NO334610B1 - Terapeutiske forbindelser og anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsene for fremstilling av et cytotoksisk medikament for behandling av kreft, hvor kreften er forårsaket av en genetisk defekt i et gen som medierer homolog rekombinasjon - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen vedrører trisykliske laktamindolderivater og triasykliske laktambenzimodolderivater og deres anvendelse ved inhibering av aktiviteten til PARP-enzym. Oppfinnelsen vedrører også anvendelsen av disse forbindelsene for fremstilling av medikamenter.

Description

Denne oppfinnelsen vedrører en serie forbindelser som er derivater av trisykliske laktamindoler og trisykliske laktambenzimidazoler og som inhiberer poly (ADP-ribose)-polymerase (PARP) og dere anvendelse i behandling av kreft, spesielt brystkreft.

Homolog rekombinasjon (HR) har blitt vist å spille en viktig rolle i reparasjon av skade som forekommer på DNA-replikasjonsknutepunktet i pattedyrceller (2). Slik viser celler som mangler HR dårlig vekst og oppviser høyere nivåer av genetisk ustabilitet. Det er antatt at genetisk ustabilitet som skyldes tap av HR-reparasjon i humane kreftformer vesentlig bidrar til utviklingen av kreft i disse cellene (1).

Posttranskripsjonell modifisering av nukleære proteiner ved poly-(ADP-ribosyl)ering som en følge av brudd i DNA-tråden spiller en viktig rolle i DNA-reparasjon, regulering av apoptose og opprettholdelse av genomisk stabilitet.

Poly (ADP-ribose)-polymerase (PARP-1) er det viktigste medlemmet av PARP-enzymfamilien og er et vanlig forekommende nukleært protein i pattedyrceller. PARP-1 katalyserer dannelsen av poly (ADP-ribose) (PAR)-polymerer ved å benytte NAD<+>som substrat. Ved DNA-skade binder PARP-1 raskt til et DNA-enkelttrådbrudd (SSB) og katalyserer påsetningen av negativt ladde PAR-kjeder på seg selv (automodifisering) og andre proteiner [se (3,4) for gjennomgang]. Bindingen av PARP-1 til SSB er antatt å beskytte DNA-lesjoner fra ytterligere prosessering inntil PARP-1 blir dissosiert fra bruddet ved den akkumulerte, negative ladningen som skyldes PAR-polymerer (5,6).

Selv om PARP-1 har blitt implisert i flere kjerneprosesser, slik som modulering av kromatinstruktur, DNA-replikasjon, DNA-reparasjon og -transkripsjon, utvikles PARP-1 knockoutmus normalt (7). Celler som er isolert fra disse musene oppviser en hyperrekombinasjonsfenotype og genetisk ustabilitet i form av økte nivåer av søster-kromatiske endringer (SCE) mikrokjerner og tetraploiditet (8, 10). Genetisk ustabilitet kan også forekomme i disse PARP-l-knockoutmusene via telomerforkorting, økt hyppighet av kromosomfusjon og aneuploid (11), selv om alle disse resultatene ikke kunne bli repetert i et annet sett med PARP-1 - knockoutmus (12). I de første knockout-musene reddet PARP-l-nullmutasjon gal V (D) J-rekombinasjon i SCID-mus (13).

Disse resultatene underbygger synet som er foreslått av Lindahl og samarbeids-partnere om at PARP-1 har en beskyttende rolle mot rekombinasjon (5). Det ble foreslått at binding av PARP-1 til ssDNA-brudd forhindrer rekombinasjonsmaskineriet fra å gjenkjenne og prosessere DNA-lesjoner eller, alternativt, at de negative ladningene som blir akkumulert etter poly (ADP-ribosylering) frastøtte motstående rekombinogene DNA-sekvenser. Kun den siste modellen er i overensstemmelse med inhibering av PARP-1 selv og uttrykking av en dominant negativ mutant PARP-1, inkludert SCE, genamplifikasjon og homolog rekombinasjon (14-18).

Undersøkelser basert på behandling av celler med inhibitor av PARP-1 eller celler som er avledet fra PARP-1-knockoutmus indikerer at undertrykkingen av PARP-1-aktiviteten øker cellenes mottakelighet for DNA-skadende midler og inhiberer sammen-føyning av tråder med brudd (3,4, 8- 11,19,20).

Inhibitorer av PARP-1-aktivitet har blitt benyttet i kombinasjon med tradisjonelle kreftbehandlingsregimer, slik som radioterapi og kjemoterapi (21). Når inhibitorene ble benyttet i kombinasjon med metylerende midler, topoisomerasegiftstoffer og ioniserende stråling ble det kjent å forsterke effektiviteten av disse formene for behandling. Likevel er slike behandlinger ikke-selektive og som sådanne forårsaker de skade og død for ikke-kreftrammede eller "friske" celler. Videre er slike behandlinger kjent for å føre til ubehagelige bivirkninger.

Derfor er det svært ønskelig å tilveiebringe en behandling mot kreft som er både effektiv og selektiv til å drepe kreftceller og som ikke trenger å bli administrert i kombinasjon med radioterapibehandling eller kjemoterapibehandling.

Overraskende er det blitt funnet at celler som mangler homolog rekombinasjon (HR) er hypersensitive overfor PARP-inhibitorer i forhold til villtypeceller.

Foreliggende oppfinnelse angår tilveiebringelse av en forbindelse som har formel I, II eller III, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for anvendelse som et cytotoksisk medikament for behandling av kreft hvor kreften er forårsaket av en genetisk defekt i genet som medierer homolog rekombinasjon:

Forbindelsene som er beskrevet her kan bli fremstilt via syntetiske ruter som er basert på de som er tilkjennegitt i WO 00/42040 og WO 01/16136.

Det skal bli forstått slik her at der referanse er gjort til forbindelser med formel I til III så skal referansen anses også å strekke seg til deres farmasøytisk akseptable salter.

Som referert til her, inkluderer farmasøytisk akseptable salter metallsalter, fosfater og kvarternære aminer. Metallsaltene kan bli dannet med alkalimetaller, slik som litium, natrium eller kalium.

Fortrinnsvis blir formel I ovenfor administrert i form av et farmasøytisk akseptabelt fosfatsalt som har den følgende formel:

Formel I - fosfat

Foreliggende oppfinnelse vedrører den terapeutiske anvendelsen av forbindelsene som er beskrevet her.

Ifølge et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse blir det tilveiebrakt anvendelsen av en terapeutisk mengde av en forbindelse med formel I, II eller III, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav ved fremstillingen av et cytotoksisk medikament til behandlingen av kreft, hvor kreften er forårsaket av en genetisk defekt i et gen som medierer homolog rekombinasjon.

Kreften, forårsaket av en genetisk defekt i et gen som medierer homolog rekombinasjon, inkluderer spesielt brystkreft.

Som referert til her, inkluderer "kreft" eller "tumor", kreft i lungen, tykktarmen, pankreas, magen, ovariet, cervix, bryst, prostata, ben, hjerne eller hud.

PARP-inhibitorene anvendes ved behandlingen av kreft som er forårsaket av en genetisk defekt i et gen der nevnte gen medierer homologe rekombinasjoner. Kreftceller av denne typen har en tendens til å være HR-manglende.

Den spesifikke sensitiviteten til HR-manglende tumorer overfor PARP-inhibering betyr at normalt delende "friske" celler hos pasienter som har en tilstrekkelig mengde av HR, i stor grad vil være upåvirket av behandlingen.

Et ytterligere fortrinn ved behandling ved å benytte PARP-inhibitorer er at PARP-inhibitorene ikke trenger å bli administrert som en kombinasjonsterapi sammen med konvensjonell radioterapibehandling eller kjemoterapibehandling, for derved å unngå bivirkningene som er assosiert med disse konvensjonelle formene for behandling.

En defekt i et gen som medierer homolog rekombinasjon kan skyldes en mutasjon i, fravær av, eller feilaktig ekspresjon av, et gen som koder for et protein som er involvert i HR.

Ifølge et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse blir det tilveiebrakt anvendelsen av en terapeutisk mengde av en forbindelse med formel I, II eller III eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav for fremstilling av et cytotoksisk medikament for å indusere apoptose i kreftceller, hvor kreftcellene har en defekt i et gen som medierer homolog rekombinasjon.

Kreftceller som er passende for behandling med forbindelsene som er beskrevet her, kan partielt eller totalt mangle HR. Fortrinnsvis mangler cellene totalt HR.

Forbindelsene som er beskrevet her kan også bli benyttet til å behandle en arvelig form av kreft der pasienten som skal bli behandlet har en familiær predisponering for kreftformen. Likevel er nevnte forbindelser spesielt passende til behandlingen av genbundet, arvelig kreft, og mest foretrukket, genbundet, arvelig brystkreft.

I et foretrukket aspekt er PARP-inhibitoren nyttig i behandlingen av kreftceller med feilaktig ekspresjon av et gen som er involvert i HR. Gener med antatt funksjon i HR, inkludert XRCC1, ADPRT (PARP-1), ADPRTL2, (PARP02) CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51p\ RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCCR, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NB51, WRN, BLM KU70, KU80, ATM,

ATR CHK1, CHK2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCC, RADI, RAD9 [Se

(2,3, 5,22-28) for gjennomgang].

Et gen som er involvert i HR kan være et tumorsuppressorgen. Oppfinnelsen tilveiebringer slik behandlingen av kreftceller som mangler uttrykkingen av et tumorsuppressorgen. Fortrinnsvis er tumorsuppressorgenet BRCA1 eller BRCA2.

Brystkreft er den vanligste typen av kreft blant kvinner i den vestlige verden. Visse familier har en sterk predisponering for brystkreft, som ofte skyldes en arvelig mutasjon i et allel for enten BRCA1 eller BRCA2. Likevel blir et funksjonelt allel opprettholdt. Slik utvikles individer som har den nevnte mutasjonen normalt og får ingen fenotypisk konsekvens fra denne mutasjonen. Likevel kan det funksjonelle allelet bli tapt i en celle, noe som gjør cellen til en kreftcelle og samtidig mangle HR. Dette trinnet er kritisk i forhold til fremveksten av en tumor (1).

Kreftcellene som skal bli behandlet kan delvis eller totalt mangle BRCA1- eller BRCA2-uttrykking. Slike mangler kan bli identifisert ved å benytte multipleks-PCR-teknikker (29, 30) eller ved å benytte andre screeninger som er kjent for fagfolk på området. Spesielt nyttige teknikker inkluderer samtids, kvantitativ, RT-PCR, Northern-blotting, immunhistokjemi og Western-blotting (31, 32).

Forbindelsen med formel I, II, og III er av interesse for behandlingen av et utvalg av valgte krefttumorer, og er anvendbare for behandlingen av en pasient som lider av kreft forårsaket at en genetisk defekt i genet som medierer HR.

Forbindelsene som blir beskrevet her kan bli administrert i en terapeutisk effektiv, ikke-toksisk mengde via enhver passende rute for effektivt å målsøke kreftceller. Passende administreringsmåter inkluderer, men er ikke begrenset til, enhver av de følgende: oralt, intravenøst, intramuskulært, intradermalt, intranasalt eller topisk.

En terapeutisk effektiv mengde av forbindelsene som er beskrevet her er typisk én som er tilstrekkelig til å oppnå den ønskede effekten og kan variere i henhold til egenskapene og alvorligheten til sykdomstilstanden og styrken til forbindelsen. Det vil bli satt pris på at ulike konsentrasjoner kan bli benyttet til profylakse i forhold til for behandling av en aktiv sykdom.

For administrering til pattedyr, og spesielt mennesker, er det forventet at det daglige doseringsnivået av det aktive middelet vil være fra 0,01 til 50 mg/kg hos mus og 0,01 mg/m<2>til 50 mg/m<2>kroppsoverflate hos mennesker. I siste instans vil likevel mengden av aktiv ingrediens som blir administrert og hyppigheten av administrering være opptil ansvarlig lege.

Fordelaktig er kun svært lave doser med PARP-inhiberende forbindelser nødvendig for å oppnå en terapeutisk effekt i behandling av kreft for derved å redusere systemisk opphopning av forbindelsene og dermed minimalisere potensielle assosierte toksiske effekter.

Selv om det kan være mulig for forbindelsene som er beskrevet her å bli administrert alene som "råforbindelsen" er det foretrukket at forbindelsene foreligger i et farmasøytisk preparat.

Alle fremgangsmåter for formulering i fremstilling av slike farmasøytiske preparater vil generelt inkludere trinnene med å bringe én av forbindelsene som er beskrevet her inn i assosiering med en bærer som utgjøre én eller flere tilleggsingredienser. Vanligvis blir formuleringene fremstilt ved uniformt og intimt å bringe forbindelsen ifølge formel I i assosiasjon med en flytende bærer eller med en fint oppdelt, fast bærer eller med begge og deretter, hvis nødvendig, forme produktet til ønskede formuleringer.

Formuleringer som er passende til oral administrering, kan bli fremlagt som avgrensede enheter, slik som kapsler, tabletter eller pastiller, der hver inneholder en forhåndsbestemt mengde av én av forbindelsene som er beskrevet her, som et pulver eller som granuler, eller en suspensjon i et vandig, flytende stoff eller ikke-vandig væske, slik som er sirup, en eliksir, en emulsjon eller et uttrekk. Enhver av forbindelsene som er beskrevet her kan også bli presentert som en bolus, medisin blandet med søtstoff eller en pasta.

En tablett kan bli fremstilt ved hjelp av sammenpressing eller forming, eventuelt med én eller flere tilleggsingredienser. Sammenpressede tabletter kan bli fremstilt ved å sammenpresse, i en passende maskin, enhver av forbindelsene som er beskrevet her i en frittflytende form, slik som et pulver eller granuler, eventuelt blandet med et bindingsmiddel, smøremiddel, inert fortynningsmiddel, overflateaktivt middel eller dispersjonsmiddel. Formede tabletter kan bli fremstilt ved å forme, i en passende maskin, en blanding av enhver av de pulveriserte forbindelsene som er beskrevet her med enhver passende bærer.

En sirup kan bli fremstilt ved å tilsette enhver av forbindelsene som er beskrevet her til en konsentrert, vandig løsning av et sukker, for eksempel sukrose, og til dette kan det bli tilsatt enhver ønsket tilleggsingrediens. Slike tilleggsingredienser kan inkludere smaksmidler, et middel for å hemme krystallisering av sukkeret eller et middel for å øke løseligheten til enhver annen ingrediens, slik som en polyhydrisk alkohol, for eksempel glyserol eller sorbitol.

Formuleringer for rektal administrering kan foreligge som en stikkpille med en vanlig bærer, slik som kakaosmør.

Formuleringer som er passende for parenteral administrering omfatter hensikts-messig et sterilt, vandig preparat av enhver av forbindelsene som er beskrevet her, som fortrinnsvis er isotont i forhold til blodet til mottakeren.

I tillegg til de tidligere nevnte ingrediensene kan formuleringene, for eksempel salver, kremer og lignende, inkludere én eller flere tilleggsingredienser, for eksempel et fortynningsmiddel, en buffer, smaksmiddel, bindingsmiddel, overflateaktivt middel, fortykningsmiddel, smøremiddel og/eller et preserveringsmiddel (inkludert en antioksidant) eller annen farmasøytisk inert eksipiens.

Forbindelsene kan også bli fremstilt for administrering i liposomale formuleringer som kan bli fremstilt ved hjelp av fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet.

Farmasøytiske preparat kan fremstilles som omfatter en forbindelse med formel I, II eller III, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, som et aktivt middel.

Det farmasøytiske preparatet kan ytterligere omfatte minst én annen ingrediens som utgjør et kompatibelt farmasøytisk akseptabelt tilsetningsstoff, bærerfortynnings-middel, bærer eller eksipiens og kan foreligge i enhetsdoseringsform.

Bæreren/bærerne må være farmasøytisk akseptable ved at de er kompatible med de andre ingrediensene i formuleringen og ikke skadelige for måltakeren derav.

De mulige formuleringene inkluderer de som er passende til oral, rektal, topisk og parenteral (inkludert subkutan, intramuskulær og intravenøs) administrering eller for administrering til lungen eller annet absorberende sted, slik som nesegangene.

Forbindelsene som blir referert til her kan bli administrert i kombinasjon med andre antikreftforbindelser.

Forbindelsene som er beskrevet her, og deres farmasøytisk akseptable salter, kan administreres i metoder for behandling av kreft i pattedyr.

Foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet ved hjelp av eksempler kun med referanse til de tilhørende figurene, der: Figur 1 er en graf som viser celleoverlevelse i nærvær av PARP-inhibitor med formel III i

AA8-cellelinje, IsrlSF-cellelinje og CxR3-cellelinje,

Figur 2 er en graf som viser celleoverlevelse i nærvær av PARP-inhibitor med formel III i

V79-cellelinje, VC8-cellelinje og VC8B2-cellelinje,

Figur 3 er en graf som viser celleoverlevelse i nærvær av PARP-inhibitor med

formel I i V79-cellelinje, VC8-cellelinje og VC8B2-cellelinje,

Figur 4 er et stolpediagram som viser PARP-aktivitet i VC8-, V79-, VC8#13- og VC8-,

VC8#13- og VC8+B2-cellelinjer i nærvær av PARP-inhibitor med formel III, Figur 5 er et par med grafer som viser cellulær PARP-aktivitet i nærvær av PARP-inhibitor med formel I og III i permeabiliserte (øvre graf) og intakte (nedre grad) L1210-celler,

Figur 6 er et par med stolpediagrammer som viser blod- og tumorfarmakokinetikk

og farmakodynamikk med formel I-fosfat ved 1 mg/kg (øvre) og 10 mg/kg (lavere) hos mus som bærer SW620-xenografer.

Figur 7 er et stolpediagram som viser farmakokinetikken og farmakodynamikken med

formel III hos mus som bærer SW620-xenografter.

Figur 8 er en graf som viser tumorveksten (gjennomsnittlig relativt tumorvolum) hos mus som bærer SW620-xenografter etter behandling med formel II i kombinasjon med temozolomid (TMZ) og med TMZ alene. Figur 9 er en graf som viser tumorveksten (gjennomsnittlig relativt tumorvolum) for mus som bærer SW620-xenografter etter behandling med formel I i kombinasjon med temozolomid (TMZ) og med formel I-fosfat og TMZ alene, Figur 1 viser den prosentvise overlevelsen for AA8-, IrS-ISF- og CxR3-cellelinjer når de blir behandlet med ulike konsentrasjoner av forbindelsen med formel III. Formel III ble funnet å være mest aktiv mot IrS ISF, som mangler XRCC3, og som har en LC50(konsentrasjonen av den aktive forbindelsen som dreper 50 % av cellene) på 100 nM. Figur 2 viser prosentvis overlevelse for V79-Z-, VC8- og VC8B2-cellelinjer når de blir behandlet med ulike konsentrasjoner av forbindelsen med formel III. Formel III ble funnet å være mest effektiv mot VC8-cellelinjen, som mangler BRCA2, og som har en LCso-verdi på 43 nM og LCc>o-verdi (konsentrasjon av aktiv komponent som dreper 90 % av cellene) på 1 200 nM. Figur 3 viser prosentvis overlevelse for V79-Z, VC8- og VC8B2-cellelinjer når de ble behandlet med ulike konsentrasjoner av forbindelsen med formel I. Formel I ble funnet å være mest effektiv mot VC8-cellelinjen, som mangler BRCA2, som har LCso-verdi på 12 nM, LC90var 27 nM. Figur 4 viser PARP-aktivitet for ulike cellelinjer når de ble behandlet med ulike konsentrasjoner av forbindelsen med formel III. Grafen i figur 3 er delt på fire resultatsett for hver respektive cellelinje. Den første stolpen for hvert sett viser bakgrunns-PARP-aktiviteten (ingen oligo til stede, slik at PARP-aktivitet er avhengig av endogene DNA-brudd), den andre stolpen er total stimulerbar (ved oligo) PARP-aktivitet, og den tredje og fjerde stolpen viser PARP-aktiviteten i nærvær av forbindelsen med formel III.

Figur 5 viser effekten av forbindelser med formel I og III på PARP-aktivitet.

Celler som ble benyttet til å fremskaffe resultatene som er vist i figur 5 var enten permeabiliserte med digitonin og deretter analysert for total stimulerbar (ved oligo) PARP-aktivitet i nærvær og fravær av PARP-inhibitor med formel I og formel III eller eksponert overfor én av nevnte PARP-inhibitorer i 20 minutter før permeabilisering og analysert for total stimulerbar PARP-aktivitet.

Det var ingen forskjell i den PARP-inhibitoriske aktiviteten for forbindelsene med formel I og formel III når cellene ble permeabilisert før tilsetning av inhibitorforbindelsen, men forbindelsen med formel I var sterkere i intakte celler, muligens fordi den akkumuleres i cellene i større grad.

Figur 6 viser plasmakonsentrasjonen og tumorkonsentrasjonen av forbindelsen med formel I, og den farmakokinetiske effekt på perifere blodlymfocytter fra mus (pbl parp) og SW620-xenografter (tumor-PARP) ved ulike tidspunkter etter intraperitoneal administrering av fosfatsaltet av forbindelsen med formel I. Fosfatsaltet av forbindelsen med formel I øker løseligheten for formel I. Ved administrering til et dyr (inkludert menneske) bryter plasmafosfataser fosfatsaltet med formel I (formel I-fosfat) ned til morforbindelsen, det vil si formel I.

Det er åpenbart fra figur 4 at 30 minutter etter administrering av formel I-fosfat ved 10 mg/kg, ble høye nivåer av forbindelsen påvist i både plasma og tumor. Konsentrasjonen av formel I minsket med tid raskere i plasma enn i tumor og ved 24 timer etter administrering var signifikante nivåer påvisbare i tumoren, men ingen kunne bli påvist i plasma. Det var en omfattende og vedvarende inhibering av PARP-aktivitet i både pbls og tumor: < 50 % kontroll opptil 24 timer.

Etter administrering av formel I-fosfat ved 1 mg/kg kan lavere nivåer av forbindelsen med formel I bli funnet i både plasma og tumor, og dermed var det en mindre tydelig effekt på PARP-aktivitet. Figur 7 viser plasmakonsentrasjonen og tumorkonsentrasjonen for forbindelsen med formel III, og dens farmakokinetiske effekt på SW620-xenografter (tumor-PARP-virkning) ved ulike tidspunkter etter intraperitoneal administrering av 10 mg/kg med forbindelse ifølge formel III. Denne forbindelsen fordeles også godt til tumoren og blir fortrinnsvis opprettholdt med tid og inhiberer tilsvarende PARP-aktivitet i tumoren. Figur 8 viser at 20 dager fra administrering av temolozomid (68 mg/kg daglig x 5) har tumorxenograften progressivt blitt redusert i størrelse. Likevel begynner tumorstørrelsen å øke igjen kort etter dette tidspunktet. Når en forbindelse med formel III (5 mg/kg daglig x 5) blir administrert i sammenheng med temozolomid, minsker tumoren signifikant i omtrent 15 dager, til en ikke-påvisbar størrelse, tumorstørrelsen forblir ikke-påvisbar i ytterligere 50 dager deretter, når den begynner å øke i størrelse. Når en større dose med formel III (15 mg/kg daglig x 5) blir administrert, forblir tumorstørrelsen ikke-påvisbar i ytterligere 80 dager inntil slutten av eksperimentet når ingen tumor var påvisbar ved autopsi, dvs. komplett tumortilbakedannelse. Figur 9 viser et tilsvarende mønster som i figur 8 etter administreringen av formel I-fosfat (ved 0,1 mg/kg og 1,0 mg/kg) i kombinasjon med temolozomid.

Materialer og fremgangsmåter

Cvtotoksisitet for PARP- inhibitorer overfor celler som mangler HR ( XRCC3 eller BRCA2)

Cellekultur

AA8-irslSF og CXR3-cellelinjene ble tilveiebrakt av Larry Thompson [41].

VC-8, VC-8+B2, VC-8#13 var en gave fra Malgorzata Zdienicka [42]. Alle cellelinjer i denne undersøkelsen ble dyrket i Dulbeccos modified Eagel's Medium (DMEM) med 10 % føtalt bovint serum og penicillin (100 U/ml) og streptomycinsulfat (100 ug/ml) ved 37 °C under en atmosfæres inneholdende 5 % CO2.

Toksisitetsanalyse - klonogen overlevelsesanalyse

Eksponentielt voksende celler i 6-brønners plate ble eksponert for forbindelsen med formel III ved konsentrasjonene som er indikert i fig. 2 i 1 % DMSO eller DMSO alene i medium i 24 timer.

Cellene ble høstet ved hjelp av trypsinering, talt og sådd ut ved varierende tettheter i 10 cm skåler i friskt medium i fravær av legemiddel for kolonidannelse.

7-10 dager senere ble skålene fiksert med metanol:eddiksyre 3:1 og farget med 0,4 % krystallfiolett.

Kolonier ble talt og overlevelsen relatert i forhold til 1 % DMSO-kontroll-behandlede celler ble kalkulert.

PARP-aktivitetsanalyse

Eksponentielt voksende celler ble eksponert overfor 1 % DMSO i kulturmedium (kontroll) eller en forbindelse med formel I eller III i 1 % DMSO ved konsentrasjoner indikert i fig. 4 til celler permeabilisert med digitonin, eller intakte celler i 20 minutter før vasking og digitoninpermeabilisering. PARP-aktivitet ble målt ved inkorporering av et [32P]-merket NAD+substrat i TCA-presipiterbare polymerer etter stimulering ved tilsetningen av et butt-endet oligonukleotid og sammenlignet med ikke-oligonukleotidstimulerte celler. PARP-aktivitet i tumorhomogenater (1 av 40 i isoton buffer) fra formel III-behandlet mus ble målt på samme måte. PARP-aktivitet i pbls- og tumorhomogenater fra formel I-fosfatbehandlede mus ble målt ved hjelp av immunologisk påvisning av polymer ved å benytte lOH-antistoff. Kort fortalt ble tumorhomogenater som er fortynnet opp til 1:1000 i isoton buffer inkubert med 350 um NAD i 6 min og blottet på nitrocellulosemembran. Poly(ADP-ribose) (PAR)-polymerdannelsen ble kvantifisert ved hjelp av kjemiluminiscenspåvisning ved å benytte en Fuji LAS3000 UV-illuminator med referanse til seriefortynninger av en PAR-standard, etter inkubering med 10H- antistoff mot PAR og et sekundært anti-museantistoff. Resultatene ble standardisert med referanse til det målte proteininnhold av homogenatet.

REFERANSER:

[1] C. Lundin, K. Erixon, C. Arnaudeau, N. Schultz, D. Jenssen, M. Meuth og T. Helleday Differrent roles for nonhomologous end joining and homologous recombination following replication arrest in mammalian cells, Mol Cell Biol 22 (2002) 5869-58-78.

[2] A.R. Venkitaraman Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and BRCA2, Cell

108(2002) 171-182.

[3] D. D'amour, S. Desnoyers, L. D'Silva og G.G. Poirier Poly(ADP-ribosyl)ation reactions

in the regulation of nuclear functions, Biochem J 342 (1999) 249-268.

[4] Z. Herceg og Z.Q. Wang Functions of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) in DNA

repair, genomic integrity and cell death, Mutat Res 477 (2001) 97-110.

[5] T. Lindahl, M.S. Satoh, G.G. Poirier og A. Klungland Post-translationnal modification of poly(ADP-ribose) polymerase induced by DNA strand breaks, Trends Biochem Sei 20(1995) 405-411.

[6] M.S. Satoh og T. Lindahl Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair, Nature

356(1992) 356-358.

[7] S. Shall og G. de Murcia Poly(ADP-ribose) polymerase-1: what have we learned from

deficient mousse model?, Mutat Res 460 (2000) 1-15.

[8] Z.Q. Wang, L. Stingi, C. Morrison, M. Jantsch; M. Los, K. Schulze-Osthoff og E.F. Wagner PARP is important for genomic stability but dispensable in apoptosis, Genes Devll (1997) 2347-2358.

[9] CM. Simbulan-Rosenthal, B.R. Haddad, D.S. Rosenthal, Z. Weaver, A. Coleman, R. Luo, H.M. Young, Z.Q. Wang, T. Ried og M.E. Smulson Chromosomal aberrations in PARP(-/-) mice: genome stabilization in immortalized cells by reintroduction of poly(ADP-ribose) polymerase cDNA, Proe Nati Acad Sei U S A 96 (1999) 13191-13196.

[10] J.M. de Murcia, C. Niedergang, C. Trucco, M. Ricoul, B. Dutrillaux, M. Mark, F.J. Oliver, M. Masson, A. Dierich, M. LeMeur, C. Walztinger, P. Chambon og G. de Murcia Requirement of poly(ADP-ribose)polymerase recovery from DNA damage in mice and in cells, Proe Nati Acad Sei U S A 94 (1997) 7303-7307.

[11] F. cTAdda di Fagagna, M.P. Hande, W.M. Tong, P.M. Landsdorp, Z.Q. Wang og S.P. Jackson Functions of poly(ADP-ribose) polymerase in controlling telomere length and chromosomal stability, Nat Genet 23 (1999) 76-80.

[12] E. Samper, FA. Goytisolo, J. Menissier-de Murcia, E. Gonzales-Suarez, J.C. Cigudosa, G. de Murcia og M.A. Blasco Normal Telomere length and chromosomal end capping in poly(ADP-ribose) polymerase-deficient mice and primary cells despite increased chromosomal instability, J Cell Biol 154 (2001) 49-60.

[13] C. Morrison, G.C. Smith, L. Stingi, S.P. Jackson, E.F. Wagner og Z.Q. Wang Genetic interaction between PARP and DNA-PK in V(D)J recombination and tumorgenesis, Nat Genet 17(1997) 479-482.

[14] V. Schreiber, D. Hunting, C. Trucco, B. Gowans, D. Grunwald, G. De Murcia og J.M. De Murcia A dominant-negative mutant of human poly(ADP-ribose) polymerase affects cell recovery, apoptosis, and sister chromatid exchange following DNA damage, Proe Nati Acad Sei U S A 92 (1995) 4753-4757.

[15] J.H. Kupper, M. Muller og A. Burkle Trans-dominant inhibition of poly(ADP-ribosyl)ation potentiates carcinogen indused gene amplification in SV40-transformed Chinese hamster cells, Cancer Res 56 (1996) 2715-2717.

[16] J. Magnusson og C. Ramel Inhibitor of poly(ADP-ribose)transferase potentiates the recombinogenic but not the mutagenic action of alkylating agents in somatic cells in vivo in Drosophila melanogaster, Mutagenesis 5 (1990) 511-514.

[17] A.S. Waldman og B.C. Waldman Stimulation of intrachromosomal homologous recombination in mammalian cells by an inhibitor of poly(ADP-ribosylation), Nucleic Acids Res 19 (1991) 5943-5947.

[18] A. Semionov, D. Cournoyer and T.Y. Chow Inhibition of poly(ADP-ribo Inhibition of poly(ADP-ribose)polymerase stimulates extrachromosomal homologous recombination in mouse Ltk-fibroblasts, Nucleic Acids Res 27 (1999) 4526-4526.

[19] F. Dabtzer, V. Schreiber, C. Niedergang, C. Trucco, E. Flatter, G. De LaRubia, J. Oliver, V. Rolli, J. Menissier-de Murcia og G. de Murcia Involvement og poly(ADP-ribose) polymerase in base excision repair, Biochimie 81 (2999) 69-75.

[20] F. Dantzer, G. de La Rubia, J. Menissier-De Murcia, Z. Hostomsky, G. de Murcia og V. Schreiber Base excision repair is impaired in mammalian cells lacking Poly(ADP-ribose)polymerase-l, Biochemistry 39 (2000) 7559-7569.

[21] L.Tentori, I. Portarena og G. Graziani Potential clinical applications of poly(ADP-ribose)polymerase (PARP) inhibitors, Pharmacol Res 45 (2002) 73-85.

[22] T. Lindahl and R.D. Wood Quality control by DNA repair, Science 286 (1999), 1897-1905.

[23] K.W. Caldecott DNA single-strand break repair and spinocerebellar ataxia, Cell 112

(2003) 7-10.

[24] D. D'Amours and S.P. Jackson The Mrell complex: at the crossroads of dna repair and

checkpoint signalling, Nat Rev Mol Cell Biol 3 (2002) 317-327.

[25] A.D. D'Andrea and M. Grompe The Fanconi anaemialBRCA pathway, Nat Rev Cancer 3 (2003) 23-34.

[26] S.P. Jackson Sensing and repairing DNA double-strand breaks, Carcinogenesis 23

(2002) 687-696.

[27] R. Kanaar, J.H. Hoeijmakers and D.C. van Gent Molecular mechanisms of DNA double

strand break repair, Trends Cell Bioi 8 (1998) 483-489.

[28] D.C. van Gent, J.H. Hoeijmakers and R. Kanaar Chromosomal stability and the DNA

double-stranded break connection, Nat Rev Genet 2 (2001) 196-206.

[29] S.L. Neuhausen and EA. Ostrander Mutation testing of early-onset breast cancer genes

BRCA1 and BRCA2, Genet Test 1 (1997) 75-83.

[30] G. Kuperstein, W.D. Foulkes, P. Ghadirian, J. Hakimi and S.A. Narod A rapid fluorescent multiplexed-PCR analysis (FMP A) for founder mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes, Clin Genet 57 (2000) 213-220.

[31] Vissac-Sabatier C, Coxam V, Dechelotte P, Picherit C, Horcajada M-N, Davicco M-J, Lebecque P, Bignon Y-J, and Bemard-Gallon D. Phytoestrogenrich diets modulate expression of BRCA1 and BRCA2 tumour suppressor genes in mammary glands of female Wistar rats. Cancer Research vol 63 pp 6607-6612 (2003).

[32] Wu K, Jiang S-W and Couch FJ. p53 mediates repression of the BRCA2 promoter and down regulation of BRCA2 mRNA and protein levels in response to DNA damage. J. Biol. Chem. Vol278 pp 15652-15660 (2003).

[33] A. Chiarugi Poly(ADP-ribose) polymerase: killer or conspirator? The 'suicide

hypothesis' revisited, Trends Pharmacol Sei 23 (2002) 122-129.

[34] CR. Calabrese, MA. Batey; H.D. Thomas, B.W. Durkacz, L.Z. Wang, S. Kyle, D. Skalitzky, J. Li, C. Zhang, T. Boritzki, K. Maegley, A.H. Calvert, Z. Hostomsky, D.R. Newell and N.J. Curtin Identification of Potent Nontoxic Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1 Inhibitors: Chemopotentiation and Pharmacological Studies, Clin Cancer Res 9 (2003) 2711-2718.

[35] D. Ferraris, Y.S. Ko, T. Pahutski, R.P. Ficco, L. Serdyuk, C. Alemu, C. Bradford, T. Chiou, R. Hoover, S. Huang, S. Lautar, S. Liang, Q. Lin, M.X. Lu, M. Mooney, L. Morgan, Y. Qian, S. Tran, L.R. Williams, Q.Y. Wu, J. Zhang, Y. Zou and V. Kalish Design and synthesis of poly ADP-ribose polymerase-1 inhibitors. 2. Biological evaluation of aza-5[H]-phenanthridin-6-ones as potent, aqueous-soluble compounds for the treatment of ischemic injuries, J Med Chem 46 (2003) 3138-3151.

[36] K.J. Dillon, G.C. Smith and N.M. Martin A FlashPlate assay for the identification

ofPARP-1 inhibitors, J Biomol Screen 8 (2003) 347-352.

[37] AJ. Pierce, R.D. Johnson, L.H. Thompson and M. Jasin XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells, Genes Dev 13 (1999) 2633-2638.

[38] R.D. Johnson, N. Liu and M. Jasin Mammalian XRCC2 promotes the repair of DNA

double-strand breaks by homologous recombination, Nature 401 (1999) 397-399.

[39] G.M. Shah, D. Poirier, S. Desnoyers, S. Saint-Martin, J.c. Hotlack, P. Rong, M. ApSimon, J.B. Kirkland and G.G. Poirier Complete inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase activity prevents the recovery of C3HI0T1I2 cells from oxidative stress, Biochim Biophys Acta 1312 (1996) 1-7.

[40] RJ. Griffin, S. Srinivasan, K. Bowman, A.H. Calvert, N.J. Curtin, D.R. Newell, L.C. Pemberton andB.T. Golding Resistance-modifying agents. 5. Synthesis and biological properties of quinazolinone inhibitors of the DNA repair enzyme poly(ADP-ribose) polymerase (pARP), J Med Chem 41 (1998) 5247-5256.

[41] S. Boulton, L.C. Pemberton, J.K. Porteous, NJ. Curtin, R.J. Griffin, B.T. Golding and B.W. Durkacz Potentiation of temozolomide-induced cytotoxicity: a comparative study of the biological effects of poly(ADPribose) polymerase inhibitors, Br J Cancer 72

(1995) 849-856.

[42] C.S. Griffin, P.J. Simpson, CR. Wilson and J. Thacker Mammalian recombination-repair genes XRCC2 and XRCC3 promote correct chromosome segregation, Nat Cell Biol 2 (2000) 757-761.

[43] R.S. Tebbs, Y. Zhao, J.D. Tucker, J.B. Scheerer, MJ. Siciliano, M. Bwang, N. Liu, RJ. Legerski and L.B. Thompson Correction of chromosomal instability and sensitivity to diverse mutagens by a cloned cDNA of the XRCC3 DNA repair gene, Proe Nati Acad Sei USA 92 (1995) 6354-6358.

[44] M. Kraakman-van der Zwet, WJ. Overkamp, R.E. van Lange, J. Essers, A. van Duijn-Goedhart, 1. Wiggers, S. Swaminathan, P.P. van Buul, A. Errami, R.T. Tan, N.G. Jaspers, S.K. Sharan, R. Kanaar and M.Z. Zdzienicka Brca2 (XRCC11) deficiency results in radioresistant DNA synthesis and a higher frequency of spontaneous deletions, Mol Cell Biol 22 (2002) 669-679.

Claims (27)

1. Forbindelse med formel I, II eller III eller farmasøytisk akseptable salter derav, for anvendelse som et cytotoksisk medikament for behandling av kreft, hvor kreften er forårsaket av en genetisk defekt i et gen som medierer homolog rekombinasjon

2. Forbindelse ifølge krav 1, hvor forbindelsen er forbindelsen med formel 1.

3. Forbindelse ifølge krav 2, hvor forbindelsen foreligger i form av fosfatsalt.

4. Forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 3, hvor kreften er brystkreft.

5. Forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 4 hvor den genetiske defekten er fraværet av et gen som koder for et protein som er involvert i homolog rekombinasjon.

6. Forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 4 hvor den genetiske defekten foreligger i ekspresjonen av et gen som koder for et protein som er involvert i homolog rekombinasjon.

7. Forbindelse ifølge krav 6, hvor genet som medierer homolog rekombinasjon er valgt fra gruppen som består av XRCC1, CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51p, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCCR, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NB51, WRN, BLM KU70, KU80, ATM, ATR CHK1, CHK2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RADI and RAD9.

8. Forbindelse ifølge enten krav 6 eller krav 7, hvor genet som medierer homolog rekombinasjon er et tumor supressor gen.

9. Forbindelse ifølge krav 8, hvor tumor supressor genet er BRCA1 og/eller BRCA2.

10. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse med formel I, II eller III eller farmasøytisk akseptable salter derav, for fremstilling av et cytotoksisk medikament for behandling av kreft, hvor kreften er forårsaket av en genetisk defekt i et gen som medierer homolog rekombinasjon

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvor forbindelsen er forbindelsen med formel 1.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvor forbindelsen foreligger i form av fosfatsalt.

13. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 10 til 12, hvor kreften er brystkreft.

14. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 10 til 13 hvor den genetiske defekten er fraværet av et gen som koder for et protein som er involvert i homolog rekombinasjon.

15. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 10 til 13 hvor den genetiske defekten foreligger i ekspresjonen av et gen som koder for et protein som er involvert i homolog rekombinasjon.

16. Anvendelse ifølge krav 15, hvor genet som medierer homolog rekombinasjon er valgt fra gruppen som består av XRCC1, CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51p, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCCR, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NB51, WRN, BLM KU70, KU80, ATM, ATR CHK1, CHK2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RADI and RAD9.

17. Anvendelse ifølge enten krav 15 eller krav 16, hvor genet som medierer homolog rekombinasjon er et tumor supressor gen.

18. Anvendelse ifølge krav 17, hvor tumor supressor genet er BRCA1 og/eller BRCA2.

19. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse med formel I, II eller III eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, til fremstilling av et cytotoksisk medikament for å indusere apoptose i kreftceller hvor kreftcellene er defekte i genet som medierer homolog rekombinasjon

20. Anvendelse ifølge krav 19, hvor forbindelsen er forbindelsen med formel 1.

21. Anvendelse ifølge krav 20, hvor forbindelsen foreligger i form av fosfatsalt.

22. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 19 til 21, hvor kreftcellene er brystkreftceller.

23. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 19 til 22 hvor den genetiske defekten i kreftcellene er fraværet av et gen som koder for et protein som er involvert i homolog rekombinasjon.

24. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 19 til 22 hvor den genetiske defekten i kreftcellene foreligger i ekspresjonen av et gen som koder for et protein som er involvert i homolog rekombinasjon.

25. Anvendelse ifølge krav 24, hvor genet som medierer homolog rekombinasjon er valgt fra gruppen som består av XRCC1, CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51p, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCCR, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NB51, WRN, BLM KU70, KU80, ATM, ATR CHK1, CHK2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RADI and RAD9.

26. Anvendelse ifølge enten krav 24 eller krav 25, hvor genet som medierer homolog rekombinasjon er et tumor supressor gen.

27. Anvendelse ifølge krav 26, hvor tumor supressor genet er BRCA1 og/eller BRCA2.