NO331877B1 - Loselig aß-form-T-cellereseptor (sTCR), multivalent T-cellereseptor(TCR)-kompleks, nukleinsyremolekyl, vektor, vertscelle og fremgangsmate for a fremskaffe hele eller deler av T-cellereseptoren, fremgangsmate for a pavise MHC-peptidkomplekser, og farmasoytisk formulering inneholdende sTCR eller multivalent TCR-kompleks. - Google Patents

Abstract

Sammendrag Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en løselig T-cellereseptor (sTCR) som omfatter (i) hele eller deler av en TCR-alfa-kjede, unntatt transmembrandomenet derav, og (ii) hele eller deler av en TCR-beta-kjede, unntatt transmembrandomenet derav. (i) og (ii) omfatter hver et funksjonelt variabelt domene og i det minste en del av det konstante domenet på TCRkjeden, og er bundet sammen med en disulfidbinding mellom residier på konstantdomenet som ikke er til stede i nativTCR. (Figur)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører løselige T-cellereseptorer (TCR).

Som beskrevet i WO 99/60120 medierer TCR T-cellers gjenkjennelse av spesifikke MHC- (Major Histocompatibility Complex) peptidkomplekser og er i egenskap av dette essensielle for virkningen av immunsystemets cellulære del.

Antistoffer og TCR er de eneste to typer av molekyler som gjenkjenner antigener på en spesifikk måte, og dermed er TCR den eneste reseptoren for spesielle peptid-antigener som presenteres av MHC der det fremmede peptidet ofte er det eneste tegnet på et avvik inne i cellen. T-cellegjenkjenning forekommer når en T-celle og en antigenpresenterende celle (APC) kommer i direkte fysisk kontakt, og blir initiert ved sammen-kopling av TCRer og pMHC-komplekser.

TCR er et heterodimert celleoverflateprotein tilhørende immunoglobulinsuperfamilien som er assosiert med uforanderlige proteiner i CD3-komplekset som er involvert i medieringen av signaloverføring. TCR foreligger i afl- og i y8-former som er strukturelt like, men T-celler som uttrykker dem har svært distinkte anatomiske lokaliseringer og sannsynligvis funksjoner. Den ekstracellulære delen av reseptoren består av to membranproksimale konstante domener og to membrandistale variable domener med polymorfe løkker som er analoge med de komplementaritets-bestemmende regionene (CDR) på antistoffer. Det er disse løkkene som danner bindingssetet på TCR-molekylet og som bestemmer peptidspesifisitet. MHC-klasse-I- og MHC-klasse-II-ligander er også proteiner i immunoglobulinsuperfamilien, men de er spesialiserte for antigenpresentering med et polymorfi; peptidbindingssete som gjør dem i stand til å presentere et bredt spekter av korte peptidfragmenter på APC-celleoverflaten.

Løselige TCRer er nyttige, ikke bare til formålet med å undersøke spesifikke TCR-pMHC-interaksjoner, men også potensielt som et diagnostisk redskap for å påvise infeksjon, eller for å påvise markører for autoimmunsykdom. Løselige TCRer har også anvendelse innenfor farging, for eksempel til farging av celler for å avsløre tilstedeværelse av et spesielt peptidantigen som presenteres i konteksten med MHC. Likeledes kan løselige TCRer bli benyttet for å levere et terapeutisk middel, for eksempel en cytotoksisk forbindelse eller en immunstimulerende forbindelse, til celler som presenterer et spesielt antigen. Løselige TCRer kan også bli benyttet for å hemme T-celler, for eksempel de som reagerer mot et autoimmunt peptidantigen.

Proteiner som består av mer enn én polypeptidsubenhet, og som har et trans-membrandomene, kan være vanskelige å fremstille i løselig form fordi proteinet i mange tilfeller blir stabilisert med sin transmembranregion. Dette er tilfellet for TCR, og det kommer frem i forskningslitteraturen som beskriver trunkerte fonner av TCR som inneholder enten bare ekstracellulære domener eller ekstracellulære og cytoplasmiske domener som kan bli gjenkjent av TCR-spesifikke antistoffer (noe som tyder på at den delen av den rekombinante TCRen som blir gjenkjent av antistoffet er korrekt foldet), men som ikke kan bli fremstilt med et godt utbytte, som ikke er stabile ved lave konsentrasjoner og/eller som ikke kan gjenkjenne MHC-peptidkomplekser. Denne litteraturen er presentert i WO 99/60120.

Et antall artikler beskriver fremstillingen av TCR-heterodimerer som inkluderer den native disulfidbroen som binder sammen de respektive subenhetene (Garboczi, et al.,

(1996), Nature 384(6605): 134-41, Garboczi, et al., (1996), J. Immunol. 157(12):5403-10, Chang et al., (1994), PNAS USA 91: 11408-11412, Davodeau et al., (1993), J. Biol. Chem. 268(21): 15455-15460, Golden et al., (1997), J. Imm. Meth. 206: 163-169, US patentskrift nr. 6080840). Selv om slike TCRer kan bli gjenkjent av TCR-spesifikke antistoffer ble likevel ingen vist å kunne gjenkjenne sin native ligand ved noe annet enn ved relativt høye konsentrasjoner og/eller de var ikke stabile.

I WO 99/60120 blir det beskrevet en løselig TCR som er korrekt foldet slik at den er i stand til å gjenkjenne sin native ligand, som er stabil over et tidsrom og som kan bli fremstilt i rimelige mengder. Denne TCRen omfatter et TCR-a- eller TCR-y-kjede-ekstracellulærdomene dimerisert henholdsvis med et TCR-B- eller TCR-8-kjede-ekstracellulærdomene ved hjelp av et par C-terminale dimeriseringspeptider slik som såkalte leucizippere. Denne strategien for fremstilling av TCR er generelt anvendbar for alle TCRer.

Reiter et al., Immunity, 1995, 2:281-287, beskriver i detalj fremstillingen av et løselig molekyl som omfatter disulfidstabiliserte TCR-a- og TCR-lJ-domener, der ett er bundet til en trunkert form av Pseudomonaseksotoksin (PE38). En av de fremsatte grunnene for å fremstille dette molekylet var å overvinne den naturlige ustabiliteten til enkeltkjede-TCRer. Posisjonen til den nye disulfidbindingen i de variable domenene til TCR ble identifisert via homologi med de variable domenene til antistoffer, i hvilke disse tidligere har blitt introdusert (se for eksempel Brinkmann et al., (1993), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90: 7538-7542 og Reiter et al., (1994) Biochemistry 33: 5451-5459). Siden det ikke foreligger slik homologi mellom de konstante antistoff- og TCR-domenene kan ikke en slik teknikk bli benyttet for å identifisere passende seter for nye interkjededisulfidbindinger mellom konstante TCR-domener.

Gitt viktigheten av løselige TCRer ville det vært ønskelig å tilveiebringe en alternativ måte å fremstille slike molekyler.

Ifølge et første aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse, som angitt i krav 1, en løselig afi-form-T-cellereseptor (sTCR), hvor

(a) en kovalent disulfidbinding forbinder et residue på immunoglobulinregionen på det konstante domenet til a-kjeden med et residue på immunoglobulinregionen på det konstante domenet til B-kjeden, der en interkjededisulfidbinding i nativ TCR ikke er til stede, eller (b) en kovalent disulfidbinding forbinder cysteinresiduer som er substituert for: Thr 48 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Ser 57 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01,

Thr 45 i ekson 1 på TRAC01 og Ser 77 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01,

Tyr 10 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Ser 17 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01,

Thr 45 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Asp 59 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01,

Ser 15 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Glu 15 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01.

Ifølge et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en sTCR ifølge krav 1, som omfatter (i) hele eller deler av en TCR-a-kjede, unntatt transmembrandomenet derav, og (ii) hele eller deler av en TCR-fi-kjede, unntatt transmembrandomenet derav, der (i) og (ii) hver omfatter et funksjonelt variabelt domene og i det minste en del av det konstante domenet til TCR-kjeden.

Ifølge et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et multivalent T-cellereseptor (TCR)-kompleks, som angitt i krav 22, som omfatter et flertall av sTCRer ifølge ethvert av de foregående krav.

Ifølge enda et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et nukleinsyremolekyl, angitt i krav 26, som omfatter en sekvens som koder for (i) eller (ii) fra en sTCR ifølge ethvert av kravene 2-21, eller en sekvens som er komplementær dertil.

Ifølge et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen, i krav 27, en vektor, som omfatter et nukleinsyremolekyl ifølge krav 26.

Ifølge et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen, i krav 28, en vertscelle, som omfatter en vektor ifølge krav 27.

Ifølge enda et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremskaffe (i) eller (ii) som definert i ethvert av kravene 2-21, som omfatter å inkubere en vertscelle ifølge krav 28 ved betingelser som fører til uttrykking av peptidet og deretter rensing av polypeptidet.

Ifølge enda et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremskaffe en løselig afl-form-T-cellereseptor (sTCR), som omfatter å: inkubere en vertscelle som omfatter en vektor som omfatter et nukleinsyremolekyl som koder for en TCR-a-kjede og en vertscelle som omfatter en vektor som omfatter et nukleinsyremolekyl som koder for en TCR-B-kjede ved betingelser som fører til uttrykking av de respektive TCR-kjedene,

rense de respektive TCR-kjedene, og

blande de respektive TCR-kjedene ved refoldingsbetingelser slik at en kovalent disulfidbinding forbinder et residue på immunoglobulinregionen på det konstante domenet på a-kjeden med en residue på immunoglobulinregionen på det konstante

domenet på B-kjeden, der disulfidbindingen er en binding som ikke er tilstede i nativ

TCR.

Ifølge enda et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å påvise MHC-peptidkomplekser, som omfatter å: (i) tilveiebringe en løselig TCR ifølge ethvert av kravene 1-21, en løselig TCR fremstilt ved fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 31-51, et multivalent T-celle-reseptorkompleks ifølge ethvert av kravene 22-25 eller et multivalent T-cellereseptor-kompleks fremstilt ved fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 52-55, (ii) bringe den løselige TCRen eller det multivalente TCR-komplekset i kontakt med MHC-peptidkompleksene, og (iii) påvise binding av den løselige TCRen eller det multivalente TCR-komplekset til MHC-peptidkompleksene.

Ifølge enda et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en farmasøytisk formulering, som omfatter

en sTCR (a) ifølge ethvert av kravene 1-21, eller (b) fremstilt ved fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 31-51, og/eller

et multivalent TCR-kompleks (a) ifølge ethvert av kravene 22-25, eller

(b) fremstilt ved fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 52-55,

sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

sTCRene ifølge foreliggende oppfinnelse har den fordelen at de ikke inneholder heterologe polypeptider som kan være immunogene eller som kan føre til at sTCRene raskt blir fjernet fra kroppen. TCRer ifølge foreliggende oppfinnelse har videre en tredimensjonal struktur som er svært lik strukturen til de native TCRene de er avledet fra, og på grunn av denne strukturelle likheten er det ikke sannsynlig at de er immunogene. sTCRer kan i overensstemmelse med oppfinnelsen bli brukt til å gjenkjenne Klasse-I-MHC-peptidkomplekser eller Klasse-II-MHC-peptidkomplekser.

TCRer ifølge foreliggende oppfinnelse er løselige. I konteksten til denne søknaden er løselighet definert som TCR sin evne til å bli renset som en monodispers heterodimer i fosfatbufret saltvannsoppløsning (PBS) (KC1 2,7mM, KH2P04l,5mM, NaCl 137mM og Na2P048mM, pH 7,1-7,5, Life Tchnologies, Bibco BRL) ved en konsentrasjon på 1 mg/ml og der >90 % av nevnte TCR fremdeles foreligger som en monodispers heterodimer etter inkubering ved 25 °C i 1 time. For å kunne vurdere løseligheten av TCRen blir den først renset som beskrevet i eksempel 2. Etter denne rensingen blir 100u.g av TCRen analysert med analytisk størrelsesekskluderings-kromatografi ved for eksempel å benytte en Pharmacia-Superdex-75-HR-kolonne som er balansert med PBS. Ytterligere lOOjig av TCRen blir inkubert ved 25 °C i 1 time og deretter analysert med størrelsesekskluderingskromatografi som tidligere. Størrelses-eksklusjonskurvene blir så analysert ved integrasjon, og arealene under toppene som tilsvarer den monodisperse heterodimeren blir sammenlignet. De relevante toppene kan bli identifisert ved å sammenligne med elueringsposisjonene til proteinstandarder med kjent molekylvekt. Den monodisperse heterodimere løselige TCRen har en molekylvekt på omtrent 50 kDa. Som fastslått ovenfor er TCRene ifølge foreliggende oppfinnelse løselige. Som forklart i nærmere detalj nedenfor kan likevel TCRene bli koplet til en enhet slik at det resulterende komplekset blir uløselig eller de kan bli presentert på overflaten til en uløselig fast bærer.

Nummereringen av TCR-aminosyrer som blir benyttet her følger IMGT-systemet som er beskrevet i The T cell Receptor Factsbook, 2001, LeFranc & LeFranc, Academic Press. I dette systemet har a-kjede-konstantdomenet følgende notasjon: TRAC<*>01, der "TR" indikerer T-celle-reseptorgen, "A" indikerer a-kjede-gen, "C" indikerer konstantregion og "01<*>" indikerer allel 1. 6-kjede-konstantdomenet har den følgende notasjonen: TRBC1*01.1 dette tilfellet er det to mulige konstantregiongener "Cl" og C2". Det translaterte domenet som er kodet for av hvert allel kan bli dannet av den genetiske koden fra flere eksoner og derfor er disse også spesifisert. Aminosyrer er nummerert i overensstemmelse med eksonet til det spesielle domenet der de er til stede. Den ekstracellulære delen av nativt TCR består av to polypeptider (afi eller y8) der hver av disse har et membranproksimalt konstant domene og et membrandistalt variabelt domene (se figur 1). Hver av de konstante og variable domenene inkluderer en intrakjededisulfidbinding. De variable domenene inneholder de svært polymorfe løkkene som er analoge med de komplementaritetsbestemmende regionene (CDR) til antistoffer. CDR3 på TCR interagerer med peptidet som blir presentert av MHC, og CDRene 1 og 2 interagerer med peptidet og med MHC. Mangfoldet av TCR-sekvenser blir generert via somatisk reorganisering av sammenkoplede variable gener (V), diversitetsgener (D), forbindelsesgener (J) og konstante gener. Funksjonelle a-kjede-polypeptider blir dannet av reorganiserte V-J-C-regioner, mens B-kjeder består av V-D-J-regioner. Det ekstracellulære konstante domenet har en membranproksimal region og en immunoglobulin-region. Den membranproksimale regionen består av aminosyrene mellom transmembrandomenet og den membranproksimale cysteinresidien. De konstante immuno-globulindomenene består av resten av aminosyreresidiene i det konstante domenet, og de strekker seg fra det membranproksimale cysteinet til begynnelsen på forbindelses-regionen, og erkarakterisert vedtilstedeværelsen av en folding av immunoglobulintype. Det er ett enkelt a-kjede-konstantdomene, kjent som Cal eller TRAC<*>01, og to ulike fi-konstantdomener, kjent som CB1 eller TRBC1<*>01 og CB2 eller TRBC2<*>01. Forskjellen mellom disse ulike B-konstantdomenene utgår fra aminosyreresidier 4, 5 og 37 fra ekson 1. TRBC1<*>01 har dermed 4N, 5K og 37F i ekson 1 derav, og TRBC2<*>01 har 4K, 5N og 37Y i ekson 1 derav. Forekomsten av hver av de ekstracellulære TCR-domenene er variabel.

Ifølge foreliggende oppfinnelse blir disulfidbindingen introdusert mellom residier som er lokalisert i de konstante domenene (eller deler derav) til de respektive kjedene. De respektive kjedene til TCR omfatter tilstrekkelig av de variable domenene derav til å være i stand til å interagere med sitt pMHC-kompleks. Slike interaksjoner kan bli målt ved å benytte et BIAcore-3000 eller BIAcore-2000 instrument som beskrevet i henholdsvis eksempel 3 eller i WO 99/6120.

I en utførelsesform omfatter de respektive kjedene i sTCRen ifølge oppfinnelsen også intrakjededisulfidbindingene derav. TCRen ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte hele den ekstracellulære konstante Ig-regionen til de respektive TCR-kjedene, og helst hele det ekstracellulære domenet til de respektive kjedene, d.v.s. inkludert den membranproksimale regionen. I nativ TCR er det en disulfidbinding som forbinder de konserverte membranproksimale regionene til de respektive kjedene. I en utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke denne disulfidbindingen til stede. Dette kan oppnås ved å mutere de rette cysteinresidiene (henholdsvis aminosyre 4, ekson 2 i TRAC<*>01-genet og aminosyre 2 i både TRBC1<*>01- og TRBC2<*>01-genet) til en annen aminosyre, eller ved å trunkere de respektive kjedene slik at cysteinresidiene ikke blir inkludert. En foretrukket løselig TCR ifølge oppfinnelsen omfatter de native a- og B-TCR-kjedene der disse er trunkerte på C-terminalen slik at cysteinresidiene som danner den native interkjededisulfidbindingen blir ekskludert, d.v.s. trunkert på residiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, eller 10 N-terminalt i forhold til cysteinresidiene. Det må likevel være klart at den native interkjededisulfidbindingen kan være til stede i TCRer ifølge foreliggende oppfinnelse, og at det i visse utførelsesformer er slik at bare én av TCR-kjedene inneholder den native cysteinresidien som danner den native interkjededisulfidbindingen. Dette cysteinet kan bli benyttet til å kople enheter til TCRen.

De respektive TCR-kjedene kan likevel være kortere. Fordi de konstante domenene ikke er direkte involvert i kontaktene med peptid-MHC-ligandene kan det C-terminale trunkeringspunktet bli forandret vesentlig uten tap av funksjonalitet.

Alternativt kan et større fragment av de konstante domenene være til stede enn det som er foretrukket her, d.v.s. de konstante domenene behøver ikke å bli trunkerte bare i forkant av cysteinene som danner interkjededisulfidbindingen. For eksempel kan hele det konstante domenet unntatt transmembrandomenet (d.v.s. de ekstracellulære og cytoplasmiske domenene) bli inkludert. Det kan i dette tilfellet være fordelaktig å mutere én eller flere av cysteinresidiene som danner interkjededisulfidbindingen i den cellulære TCRen til en annen aminosyreresidie som ikke er involvert i dannelse av disulfidbinding, eller å fjerne én eller flere residier.

Signalpeptidet kan bli utelatt dersom den løselige TCRen skal bli uttrykt i prokaryote celler, for eksempel i E. coli, siden dette peptidet ikke har noen funksjon i den ferdig utviklede TCRen i forhold til dennes ligandbindende evne, og peptidet kan i visse tilfeller motvirke dannelsen av en funksjonell løselig TCR. I de fleste tilfeller blir kløyvingssetet der signalpeptidet blir splittet fra de ferdig utviklede TCR-kjedene forutsatt, men det blir ikke bestemt eksperimentelt. Konstruering av de uttrykte TCR- kjedene slik at de blir noen få, d.v.s. opp til for eksempel omtrent 10, aminosyrer lengre eller kortere på den N-terminale enden behøver ikke å ha noen betydning for funksjo-naliteten (d.v.s. på evnen til å gjenkjenne pMHC) til den løselige TCRen. Visse tilføyelser, som ikke er til stede i den originale proteinsekvensen, kan bli påsatt. For eksempel kan en kort markørsekvens som kan fremme rensing av TCR-kjedene bli påsatt, forutsatt at den ikke påvirker den korrekte strukturen og foldingen av det antigenbindende setet på TCRen.

Ved uttrykking i E. coli kan en metioninresidie bli satt inn på det N-terminale startstedet på den ferdig utviklede beregnede proteinsekvensen for å muliggjøre initiering av translasjon.

Langt fra alle residier i de variable domenene til TCR-kjedene er essensielle for antigenspesifisitet og funksjonalitet. Dermed kan et anselig antall mutasjoner bli introdusert i dette domenet uten at antigenspesifisitet og funksjonalitet blir påvirket. Langt fra alle residier i de konstante domenene til TCR-kjedene er essensielle for antigenspesifisitet og funksjonalitet. Dermed kan et anselig antall mutasjoner bli introdusert i denne regionen uten at antigenspesifisiteten blir påvirket.

TCR-B-kjeden inneholder en cysteinresidie som ikke finnes i den cellulære eller native TCRen. Det er foretrukket at denne cysteinresidien blir fjernet eller mutert til en annen residie for å unngå ukorrekt intrakjede- eller interkjedeparing. Substitueringer av denne cysteinresidien med en annen residie, for eksempel serin eller alanin, kan ha signifikant positiv effekt på refoldingseffektivitet in vitro.

Disulfidbindingen kan bli dannet ved å mutere residier på de respektive kjedene som ikke er cystein slik at de blir cysteiner, noe som fører til at bindingen blir dannet mellom de muterte residiene. Residier hvis respektive fl-karboner ligger omtrent 6Å

(0,6nm) eller mindre, og helst i området 3,5Å (0,35nm) til 5,9Å (0,59nm) fra hverandre i nativ TCR er foretrukket, slik at en disulfidbinding kan bli dannet mellom cysteinresidier som blir introdusert istedenfor de native residiene. Det er foretrukket at disulfidbindingene foreligger mellom residier i den konstante immunoglobulinregionen, selv om de kan eksistere mellom residier i den membranproksimale regionen. Foretrukne seter der cysteiner kan bli introdusert for å danne disulfidbindingene er de følgende residiene i ekson 1 i TRAC<*>01 for TCR-a-kjeden og TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01 for TCR-B-kieden:

Én sTCR ifølge foreliggende oppfinnelse er avledet fra A6-Tax-TCR (Garboczi et al., Nature, 1996, 384(6605): 134-141). I en utførelsesform omfatter sTCRen hele TCR-a-kjeden som er N-terminal for ekson 2, residie 4 fra TRAC<*>01 (aminosyrer 1-182 på a-kjeden ifølge nummereringen benyttet i Garboczi et al) og hele TCR-B-kjeden som er N-terminal for ekson 2, residie 2 på både TRBC1<*>01 og TRCB2<*>01 (aminosyrer 1-210 på B-kjeden ifølge nummereringen benyttet i Garboczi et al). For å kunne danne disulfidbindingen kan treonin 48 på ekson 1 i TRAC<*>01 (treonin 158 på a-kjeden ifølge nummereringen benyttet i Garboczi et al) og serin 57 på ekson 1 i både TRBC1<*>01 og TRBC2<*>01 (serin 172 på 6-kjeden ifølge nummereringen benyttet i Garboczi et al) begge bli mutert til cystein. Disse aminosyrene er lokalisert på B-tråd-D i det konstante domenet til henholdsvis a- og B-TCR-kjeder.

Det må pekes på at residie 1 (ifølge nummereringen som er benyttet i Garboczi et al) er henholdsvis K og N i figur 3a og figur 3b. Den N-terminale metioninresidien er ikke til stede i nativ A6-Tax-TCR og, som nevnt ovenfor, er noen ganger til stede når de respektive kjedene blir fremstilt i bakterielle ekspresjonssystemer.

Nå som residiene i humane TCRer som kan bli mutert til cysteinresidier for å danne en ny interkjededisulfidbinding har blitt identifisert, vil fagfolk på området være i stand til å mutere enhver TCR på samme måte for å fremstille en løselig form av den TCRen som har en ny interkjededisulfidbinding. Hos mennesker behøver fagfolk kun å se etter de følgende motiver i de respektive TCR-kjedene for å identifisere residien som skal bli mutert (den understrekede residien er den som skal muteres til cystein).

a-kjede Thr 48: DSDVYITDKTVLDMRSMDFK (aminosyrer 39-58 fra ekson 1 på

TRAC<*>01-genet)

a-kjede Thr 45: QSKDSDVYTTDKTVLDMRSM (aminosyrer 36-55 fra ekson 1 på

TRAC<*>01-genet)

a-kjede Tyr 10: DIQNPDPAVYQLRDSKSSDK (aminosyrer 1 -20 fra ekson 1 på

TRAC*01 -genet)

a-kjede Ser 15: DPAVYQLRDSKSSDKSVCLF (aminosyrer 6-25 fra ekson 1 på

TRAC*01 -genet)

B-kjede Ser 57: NGKEVHSGVSTDPQPLKEQP (aminosyrer 48-67 fra ekson 1

på TRBC1<*>01- og TRBC2*01 -genet)

B-kjede Ser 77: ALNDSRYALSSRLRVSATFW (aminosyrer 68-87 fra ekson 1 på

TRBC1<*>01- og TRBC2*01 -genet)

B-kjede Ser 17: PPEVAVFEPSEAEISHTQKA (aminosyrer 8-27 fra ekson 1 på

TRBC1<*>01- og TRBC2<*>01-genet)

B-kjede Asp 59: KEVHSGVSTDPQPLKEQPAL (aminosyrer 50-69 fra ekson 1

på TRBC1<*>01- og TRBC2<*>01-genet)

B-kjede Glu 15: VFPPEVAVFEPSEAEISHTQ (aminosyrer 6-25 fra ekson 1 på

TRBC1<*>01- og TRBC2<*>01-genet)

Hos andre arter er det ikke sikkert at TCR-kjedene har regioner med 100 % identitet med motivene ovenfor. Fagfolk på området vil likevel være i stand til å benytte motivene ovenfor for å identifisere de tilsvarende delene av TCR-a- og TCR-B-kjedene og dermed også residien som skal muteres til cystein. Sammenligningsteknikker kan bli benyttet i så henseende. For eksempel kan ClustalW, som er tilgjengelig på internettsiden til the European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk/index.html), bli benyttet for å sammenligne motivene ovenfor med en spesiell TCR-kjedesekvens for å kunne lokalisere den relevante delen av TCR-sekvensen som skal muteres.

Foreliggende oppfinnelse inkluderer i sitt omfang humane disulfidbundne aB-TCRer i tillegg til disulfidbundne aB-TCRer fra andre pattedyr, inkludert men ikke begrenset til, mus, rotte, svin, geit og sau. Som nevnt ovenfor vil fagfolk på området være i stand til å bestemme seter, tilsvarende til de humane setene som er beskrevet ovenfor, der cysteinresidier kan bli introdusert for å danne en interkjededisulfidbinding. For eksempel vises i det følgende aminosyresekvensene til løselige muse-Ca- og muse-CB-domener, sammen med motiver som viser de murine residiene, som er ekvivalente med de humane residiene som er nevnt ovenfor, som kan bli mutert til cysteiner for å danne en TCR-interkjededisulfidbinding (der de relevante residiene er understreket):

Murin ekvivalent til human a-kjede Thr 45: KTMESGTFITDKTVLDMKAM

Murin ekvivalent til human a-kjede Tyr 10: YIQNPEPAVYQLKDPRSQDS

Murin ekvivalent til human a-kjede Ser 15: AVYQLKDPRSQDSTLCLFTD

Murin ekvivalent til human B-kjede Ser 57: NGREVHSGVSTDPQAYKESN

Murin ekvivalent til human B-kjede Ser 77: KESNYSYCLSSRLRVSATFW

Murin ekvivalent til human B-kjede Ser 17: PPKVSLFEPSKAEIANKQKA

Murin ekvivalent til human B-kjede Asp 59: REVHSGVSTDPQAYKESNYS

Murin ekvivalent til human B-kjede Glu 15: VTPPKVSLFEPSKAEIANKQ

I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse omfatter (i) og (ii) av TCRen hver det funksjonelle variable domenet fra en første TCR fusjonert med hele eller deler av det konstante domenet fra en annen TCR, der den første og den andre TCRen stammer fra den samme arten, og der interkjededisulfidbindingen foreligger mellom residier i nevnte respektive hele eller del av det konstante domenet som ikke er til stede i nativ TCR. I en utførelsesform er den første og den andre TCRen human. Med andre ord virker de disulfidbundne konstante domenene som et skjellett til hvilket variable domener kan bli fusjonert. Den resulterende TCR vil være vesentlig identisk med den native TCR fra hvilken den første TCRen er fremskaffet. Et slikt system tillater enkel uttrykking av ethvert funksjonelt variabelt domene på et stabilt konstant domeneskjellett.

De konstante domenene til A6-Tax-TCR beskrevet ovenfor, eller i det hele tatt de konstante domenene til enhver av de mutante aB-TCRene som har en ny interkjededisulfidbinding som beskrevet ovenfor, kan bli benyttet som et skjellett på hvilket heterologe variable domener kan bli fusjonert. Det er foretrukket at fusjonsproteinet opprettholder så mye av konformasjonen til de heterologe variable domenene som mulig. Derfor er det foretrukket at de heterologe variable domenene blir bundet til de konstante domenene på ethvert punkt mellom de introduserte cysteinresidiene og N-terminalen på det konstante domenet. For A6-Tax-TCR er de introduserte cysteinresidiene på a- og B-kjedene helst lokaliserte på henholdsvis treonin 48 fra ekson 1 i TRAC<*>01 (treonin 158 på a-kjeden ifølge nummereringen benyttet i Garboczi et al) og serin 57 fra ekson 1 i både TRBC1<*>01 og TRBC2<*>01 (serin 172 på B-kjeden ifølge nummereringen benyttet Garboczi et al). Derfor er det foretrukket at forbindelsespunktene til de heterologe variable a- og B-kjededomenene ligger mellom residiene 48 (159 ifølge nummereringen benyttet i Garboczi et al) eller 58 (173 ifølge nummereringen benyttet i Garboczi et al) og N-terminalen på henholdsvis de konstante a- eller B-domenene.

Residiene i de konstante domenene til de heterologe a- og B-kjedene som tilsvarer forbindelsespunktene i A6-Tax-TCR kan bli identifisert ved hjelp av sekvenshomologi. Fusjonsproteinet blir helst fremstilt slik at det inkluderer hele den heterologe sekvensen som ligger N-terminalt i forhold til forbindelsespunktet.

Som diskutert i nærmere detalj nedenfor kan sTCRene ifølge foreliggende oppfinnelse bli derivatisert med eller fusjonert med en enhet på sine C- eller N-terminale ender. C-terminalen er foretrukket siden denne ligger langt fra bindingsdomenet. I en utførelsesform har én eller begge TCR-kjedene en cysteinresidie på sin C- og/eller N-terminal på hvilke en slik enhet kan bli fusjonert.

En løselig TCR (som helst er human) ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli tilveiebrakt i vesentlig ren form, eller i form av et renset eller isolert preparat. For eksempel kan den bli tilveiebrakt i en fonn som er vesentlig fri for andre proteiner.

Et flertall med løselige TCRer ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli tilveiebrakt i et multivalent kompleks. I et aspekt tilveiebringer dermed foreliggende oppfinnelse et multivalent T-cellereseptor- (TCR) kompleks som omfatter et flertall av løselige T-cellereseptorer som beskrevet heri. Hver av de i flertallet med løselige TCRer er helst identiske.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen, som tidligere nevnt, en fremgangsmåte for å påvise MHC-peptidkomplekser.

I det multivalente komplekset ifølge foreliggende oppfinnelse kan TCRene foreligge i form av multimerer, og/eller foreligge på eller være assosiert med et lipidlag, for eksempel et liposom.

I sin enkleste form omfatter et multivalent TCR-kompleks ifølge foreliggende oppfinnelse en multimer som består av to eller tre eller fire eller flere T-cellereseptomiolekyler som er assosiert (for eksempel kovalent eller på annen måte forbundet) med hverandre, helst via et forbindelsesmolekyl. Hensiktsmessige forbindelsesmolekyler inkluderer, men er ikke begrenset til, multivalente koplings-molekyler slik som avidin, streptavidin, neutravidin og ekstravidin, der hver av disse har fire bindingsseter for biotin. Biotinylerte TCR-molekyler kan dermed bli dannet på multimerer av T-cellereseptorer som har et flertall med TCR-bindingsseter. Antallet TCR-molekyler i multimeren vil være avhengig av mengden av TCR i forhold til mengden av forbindelsesmolekyl som er benyttet for å danne multimerene, og også av tilstedeværelsen eller fraværet av andre biotinylerte molekyler. Foretrukne multimerer er dimere, trimere eller tetramere TCR-komplekser.

Strukturer som er en god del større enn TCR-tetramerer kan bli benyttet for å finne eller målsøke celler som uttrykker spesifikke MHC-peptidkomplekser. Helst er strukturene av størrelsesorden 10nm til lOum i diameter. Hver struktur kan fremvise flere TCR-molekyler som har en innbyrdes avstand seg i mellom som tillater to eller flere TCR-molekyler på strukturen å binde samtidig til to eller flere MHC-peptidkomplekser på en celle, og som dermed øker reaksjonsvilligheten til den multimere bindingsenheten for cellen.

Passende strukturer som kan benyttes med oppfinnelsen inkluderer membran-strukturer slik som liposomer og faste strukturer som helst er partikler slik som kuler, for eksempel latekskuler. Andre strukturer som kan bli belagt på overflaten med T-cellereseptormolekyler er også passende. Helst er strukturene belagte med T-cellereseptor-multimerer istedenfor individuelle T-cellereseptormolekyler.

I tilfellet med liposomer kan T-cellereseptormolekylene eller multimerer derav bli koplet til eller på annen måte bli assosiert med membranen. Teknikker for dette er velkjent for fagfolk på området.

Et merke eller en annen enhet, slik som et toksin eller en terapeutisk enhet, kan bli inkludert i et multivalent TCR-kompleks ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan merket eller enheten bli inkludert i en multimer med blandede molekyler. Ett eksempel på et slikt multimert molekyl er en tetramer som inneholder tre TCR-molekyler og ett peroksidasemolekyl. Dette kan bli oppnådd ved å blande TCRen og enzymet i et molart forhold på 3:1 for å danne tetramere komplekser, og isolere det ønskede komplekset fra komplekser som ikke inneholder det forholdet av molekyler. Disse blandede molekylene kan inneholde enhver kombinasjon av molekyler, gitt at sterisk hindring ikke kompromitterer eller ikke vesentlig kompromitterer den ønskede funksjonen til molekylene. Posisjoneringen av bindingssetene på streptavidinmolekylet er hensiktsmessig for blandede tetramerer siden sterisk hindring ikke er sannsynlig.

Alternative måter å biotinylere TCRen på kan være mulige. For eksempel kan kjemisk biotinylering bli benyttet. Alternative biotinyleringsmerker kan bli benyttet, selv om visse aminosyrer i biotinmerkesekvensen er essensielle (Schatz, (1993), Biotechnology NY 11(10): 1138-43). Blandingen som blir benyttet til biotinylering kan også bli variert. Enzymene krever Mg-ATP og lav ionestyrke, selv om begge disse betingelsene kan bli variert, for eksempel kan det være mulig å benytte en høyere ionestyrke og en lengre reaksjonstid. Det kan være mulig å benytte et annet molekyl enn avidin eller streptavidin for å danne multimerer av TCRen. Ethvert molekyl som binder biotin på en multivalent måte vil være hensiktsmessig. Alternativt kan en helt annet forbindelse bli benyttet (slik som polyhistidinmerke på chelatert nikkelion (Quiagen Product Guide 1999, Kapittel 3 "Protein Expression, Purification, Detection and Assay" s. 35-37). Helst er merket lokalisert i nærheten av den C-terminale enden av proteinet for å redusere omfanget av sterisk hindring ved interaksjon med peptid-MHC-komplekser til et minimum.

Én av eller begge TCR-kjedene kan bli merket med et merke som kan bli påvist, for eksempel et merke som er hensiktsmessig til diagnostiske formål. Oppfinnelsen tilveiebringer dermed en fremgangsmåte for å påvise MHC-peptidkomplekser, der fremgangsmåten omfatter å bringe MHC-peptidkompleksene i kontakt med et TCR-kompleks eller et multimert TCR-kompleks ifølge oppfinnelsen som er spesifikt for MHC-peptidkomplekset, og påvise binding mellom TCR-komplekset eller det multimere TCR-komplekset og MHC-peptidkomplekset. I tetramer TCR, som er dannet ved å benytte biotinylerte heterodimerer, kan fluorescerende streptavidin (kommersielt tilgjengelig) bli benyttet for å tilveiebringe et merke som det er mulig å påvise. En fluorescensmerket tetramer er hensiktsmessig til bruk i FACS-analyse, for eksempel for å påvise antigenpresenterende celler som bærer peptidet som TCRen er spesifikk mot.

En annen måte å påvise de løselige TCRene ifølge foreliggende oppfinnelse består i å benytte TCR-spesifikke antistoffer, spesielt monoklonale antistoffer. Det finnes mange kommersielt tilgjengelige anti-TCR-antistoffer, slik som aFl og BF1, som gjenkjenner de konstante regionene på henholdsvis a- og B-kjeden.

TCRen (eller et multivalent kompleks derav) ifølge foreliggende oppfinnelse kan alternativt eller i tillegg bli assosiert med (for eksempel kovalent eller på annen måte forbundet med) et terapeutisk middel som for eksempel kan være en toksisk enhet som kan benyttes for å drepe celler, eller et immunstimulerende middel slik som et interleukin eller et cytokin. Et multivalent TCR-kompleks ifølge foreliggende oppfinnelse kan ha økt bindingskapasitet for et pMHC sammenlignet med en ikke-multimer T-cellereseptor-heterodimer. De multivalente TCR-kompleksene ifølge oppfinnelsen er dermed spesielt nyttige til å lete opp eller målsøke celler som presenterer spesielle antigener in vitro eller in vivo, og de er også nyttige som mellomprodukter i fremstillingen av ytterligere multivalente TCR-komplekser som har slike anvendelser. TCR-komplekset eller det multivalente TCR-komplekset kan derfor bli tilveiebrakt i en farmasøytisk akseptabel formulering.

Den løselige TCRen eller det multivalente TCR-komplekset kan bli benyttet til å levere terapeutiske midler til en lokalisering av celler som presenterer et spesielt antigen. Det vil være nyttig i mange situasjoner og spesielt mot tumorer. Et terapeutisk middel kan bli levert slik at effekten av det vil være lokal men ikke bare på cellen det bindes til. Én spesiell strategi forestiller seg dermed antitumormolekyler som er koplet til T-cellereseptorer eller multivalente TCR-komplekser som er spesifikke for tumorantigener.

Mange terapeutiske midler kan bli benyttet i denne anvendelsen, for eksempel radioaktive forbindelser, enzymer (for eksempel perforin) eller kjemoterapeutiske midler (for eksempel cisplatin). For å trygge at toksiske effekter kun kommer til uttrykk på det ønskede stedet kan toksinet bli plassert inne i et liposom som er koplet til streptavidin slik at forbindelsen blir frigjort langsomt. Dette vil forhindre ødeleggende effekter under transporten gjennom kroppen og sikre at toksinet har maksimal effekt etter at TCRen binder til de relevante antigenpresenterende cellene.

Andre passende terapeutiske midler inkluderer:

- småmolekylcytotoksiske midler, d.v.s. forbindelser med evnen til å drepe pattedyrceller som har en molekylvekt på mindre enn 700 dalton. Slike forbindelser kan også inneholde toksiske metaller som er i stand til å inneha cytotoksiske effekter. Videre er det slik at disse småmolekylcytotoksiske midlene også inkluderer prolegemidler, d.v.s. forbindelser som brytes ned eller blir omdannet ved fysiologiske betingelser for å frigjøre cytotoksiske midler. Eksempler på slike midler inkluderer cisplatin, maytansinderivater, rachelmycin, docetaxel, etopsid, gemcitabin, ifosfamid, irinotecan, melphalan, mitoxantron, sorfimernatriumphotofrin-II, temozolmid, topotecan, trimetreat, glucuronat, auristatin E, vincristin og doxorubicin. - peptidcytotoksiner, d.v.s. proteiner eller fragmenter derav med evnen til å drepe pattedyrceller. Eksempler inkluderer ricin, difteritoksin, pseudomonabakterieeksotoksin A, DNAse og RNAse, - radionuklider, d.v.s. ustabile isotoper av stoffer som brytes ned mens de frigjør én eller flere a- eller B-partikler eller y-stråling. Eksempler inkluderer jod-131, rhenium-186, indium-111, yttrium-90, vismut-210 og -213, actinium-225 og astatin-213,

- prolegemidler slik som antistoffrettede enzymatiske prolegemidler,

- immunstimulerende midler, d.v.s. enheter som stimulerer immunrespons. Eksempler inkluderer cytokiner slik som IL-2, kjemokiner slik som IL-8, platefaktor-4, melanom-vekststimulerende protein, o.s.v., antistoffer eller fragmenter derav, komplement-aktivatorer, xenogene proteindomener, allogene proteindomener, virale/bakterielle proteindomener og virale/bakterielle peptider.

Løselige TCRer eller multivalente TCR-komplekser ifølge oppfinnelsen kan bli koplet til et enzym som er i stand til å omdanne et prolegemiddel til et legemiddel. Dette gjør at prolegemidlet kun blir omdannet til legemiddelet på det stedet der det er nødvendig (d.v.s. det stedet som er bestemt av sTCRen).

Eksempler på passende MHC-peptidmål for TCRen ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, virale epitoper slik som HTLV-l-epitoper (for eksempel Tax-peptidet som er begrenset av HLA-A2, HTLV-1 er assosiert med leukemi), HIV-epitoper, EBV-epitoper, CMV-epitoper, melanomepitoper (for eksempel MAGE-1 HL A-Al begrenset epitop) og andre kreftspesifikke epitoper (for eksempel det nyrecellekarsinomassosiert antigenet G250 som er begrenset av HLA-A2), og epitoper som er assosiert med autoimmunforstyrrelser slik som revmatoid artritt. Andre sykdoms-assosierte pMHC-mål som er passende til anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet i the HLA Factbook (Barclay (Red.) Academic Press) og mange andre blir identifisert.

En mengde sykdomsbehandlinger kan potensielt bli forbedret ved å lokalisere legemiddelet ved hjelp av spesifisiteten til løselige TCRer.

Virale sykdommer, for hvilke legemidler finnes, for eksempel HIV, SIV, EBV, CMV, vil dra nytte av at legemidlet blir frigjort eller aktivert i nærheten av de infiserte cellene. Når det gjelder kreft vil en lokalisering i nærheten av tumorer eller metastaser forbedre effekten av toksiner eller immunostimulerende midler. Ved autoimmune sykdommer kan immundempende legemidler bli frigjort langsomt og dermed ha en mer lokal effekt over lengre tid mens den totale immunkapasiteten til individet blir påvirket så lite som mulig. Ved motvirkning av frastøtning av transplantater kan effekten av immundempende legemidler bli optimalisert på samme måte. Ved vaksinelevering kan vaksineantigenet bli lokalisert i nærheten av antigenpresenterende celler og dermed forbedre effektiviteten til antigenet. Fremgangsmåten kan også bli benyttet til synlig-gjøring.

De løselige TCRene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet for å modulere T-celleaktivering ved binding til spesifikke pMHC og dermed hemme T-celleaktivering. Autoimmune sykdommer som involverer T-cellemediert inflammasjon og/eller vevsskade vil være mottakelig for denne tilnærmingen, for eksempel diabetes type I. Kjennskap til den spesifikke peptidepitopen som presenteres av det relevante pMHC er påkrevd til denne anvendelsen.

Medikamenter ifølge oppfinnelsen vil vanligvis bli levert som en del av et sterilt, farmasøytisk preparat som normalt vil inkludere en farmasøytisk akseptabel bærer. Dette farmasøytiske preparatet kan foreligge i en passende form (avhengig av den ønskede fremgangsmåten for administrering til en pasient). Det kan bli tilveiebrakt i enhets-doseringsform, vil generelt være tilveiebrakt i en forseglet beholder og kan bli tilveiebrakt som en del av et sett. Et slikt sett vil normalt (selv om det ikke er nødvendig) inkludere instruksjoner for anvendelse. Det kan inneholde et flertall av nevnte enhetsdoserings-former.

Det farmasøytiske preparatet kan bli tilpasset til administrering på en bestemt måte, for eksempel oralt (inkludert buccalt eller subligualt), rektalt, nasalt, topisk (inkludert buccalt, sublingualt eller transdermalt), vaginalt eller parenteralt (inkludert subkutant, intramuskulært, intravenøst eller intradermalt). Slike preparater kan bli fremstilt med enhver fremgangsmåte som er kjent i farmasien, for eksempel ved å tilsette de aktive ingrediensene til bæreren(e) ved sterile betingelser.

Farmasøytiske preparater som er tilpasset til oral administrering kan bli presentert som avgrensede enheter slik som kapsler eller tabletter, som pulvere eller granuler, som løsninger, siruper eller oppløsninger (i vandige eller ikke-vandige væsker, eller som spiselige skumtyper eller vispinger, eller som emulsjoner). Passende eksipienser for tabletter eller harde gelatinkapsler inkluderer laktose, maisstivelse eller derivater derav, stearinsyre eller salter derav. Passende eksipienser til bruk sammen med myke gelatin kapsler inkluderer for eksempel planteoljer, voks, fettyper, halvfaste eller flytende polyoler o.s.v.

Til fremstilling av løsninger og siruper inkluderer eksipienser som kan bli benyttet for eksempel vann, polyoler og ulike sukkertyper. Til fremstillingen av suspensjoner kan oljer (for eksempel planteoljer) bli benyttet for å tilveiebringe olje-i-vann- eller vann-i-olje-suspensjoner. Farmasøytiske preparater som er tilpasset til transdermal administrering kan bli presentert i form av plastre som det er ment skal forbli i nær kontakt med huden til mottakeren over en lengre tidsperiode. Den aktive ingrediensen kan for eksempel bli levert fra plastret ved hjelp av iontoforese slik det generelt er beskrevet i Pharmaceutical Research, 3(6):318 (1986). Farmasøytiske preparater som er tilpasset til topisk administrering kan bli utformet som salver, kremer, suspensjoner, pulver, løsninger, pastaer, geler, spray, aerosoler eller oljer. Mot infeksjoner i øyet eller andre eksterne vev, for eksempel munn og hud, blir preparatene helst påført som en topisk salve eller krem. Når den er utformet i en salve kan den aktive ingrediensen bli benyttet med enten en parafinbasert eller vannblandbar salvebasis. Alternativt kan den aktive ingrediensen bli utformet i en krem med en olje-i-vann krembase eller en vann-i-olje base. Farmasøytiske preparater som er tilpasset til topisk administrering på øyet inkluderer øyedråper der den aktive ingrediensen er løst eller suspendert i en passende bærer, spesielt i et vandig løsningsmiddel. Farmasøytiske preparater som er tilpasset til topisk administrering i munnen inkluderer sugetabletter og munnskyllemidler.

Farmasøytiske preparater som er tilpasset til rektal administrering kan bli presentert i form av stikkpiller eller klystér. Farmasøytiske preparater som er tilpasset til nasal administrering der bæreren er et fast stoff inkluderer et grovt pulver som for eksempel har en partikkelstørrelse i området 20 til 500 mikrometer blir administrert på samme måte som når man tar snus, d.v.s. ved rask inhalering gjennom nesen fra en beholder med pulveret som holdes nært opp til nesen. Passende preparater der bæreren er en væske til administrering som en nesespray eller som nesedråper inkluderer vandige løsninger eller oljeløsninger av den aktive ingrediensen. Farmasøytiske preparater som er tilpasset til administrering ved inhalering inkluderer fine støvpartikler eller dusjer som kan bli frembrakt ved hjelp av ulike typer av doseutmålte aerosoler under trykk, forstøvere eller insufflatorer. Farmasøytiske preparater som er tilpasset til vaginal administrering kan bli presentert som pessarer, tamponger, kremer, geler, pastaer, skum eller sprayer. Farmasøytiske preparater som er tilpasset til parenteral administrering inkluderer vandige eller ikke-vandige sterile injeksjonsløsninger som kan inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostater og løst stoff som gjør utformingen vesentlig isoton i forhold til blodet til mottakeren, og vandige og ikke-vandige sterile suspensjoner som kan inkludere suspenderende midler og fortykningsmidler. Eksipienser som kan bli benyttet i injiserbare løsninger inkluderer for eksempel vann, alkoholer, polyoler, glyserin og planteoljer. Preparatene kan bli presentert i enhetsdoserings- eller multidoserings- beholdere, for eksempel forseglede ampuller og rør, og kan bli lagret i en frysetørket (lyofilisert) tilstand der kun tilsetning av den sterile bærervæsken er nødvendig, for eksempel vann til injeksjoner, rett i forkant av bruk. Ekstemporerte injeksjonsløsninger og suspensjoner kan bli fremstilt fra sterile pulvere, granuler og tabletter.

Det farmasøytiske preparatet kan inneholde preserveringsmidler, løsnings-fremmende midler, stabiliserende midler, fuktningsmidler, emulgeringsmidler, søtnings-midler, fargestoffer, luktstoffer, salter (stoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan i seg selv bli tilveiebrakt i fonn av et farmasøytisk akseptabelt salt), buffere, overtrekksstoffer eller antioksidanter. De kan også inneholde terapeutisk aktive midler i tillegg til stoffene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Doseringer av stoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan varier innenfor vide grenser avhengig av sykdommen eller forstyrrelsen som skal bli behandlet, alderen eller tilstanden til individet som skal bli behandlet o.s.v., og en lege vil i siste instans bestemme passende doseringer som skal benyttes. Doseringen kan bli gjentatt så ofte som det er hensiktsmessig. Hvis bivirkninger viser seg kan mengden og/eller frekvensen av doseringen bli redusert i overensstemmelse med normal klinisk praksis.

Genkloningsteknikker kan bli benyttet for å tilveiebringe en sTCR ifølge oppfinnelsen, helst i vesentlig ren form. Disse teknikkene er for eksempel beskrevet i J. Sambrook et al., Molecular Cloning 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press

(1989). I et videre aspekt tilveiebringer dermed foreliggende oppfinnelse et nukleinsyremolekyl som omfatter en sekvens som koder for en kjede fra den løselige TCRen ifølge foreliggende oppfinnelse, eller en sekvens som er komplementær med denne. Slike nukleinsyresekvenser kan bli fremskaffet ved å isolere nukleinsyrer som koder for TCR fra T-cellekloner, og innføre passende mutasjoner (ved innskudd, delesjon eller substitusjon).

Nukleinsyremolekylet kan foreligge i isolert eller i rekombinant form. Det kan bli inkorporert i en vektor og vektoren kan bli satt inn i en vertscelle. Slike vektorer og passende verter danner enda flere aspekter av foreliggende oppfinnelse.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å fremskaffe en TCR-kjede, der fremgangsmåten omfatter å inkubere en slik vertscelle ved betingelser som medfører uttrykking av TCR-kjeden for deretter å rense polypeptidet.

De løselige TCRene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli fremskaffet ved uttrykking i en bakterie, slik som E. coli, i form av inklusjonslegemer, og ved påfølgende refolding in vitro.

Refolding av TCR-kjedene kan foregå in vitro ved passende betingelser for ny folding. I en spesiell utførelsesform blir en TCR med korrekt konformasjon oppnådd ved refolding av løseliggjorte TCR-kjeder i en refoldingsbuffer som omfatter et løselig-gjørende middel, for eksempel urea. Urea kan fordelaktig være til stede med en konsentrasjon på minst 0,1 M, eller i det minste 1 M, eller i det minste 2,5 M, eller omtrent 5 M. Et alternativt løseliggjørende middel som kan bli benyttet er guanidin, benyttet med en konsentrasjon på mellom 0,1 M og 8 M, helst minst 1 M, eller i det minste 2,5 M. Før refolding blir et reduserende middel helst benyttet for å sikre fullstendig reduksjon av cysteinresidier. Andre denaturerende midler slik som DTT og guanidin kan bli benyttet når det er nødvendig. Ulike denaturerende midler og reduserende midler kan bli benyttet før refoldingstrinnet (for eksempel urea, B-merkaptoetanol). Alternative redokspar kan bli benyttet under refolding, slik som et cystamin/cysteamin redokspar, DTT eller B-merkaptoctanol/atmosfærisk oksygen, og cystein i reduserte og oksiderte former.

Foldingseffektivitet kan også bli økt ved tilsettingen av visse andre protein-komponenter til refoldingsblandingen, for eksempel chaperonproteiner. Forbedret refolding har blitt oppnådd ved å la proteinet passere gjennom kolonner med immobiliserte mini-chaperoner (Altamirano, et al., (1999), Nature Biotechnology 17: 187-191, Altamirano, et al., (1997), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94(8): 3576-8).

Alternativt kan løselig TCR ifølge foreliggende oppfinnelse bli fremskaffet ved uttrykking i et eukaryot cellesystem, slik som i en insektcelle.

Rensing av TCRen kan bli oppnådd på mange ulike måter. Alternative ionebytter-fremgangsmåter kan bli benyttet, eller andre fremgangsmåter for proteinrensing kan bli benyttet, slik som gelfiltreringskromatografi eller affinitetskromatografi.

Løselige TCRer og multivalente TCR-komplekser ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli benyttet ved screening etter midler, slik som små kjemiske forbindelser, som har evnen til å hemme bindingen av TCRen til dens pMHC-kompleks. En fremgangsmåte for screening etter et middel som hemmer bindingen av en T-cellereseptor til et peptid-MHC-kompleks som omfatter å overvåke bindingen av en løselig T-cellereseptor ifølge oppfinnelsen til et peptid-MHC-kompleks i nærvær av et middel, og velge ut midler som hemmer slik binding, er også mulig.

Passende teknikker for en slik screeningsfremgangsmåte inkluderer den overflate-plasmon-resonansbaserte fremgangsmåten beskrevet i WO 01/22084. Andre velkjente teknikker som kan danne basisen for denne screeningsfremgangsmåten er "Scintillation Proximity Analysis" (SPA) og "Amplified Luminescent Proximity Assay".

Midler som blir valgt ved hjelp av screeningsfremgangsmåter ifølge oppfinnelsen kan bli benyttet som legemidler, eller som basisen i et legemiddelutviklingsprogram, der de blir modifiserte eller på annen måte forbedret for å få karakteristika som gjør dem mer passende til administrering som et medikament. Slike medikamenter kan bli benyttet til behandlingen av tilstander som inkluderer en uønsket T-cellerespons. Slike tilstander inkluderer kreft (for eksempel nyrekreft, ovariekreft, tarmkreft, hode- og nakkekreft, testikkelkreft, lungekreft, magekreft, livmorhalskreft, blærekreft, prostatakreft eller melanom), autoimmune sykdommer, transplantatfrastøtning og sykdom som oppstår hos verten forårsaket av et transplantat.

Foretrukne egenskaper ved hvert aspekt ifølge oppfinnelsen er som for hver av de andre aspektene mutatis mutandis.

Eksempler

Oppfinnelsen blir ytterligere beskrevet i de følgende eksemplene.

Det blir i det påfølgende referert til de vedlagte tegningene der:

Figur 1 er et skjematisk diagram av en løselig TCR med en introdusert interkjededisulfidbinding ifølge oppfinnelsen, Figur 2a og 2b viser henholdsvis nukleinsyresekvensen til a- og B-kjedene fra en løselig A6-TCR som er mutert for å introdusere et cysteinkodon. Skyggeleggingen indikerer det introduserte cysteinkodonet, Figur 3a viser den ekstracellulære aminosyresekvensen til A6-TCR-a-kjeden, inkludert T48—»C mutasjonen (understreket) benyttet for å fremstille den nye interkjededisulfidbindingen, og Figur 3b viser den ekstracellulære aminosyresekvensen til A6-TCR-B-kjeden, inkludert S57—»C mutasjonen (understreket) benyttet for å fremstille den nye interkjededisulfidbindingen, Figur 4 er en kurve som er fremskaffet etter anionbytterkromatografi av løselig A6-TCR, som viser proteineluering fra en POROS-50HQ-kolonne ved å benytte en 0-500mM NaCl gradient, slik som indikert med den stiplede linjen, Figur 5 - A. Reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av fraksjoner fira kolonnen som ble kjørt som vist i figur 4. B. Ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av fraksjoner fra kolonnen som ble kjørt som vist i figur 4. Topp 1 inneholder åpenbart hovedsakelig ikke-disulfidbundet B-kjede, topp 2 inneholder TCR-heterodimer som er interkjededisulfidbundet, og skulderen skyldes £.co//'-forurensninger som er blandet med den interkjededisulfidbundne sTCRen, som er dårlig synlig på denne reproduserte tegningen, Figur 6 er en kurve fremskaffet ved størrelsesekskluderende kromatografi av sammenslåtte fraksjoner fra topp 1 i figur 5. Proteinet elueres som en enkelt stor topp tilsvarende til heterodimeren, Figur 7 er en BIAcore-responskurve av den spesifikke bindingen av disulfidbundet-A6-løselig-TCR til HLA-A2-tax-kompleks. Den innskutte figuren viser bindingsrespons sammenlignet med kontroll for en enkelt injeksjon av disulfidbundet-A6-løselig-TCR, Figur 8a viser A6-TCR-a-kjedesekvensen inkludert ny cysteinresidie mutert for å inkorporere et BamHl-restriksjonssete. Skyggelegging indikerer mutasjonene som er introdusert for å danne BamHl-restriksjonssetet. Figurene 8b og 8c viser DNA-sekvensen til a- og B-kjeden til JM22-TCR, mutert for å inkludere ytterligere cysteinresidier for å kunne danne en ikke-nativ disulfidbinding, Figur 9a og 9b viser henholdsvis de ekstracellulære aminosyresekvensene til a- , og B-kjedene til JM22-TCR, som er fremstilt fra DNA-sekvensene ifølge figurene 8a og 8b, Figur 10 er en kurve som er satt opp på bakgrunn av anionbytterkromatografi av løselig disulfidbundet JM22-TCR og som viser proteineluering fra en POROS-50HQ-kolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som illustrert med den stiplede linjen, Figur lia viser en reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av fraksjoner fra kolonnen som ble kjørt i figur 10 som vist, og Figur 11b viser en ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av fraksjoner fra kolonnen som ble kjørt i figur 10 som vist. Topp 1 inneholder åpenbart TCR-heterodimer som er interkjededisulfidbundet. Figur 12 er en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av størrelsesekskluderende kromatografi foretatt på sammenslåtte fraksjoner fra topp 1 i figur 10. Proteinet elueres som en enkelt stor topp som tilsvarer heterodimeren. Utbytte er 80 %, Figur 13 - A. BIAcore-responskurve av den spesifikke bindingen av disulfidbundet JM22-løselig-TCR til HLA-Flu-kompleks. B. Bindingsrespons sammenlignet med kontroll for en enkelt injeksjon av disulfidbundet JM22-løselig-TCR, Figurene 14a og 14b viser DNA-sekvensen til a- og B-kjedene i NY-ESO som er mutert for å inkludere ytterligere cysteinresidier for å danne ikke-nativ disulfidbinding, Figurene 15a og 15b viser henholdsvis de ekstracellulære a- og B-kjedeamino-syresekvensene til NY-ESO-TCR som er fremstilt fra DNA-sekvensene ifølge figurene 14a og 14b, Figur 16 er en kurve som er fremkommet på bakgrunn av anionbytterkromatografi av løselig NY-ESO-disulifdbundet-TCR og som viser proteineluering fra en POROS-50HQ-kolonne ved å benytte en 0-500mM gradient med NaCl som indikert med den stiplede linjen, Figur 17 - A. Reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av fraksjoner fra kolonnen kjørt i figur 16 som vist. B. Ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av fraksjoner fra kolonnen kjørt i figur 16 som vist. Topp 1 og 2 inneholder åpenbart TCR-heterodimer som er interkjededisulfidbundet, Figur 18 viser størrelseseksklusjonskromatografi av sammenslåtte fraksjoner fra topp 1 (A) og topp 2 (B) i figur 17. Proteinet elueres som en enkelt stor topp som tilsvarer heterodimeren, Figur 19 viser en BIAcore-responskurve av den spesifikke bindingen av disulfidbundet NY-ESO-løselig-TCR til HLA-NYESO-kompleks. A. topp 1, B. topp 2, Figurene 20a og 20b viser henholdsvis DNA-sekvensene til a- og B-kjedene fra en løselig NY-ESO-TCR som er mutert for å introdusere et nytt cysteinkodon (indikert ved skyggelegging). Sekvensen inkluderer cysteinet involvert i den native interkjededisulfidbindingen (indikert med uthevet kodon), Figurene 21a og 21b viser henholdsvis de ekstracellulære aminosyresekvensene til a- og B-kjedene fra NY-ESO-TCR som er fremstilt fra DNA-sekvensene ifølge

Figurene 20a og 20b,

Figur 22 viser en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av anionbytterkromatografi av løselig NY-ESO-TCRa<cys>fi<cys>og som viser proteineluering fra en POROS-50HQ-kolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede linjen, Figur 23 viser en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av anionbytterkromatografi av løselig NY-ESO-TCRa<cys>og som viser proteineluering fra en POROS-50HQ-kolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede linjen, Figur 24 viser en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av anionbytterkromatografi av løselig NY-ESO-TCRB<cys>og som viser proteineluering fra en POROS-50HQ-kolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede li<n>jen, Figur 25 viser en reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av NY-ESO-TCRa<cys>6cys-, -TCRa<cys->og -TCRB<cys->fraksjoner fra anionbytterkolonne kjørt i henholdsvis figurene 22-24. Sporene 1 og 7 er molekylvektmarkører, spor 2 er NYESOdsTCRl g4-a-cys-B-topp (EB/084/033), spor 3 er NYESOdsTCRl g4-a-cys-B-liten topp (EB/084/033), spor 4 er NYESOdsTCRlg4-a-B-cys (EB/084/034), spor 5 er NYESOdsTCRl g4-a-cys-B-cys-liten topp (EB/084/035) og spor 6 er NYESOdsTCRl g4-a-cys-B-cys-topp (EB/084/035), Figur 26 viser en ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av NY-ESO-TCRa<cys>6<cys->, -TCRa<cys->og -TCRB<cys->fraksjoner fra anionbytterkolonne kjørt i henholdsvis figurene 22-24. Sporene 1 og 7 er molekylvektmarkører spor 2 er NYESOdsTCRl g4-a-cys-B-topp (EB/084/033), spor 3 er NYESOdsTCRlg4-a-cys-B-liten topp (EB/084/033), spor 4 er NYESOdsTCRlg4-a-6-cys (EB/084/034), spor 5 er NYESOdsTCRl g4-a-cys-B-cys-liten topp (EB/084/035) og spor 6 er NYESOdsTCRl g4-a-cys-B-cys-topp (EB/084/035), Figur 27 er en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av størrelseseksklusjons-kromatografi av løselig NY-ESO-TCRa<cys>B<cys>og som viser proteineluering fra sammenslåtte fraksjoner fra figur 22. Proteinet elueres som en enkelt stor topp som tilsvarer heterodimeren, Figur 28 er en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av størrelseseksklusjons-kromatografi av løselig NY-ESO-TCRa<cys>og som viser eluering av sammenslåtte fraksjoner fra figur 22. Proteinet elueres som en enkelt stor topp som tilsvarer heterodimeren, Figur 29 er en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av størrelseseksklusjons-kromatografi av løselig NY-ESO-TCRB<cys>og som viser proteineluering fra sammenslåtte fraksjoner fra figur 22. Proteinet elueres som en enkelt stor topp som tilsvarer heterodimeren, Figur 30 er en BIAcore-responskurve av den spesifikke bindingen av NY-ESO-TCRa<cys>Bcys til HLA-NY-ESO-kompleks, Figur 31 er en BIAcore-responskurve av den spesifikke bindingen av NY-ESO-TCRa<cys>til HLA-NY-ESO-kompleks, Figur 32 er en BIAcore-responskurve av den spesifikke bindingen av NY-ESO-TCRB<cys>til HLA-NY-ESO-kompleks, Figurene 33a og 33b viser henholdsvis DNA-sekvensene til a- og B-kjedene fra en løselig AH-1,23-TCR som er mutert for å introdusere et nytt cysteinkodon (indikert ved skyggelegging). Sekvensene inkluderer cysteinet som er involvert i den native interkjededisulfidbindingen (indikert med uthevet kodon), Figurene 34a og 34b viser henholdsvis de ekstracellulære aminosyresekvensene til a- og B-kjedene i AH-1,23-TCR som er fremstilt fra DNA-sekvensene ifølge figurene 33a og 33b, Figur 35 er en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av anionbytterkromatografi av løselig AH-1,23-TCR og som viser proteineluering fra en POROS-50HQ-kolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede linjen, Figur 36 er en reduserende SDS-PAGE (10 % Bis-Tris-gel, Coomassiefarget) av AH-l,23-TCR-fraksjoner fra anionbytterkolonnen kjørt i figur 35. Undersøkte proteiner er anionbytterfraksjonene av TCR-1,23-S-S fra refolding 3. Spor 1 er molekylvektmarkører, spor 2 er B4, spor 3 er C2, spor 4 er C3, spor 5 er C4, spor 6 er C5, spor 7 er C6, spor 8 er C7, spor 9 er C8 og spor 10 er C9, Figur 37 er en ikke-reduserende SDS-PAGE (10 % Bis-Tris-gel, Coomassiefarget) av AH-l,23-TCR-fraksjoner fra anionbytterkolonne kjørt i figur 35. Undersøkte proteiner er anionbytterfraksj onene av TCR-1,23-S-S fra refolding 3. Spor 1 er molekylvektmarkører, spor 2 er B4, spor 3 er C2, spor 3 er C2, spor 4 er C3, spor 5 er C4, spor 6 er C5, spor 7 er C6, spor 8 er C7, spor 9 er C8 og spor 10 er C9, Figur 38 er en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av størrelseseksklusjonskromatografi av løselig AH-1,23-TCR og som viser proteineluering fra sammenslåtte fraksjoner fra figur 35. Proteinet elueres som en enkelt stor topp som tilsvarer heterodimeren, Figurene 39a og 39b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til a-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 48 i ekson 1 på TRAC<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 40a og 40b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til o> kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 45 i ekson 1 på TRAC<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 41a og 41b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til a-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 61 i ekson 1 på TRAC<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 42a og 42b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til a-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 50 i ekson 1 på TRAC<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 43a og 43b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til a-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 10 i ekson 1 på TRAC<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 44a og 44b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til a-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 15 i ekson 1 på TRAC<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 45a og 45b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til a-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 12 i ekson 1 på TRAC<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 46a og 46b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til a-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 22 i ekson 1 på TRAC<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og skyggelagt aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 47a og 47b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til a-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 52 i ekson 1 på TRAC<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 48a og 48b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til a-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 43 i ekson 1 på TRAC<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 49a og 49b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til a-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 57 i ekson 1 på TRAC<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 50a og 50b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til B-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 77 i ekson 1 på TRBC2<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 51a og 51b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til B-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 17 i ekson 1 på TRBC2<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 52a og 52b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til B-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 13 i ekson 1 på TRBC2<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 53a og 53b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til 6-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 59 i ekson 1 på TRBC2<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 54a og 54b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til fi-ki eden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 79 i ekson 1 på TRBC2<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 55a og 55b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til fi-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 14 i ekson 1 på TRBC2<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 56a og 56b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til B-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 55 i ekson 1 på TRBC2<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 57a og 57b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til B-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 63 i ekson 1 på TRBC2<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 58a og 58b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensen til B-kjeden fra løselig A6-TCR, som er mutert for å introdusere et nytt cystein på residie 15 i ekson 1 på TRBC2<*>01. De skyggelagte nukleotidene indikerer det nye introduserte cysteinkodonet og understreket aminosyre indikerer det introduserte cysteinet, Figurene 59-64 er kurver som er utarbeidet på bakgrunn av anionbytterkromatografi av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom henholdsvis: residiene 48 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 57 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, residiene 45 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 77 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, residiene 10 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 17 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, residiene 45 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 59 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, residiene 52 fra ekson 1 i TRAC01 og 55 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, residiene 15 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 15 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, og som viser proteineluering fra en POROS-50-kolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede linjen, Figurene 65a og 65b er henholdsvis reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 48 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 57 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, og fraksjoner som ble kjørt ble samlet fra anionbytterkolonnen kjørt i figur 59, Figur 66a og 66b er henholdsvis reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 45 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 77 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, og fraksjoner som ble kjørt ble samlet fra anionbytterkolonnen kjørt i figur 60, Figurene 67a og 67b er henholdsvis reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 10 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 17 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, og fraksjoner som ble kjørt ble samlet fra anionbytterkolonnen kjørt i figur 61, Figurene 68a og 68b er henholdsvis reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 45 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 59 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, og fraksjoner som ble kjørt ble samlet fra anionbytterkolonnen kjørt i figur 62, Figurene 69a og 69b er henholdsvis reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 52 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 55 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, og fraksjoner som ble kjørt ble samlet fra anionbytterkolonnen kjørt i figur 63, Figurene 70a og 70b er henholdsvis reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 15 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 15 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, og fraksjoner som ble kjørt ble samlet fra anionbytterkolonnen kjørt i figur 64, Figur 71 er en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av størrelseseksklusjons-kromatografi av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 48 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 57 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, og som viser proteineluering fra en Superdex-200-HL-gelifltreringskolonne. Fraksjoner som ble kjørt ble samlet fra anionbytterkolonnen kjørt i figur 59, Figur 72 er en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av størrelseseksklusjons-kromatografi av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 45 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 77 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, og som viser proteineluering fra en Superdex-200-HL-gelfiltreringskolonne. Fraksjoner som ble kjørt ble samlet fra anionbytterkolonnen kjørt i figur 60, Figur 73 er en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av størrelseseksklusjons-kromatografi av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 10 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 17 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, og som viser proteineluering fra en Superdex-200-HL-gelfiltreringskolonne. Fraksjoner som ble kjørt ble samlet fra anionbytterkolonnen kjørt i figur 61, Figur 74 er en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av størrelseseksklusjons-kromatografi av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 45 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 59 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, og som viser proteineluering fra en Superdex-200-HL-gelifltreringskolonne. Fraksjoner som ble kjørt ble samlet fra anionbytterkolonnen kjørt i figur 62, Figur 75 er en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av størrelseseksklusjons-kromatografi av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 52 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 55 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, og som viser proteineluering fra en Superdex-200-HL-gelifltreringskolonne. Fraksjoner som ble kjørt ble samlet fra anionbytterkolonnen kjørt i figur 63, Figur 76 er en kurve som er utarbeidet på bakgrunn av størrelseseksklusjons-kromatografi av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 15 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 15 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, og som viser proteineluering fra en Superdex-200-HL-gelifltreringskolonne. Fraksjoner som ble kjørt ble samlet fra anionbytterkolonnen kjørt i figur 64, Figurene 77-80 er BIAcore-responskurver som henholdsvis viser binding av løselig A6-TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom: residiene 48 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 57 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, residiene 45 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 77 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, residiene 10 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 17 fra ekson 1 i TRBC2<*>01 og residiene 45 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 59 fra ekson 1 i TRBC2<*>01 til HL A-A2-tax-pMHC. Figur 81 er en BIAcore-kurve som viser uspesifikk binding av løselig A6-TCR, som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 52 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 55 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, til HLA-A2-tax og til HLA-A2-NY-ESO-pMHC, Figur 82 er en BIAcore-responskurve som viser binding av løselig A6-TCR, som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom residiene 15 fra ekson 1 i TRAC<*>01 og 15 fra ekson 1 i TRBC2<*>01, til HLA-A2-tax-pMHC, Figur 83a er et elektrontetthetskart rundt modellen med lBD2-sekvens (Kjede A Thrl64, Kjede B Serl 74). Kart er profilert ved 1,0,2,0 og 3,0 a. Figur 83b er et elektrontetthetskart etter forbedring med Cys i de to posisjonene A164 og Bl74. Kartet er profilert ved de samme o-nivåene som for figur 83a, Figur 84 sammenligner strukturene til 1BD2-TCR med en NY-ESO-TCR ifølge foreliggende oppfinnelse ved å overlappe nevnte strukturer i bånd- og trådrepresenta-sjoner, Figurene 85a og 85b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensene til B-kjeden i NY-ESO-TCR med et inkorporert biotingjenkjenningssete. Biotingjenkjenningssetet er uthevet, Figurene 86a og 86b viser henholdsvis DNA- og aminosyresekvensene til B-kjeden i NY-ESO-TCR med et inkorporert heksa-histidinmerke. Heksa-histidinmerket er uthevet, Figur 87 viser elueringen av løselig NY-ESO-TCR, som inneholder en ny disulfidbinding og en biotingjenkjenningssekvens, fra POROS-50HQ-anionbytterkolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede linjen, Figur 88 viser elueringen av løselig NY-ESO-TCR, som inneholder en ny disulfidbinding og et heksa-histidinmerke, fra POROS-50HQ-anionbytterkolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede linjen, Figur 89 er en proteinelueringsprofil fra gelfiltreringskromatografi av oppsamlede fraksjoner fra den NY-ESO-biotinmerkede anionbytterkolonnen som ble kjørt og som er illustrert i figur 87, Figur 90 er en proteinelueringsprofil fra gelfiltreringskromatografi av oppsamlede fraksjoner fra den NY-ESO-heksa-histidinmerkede anionbytterkolonnen som ble kjørt og som er illustrert i figur 88, Figurene 91a-h viser FACS-histogrammer som illustrerer fargingsintensiteten fremkommet fra 25 000 hendelser for HLA-A2-positiv EBV-transformert B-cellelinje (PP LCL) inkubert med de følgende konsentrasjoner av henholdsvis NY-ESO-peptid og fluorescerende NY-ESO-TCR-tetramerer: NYESO 0 TCR 5 ug, NYESO 10"<4>M TCR 5 ug, NYESO 10_<5>M TCR 5ug, NYESO lO^M TCR 5ug, NYESO 0 TCR 10ug, NYESO 10_<4>M TCR 10ug, NYESO 10_<5>M TCR 10ug, NYESO 10-<6>M TCR 10ug, Figur 92 viser DNA-sekvensen til B-kjeden i A6-TCR med den konstante regionen fra TRBC 1<*>01, Figur 93 er en anionbytterkromatografikurve av løselig A6-TCR som inneholder den konstante regionen fra TRBC<*>01 og som viser proteineluering fra en POROS-50HQ-kolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede li<n>jen, Figur 94 - A. Reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av fraksjoner fra kolonne kjørt i figur 93 som vist. B. Ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av fraksjoner fra kolonne kjørt i figur 93 som vist, Figur 95 - Størrelseseksklusjonskromatografi av oppsamlede fraksjoner fra topp 2 i figur 93. Topp 1 inneholder TCR-heterodimer som er interkjededisulfidbundet, Figur 96 - A. BlAcore-analyse av spesifikk binding av disulfidbundet A6-løselig-TCR til HLA-Flu-kompleks. B. Bindingsrespons sammenlignet med kontroll for en enkelt injeksjon av disulfidbundet A6-løseligTCR, Figur 97 viser nukleinsyresekvensen til den muterte B-kjeden fra A6-TCR med det "frie" cysteinet inkorporert, Figur 98 - Anionbytterkromatografi av løselig A6-TCR med det "frie" cysteinet inkorporert som viser proteineluering fra en POROS-50HQ-kolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede linjen, Figur 99 - A. Reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av fraksjoner fra kolonne kjørt i figur 98 som vist. B. Ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av fraksjoner fra kolonne kjørt i figur 98 som vist, Figur 100 - Størrelseseksklusjonskromatografi av sammenslåtte fraksjoner fra topp 2 i Figur 98. Topp 1 inneholder heterodimer som er interkjededisulfidbundet, Figur 101 - A. BlAcore-analyse av den spesifikke bindingen av disulfidbundet A6-løselig-TCR med det "frie" cysteinet inkorporert, til HLA-Flu-kompleks. B. Bindingsrespons sammenlignet med kontroll for en enkelt injeksjon av disulfidbundet A6-løselig-TCR, Figur 102 viser nukleinsyresekvensen til den muterte B-kjeden fra A6-TCR der en serinresidie er mutert inn istedenfor det "frie" cysteinet, Figur 103 - Anionbytterkromatografi av løselig A6-TCR der en serinresidie er mutert inn istedenfor det "frie" cysteinet og som viser proteineluering fra en POROS-50HQ-kolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede linjen, Figur 104 - A. Reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av fraksjoner fra kolonne kjørt i figur 103 som vist. B. Ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) av fraksjoner fra kolonne kjørt i figur 103 som vist. Topp 2 inneholder åpenbart TCR-heterodimer som er interkjededisulfidbundet, Figur 105 - Størrelseseksklusjonskromatografi av oppsamlede fraksjoner fra topp 2 i figur 103. Topp 1 inneholder TCR-heterodimer som er interkjededisulfidbundet, Figur 106 - A. BlAcore-analyse av den spesifikke bindingen av disulfidbundet A6-løselig-TCR, som inneholder en serinresidie mutert inn istedenfor det "frie" cysteinet, til HLA-Flu-kompleks. B. Bindingsrespons sammenlignet med kontroll for en enkelt injeksjon av disulfidbundet A6-løselig-TCR,

Figur 107 viser nukleotidsekvensen til pYXl 12,

Figur 108 viser nukleotidsekvensen til pYX122,

Figur 109 viser DNA- og proteinsekvensen til pre-pro-paringsfaktor-alfa fusjonert med TCR-a-kjede, Figur 110 viser DNA- og proteinsekvensen til pre-pro-paringsfaktor-alfa fusjonert med TCR-B-kjede, Figur 111 viser et Western-blot av løselig TCR uttrykt i S. cerevisiae- SEY62\ 0. Spor C inneholder 60ng renset løselig NY-ESO-TCR som en kontroll. Sporene 1 og 2 inneholder proteiner som er høstet fra to ulike TCR-transformerte gjærkulturer, Figur 112 viser nukleinsyresekvensen til innskuddet mellom Kpnl og EcoRI på pEX172-plasmidet. Resten av plasmidet er pBlueScript-II KS-, Figur 113 er et skjematisk diagram av TCR-kjedene til kloning inn i baculovirus, Figur 114 viser nukleinsyresekvensen til disulfid-A6-a-TCR-konstruksjonen som et BamHI-innskudd som kan bli satt inn i ekspresjonsplasmidet pAcAB3, Figur 115 viser disulfid-A6-B-TCR-konstruksjonen som et BamHI-innskudd som kan bli satt inn i ekspresjonsplasmidet pAcAB3, og Figur 116 viser en Coomassiefarget gel og Western-blot mot bakterielt fremstilt disulfid-A6-TCR og insekt-disulfid-A6-TCR.

I alle de påfølgende eksemplene er de løselige TCR-kjedene som er fremstilt trunkerte straks C-terminalt for cysteinresidiene som danner den native interkjededisulfidbindingen, hvis ikke annet er opplyst.

Eksempel 1 - Design av primere og mutagenese av A6- Tax- TCR- a- og - fi- kjeder

For å kunne mutere A6-treonin 48 i ekson 1 i TRAC<*>01 til cystein ble de følgende primerne designet (mutasjon vist med små bokstaver):

For å kunne mutere A6-Tax-serin 57 i ekson 1 i både TRBC1<*>01 og TRBC2<*>01 til cystein ble de følgende primerne designet (mutasjon vist med små bokstaver):

PCR- mutagenese:

Ekspresjonsplasmider som inneholdt genene for a- og B-kjedene i A6-Tax-TCR ble mutert ved å benytte henholdsvis a-kjedeprimerene eller B-kjedeprimerene på følgende måte. lOOng plasmid ble blandet med 5 ul lOmM dNTP, 25ul lOxPfu-buffer (Stratagene), 10 enheter Pfu-polymerase (Stratagene) og sluttvolumet ble justert til 240ul med H20.148ul av denne blandingen ble primere som var fortynnet for å gi en sluttkonsentrasjon på 0,2uM i 50ul sluttreaksjonsvolum tilsatt. Etter et første denatureringstrinn på 30 sekunder ved 95 °C ble reaksjonsblandingen utsatt for 15 runder med denaturering (95 °C, 30 sek.), sammensmelting (55 °C, 60 sek.) og elongering (73 °C, 8 min.) i en Hybaid-PCR-express-PCR-maskin. Produktet ble deretter fordøyd i 5 timer ved 37 °C med 10 enheter av Dpnl-restriksjonsenzym (New England Biolabs). 10ul av den fordøyde reaksjonsblandingen ble transformert inn i kompetente XLl-Blue-bakterier og dyrket i 18 timer ved 37 °C. En enkelt koloni ble plukket og dyrket over natt i 5ml TYP+ampicillin (16g/l Bacto-Trypton, 16g/l Gjærekstrakt, 5g/l NaCl, 2,5g/l K2HP04, lOOmg/1 Ampicillin). Plasmid-DNA ble renset på en Qiagen-mini-prep-kolonne i overensstemmelse med forhandlerens instruksjoner og sekvensene ble bekreftet med automatisk sekvensering på sekvenseringsenheten til Department of Biochemistry, Oxford University. De respektive muterte nukleinsyre- og aminosyresekvensene er vist i figur 2a og 3a for a-kjeden og i figur 2b og 3b for B-kjeden.

Eksempel 2 - Uttrykking, refolding og rensing av løselig TCR

Ekspresjonsplasmidene inneholdende henholdsvis de muterte a- og B-kjedene ble transformert separat inn i £.cø//-BL21pLysS, og enkeltstående ampicillinresistente kolonier ble dyrket ved 37 °C i TYP- (ampicillin 100ug/ml) medium til OD60o var nådd 0,4 før proteinuttrykking ble indusert med 0,5mM IPTG. Celler ble høstet tre timer etter induksjonen ved sentrifugering i 30 minutter ved 4000rpm i en Beckman-J-6B. Cellepelleter ble resuspendert i en buffer som inneholdt 50mM Tris-HCl, 25 % (w/v) sukrose, ImM NaEDTA, 0,1 % (w/v) NaAzid, 10mM DTT, pH 8,0. Etter et trinn med frysing-tining over natt ble resuspenderte celler sonikert med 1 minutts pulser i totalt omtrent 10 minutter i en Milsonix-XL2020-sonikator ved å benytte en standard probe med 12mm i diameter. Inklusjonslegemepelleter ble gjenvunnet med sentrifugering i 30 minutter ved 13000rpm i en Beckman-J2-21 -sentrifuge. Tre detergentvaskinger ble deretter utført for å fjerne celleavfall og membrankomponenter. Hver gang ble inklusjonslegemepelleten homogenisert i en Triton-buffer (50mM Tris-HCl, 0,5 % Triton-X100, 200mM NaCl, 10mM NaEDTA, 0,1 % (w/v) NaAzid, 2mM DTT, pH 8,0) før pelleten ble gjenskapt ved hjelp av sentrifugering i 15 minutter ved 13000rpm i en Beckman-J2-21. Detergent og salt ble deretter fjernet med en liknende vasking i følgende buffer: 50mM Tris-HCl, ImM NaEDTA, 0,1 % (w/v) NaAzid, 2mM DTT, pH 8,0. Til slutt ble inklusjonslegemene fordelt i like deler på 30mg og frosset ned til -70 °C. Inklusjons-legemeproteinutbytte ble kvantitert ved å løseliggjøre med 6M guanidin-HCl og måling med en Bradford-fargestoffbindende analyse (PerBio). Omtrent 30mg (d.v.s. lumol) av hver løseliggjorte inklusjonslegemekjede ble tint opp fra frosset stokkløsning, prøver ble deretter blandet og blandingen ble fortynnet til 15ml av en guanidinløsning (6M guanidinhydroklorid, lOmM natriumacetat, lOmM EDTA) for å sikre fullstendig kjededenaturering. Guanidinløsningen inneholdende fullstendig reduserte og denaturerte TCR-kjeder ble deretter injisert i 1 liter av den følgende refoldingsbufferen: lOOmM Tris pH 8,5,400mM L-arginin, 2mM EDTA, 5mM redusert glutation, 0,5mM oksidert glutation, 5M urea, 0,2mM PMSF. Løsningen ble hensatt i 24 timer. Refoldingsblandingen ble deretter dialysert to ganger, først mot 10 liter lOOmM urea og deretter mot 10 liter lOOmM urea, lOmM Tris pH 8,0. Både refoldingstrinn og dialysetrinn ble utført ved 6-8 °C.

sTCR ble separert fra degraderingsprodukter og urenheter ved å sette den dialyserte refoldingsblandingen på en POROS-50HQ-anionbytterkolonne og eluere bundet protein med en 0-500mM gradient av NaCl over 50 kolonnevolumer ved å benytte en Akta-renser (Pharmacia) som i figur 4. Fraksjoner samlet fra toppene ble lagret ved 4 °C og analysert med Coomassiefarget SDS-PAGE (figur 5) før de ble slått sammen og konsentrert opp. Til slutt ble sTCRene renset ogkarakterisert vedå benytte en Sephadex-200HR-gelfiltreringskolonne (Figur 6) balansert med HBS-EP-buffer (lOmM HEPES pH 7,4, 150mM NaCl, 3,5mM EDTA, 0,05 % nonidet p40). Fraksjonene fra toppen som eluerte ved en relativ molekylvekt på omtrent 50kDa ble slått sammen og konsentrert før karakterisering med BIAcore-overflate-plasmon-resonans-analyse ble foretatt.

Eksempel 3 — BIAcore- overflate- plasmon- resonans- karakterisering av sTCR- binding til spesifikk pMHC

En overflate-plasmon-resonans-biosensor (BIAcore-3000) ble benyttet for å analysere bindingen av en sTCR til sin peptid-MHC-ligand. Dette ble fremmet ved å fremstille enkle pMHC-komplekser (beskrevet nedenfor) som ble immobiliserte på en streptavidinbelagt bindingsoverflate på en semi-orientert måte som tillot effektiv testing av bindingen av en løselig T-cellereseptor til opp til fire ulike pMHC (immobiliserte på separate strømningsceller) samtidig. Manuell injeksjon av HLA-kompleks tillater at det presise nivået av immobiliserte klasse-I-molekyler med letthet kan bli manipulert. Slike immobiliserte komplekser er i stand til å binde både T-cellereseptorer og koreseptoren CD8aa, der begge kan bli injisert i den løselige fasen. Spesifikk binding av TCR blir oppnådd selv ved lave konsentrasjoner (minst 40ug/ml) noe som tyder på at TCRen er relativt stabil. pMHC-bindende egenskaper for sTCR er observert å være kvalitativt og kvantitativt tilsvarende enten sTCR blir benyttet i den løselige eller i den immobiliserte fasen. Dette er en viktig kontroll for partiell aktivitet fra løselige typer og tyder også på at biotinylerte pMHC-komplekser er biologisk like aktive som ikke-biotinylerte komplekser.

Biotinylerte klasse-I HLA-A2-peptidkomplekser ble refoldet in vitro fra bakterieuttrykte inklusjonslegemer som inneholdt de integrerte subenhetsproteinene og syntetiske peptid, etterfulgt av rensing og enzymatisk biotinylering in vitro (0'Callaghan et al., (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Tung HLA-kjede ble uttrykt med et C-terminalt biotinyleringsmerke som erstatter de transmembrane og cytoplasmiske domenene til proteinet i en hensiktsmessig konstruksjon. Uttrykkingsnivåer av inklusjonslegemer på~75mg/liter bakteriell kultur ble oppnådd. Den lette HLA-kjeden eller B2-mikroglobulin ble også uttrykt som inklusjonslegemer i E.coli fra en hensiktsmessig konstruksjon ved et nivå på~500mg/liter bakteriell kultur.

£.co//-celler ble lyserte og inklusjonslegemer ble renset til omtrent 80 % renhet. Protein fra inklusjonslegemer ble denaturert i 6M guanidin-HCl, 50mM Tris pH 8,1, lOOmM NaCl, 10mM DTT, lOmM EDTA og ble refoldet ved en konsentrasjon på 30mg/liter tung kjede, 30mg/liter B2m inn i 0,4M L-arginin-HCl, lOOmM Tris pH 8,1, 3,7mM cystamin, 6,6mM B-cystamin, 4mg/ml peptid (for eksempel tax 11-19) ved tilsetting av en enkelt puls med denaturert protein til refoldingsbuffer ved <5 °C. Refolding ble tillatt å bli fullstendig ved 4 °C i minst 1 time.

Buffer ble byttet ved dialyse i 10 volumer med lOmM Tris pH 8,1. To bufferskift var nødvendig for å redusere ionestyrken til løsningen tilstrekkelig. Proteinløsningen ble deretter filtrert gjennom et l,5um celluloseacetatfilter og satt på en POROS-50HQ-anionbytterkolonne (8ml i volum). Protein ble eluert med en lineær 0-500mM gradient av NaCl. HLA-A2-peptidkompleks eluerte ved omtrent 250mM NaCl, og toppfraksjoner ble samlet, en blanding av proteasehemmere (Calbiochem) ble tilsatt og fraksjonene ble avkjølt på is.

Biotinylertmerkede HLA-komplekser ble byttet buffer på i lOmM Tris pH 8,1, 5mM NaCl ved å benytte Pharmacia-hurtigavsaltingskolonne som var balansert med den samme bufferen. Umiddelbart etter eluering ble de proteininneholdende fraksjonene avkjølt på is og proteasehemmerblanding (Calbiochem) ble tilsatt. Biotinylerings-reagenser ble deretter tilsatt: ImM biotin, 5mM ATP (bufret til pH 8), 7,5mM MgCl2og 5u,g/ml BirA-enzym (renset i henhold til 0'Callaghan et al., (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Blandingen ble deretter tillatt å inkubere ved romtemperatur over natt.

Biotinylerte HLA-komplekser ble renset ved å benytte gelfiltreringskromatografi. En Pharmacia-Superdex-75-HR-10/30-kolonne ble på forhånd balansert med filtrert PBS og lml av biotinyleringsreaksjonsblandingen ble satt på og kolonnen ble kjørt med 0,5ml PBS per minutt. Biotinylerte HLA-komplekser eluerte som en enkelt topp ved omtrent 15ml. Fraksjoner som inneholdt protein ble slått sammen, avkjølt på is og proteasehemmerblanding ble tilsatt. Proteinkonsentrasjon ble bestemt ved å benytte en Coomassiebindingsanalyse (PerBio), og like volumer med biotinylerte HLA-komplekser ble lagret og frosset ned til -20 °C. Streptavidin ble immobilisert med standard amin-koplingsfremgangsmåter.

Interaksjonene mellom A6-Tax-sTCR inneholdende en ny interkjedebinding og dennes ligand/MHC-kompleks eller en irrelevant HLA-peptidkombinasjon, fremstillingen av hvilke er beskrevet ovenfor, ble analysert på en BIAcore-3000-overflate-plasmon-resonans- (SPR) biosensor. SPR måler forandringer i brytningsindeks uttrykt i respons-enheter (RU) nær en sensoroverflate inne i en liten strømningscelle, et prinsipp som kan bli benyttet for å påvise reseptor-ligand interaksjoner og for å analysere deres affinitet og kinetiske parametere. Probestrømningscellene ble gjort klare ved å immobilisere de individuelle HLA-peptidkompleksene i separate strømningsceller via binding mellom biotinet som var kryssbundet på 62m og streptavidin som var kjemisk kryssbundet på den aktiverte overflaten til strømningscellene. Analysen ble deretter utført ved å la sTCR passere over overflatene i de ulike strømningscellene med en konstant strømnings-hastighet, måle SPR-responsen som følge av dette. Først ble spesifisiteten av interaksjonen bekreftet ved å la sTCR passere over to ulike overflater med en konstant strømningshastighet på 5ul per minutt, én belagt med -5000 RU med spesifikt peptid-HLA-kompleks og den andre belagt med~5000 RU med ikke-spesifikt peptid-HLA-kompleks (figur 7, innskutt figur). Injeksjoner av løselig sTCR med konstant strømnings-hastighet og med ulike konsentrasjoner over peptid-HLA-komplekset ble benyttet for å definere bakgrunnsresonansen. Verdiene for disse kontrollmålingene ble trukket fra verdiene som ble funnet med spesifikt-HLA-kompleks og benyttet for å beregne bindingsaffiniteter uttrykt som dissosiasjonskonstanten, Kd (Price & Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2. utgave) 1979, Clarendon Press, Oxford), som i figur 7.

Den fremkomne Kd-verdien (l,8uM) ligger nært opp til den som er rapportert for interaksjonen mellom A6-Tax-sTCR uten den nye disulfidbindingen og pMHC (0,9luM - Ding et al., 1999, Immunity 11:45-56).

Eksempel 4 - Fremstilling av løselig JM22- TCR inneholdende en ny disulfidbinding.

B-kjeden til den løselige A6-TCRen fremstilt i eksempel 1 inneholder i den native sekvensen et Bglll-restriksjonssete (AAGCTT) som er hensiktsmessig til bruk som et ligeringssete.

PCR-mutagenese ble utført som beskrevet i detalj nedenfor for å introdusere et BamHl-restriksjonssete (GGATCC) i a-kjeden til løselig A6-TCR, plassert 5' i forhold til det nye cysteinkodonet. Sekvensen beskrevet i figur 2a ble benyttet som et templat for denne mutagenesen. De følgende primerne ble benyttet:

lOOng plasmid ble blandet med 5ul lOmM dNTP, 25ul lOxPfu-buffer (Stratagene), 10 enheter Pfu-polymerase (Stratagene) og sluttvolumet ble justert til 240 ul med H2O. 48ul av denne blandingen ble tilsatt primere som var fortynnet for å gi en sluttkonsentrasjon på 0,2uM i 50ul sluttreaksjonsvolum. Etter et første denatureringstrinn på 30 sekunder ved 95 °C ble reaksjonsblandingen utsatt for 15 omganger med

denaturering (95 °C, 30 sek.), sammensmelting (55 °C, 60 sek.) og elongering (73 °C, 8 min.) i en Hybaid-PCR-express-PCR-maskin. Produktet ble deretter fordøyd i 5 timer ved 37 °C med 10 enheter Dpnl-restriksjonsenzym (New England Biolabs). IOjj.1 fra den fordøyde reaksjonen ble transformert ble transformert inn i kompetente XLl-Blue-bakterier og dyrket i 18 timer ved 37 °C. En enkelt koloni ble plukket og dyrket over natt i 5ml TYP+ampicillin (16g/l Bacto-Trypton, 16g/l Gjærekstrakt, 5g/l NaCl, 2,5g/l K2HP04, lOOmg/1 Ampicillin). Plasmid-DNA ble renset på en Qiagen-mini-prep-kolonne i henhold til forhandlers instruksjoner og sekvensen ble bekreftet med automatisk sekvensering ved sekvenseringsfasiliteten til Department of Biochemistry, Oxford University. Mutasjonene som ble introdusert i a-kjeden var "tause", og derfor forble aminosyresekvensen til denne kjeden uforandret fra den som er vist ifølge figur 3a. DNA-sekvensen til den muterte a-kjeden er vist i figur 8a.

For å kunne fremstille en løselig JM22-TCR med en inkorporert ny disulfidbinding ble A6-TCR-plasmider som inneholdt BamHl-restriksjonssetet på a-kjeden og Bglll-restriksjonssetet på B-kjeden benyttet som templat:

JM22-TCR-a- og -B-kjedekonstruksjoner ble fremskaffet med PCR-kloning på følgende måte. PCR-reaksjoner ble utført ved å benytte primerne som er vist ovenfor og templater inneholdende JM22-TCR-kj edene. PCR-produktene ble restriksjonsfordøyd med de relevante restriksjonsenzymene og klonet inn i pGMT7 for å fremskaffe ekspresjonsplasmider. Sekvensen til plasmidinnskuddene ble bekreftet med automatisert DNA-sekvensering. Figurene 8b og 8c viser henholdsvis DNA-sekvensene til de muterte a- og B-kjedene til JM22-TCR, og figurene 9a og 9b viser de resulterende aminosyresekvensene.

De respektive TCR-kjedene ble uttrykt, ko-refoldet og renset som beskrevet i eksemplene 1 og 2. Figur 10 illustrerer elueringen av løselig disulfidbundet JM22-TCR-protein fra en POROS-50HQ-kolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede linjen. Figur 11 viser resultatene fra både reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) og ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) geler av fraksjoner fra kolonnen kjørt og illustrert av figur 10. Topp 1 inneholder åpenbart TCR-heterodimer som er interkjededisulfidbundet. Figur 12 viser proteineluering fra en størrelseseksklusjonskolonne av sammenslåtte fraksjoner fra topp 1 ifølge figur 10.

En BlAcore-analyse av bindingen av JM22-TCR til pMHC ble utført som beskrevet i eksempel 3. Figur 13a viser BlAcore-analyse av den spesifikke bindingen av disulfidbundet JM22-løselig-TCR til HLA-Flu-kompleks. Figur 13b viser bindings-responsen sammenlignet med kontroll for en enkelt injeksjon av disulfidbundet JM22-løselig-TCR. Kd-verdien til denne disulfidbundne TCRen for HLA-Flu-kompleks ble bestemt å være 7,9 ± 0,5 luM.

Eksempel 5 - Fremstilling av løselig NY- ESO- TCR inneholdende en ny disulfidbinding.

cDNA som koder for NY-ESO-TCR ble isolert fra T-celler tilveiebrakt av Enzo Cerundolo (Institute of Molecular Medicine, University of Oxford) i overensstemmelse med kjente teknikker. cDNA som koder for NY-ESO-TCR ble fremstilt ved å behandle mRNA med revers transkriptase.

For å kunne fremstille en løselig NY-ESO-TCR med en ny disulfidbinding inkorporert ble A6-TCR-plasmider inneholdende BamHI-restriksjonssetet på a-kjeden og Bglll-restriksjonssetet på B-kjeden benyttet som templater, som beskrevet i eksempel 4. De følgende primerne ble benyttet:

NY-ESO-TCR-a- og -B-kjedekonstruksjoner ble fremskaffet med PCR-kloning på følgende måte. PCR-reaksjoner ble utført ved å benytte primerne som er vist ovenfor og templater inneholdende NY-ESO-TCR-kjedene. PCR-produktene ble restriksjons-fordøyde med de relevante restriksjonsenzymene og klonet inn i pGMT7 for å få ekspresjonsplasmider. Sekvensene til plasmidinnskuddene ble bekreftet med automatisert DNA-sekvensering. Figurene 14a og 14b viser henholdsvis DNA-sekvensene til de muterte a- og 6-kjedene til NY-ESO-TCR, og figurene 15a og 15b viser de resulterende aminosyresekvensene.

De respektive TCR-kjedene ble ko-refoldet og renset som beskrevet i eksemplene 1 og 2, med unntak av følgende forandring i protokollen: Denaturering av løselige TCRer. 30mg av det løseliggjorte TCR-B-kjede-inklusjonslegemet og 60mg av det løseliggjorte TCR-a-kjede-inklusjonslegemet ble tint fra frosne stokkløsninger. Inklusjonslegemene ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 5mg/ml i 6M guanidinløsning, og DTT (2M stokkløsning) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på lOmM. Blandingen ble inkubert ved 37 °C i 30 min.

Refolding av løselige TCRer. IL refoldingsbuffer ble rørt kraftig ved 5 °C ± 3 °C. Redoksparet 2-merkaptoetylamin og cystamin (henholdsvis til sluttkonsentrasjon på 6,6mM og 3,7mM) ble tilsatt omtrent 5 minutter før tilsetting av denaturerte TCR-kjeder. Proteinet ble deretter tillatt å gjennomgå refolding i omtrent 5 timer ±15 minutter under røring ved 5 °C ± 3 °C.

Dialyse av refoldede løselige TCRer. Refoldet TCR ble dialysert i Spectrapor-1-membran (Spectrum, Produktnr. 132670) mot 10L lOmM Tris pH 8,1 ved 5 °C ± 3 °C i 18-20 timer. Etter denne tiden ble den dialyserte bufferen skiftet ut med ny 1 OmM Tris pH 8,1 (10L) og dialyse ble fortsatt ved 5 °C ± 3 °C i ytterligere 20-22 timer.

Figur 16 viser elueringen av løselig NY-ESO-disulfidbundet-TCR-protein fra en POROS-50HQ-kolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede linjen. Figur 17 viser resultatene fra både reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) og ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) geler av fraksjoner fra kolonnen som ble kjørt og som er illustrert i Figur 16. Toppene 1 og 2 inneholder åpenbart TCR-heterodimer som er interkjededisulfidbundet. Figur 18 viser størrelses-eksklusjonskromatografi av sammenslåtte fraksjoner fra topp 1 (A) og topp 2 (B) i figur 17. Proteinet elueres som en enkelt stor topp som tilsvarer heterodimeren.

En BlAcore-analyse av bindingen av disulfidbundet NY-ESO-TCR til pMHC ble utført som beskrevet i eksempel 3. Figur 19 viser BlAcore-analyse av den spesifikke bindingen av disulfidbundet løselig TCR til HLA-NYESO-kompleks. A. topp 1, B. topp 2.

Kd-verdien til denne disulfidbundne TCRen for HLA-NY-ESO-komplekset ble bestemt å være 9,4 ± 0,84uM.

Eksempel 6 - Fremstilling av løselig NY- ESO- TCR inneholdende en ny interkjededisulfidbinding og minst ett av de to cysteinene som er nødvendige for å danne den native inter-kjededisulifdbindingen.

For å kunne fremstille en løselig NY-ESO-TCR med en ny disulfidbinding inkorporert og i det minste ett av cysteinresidiene som er involvert i den native interkjededisulfidbindingen ble plasmider som inneholdt BamHI-restriksjonssetet på a- kjeden og Bglll-restriksjonssetet på B-kjeden benyttet som skjellett som beskrevet i eksempel 4. De følgende primerne ble benyttet:

NY-ESO-TCR-a- og B-kjede-konstruksjoner ble tilveiebrakt med PCR-kloning på følgende måte. PCR-reaksjoner ble utført ved å benytte primerne vist ovenfor og templater inneholdende NY-ESO-TCR-kjedene. PCR-produktene ble restriksjons-fordøyde med de relevante restriksjonsenzymene og klonet inn i pGMT7 for å få ekspresjonsplasmider. Sekvensen til plasmidinnskuddene ble bekreftet med automatisert DM A-sekvensering. Figur 20a og 20b viser henholdsvis DNA-sekvensen til de muterte a-og B-kjedene til NY-ESO-TCRen, og figur 21a og 21b viser de resulterende aminosyresekvensene.

For å fremstille en løselig NY-ESO-TCR inneholdende både en ikke-nativ interkjededisulfidbinding og den native interkjededisulfidbindingen ble DNA som var isolert ved å gjøre bruk av begge primerne ovenfor benyttet. For å fremstille løselige TCRer med en ikke-nativ interkjededisulfidbinding og kun én av cysteinresidiene som er involvert i den native interkjededisulfidbindingen, ble DNA som var isolert ved å gjøre bruk av én av primerne ovenfor sammen med den hensiktsmessige primeren fra eksempel 5 benyttet.

De respektive TCR-kjedene ble uttrykt, ko-refoldet og renset som beskrevet i eksempel 5.

Figurene 22-24 illustrerer elueringen av løselig NY-ESO-TCRacysBcy<s>(d.v.s. med ikke-native og med native cysteiner i begge kjeder), -TCRa<cys>(med ikke-native cysteiner i begge kjeder men med det native cysteinet kun i a-kjeden) og -TCRB<cys>(med ikke-native cysteiner i begge kjeder men med det native cysteinet kun i B-kjeden) fra POROS-50HQ-anionbytterkolonner ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den

stiplede linjen. Figurene 25 og 26 viser henholdsvis resultatet fra reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) og ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) geler av fraksjoner fra kolonner kjørt med NY-ESO-TCRa<cys>B<cys>, NY-ESO-TCRa<cys>og NY-ESO-TCRB<cys>illustrert i Figurene 22-24. Disse indikerer klart at TCR-heterodimerer som er interkjede-

disulfidbundet har blitt dannet. Figurene 27-29 viser proteinelueringsprofiler fra gelfiltreringskromatografi av oppsamlede fraksjoner fra anionbytterkolonnen kjørt med NY-ESO-TCRa<cys>B<cys>, NY-ESO-TCRa<cys>og NY-ESO-TCRB<cys>og som henholdsvis er illustrert i figurene 22-24. Proteinet elueres som en enkelt stor topp som tilsvarer TCR-heterodimeren.

BlAcore-analyse av sTCR-binding til pMHC ble utført som beskrevet i eksempel 3. Figurene 30-32 viser BlAcore-analyse av den spesifikke bindingen av henholdsvis NY-ESO-TCRa<cys>Bcys, NY-ESO-TCRa<cys>og NY-ESO-TCRBcys til HLA-NYESO-kompleks.

TCRa<cys>Bcys hadde en Kd på 18,08 ± 2,075 uM, TCRa<cys>hadde en Kd på 19,24 ± 2,0luM og TCR6<cys>hadde en Kd på 22,5 ± 4,0692uM.

Eksempel 7 - Fremstilling av løselig AH- 1, 23- TCR inneholdende en ny interkjededisulfidbinding.

cDNA som koder for AH-1.23-TCR ble isolert fra T-celler levert av Hill Gaston (Medical School, Addenbrooke's Hospital, Cambridge) i overensstemmelse med kjent teknikk. cDNA som koder for NY-ESO-TCR ble fremstilt ved å behandle mRNAet med revers transkriptase.

For å kunne fremstille en løselig AH-1,23-TCR med en ny disulfidbinding inkorporert ble TCR-plasmider som inneholdt BamHI-restriksjonssetet på a-kjeden og Bglll-restriksjonssetet på B-kjeden benyttet som et skjellett som beskrevet i eksempel 4. De følgende primerne ble benyttet:

AH-l,23-TCR-a- og -B-kjedekonstruksjoner ble tilveiebrakt med PCR-kloning som følger. PCR-reaksjoner ble utført ved å benytte primerne vist ovenfor og templater inneholdende AH-l,23-TCR-kjedene. PCR-produktene ble restriksjonsfordøyde med de relevante restriksjonsenzymene og klonet inn i pGMT7 for å få ekspresjonsplasmider. Sekvensen til plasmidinnskuddene ble bekreftet med automatisert DNA-sekvensering. Figurene 33a og 33b viser henholdsvis DNA-sekvensen til de muterte a- og (J-kjedene til AH-1,23-TCR, og Figur 34a og 43b viser de resulterende aminosyresekvensene.

De respektive TCR-kjedene ble uttrykt, ko-refoldet og renset som beskrevet i Eksempel 5.

Figur 35 illustrerer elueringen av løselig disulfidbundet AH-l,23-TCR-protein fra en POROS-50HQ-anionbytterkolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede linjen. Figurene 36 og 37 viser henholdsvis resultatene av reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) og ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) geler av fraksjoner fra kolonnen som ble kjørt og som er illustrert i figur 35. Disse gelene indikerer klart tilstedeværelsen av en TCR-heterodimer som er interkjededisulfidbundet. Figur 38 viser elueringsprofilen fra en Superdex-75-HR-gelfiltreringskolonne av sammenslåtte fraksjoner fra anionbytterkolonnen som ble kjørt og som er illustrert i figur 35. Proteinet elueres som en enkelt stor topp som tilsvarer heterodimeren.

Eksempel 8 - Fremstilling av løselig A6- TCR som inneholder en ny interkjededisulfidbinding mellom alternative posisjoner i immunoglobulinregionen til det konstante domenet.

De følgende eksperimentene ble utført for å undersøke hvorvidt det var mulig å danne funksjonelle løselige TCRer som inneholdt en ny disulfidbinding i TCR-immunoglobulinregionen på en posisjon forskjellig fra mellom treonin 48 på ekson 1 i TRAC<*>01 og serin 57 på ekson 1 i både TRBC1<*>01 / TRBC2<*>01.

Til mutering av A6-TCR-a-kjeden ble de følgende primerne designet (nummeret i primernavnene refererer til posisjonen til aminosyreresidien som skal bli mutert i ekson 1 fra TRAC<*>01, muterte residier er vist med små bokstaver):

Til å mutere TCR-A6-iJ-kj eden ble de følgende primerne benyttet (nummeret i primernavnene refererer til posisjonen til aminosyreresidien som skal bli mutert i ekson 1 på TRBC2<*>01. Muterte residier er vist med små bokstaver):

PCR-mutagenese, amplifisering av a- og B-TCR-konstruksjoner, ligering og plasmidrensing ble utført som beskrevet i eksempel 1 ved å benytte den hensiktsmessige kombinasjonen av primerne ovenfor for å fremstille løselige TCRer med nye interkjededisulfidbindinger mellom de følgende aminosyreparene inkludert:

Figurene 39 til 58 viser DNA- og aminosyresekvensene til de muterte A6-TCR-kjedene som er amplifisert med primerne ovenfor. Kodonene som koder for de muterte cysteinene er uthevet.

De respektive TCR-kjedene ble uttrykt, ko-refoldet og renset som beskrevet i eksempel 5. Etter rensing på POROS-50HQ-anionbytterkolonne ble de resulterende proteinene kjørt på SDS-PAGE-geler for å kunne vurdere hvorvidt korrekte refoldede løselige TCRer hadde blitt dannet. Disse gelene ble også undersøkt for å bekrefte tilstedeværelse eller fravær av disulfidbundet protein med korrekt molekylvekt i det rensede materialet. Undersøkte TCRer som inneholdt de følgende nye interkjededisulfidbindingene misslyktes i å danne disulfidbundne proteiner med korrekt molekylvekt i dette bakterielle ekspresjonssystemet og de ble ikke undersøkt nærmere. Alternative prokaryote eller eukaryote ekspresjonssystemer er likevel tilgjengelige.

Figurene 59 til 64 illustrerer henholdsvis elueringen av løselig TCR inneholdende nye interkjededisulfidbindinger mellom de følgende residiene: Thr 48 - Ser 57, Thr 45 - Ser 77, Tyr 10 - Ser 17, Thr 45 - Asp 59, Met 52 - Gly 55 og Ser 15 - Glu 15 fra en POROS-200HQ-anionbytterkolonne ved å benytte en 0-500mM gradient med NaCl som indikert med den stiplede linjen. Figurene 65 til 70 viser henholdsvis resultatene fra reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) og ikke-reduserende SDS-PAGE (Coomassiefarget) geler av fraksjoner fra kolonnen som ble kjørt og som er illustrert i figurene 59 til 64. Disse gelene indikerer klart tilstedeværelsen av TCR-heterodimer som er interkjededisulfidbundet. Figurene 71 til 76 viser elueringsprofiler fra en Sephadex-200-HR-gelfiltrerings-kolonne av sammenslåtte fraksjoner fra anionbytterkolonnen som ble kjørt og som er illustrert i Figurene 59 til 64.

En BlAcore-analyse av bindingen av TCRene til pMHC ble utført som beskrevet i eksempel 3. Figurene 77 til 82 viser BIAcore-kurver som viser de rensede løselige TCRene sin evne til å binde HLA-A2-tax-pMHC-komplekser.

Thr 48 - Ser 57 hadde en Kd på 7,8uM, Thr 45 - Ser 77 hadde en Kd på 12,7uM, Tyr 10 - Ser 17 hadde en Kd på 34uM, Thr 45 - Asp 59 hadde en Kd på 14,9uM og Ser 15 - Glu 15 hadde en Kd på 6,3 uM. Met 52 - Gly 55 var i stand til å binde til sitt native "mål", HLA-A2-tax-komplekset, selv om det også binder på en liknende måte til et "irrelevant" mål, HLA-A2-NY-ESO-komplekset (se figur 81).

Eksempel 9 - Røntgenkrystallografi av den disulfidbundne NY- ESO- T- celle- reseptoren, spesifikk for NY- ESO- HLA- A2- komplekset.

NY-ESO-dsTCR ble klonet som beskrevet i eksempel 5 og uttrykt på følgende måte.

Ekspresjonsplasmidene inneholdende henholdsvis de muterte a- og B-kjedene ble transformert separat inn i £.co//-BL21-pLysS og enkeltstående ampicillinresistente kolonier ble dyrket ved 37 °C i TYP-medium (ampicillin lOOug/ml) til OD600nådde 0,7 før proteinuttrykking ble indusert med 0,5mM IPTG. Celler ble høstet 18 timer etter induksjon ved hjelp av sentrifugering i 30 minutter med 4000rpm i en Beckman-J-6B. Cellepelleter ble resuspendert i lyseringsbuffer som inneholdt lOmM Tris-HCl pH 8,1, lOmM MgCl2, 150mM NaCl, 2mM DTT, 10 % glyserol. For hver liter med bakteriekultur ble lOOul lysozym (20 mg/ml) og lOOul Dnase-I (20 ug/ml) tilsatt. Etter inkubering på is i 30 minutter ble den bakterielle suspensjonen sonikert med 1 minutts pulser i totalt 10 minutter ved å benytte en Milsonix-XL2020-sonikator med en standard 12mm i diameter probe. Inklusjonslegemepelleter ble gjenvunnet ved å sentrifugere i 30 minutter ved 13000rpm i en Beckman-J2-21 -sentrifuge (4 °C).Tre vaskinger i Triton-vaskebuffer (50mM Tris-HCl pH 8,1, 0,5 % Triton-X100, lOOmM NaCl, lOmM NaEDTA, 0,1 %

(w/v), 2mM DTT) ble deretter gjennomført for å fjerne cellerester og membrankomponenter. Hver gang ble inklusjonslegemepelleten homogenisert i Triton-vaskebuffer før pelleten ble gjenvunnet med sentrifugering i 15 minutter ved 13000rpm i en Beckman-J2-21. Detergent og salt ble deretter fjernet med en tilsvarende vasking i resuspensjonsbuffer (50mM Tris-HCl pH 8,1, lOOmM NaCl, lOmM NaEDTA, 0,1 % (w/v) NaAzid, 2mM DTT). Til slutt ble inklusjonslegemene løseliggjort i 6M guanidinbuffer (6M guanidinhydroklorid, 50mM Tris pH 8,1, lOOmM NaCl, 10mM EDTA, lOmM DTT), fordelt i like deler med 120mg i hver og frosset ned til -70 °C. Inklusjonslegemer ble kvantitert ved å løseliggjøre dem i 6M guanidin-HCl og måle med en Bradford-fargestoffbindende analyse (PerBio).

Omtrent 60mg (d.v.s. 2,4umol) frosset løseliggjort alfakjede ble blandet med 30mg (d.v.s. l,2umol) frosset løseliggjort betakjede. TCR-blandingen ble fortynnet til et sluttvolum på 18ml med 6M guanidinbuffer og varmet opp til 37 °C i 30 minutter for å sikre fullstendig kjededenaturering. Guanidinløsningen inneholdende fullstendig reduserte og denaturerte TCR-kjeder ble så blandet i 1 liter med kald refoldingsbuffer (lOOmM Tris pH 8,1,400mM L-arginin-HCl, 2mM EDTA, 6,6mM 2-mekaptoetylamin, 3,7mM cystamin, 5M urea) under omrøring. Løsningen ble hensatt i 5 timer i kjølerommet (5 °C ± 3 °C) for å la refolding skje. Refoldingsløsningen ble deretter dialysert mot 12 liter med vann i 18-20 timer etterfulgt av 12 liter med lOmM Tris pH 8,1 i 18-20 timer (5 °C ± 3 °C). Spectrapor-l-dialysemembran (Spectrum Laboratories produktnummer 132670) som har en molekylvektsbegrensning på 6-8000 kDa ble benyttet i denne dialyseprosessen. Det dialyserte proteinet ble filtrert gjennom filtre med porestørrelse på 0,45 um (Schleicher og Schuell, Referansenummer 10 404012) tilpasset til en Nalgene-filtreringsenhet.

Refoldet NY-ESO-TCR ble separert fra degraderingsprodukter og urenheter ved å sette refoldingsløsningen på en POROS-50HQ-anionbytterkolonne (Applied Biosystems) ved å benytte en ÅKTA-renser (Amersham Biotech). En POROS-50HQ-kolonne ble forhåndsbalansert med 10 kolonnevolumer med buffer-A (lOmM Tris pH 8,1) før protein ble satt på. Det bundne proteinet ble eluert med en gradient på 0-500mM NaCl over 7 kolonnevolumer. Toppfraksjoner (lml) ble analysert på denaturerende SDS-PAGE ved å benytte en ikke-reduserende prøvebuffer. Toppfraksjoner inneholdende det heterodimere alfa-beta-komplekset ble ytterligere renset ved å benytte en Superdex-75HR-gelfiltreringskolonne som var balansert med 25mM MES pH 6,5. Fraksjonene fra proteintoppen som eluerte ved en relativ molekylvekt på omtrent 50 kDa ble slått sammen, konsentrert til 42mg/ml i Ultrafree-concentrators (Milipore. delnummer UFV2BGC40) og lagret ved -80 °C.

Krystallisering av NY-ESO-TCR ble utført med hengende-dråpe teknikk ved 18 °C ved å benytte lul proteinløsning (8,4mg/ml) i 5mM MES pH 6,5 blandet med et ekvivalent volum med krystalliseringsbuffer. Krystaller ble dannet ved flere ulike betingelser når Crystal-Screen-buffere (Hampton Research) ble benyttet. Enkeltstående kubiske krystaller (< lOOum) ble dyrket frem i 30 % PEG 4000, 0,1M Na-Citrat pH 5,6, 0,2M ammoniumacetatbuffer og benyttet til strukturbestemmelse.

Krystaller av NY-ESO-TCR ble hurtigfrosset og testet for diffraksjon i røntgenstrålen fra en Daresbury-synchrotron. Krystallene diffrakterte til 0,25nm (2,5Å) oppløsning. Ett datasett ble samlet inn og prosessert for å gi et 98,6 % komplett sett med amplituder som var fornuftig til omtrent 0,27nm (2,7Å), men brukbart opp til 0,25nm (2,5Å). Den forenende R-faktoren, d.v.s. overensstemmelsen mellom mange målinger av krystallografiske ekvivalente refleksjoner, var 10,8 % for alle dataene. Dette er marginalt i det høyeste løsningsskallet. Romgruppen var P2i, med celledimensjoner a=4,25nm (42,5Å), b=5,95nm (59,5Å), c=8,17nm (81,7Å), B=91,5°. Celledimensjonene og symmetrien betydde at det var to kopier i cellen. Den asymmetriske enheten, au eller det minste volumet som det er nødvendig å undersøke, har bare ett molekyl, og det andre molekylet i cellen blir dannet med 2rsymmetrioperasjonen. Posisjoneringen av molekylet i au er tilfeldig i Y-retningen. Så lenge det er i korrekt posisjon i x-z-planet kan det bli oversatt når det er ønskelig i y-retningen. Dette er referert til som fri parameter i denne "polare" romgruppen.

PDB-databasen gir bare ett treff som inneholder en A/B-heterodimer TCR, 1BD2. Dette treffet har også koordinatene til det HLA-beslektede peptidet i kompleks med TCRen. TCR-kjede-B var den samme i NY-ESO men kjede-A hadde små forskjeller i C-domenet og signifikante forskjeller i N-domenet. Ved å benytte lBD2-A/B-modellen til molekylær erstatning ga MR en gal løsning, som illustrert med omfattende overlapp med symmetriekvivalente molekyler. Ved å benytte B-kjeden alene ble en bedre løsning oppnådd som ikke hadde signifikante konflikter med naboer. Korrelasjonskoeffisienten var 49 %, den krystallografiske R-faktoren 50 % og den nærmeste tilnærmingen var 0,49nm (49Å). Rotasjons- og translasjonsoperasjonen som var nødvendig for å transformere kjede-B-modellen til MR-ekvivalenten ble foretatt på kjede-A. Den hybride MR-løsningen som dermed ble generert passet godt i cellen med minimale konflikter.

Elektrontetthetskart stemte generelt overens med modellen og tillot dennes tilpasning for å passe sekvensen til NY-ESO-TCRen. Men, utgangsmodellen hadde mange hull, spesielt manglende sidekjeder, som er karakteristisk for dårlig ordnede deler av modellen. Mange av hårnålsløkkene mellom kjeder hadde svært lav tetthet og var vanskelige å modellere. Den krystallografiske R-faktoren til modellen er 30 %. R-faktoren er et mellomværende, d.v.s. den er forskjellen mellom de kalkulerte og observerte amplitudene.

Som figur 83a og 83b viser så passer ikke den innskutte sekvensen fra 1BD2 noe særlig med tettheten. Forandring av modellen med Cys i posisjon 164 i kjede-A og 174 i kjede-B etterfulgt av ytterligere forbedring viste klart at denne sekvensfastsettelsen er mye bedre tilpasset til tettheten. Men, forskjellene når det gjelder størrelse på sidekjeden er minimale, så det var lite forstyrrelse i modellen. Elektrontettheten i den regionen er lite forandret.

Det viktigste aspektet ved dette arbeidet er at den nye TCRen er svært lik i struktur med den publiserte modellen (1BD2). Sammenligningen kan inkludere hele TCRen, de konstante domenene eller den lille delen nær mutasjonspunktet.

r.m.s.-avviksverdiene er ført opp i tabellen nedenfor. Sammenligningen av strukturer er vist i figur 84.

Det korte strekket refererer til enkeltkjeden fra kjede-A (Al57 til A169) og enkeltkjeden fra kjede-B (Bl70 til Bl83) som nå er bundet sammen av disulfidbroen. Avvikene ble kun beregnet for hovedatomene i kjeden.

Disse resultatene viser at introduksjonen av disulfidbindingen har minimal effekt på den lokale strukturen av TCRen rundt bindingen. Noen større effekter blir observert når TCRen blir sammenlignet med den publiserte strukturen (1BD2) til A6-TCR men økningen i RMS-fortrengning skyldes i hovedsak forskjeller i løkkekonformasjoner (se figur 84). Disse løkkene utgjør ikke en del av kjernestrukturen til TCRen, som er dannet av en serie fi-flater som danner en karakteristisk Ig-folding. RMS-avviket for hele a-kjeden er spesielt stort på grunn av forskjellen i sekvensen til variable domener mellom A6 (1BD2) og NY-ESO-TCRer. A6 og NY-ESO-TCRene har likevel det samme variable fi-domenet og RMS-avvikene hele B-kjeden viser at strukturen til dette variable domenet også er opprettholdt i TCRen med den nye disulfidbindingen. Disse dataene indikerer derfor at kjernestrukturen til TCRen blir opprettholdt i kry stal lstrukturen til TCRen med den nye disulfidbindingen.

Eksempel 10- Fremstilling av løselige NY- ESO- TCRer som inneholder en ny interkjededisulfidbinding og C- terminale fi- kjede- merkingsseter.

For å kunne fremstille en løselig NY-ESO-TCR med en ny disulfidbinding inkorporert ble A6-TCR-plasmider inneholdende restriksjonssetene BamHI fra a-kjeden og Bglll fra B-kjeden benyttet som skjelletter som beskrevet i eksempel 4.

NY-ESO-TCR-B-kjede konstruksjoner ble fremskaffet med PCR-kloning på følgende måte. PCR-reaksjoner ble utført ved å benytte primerne som er vist nedenfor og templater som inneholdt NY-ESO-TCR-kjedene.

PCR-produktene ble restriksjonsfordøyde med de relevante restriksjonsenzymene og klonet inn i pGMT7 inneholdende biotingjenkjenningssekvensen for å tilveiebringe ekspresjonsplasmider. Sekvensen til plasmidinnskuddene ble bekreftet med automatisert DNA-sekvensering. Figur 85a viser DNA-sekvensen til B-kjeden fra NY-ESO-TCRen med biotingjenkjenningssetet inkorporert, og figur 85b viser den resulterende aminosyresekvensen.

A-kjedekonstruksjonen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 5. De respektive TCR-kjedene ble uttrykt, ko-refoldet og renset som beskrevet i eksempel 5.

For å kunne fremstille løselig NY-ESO-TCR inneholdende en ikke-nativ interkjededisulfidbinding og et heksa-histidinmerke på C-terminalen til B-kjeden ble de samme primerne og NY-ESO-templatet som ovenfor benyttet. PCR-produktene ble restriksjonsfordøyde med de relevante restriksjonsenzymene og klonet inn i pGMT7 inneholdende heksa-histidinsekvensen for å tilveiebringe ekspresjonsplasmider. Figur 86a viser DNA-sekvensen til B-kjeden på NY-ESO-TCR med heksa-histidinmerket inkorporert, og figur 86b viser den resulterende aminosyresekvensen. Figur 87 illustrerer elueringen av løselig NY-ESO-TCR inneholdende en ny disulfidbinding og biotingjenkjenningssekvensen fra en POROS-50HQ-anionbytterkolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede linjen. Figur 88 illustrerer elueringen av løselig NY-ESO-TCR inneholdende en ny disulfidbinding og heksa-histidinmerket fra en POROS-50HQ-anionbytterkolonne ved å benytte en 0-500mM gradient av NaCl som indikert med den stiplede linjen. Figur 89 og 90 viser proteinelueringsprofiler fra gelfiltreringskromatografi av sammenslåtte fraksjoner fra NY-ESO-biotin-merket og NY-ESO-heksa-histidinmerket anionbytterkolonnekjøringer illustrert av henholdsvis figur 87 og 88. Proteinet elueres som en enkelt stor topp tilsvarende til TCR-heterodimeren.

En BlAcore-analyse av sTCR binding til pMHC ble utført som beskrevet i Eksempel 3. MY-ESO-biotin-TCRen hadde en Kd på7,5uM og NY-ESO-heksa-histidinmerket-TCRen hadde en Kd på 9,6 uM.

Eksempel 11 - Cellefarging ved å benytte fluorescensmerkede tetramerer av løselig NY-ESO-TCR inneholdende en ny interkjededisulfidbinding.

Fremstilling av TCR- tetramer:

De løselige NY-ESO-TCRene, inneholdende en ny disulfidbinding og en biotingjenkjenningssekvens fremstilt som i eksempel 10, ble benyttet for å danne de løselige TCR-tetramerene som er nødvendige for cellefarging. 2,5ml renset løselig TCR løsning (~0,2mg/ml) ble byttet buffer på til biotinyleringsreaksjonsbuffer (50mM Tris pH 8,0, lOmM MgCl2) ved å benytte en PD-10-kolonne (Pharmacia). Eluatet (3,5ml) ble konsentrert til 1 ml ved å benytte en centricon-konsentrator (Amicon) med en ekskludering av molekylvekt på 10 kDa. Dette ble gjort om til lOmM med ATP tilsatt fra stokkløsning (0,1 g/ml justert til pH 7,0). Et volum av en blanding av proteasehemmere ble deretter tilsatt (protease inhibitor cocktail Set 1, Calbiochem Biochemicals), tilstrekkelig til å gi en sluttkonsentrasjon av proteaseblanding på 1/100 av stokkløsningen slik den blir levert, etterfulgt av ImM biotin (tilsatt fra 0,2M stokkløsning) og 20ug/ml enzym (fra 0,5mg/ml stokkløsning). Blandingen ble deretter inkubert over natt ved romtemperatur. Overskudd av biotin ble fjernet fra løsningen med størrelseseksklusjonskromatografi på en S75-HR-kolonne. Nivået av biotinylering på NY-ESO-TCRen ble bestemt med en størrelses-eksklusjon-HPLC-basert fremgangsmåte som følger. 50ul av den biotinylerte NY-ESO-TCRen (2mg/ml) ble inkubert med 50ul streptavidinbelagte agarosekuler (Sigma) i 1 time. Kulene ble deretter spunnet ned og 50ul av den ubundne prøven ble kjørt på en TSK-2000-SW-kolonne (Tosoohaas) ved å benytte en strømningshastiget på 0,5ml/min (200mM fosfatbuffer pH 7,0) over 30 minutter. Tilstedeværelsen av biotinylert NY-ESO-TCR ble påvist med et UV-spektrometer ved både 214nm og ved 280nm. Den biotinylerte NY-ESO ble kjørt mot en ikke-biotinylert NY-ESO-TCR-kontroll. Prosentandelen av biotinylering ble beregnet ved å subtrahere topparealet til det biotinylerte proteinet fra det fra det ikke-biotinylerte proteinet.

Tetramerisering av den biotinylerte løselige TCRen ble oppnådd ved å benytte neutravidin-phycoerythrinkonjugat (Cambridge Biosciences, UK). Konsentrasjonen av biotinylert løselig TCR ble målt ved å benytte en Coomassie-proteinanalyse (Pierce) og et forhold mellom løselig TCR 0,8mg/ml neutravidin-phycoerythrinkonjugat ble beregnet for å oppnå metting av neutravidin-PE med biotinylert TCR ved et forhold på 1:4. 19,5ul av en 6,15mg/ml-løsning av biotinylert NY-ESO-løselig-TCR i fosfatbufret saltvann (PBS) ble tilsatt sakte til 150ul av en lmg/ml neutravidin-PE løselig over is med forsiktig risting. 100,51x1 PBS ble deretter tilsatt til denne løsningen for å tilveiebringe en sluttkonsentrasjon av N Y-ESO-TCR-tetramer på 1 mg/ml.

Fargingsprotokoll:

Fire like volumer med 0,3x10<6>HLA-A2-positive EBV-transformert B-cellelinje (PP LCL) i 0,5ml PBS ble inkubert med varierende konsentrasjoner (0, IO"<4>, 10"5 og 10"<6>M) av HLA-A2-NYESO-peptid (SLLMWITQC) i 2 timer ved 37 °C. Disse PP-LCL-cellene ble deretter vasket to ganger i Hanks-bufret-saltvannsløsning (HBSS) (Gibco,

UK).

Hver av de fire like volumene ble fordelt likt og farget med biotinylert NY-ESO-disulfidbundet-TCR som var nylig tetramerisert med neutravidin-phycoerythrin. Celler

ble inkubert med enten 5 eller 10ug phycoerythrinmerket, tetramere dsTCR-komplekser på is i 30 minutter og vasket med HBSS. Celler ble vasket igjen, resuspendert i HBSS og analysert med FACSVantage. 25 000 hendelser ble innsamlet og data ble analysert ved å benytte WinMIDI-programvare.

Resultater:

Figurene 91 a-h illustrerer som histogrammer FACSVantage-dataene generert for hver av prøvene som ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Den følgende tabellen viser prosentandelen av positivt fargede celler som ble observert for hver av prøvene:

Disse dataene indikerer klart at andelen av celler merket med NY-ESO-TCR-tetramerene øker på en måte som er korrelert til konsentrasjonen av peptidet (SLLMWITQC) i hvilken de hadde blitt inkubert. Disse NY-ESO-TCR-tetramerene er derfor enheter som er hensiktsmessige til spesifikk cellemerking basert på uttrykkingen av HLA-A2-NY-ESO-komplekset.

I foreliggende eksempel har en fluorescerende konjugert NY-ESO-TCR-tetramer blitt benyttet. Tilsvarende nivåer av cellebinding vil likevel være forventet dersom dette merket ble byttet ut med en passende terapeutisk enhet.

Eksempel 12 - Fremstilling av løselig A6- TCR med en ny disulfidbinding med den konstante Cfil- regionen inkorporert.

Alle de forutgående eksemplene beskriver fremstillingen av løselige TCRer med en ny disulfidbinding og med konstante CB2-regionen inkorporert. Foreliggende eksempel viser at løselige TCRer som har den konstante Cfil-regionen inkorporert kan bli fremstilt med hell.

Design av primere til PCR- sammenføyning av A6- TCR- fi- kjede- V- domene med Cfil:

Til PCR-konstruksjon av A6-TCR-B-kjede-V-domene ble de følgende primerne designet:

Beta-VTCR-konstruksjon og Cfil-konstruksjon ble amplifisert separat ved å benytte standard PCR-teknologi. De ble forbundet med hverandre ved å benytte sammcnføyendc-PCR. Plasmid-DNA ble renset på en Qiagen-mini-prep-kolonne i overensstemmelse med forhandlers instruksjoner og sekvensen ble bekreftet med automatisert sekvensering ved sekvenseringsenheten til Department of Biochemistry, Oxford University. Sekvensen til A6+CB1 er vist i figur 92.

Dermed ble A6+CB1 koplet til A6-alfa-TCR med interkjededisulfidbinding etter at cysteiner ble introdusert i C-domenet til begge kjeder.

Den løselige TCRen ble uttrykt og refoldet som beskrevet i eksempel 2.

Rensing av refoldet løselig TCR:

sTCR ble separert fra degraderingsprodukter og urenheter ved å sette den dialyserte refoldingsløsningen på en POROS-50HQ-anionbytterkolonne og eluere bundet protein med en 0-500mM gradient av NaCl over 50 kolonnevolumer ved å benytte en Akta-renser (Pharmacia) som i figur 93. Toppfraksjoner ble lagret ved 4 °C og analysert med Coomassiefarget SDS-PAGE (figur 94) før de ble slått sammen og konsentrert. Til slutt ble sTCRene renset ogkarakterisert vedå benytte en Superdex-200HR- gelfiltreringskolonne (figur 95) som var balansert med HBS-EP-buffer (lOmM HEPES pH 7,4, 150mM NaCl, 3,5mM EDTA, 0,05 % nonidet p40). Fraksjoner fra toppen som eluerte ved en relativ molekylvekt på omtrent 50 kDa ble slått sammen og konsentrert før karakterisering med BIAcore-overflate-plasmon-resonansanalyse.

En BlAcore-analyse av bindingen av den disulfidbundne A6-TCRen til pMHC ble utført som beskrevet i eksempel 3. Figur 96 viser BlAcore-analyse av den spesifikke bindingen av disulfidbundet A6-løselig-TCR til sin tilhørende pMHC.

Den løselige A6-TCR med en ny disulfidbinding og med den konstante CC1-regionen inkorporert hadde en Kd på 2,42 ± 0,55uM for sin tilhørende pMHC. Denne verdien er svært lik Kd-verdien på 1,8uM som er bestemt for den løselige A6-TCRen med en ny disulfidbinding og som har den konstante CB2-regionen inkorporert slik som det ble bestemt i eksempel 3.

Eksempel 13 — Fremstilling av løselig A6- TCR med en ny disulfidbinding og som har det " frie " cysteinet ifi- kjeden inkorporert.

De konstante B-kjederegionene til TCRer inkluderer en cysteinresidie (residie 75 i ekson 1 på TRBC1<*>01 og TRBC2<*>01) som ikke er involvert i verken interkjede- eller intrakjededisulfidbindingsdannelse. Alle de forutgående eksemplene beskriver fremstillingen av løselige TCRer med en ny disulfidbinding der dette "frie" cysteinet har blitt mutert til alanin for å unngå mulig dannelse av "upassende" disulfidbindinger som kan føre til redusert utbytte av funksjonell TCR. Foreliggende eksempel viser at løselige TCRer med dette "frie" cysteinet inkorporert kan bli fremstilt.

Design av primere og mutagenese av TCR- fi- kjede:

For å kunne mutere alaninet i TCR-B-kjeden (residie 75 i ekson 1 på TRBC1<*>01 og TRBC2<*>01) til cystein ble de følgende primerne designet (mutasjon er vist med små bokstaver):

PCR-mutagenese, uttrykking og refolding av den løselige TCRen ble foretatt som beskrevet i eksempel 2.

Rensing av refoldet løselig TCR:

sTCR ble separert fra degraderingsprodukter og urenheter ved å sette den dialyserte refoldingsløsningen på en POROS-50HQ-anionbytterkolonne og eluere bundet protein med en 0-500mM gradient av NaCl over 50 kolonnevolumer ved å benytte en

Akta-renser (Pharmacia) som i figur 98. Toppfraksjoner ble lagret ved 4 °C og analysert med Coomassiefarget SDS-PAGE (figur 99) før de ble slått sammen og konsentrert. Til slutt ble sTCRen renset ogkarakterisert vedå benytte en Superdex-200HR-gelfiltrerings-kolonne (figur 100) som var balansert med HBS-EP-buffer (lOmM HEPES pH 7,4, 150mM NaCl, 3,5mM EDTA, 0,05 % nonidet p40). Toppen som eluerte ved en relativ molekylvekt på omtrent 50 kDa ble slått sammen og konsentrert før karakterisering med BlAcore-overflate-plasmon-resonansanalyse.

En BlAcore-analyse av bindingen av disulfidbundet A6-TCR til pMHC ble utført som beskrevet i eksempel 3. Figur 101 viser BlAcore-analyse av den spesifikke bindingen av disulfidbundet A6-løselig-TCR til sin tilhørende pMHC.

Den løselige A6-TCRen med en ny disulfidbinding og med det "frie" cysteinet i B-kjeden inkorporert hadde en Kd på 21,39 ± 3,55uM for sin tilhørende pMHC.

Eksempel 14 - Fremstilling av løselig A6- TCR med en ny disulfidbinding der " fritt" cystein ifi- kjeden er mutert til serin.

Foreliggende eksempel viser at løselige TCRer med en ny disulfidbinding der det "frie" cysteinet i B-kjeden (residie 75 i ekson 1 på TRBC1<*>01 og TRBC2<*>01) er mutert til serin kan bli fremstilt med hell.

Design av primere og mutagenese av TCR- fi- kjede:

For å kunne mutere alaninet i TCR-fi-kjeden som tidligere hadde blitt substituert for det native cysteinet (residie 75 i ekson 1 fra TRBC1<*>01 og TRBC2<*>01) til serin ble de følgende primerne designet (mutasjon er vist med små bokstaver):

PCR-mutagenese (som resulterer i en mutert beta-kjede som vist i figur 102), uttrykking og refolding av løselig TCR ble utført som beskrevet i eksempel 2.

Rensing av refoldet løselig TCR:

sTCR ble separert fra degraderingsprodukter og urenheter ved å sette den dialyserte refoldingsløsningen på en POROS-50HQ-anionbytterkolonne og eluere bundet protein med en 0-500mM gradient av NaCl over 50 kolonnevolumer ved å benytte en Akta-renser (Pharmacia) som vist i figur 103. Toppfraksjoner ble lagret ved 4 °C og analysert med Coomassiefarget SDS-PAGE (figur 104) før de ble slått sammen og konsentrert. Til slutt ble sTCRene renset ogkarakterisert vedå benytte en Superdex-200HR-gelfiltreringskolonne (figur 105) som var balansert med HBS-EP-buffer (lOmM

HEPES pH 7,4, 150mMNaCl, 3,5mM EDTA, 0,05 % nonidet p40). Toppen som eluerte ved en relativ molekylvekt på omtrent 50 kDa ble slått sammen og konsentrert før karakterisering med BIAcore-overflate-plasmon-resonansanalyse.

En BlAcore-analyse av bindingen av den disulfidbundne A6-TCRen til pMHC ble utført som beskrevet i eksempel 3. Figur 106 viser BlAcore-analyse av den spesifikke bindingen av disulfidbundet A6-løselig-TCR til sin tilhørende pMHC.

Den løselige A6-TCRen med en ny disulfidbinding der det "frie" cysteinet i 15-kjeden var mutert til serin hadde en Kd på 2,98 ± 0,27uM for sin tilhørende pMHC. Denne verdien er svært lik Kd-verdien på l,8uM som ble bestemt for den løselige A6-TCRen med en ny disulfidbinding der det "frie" cysteinet i fi-kjeden var mutert til alanin slik det ble bestemt i eksempel 3.

Eksempel 15 — Kloning av NY- ESO- TCR- a- ogfi- kjeder som inneholder en ny disulfidbinding inn i gjær ekspresjonsvektorer.

NY-ESO-TCR-a og -B-kjeder ble fusjonert med C-terminalen på pre-pro-paringsfaktor-alfa-sekvensen fra Saccharomyces cerevisiae og henholdsvis klonet inn i gjærekspresjonsvektorene pYX122 og pYXl 12 (se figur 107 og 108).

De følgende primerne ble designet for å PCR-amplifisere pre-pro-paringsfaktor-alfa-sekvensen fra S.cerevisiae-SEY6210 (Robinson et al., (1991), Mol. Cell Biol. ll(12):5813-24) for fusjonering med TCR-a-kjeden.

De følgende primerne ble designet for å PCR-amplifisere pre-pro-paringsfaktor-alfa-sekvensen fra S.cerevisiae-SEY6210 for fusjonering med TCR-B-kjeden.

Gjær-DNA ble tilveiebrakt ved å resuspendere en koloni av S. cerevisiae-SEY6210 i 30ul med 0,25 % SDS i vann og varme opp til 90 °C i 3 minutter. Pre-pro-paringsfaktor-alfa-sekvensene til fusjonering med TCR-a- og TCR-6-kjedene ble tilveiebrakt ved å PCR-amplifisere 0,25ul gjær-DNA med de respektive primerparene som er beskrevet ovenfor og ved å benytte følgende PCR-betingelser. 12,5pmol av hver primer ble blandet med 200uM dNTP, 5ull0x Pfu-buffer og 1,25 enheter med Pfu-polymerase (Stratagene) i et sluttvolum på 50ul. Etter et første denatureringstrinn på 30 sekunder ved 92 °C ble reaksjonsblandingen utsatt for 30 runder med denaturering (92 °C, 30 sek.), sammensmelting (46,9 °C, 60 sek.) og elongering (72 °C, 2 min.) i en Hybaid-PCR-express-PCR-maskin.

De følgende primerne ble designet for å PCR-amplifisere TCR-a-kjeden som skulle bli fusjonert med pre-pro-paringsfaktor-alfa-sekvensen nevnt ovenfor.

De følgende primerne ble designet for å PCR-amplifisere TCR-B-kjeden som skulle bli fusjonert med pre-pro-paringsfaktor-alfa-sekvensen nevnt ovenfor.

PCR-betingelsene for amplifisering av TCR-a- og TCR-B-kjedene var de samme som nevnt ovenfor med unntak av følgende forandringer: DNA-templatet som ble benyttet for å amplifisere TCR-a- og TCR-B-kjedene var henholdsvis NY-ESO-TCR-a-og -B-kjedene (som fremstilt i eksempel 5), og sammensmeltingstemperaturen som ble benyttet var 60,1 °C.

PCR-produktene ble deretter benyttet i en PCR-sammenføyningsreaksjon ved å utnytte de komplementære overlappende sekvensene som var blitt introdusert i de første PCR-produktene for å danne full-lengde kimert gen. De resulterende PCR-produktene ble fordøyd med restriksjonsenzymene EcoRI og Xhol og klonet inn i enten pYX122 eller pYXl 12 som var fordøyd med de samme enzymene. De resulterende plasmidene ble renset på en Qiagen-mini-prep-kolonne i henhold til forhandlerens instruksjoner og sekvensene ble bekreftet med automatisert sekvensering ved sekvenseringsenheten til Genetics Ltd, Queensway, New Milton, Hampshire, UK. Figur 109 og 110 viser DNA- og proteinsekvensene til de klonede kimere produktene.

Eksempel 16- Uttrykking av løselig NY- ESO- TCR, som inneholder en ny disulfidbinding, i gjær.

Gjærekspresjonsplasmidene, henholdsvis inneholdende TCR-a- og TCR-B-kjedene, fremstilt som beskrevet i eksempel 15 ble ko-transformert inn i S. cerevisiae-SEY6210 ved å benytte protokollen beskrevet av Agatep et al., (1998) (Tekniske tips på internett (http://tto.trends.com) 1:51 :P01525). En enkelt koloni som vokste på syntetisk-dropout (SD) agar inneholdende histidin og uracil (Qbiogene, Illkirch, Frankrike) ble dyrket over natt ved 30 °C i lOml SD-medium inneholdende histidin og uracil. Over-natt-kulturen ble sub-dyrket 1:10 i lOml friskt SD-medium inneholdende histidin og uracil og dyrket i 4 timer ved 30 °C. Kulturen ble sentrifugert i 5 minutter ved 3800rpm i en Heraeus-Megafuge-2.0R (Kendro Laboratory Products Ltd., Bishop's Stortford, Hertfordshire, UK) og supernatanten ble høstet. 5 ul StratClean-Resin (Stratagene) ble blandet med supernatanten og holdt roterende i et blodhjul ved 4 °C over natt. StrataClean-resinet ble spunnet ned ved 3800rpm i en Heraeus-Megafuge-2.0R og mediumet ble fjernet. 25ul reduserende prøvebuffer (950ul Laemmli-prøvebuffer (Biorad) inneholdende 50ul 2M DTT) ble tilsatt til resinet og prøvene ble varmet opp til 95 °C i 5 minutter og deretter avkjølt på is før 20ul av blandingen ble satt på en SDS-PAGE-gel ved 0,8mA konstant/cm av geloverflate i 1 time. Proteinene i gelen ble overført til Immuno-Blot-PVDF-membraner (Bio-Rad) og probet med TCR-anti-a-kjede-antistoff som beskrevet i Eksempel 17 nedenfor med unntak av følgende forandringer. Det primære antistoffet (TCR-anti-a-kjede) og de sekundære antistoffene ble henholdsvis benyttet i 1/200 og 1/1000 fortynninger. Figur 111 viser et bilde av den utviklede membranen. Resultatene viser at det er et lavt nivå av TCR-utskilling fra gjær og ut i mediumet.

Eksempel 17- Disulfid- A6- Tax- TCR- a- og - fi- kjedeuttrykking i Baculovirus.

Kloningsstrategi:

A- og B-kjedene til disulfid-A6-Tax-TCR ble klonet fra pGMT7 inn i en pBlueScript-KS2-basert vektor kalt pEX172. Denne vektoren ble designet for å klone ulike MHC-klasse-II-B-kjeder, til insektcelleuttrykking, ved å benytte ledersekvensen fra DRB1<*>0101, et Agel-sete for innsetting av ulike peptidkodende sekvenser, en linker-region og Mlul- og Sall-seter for å kunne klone DRB-kjedene inn foran Jun-Leucinzipper-sekvensen. Sekvensen der pEX172 er forskjellig fra pBlueScript-II-KS, lokalisert mellom Kpnl- og EcoRI-setene i BlueScript-II-KS, er vist i figur 112. For å kunne klone TCR-kjeder i insektceller ble denne pEX172 kuttet med Agel og Sali for å fjerne linker-regionen og Mlul-setet, og TCR-kjedene kan bli satt inn der peptidsekvensen ville startet. TCR-sekvensene ble klonet fra pGMT7 med et BspEI-sete på den 5'-enden (dette medfører Agel-kompatible overheng) og et Sall-sete på den 3'-enden. For å kunne tilveiebringe kløyvingssetet for fjerningen av DRB-ledersekvensen ble de første tre residiene på DRB-kjeden (GDT) beholdt. For å unngå at Jun-Leucinzipper-sekvensen blir transkribert var det nødvendig å sette inn et stoppkodon foran Sall-setet. En skjematisk oversikt over dette er vist i figur 113. Når TCR-kjedene kom på plass i dette plasmidet ble BamHI-fragmentet kuttet ut og subklonet inn i pAcAB3-vektoren som har homologire-kombinasjonsseter for Baculovirus. pAcAB3-vektoren har to divergente promotorer, én med et BamHI-scte og én med et Bglll-kloningssete. Det foreligger et Bglll-sete i A6-TCR-B-kjeden slik at A6-TCR-a-kjeden ble satt inn i Bglll-setet, og B-kjeden ble deretter subklonet inn i BamHI-setet.

I overensstemmelse med kloningsstrategien ovenfor ble de følgende primerne designet (homologi med vektorene er vist med store bokstaver):

PCR, kloning og subkloning:

Ekspresjonsplasmider inneholdende genene for A6-Tax-TCR-a- eller -B-kjeden ble benyttet som templater i de følgende PCR-reaksjonene. lOOng a-plasmid ble blandet med lul lOmMdNTP, 5 ul 10x Pfu-buffer (Stratagene), 1,25 enheter Pfu-polymerase (Stratagene), 50pmol av A6a-primerne ovenfor og sluttvolumet ble justert til 50ul med H20. En liknende reaksjonsblanding ble laget for B-kjeden der B-plasmidet og paret med B-primere ble benyttet. Reaksjonsblandingen ble utsatt for 35 runder med denaturering (95 °C, 60 sek.), sammensmelting (50 °C, 60 sek.) og elongering (72 °C, 8 min.) i en Hybaid-PCR-express-PCR-maskin. Produktet ble deretter fordøyd i 2 timer ved 37 °C med 10 enheter BspEI-restriksjonsenzym og deretter for ytterligere 2 timer med 10 enheter Sali (New England Biolabs). De fordøyde reaksjonene ble ligert inn i pEX172 som hadde blitt fordøyd med Agel og Sali, og disse ble transformert inn i kompetente XLl-Blue-bakterier og dyrket i 18 timer ved 37 °C. En enkelt koloni ble plukket fra hver av a- og B- og dyrket over natt i 5ml TYP+ampicillin (16g/l Bacto-Tryptone, 16g/l Gjærekstrakt, 5g/l NaCl, 2,5g/l K2HP04, lOOmg/1 Ampicillin). Plasmid-DNA ble renset på en QlAgen-mini-prep-kolonne i henhold til forhandlers instruksjoner og sekvensen ble bekreftet med automatisert sekvensering på sekvensenheten til Genetix. Aminosyresekvensene til BamHI-innskuddene er vist i figur 114 og 115 for henholdsvis a-kjeden og B-kjeden.

Disse a- og B-kjede-disulfid-A6-Tax-TCR-kjede-konstruksjonene i pEX172 ble fordøyd ut i 2 timer ved 37 °C med BamHI-restriksjonsenzym (New England Biolabs). A-kjede-BamHI-innskuddet ble ligert inn i pAcAB3-vektor (Pharmingen-BD Biosciences: 21216P) som hadde blitt fordøyd med Bglll-enzym. Dette ble transformert inn i kompetente XLl-Blue-bakterier og dyrket i 18 timer ved 37 °C. En enkelt koloni ble plukket fra denne platen og dyrket over natt i 5ml TYP+ampicillin og plasmid-DNA ble renset som tidligere. Dette plasmidet ble deretter fordøyd med BamHI og B-kjede-BamHl-innskuddet ble ligert inn, transformert inn i kompetente XLl-Blue-bakterier, dyrket over natt, plukket til TYP-ampicillin og dyrket før det ble minipreppet som tidligere ved å benytte en QIAgen-mini-prep-kolonne. Den korrekte orienteringen av både a- og B-kjedene ble bekreftet med sekvensering der følgende primere ble benyttet:

Transfeksjon, infeksjon, uttrykking og analyse av A6- TCR i insektceller: Ekspresjonsplasmidet inneholdende a- og B-kjeden ble transfektert inn i sf9-celler (Pharmingen-BD Biosciences: 21300C), dyrket i serumfritt medium (Pharmingen-BD Biosciences: 551411), ved å benytte Baculogold-transfeksjonssettet (Pharmingen-BD Biosciences: 21100K) etter forhandlerens instruksjoner. Etter 5 dager ved 27 °C ble 200ul av mediumet disse transfekterte cellene hadde blitt dyrket i tilsatt til lOOml High-Five-celler ved lxlO<6>celler/ml i serumfritt medium. Etter ytterligere 6 dager ved 27 °C ble lml av dette mediumet fjernet og sentrifugert ved 13 OOOrpm i en Heraeus-microfuge i 5 minutter for å få dannet en pellet av celleavfall.

lOul av denne insekt-A6-disulfidbundne-TCR-supernatanten ble kjørt side om side med positive kontroller med 5ug og 10ug bakteriell A6-disulfidbundet-TCR på en ferdig støpt 4-20 % Tris/glysin-gel (Invitrogene: EC60252). Reduserte prøver ble laget ved å tilsette lOul reduserende prøvebuffer (950ul Laemmli-prøvebuffer (Bio-Rad: 161-0737) 50(0.1 2M DTT) og varme opp til 95 °C i 5 minutter, avkjøle ved romtemperatur i 10 minutter og deretter sette på 20\ i\. Ikke-reduserte prøver ble laget ved å tilsette 10ul Laemmli-prøvebuffer og sette på 20ul.

Gelen ble kjørt ved 150 volt i 1 time i en Novex-Xcell-geltank og deretter ble gelen farget i 50ml Coomassiefargeløsning i 1 time under forsiktig risting (l,lg Coomassiepulver i 500ml metanol, rør i 1 time, tilsett lOOml eddiksyre, lag opp til 1 liter med H20 og rør i 1 time før det filtreres gjennom et 0,45um filter). Gelen ble avfarget tre ganger 30 minutter med forsiktig risting i 50ml avfargingsløsning (som Coomassiefargeløsning uten Coomassiepulver).

Western-Blot ble utført ved å kjøre SDS-PAGE-geler som før men proteinene ble overført på Immuno-Blot-PVDF-membraner (Bio-Rad: 162-0174) istedenfor å farge gelene med Coomassie. Seks filterpapir ble klippet til gelens størrelse og dynket i overføringsbuffer (2,39g glysin, 5,81g Tris-Base, 0,77g DTT løst i 500ml H20, 200ml metanol tilsatt og fylt opp med H20 til lOOOml). PVDF-membranen ble gjort klar ved å bløtgjøre den i metanol i 1 minutt og deretter i overføringsbuffer i 2 minutter. Tre filterpapir ble plassert på anodeoverflaten til Immuno-blot-apparatet (Pharmacia - Novablot) deretter ble membranen plassert på toppen fulgt av gelen og deretter tre ekstra filterpapir på katodesiden. Immuno-blot ble kjørt i 1 time ved 0,8mA konstant/cm<2>på geloverflate.

Etter blottingen ble membranen blokkert i 7,5ml blokkeringsbuffer (4 Trisbuffrede salttabletter (Sigma: T5030), 3g fettfri tørrmelk (Sigma: M7409), 30ul Tween-20 fylt opp til 30ml med H20) i 60 minutter med forsiktig risting. Membranen ble vasket tre ganger i 5 minutter med TBS-vaskebuffer (20 TBS-tabletter, 150u,l Tween-20 fylt opp til 300ml med H20). Membranen ble deretter inkubert i primært antistoff 1/50 fortynning av anti-TCR-a-kjede klon 3A8 (Serotec: MCA987) eller anti-TCR-fi-kjede klon 8A3 (Serotec: MCA988) i 7,5ml blokkeringsbuffer i 1 time med forsiktig risting. Membranen ble vasket som før i TBS-vaskebuffer. Deretter ble en sekundær antistoff-inkubering med HRP-merket geit-anti-mus-antistoff (Santa Cruz Biotech: Sc-2005) med 1/1000 fortynning i 7,5ml blokkeringsbuffer utført i 30 minutter med forsiktig risting. Membranen ble vasket som før og deretter vasket i 30ml H20 med 2 TBS-tabletter.

Antistoffbindingen ble påvist med Opti-4CN-kolometrisk påvisning (Biorad: 170-8235) /l,4ml Opt-4CN-fortynningsmiddel, 12,6ml H20, 0,28ml Opti-4CN-substrat). Membranene ble farget i 30 minutter og deretter vasket i H20 i 15 minutter. Membranene ble tørket ved romtemperatur og bilder ble lagt ved siden av et bilde av den coomassie-fargede gelen (Figur 116).

Resultater:

På figur 116 kan de sees at begge disulfid-TCRene er dannet som en heterodimer som er stabil i SDS-gelen. Begge brytes opp i a- og B-kjeder ved reduksjon. Insekt-disulfid-TCR-heterodimeren har en litt høyere molekylvekt enn den bakterielt fremstilte utgaven, antagelig på grunn av glykosyleringen i insektcellene. I dette tilfellet kan det observeres at insektcellene fremstiller a-kjede i overskudd og frie a-kjeder kan sees i det ikke-reduserte sporet på anti-a-western-blottet.

Disse dataene viser klart at baculovirusekspresjonssystemet beskrevet ovenfor tilveiebringer et levedyktig alternativ til prokaryot uttrykking av løselige TCRer som inneholder nye disulfidbindinger.

Claims (57)

1. Løselig afi-form-T-cellereseptor (sTCR),karakterisert vedat (a) en kovalent disulfidbinding forbinder et residue på immunoglobulinregionen på det konstante domenet til a-kjeden med et residue på immunoglobulinregionen på det konstante domenet til B-kjeden, der en interkjededisulfidbinding i nativ TCR ikke er til stede, eller (b) en kovalent disulfidbinding forbinder cysteinresiduer som er substituert for: Thr 48 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Ser 57 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01, Thr 45 i ekson 1 på TRAC01 og Ser 77 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01, Tyr 10 i ekson 1 på TRAC01 og Ser 17 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01, Thr 45 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Asp 59 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01, Ser 15 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Glu 15 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01.

2. sTCR ifølge krav 1,karakterisert vedat den omfatter (i) hele eller deler av en TCR-a-kjede, unntatt transmembrandomenet derav, og (ii) hele eller deler av en TCR-B-kjede, unntatt transmembrandomenet derav, der (i) og (ii) hver omfatter et funksjonelt variabelt domene og i det minste en del av det konstante domenet til TCR-kjeden.

3. sTCR ifølge krav 2,karakterisert vedat én av eller begge (i) og (ii) omfatter hele det ekstracellulære konstante Ig-domenet til TCR-kjeden.

4. sTCR ifølge krav 2 eller 3,karakterisert vedat én av eller begge (i) og (ii) omfatter hele det ekstracellulære domenet til TCR-kjeden.

5. sTCR ifølge ethvert av kravene la og 2, 3 og 4 når avhengig av krav la,karakterisert vedat disulfidbindingen som ikke er til stede i nativ TCR foreligger mellom cysteinresiduer som er substituert inn for residuer hvis B-karbonatomer ligger mindre enn 0,6 nm fra hverandre i den native TCR-strukturen.

6. sTCR ifølge krav 5, karakterisert vedat disulfidbindingen som ikke er til stede i nativ TCR foreligger mellom cysteinresiduer som er substituert inn for Thr 48 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Ser 57 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01.

7. sTCR ifølge krav 5, karakterisert vedat disulfidbindingen som ikke er til stede i nativ TCR foreligger mellom cysteinresiduer som er substituert inn for Thr 45 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Ser 77 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01.

8. sTCR ifølge krav 5, karakterisert vedat disulfidbindingen som ikke er til stede i nativ TCR foreligger mellom cysteinresiduer som er substituert inn for Tyr 10 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Ser 17 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01.

9. sTCR ifølge krav 5, karakterisert vedat disulfidbindingen som ikke er til stede i nativ TCR foreligger mellom cysteinresiduer som er substituert inn for Thr 45 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Asp 59 i ekson 1 påTRBCl<*>01 eller TRBC2<*>01.

10. sTCR ifølge krav 5, karakterisert vedat disulfidbindingen som ikke er til stede i nativ TCR foreligger mellom cysteinresiduer som er substituert inn for Ser 15 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Glu 15 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01.

11. sTCR ifølge ett av kravene lb og 2, 3 og 4 når avhengig av krav lb,karakterisert vedat en interkjededisulfidbinding i nativ TCR ikke er til stede.

12. sTCR ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert vedat native a- og B-TCR-kjeder er trunkerte på C-terminal ende slik at cysteinresiduene som danner den native interkjededisulfidbindingen er fjernet.

13. sTCR ifølge ethvert av kravene 1-11, karakterisert vedat cysteinresiduer som danner den native interkjededisulfidbindingen substitueres med en annen residue.

14. sTCR ifølge krav 13, karakterisert vedat cysteinresiduer som danner den native interkjededisulfidbindingen substitueres med serin eller alanin.

15. sTCR ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert vedat et uparet cysteinresidue som er til stede i nativ TCR-6-kjede ikke er til stede.

16. sTCR ifølge ethvert av kravene 2-15, karakterisert vedat (i) og (ii) hver omfatter det funksjonelle variable domenet fra en første TCR fusjonert med hele eller deler av det konstante domenet fra en annen TCR, der den første og den andre TCRen stammer fra den samme arten.

17. sTCR ifølge krav 16, karakterisert vedat de konstante domenene til den andre TCRen er trunkerte på N-terminal side av residuene som danner den ikke-native interkjededisulfidbindingen.

18. sTCR ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert vedat én av eller begge kjedene er derivatisert med, eller fusjonert med, en enhet på sin C-terminale eller N-terminale ende.

19. sTCR ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert vedat én av eller begge kjedene har et cysteinresidue på sin C-terminale eller N-terminale ende på hvilken en enhet kan bli fusjonert.

20. sTCR ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert vedat den ytterligere omfatter et merke som kan bli påvist.

21. sTCR ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert vedat den er assosiert med et terapeutisk middel.

22. Multivalent T-cellereseptor (TCR)-kompleks, karakterisert vedat det omfatter et flertall av sTCRcr ifølge ethvert av de foregående krav.

23. Kompleks ifølge krav 22, karakterisert vedat det omfatter en sTCR-multimer.

24. Kompleks ifølge krav 23, karakterisert vedat det omfatter to eller tre eller fire eller flere T-cellereseptormolekyler som er assosiert med hverandre, helst via et forbindelsesmolekyl.

25. Kompleks ifølge kravene 20, 21 eller 22, karakterisert vedat sTCRene eller sTCR-multimerene foreligger i et lipidbilag eller er forbundet med en partikkel.

26. Nukleinsyremolekyl, karakterisert vedat det omfatter en sekvens som koder for (i) eller (ii) fra en sTCR ifølge ethvert av kravene 2-21, eller en sekvens som er komplementær dertil.

27. Vektor, karakterisert vedat den omfatter et nukleinsyremolekyl ifølge krav 26.

28. Vertscelle, karakterisert vedat den omfatter en vektor ifølge krav 27.

29. Fremgangsmåte for å fremskaffe (i) eller (ii) som definert i ethvert av kravene 2-21, karakterisert vedat den omfatter å inkubere en vertscelle ifølge krav 28 ved betingelser som fører til uttrykking av peptidet og deretter rensing av polypeptidet.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 29, karakterisert vedat den ytterligere omfatter å blande (i) og (ii) ved passende refoldingsbetingelser.

31. Fremgangsmåte for å fremskaffe en løselig a6-form-T-cellereseptor (sTCR),karakterisert vedat den omfatter å: inkubere en vertscelle som omfatter en vektor som omfatter et nukleinsyremolekyl som koder for en TCR-a-kjede og en vertscelle som omfatter en vektor som omfatter et nukleinsyremolekyl som koder for en TCR-6-kjede ved betingelser som fører til uttrykking av de respektive TCR-kjedene, rense de respektive TCR-kjedene, og blande de respektive TCR-kjedene ved refoldingsbetingelser slik at en kovalent disulfidbinding forbinder et residue på immunoglobulinregionen på det konstante domenet på a-kjeden med en residue på immunoglobulinregionen på det konstante domenet på B-kjeden, der disulfidbindingen er en binding som ikke er tilstede i nativ TCR.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 31, karakterisert vedat nukleinsyren som koder for en TCR-a-kjede koder for (i) hele eller deler av en TCR-a-kjede, unntatt transmembrandomenet derav, og TCR- nukleinsyren som koder for en TCR-B-kjede koder for (ii) hele eller deler av en TCR-B-kjede, unntatt transmembrandomenet derav, og hvori (i) og (ii) hver omfatter et funksjonelt variabelt domene og i det minste en del av det konstante domenet av TCR-kjeden.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 32, karakterisert vedat én av eller begge (i) og (ii) omfatter hele det ekstracellulære konstante Ig-domenet til TCR-kjeden.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 32 eller 33, karakterisert vedat én av eller begge (i) og (ii) omfatter hele det ekstracellulære domenet til TCR-kjeden.

35. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 31-34, karakterisert vedat en interkjededisulfidbinding i native TCR ikke er til stede.

36. Fremgangsmåte ifølge krav 35, karakterisert vedat native a- og B-TCR-kjeder er trunkerte på C-terminal ende slik at cysteinresiduene som danner den native interkjededisulfidbindingen er fjernet.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 35, karakterisert vedat cysteinresiduer som danner den native interkjededisulfidbindingen er substituert med et annet residue.

38. Fremgangsmåte ifølge krav 37, karakterisert vedat cysteinresiduer som danner den native interkjededisulfidbindingen er substituert med serin eller alanin.

39. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 31-38, karakterisert vedat et uparet cysteinresidue som er til stede i native TCR-B-kjede ikke er til stede.

40. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 31-39, karakterisert vedat disulfidbindingen som ikke er til stede i nativ TCR foreligger mellom cysteinresiduer som er substituert inn for residuer hvis 6-karbonatomer ligger mindre enn 0,6 nm fra hverandre i den native TCR-strukturen.

41. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 31 -40, karakterisert vedat disulfidbindingen som ikke er til stede i nativ TCR foreligger mellom cysteinresiduer som er substituert inn for Thr 48 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Ser 57 i ekson 1 påTRBCl<*>01 eller TRBC2<*>01.

42. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 31-40, karakterisert vedat disulfidbindingen som ikke er til stede i native TCR foreligger mellom cysteinresiduer som er substituert inn for Thr 45 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Ser 77 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01.

43. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 31 -40, karakterisert vedat disulfidbindingen som ikke er til stede i native TCR foreligger mellom cysteinresiduer som er substituert inn for Tyr 10 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Ser 17 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2*01.

44. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 31-40, karakterisert vedat disulfidbindingen som ikke er til stede i native TCR foreligger mellom cysteinresiduer som er substituert inn for Thr 45 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Asp 59 i ekson 1 på TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01.

45. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 31 -40, karakterisert vedat disulfidbindingen som ikke er til stede i native TCR foreligger mellom cysteinresiduer som er substituert inn for Ser 15 i ekson 1 på TRAC<*>01 og Glu 15 i ekson 1 påTRBCl<*>01 eller TRBC2<*>01.

46. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 31-45, karakterisert vedat (i) og (ii) hver omfatter det funksjonelle variable domenet til en første TCR fusjonert med hele eller deler av det konstante domenet til en annen TCR, der den første og den andre TCRen stammer fra den samme arten.

47. Fremgangsmåte ifølge krav 46, karakterisert vedat de konstante domenene til den andre TCRen er trunkerte på N-terminal side av residuene som danner den ikke-native interkjededisulfidbindingen.

48. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 32-47, karakterisert vedat én av eller begge kjedene er derivatisert med, eller fusjonert med, en enhet på sin C-terminale eller N-terminale ende.

49. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 32-48, karakterisert vedat én av eller begge kjedene har en cysteinresidue på sin C-terminale og/eller N-terminale ende til hvilken en enhet kan bli fusjonert.

50. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 32-49, karakterisert vedat sTCRen ytterligere omfatter et merke som kan bli påvist.

51. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 32-50, karakterisert vedat sTCRen er assosiert med et terapeutisk middel.

52. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 32-51, karakterisert vedat den ytterligere omfatter å kombinere et flertall av sTCRer for å danne et multivalent T-cellereseptor (TCR)-kompleks.

53. Fremgangsmåte ifølge krav 52, karakterisert vedat sTCRene kombineres for å danne en sTCR-multimer.

54. Fremgangsmåte ifølge krav 53, karakterisert vedat to eller tre eller fire eller flere T-cellereseptorer assosieres med hverandre, helst via et forbindelsesmolekyl.

55. Fremgangsmåte ifølge kravene 52, 53 eller 54, karakterisert vedat sTCRene eller sTCR-multimerene er kombinert i et lipidbilag eller er forbundet med en partikkel.

56. Fremgangsmåte for å påvise MHC-peptidkomplekser, karakterisert vedat den omfatter å: (i) tilveiebringe en løselig TCR ifølge ethvert av kravene 1-21, en løselig TCR fremstilt ved fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 31-51, et multivalent T-celle-reseptorkompleks ifølge ethvert av kravene 22-25 eller et multivalent T-cellereseptor-kompleks fremstilt ved fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 52-55, (ii) bringe den løselige TCRen eller det multivalente TCR-komplekset i kontakt med MHC-peptidkompleksene, og (iii) påvise binding av den løselige TCRen eller det multivalente TCR-komplekset til MHC-peptidkompleksene.

57. Farmasøytisk formulering, karakterisert vedat den omfatter en sTCR (a) ifølge ethvert av kravene 1-21, eller (b) fremstilt ved frem gangsmåten ifølge ethvert av kravene 31-51, og/eller et multivalent TCR-kompleks (a) ifølge ethvert av kravene 22-25, eller (b) fremstilt ved fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 52-55, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.