikke ble funnet å være forskjellig fra placebo. I den fenylbutyratbehandlede gruppen ble det funnet en signifikant økning i plasmaammoniakk etter 1 time (p<0,01 vs. alle andre grupper), selv om denne forskjellen ble funnet å være mindre ved tre-timers tidspunktet. Dette funnet passer med hypotesen at fenylbutyrat (fenylacetat) kun er effektiv i individer med hevede glutaminkonsentrasjoner. I dyrene uten ornitinsupplementering som kan metaboliseres til å danne glutamin, er effektene av P alene uønskede og er potensielt skadelige. Et signifikant lavere ammoniakknivå ble observert i den ornitin pluss fenylbutyrat- (OP) behandlede gruppen. I disse dyrene ble en vedvarende senkning av ammoniakk målt over den tre timer lange varigheten av studien, nivåene av hvilke ble funnet å være signifikant mindre enn de i kun-ornitingruppen ved slutten av studien (p<0,05).

Dette demonstrerer tydelig at kombinasjonen av OP har større virkning i å redusere plasmaammoniakk enn enten O eller P alene. Videre kan de økte plasmanivåene av ammoniakk være detrimentale i de P-alene behandlede dyrene.

I en delmengde av prøver undersøkte vi opptak av ornitin i blodstrømmen etterfølgende IP-injisering av O eller OP. Figur 20 viser den arterielle ornitinkonsentrasjonen i de supplementerte gruppene. Det kan tydelig ses at i begge gruppene øker plasmaornitinkonsentrasjonen markert ved 1 time etterfølgende IP-injiseringen, hvilket deretter reduseres ved 3 timer ettersom dette ornitinet metaboliseres i kroppen. Ingen signifikant forskjell ble funnet i plasmaornitinkonsentrasjon mellom disse gruppene ved noe som helst tidspunkt.

Dette funnet er viktig ettersom det demonstrerer at den valgte fremgangsmåten av administrering er effektiv i å avlevere ornitin i disse dyrene. Videre indikerer det raske opptaket og observerte nedgang i plasmanivåer at aktiv metabolisme av denne aminosyren forekommer.

Eksempel 14: Effekten av ornitin, fenylbutyrat og isoleucin i gallegangligert rotte

Fremgangsmåter

Sprague-Dawley rotter av hankjønn (200-250 g) ble anvendt for denne prosedyren. I de 48-timene før avlivning ble dyrene skiftet fra standard gnagerfôr til en komplett væske diett (Liquidiet, Bio-Serv, Frenchtown NJ, USA) til hvilket det ble tilsatt en aminosyreblanding etterlignende sammensetningen av hemoglobin (2,8 g/kg, Nutricia Cuijk, Nederland, produkt nr. 24143). Akutt leversvikt (ALF) ble indusert 24 timer før avlivning ved IP-injisering av galactosamin (1 g/kg, Sigma, Poole UK) i saline (n=5 i hver gruppe). Tre timer før avlivning ble dyr behandlet med enten en sammensetning av OIP (ornitin 0,22 g/kg, isoleucin 0,25 g/kg, fenylbutyrat 0,3 g/kg, i saline IP) eller saline kontroll. Ved termineringen av forsøket ble arterielt blod samlet i forkjølede hepariniserte rør og lagret på is inntil prosessering. Plasma ble samlet og lagret som ovenfor. Ammoniakk ble bestemt som ovenfor.

Resultater

Arterielle ammoniakknivåer ble funnet å være signifikant redusert i akutt leversviktrotter behandlet med OIP sammenlignet med placebokontroller (figur 21). Denne studien ble designet for å teste hvorvidt isoleucin i kombinasjon med ornitin og fenylbutyrat (fenylacetat) ville være i stand til å effektivt redusere plasmaammoniakk. Det er tidligere vist at isoleucin alene ikke påvirker ammoniakknivåer i humane studier, selv om dens effektivitet i kombinasjon med O og P ikke er testet tidligere.

Figur 21 viser arterielle plasmaammoniakknivåer i en hyperammonemisk akutt leversviktmodell for saline placebo (ALF) og OIP-behandlet (ALF OIP). Et signifikansnivå av p<0,01 ble funnet mellom disse to grupper (T-Test).

Dette funnet støtter hypotesen av at isoleucin i kombinasjon med ornitin og fenylbutyrat er effektiv å i redusere ammoniakknivåer. Disse er i tillegg til de fordelaktige effekter av isoleucin tidligere beskrevet for proteinsyntese.

Eksempel 15: Effekten av ornitin og fenylbutyrat i den devaskulariserte grisemodellen

Fremgangsmåter

Fem griser ble randomisert i fire grupper: akutt leversvikt (ALF)+placebo+placebo (n=2); ALF+ornitin+placebo; ALF+ fenylbutyrat placebo; ALF+ornitin og fenylbutyrat. Griser fikk katetere satt inn i den femorale arterie og vene, portale vene, renale vene og pulmonære arterie. Forsøket startet ved tid= -1 hr, når placeboeller behandlingsinfusjoner ble startet.

1. Placebo: 5 % dekstrose i 3 timer, oral vannplacebo

2. Ornitin alene: 0,3 g/kg, 5 % dekstrose i 3 timer intravaskulært drypp 3. Fenylbutyrat: 0,3 g/kg, 5 % dekstrose i 3 timer intragastrisk fôr Ornitin fenylbutyrat: 0,3 g/kg, 5 % dekstrose i 3 timer intravaskulært drypp, 0,3 g/kg, 5 % dekstrose i 3 timer intragastrisk fôr.

ALF ble indusert ved portal vene anastamose til den inferiore vena cava og påfølgende hepatisk arterie ligering (devaskularisering) ved tid= 0 hr; infusjoner ble stanset ved t= 2 hr og forsøket ble terminert ved tid = 8 hr. Blod- og urinprøver ble samlet ved tid= 0, 1, 3, 5, 7 og 9 hr for måling av regional ammoniakk og aminosyreendringer. Ved slutten av forsøket ble en seksjon av frontal cortex fjernet for hjernevannmålinger.

Resultater

Etterfølgende ornitininfusjon frembringende intracellulær glutamat og intragastrisk tilførsel av konjugerende fenylacetatresultater antyder dyp endring i totale ammoniakknivåer og glutaminutnytting i denne katastrofiske modellen av leversvikt.

Det er en konsistent stigning i arteriell ammoniakkonsentrasjon med tiden fra devaskularisering i de placebobehandlede dyrene (figur 22), med en viss muskel produksjon (figur 23) og en stor mengde av ammoniakk som kommer fra tarmen (figur 24). Dette dyret viser en mild muskelglutaminfrigjøring (figur 25) og merkbar tarmglutaminopptak (figur 26).

I tilfellet av det ornitin-alene behandlede dyret, sløves den tidlige ammoniakkstigningen initielt, men stiger deretter til å være den høyeste ved terminering av forsøket (figur 22). Det er et netto opptak av ammoniakk av muskelen i dette dyret (figur 24), med en sammenlignbar mengde av glutamin som frigjøres fra muskel– sammenlignet med det placebo-behandlede dyret (figur 25) med et økt tarmopptak av glutamin (figur 26).

Fenylbutyrat alene viser også en initiell sløving av arterielle ammoniakknivåer, som hurtig stiger til nivåer sammenlignbare med ornitin alene ved eksperimentterminering (figur 22) med liten endring i muskel ammoniakk opptak (figur 23), men tydelig tarmproduksjon av ammoniakk (figur 24). Interessant er at der er en netto fjerning av glutamin av muskel med fenylbutyrat alene-behandling (figur 25) med lite åpenbar effekt på tarmglutaminopptak, sammenlignet med placebo-behandlede dyr (figur 26).

Kombinasjonen av ornitin og fenylbutyrat har den største innvirkningen på arterielle ammoniakknivåer med en imponerende reduksjon i sirkulerende nivåer ved slutten av forsøket sammenlignet med alle de andre dyrene (figur 22). Ammoniakk fjernes aktivt fra blodet ved muskel i dette dyret (figur 23) med en svært redusert tarm ammoniakkproduksjon (figur 24). Det er interessant å bemerke at muskelglutaminfrigjøringen øker sammenlignet med både placebo og ornitin alene behandlede dyr (figur 25). Til tross for denne økte glutaminproduksjonen i muskelen, reduseres tarm glutaminopptaket vesentlig (figur 26).

En demonstrasjon av økte sirkulerende nivåer av ornitin i de ornitin-behandlede dyrene vises i figur 27.

Virkningen av devaskulariseringen og behandlingsintervensjonene på arteriell glutamin er vist i figur 28. Det er en økning i det sirkulerende nivået av glutamin i de ornitin-behandlede dyrene, hvilket bedres ved ko-administrering av fenylacetat. Et interessant funn var den betydelige forbedringen av de arterielle glysinnivåer som ble funnet i dyret behandlet med både ornitin og fenylbutyrat (figur 29).

Ved slutten av forsøket ble den frontale cortex av hjernen fjernet og hjerne vanninnhold målt (figur 30).

En uavhengig patolog rapporterte på den cellulære anatomien av hjernen i disse eksperimentelle dyrene. Hans rapport er oppsummert nedenfor.

ALF: Mikrovessels med perivaskulær ødem med omliggende vesikler. Neuron med nekrotiske endringer omkranset av vesikler.

ALF O+P: Mikrovessels med perivaskulær ødem med omliggende vesikler (mindre enn fra ALF uten noen behandling). Intracellulær ødem.

Blind: Hjernevev med minimale ultrastrukturelle endringer=normalt hjernevev.

Konklusjoner

Oppfinnerne har funnet at simulering av enkelte av symptomene av et akutt angrep forbundet med kronisk leversykdom, slik som å øke ammoniakkonsentrasjonen eller simulere en gastrointestinal blødning, resultater i reduksjon av neutrofil funksjon og denne reduksjonen kan delvis reverseres ved ornitin eller isoleucin. Redning av neutrofil funksjon av både ornitin og isoleucin spiller en viktig rolle i forebygging av sepsis, hvilket er en vanlig utløsende faktor i fremskridelse av leverdekompensasjon.

Videre har oppfinnerne funnet at isoleucin ikke påvirker stigningen i konsentrasjon av ammoniakk etterfølgende en simulert gastrointestinal blødning. Derfor er, i motsetning til hypotesen om at ammoniakknivåer vil synke ved administrering av isoleucin på grunn av stimulering av proteinsyntese, ammoniakknivåer upåvirket. Således er anvendelse av isoleucin i kombinasjon med ornitin, som er kjent for å senke ammoniakknivåer, særskilt fordelaktig.

Derfor vil administrering av ornitin og isoleucin forhindre de metaboliske konsekvensene av en gastrointestinal blødning. Stigende ammoniakknivåer sløves, defisiensen i isoleucin korrigeres og neutrofil funksjon reddes. Den kombinerte anvendelsen av ornitin og isoleucin tilveiebringer derfor en ny behandling for pasienter etterfølgende en utløsende hendelse for å forhindre leverdekompensasjon fra å forekomme.

Oppfinnerne har også funnet at L-ornitin L-aspartat (LOLA), hvilket anvendes for å redusere ammoniakk i pasienter med hepatisk encefalopati, ikke reverserer effekten av ammoniakk på neutrofil funksjon. Således er anvendelse av ornitin alene med fordelaktig enn anvendelse av LOLA, siden ornitin både kan redusere ammoniakk og redde neutrofil funksjon. I tillegg akkumuleres aspartatkomponenten av LOLA i kroppen. Denne akkumuleringen av aspartat kan faktisk være skadelig for pasienter siden aspartat svekker effekten av ammoniakk på neutrofil funksjon, videre reduserende neutrofil funksjon. Som det følger av dette, kan forebygging eller forsinking av inntreden av leverdekompensasjon oppnås ved anvendelse av ornitin i kombinasjon med isoleucin, fortrinnsvis i fravær av aspartat.

Videre har oppfinnerne funnet at behandling av pasienter med hepatisk encefalopati (HE) med L-ornitin L-aspartat (LOLA) reduserer ammoniakknivåer og som en konsekvens, øker glutaminnivåer. Dog er glutamin kun en temporær ammoniakkbuffer siden den kan gjenvinnes og regenerere ammoniakk i nyren og tynntarmen. Derfor kan behandling med LOLA alene føre til en sekundær økning i ammoniakknivåer, videre bidragende til patologien av hepatisk encefalopati.

Anvendelse av fenylacetat eller fenylbutyrat i barn med ureasyklusforstyrrelser reduserer de unormalt høye nivåene av glutamin. I motsetning har pasienter lidende av HE normale nivåer av glutamin såfremt ikke, som vist i eksempel 1, de behandles med LOLA hvilket reduserer nivåer av ammoniakk, men øker nivåer av glutamin. Derfor tillater anvendelse av fenylacetat og/eller fenylbutyrat for fjerningen av glutamin for å forhindre den sekundære stigningen i ammoniakknivåer i pasienter med HE.

Som det følger av dette, kan en forbedret behandling for hepatisk encefalopati oppnås ved administrering av ornitin i kombinasjon med minst en av fenylacetat og fenylbutyrat, fortrinnsvis i fravær av aspartat.

Våre inngående undersøkelser i dyremodeller og også i mennesker med chirrose støtter synet av at hovedorganet for å fjerne ammoniakk i pasienter med chirrose er muskelen, som konverterer ammoniakk til glutamin, en reaksjon i hvilket glutamat anvendes. I leversvikt induseres enzymet ansvarlig for denne reaksjonen, glutaminsynthetase induseres og frembringelse av glutamat vil øke ammoniakkdetoksifisering.

Ornitin, en forløper til glutamat, detoksifiserer ammoniakk ved transformering til glutamin. Dog har våre innledende studier vist at dette glutaminet, resirkuleres og regenererer ammoniakk. Vår oppfinnelse tilveiebringer en hittil ukjent fremgangsmåte av ikke bare å detoksifisere ammoniakk til glutamin, men også eliminere overskuddsglutaminet som genereres. Således reduserer OP ammoniakkonsentrasjon i pasienter med chirrose og hyperammonemi signifikant mer markert enn den ene alene. Effekten er tydelig synergistisk heller enn additiv. I tillegg avskaffes, postprandial økning i ammoniakk ved administrering av OP. Denne kan tillate for mating av pasienter med dekompensert chirrose med proteinrike dietter uten risikoen for hyperammonemi.

Reduksjonen i ammoniakk var forbundet med forbedring i den mentale tilstanden.

Den oppnår reduksjon i ammoniakkonsentrasjon ved å forebygge en økning i glutamin. Dette er i overensstemmelse med hypotesen om at ornitin driver glutaminproduksjonen i muskelen (derved fangende 1 molekyl av ammoniakk), men dette glutaminet utskilles (eventuelt som et addukt av fenylacetat) forebyggende en stigning i systemisk glutamin, derved forebyggende hyperammonemi tilbakevending.

Den etablerte kunnskapen om at fenylacetat reduserer ammoniakk i den hyperammonaemiske nyfødte presenterende med ureasyklusforstyrrelser er at ammoniakken fanges i glutamin og at glutaminet transporteres til nyrene for utskillelse som fenylacetatglutaminadduktet. Disse nyfødte presenterer med høy ammoniakk og, førs og fremst, høy glutamin. I kontrast presenterer de cirrhotiske pasienter med høy ammoniakk og normal til lav glutamin. Grisemodellen beskrevet ovenfor har ikke en forhøyet glutamin og ammoniakknivåene øker dramatisk etter at leveren isoleres.

Behandling med ornitin alene øker blodglutamin, mens ammoniakknivåer er upåvirkede. Fenylbutyrat alene øker glutamin marginalt og har igjen usignifikante effekter på ammoniakknivåer. I dramatisk kontrast medfører, i denne katastrofiske modellen av eskalerende hyperammonaemi, kombinasjonen av både ornitin og fenylbutyrat (OP), en merkbar reduksjon i sirkulerende ammoniakk og bedrer økningen i glutamin sett med ornitin alene. Glysin, en ammoniakkfrembringende aminosyre, økte i alle dyrene, dog var økningen vesentlig mindre kun i de OP-behandlede dyrene, antydende ytterligere fordel å få for denne typen av intervensjon. En etablert konsekvens av elevert ammoniakk er hjerneoppsvulming ettersom vanninnholdet i hjernen øker. Hjernen fra ornitin alene-behandlet gris viser betraktelig økning i vann innhold mens ornitinet og fenylbutyratet kombinert reduserer hjerne vanninnhold. Histologisk er det mindre synlig skade i mikrostrukturen av hjernen av ornitinet og fenylbutyratet kombinertbehandling dyr sammenlignet med det placebobehandlede dyret.