NO335365B1 - Enkeltkjedede, rekombinante T-cellereseptorer, multivalent T-celle reseptor (TCR)-kompleks, nukleinsyre-molekyl omfattende en sekvens som koder for en scTCR og dennes vektor samt et preparat; fremgangsmåte for å påvise en TCR-ligand og fremgangsmåter for å identifisere en inhibitor eller potensiell inhibitor av interaksjonen mellom en scTCR og en TCR-ligand - Google Patents

Abstract

En enkeltkjedet, T-cellereseptor (scTCR) som omfatter et segment som utgjøres av en TCR-a-kjedevariabelregionsekvens fusjonert med N-terminalen til en TCR-akjedekonstantregionekstracellulærsekvens, et ß-segment som utgjøres av en TCR-ßkjedevariabelregion fusjonert med N-terminalen til en TCR-ß-kjedekonstantregionekstacellulærsekvens, og en linkersekvens som binder sammen C-terminalen til a-segmentet med N-teminalen til ß-segmentet eller vise versa, der konstantregionekstracellulærsekvensene til a- og ß-segmentene er bundet sammen med en disulfidbinding, der lengden på linkersekvensen og posisjonen til disulfidbindingen er slik at variabelregionsekvensene til cc- og P-segmentene er gjensidig orientert vesentlig som i native aß-T-cellereseptorer. Komplekser av to eller flere slike scTCRene, og anvendelse av scTCRene ved terapi og i ulike sereeningsapplikasjoner, blir også tilkjennegitt.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører enkeltkjedede T-cellereseptorer (TCRer).

Bakgrunn for oppfinnelsen

Native TCRer

Som for eksempel beskrevet i WO 99/60120 medierer TCRer gjenkjenning av spesifikke viktigste vevsforlikelihetskompleks (MHC)-peptidkomplekser ved T-celler, og er i egenskap av dette essensielle for funksjonen til den cellulære delen av immunsystemet.

Antistoffer og TCRer er bare to typer av molekyler som gjenkjenner antigener på en spesifikk måte, og slik er TCRen den eneste reseptoren for spesielle peptidantigener som er presentert på MHC, der det fremmede peptidet ofte er det eneste tegn på en unormalhet inne i cellen. T-cellegjenkjenning forekommer når en T-celle og en antigenpresenterende celle (APC) er i direkte fysisk kontakt, og blir initiert ved binding av antigenspesifikke TCRer til pMHC-komplekser.

Den native TCR er et heterodimert celleoverflateprotein tilhørende immunoglobulin-superfamilien som er assosiert med invariante proteiner i CD3-komplekset som er involvert i mediering av signaloverføring. TCRer forekommer i ap- og y5-former som er strukturelt lignende, men som har svært distinkte, anatomiske lokaliseringer og sannsynligvis funksjoner. MHC-klasse-I- og MHC-klasse-II-ligander er også immunoglobulinsuperfamilieproteiner, men er spesialiserte for antigenpresentasjon og har et svært polymorft peptidbindingssete som gjør dem i stand til å presentere et bredt utvalg av korte peptidfragmenter på APC-celleoverflaten.

Ytterligere to klasser av proteiner er kjent for å være i stand til å virke som TCR-ligander. (1) CDl-antigener er MHC-klasse-I-relaterte molekyler hvis gener er lokaliserte på et annet kromosom enn de klassiske MHC-klasse-I- og MHC-klasse-II-antigenene. CDl-molekyler er i stand til å presentere peptid- og ikke-peptid- (f.eks. lipid, glykolipid) enheter for T-celler på en måte som er analog med konvensjonelle klasse-I- og klasse-II-MHC-peptidkomplekser. Se foreksempel (Barclay et al., (1997) The Leucocyte Antigen Factsbook, 2. utgave, Academeic Press) og (Bauer (1997) Eur J Immunol 27 (6) 1366-1373)) (2) Bakterielle superantigener er løselige toksiner som er i stand til å binde både klasse-II-MHC-molekyler og en undergruppe av TCRer. (Fraser (1989) Nature 339 221-223). Mange superantigener oppviser spesifisitet for ett eller to Vbeta-segmenter, mens andre oppviser mer promiskuøs binding. I hvert tilfelle er superantigenet i stand til å utløse en forsterket immunrespons i kraft av dets evne til å stimulere undergrupper av T-celler på en polyklonal måte.

Den ekstracellulære delen av nativ heterodimer apTCR består av to polypeptider der hvert har et membranproksimalt konstant domene og et membrandistalt variabelt domene (se figur 1). Hvert av de konstante og variable domenene inkluderer en intrakjededisulfidbinding. De variable domenene inneholder de svært polymorfe løkkene som er analoge med de komplementaritetsbestemmende regionene (CDRer) i antistoffer. CDR3 i TCR interagerer med peptidet som er presentert av MHC, og CDRene 1 og 2 interagerer med peptidet og MHC. Mangfoldet av TCR-sekvenser blir generert via somatisk rearrangering av sammenbundne variable (V), diversitets (D), sammenbindende (J) og konstante gener. Funksjonelle a-kjede-polypeptider blir dannet av rearrangerte V-J-C-regioner, mens p-kjeder består av V-D-J-C-regioner. Det ekstracellulære, konstante domenet har en membranproksimal region og en immunoglobulinregion. Det finnes ett enkelt a-kjedekonstantdomene, kjent som TRAC, og to ulike p-konstantdomener, kjent som TRBC1 og TRBC2 (IMGT-nomenklatur). Det er fire aminosyreforskjeller mellom disse p-konstantdomenene, der tre av disse er i domenene som benyttes for å fremstille enkeltkjede-TCRene ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse forskjellene er alle inne i ekson 1 i TRBC1 og TRBC2: N4K5->K4N5og F37->Y (IMGT-nummerering, ulikheter TRBC1->TRBC2), og der den siste aminosyreendringen mellom de to TCR p-kjedekonstant-regionene er i ekson 3 i TRBC1 og TRBC2: Vi->E. Omfanget av hvert av de ekstracellulære TCR-domenene er noe variabelt. Likevel kan en fagperson på området med letthet bestemme posisjonen til domenegrensene ved å benytte en referanse slik som The T Cell Receptor Facts Book, Lefranc & Lefranc, Publ. Academic Press 2001.

Enkeltkiede- TCRer

Enkeltkjede-TCRer (scTCRer) er kunstige konstruksjoner som består av en enkelt aminosyretråd som på samme måte som native, heterodimere TCRer binder til MHC-peptidkomplekser. Dessverre har forsøk på å fremstille funksjonelle alfa/beta-analog scTCRer ved ganske enkelt å binde alfa- og betakjedene, slik at begge blir uttrykt i en enkel, åpen leseramme, ikke vært vellykket, sannsynligvis på grunn av den naturlige ustabiliteten i alfabeta-løselig domeneparing.

På grunn av dette har spesielle teknikker som benytter ulike trunkeringer på én av, eller begge, alfa- og betakjedene vært nødvendig for fremstillingen av scTCRer. Disse formatene ser kun ut til å være anvendbare på et svært begrenset utvalg av scTCR-sekvenser. Soo Hoo et al. (1992) PNAS. 89 (10): 4759-63 rapporterer uttrykkingen av en muse-TCR i et enkeltkjedeformat fra 2C-T-celleklonen ved å benytte en trunkert beta- og alfakjede bundet til en 25-aminosyrelinker og bakteriell periplasmisk uttrykking (se også Schodin et al. (1996) Mol. Immunol 33 (9): 819-29). Denne designen danner også basis for m6-enkeltkjede-TCR rapportert av Holler et al. (2000) PNAS. 97 (10): 5387-92 som er avledet fra 2C-scTCR og binder til den samme H2-Ld-begrensede alloepitop. Shusta et al. (2000) Nature Biotechnologyl8: 754-759 rapporterer å benytte enkeltkjede-2C-TCR-konstruksjoner i gjæruttrykkingseksperimenter som frembrakte muterte TCRer med forbedret termosta bi I itet og løselighet. Denne rapporten viste også evnen til disse uttrykte 2C-TCRertil å selektivt binde celler som uttrykker deres beslektede pMHC. Khandekaret al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (51): 32190-7 rapporterer om en tilsvarende design for den murine D10-TCR, selv om denne scTCR var fusjonert med MBP og uttrykt i bakterielt cytoplasma Hare et al. (1999) Nat. Struct. Biol. 6 (6): 574-81) Hilyard et al. (1994) PNAS. 91 (19): 9057-61 rapporterer om en human scTCR som er spesifikk for influensamatriksprotein-HLA-A2, ved å benytte en Va-linker-Vp-design og uttrykt i bakterielt periplasma.

Chung et al. (1994) PNAS. 91 (26) 12654-8 rapporterer om produksjonen av human scTCR ved å benytte en Va-linker-Vp-design og uttykking på overflaten av en pattedyrcellelinje. Denne rapporten inkluderer ikke noen referanse til peptid-HLA-spesifikk binding av scTCR. Plaksin et al. (1997) J. Immunol. 158 (5): 2218-27 rapporterer om en tilsvarende Va-linker-Vp-Cp-design for å produsere en murin scTCR som er spesifikk for en HIV-gpl20-H-2Dd<->epitop. Denne scTCR blir uttykt som bakterielle inklusjonslegemer og blir refoldet in vitro.

Terapeutisk anvendelse

Det er behov for målsøkende enheter som er i stand til å lokaliseres til celler som er rammet av sykdomsprosesser. Slike målsøkende enheter kan bli benyttet enten for direkte å blokkere den feilrettede virkningen til immunsystemet som er ansvarlig for autoimmun sykdom, eller som et middel for å levere cytotoksiske midler til kreftceller.

Ideelt må molekyler som er passende til disse applikasjonene ha en spesifikk affinitet for en cellemarkør som er direkte involvert i den relevante sykdomsprosessen. Antistoffer er blitt benyttet til dette formålet.

Screeninqsanvendelse

Et antall viktige cellulære interaksjoner og celleresponser, inkludert den TCR-medierte immunsynapsen, blir kontrollert ved kontakter som blir gjort mellom celleoverflatereseptorer og ligander som er presentert på overflaten til andre celler. Disse typene av spesifikke molekylære kontakter er av stor viktighet forden korrekte, biokjemiske reguleringen i menneskekroppen og blir derfor studert inngående. I mange tilfeller er målet for slike studier å finne frem til en måte for å modulere cellulære responser for å kunne forhindre eller motkjempe sykdom.

Derfor er fremgangsmåter som kan bli benyttet for å identifisere forbindelser som binder med noen grad av spesifisitet til humane reseptorer eller ligandmolekyler, viktige som ledetråder for oppdagelsen og utviklingen av nye sykdomsterapeutiske midler. Spesielt har forbindelser som interferer med visse reseptorligandinteraksjoner umiddelbart potensiale som terapeutiske midler eller bærere.

Fremskritt i kombinatorisk kjemi som muliggjør relativt enkel og kostnadseffektiv produksjon av svært store forbindelsesbiblioteker, har økt omfanget av forbindelsestesting enormt. Nå utgjøres begrensningene til screeningsprogrammer oftest av egenskapene til analysene som kan bli benyttet, produksjonen av passende reseptor- og ligandmolekyler og hvor godt disse analysene kan bli tilpasset til høyomsetningsscreeningsfremgangsmåter.

Av kjent teknikk vedrører WO 9918129 Al et løselig enkeltkjede TCR omfattende a og P variabel- og konstantdomener koblet sammen med en peptidlinkersekvens. Videre beskrives DNA molekyl som koder for slikt TCR samt metoder for fremstilling av slike TCR og anvendelser. US 6080840 A angår en løselig TCR sammensatt av de ekstracellulære domener og koblet til et GPI-anker som gjør at de kan frigjøres enzymatisk fra membran. I det løselige TCR har a og p-domenene den native konformasjon. Videre diskuterers mulige modifikasjoner, blant annet å introdusere ekstra Cysteiner for å danne disulfidbindinger. REITER et al. beskriver i Immunity, vol. 2, nr. 3, 1995, s. 281-287, løselige a/P TCR-dimerer stabilisert ved innføring av disulfidbindinger mellom cysteinresidier i det konstante området av variabelt domene. TCR-dimerene blir korrekt foldet, og har en redusert tendens til å aggregere.

Kort beskrivelse av oppfinnelsen

Denne oppfinnelsen tilgjengeliggjør en ny klasse av alfa/beta-analog-scTCRer som er kjennetegnet ved tilstedeværelsen av en disulfidbinding mellom residier på den enkle aminosyretråden, der denne bindingen bidrar til stabiliteten til paringen mellom alfa- og betaregioner på molekylet. Slike TCRer er nyttige for screening eller for fremstilling av et preparat for terapeutiske formål.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en enkeltkjede-T-cellereseptor (scTCR) som omfatter et a-segment som utgjøres av en TCR-a-kjedevariabelregionsekvens fusjonert med N-terminalen på en TCR-a-kjedekonstantregionekstracellulærsekvens, et p-segment som utgjøres av en TCR-p-kjedevariabelregionsekvens fusjonert til N-terminalen på en TCR-p-kjedekonstantregionekstracellulærsekvens og en linkersekvens som binder sammen C-terminalen på a-segmentet med N-terminalen på p-segmentet eller vise versa, der konstantregionekstracellulærsekvensen til a- og p-segmentene er bundet sammen med en disulfidbinding mellom cysteinrester som er substituert for: Thr 48 i ekson 1 av TRAC<*>01 og Ser 57 i ekson 1 av TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01;

Thr 45 i ekson 1 av TRAC<*>01 og Ser 77 i ekson 1 av TRBCI<*>01 eller TRBC2<*>01;

Tyr 10 i ekson 1 av TRAC<*>01 og Ser 17 i ekson 1 av TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01;

Thr 45 i ekson 1 avTRAC<*>01 og Asp 59 i ekson 1 avTRBCl<*>01 eller TRBC2<*>01; eller

Ser 15 i ekson 1 av TRAC<*>01 og Glu 15 i ekson 1 av TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01. der lengden til linkersekvensen og posisjonen til disulfidbindingen er slik at variabel region sekvensene til a- og p-segmentene er gjensidig orientert, vesentlig som i native ap-T-cellereseptorer.

I scTCRene ifølge oppfinnelsen blir nødvendigheten av at variabelregionsekvensene til a- og p-segmentene er gjensidig orientert, vesentlig som i native ap-T-cellereseptorer, testet ved å bekrefte at molekyler binder til den relevante TCR-liganden (pMHC-kompleks, CD1-antigenkompleks, superantigen eller superantigen/MHC-kompleks) - hvis det binder, da er betingelsen oppfylt. Interaksjoner med pMHC-komplekser kan bli målt ved å benytte et BIAcore-3000- eller BIAcore-2000-instrument. Henholdsvis eksempel 3 her eller WO99/6120 tilveiebringer detaljerte beskrivelser av fremgangsmåtene som er nødvendige for å analysere TCR-binding til MHC-peptidkomplekser. Disse fremgangsmåtene er like anvendelige for undersøkelsen avTCR/CDl og TCR/superantigeninteraksjoner. For å kunne benytte disse fremgangsmåtene i undersøkelsen av TCR/CDl-interaksjoner, er løselige former av CD1 nødvendige, der produksjonen av disse er beskrevet i (Bauer (1997) Eur J Immunol 27 (6) 1366-1373.

a- og p- seqmenter

Konstantregionekstracellulærsekvensene som foreligger i a- og p-segmentene, tilsvarer foretrukket de som foreligger i humant TCR, og det gjør også variabelregionsekvensene som foreligger i a- og p-segmentene. Likevel behøver ikke overensstemmelsen mellom slike sekvenser å være 1:1 på et aminosyrenivå. N- eller C-trunkering og/eller aminosyredelesjon og/eller substitusjon relativt i forhold til de tilsvarende, humane TCR-sekvensene er akseptabelt, gitt at det totale resultatet er gjensidig orientering av variabel-regionsekvenser i a- og p-segmentene som i native a- og p-cellereseptorer og opprettholdelse av peptid-MHC-bindingsfunksjonalitet. Spesielt fordi konstantregionekstracellulærsekvensene som er til stede i a- og p-segmentene ikke er direkte involvert i kontakter med peptid-MHC-komplekset, på hvilket scTCR binder, kan de være kortere enn, eller kan inneholde substitusjoner eller delesjoner relativt i forhold til ekstracellulærkonstantdomenesekvenser i native TCRer.

Konstantregionekstracellulærsekvensen som foreligger i a-segmentet, kan inkludere en sekvens som tilsvarer det ekstracellulære, konstante Ig-domenet på en TCR-a-kjede, og/eller konstantregionekstracellulærsekvensen som foreligger i p-segmentet, kan inkludere en sekvens som tilsvarer det ekstracellulære, konstante Ig-domenet i en TCR-p-kjede.

I en utførelsesform av oppfinnelsen tilsvarer a-segmentet vesentlig hele den variable regionen til en TCR-a-kjede fusjonert med N-terminalen til vesentlig hele det ekstracellulære domenet til den konstante regionen på en TCR-a-kjede, og/eller p-segmentet tilsvarer vesentlig hele den variable regionen på en TCR-p-kjede fusjonert med N-terminalen til vesentlig hele det ekstracellulære domenet i den konstante regionen på en TCR-p-kjede.

I en annen utførelsesform tilsvarer konstantregionekstracellulærsekvensene som er til stede i a- og p-segmentene de konstante regionene på a- og p-kjedene i native TCR trunkert på deres C-terminale ender, slik at cysteinresidien som danner den native interkjededisulfidbindingen i TCRen er ekskludert. Alternativt kan disse cysteinresidiene bli substituert med en annen aminosyreresidie, slik som serin eller alanin, slik at den native disulfidbindingen blir fjernet. I tillegg inneholder den native TCR-p-kjeden en uparet cysteinresidie, og denne residien kan bli deletert fra, eller erstattet med, en ikke-cysteinresidie i p-sekvensen på scTCRen ifølge oppfinnelsen.

I en spesiell utførelsesform ifølge oppfinnelsen kan TCR-a- og -p-kjedevariabel-regionsekvensene som er til sted i a- og p-segmentene sammen tilsvare det funksjonelle, variable domenet i en første TCR, og TCR-a- og -p-kjedekonstantregionekstarcellulær-sekvensene som er til stede i a- og p-segmentene, kan tilsvare de i en annen TCR, der den første og andre TCR stammer fra samme art. Dermed kan a- og p-kjedevariabelregion-sekvensene som er til stede i a- og p-segmentene tilsvare de i en første human TCR, og de a-og p-kjedekonstantregionekstracellulære sekvensene kan tilsvare de i en annen human TCR, foreksempel kan A6-tax-sTCR-konstantregionekstracellulærsekvenser bli benyttet som rammeverk på hvilket heterologe, variable domener kan bli fusjonert.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen tilsvarer TCR-a- og -p-kjedevariabelregion-sekvensene som er til stede i a- og p-segmentene sammen det funksjonelle, variable domenet i en første TCR, og TCR-a- og -p-kjedekonstantregionekstracellulærsekvensene som er til stede i a- og p-segmentene, tilsvarer de på en annen TCR, der den første og andre TCR stammer fra ulike arter. I denne utførelsesformen er det foretrukket at TCR-a- og -p-kjedevariabelregion-sekvensene som er til stede i a- og p-segmentene, sammen tilsvarer det funksjonelle, variable domenet i en human TCR, og TCR-a- og -p-kjedekonstantregionekstracellulærsekvensene som er til stede i a- og p-segmentene tilsvarer de i en muse-TCR. Slike utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse har det fortrinnet at scTCRene inneholder ikke-humane konstant-regionsekvenser som sannsynligvis er immunogene, og som dermed sannsynligvis øker den totale immunresponsen mot dTCRen når den er lokalisert på sin målcelle. Immunresponsen mot avvikende celler, slik som kreftceller, kan dermed bli forbedret.

Linker

I foreliggende oppfinnelse binder en linkersekvens a- og p-segmentene, slik at det dannes en enkel polypeptidtråd. Linkersekvensen kan for eksempel ha formelen -P-AA-P- der P er prolin, og AA representerer en aminosyresekvens der aminosyrene er glysin og serin.

Foråt scTCRen skal binde til et MHC-peptidkompleks, må a- og p-segmentene bli paret slik at variabelregionsekvensene derav er orientert for slik binding. Dermed bør linkeren ha tilstrekkelig lengde til å dekke distansen mellom C-terminalen til a-segmentet og N-terminalen til p-segmentet, eller vise versa. På den annen side bør for lang linkerlengde foretrukket bli unngått i tilfelle enden på linkeren på den N-terminale variabelregionsekvensen blokkerer eller reduserer binding av scTCRen til målpeptid-MHC-komplekset.

Foreksempel i tilfellet der konstantregionekstracellulærsekvensene som er til stede i a- og p-segmentene tilsvarer de konstante regionene på a- og p-kjedene til en nativ TCR trunkert på deres C-terminale ende, slik at cysteinresidiene som danner den native interkjededisulfidbindingen i TCRen blir ekskludert, og linkersekvensen binder sammen C-terminalen på a-segmentet med N-terminalen på p-segmentet, kan linkeren bestå av fra 26 til 41, for eksempel 29, 30, 31 eller 31 aminosyrer, og en spesiell linker har formelen

-PGGG-(SGGGG)5-P- der P er prolin, G er glysin og S er serin.

Disulfidbinding

En prinsipiell karakteriserende egenskap ved scTCRene ifølge foreliggende oppfinnelse er disulfidbindingen mellom cysteinresidiene substituert for visse aminosyrer i konstantregionekstracellulærsekvensene i a- og p-segmentene. I noen tilfeller kan både en nativ og en ikke-nativ disulfidbinding være ønskelig i de foreliggende scTCRene.

Posisjonen til disulfidbindingen er styrt av nødvendigheten av at variabelregionsekvensene til a- og p-segmentene er gjensidig orientert vesentlig som i native ap-T-cellereseptorer.

Disulfidbindingene kan bli dannet ved å mutere ikke-cysteinresidier på a- og p-segmenter til cystein, og gjøre at bindingen blir dannet mellom de muterte residiene. Residier, hvis respektive p-karboner er omtrent 6 Å (0,6 nm) eller mindre, og foretrukket i området 3,5 Å (0,35 nm) til 5,9 Å (0,59 nm) fra hverandre i den native TCR, er foretrukket, slik at en disulfidbinding kan bli dannet mellom cycteinresidier som er introdusert i stedet for de native residiene. Det er foretrukket at disulfidbindingen foreligger mellom residier i konstantimmunoglobulinregionen, selv om den kan foreligge mellom residier i den membranproksimale region. Foretrukne seter der cysteiner kan bli introdusert for å danne disulfidbindingen, er de følgende residier i ekson 1 i TRAC<*>01 for TCR-a-kjeden og TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01 for TCR-p-kjeden:

Nå når residiene i humane TCRer som kan bli mutert til cysteinresidier for å danne en ny interkjededisulfidbinding i scTCRer ifølge oppfinnelsen er blitt identifisert, vil fagfolk på området være i stand til å mutere TCRer fra andre arter på samme måte for å fremstille en scTCR for denne arten. Hos mennesker behøver den erfarne fagperson kun å se etter de følgende motivene i de respektive TCR-kjedene for å identifisere residien som skal bli mutert (den skyggelagte residien er residien som skal muteres til en cysten).

I andre arter er det ikke sikkert a TCR-kjedene inneholder en region som har 100 % identitet med motivene ovenfor. Likevel vil fagfolk på området være i stand til å benytte motivene ovenfor for å identifisere den ekvivalente del av TCR-a- og -p-kjeden og dermed residien som skal bli mutert til cystein. Sammenligningsteknikker kan bli benyttet med hensyn til dette. For eksempel kan ClustalW, som er tilgjengelig på websiden til the European Bioinformatics Institute ( http;// www. ebi. ac. ul</ index. htmO bli benyttet for å sammenligne motivene ovenfor med en spesiell TCR-kjedesekvens for å kunne lokalisere den relevante delen av TCR-sekvensen som skal muteres.

Foreliggende oppfinnelse inkluderer innenfor sitt omfang ap-analog-scTCRer i tillegg til de fra andre pattedyr, inkludert, men ikke begrenset til, mus, rotte, gris, geit og sau. Også inkludert er humane/ikke-humane, kimere scTCRer som diskutert ovenfor. Som nevnt ovenfor, vil fagfolk på området være i stand til å bestemme seter som er ekvivalente med de ovenfor beskrevne, humane setene, på hvilke cysteinresidier kan bli introdusert for å danne en interkjededisulfidbinding. For eksempel viser de følgende aminosyresekvensene til muse-Ca- og

-Cp-løselige domener, sammen med motiver som viser de munne residiene som er ekvivalente med de humane residiene nevnt ovenfor som kan ble mutert til cysteiner for å danne en TCR-interkjededisulfidbinding (der de relevante residiene er skyggelagte): Muse-Ca-løselig domene:

Muse-Cp-løselig domene:

Murin ekvivalent av human a-kjede Thr 48: ESGTFITDKTVLDMKAMDSK

Murin ekvivalent av human a-kjede Thr 45. KTM ESGTFITD KTVLD M KAM

Murin ekvivalent av human a-kjede Tyr 10: YIQNPEPAVYQLKDPRSQDS

Murin ekvivalent av human a-kjede Ser 15: AVYQLKDPRSQDSTLCLFTD

Murin ekvivalent av human p-kjede Ser 57: NGREVHSGVSTDPQAYKESN

Murin ekvivalent av human p-kjede Ser 77: KESNYSYCLSSRLRVSATFW

Murin ekvivalent av human p-kjede Ser 17: PPKVSLFEPSKAEIANKQKA

Murin ekvivalent av human p-kjede Asp 59: REVHSGVSTDPQAYKESNYS

Murin ekvivalent av human p-kjede Glu 15: VTPPKVSLFEPSKAEIANKQ

Som diskutert ovenfor kan A6-tax-sTCR-ekstracellulærkonstantregionene bli benyttet som rammeverk, på hvilke heterologe, variable domener kan bli fusjonert. Det er foretrukket at de heterologe variabelregionsekvensene er bundet til konstantregionsekvensene på ethvert punkt mellom disulfidbindingen og de N-terminale endene til konstantregionsekvensene. I tilfellet med A6-tax-TCR-a- og -p-konstantregionsekvensene kan disulfidbindingen bli dannet mellom cysteinresidier som er introdusert på henholdsvis aminosyreresidiene 158 og 172. Derfor er det foretrukket at de heterologe a- og p-kjedevariabelregionsekvensforbindelsespunktene ligger mellom henholdsvis residiene 159 eller 173 og N-terminalen på a- eller p-konstantregionsekvensene.

Ytterligere aspekter

En scTCR (som foretrukket er human) ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli tilveiebrakt i vesentlig ren form, eller som et renset eller isolert preparat. For eksempel kan det bli tilveiebrakt i en form som i all vesentlighet er fri for andre proteiner.

Et flertall av scTCRer ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli tilveiebrakt i et multivalent kompleks. Dermed tilveiebringer foreliggende oppfinnelse i et aspekt et multivalent T-cellereseptor-(TCR)-kompleks som omfatter et flertall av løselige T-cellereseptorer som beskrevet her. Hvert av flertallene av løselige TCRer er foretrukket identiske.

I det multivalente komplekset ifølge foreliggende oppfinnelse kan scTCRene foreligge i form av multimerer, og/eller kan foreligge på, eller bli assosiert med, et lipiddobbeltlag, for eksempel et liposom.

I sin enkleste form omfatter et multivalent scTCR-kompleks ifølge oppfinnelsen en multimer av to eller tre eller fire eller flere T-cellereseptormolekyler assosiert (for eksempel kovalent eller på annen måte forbundet) med hverandre, foretrukket via et linkermolekyl. Passende linkermolekyler inkluderer, men er ikke begrenset til, multivalente forbindelsesmolekyler, slik som avidin, streptavidin, neutravidin og ekstravidin, der hver av disse har fire bindingsseter for biotin. Dermed kan biotinylerte TCR-molekyler bli dannet som multimerer av T-cellereseptorer som har et flertall av TCR-bindingsseter. Antallet TCR-molekyler i multimeren vil være avhengig av mengden av TCR i forhold til mengden av linkermolekyl som er benyttet for å danne multimerene, og også på tilstedeværelsen eller fravær av andre biotinylerte molekyler. Foretrukne multimerer er dimere, trimere eller tetramere TCR-komplekser.

Strukturer som er en god del større enn TCR-tetramerer, kan bli benyttet for å finne eller målsøke celler som uttrykker spesifikke MHC-peptidkomplekser. Foretrukket er strukturene i området 10 nm til 10 um i diameter. Hver struktur kan oppvise flere scTCR-molekyler som har en tilstrekkelig spredning, slik at to eller flere TCR-molekyler på strukturen kan binde simultant til to eller flere peptidkomplekser på en celle og dermed øke muligheten til den multimere bindingsenheten for cellen.

Passende strukturer til anvendelse ved oppfinnelsen, for å danne komplekser med én eller et flertall av scTCRer, inkluderer membranstrukturer, slik som liposomer og faste strukturer som foretrukket er partikler, slik som kuler, for eksempel latekskuler. Andre strukturer som kan bli eksternt belagte med T-celleresptormolekyler er også passende. Foretrukket er strukturene belagte med T-cellereseptormultimerer heller enn med individuelle T-cellereseptormolekyler.

I tilfellet med liposomer kan T-cellereseptormolekylene eller multimerer derav være bundet til, eller på annen måte assosiert med, membranen. Teknikker for dette er velkjente for fagfolk på området.

Et merke eller en annen enhet, slik som en toksisk eller terapeutisk enhet, kan bli inkludert i et multivalent scTCR-kompleks ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan merket eller en annen enhet bli inkludert i en blandet molekylmultimer. Et eksempel på et slikt multumert molekyl er en tetramer som inneholder tre scTCR-molekyler og et peroksidasemolekyl. Dette kan bli oppnådd ved å blande TCRen og enzymet ved et molart forhold på 3:1 for å generere tetramere komplekser og isolere det ønskede komplekset fra komplekser som ikke inneholder det korrekte forholdet av molekyler. Disse blandede molekylene kan inneholde enhver kombinasjon av molekyler, gitt at sterisk hindring ikke kompromitterer, eller signifikant kompromitterer, den ønskede funksjonen av molekylene. Posisjoneringen av bindingssetene på streptavidinmolekylet er passende for blandede tetramerer siden sterisk hindring ikke er tilbøyelig til å forekomme.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å påvise MHC-peptidkomplekser som omfatter å:

a. tilveiebringe en scTCR ifølge foreliggende oppfinnelse,

b. kontakte scTCRen med MHC-peptidkompleksene og

påvise binding av scTCRen til MHC-peptidkompleksene.

Terapeutisk anvendelse

scTCRen (eller multivalentkompleks derav) ifølge oppfinnelsen, kan alternativt eller ytterligere bli assosiert med (for eksempel kovalent, eller på annen måte, bundet til) et terapeutisk middel som for eksempel kan være en toksisk enhet til bruk for å drepe celler eller et immunstimulerende middel, slik som et interieukin eller et cytokin. Et multivalent scTCR-kompleks ifølge foreliggende oppfinnelse kan ha forbedret bindingsevne for en TCR-ligand, slik som et pMHC-kompleks eller CDl-molekyl, sammenlignet med en ikke-multimer T-cellereseptorheterodimer. Dermed er de multivalente scTCR-kompleksene ifølge foreliggende oppfinnelse spesielt nyttige for å finne eller målsøke celler som presenterer spesielle antigener in vitro eller in vivo, og er også nyttige som intermediater for fremstillingen av ytterligere multivalente TCR-komplekser som har slike anvendelser. scTCRen eller det multivalent scTCR-kompleks kan derfor bli tilveiebrakt i en farmasøytisk akseptabel formulering for fremstilling av et preparat for anvendelse in vivo.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en preparat som kan anvendes i en fremgangsmåte for å levere et terapeutisk middel til en målcelle, der fremgangsmåten omfatter å kontakte potensielle målceller med en scTCR eller det multivalent scTCR-kompleks i overensstemmelse med oppfinnelsen under betingelser som muliggjør binding av scTCRen eller multivalent scTCR-kompleks til målcellen, der nevnte scTCR eller multivalent scTCR-kompleks er spesifikt for MHC-peptidkompleksene og har det terapeutiske middelet assosiert dermed.

Spesielt kan et preparat av den løselige scTCR eller det multivalente scTCR-komplekset bli benyttet for å levere terapeutiske midler til stedet der celler presenterer et spesielt antigen. Dette vil være nyttig i mange situasjoner og spesielt mot tumorer. Et terapeutisk middel kan bli levert slik at det vil utøve sin effekt lokalt, men ikke bare på cellen som det binder til. Dermed forespeiler en spesiell strategi antitumormolekyler bundet til T-cellereseptorer eller multivalente scTCR-komplekser som er spesifikke for tumorantigener.

Mange terapeutiske midler kan bli benyttet ved denne anvendelsen, for eksempel radioaktive forbindelser, enzymer (perforin for eksempel) eller kjemoterapeutiske midler (cis-platin for eksempel). For å forsikre at toksiske effekter blir utøvd på den ønskede lokaliseringen, kan toksinet foreligge inne i et liposom som er bundet til streptavidin, slik at forbindelsen blir frigjort sakte. Dette vil forhindre skadelige effekter under transporten i kroppen og forsikre at toksinet har maksimal effekt etter binding av scTCRen til de relevante antigenpresenterende cellene.

Andre passende terapeutiske midler inkluderer:

• småmolekylære cytotoksiske midler, dvs. forbindelser med evnen til å drepe pattedyrceller som har en molekylvekt på mindre enn 700 daltons. Slike forbindelser kan også inneholde toksiske metaller som er i stand til å ha en cytotoksisk effekt. Videre skal det forstås slik at disse småmolekylære, cytotoksiske midlene også inkluderer prolegemidler, dvs. forbindelser som brytes ned eller blir omdannet under fysiologiske betingelser for å frigi cytotoksiske midler. Eksempler på slike midler inkluderer cis-platin, maytansinderivater, rachelmycin, calicheamisin, docetaxel, etopsid, gemcitabin, ifosfamid, irinotecan, melfalan, mitoksantron, sorfimer-natriumfotofrin II, temozolmid, topotecan, trimetreatglukuronat, auristatin E, vincristin og doxorubicin, • peptidcytotoksiner, dvs. proteiner eller fragmenter derav med evnen til å drepe pattedyrceller. Eksempler inkluderer ricin, difteritoksin, pseudomonas bakterielt exotoksin-A, DNAse og RNase, • radionuklider, dvs. ustabile isotoper av elementer som brytes ned med den samtidige utstrålingen av én eller flere av a- og p-partikler eller y-stråler. Eksempler inkluderer jod 131, rhenium 186, indium 111, yttrium 90, vismut 210 og 213, actinium 225 og astatin 213,

• prolegemidler, slik som antistoffrettede enzym prolegemidler,

• immunstimulerende midler, dvs. enheter som stimulerer immunrespons. Eksempler inkluderer cytokiner, slik som IL-2, kjemokiner, slik som IL-8, platefaktor 4, melanomvekststimulatorisk protein osv., antistoffer eller fragmenter derav, komplementaktivatorer, xenogene proteindomener, allogene proteindomener, virus-/bakterieproteindomener og virus-/bakteirepeptider.

Løselige scTCRer eller multivalente scTCR-komplekser ifølge oppfinnelsen kan bli bundet til et enzym som er i stand til å omdanne et prolegemiddel til et legemiddel. Dette gjør prolegemiddelet i stand til å bli omdannet til legemiddelet kun på stedet der det er nødvendig (dvs. som er målsøkt av scTCRen).

Eksempler på passende MHC-peptidmål for scTCRen ifølge oppfinnelsen inkluderer virusepitoper, slik som HTLV-l-epitoper (for eksempel er tax-peptidet, begrenset av HLA-A2, HTLV-1 assosiert med leukemi), HIV-epitoper, EBV-epitoper, CMV-epitoper, melanomepitoper (for eksempel MAGE-1 I-l LA-Al begrenset epitop) og andre kreftspesifikke epitoper (for eksempel nyrecellekarsinomet som er assosiert med antigen G250 begrenset av HLA-A2) og epitoper assosiert med autoimmune forstyrrelser, slik som revmatoid artritt. Ytterligere sykdomsassosierte pMHC-mål som er passende for anvendelse i foreliggende oppfinnelse er listet opp i the I-l LA Factbook (Barclay (red.) Academic Press) og mange andre er i ferd med å bli identifisert.

Lokalisering av legemiddellevering via spesifisiteten til scTCRer kan potensielt øke flertallet av sykdomsbehandlinger.

Virussykdommer som det foreligger legemidler mot, for eksempel HIV, SIV, EBV, CMV, vil kunne dra fordel av at legemiddelet blir frigjort eller aktivert i nærheten av infiserte celler. For kreft vil lokaliseringen i nærheten av tumorer eller metastaser forbedre effekten av toksiner eller immunstimulerende midler. I autoimmune sykdommer kan immunundertrykkende legemidler bli frigitt sakte og ha mer lokal effekt over et lengre tidsrom, mens den totale immunkapasiteten til individet blir påvirket minimalt. Ved forhindringen av transplantatavstøtninger kan effekten av immunundertrykkende legemidler bli optimalisert på samme måte. For va ksi nei eve ring kan vaksineantigenet bli lokalisert i nærheten av antigenpresenterende celler og dermed øke effektiviteten til antigenet. Fremgangsmåten kan også bli benyttet ved synliggjøringshensikter.

scTCRene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet for å modulere T-celleaktivering av binding til spesifikke ligander, slik som pMHC, og derved inhibere T-celleaktivering. Autoimmunsykdommer som involverer T-cellemediert inflammasjon og/eller vevskade, kan bli tilpasset til denne tilnærmingen, for eksempel type I-diabetes. Kjennskap til den spesifikke peptidepitopen som ble presentert av den relevante pMHC, er nødvendig for denne anvendelsen.

Medikamenter i overensstemmelse med oppfinnelsen vil vanligvis bli tilført som en del av et sterilt farmasøytisk preparat som normalt inkluderer en farmasøytisk akseptabel bærer. Dette farmasøytiske preparatet kan foreligge i enhver passende form (avhengig av den ønskede administreringsfremgangsmåten til en pasient). Det kan bli tilveiebrakt i enhetsdoseringsform, vil generelt være tilveiebrakt i en forseglet beholder og kan bli tilveiebrakt som en del av et sett. Et slikt sett vil normalt (selv om det ikke er nødvendig) inkludere instruksjoner for anvendelse. Det kan inkludere et flertall av nevnte enhetsdoseringsformer.

Det farmasøytiske preparatet kan bli tilpasset for administrering på enhver passende måte, for eksempel for oral (inkludert buccal eller sublingval), rektal, nasal, topisk (inkludert buccal, sublingval eller transdermal), vaginal eller parenteral (inkludert subkutan, intramuskulær, intravenøs eller intradermal) administrering. Slike preparater kan bli fremstilt ved hjelp av enhver fremgangsmåte som er kjent på fagområdet for farmasi, for eksempel ved å blande den aktive ingrediensen med bæreren/bærerne eller eksipiensen/eksipiensene under sterile betingelser.

Screeninqsanvendelse

scTCRene ifølge foreliggende oppfinnelse er i stand til å bli benyttet i screeningsfremgangsmåter som er designet for å identifisere modulatorer, inkludert inhibitorer, av den TCR-medierte, cellulære immunsynapsen.

Som kjent for fagfolk på området foreligger det et antall analyseformater som tilveiebringer en hensiktsmessig basis for protein-proteininteraksjonsscreeninger av denne typen.

Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay-systemer, slik som AphaScreen, støtter seg på anvendelsen av "donor"- og "akseptor"-kuler som er belagte med et lag med hydrogel på hvilket reseptor- og ligandproteiner kan bli bundet. Interaksjonen mellom disse reseptor- og ligandmolekylene bringer kulene nær hverandre. Når disse kulene blir utsatt for laserlys, konverterer en fotosensitiv enhet på donorkula, nærliggende oksygen til en mer eksitert enkelttilstand. Enkelttilstandsoksygenmolekylene diffuserer over for å reagere med en kjemiluminescensenhet på akseptorkulen som ytterligere aktiverer fluoroforer som finnes på den sammen kulen. Fluoroforene emitterer deretter lys ved 520-620 nanometer, og dette signaliserer at reseptor-ligandinteraksjonen har forekommet. Tilstedeværelsen av en inhibitor av reseptor-ligandeinteraksjonen gjør at dette signalet reduseres.

Surface Plasmon Resonance (SPR) er en optisk interfaseanalyse der én bindingspartner (normalreseptoren) blir immobilisert på en "brikke" (sensoroverflaten) og bindingen av den andre bindingspartneren (normalt liganden) som er løselig, og som blir ledet til å flyte over brikken, blir påvist. Bindingen av liganden fører til en økning i konsentrasjon av protein nær brikkens overflate, noe som fører til en endring i den refraktive indeksen i den regionen. Overflaten på brikken blir sammensatt slik at endringen i refraktiv indeks kan bli påvist ved hjelp av surface plasmon resonance, et optisk fenomen hvorved lys ved en viss inngangsvinkel på en tynn metallfilm forårsaker en reflektert stråle med redusert intensitet som skyldes resonanseksitasjon av bølger av oscillerende overflateladningstetthet (surface plasmons). Resonansen er svært sensitiv overfor endringer i den referaktive indeksen på den andre siden av metallfilmen, og det er dette signalet som blir benyttet for å påvise binding mellom de immobiliserte og de løselige proteinene. Systemer som tillater hensiktsmessig anvendelse av SPR-deteksjon av molekylære interaksjoner og dataanalyse er kommersielt tilgjengelige. Eksempler er Iasys-maskiner (Fisons) og Biacore-maskinene.

Andre interfaseoptiske analyser inkluderer total internal reflectance fluorescence (TIRF), resonant mirror (RM) og optical grating coupler sensor (GCS) og er diskutert mer detaljert i Woodbury and Venton (J. Chromatog. B. 725 113-137 (1999)). Scintillasjons-proksimitetsa na lysen (SPA) er blitt benyttet for å screene forbindelsesbiblioteker for inhibitorer av lavaffinitetsinteraksjonen mellom CD28 og B7 (Kder sannsynligvis i området 4 uM (Van der Merwe et al. J. Exp. Med. 185:393-403 (1997), Jenh et al., Anal Biochem 165(2)287-93 (1998)). SPA er en radioaktiv analyse som gjør bruk av betapartikkel-emisjon fra visse radioaktive isotoper som overfører energi til scintillator som er immobilisert på indikatoroverflaten. Den korte rekkevidden til betapartiklene i løsning sikrer at scintillasjon bare forekommer når betapartiklene blir emittert i nærhet av scintillatoren. Når den blir benyttet til deteksjon av protein-proteininteraksjoner blir en interaksjonspartner merket med radioisotopen, mens den andre enten blir bundet til kuler som inneholder scintillator eller belagt på en overflate sammen med scintillator. Hvis analysen kan bli satt opp optimalt, vil radioisotopen bli brakt nært nok inntil scintillatoren slik at fotonemisjon kan bli aktivert kun når binding mellom de to proteinene forekommer.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å identifisere en inhibitor av interaksjonen mellom en scTCR og en TCR-ligand valgt fra MHC-peptidkomplekser, CDl-antigenkomplekser, superantigener og MHC-peptid/-superantigen-komplekser omfattende å kontakte scTCRen med en scTCR-ligandbindingspartner i nærvær av, og i fravær av, en testforbindelse, og bestemme hvorvidt nærværet av testforbindelsen reduserer binding av scTCRen til liganden, der en slik reduksjon blir tatt som en identifisering av en inhibitor.

Et siste aspekt av forbindelsen er en fremgangsmåte for å identifisere en potensiell inhibitor av interaksjonen mellom en scTCR og TCR-ligand valgt fra MHC-peptidkomplekser, CDl-antigenkomplekser, superantigener og MHC-peptid/superantigen-komplekser omfattende å kontakte scTCR eller scTCR-ligandbindingspartneren med en testforbindelse og bestemme hvorvidt testforbindelsen binder til scTCRen og/eller liganden, der slik binding blir tatt som en identifikasjon på en potensiell inhibitor. Dette aspektet av oppfinnelsen kan finne spesiell anvendelse i interfaseoptiske analyser, slik som de som blir utført ved å benytte BIAcore-systemet.

Eksempler

Oppfinnelsen er ytterligere beskrevet i de følgende eksemplene.

I det følgende blir referanse gjort til de medfølgende tegningene der:

Figurene la og lb henholdsvis viser nukleinsyresekvensen til a- og p-kjedene til en løselig A6 TCR som er mutert for å introdusere et cysteinkodon. Skyggeleggingen indikerer de introduserte cysteinkodons, Figur 2a viser A6-TCR-a-kjede-ekstracellulæraminosyresekvensen, inkludert T48->C-mutasjonen (understreket) benyttet for å produsere den nye disulfidinterkjede- bindingen, og figur 2b viser A6 TCR-p-kjede-ekstracellulæraminosyresekvensen, inkludert S57->C-mutasjonen (understreket) benyttet til å produsere den nye disulfidinterkjede-bindingen,

Figur 3 viser DNA- og aminosyresekvensen til Gly/Ser-linkeren (30mer)

Figur 4 oppsummerer kloningsstrategien som er benyttet for å produsere scDiS A6 TCR.

Figur 5a viser DNA-sekvensen til scDiS A6 TCR.

Figur 5b viser aminosyresekvensen til scDiS A6 TCR.

Figur 6 illustrerer elueringen av scDiS A6 TCR-protein fra en POROS 50HQ-ionebytterkolonne ved å benytte en 0-500 mM NaCI-gradient, som indikert ved den rette linjen, Figur 7 viser resultatet av både reduserende SDS-PAGE (coomassie-farget) og ikke-reduserende SDS-PAGE (coomassie-farget) geler av fraksjonene A15, B10, B9 og B3 fra kolonnekjøringen som er illustrert i figur 6. Fraksjonene B9 og B10 inneholder klart protein som tilsvarer den forventede størrelsen på scDiS A6 TCR. Figur 8 illustrerer elueringen av scDiS A6 TCR-eluering fra en Superdex 200 gelfiltreringskolonne av fraksjonene B10-B7 fra ionebytterkolonnekjøringen som er vist i figur 6. Figur 9 viser resultatet av både reduserende SDS-PAGE (coomassie-farget) og ikke-reduserende SDS-PAGE (coomassie-farget) geler av fraksjonene B8, B7, B3 og B2 fra gelfiltreringskolonnekjøringen som er illustrert i figur 8. Fraksjon B7 inneholder åpenbart protein som tilsvarer den forventede størrelse for scDiS A6 TCR, Figur 10 er en siste gelfiltreringskjøring i BIAcore-buffer av de konsentrerte fraksjonene B9-B6 av gelfiltreringskjøringen som er vist i figur 8. scDiS A6 TCR eluerer som en enkelt stor topp, Figur 11 viser BIAcore-data for binding av scDiS A6 TCR til HLA-A2 TAX,

Eksempel 1 - design av primere og mutaqenese av A6- tax- TCR- a- og - B- kieder for å introdusere cvsteinresidiene som er nødvendige for dannelsen av en nv interkiededisulfidbinding

For å mutere A6-tax-treonin 48 i ekson 1 i TRAC<*>01 til cystein, ble de følgende primerne designet (mutasjon er vist med små bokstaver):

For å mutere A6 tax serin 57 i ekson 1 i både TRBC1<*>01 og TRBC2<*>01 til cystein, ble de følgende primerne designet (mutasjon er vist med små bokstaver):

PCR- mutaqenese

Ekspresjonsplasmidet inneholdende genene for A6-tax-TCR-a- eller -B-kjeden ble mutert ved å benytte a-kjedeprimerne eller B-kjedeprimerne på følgende måte. 100 ng plasmid ble blandet med 5 ul 10 Mm dNTP, 25 ul lOxPfu-buffer (Stratagene), 10 enheter Pfu-polymerase (Stratagene) og sluttvolumet ble justert til 240 ul med H20. 48 ul av denne blandingen ble tilsatt primere fortynnet til å gi en sluttkonsentrasjon på 0,2 uM i 50 ul sluttreaksjonsvolum. Etter et første denatureringstrinn på 30 sekunder ved 95 °C ble reaksjonsblandingen utsatt for 15 runder med denaturering (95 °C, 30 sek.), annealing (55 °C, 60 sek.) og elongering (73 °C, 8 min.) i en hybaid-PCR-ekspress-PCR-maskin. Produktet ble deretter fordøyd i 5 timer ved 37 °C med 10 enheter Dpnl-restriksjonsenzym (New England Biolabs). 10 ul av den fordøyde reaksjonsblandingen ble transformert inn kompetente XL-l-blue-baketerier og dyrket i 18 timer ved 37 °C. En enkeltkoloni ble plukket og dyrket over natt i 5 ml TYP + ampicillin (16 g/l bacto-trypton, 16 g/l gjær-ekstrakt, 5 g/l NaCI, 2,5 g/l K2HP04, 100 mg/l ampicillin). Plasmid-DNA ble renset på en Qiagen-miniprepkolonne i henhold til forhandlers instruksjoner, og sekvensen ble bekreftet ved hjelp av automatisert sekvensering på sekvenseringsfasiliteten til Department of Biochemistry, Oxford University. De respektive, muterte nukleinsyre- og aminosyresekvensene er vist i figurene la og 2a for a-kjeden og figurene lb og 2b for B-kjeden.

Eksempel 2 - design, uttrvkkinq og testing av en enkeltkiede- A6- TCR som inneholder en nv disulfidinterkiedebinding

Ekspresjonsvektorene inneholdende DNA-sekvensene til de muterte A6 TCR a-og B-kjedene som inneholder de ytterligere cysteinresidiene som er nødvendige for dannelsen av en ny disulfid som er fremstilt i eksempel 1 og som vist i figurene la og lb, ble benyttet som basisen for fremstillingen av en enkeltkjede-A6 TCR, med unntaket av at stoppkodonet (TAA) var fjernet fra enden av a-kjedesekvensen på følgende måte: scDiS A6 TCR inneholder en linkersekvens på 30 aminosyrer mellom C-terminalen til TCR-a-kjeden og N-terminalen til B-kjeden. Figur 3 viser DNA- og aminosyresekvensen til denne linkeren. Kloningsstrategien som ble benyttet for å fremstille scDiS A6 TCRen er summert i figur 4.

Kort fortalt, ble alfa- og beta-kjedene i A6-dsTCRen amplifisert ved PCR ved å benytte primere som inneholder restriksjonsseter som vist i figur 4, dvs.:

De to fragmentene som derved ble fremstilt ble sammensydd med PCR ved å benytte de 5' alfa- og 3' betaprimerne for å gi en enkeltkjede-TCR med en kort linker inneholdende Xmal-BamHI-Apal-setene. Dette fragmentet ble klonet inn i pGMT7. Fullengdelinkeren ble deretter innsatt i to trinn, først ble et fragment på 42bp innsatt ved å benytte Xmal og BamHI-setene:

Deretter ble et fragment på 48 bp innsatt ved å benytte BamHI- og Apal-setene for å danne en linker på 90 bp mellom 3' ende på alfakjeden og 5' ende på betakjeden. 48 bp-fragmentet ble fremstilt ved hjelp av PCR-forlengning av en blanding av de følgende oligoer:

Produktet av denne forlengningen ble fordøyd med BamHI og Apal og ligert inn i det fordøyde plasmidet inneholdende linkerfragmentet på 42 bp. Den komplette DNA- og aminosyresekvensen til scDiS A6 TCRen er vist figurene 5a og 5b.

Uttvkkina oa rensing av enkeltkiededisulfidbundet A6- TCR:

Ekspresjonsplasmidet inneholdende enkeltkjededisulfidbundet A6 TCR ble transformert inn i f.co//-stammen BL21pLysS, og enkelte ampicillinresistente kolonier ble dyrket ved 37 °C i TYP (ampicillin 100ug/ml) medium til OD600på 0,4 før proteinuttrykking ble indusert med 0,5 mM IPTG. Celler ble høstet tre timer etter induksjon ved sentrifugering i 30 minutter ved 4 000 rpm i en Beckmann J-6B. Cellepelleter ble resuspendert i en buffer inneholdende 50 mM tris-HCI, 25 % (w/v) sukrose, 1 mM NaEDTA, 0,1 % (w/v) NaAzid, 10 mM DTT, pH 8,0. Etter et over-natt-trinn med frysing - tining, ble resuspenderte celler sonikert i 1 minutts pulser i totalt omtrent 10 minutter i en milsonix XL2020-sonikator ved å benytte en standard 12 mm- diameter- probe. Inklusjonslegeme-pelleter ble fremskaffet ved sentrifugering i 30 minutter ved 13 000 rpm i en Beckmann J2-21-sentrifuge. Tre detergentvaskinger ble deretter utført for å fjerne celleavfall og membrankomponenter. Hver gang ble inklusjonslegemepelleten homogenisert i en triton- buffer (50 mM tris-HCI, 0,5 % triton-X100, 200 mM NaCI, 10 mM NaEDTA, 0,1 % (w/v) NaAzid, 2 Mm DTT, pH 8,0) før den ble spunnet ned ved sentrifugering i 15 minutter ved 13 000 rpm i en Beckmann J2-21. Detergent og salt ble deretter fjernet ved hjelp av en lignende vasking i følgende buffer: 50 mM tris-HCI, 1 mM NaEDTA, 0,1 % (w/v) NaAzid, 2 mM DTT, pH 8,0. Til slutt ble inklusjonslegemene delt i like volumer på 30 mg og frosset ned ved -70 °C. Inklusjonslegemeproteinutbytte ble kvantifisert ved å løseliggjøre med 6 M guanidin-HCI og målinger med en Bradford-fargebindingsanalyse (PerBio).

Omtrent 15 mg av den løseliggjorte inklusjonslegemekjeden ble tint fra frosne stokkløsninger. Inklusjonslegemene ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 5 mg/ml i 6 M guanidinløsning og DTT (2 M stokkløsning) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 mM. Blandingen ble inkubert ved 37 °C i 30 minutter. 1 liter av den følgende refoldingsbufferen: 100 mM tris pH 8,5, 400 mM L-Arginin, 2 mM EDTA, 5 mM redusert glutation, 0,5 mM oksidert glutation, 5 M urea, 0,2 mM PMSF ble fremstilt og rørt kraftig ved 5°C ± 3 °C. Redoksparet (2-merkaptoetylamin og cystamin, henholdsvis til sluttkonsentrasjoner på 6,6 mM og 3,7 mM) ble tilsatt omtrent 5 minutter før tilsetting av de denaturerte TCR-kjedene. Proteinet ble deretter tilsatt for å refolde i omtrent 5 timer ± 15 minutter med røring ved 5 °C ± 3 °C. Refoldingen ble deretter dialysert to ganger, først mot 10 liter 100 mM urea, deretter mot 10 liter 100 mM urea, 10 mM tris pH 8,0. Begge refoldings- og dialysetrinn ble utført ved 6-8 °C.

scTCR ble separert fra degraderingsprodukter og urenheter ved å sette den dialyserte refoldingsløsningen på en POROS 50 HQ anionbytterkolonne og eluere bundet protein med en gradient av 0-500 mM NaCI over 50 kolonnevolumer ved å benytte en aktarenser (Pharmacia) som i figur 6. Toppfraksjoner ble lagret ved 4 °C og analysert med coomassiefarget SDS-PAGE (figur 7) før det ble sammenslått og konsentrert. sTCRen ble deretter renset og kjennetegnet ved å benytte en Superdex 200HR gelfiltreringskolonne (figur 8) prebalansert i HBS-EP-buffer (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCI, 3,5 mM EDTA, 0,05 % nonidet p40). Toppfraksjoner ble lagret ved 4 °C og analysert med coomassiefarget SDS-PAGE (figur 9) før det ble sammenslått og konsentrert. Til slutt ble konsentrerte fraksjoner B9-B6 kjørt gjennom et annet gelfiltreringstrinn for å fremstille renset protein i BIAcore buffer, figur 10). Toppen som eluerte ved en relativ molekylvekt på omtrent 50 kDa ble sammenslått. Dette ble konsentrert før karakterisering ved BIAcore surface plasmon resonance analyse.

Eksempel 3 - BIAcore- surface- plasmon- resonance- karakteriserinq av scTCR- bindinq til HLA- A2- tax

En surface plasmon resonance biosensor (BIAcore 3000) ble benyttet for å analysere bindingen av A6 scTCR til sin peptid-MHC-ligand (HLA-A2-tax). Dette ble fremmet ved å fremstille enkeltstående pMHC-komplekser (beskrevet nedenfor) som ble immobilisert på en streptavidinbelagt bindingsoverflate på en semiorientert måte, som tillot effektiv testing av bindingen av en løselig T-cellereseptortil opp til fire ulike pMHC (immobilisert på separate flowceller) samtidig. Manuell injeksjon av HLA-kompleks gjør at det presise nivået av immobiliserte klasse I-molekyler kan bli manipulert enkelt.

Slike immobiliserte komplekser er i stand til å binde både T-cellereseptorer og koreseptoren CD8aa, der begge kan bli injisert i den løselige fasen.

Biotinylerte klasse-I-HLA-A2-tax-komplekser ble refoldet in vitro fra bakterielt uttrykte inklusjonslegemer inneholdende de tilhørende subenhetsproteinene og det syntetiske peptid, etterfulgt av rensing og in wfro-enzymatisk biotinylering (0'Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266:9-15). HLA-tungkjede ble uttrykt med et C-terminalt biotinyleirngsmerke som erstatter transmembran- og cytoplasmadomenene til proteinet i en passende konstruksjon. HLA-lettkjeden eller B2-mikroglobulin ble også uttykt som inklusjonslegemer i E. coli fra en passende konstruksjon, ved et nivå på~500 mg/liter bakteriekultur.

E.co//-celler ble lysert og inklusjonslegemet ble renset til omtrent 80 % renhet. Protein fra inklusjonslegemer ble denaturert i 6 M guanidin-HCI, 50 mM tris pH 8,1, 100 mM NaCI, 10 mM DTT, 10 mM EDTA og ble refoldet ved en konsentrasjon på

30 mg/liter tungkjede, 30 mg/liter B2m i 0,4 M L-arginin-HCI, 100 mM tris pH 8,1,

3,7 mM cystamin, mM cysteamin, 4 mg/ml peptid (foreksempel tax 11-19) ved tilsetning av en enkelt puls med denaturert protein i refoldingsbuffer ved <5 °C. Refolding ble tillatt å bli fullstendig ved 4 °C i minst én time.

Buffer ble byttet ved dialyse i 10 volumer med 10 mM tris pH 8,1. To utskiftninger av buffer var nødvendig for å redusere ionestyrken til løsningen tilstrekkelig. Proteinløsningen ble deretter filtrert gjennom et 1,5 um celluloseacetatfilter og satt på en POROS 50HQ-anionbytterkolonne (8 ml volum) Protein ble eluert med en lineær

0-500 mM NaCI-gradient. HLA-A2-peptidkompleks eluerte ved omtrent 250 mM NaCI, og toppfraksjoner ble samlet, en cocktail av proteaseinhibitorer (Calbiochem) ble tilsatt og fraksjonene ble avkjølt på is.

Biotinyleirngsmerkede HLA-komplekser ble bufferbyttet i 10 mM tris pH 8,1, 5 mM NaCI ved å benytte en rask avsaltingskolonne fra Pharmacia som var balansert i den samme bufferen. Rett etter eluering ble de proteininneholdende fraksjonene avkjølt på is, og proteaseinhibitorcoctail (Calbiochem) ble tilsatt. Biotinyleringsreagenser ble deretter tilsatt: 1 mM biotin, 5 mM ATP (bufret til pH 8), 7,5 MgCI2 og 5ug/ml BirA-enzym (renset i overensstemmelse med 0'Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Blandingen ble deretter tillatt å inkubere ved romtemperatur over natt.

Biotinylerte HLA-komplekser ble renset ved å benytte gelfiltreringskromatografi. En Superdex 75 HR 10/30-kolonne fra Pharmacia ble forhåndsbalansert med filtrert PBS og en 1 ml av biotinyleringsreaksjonsblandingen ble påsatt, og kolonnen ble utviklet med PBS ved 0,5 ml/min. Biotinylerte HLA-komplekser eluerte som en enkelt topp ved omtrent 15 ml. Fraksjoner som inneholdt protein ble slått sammen, avkjølt på is og proteaseinhibitor coctail ble tilsatt. Proteinkonsentrasjon ble bestemt ved å benytte en coomassiebindings-analyse (PerBio) og like volumer av biotinylerte HLA-komplekser ble lagret frosset ved -20 °C. Streptavidin ble immobilisert ved hjelp av standard aminkoblingsfremgangsmåter.

Interaksjoner mellom A6 tax scTCR inneholdende en ny interkjedebinding og dens ligand/MHC-kompleks eller en irrelevant HLA-peptidkombinasjon, produksjon av hvilke er beskrevet ovenfor, ble analysert på en BIAcore 3000 surface plasmon resonance (SPR) biosensor. SPR måler endringer i refraktiv indeks uttrykt i responsen heter (RU) nær en sensoroverflate i en liten flowcelle, et prinsipp som kan bli benyttet for å påvise reseptoriigandinteraksjoner og for å analysere deres affinitet og kinetiske parametere. Probeflowcellene ble klargjort ved å immobilisere de individuelle HLA-peptidkompleksene i separate flowceller via binding mellom biotinet, kryssbundne på B2m og streptavidin som har blitt kjemisk kryssbundet til den aktiverte overflaten på flowcellene. Analysen ble deretter utført ved å passere scTCR over overflatene i de ulike flowcellene ved en konstant strømningsrate, og måle SPR-responsen ved å utføre dette. Injeksjoner av løselig scTCR ved konstant strøm ningsrate og ulike konsentrasjoner over peptid-HLA-komplekset ble benyttet for å definere bakgrunnsresonansen. Verdiene på disse kontrollmålingene ble trukket fra verdiene som ble oppnådd med spesifikt peptid-HLA-kompleks og benyttet for å beregne bindingsaffiniteter uttrykt som dissosieringskonstanten, Kd (Price & Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2. utgave) 1979, Clarendon Press, Oxford).

BIAcore analysen av scDiS A6 TCR viste at dette molekylet bandt spesifikt til sin relaterte ligand (HLA-A2-tax) med en kd på 12,4 ± 1,62 |aM.

Claims (28)

1. Enkeltkjede-T-celle reseptor (scTCR), karakterisert vedat den omfatter et a-segment som utgjøres av en TCR-a-kjedes variabel region sekvens fusjonert med N-terminalen til en TCR-a-kjedes konstant region ekstracellulærsekvens, et B-segment som utgjøres av en TCR-B-kjedes variabel region fusjonert med N-terminalen til en TCR-B-kjedes konstant region ekstracellulærsekvens, og en linkersekvens som binder sammen C-terminalen til a-segmentet med N-terminalen til B-segmentet, eller vise versa, hvor konstant regionens ekstracellulærsekvenser til a- og B-segmentene er bundet sammen med en disulfid-binding mellom cysteinrester som er substituert for: Thr 48 i ekson 1 av TRAC<*>01 og Ser 57 i ekson 1 av TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01; Thr 45 i ekson 1 av TRAC<*>01 og Ser 77 i ekson 1 av TRBCI<*>01 eller TRBC2<*>01; Tyr 10 i ekson 1 av TRAC<*>01 og Ser 17 i ekson 1 av TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01; Thr 45 i ekson 1 avTRAC<*>01 og Asp 59 i ekson 1 avTRBCl<*>01 eller TRBC2<*>01; eller Ser 15 i ekson 1 av TRAC<*>01 og Glu 15 i ekson 1 av TRBC1<*>01 eller TRBC2<*>01. der lengden til linkersekvensen og posisjonen til disulfid-bindingen er slik at variabel region sekvensene til a- og B-segmentene er gjensidig orientert, vesentlig som i native aB-T-cellereseptorer.

2. scTCR ifølge krav 1, hvor (a) a-segmentet er den variable regionen på en TCR fusjonert med N-terminalen på det ekstracellulære domenet til a-kjedens konstante region på en TCR-a-kjede, og/eller (b) B-segmentet er den variable regionen på en TCR-B-kjede fusjonert med en N-terminalen til det ekstracellulære domenet på den konstante regionen til en TCR-B-kjede.

3. scTCR ifølge krav 1 eller krav 2, hvor konstant region ekstracellulærsekvensene som er til stede i a- og B-segmentene tilsvarer konstant regionene på a- og B-kjedene i en nativ TCR trunkert på deres C-terminale ende, slik at cysteinrestene som danner den native interkjede disulfid-bindingen i TCRen er ekskludert.

4. scTCR ifølge krav 1 eller krav 2, hvor konstant region ekstracellulærsekvensene som foreligger i a- og B-segmentene tilsvarer konstant regionene i a- og B-kjedene til en nativ TCR der cysteinrestene som danner den native interkjede disulfid-bindingen, er substituert med en annen aminosyrerest.

5. scTCR ifølge krav 4, hvor nevnte cysteinrester er substituert med serin eller alanin.

6. scTCR ifølge ethvert av de foregående krav, hvor linkersekvensen har formelen -P-AA-P-, der P er prolin og AA representerer en aminosyresekvens der aminosyrene er glysin og serin.

7. scTCR ifølge ethvert av de foregående krav, hvor linkersekvensen binder sammen C-terminalen på a-domenet og N-terminalen på B-domenet.

8. scTCR ifølge krav 7, hvor linkersekvensen består av fra 26 til 41 aminosyrer.

9. scTCR ifølge krav 7, hvor linkersekvensen består av 29, 30, 31 eller 32 aminosyrer.

10. scTCR ifølge krav 7, hvor linkersekvensen består av 33, 34, 35 eller 36 aminosyrer.

11. scTCR ifølge krav 7, hvor linkersekvensen er -PGGG-(SGGGG)5-P-, der P er prolin, G er glysin og S er serin.

12. scTCR ifølge krav 7, hvor linkersekvensen er -PGGG-(SGGGG)6-P-, der P er prolin, G er glysin og S er serin.

13. scTCR ifølge ethvert av de foregående krav, hvor en uparet cysteinrest som er til stede i nativ TCR-B-kjede ikke er til stede.

14. scTCR ifølge ethvert av de foregående krav, hvor TCR-a- og -B-kjedenes variabel region sekvenser som er til stede i a- og B-segmentene sammen tilsvarer det funksjonelle, variable domenet i en første TCR, og TCR-a- og -B-kjedenes konstant region ekstracellulærsekvenser som er til stede i a- og B-segmentene, tilsvarer de i en andre TCR, der den første og den andre TCR stammer fra samme art.

15. scTCR ifølge ethvert av kravene 1 til 13, hvor TCR-a- og -B-kjedenes variabel region-sekvenser som er til stede i a- og B-segmentene, sammen tilsvarer det funksjonelle, variable domenet i en første TCR, og TCR-a- og -B-kjedenes konstant region ekstracellulærsekvenser som er til stede i a- og B-segmentene, tilsvarer de i en andre TCR, der den første og den andre TCR stammer fra samme art.

16. scTCR ifølge krav 15, hvor TCR-a- og -B-kjedenes variabel region sekvenser som er til stede i a- og B-segmentene, sammen tilsvarer det funksjonelle, variable domenet i en human TCR, og TCR-a- og -B-kjedenes konstant region ekstracellulærsekvenser som er til stede i a- og B-segmentene, tilsvarer de i en muse-TCR.

17. scTCR ifølge krav 1 til 14, hvor TCRen er en som binder et peptid-MHC-kompleks.

18. scTCR ifølge krav 17, hvor TCRen er en som binder et CDl-antigenkompleks.

19. scTCR ifølge krav 1 til 14, hvor TCRen er en som binder et superantigen eller et peptid-MHC/superantigen-kompleks.

20. Multivalent T-celle reseptor (TCR)-kompleks, karakterisert vedat det omfatter et flertall av scTCRer ifølge ethvert av de foregående krav.

21. scTCR ifølge ethvert av kravene 1 til 19 eller et kompleks ifølge krav 20, hvor den er kovalent bundet til et terapeutisk middel.

22. scTCR ifølge ethvert av kravene 1 til 19 eller 21 eller et flertall derav, hvor den er bundet til en partikkel eller kule.

23. Preparat, karakterisert vedat det omfatter en scTCR ifølge ethvert av de foregående krav og en farmasøytisk akseptabel bærer.

24. Fremgangsmåte for å påvise en TCR-ligand som er valgt fra MHC-peptidkomplekser, CDl-antigenkomplekser, superantigener og MHC-peptid/superantigen-komplekser,karakterisert vedat den omfatter å: tilveiebringe en scTCR ifølge ethvert av kravene 1 til 19 eller et flertall derav, kontakte scTCRen med TCR-liganden og påvise binding av scTCRen til liganden.

25. Fremgangsmåte for å identifisere en inhibitor av interaksjonen mellom en scTCR ifølge ethvert av kravene 1 til 19, eller et flertall derav, og en TCR-ligand som er valgt fra MHC-peptidkomplekser, CDl-antigenkomplekser, superantigener og MHC-peptid/superantigen-komplekser, karakterisert vedat den omfatter å kontakte scTCRen med en scTCR-ligandbindingspartner i nærvær av, og i fravær av, en testforbindelse og bestemme hvorvidt nærværet av testforbindelsen reduserer binding av scTCRen til TCR-liganden, der en slik reduksjon blir tatt som bevis på at en inhibitor er identifisert.

26. Fremgangsmåte for å identifisere en potensiell inhibitor av interaksjonen mellom en scTCR ifølge ethvert av kravene 1 til 19, eller et flertall derav, og en TCR-ligand som er valgt fra MHC-peptidkomplekser, CDl-antigenkomplekser, superantigener og MHC-peptid/- superantigen-komplekser, karakterisert vedat den omfatter å kontakte scTCRen eller scTCR-ligandbindingspartneren med en testforbindelse og bestemme hvorvidt testforbindelsen binder til scTCRen og/eller TCR-liganden, der en slik binding blir tatt som bevis på at en potensiell inhibitor er identifisert.

27. Nukleinsyre-molekyl, karakterisert vedat det omfatter en sekvens som koder for en scTCR ifølge ethvert av kravene 1 til 19, eller en sekvens som er komplementær dertil.

28. Vektor, karakterisert vedat den omfatter et nukleinsyre-molekyl ifølge krav 27.