CN113840834A

CN113840834A - Magea1特异性t细胞受体及其用途

Info

Publication number: CN113840834A
Application number: CN202080036468.XA
Authority: CN
Inventors: 卡里娜·韦纳; 马诺·韦斯; 西尔克·拉菲格斯特; 安雅·莫施
Original assignee: Medigene Immunotherapies GmbH
Current assignee: Medigene Immunotherapies GmbH
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2020-04-01
Publication date: 2021-12-24
Also published as: AU2020255249A1; EA202192726A1; WO2020201318A1; EP3947435A1; TW202102530A; JP7483746B2; CA3135306A1; US20230037552A1; JP2022527813A

Abstract

本发明涉及对MAGEA1衍生肽特异的分离的T细胞受体(TCR)和包含TCR的功能部分的多肽。进一步涉及多价TCR复合物、编码TCR的核酸、表达TCR的细胞和包含TCR的药物组合物。本发明还涉及用作药物的TCR，特别是用于治疗癌症的TCR。

Description

MAGEA1特异性T细胞受体及其用途

技术领域

背景技术

MAGEA1，也称为黑色素瘤相关抗原1(Melanoma-Associated Antigen 1)，是编码许多彼此具有高度同源性的蛋白质的MAGEA基因家族的成员。MAGEA抗原属于癌症/睾丸抗原(CTA)家族，并且是第一种在分子水平上鉴定的人类肿瘤相关抗原(Science 1991.254:1643-1647/再版于J.Immunol.2007；178:2617-2621)。MAGEA基因家族包括位于染色体Xq28上的12种高度同源的基因。它们的表达在不同组织学来源的癌症中始终能检测到，例如非小细胞肺癌、膀胱癌、食道癌、头颈癌和肉瘤，以及骨髓瘤、某些类型的乳腺癌，并且还在生殖细胞中检测到(Front Med(Lausanne).2017；4:18.)。MAGEA1是一种细胞溶质/细胞质蛋白，并且衍生自MAGEA1蛋白的肽在MHC I类背景下(即HLA分子上)呈递。更具体地，MAGEA1衍生表位在HLA-A2分子上呈递，表明了抗原免疫原性和作为癌症免疫治疗靶标的这种适用性。在免疫治疗领域已经靶向MAGEA蛋白进行了的大量临床试验(clinicaltrials.gov)。MAGEA1在多种肿瘤实体如黑色素瘤和肺癌(Lancet Oncol 2003；4:104–09)和大量患者中的表达与所描述的抗原免疫原性的组合使得MAGEA1成为T细胞介导的免疫治疗的有希望的靶标。使用过继细胞转移(ACT)的癌症免疫治疗的原理能够利用患者自身的免疫***进行高度肿瘤特异性的癌症治疗。ACT使用离体扩增的自体(患者来源的)T细胞，该细胞经遗传改造以表达对源自细胞内蛋白(例如MAGEA1)的限定表位具有特异性的T细胞受体(TCR)。因此，仍然需要仅靶向肿瘤特异性/限制性抗原MAGEA1并因此具有用于癌症免疫治疗的特殊潜力的高效TCR。因此，需要针对这种靶向MAGEA1的特异性TCR。

发明内容

本发明的一个目的是提供对MAGEA1特异的T细胞受体(TCR)。

在一个具体实施方案中，分离的TCR包含：包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的TCRα链，包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3的TCRβ链。

TCR特异性识别氨基酸序列SEQ ID NO:1或其片段。

在具体实施方案中，TCR特异性识别SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HLA-A2和/或HLA-A26结合形式，优选HLA-A2结合形式。更具体地，TCR特异性识别由选自由HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:04、HLA-A*02:16、HLA-A*02:17和HLA-A*26:01组成的组的基因编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，更优选地TCR特异性识别由选自由HLA-A*02:01、HLA-A*02:04、HLA-A*02:16和HLA-A*02:17组成的组的基因编码的分子呈递的SEQ IDNO:1的氨基酸序列，甚至更优选地TCR特异性识别由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ IDNO:1的氨基酸序列。

本发明的TCR特别有用，因为其表现出高肿瘤细胞识别能力、高肿瘤细胞杀伤能力和高功能亲合力。此外，TCR没有表现出Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的大量分泌，这有利于有效的肿瘤消退。

优选地，TCR不具有与其它MAGEA家族成员的交叉反应性。

本发明的另一个目的是提供表达对MAGEA1特异的功能性TCR的T细胞。

根据本发明的TCR是分离的和/或纯化的并且可以是可溶的或膜结合的。

在一些实施方案中，TCR的氨基酸序列可包含一个或多个表型沉默替换。此外，本发明的TCR可以被标记。有用的标记是本领域已知的并且可以使用常规方法，任选地通过各种长度的接头与TCR或TCR变体偶联。术语“标记”或“标记基团”是指任何可检测标记。另外或替代地，可以对氨基酸序列进行修饰以包含治疗剂或药代动力学修饰部分。治疗剂可选自由免疫效应分子、细胞毒剂和放射性核素组成的组。免疫效应分子可以是例如细胞因子。药代动力学修饰部分可以是至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团或其组合。

根据本发明的TCR，特别是TCR的可溶形式，可以通过连接额外的功能部分进行修饰，例如用于降低免疫原性、增加流体动力学尺寸(溶液中的尺寸)、溶解度和/或稳定性(例如通过增强对蛋白水解降解的保护)和/或延长血清半衰期。其它有用的功能部分和修饰包括“***”或“安全开关”，其可用于关闭或打开患者体内携带本发明TCR的效应宿主细胞，或者关闭或打开转基因TCR本身。本文还设想了具有改变的糖基化模式的TCR。

还可以想到将药物或治疗实体(例如小分子化合物)添加到TCR，特别是添加到本发明TCR的可溶形式。

TCR，特别是本发明TCR的可溶形式，可以被另外修饰以引入有助于鉴定、追踪、纯化和/或分离相应分子的额外结构域(标签)。

在一些实施方案中，TCR为单链类型，其中TCRα链和TCRβ链通过接头序列连接。

本发明的另一方面涉及包含如本文所述的TCR的功能部分的多肽，其中功能部分包含SEQ ID NO:4和7的氨基酸序列中的一个，优选地其中功能部分包含氨基酸序列SEQ IDNO:2、3、4和5、6、7。

在具体实施方案中，功能部分包含TCRα可变链和/或TCRβ可变链。

具体实施方案涉及包含至少两个如本文所述的TCR的多价TCR复合物。在更具体的实施方案中，所述TCR中的至少一个与治疗剂相缔合。

一些实施方案涉及在效应细胞，特别是在免疫效应细胞上表达为功能性多肽或功能性多价多肽的本发明TCR，其中在与氨基酸序列SEQ ID NO:2的HLA-A2结合形式结合后，在表达TCR的前述效应细胞中诱导IFN-γ分泌。

本发明的另一方面涉及编码如本文所述的TCR或编码如上文所述的多肽的核酸。

本发明的另一方面涉及包含如上所述的本申请的核酸的质粒或载体。优选地，载体是表达载体，或适合于细胞，尤其是真核细胞的转导或转染的载体。载体可以是例如逆转录病毒载体，例如γ-逆转录病毒或慢病毒载体。

本发明的另一方面涉及表达如本文所述的TCR的细胞。细胞可以是分离的原代细胞或非天然存在的。

本发明的另一方面涉及包含如上所述的核酸或如上所述的质粒或载体的细胞。更具体地，细胞可以包含：

a)包含至少一种如上所述的核酸的表达载体，或

b)包含编码如本文所述的TCR的α链的核酸的第一表达载体，以及包含编码如本文所述的TCR的β链的核酸的第二表达载体。

细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。通常，细胞是免疫效应细胞，特别是T细胞。其它合适的细胞类型包括γ-δT细胞和NK样T细胞和NK细胞，无论是修饰的还是未修饰的。

另一方面涉及特异性结合如本文所述的TCR的介导对MAGEA1的特异性的部分的抗体或其抗原结合片段。在一个具体实施方案中，TCR的介导MAGEA1特异性的部分包含SEQ IDNO:4的α链CDR3和/或SEQ ID NO:7的β链CDR3。在一些实施方案中，TCR的介导MAGEA1特异性的部分包含SEQ ID NO:2、3、4和5、6、7的氨基酸序列。

本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含如本文所述的TCR、如本文所述的多肽、如本文所述的多价TCR复合物、如本文所述的核酸、如本文所述的载体、如本文所述的细胞、或本文所述的抗体。

通常，药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体。

本发明的另一方面涉及如本文所述的TCR、如本文所述的多肽、如本文所述的多价TCR复合物、如本文所述的核酸、如本文所述的载体、如本文所述的细胞、或本文所述的抗体，用于作为药物使用，特别是用于在治疗癌症中使用。癌症可以是血液癌症或实体瘤。癌症可以选自由以下组成的组：***癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、***、结直肠癌、胃腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、髓细胞白血病和急性淋巴母细胞白血病、肉瘤或骨肉瘤。

附图说明

图1示出了来自不同供体(供体A或B；灰色或黑色的柱子)的表达TCR T15.8-4.3-83的效应子对负载MAGEA1_KVL(SEQ ID NO.1)肽(KVL)的T2细胞的特异性识别。如通过IFN-γ分泌测量的，具有完全鼠C区(murC)的TCR版本的TCR介导的靶标识别在左图中示出，具有最小鼠源化人C区(mmC)的TCR版本的TCR介导的靶标识别在中间图中示出。由基准对照MAGEA1-TCR转导的效应子介导的识别在右侧示出。作为对照，将负载有不相关ASTN-1肽(SEQ ID NO.28)的T2细胞与表达本发明TCR或对照TCR(Ctrl.MAGEA1-TCR)的T细胞一起孵育。

图2示出了在三种不同的效应细胞制备物(阴影柱子：白色、浅灰色和深灰色)中表达的TCR T15.8-4.3-83特异性识别负载KVL肽的淋巴母细胞系(LCL)后的IFN-γ分泌。当未负载的LCL与相应的效应细胞(纯色柱子：白色、浅灰色、深灰色)共培养时，没有观察到识别。方框表示负责呈递和识别的HLA等位基因。在HLA-A杂合的LCL(如星号所示)的情况下，可以排除对其它HLA-A上的肽的识别(数据未示出)。

图3描绘了由表达TCR T15.8-4.3-83的效应子(上图)或基准Ctrl.MAGEA1-TCR(下图)介导的不同来源的多种肿瘤细胞系的识别。效应细胞来自三个不同的供体(供体A、B或C；白色、浅灰色或深灰色柱子)。通过测量IFN-γ分泌来检测表达MAGEA1-TCR的效应细胞(纯色柱子)或未转导的对照细胞(阴影柱子)的靶标识别。负载有KVL肽或负载有不相关ASTN1肽的T2细胞用作靶标对照，并示出在每个图的右侧(T2+KVL、T2+ASTN1)。

图4A至D示出了肿瘤细胞系UACC-62(A)、NCI-H1703(B)、Saos-2(C)和647-V(D)的TCR介导的裂解。通过荧光标记的靶细胞的消失来测量细胞的裂解。测试未修饰(黑色)或负载有KVL肽(灰色)作为阳性对照的肿瘤细胞。将靶标与来自三个不同供体(供体A、B或C，实心圆圈)的效应细胞共培养多至144小时，这些细胞表达TCR T15.8-4.3-83(上图)、基准Ctrl.MAGEA1-TCR(中间图)或未转导(下图)。单独培养的靶细胞在每个图中作为参考(空心圆圈)示出。每2小时使用IncuCyte^TM Zoom System拍摄和分析图像，描绘的是144小时内的靶细胞计数/孔。

图5示出了在与来自三个不同供体(供体A、B或C；白色、浅灰色或深灰色柱子)的基准ctrl.MAGEA1-TCR转导的(纯色柱子)或未转导的(阴影柱子)效应子共培养后，负载有用于苏氨酸替换扫描的肽的T2细胞的识别。TCR的原始MAGEA1衍生表位KVL的识别示出在左侧。x轴上示出的表位序列表示原始AA交换成苏氨酸的位置。通过原始AA的交换消除的识别用黑色框突出显示。通过测量T细胞介导的IFN-γ分泌来检测靶标识别。

图6示出了在与来自三个不同供体(供体A、B或C；白色、浅灰色或深灰色柱子)的TCR T15.8-4.3-83转导的(纯色柱子)或未转导的(阴影柱子)效应子共培养后，负载有用于苏氨酸替换扫描的肽的T2细胞的识别。TCR的原始MAGEA1衍生表位KVL的识别示出在左侧。x轴上示出的表位序列表示原始AA交换成苏氨酸的位置。通过原始AA的交换消除的识别用黑色框突出显示。通过测量T细胞介导的IFN-γ分泌来检测靶标识别。

图7示出了TCR T15.8-4.3-83介导的对HEK 293T细胞(A)、K562细胞(B)和LCL细胞(C)的识别。通过测量T细胞介导的IFN-γ分泌来检测靶细胞的识别。细胞系和T2细胞负载MAGEA1衍生的KVL肽(+KVL)或ASTN1衍生的KLY肽(+ASTN1)作为对照，或者用编码MAGEA1、ASTN1或13个MAGE家族成员的ivtRNA转染，如x轴上指示的。靶标与来自两个供体(浅灰色或深灰色)的TCR转导(纯色柱子)或未转导(阴影柱子)的效应细胞共培养。由单独培养的靶细胞(仅靶细胞)介导的背景以白色柱子给出。虚线表示IFN-γ的靶标独立的背景分泌。

图8示出了TCR T15.8-4.3-83介导的对源自健康组织或来自代表健康人体组织的诱导多能干细胞(iPS)的未修饰(未负载)或负载KVL的靶细胞的识别。通过测量来自用TCRT15.8-4.3-83转导的三个不同供体(供体A、B或C；白色、浅灰色或深灰色柱子)的T细胞的IFN-γ分泌来检测靶细胞的识别。示出了每种细胞类型的单独靶标(仅靶标)的背景IFN-γ分泌作为对照，还在图的右侧示出了被TCR识别的负载有表位KVL的T2细胞(T2+KVL)的识别，以及通过单独效应子的背景(仅效应子)。

图9示出了使用相差显微镜拍摄的正常细胞与效应细胞共培养的代表性图片。虽然所有负载KVL的靶细胞都有明显的TCR介导的裂解(细胞层的完全破坏)，但表达TCR的效应细胞不会裂解未修饰的正常细胞。

图10示出了TCR转基因效应T细胞群体响应于MAGEA1和HLA-A*02:01双阳性肿瘤细胞系产生IFN-γ的能力。FH1、FH2、FH3和FH4是指WO 2018/170338中公开的TCR，FH1：Vα＝WO’338的SEQ ID NO.:7，Vβ＝WO’338的SEQ ID NO:5；FH2：Vα＝WO’338的SEQ ID NO.:11，Vβ＝WO’338的SEQ ID NO.:9，FH3:Vα＝WO’338的SEQ ID NO.:15，Vβ＝WO’338的SEQ ID NO:13；FH1:Vα＝WO’338的SEQ ID NO.:19，Vβ＝WO’338的SEQ ID NO:17；R37P1C9是指WO2018/104438中公开的MAGA1-TCR。

图11示出了TCR转基因效应T细胞群体裂解MAGEA1和HLA-A*02:01双阳性肿瘤细胞系的能力。FH1、FH2、FH3和FH4是指WO 2018/170338中公开的TCR(见图10)。R37P1C9是指WO2018/104438中公开的MAGA1-TCR。UTD：未转导。

图12示出了不同KVL肽特异性TCR的功能亲合力。功能亲合力是指转基因TCR和pMHC复合物之间各个非共价结合相互作用的多重亲和力的累积强度。FH1、FH2、FH3和FH4是指WO 2018/170338中公开的TCR(见图10)。R37P1C9是指WO2018/104438中公开的MAGA1-TCR。

图13丝氨酸残基用于***地替换MAGEA1_KVL肽中的各个氨基酸(丝氨酸扫描)以确定表位序列中的关键氨基酸。

图14示出了用不同TCR转导的T细胞的TH2特异性细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的分泌模式。UT：未转染。T1367表示WO2014/118236中公开的TCR。仅靶标：在没有TCR的情况下培养肿瘤细胞。

具体实施方式

在关于本发明的一些优选实施方案详细描述本发明之前，提供以下一般定义。

如下示例性描述的本发明可以适当地在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下实施。

将关于特定实施方案并参考某些图来描述本发明，但本发明不限于此而仅由权利要求限制。

在本说明书和权利要求中使用术语“包含”时，不排除其它要素。出于本发明的目的，术语“由……组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包含至少一定数量的实施方案，则这也应理解为公开了优选仅由这些实施方案组成的组。

出于本发明的目的，术语“获得”被认为是术语“可获得”的优选实施方案。如果在下文中例如抗体被定义为从特定来源可获得，这也应理解为公开了从该来源获得的抗体。

除非另有具体说明，否则未用数量词限定的名词包括该名词的单数和复数二者。本发明上下文中的术语“约”或“大约”表示本领域技术人员将理解的仍能确保所讨论特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示与指示数值的偏差±10％，优选±5％。

技术术语按其常识或对本领域技术人员的涵义使用。如果向某些术语传达特定含义，则在下文中将在使用这些术语的上下文中给出术语的定义。

TCR背景

TCR由两条不同且独立的蛋白质链(即TCR alpha(α)和TCR beta(β)链)构成。TCRα链包含可变区(V)、连接区(J)和恒定区(C)。TCRβ链包含可变区(V)、多样性区(D)、连接区(J)和恒定区(C)。TCRα和TCRβ链二者的重排V(D)J区包含高变区(CDR，互补决定区)，其中CDR3区决定了特异性表位识别。在C端区域，TCRα链和TCRβ链二者包含疏水性跨膜结构域并以短的细胞质尾部结束。

通常，TCR是一条α链和一条β链的异二聚体。这种异二聚体可以与呈递肽的MHC分子结合。

本发明上下文中的术语“可变TCRα区”或“TCRα可变链”或“可变结构域”是指TCRα链的可变区。本发明上下文中的术语“可变TCRβ区”或“TCRβ可变链”是指TCRβ链的可变区。

TCR基因座和基因使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名法(IMGT数据库,www.IMGT.org；Giudicelli,V.,等人.IMGT/LIGM-DB,the

comprehensivedatabase of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences,Nucl.Acids Res.,34,D781-D784(2006).PMID:16381979；T cell Receptor Factsbook,LeFranc and LeFranc,Academic Press ISBN 0-12-441352-8)命名。

靶标

本文所述的TCR的靶标是MAGEA1(NCBI参考序列:NM_004988.4)衍生的肽KVL(SEQID NO:1)。

TCR特异性序列

一些实施方案涉及包含TCRα链和TCRβ链的分离的TCR，其中

-TCRα链包含具有SEQ ID NO:4的序列的互补决定区3(CDR3)，

-TCRβ链包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3。

具体实施方案涉及分离的TCR，其包含：

-包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:4的序列的CDR 3的TCRα链；

-包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:7的序列的CDR 3的TCRβ链。

在一些实施方案中，TCR包含具有与SEQ ID NO:8至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列的可变TCRα区，和具有与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列的可变TCRβ区。

一个优选的实施方案涉及包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCRα区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区的TCR。

源自T细胞克隆T15.8-4.3-83(其以转基因形式用于实施例中)的TCR包含：包含具有SEQ ID NO:4的序列的互补决定区3(CDR3)的TCRα链和包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3的TCRβ链。特别地，本发明TCR包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCRα区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区。

从实施例可以看出，根据本发明的TCR对MAGEA1具有特异性并且对其它表位或抗原仅表现出非常低的交叉反应性。

另一些实施方案涉及分离的TCR，其包含具有与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列的TCRα链，和具有与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列的TCRβ链。

具体实施方案涉及包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的TCRβ链的TCR。因此，对于HLA-A*02:01与SEQ ID NO:1的MAGEA1肽的复合物具有特异性的本文所述TCR包含由TRAV19*01基因编码的Vα链和由TRAV30*01基因编码的Vβ基因。

另一些实施方案涉及包含TCRα链和TCRβ链的分离的TCR，其中

-可变TCRα区具有与SEQ ID NO:8至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列并且包含SEQ ID NO:3中示出CDR3区；

-可变TCRβ区具有与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列并且包含SEQ ID NO:7中示出CDR3区。

优选使用Vector NTI Advance^TM 10程序(Invitrogen Corporation,CarlsbadCA,USA)的AlignX应用程序来确定多个序列之间的百分比同一性。该程序使用改进的Clustal W算法(Thompson等人,1994.Nucl Acids Res.22:第4673-4680页；InvitrogenCorporation；Vector NTI Advance^TM 10DNA and protein sequence analysissoftware.User’s Manual,2004,第389-662页)。使用AlignX应用程序的标准参数确定百分比同一性。

根据本发明的TCR是分离的或纯化的。本发明上下文中的“分离的”是指TCR不存在于其最初在自然界中出现的环境中。在本发明的上下文中，“纯化的”是指例如TCR不含或基本上不含其来源的细胞的其它蛋白质和非蛋白质部分。

在一些实施方案中，TCR的氨基酸序列可包含一个或多个表型沉默替换。

“表型沉默替换”也称为“保守氨基酸替换”。“保守氨基酸替换”的概念是技术人员理解的，并且优选地是指编码带正电荷的残基(H、K和R)的密码子被编码带正电荷的残基的密码子替换，编码带负电荷的残基(D和E)的密码子被编码带负电荷的残基的密码子替换，编码中性极性残基(C、G、N、Q、S、T和Y)的密码子被编码中性极性残基的密码子替换，编码中性非极性残基(A、F、I、L、M、P、V和W)的密码子被编码中性非极性残基的密码子替换。这些变异可以自发发生，通过随机诱变引入，或可以通过定向诱变引入。这些变化可以在不破坏这些多肽的基本特征的情况下进行。普通技术人员可通过本领域已知的方法容易且常规地筛选变异氨基酸和/或编码它们的核酸以确定这些变异是否显著降低或破坏配体结合能力。

技术人员理解编码TCR的核酸也可以被修饰。整个核酸序列中有用的修饰包括序列的密码子优化。可以进行导致表达的氨基酸序列内的保守替换的改变。这些变化可以在不影响功能的TCR链氨基酸序列的互补决定区和非互补决定区中进行。通常，不应在CDR3区进行添加和缺失。

根据本发明的一些实施方案，TCR的氨基酸序列被修饰以包含可检测标记、治疗剂或药代动力学修饰部分。

可检测标记的非限制性实例是放射性标记、荧光标记、核酸探针、酶和造影剂。可以与TCR缔合的治疗剂包括放射性化合物、免疫调节剂、酶或化学治疗剂。治疗剂可以被与TCR相连的脂质体包裹，使得化合物可以在靶部位缓慢释放。这将避免在体内运输过程中的损坏并确保治疗剂(例如毒素)在TCR与相关抗原呈递细胞结合后具有最大作用。治疗剂的其它实例是：

肽细胞毒素，即具有杀伤哺乳动物细胞能力的蛋白质或肽，例如蓖麻毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素A、DNase和RNase。小分子细胞毒剂，即具有杀伤哺乳动物细胞能力的分子量小于700道尔顿的化合物。这样的化合物可以包含能够具有细胞毒性作用的有毒金属。此外，应当理解，这些小分子细胞毒剂还包括前药，即在生理条件下分解或转化以释放细胞毒剂的化合物。这样的药剂可例如包括多西紫杉醇、吉西他滨、顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、卡利奇霉素(calicheamicin)、依托泊苷、异环磷酰胺、伊立替康、卟非姆钠光敏素II(porfimer sodium photofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸三甲曲沙(trimetrexate glucoronate)、米托蒽醌、阿里他汀E(auristatin E)、长春新碱和多柔比星；放射性核素，例如碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213。放射性核素与TCR或其衍生物的缔合可以例如通过螯合剂进行；免疫刺激剂，也称为免疫刺激物，即刺激免疫应答的免疫效应分子。示例性免疫刺激剂是细胞因子，例如IL-2和IFN-γ、抗体或其片段，包括抗T细胞或NK细胞决定簇抗体(例如抗CD3、抗CD28或抗CD16)；具有抗体样结合特性的替代蛋白质支架；超抗原，即造成T细胞非特异性激活，导致多克隆T细胞激活和大量细胞因子释放的抗原及其突变体；趋化因子，例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等补体激活剂；异种蛋白结构域、同种异体蛋白结构域、病毒/细菌蛋白结构域、病毒/细菌肽。

人T淋巴细胞上的抗原受体分子(T细胞受体分子)与细胞表面的CD3(T3)分子复合物非共价缔合。用抗CD3单克隆抗体干扰这种复合物会诱导T细胞活化。因此，一些实施方案涉及与抗-CD3抗体或所述抗-CD3抗体的功能片段或变体缔合(通常通过与α或β链的N-或C-末端融合)的如本文所述的TCR。适用于本文所述组合物和方法的抗体片段和变体/类似物包括微抗体、Fab片段、F(ab')₂片段、dsFv和scFv片段、Nanobodies^TM(Ablynx(Belgium)，包含源自骆驼科动物(例如骆驼或美洲驼)抗体的合成单一免疫球蛋白可变重链结构域的分子)和结构域抗体(包含亲和力成熟的单一免疫球蛋白可变重链结构域或免疫球蛋白可变轻链结构域(Domantis(Belgium))或表现出抗体样结合特性的替代蛋白质支架，例如Affibodies(包含工程化的蛋白A支架Affibody(Sweden))或Anticalins(包含工程化anticalins Pieris(German))。

治疗剂可优选地选自由免疫效应分子、细胞毒剂和放射性核素组成的组。优选地，免疫效应分子是细胞因子。

药代动力学修饰部分可以是例如至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团或其组合。至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团的缔合可以以本领域技术人员已知的多种方式引起。在一个优选的实施方案中，单元与TCR共价连接。根据本发明的TCR可以通过一个或多个药代动力学修饰部分进行修饰。特别地，TCR的可溶形式被一个或多个药代动力学修饰部分修饰。药代动力学修饰部分可以实现对治疗剂的药代动力学特征的有益改变，例如改善的血浆半衰期、降低或增强的免疫原性和改善的溶解度。

根据本发明的TCR可以是可溶性的或膜结合的。术语“可溶性”是指呈可溶形式(即没有跨膜或细胞质结构域)的TCR，例如用作将治疗剂递送至抗原呈递细胞的靶向剂。为了稳定性，可溶性αβ异二聚体TCR优选在各自恒定结构域的残基之间具有引入的二硫键，如例如WO 03/020763中所述。本发明的αβ异源二聚体中存在的一个或两个恒定结构域可以在一个或两个C末端被截短，例如多至15个、或多至10个或多至8个或更少的氨基酸。为了在过继治疗中使用，αβ异二聚体TCR可以例如被转染为具有细胞质和跨膜结构域二者的全长链。TCR可以包含对应于自然界中在相应α和β恒定结构域之间发现的二硫键，另外或替代地，可以存在非天然二硫键。

因此，根据本发明的TCR，特别是TCR的可溶形式，可以通过连接额外的功能部分进行修饰，例如用于降低免疫原性、增加流体动力学尺寸(溶液中的尺寸)、溶解度和/或稳定性(例如通过增强对蛋白水解降解的保护)和/或延长血清半衰期。

其它有用的功能部分和修饰包括“***”或“安全开关”，其可用于关闭患者体内携带本发明TCR的效应宿主细胞。一个实例是由Gargett和Brown Front Pharmacol.2014；5:235描述的诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)“安全开关”。简而言之，通过众所周知的方法对效应宿主细胞进行修饰以表达胱天蛋白酶9结构域，其二聚化依赖于小分子二聚化药物如AP1903/CIP，并导致在修饰的效应细胞中快速诱导细胞凋亡。该***例如在EP2173869(A2)中描述。其它“***”、“安全开关”的实例在本领域中是已知的，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，CD20的表达和随后使用抗CD20抗体或myc标签的消耗(Kieback等人Proc NatlAcad Sci U S A.2008 Jan 15；105(2):623-8)。

本文还设想了具有改变的糖基化模式的TCR。如本领域已知的，糖基化模式可取决于氨基酸序列(例如，如下讨论的特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在)和/或产生蛋白质的宿主细胞或生物体。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接到天冬酰胺残基的侧链。通过改变氨基酸序列，使其包含一个或多个选自天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)的三肽序列来方便地将N-连接的糖基化位点添加到结合分子。O-连接的糖基化位点可以通过向起始序列添加或替换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来引入。

TCR糖基化的另一种方法是通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。根据所使用的偶联模式，糖可以连接到(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，例如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。类似地，去糖基化(即去除结合分子上存在的碳水化合物部分)可以以化学方式完成，例如通过将TCR暴露于三氟甲磺酸，或通过使用内切和外切糖苷酶以酶促方式完成。

还可以想到将药物例如小分子化合物添加到TCR，特别是本发明TCR的可溶形式。可以通过共价键或非共价相互作用(例如通过静电力)实现连接。可以使用本领域已知的各种接头以形成药物缀合物。

TCR，特别是本发明TCR的可溶形式，可以被另外修饰以引入有助于鉴定、追踪、纯化和/或分离相应分子的额外结构域(标签)。因此，在一些实施方案中，TCRα链或TCRβ链可以被修饰以包含表位标签。

表位标签是可以被引入本发明的TCR中的标签的有用实例。表位标签是一小段(stretch)氨基酸，其允许结合特异性抗体，因此能够鉴定和跟踪患者体内可溶性TCR或宿主细胞或培养的(宿主)细胞的结合和运动。可以使用多种不同的技术来实现表位标签的检测，并且因此实现带标签的TCR的检测。

通过在对所述标签特异的结合分子(抗体)存在下培养细胞，标签可进一步用于刺激和扩增携带本发明的TCR的宿主细胞。

通常，在一些情况下，TCR可以用各种突变来修饰，这些突变改变了TCR与靶抗原的亲和力和解离率(off-rate)。特别地，突变可以增加亲和力和/或降低解离率。因此，TCR可以在至少一个CDR及其可变结构域框架区中发生突变。

然而，在一个优选的实施方案中，TCR的CDR区没有被修饰或体外亲和力成熟，例如对于实施例中的TCR受体。这意味着CDR区具有天然存在的序列。这可能是有利的，因为体外亲和力成熟可能导致对TCR分子的免疫原性。这可能导致降低或灭活治疗效果和治疗的抗药抗体的产生和/或引起副作用。

突变可以是一个或多个替换、缺失或***。这些突变可以通过本领域已知的任何合适的方法引入，例如聚合酶链式反应、基于限制性酶的克隆、不依赖连接的克隆程序，这些方法例如在Sambrook,Molecular Cloning–第4版(2012)Cold Spring HarborLaboratory Press中的实例中有所描述。

从理论上讲，由于内源和外源TCR链之间的错配，可能会出现具有交叉反应风险的不可预测的TCR特异性。为避免TCR序列的错配，可以对重组TCR序列进行修饰以包含最小鼠源化Cα和Cβ区域，该技术已被证明有效增强多种不同转导的TCR链的正确配对。TCR的鼠源化(即通过其鼠对应物交换α和β链中的人恒定区)是一种通常用于改善宿主细胞中TCR的细胞表面表达的技术。不希望受特定理论的束缚，认为鼠源化TCR与CD3共受体更有效地缔合；和/或优先彼此配对并且不太可能在人T细胞上形成混合TCR，所述人T细胞经离体遗传修饰以表达期望抗原特异性的TCR，但仍保留和表达其“原始”TCR。

已经鉴定了九个负责提高鼠源化TCR表达的氨基酸(Sommermeyer和Uckert,JImmunol.2010 Jun 1；184(11):6223-31)，并且设想了将TCRα和/或β链恒定区中的一个或所有氨基酸残基替换为其鼠对应物残基。该技术也称为“最小鼠源化”，并且优点在于增强细胞表面表达，同时减少氨基酸序列中“外来”氨基酸残基的数目，从而降低免疫原性风险。

一些实施方案涉及如本文所述的分离的TCR，其中TCR为单链类型，其中TCRα链和TCRβ链通过接头序列连接。

合适的单链TCR形式包含由对应于可变TCRα区的氨基酸序列构成的第一区段，由与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于可变TCRβ区的氨基酸序列构成的第二区段，和将第一区段的C末端连接到第二区段的N末端的接头序列。或者，第一区段可由对应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成，第二区段可由与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRα链可变区序列的氨基酸序列构成。上述单链TCR还可以在第一和第二链之间包含二硫键，并且其中接头序列的长度和二硫键的位置使得第一和第二区段的可变结构域序列基本上如在天然T细胞受体中一样相互定向。更具体地，第一区段可以由与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRα链可变区序列的氨基酸序列构成，第二区段可以由与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成，并且可以在第一和第二链之间提供二硫键。接头序列可以是不损害TCR功能的任何序列。

在本发明的上下文中，“功能性”TCRα和/或β链融合蛋白应指保持至少基本的生物活性的TCR或TCR变体，例如通过氨基酸的添加、缺失或替换而修饰的。在TCR的α和/或β链的情况下，这将意味着两条链仍然能够形成T细胞受体(利用未修饰的α和/或β链或利用另一本发明的融合蛋白α和/或β链)，其发挥其生物学功能，特别是与所述TCR的特异性肽-MHC复合物结合，和/或在特异性肽:MHC相互作用后的功能性信号转导。

在具体实施方案中，TCR可以被修饰为功能性T细胞受体(TCR)α和/或β链融合蛋白，其中所述表位-标签的长度为6至15个氨基酸，优选9至11个氨基酸。在另一个实施方案中，TCR可以被修饰为功能性T细胞受体(TCR)α和/或β链融合蛋白，其中所述T细胞受体(TCR)α和/或β链融合蛋白包含间隔开或直接串联的两个或更多个表位-标签。融合蛋白的实施方案可包含2、3、4、5或甚至更多个表位-标签，只要融合蛋白保持其生物活性/多种活性(“功能性”)即可。

优选的是根据本发明的功能性T细胞受体(TCR)α和/或β链融合蛋白，其中所述表位-标签选自但不限于CD20或Her2/neu标签，或其它常规标签例如myc-标签、FLAG-标签、T7-标签、HA(血凝素)-标签、His-标签、S-标签、GST-标签或GFP-标签。myc、T7、GST、GFP标签是源自现有分子的表位。相比之下，FLAG是为高抗原性设计的合成表位标签(参见，例如，美国专利号4,703,004和4,851,341)。可以优选使用myc标签，因为可以获得高质量试剂用于其检测。表位标签当然可以具有一种或多种超出抗体识别的额外功能。这些标签的序列在文献中有描述并且是本领域技术人员公知的。

TCR变体

本发明的另一方面涉及包含如本文所述的TCR的功能部分的多肽，其中所述功能部分包含SEQ ID NO:4和7的氨基酸序列中的至少一个。

功能部分可以介导TCR与抗原，特别是与抗原-MHC复合物的结合。

在一个实施方案中，功能部分包含如本文所述的TCRα可变链和/或TCRβ可变链。

TCR变体分子可具有TCR受体的结合特性，但可与效应细胞(T细胞除外)的信号传导结构域组合，特别是与NK细胞的信号传导结构域组合。因此，一些实施方案涉及包含与效应细胞(例如NK细胞)的信号传导结构域组合的如本文所述的TCR的功能部分的蛋白质。

本发明的另一方面涉及包含至少两个如本文所述的TCR的多价TCR复合物。在该方面的一个实施方案中，至少两个TCR分子通过接头部分连接以形成多价复合物。优选地，复合物是水溶性的，因此应相应地选择接头部分。优选地，接头部分能够连接到TCR分子上的限定位置，从而使形成的复合物的结构多样性最小化。本方面的一个实施方案由本发明的TCR复合物提供，其中聚合物链或肽接头序列在每个TCR的不位于TCR可变区序列中的氨基酸残基之间延伸。由于本发明的复合物可用于药物，因此应适当考虑它们的药物适用性，例如它们的免疫原性来选择接头部分。满足上述所需标准的接头部分的实例是本领域，例如连接抗体片段的领域已知的。

接头的实例是亲水聚合物和肽接头。亲水聚合物的实例是聚亚烷基二醇。此类中最常用的是基于聚乙二醇或PEG。然而，另一些是基于其它合适的、任选取代的聚亚烷基二醇，包括聚丙二醇，以及乙二醇和丙二醇的共聚物。肽接头包含氨基酸链，其功能是产生TCR分子可以连接的简单的接头或多聚化结构域。

一个实施方案涉及多价TCR复合物，其中所述TCR中的至少一个与治疗剂缔合。

细胞因子和趋化因子释放

一些实施方案涉及如本文所述的分离的TCR、如本文所述的多肽、如本文所述的多价TCR复合物，其中通过效应细胞上表达的本发明TCR与选自由SEQ ID NO:1组成的组的氨基酸序列的HLA-A*02结合形式的结合来诱导IFN-γ分泌。

通过效应细胞上表达的本发明TCR与选自由SEQ ID NO:1组成的组的氨基酸序列的HLA-A*02结合形式的结合诱导的IFN-γ分泌可以超过500pg/ml，例如超过1000pg/ml、超过2000pg/ml、更优选地超过4000pg/ml、最优选地甚至超过6000pg/ml。同与不相关肽(例如SEQ ID No:28)的HLA-A*02结合形式的结合相比，与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HLA-A*02结合形式结合时IFN-γ分泌可以是至少5倍高。

“效应细胞”可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。通常，效应细胞是免疫效应细胞，尤其是T细胞。其它合适的细胞类型包括γ-δT细胞和NK样T细胞。

本发明还涉及鉴定与靶氨基酸序列SEQ ID NO:1或其HLA-A*02，优选地或HLA-A*02:01结合形式结合的TCR或其片段的方法，其中该方法包括使候选TCR或其片段与SEQ IDNO:1的氨基酸序列或其HLA-A*02，优选地或其HLA-A*02:01结合形式接触，并确定候选TCR或其片段是否与靶标结合和/或介导免疫应答。

候选TCR或其片段是否介导免疫应答可以例如通过测量细胞因子分泌，例如IFN-γ分泌来确定。如上所述，细胞因子分泌可以通过体外测定来测量，其中将用编码氨基酸序列SEQ ID NO:1的ivtRNA转染的K562细胞(或其它APC)与表达TCR或包含待研究的TCR的片段的分子的富含CD8+的PBMC一起孵育。

在一个具体的实施方案中，本发明的TCR显示没有显著的Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的分泌。这可能是有利的，因为Th2细胞因子应答可能会增加肿瘤进展(Jager MJ,Desjardins L,

T,Damato BE(eds):Current Concepts in Uveal Melanoma.DevOphthalmol.Basel,Karger,2012,第49卷,第137–149页,J Immunother.2018 Oct；41(8):369-378)。

核酸、载体

本发明的另一方面涉及编码如本文所述的TCR的核酸或编码如本文所述的编码TCR的多核苷酸的核酸。

“核酸分子”通常是指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的、合成的或从天然来源获得的(例如，分离的和/或纯化的)，其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸间连接，例如氨基磷酸酯(phosphoroamidate)连接或硫代磷酸酯连接，而不是在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。优选地，本文所述的核酸是重组的。如本文使用的，术语“重组”是指(i)通过将天然或合成的核酸片段连接到可在活细胞中复制的核酸分子而在活细胞外构建的分子，或(ii)由以上(i)中描述的那些的复制而产生的分子。为了本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。核酸可以基于化学合成和/或酶促连接反应使用本领域已知的或可商购(例如，来自Genscript、Thermo Fisher等公司)的程序构建。例如，参见Sambrook等人，例如，可以使用天然存在的核苷酸或经设计以增加分子的生物稳定性或增加杂交后形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化学合成核酸。核酸可以包含编码任何重组TCR、多肽或蛋白质或其功能部分或功能变体的任何核苷酸序列。

本公开还提供了分离或纯化的核酸的变体，其中变体核酸包含与编码本文所述的TCR的核苷酸序列至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。这样的变体核苷酸序列编码特异性识别MAGEA1的功能性TCR。

本公开还提供了分离或纯化的核酸，其包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严格条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在严格条件下杂交的核苷酸序列优选在高严格条件下杂交。“高严格条件”是指核苷酸序列以比非特异性杂交可检测的更强的量与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高严格条件包括可以区分具有精确互补序列的多核苷酸或仅包含少数分散错配的多核苷酸与碰巧具有与核苷酸序列匹配的几个小区域(例如，3-10个碱基)的随机序列的条件。这种小的互补区域比14-17个或更多个碱基的全长互补更容易解链，并且高严格的杂交使它们易于区分。相对高严格条件将包括例如低盐和/或高温条件，例如由约0.02-0.1M NaCl或等同物在约50-70℃的温度下提供的。这样的高严格条件几乎不能容忍(如果有的话)核苷酸序列与模板或靶链之间的错配，并且特别适合于检测本文所述的任何TCR的表达。一般认为，可以通过添加增加量的甲酰胺使条件更加严格。

如本文别处已经描述的，可以对编码TCR的核酸进行修饰。整个核酸序列中的有用修饰可以是密码子优化。可以进行导致表达的氨基酸序列内的保守替换的改变。这些变化可以在不影响功能的TCR链氨基酸序列的互补决定区和非互补决定区中进行。通常，不应在CDR3区域进行添加和缺失。

另一个实施方案涉及包含编码如本文所述的TCR的核酸的载体。

载体优选为质粒、穿梭载体、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或用于基因治疗的颗粒和/或载体。

“载体”是能够将核酸序列携带到合适的宿主细胞中的任何分子或组合物，在该宿主细胞中可以发生被编码多肽的合成。通常并且优选地，载体是已经使用本领域已知的重组DNA技术工程化改造以引入期望核酸序列(例如本发明的核酸)的核酸。载体可以包含DNA或RNA和/或包含脂质体。载体可以是质粒、穿梭载体、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或用于基因治疗的颗粒和/或载体。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一种或多种选择标记基因和本领域普通技术人员已知的其它遗传元件。载体优选地是包含根据本发明的核酸的表达载体，所述核酸可操作地连接至允许所述核酸表达的序列。

优选地，载体是表达载体。更优选地，载体是逆转录病毒载体，更具体地是γ-逆转录病毒或慢病毒载体。

细胞、细胞系

本发明的另一方面涉及表达如本文所述的TCR的细胞。

在一些实施方案中，细胞是分离的或非天然存在的。

在具体实施方案中，细胞可以包含编码如本文所述的TCR的核酸或包含所述核酸的载体。

在细胞中，可以引入包含编码上述TCR的核酸序列的上述载体或者可以引入编码所述TCR的ivtRNA。细胞可以是外周血淋巴细胞，例如T细胞。TCR的克隆和外源表达方法例如在Engels等人(Relapse or eradication of cancer is predicted by peptide-majorhistocompatibility complex affinity.Cancer Cell,23(4),516–26.2013)中描述。例如，用慢病毒载体转导原代人T细胞在Cribbs的“simplified production andconcentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primaryhuman T cells”BMC Biotechnol.2013；13:98中描述。

术语“转染”和“转导”是可互换的，并且是指将外源核酸序列引入宿主细胞(例如真核宿主细胞)的过程。需要注意的是，核酸序列的引入或转移不限于上述方法，而是可以通过任何数量的手段来实现，包括电穿孔、显微注射、基因枪递送、脂质转染、超染和所提到的通过逆转录病毒或其它适合转导或转染的病毒的感染。

一些实施方案涉及细胞，其包含：

a)包含至少一种如本文所述的核酸的表达载体，或

b)包含编码如本文所述的TCR的α链的核酸的第一表达载体，和包含编码如本文所述的TCR的β链的核酸的第二表达载体。

在一些实施方案中，细胞是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。细胞可以是自然杀伤细胞或T细胞。优选地，细胞是T细胞。T细胞可以是CD4+或CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞样记忆T细胞。

干细胞样记忆T细胞(TSCM)是分化程度较低的CD8+或CD4+T细胞的亚群，其特征是具有自我更新和长期存在的能力。一旦这些细胞在体内遇到它们的抗原，它们就会进一步分化为中枢记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)和终末分化的效应记忆T细胞(TEMRA)，其中一些TSCM保持静止(Flynn等人,Clinical&Translational Immunology(2014)。这些剩余的TSCM细胞表现出在体内建立持久免疫记忆的能力，并且因此被认为是用于过继性T细胞治疗的重要T细胞亚群(Lugli等人,Nature Protocols 8,33–42(2013)Gattinoni等人,Nat.Med.2011 Oct；17(10):1290–1297)。免疫磁性选择可用于将T细胞池限制为干细胞记忆T细胞亚型(参见Riddell等人.2014,Cancer Journal 20(2):141–44)。

靶向TCR的抗体

本发明的另一方面涉及与如本文所述的TCR的介导MAGEA1特异性的部分特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，TCR的介导MAGEA1特异性的部分包含SEQID NO:4的α链CDR3和/或SEQ ID NO:7的β链CDR3。

抗体或其抗原结合片段可以调节TCR的活性。其可以阻断或不阻断TCR与MAGEA1的结合。其可用于调节TCR的治疗活性或用于诊断目的。

药物组合物、药物治疗和试剂盒

本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含如本文所述的TCR、包含所述TCR的功能部分的多肽、如本文所述的多价TCR复合物、编码TCR的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述TCR的细胞、或与如本文所述的TCR的一部分特异性结合的抗体。

本发明的那些活性成分优选以与可接受的载体或载体材料混合的剂量用于可以治疗或至少减轻疾病的药物组合物中。这样的组合物可以(除了活性成分和载体之外)包含填充材料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域已知的其它材料。

术语“药学上可接受的”定义为无毒材料，其不干扰活性成分的生物活性的有效性。载体的选择取决于应用。

药物组合物可以包含增强活性成分的活性或补充治疗的额外成分。这样的额外成分和/或因子可以是药物组合物的一部分以实现协同效应或使不利或不希望的效应最小化。

本发明的活性成分的配制或制备和应用/用药的技术公开在"Remington'sPharmaceutical Sciences",Mack Publishing Co.,Easton,PA最新版中。合适的应用是肠胃外应用，例如肌肉内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、结内、腹膜内或肿瘤内注射。静脉内注射是患者的优选治疗方法。

根据一个优选的实施方案，药物组合物是输注剂或注射剂。

可注射组合物是药学上可接受的流体组合物，其包含至少一种活性成分，例如表达TCR的扩增的T细胞群体(例如对于待治疗的患者是自体或同种异体)。活性成分通常溶解或悬浮在生理学上可接受的载体中，并且该组合物可以另外包含少量的一种或多种无毒辅助物质，例如乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等。可用于与本公开的融合蛋白一起使用的这样的可注射组合物是常规的；合适的制剂是本领域普通技术人员众所周知的。

通常，药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体。

因此，本发明的另一方面涉及如本文所述的TCR、包含所述TCR的功能部分的多肽、如本文所述的多价TCR复合物、编码所述TCR的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述TCR的细胞或与如本文所述的TCR的一部分特异性结合的抗体，用于作为药物使用。

一些实施方案涉及如本文所述的TCR、包含所述TCR的功能部分的多肽、如本文所述的多价TCR复合物、编码所述TCR的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述TCR的细胞，用于在治疗癌症中使用。

在一个实施方案中，癌症是血液癌症或实体瘤。

血液癌症也称为血癌，其不形成实体瘤，并且因此分散在体内。血液癌症的实例是白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。实体瘤有两种主要类型，肉瘤和癌。肉瘤是例如血管、骨骼、脂肪组织、韧带、***、肌肉或肌腱的肿瘤。

在一个实施方案中，癌症选自由以下组成的组：***癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、***、结直肠癌、胃腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、髓细胞白血病和急性淋巴母细胞白血病、肉瘤或骨肉瘤。

本文还考虑了药物组合物和试剂盒，其包含以下一种或多种：(i)如本文所述的分离的TCR；(ii)包含编码重组TCR的核酸的病毒颗粒；(iii)经修饰以表达如本文所述的重组TCR的免疫细胞，例如T细胞或NK细胞；(iv)编码如本文所述的重组TCR的核酸。在一些实施方案中，本公开提供了组合物，其包含含有编码本文所述的重组TCR的核苷酸序列的慢病毒载体颗粒(或已使用本文所述的载体颗粒修饰以表达重组TCR的T细胞)。可以在如本文进一步描述的本公开内容的方法中向受试者施用这样的组合物。

包含如本文所述的修饰的T细胞的组合物可用于根据已知技术的用于过继性免疫治疗的方法和组合物，或基于本公开内容对本领域技术人员显而易见的其变体。

在一些实施方案中，通过首先从它们的培养基中收获它们，然后在适合于以治疗有效量施用的培养基和容器***(“药学上可接受的”载体)中洗涤和浓缩细胞来配制细胞。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)，但也可以使用5％葡萄糖水溶液或林格乳酸盐。输注介质可以补充人血清白蛋白。

组合物中用于有效治疗的细胞的数目通常大于10个细胞，多至10⁶个，多至并包括10⁸个或10⁹个细胞，并且可以超过10¹⁰个细胞。细胞的数目将取决于组合物预期的最终用途以及其中包含的细胞类型。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为一升或更小，可以为500ml或更小，甚至250ml或100ml或更小。因此，期望的细胞密度通常大于10⁶个细胞/ml并且通常大于10⁷个细胞/ml，通常为10⁸个细胞/ml或更大。免疫细胞的临床相关数目可以分配到多次输注中，其累积等于或超过10⁹、10¹⁰或10¹¹个细胞。本文提供的药物组合物可以是各种形式，例如固体、液体、粉末、水性或冻干形式。合适的药物载体的实例是本领域已知的。这样的载体和/或添加剂可以通过常规方法配制并且可以以合适的剂量施用于受试者。稳定剂如脂质、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂可以防止组合物在体内降解。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。

如本文所述的重组TCR或包含编码本文提供的重组TCR的核苷酸序列的病毒载体颗粒可以被包装为试剂盒。试剂盒可以任选地包含一种或多种组件，例如使用说明书、装置和额外试剂，以及用于实施该方法的组件，例如管、容器和注射器。示例性试剂盒可以包含本文提供的编码重组TCR的核酸、重组TCR多肽或病毒，并且可以任选地包括使用说明书、用于检测受试者体内病毒的装置和用于向受试者施用组合物的装置。

本文还考虑了包含编码目的基因(例如重组TCR)的多核苷酸的试剂盒。本文还考虑了包含编码目的序列(例如重组TCR)的病毒载体和任选的编码免疫检查点抑制剂的多核苷酸序列的试剂盒。

本文考虑的试剂盒还包括用于实施检测编码本文公开的任何一种或多种TCR的多核苷酸的存在的方法的试剂盒。特别地，这样的诊断试剂盒可以包括用于进行深度测序以检测编码本文公开的TCR的多核苷酸的适当扩增和检测引物和其它相关试剂的组件。在另一些实施方案中，本文的试剂盒可以包含用于检测本文公开的TCR的试剂，例如抗体或其它结合分子。诊断试剂盒还可以包含用于确定编码本文公开的TCR的多核苷酸的存在或用于确定本文公开的TCR的存在的说明书。试剂盒还可以包含说明书。说明书通常包括描述以下的有形表达：试剂盒中包含的组件和施用方法，包括确定受试者的适当状态、适当剂量和适当施用方法的方法。说明书还可以包括在治疗时间的持续时间内监测受试者的指导。

本文提供的试剂盒还可以包含用于向受试者施用本文所述的组合物的装置。本领域已知的用于施用药物或疫苗的多种装置中的任一种可以被包含在本文提供的试剂盒中。示例性装置包括但不限于皮下针、静脉内针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，例如滴管。通常，用于施用试剂盒的病毒的装置将与试剂盒的病毒兼容；例如，诸如高压注射装置的无针注射装置可以包含在病毒不会被高压注射破坏的试剂盒中，但通常不包含在病毒被高压注射破坏的试剂盒中。

本文提供的试剂盒还可以包含用于向受试者施用化合物例如T细胞激活剂或刺激剂或TLR激动剂例如TLR4激动剂的装置。本领域已知的用于向受试者施用药物的多种装置中的任一种可以被包含在本文提供的试剂盒中。示例性装置包括皮下针、静脉内针、导管、无针注射装置，但不限于皮下针、静脉内针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，例如滴管。通常，用于施用试剂盒化合物的装置将与化合物的期望施用方法兼容。

实验

1.实验：MAGEA1特异性TCR的分离

为了分离对MAGEA1衍生表位具有特异性并且对任何感兴趣的MHC分子有限制的T细胞，使用了体外引发方法。引发***使用HLA-A*02:01阴性供体的成熟树突细胞(mDC)作为抗原呈递细胞，以启动抗原特异性T细胞应答和自体CD8⁺T细胞的扩增。编码小基因(SEQID NO:27)并被翻译成包含MAGEA1衍生肽KVLEYVIKV(如参考SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的体外转录RNA(ivtRNA)作为特异性抗原的来源。同时，将人HLA-A*02:01编码ivtRNA用作转染到mDC中的限制性元件的来源，以根据该专用HLA等位基因建立同种异体引发(如WO2007/017201中所述)。电穿孔到mDC中后，小基因编码ivtRNA被翻译成蛋白质，随后由共转染的mDC表达的转基因HLA-A*02:01分子将其加工并呈递为肽。T细胞与来自同一供体的ivtRNA转染的mDC的体外共培养导致作为相应TCR的来源的抗原特异性T细胞的从头诱导。扩增后，抗原特异性T细胞可以通过有限稀释或基于FACS的单细胞分选进行富集和单细胞克隆。

1.1实验布局

用于分离和鉴定高亲和力TCR的T细胞的树突细胞引发是根据以下方案使用通过同种异体HLA-A*02:01分子的肽呈递完成的：

根据Jonuleit等人(Jonuleit等人1997,Eur.J.Immunol.1997,27:3135-3142)，使用DC的合适的成熟化混合物在8天内产生成熟树突细胞。抗原呈递细胞(8天mDC)来自健康供体，并且用20μg编码MG_X1的ivtRNA和20μg编码同种异体HLA分子(HLA-A*02:01)的ivtRNA通过电穿孔转染细胞。随后将制备的mDC与健康供体的自体富含CD8⁺的PBMC以1:20的比例在补充有IL-7(第0天为5ng/ml)和IL-2(每二至三天50U/ml)的合适的细胞培养基中于37℃(6％CO₂)共培养约14天。随后，使用HLA-A*02:01MAGEA1_278-286多聚体(ProImmune)鉴定MAGEA1_278-286特异性细胞，并且随后使用FACS技术通过单细胞分选进行分离。

1.2结果

所描述的体外引发方法导致了表达候选TCR T15.8-4.3-83的T细胞克隆的鉴定。使用NGS分析鉴定TCR序列，在合适的效应T细胞中重建和转基因表达，以在功能和安全性方面对TCR进行全面表征。

2.实验：表位特异性

为确保转基因表达的重组TCR的功能，将TCR转导的效应T细胞与负载肽的T2细胞(靶细胞)共培养。TCR介导的对特定肽:MHC复合物的识别导致表达TCR的T细胞的激活和某些细胞因子(例如IFN-γ)的分泌。为了分析共培养上清液中分泌的IFN-γ，进行了ELISA。

2.2实验布局

向表达HLA-A*02的T2细胞负载饱和量的肽(10^-5M)。负载有MAGEA1衍生的KVL肽(SEQ ID NO:1)的T2细胞作为阳性靶标，负载有不相关ASTN1肽(SEQ ID NO:28)的T2细胞作为阴性靶标。作为效应细胞，来自两个不同供体的富含CD8的T细胞群体被转导以稳定表达重组TCR T15.8-4.3-83。制备效应子以表达两种不同版本的TCR T15.8-4.3-83，一种版本具有鼠C区(murC)，另一种版本具有人的最小鼠源化C区(mmC)。对照MAGEA1-TCR(基准TCR)也在来自两个不同供体的T细胞中表达并进行分析。

效应细胞和靶细胞在96孔圆底板中以2.5:1的E:T共培养。共培养约20小时后，收获上清液并通过ELISA(标准夹心ELISA，BD人IFN-γELISA组件)进行分析。

2.3结果

表达TCR的效应细胞仅在与负载KVL肽的T2细胞共培养后才分泌IFN-γ，表明由转基因TCR T15.8-4.3-83介导的对所呈递肽:MHC复合物的特异性识别，并证明了其功能。阴性靶标(负载有不相关ASTN1肽(SEQ ID NO:28,KLYGLDWAEL)的T2细胞)未被识别(图1)。转基因TCR介导特异性靶标识别和IFN-γ分泌，其与TCR的C区无关。

3.实验：限制分析

由于TCR仅在与特定MHC分子组合时才能识别其特异性表位，因此不仅抗原表达水平而且靶细胞的HLA类型(体外和体内)将靶标定义为阳性或阴性靶标。换句话说，根据HLA类型，患者可以被包括在或不包括在基于TCR的ACT治疗方案。

为了评估除了HLA-A*02:01之外，哪些HLA分子可以负载MAGEA1衍生的KVL肽并且可以被表达TCR T15.8-4.3-83的T细胞识别，进行了详细的限制分析。因此，将涵盖了欧洲人和北美白种人中最常见的HLA同种异型的53个LCL细胞系(EBV转化的B细胞)用作APC(抗原呈递细胞)并与未负载或负载KVL肽的TCR表达效应细胞共培养(图2)。

3.1实验布局：

向53个LCL细胞系负载饱和量的MAGEA1衍生的KVL肽(10^-5M；SEQ ID NO:1)约1.5小时，洗涤并随后与来自不同效应子制备物的表达TCR T15.8-4.3-83的效应子共培养。未负载的LCL用作对照。在96孔圆底板中以1:1的E:T设置共培养物，约20小时后收集上清液，并通过ELISA(标准夹心ELISA，BD人IFN-γELISA组件)分析IFN-γ的水平。

3.2结果

TCR T15.8-4.3-83的限制分析表明了TCR识别其MAGEA1衍生表位的潜力，这些表位不仅呈递在HLA-A*02:01上，而且以不同程度也呈递在HLA-A*02:04、HLA-A*02:16和HLA-A*02:17上。图2仅示出了导致肽特异性识别高于对于未负载的LCL检测到的背景水平的那些LCL(在53个测试中)的数据。

4.实验：肿瘤细胞识别

为了分析T细胞受体的效力、特异性及其用于临床应用的适用性，通过测量与TCR转导的效应细胞共培养后的IFN-γ分泌，测试了一组肿瘤细胞系的TCR介导的识别。

4.1实验布局(图3)：

将来自3个不同供体的效应细胞用TCR T15.8-4.3-83和基准Ctrl.MAGEA1-TCR进行转导。将TCR转导或未转导的效应子与不同的肿瘤细胞系共培养。细胞系U266、NCI-H1703、UACC-62、Saos-2和Mel624.38(HLA-A2+/MAGEA1+)以及HLA-A2转染的细胞系KYO-1和OPM-2(HLA-A2+/MAGEA1+)作为阳性靶标。细胞系NCI-H1755、647-V和CMK(HLA-A2+/MAGEA1-)、未修饰的OPM-2和KYO-1(HLA-A2-/MAGEA1+)作为阴性靶标。各细胞系的HLA-A2表达通过FACS进行分析(数据未示出)，MAGEA1表达数据使用qPCR产生或从本领域技术人员已知的公开可用数据库中提取。作为对照，所有效应子也与负载有饱和浓度(10^-5M)的MAGEA1衍生的KVL肽(SEQ ID NO:1)或不相关的ASTN1肽(SEQ ID NO:28)的T2细胞共培养。对于共培养，将效应子和靶标以2.5:1的E:T接种在96孔圆底板中，共培养约20小时后收集上清液，并通过ELISA分析IFN-γ的水平。

4.2结果(图3)：

通过将T15.8-4.3-83转导的效应子与一组不同的肿瘤细胞系共培养来评估TCR有效识别肿瘤细胞的潜力。如图3所示，T15.8-4.3-83和Ctrl MAGEA1-TCR均介导了对HLA-A2阳性且MAGEA1阳性的肿瘤细胞系U266、NCi-H1703、UACC-62、Saos-2和Mel624.38的特异性识别。KYO-1和OPM-2细胞仅在用编码HLA-A2的ivtRNA转染后才能被识别。

未转染的KYO-1和OPM-2(HLA-A2-/MAGEA1-阳性)以及NCI-H1755、647-V和CMK(HLA-A2+/MAGEA1-)作为阴性对照。每当抗原MAGEA1不表达或需要的限制性元件不存在时，没有阴性对照被识别。这种仅对MAGEA1阳性且HLA-A2阳性的细胞系的有效识别表明了TCR的高效且特异性的肿瘤细胞识别能力。

4.3实验布局(图10)

将20000个TCR转基因效应T细胞与20000个肿瘤细胞在96孔圆底板中共培养。在与黑色素瘤细胞系UACC-257、黑色素瘤细胞系UACC-62或骨肉瘤细胞系SAOS-2共培养20小时后进行标准IFN-γELISA。高于4000pg的值使用三次多项式外推。

4.5结果(图10)：

评估了TCR转基因效应T细胞群体响应于MAGEA1和HLA-A*02:01双阳性肿瘤细胞系产生IFN-γ的能力。与WO2018/170338中公开的TCR FH1、FH2、FH3和FH4和WO2018/104438中公开的R37P1C9相比，T15.8-4.3-83表现出对所有三种细胞系UACC-257、UACC-62或SAOS-2的增强的肿瘤细胞识别能力。UACC-62仅被T15.8-4.3-83识别。

5.实验：肿瘤细胞杀伤

TCR不仅识别而且有效地裂解并由此杀伤肿瘤细胞的能力具有极其重要性和临床意义。为了分析TCR T15.8-4.3-83的杀伤能力，使用IncuCyte^TM Zoom装置进行了6天的长期杀伤测试。IncuCyte^TM装置是一种允许对细胞进行实时成像的基于显微镜的***。将一组肿瘤细胞系接种到96孔平底板的孔中，并与来自3个不同供体的表达TCR的效应子共培养。肿瘤细胞系稳定表达核限制性红色荧光蛋白mKate2，使IncuCyte^TM Zoom System能够确定每个孔中红色荧光细胞的确切数目。每孔细胞数随时间增加将意味着肿瘤细胞的生长，而每孔细胞数的减少将指示TCR介导的杀伤。

5.1实验布局(图4A-4D)

根据制造商的说明书，使用IncuCyte^TM NucLight^TM Red Lentivirus Reagent用核限制性红色荧光蛋白mKate2稳定转导肿瘤细胞系647-V(膀胱尿路上皮癌)、UACC-62(黑色素瘤)、Saos-2(骨骨肉瘤)和NCI-H1703(肺腺癌)。将肿瘤细胞接种在96孔平底板中，过夜使其附着在塑料上。作为阳性对照，向肿瘤细胞负载饱和浓度的MAGEA1衍生的KVL肽(10^-5M)约1.5小时，洗涤，然后用于共培养。负载KVL或未修饰的肿瘤细胞单独培养，或与来自3个不同供体的TCR T15.8-4.3-83转导的效应子共培养。与未转导的效应子的共培养作为阴性对照。每2小时使用IncuCyte^TM Zoom System拍摄照片并使用IncuCyte^TM Zoom软件(2016B版)进行分析。

5.2结果(图4A-4D)

图4A-4D分别示出了红色荧光靶细胞系647-V(HLA-A2+/MAGEA1-)、UACC-62(HLA-A2+/MAGEA1+)、Saos-2(HLA-A2+/MAGEA1+)和NCI-H1703(HLA-A2+/MAGEA1+)的TCR介导的抗原特异性裂解。虽然未转导的效应细胞对任何肿瘤细胞的生长没有影响(随时间细胞数增加)，但用TCR T15.8-4.3-83转导的效应细胞有效地杀伤表达抗原MAGEA1和HLA-A2的肿瘤细胞NCI-H1703、UACC-62和Saos-2(随时间细胞数减少)。MAGEA1-阴性的647-V细胞未被杀伤。当人工负载KVL肽作为对照时，所有肿瘤细胞都被杀伤。还分析了单独培养的未负载或负载KVL肽的肿瘤细胞，并在每个图中显示了其生长作为参考。

5.3实验布局(图11)

将20000个TCR转基因效应T细胞与7500个

NucLight Red慢病毒转导的SAOS-2细胞共培养。在共培养开始前一天接种肿瘤细胞。添加效应细胞后，将培养板转移到IncuCyte

装置，并在37℃和6％CO₂条件下监测红色荧光细胞的扩增72小时，每4小时拍摄一次照片。使用IncuCyte

软件计算每个测量点每孔的红色荧光肿瘤细胞的细胞计数(1/mm²)。每个测量点代表3次技术重复的平均值。

5.4结果(图11)

在未转导的T细胞存在下培养的SAOS-2细胞表现出强烈的增殖。不同TCR转基因T细胞的共培养诱导SAOS-2细胞数减少。有趣的是，不同的TCR转基因效应细胞之间的杀伤速度和程度不同。与WO2018/170338中公开的TCR FH1、FH2、FH3和FH4以及WO2018/104438中公开的R37P1C9相比，TCR T15.8-4.3-83表现出最高的裂解MAGEA1且HLA-A*02:01双阳性肿瘤细胞系的能力。

6.实验：TCR表位识别基序

为了详细分析TCR的特异性表位识别基序，进行了苏氨酸替换扫描和/或丝氨酸扫描。通过用苏氨酸(或分别用丝氨酸)替换表位的原始氨基酸，可以确定表位内对于TCR介导的识别必不可少的位置。这种识别取决于肽与HLA分子的正确结合并取决于肽:MHC复合物与TCR本身的相互作用，这两者都会受到一个单氨基酸替换的影响。

6.1实验布局(图5和图6)

为了具体定义TCR T15.8-4.3-8的表位识别基序，制备了来自3个不同供体的表达TCR T15.8-4.3-83的效应子以及表达基准MAGEA1-TCR的效应子。将T细胞与负载有TCR特异性表位KVL(SEQ ID NO:1)或负载有每个单独氨基酸残基连续被苏氨酸替换的肽(苏氨酸替换扫描)的T2细胞共培养。向T2细胞分别负载饱和浓度(10^-5M)的肽，洗涤并与效应子以1:1的E:T共培养。共培养约20小时后收集上清液，并通过ELISA分析分泌的IFN-γ。

6.2结果(图5和图6)

用TCR T15.8-4.3-83转导(如图6所示)或用基准Ctrl.MAGEA1-TCR转导(如图5所示)的效应子的苏氨酸替换扫描结果证明了各个TCR对其表位和表位衍生衍生物的不同特异性。作为参考，MAGEA1衍生的KVL表位的识别示出在每个图的左侧。基准Ctrl.MAGE A1-TCR无法识别在第4和7位具有苏氨酸替换的肽(E和I，图5)。

相比之下，TCR T15.8-4.3-83似乎对第1、3和5位(K、L和Y)的氨基酸替换高度敏感，如通过缺少肽识别指示的(图6)。

表位内单个氨基酸的交换显著干扰两种TCR介导的识别，证明了它们的高度选择性识别模式，并且对于两种分析的TCR而言，对识别至关重要的位置明显不同。

6.3.实验布局(图13)

将20000个TCR转基因T细胞与20000个负载10^-5M肽的T2细胞共培养。共培养20小时后进行标准的IFN-γELISA(高于4000pg的值使用三次多项式外推)。代替上述苏氨酸残基，使用丝氨酸残基***地替换MAGEA1_KVL肽中的各个氨基酸(丝氨酸扫描)。

6.4结果(图13)

用T15.8-4.3-83TCR转导的T细胞表现出与用FH1或R37P1C9 TCR转导的T细胞在不同固定位置的不同识别基序(根据丝氨酸扫描)。

苏氨酸和丝氨酸扫描的组合表明表位中的第一个位置(赖氨酸)和表位中的第5个位置(酪氨酸)似乎对T15.8-4.3-83TCR特别重要。

7实验：MAGE家族成员

由于MAGE家族的13个成员包含与MAGEA1衍生的KVL肽高度相似的肽序列(仅2-4个错配的氨基酸)，因此进行了深入分析以进一步研究潜在的TCR T15.8-4.3-83介导的交叉识别。MAGE家族成员的表达不仅在癌症和睾丸中被描述，而且在重要器官中也有描述，这使得蛋白质衍生肽的潜在交叉识别成为用于临床开发的TCR的排除标准。

为了研究对源自其它MAGE家族成员的内源加工和呈递的肽的识别，在不同来源的3个细胞系中重组表达了包含与MAGEA1表位KVLEYVIKV相似的肽序列的MAGE家族的所有13个成员。通过共培养表达重组MAGE家族成员的细胞系和表达TCR T15.8-4.3-83的效应子，分析了蛋白质衍生MAGE肽的潜在交叉识别。

7.1实验布局

产生编码以下MAGE家族成员的IvtRNA：MAGEA8(NCBI参考序列(登陆):NM_001166400.1)、MAGEA9(NM_005365.4)、MAGEA11(NM_005366.4)、MAGEB1(NM_002363.4)、MAGEB2(NM_002363.4)、MAGEB3(NM_002365.4)、MAGEB5(NM_001271752.1)、MAGEB16(NM_001099921.1)、MAGEB17(NM_001277307.1)、MAGEB18(NM_173699.3)、MAGEC2(NM_016249.3)、MAGED2(NM_014599.5)和MAGEE2(NM_138703.4)。产生编码MAGEA1(NM_004988.4)和ASTN1肽KLY的IvtRNA作为阳性和阴性对照RNA。将肿瘤细胞系HEK 293T(HLA-A2+/MAGE-)、LCL(HLA-A2+/MAGE-)和HLA-A2转导的K562(MAGE-)分别用20μg编码13个MAGE家族成员之一、MAGEA1或ASTN1肽KLY的ivtRNA进行转染。通过FACS分析MAGE家族成员的转基因表达(数据未示出)。作为对照，T2细胞以及3个细胞系额外负载MAGEA1衍生的KVL肽(10^-5M)或ASTN1衍生的KLY肽(10^-5M)。在转染后3小时将负载肽的对照细胞和转染的细胞系接种到96孔圆底板中，并与来自2个供体的未转导或TCR T15.8-4.3-83转导的效应子以1:1的E:T比共培养。共培养约20小时后收集上清液，并通过ELISA分析分泌的IFN-γ。

7.2结果

图7示出了TCR T15.8-4.3-83介导的对HEK 293T细胞(A)、K562细胞(B)和LCL细胞(C)中表达的重组MAGE家族成员的识别。在外部负载有KVL肽或ASTN1肽的T2细胞以及HEK293T、K562或LCL细胞的识别用作对照。虽然未转导的效应子没有表现出任何特异性识别，但来自2个供体的TCR T15.8-4.3-83转导的效应子特异性识别用全长MAGEA1编码ivtRNA转染的所有3个细胞系。这表明将MAGEA1编码RNA有效翻译成MAGEA1蛋白和蛋白质衍生的KVL肽的蛋白酶体加工，然后由细胞表面的HLA-A2分子负载和呈递表位。没有识别任何用ASTN1肽转染的细胞系，也没有识别任何高于背景水平的重组表达的MAGE家族成员。可以在靶细胞的人工负载(如前所述)后识别的MAGE家族成员衍生的肽未由内源表达的MAGE蛋白加工，也未负载到MHC分子上或呈递到细胞表面上。因此，这些肽不具备免疫原性T细胞表位的资格，也不被认为是TCR T15.8-4.3-83介导的交叉识别的临床相关靶标。

8.实验：正常细胞分析

为了研究TCR的安全性，必须研究和排除TCR介导的对来自不同来源的健康组织的细胞的识别。因此，将表达TCR的效应子与来自肾(由PromoCell获得的肾皮质上皮细胞)、肺(由Lonza获得的肺成纤维细胞)和iPS衍生的肝细胞、心肌细胞和内皮细胞(通过CellularDynamics获得)的正常细胞共培养。所研究的细胞对抗原MAGEA1呈内源阴性，因此可以鉴定潜在的MAGEA1不相关的脱靶毒性。

8.1实验布局

按照供应商的规定，在共培养之前将正常细胞解冻并培养一周。将细胞接种在96孔平底板中，并与来自3个不同供体的TCR T15.8-4.3-83转导或未转导的效应子(数据未示出)共培养。通过抗体染色和FACS确认靶细胞的HLA-A2表达(数据未示出)，并测试未修饰或负载过量(10^-5M)MAGEA1衍生的KVL(SEQ ID NO:1)肽的靶细胞作为对照。作为对照，单独接种效应细胞和靶细胞，并且向T2细胞负载TCR的表位KVL(10^-5M；SEQ ID NO:1)。共培养约20小时后，收集上清液并通过ELISA进行分析。共培养约48小时后，使用IncuCyte^TM Zoom装置(Essen BioScience Inc.)拍摄相差图像，以使贴壁靶细胞的裂解和脱离方面的潜在毒性作用可视化。

8.2结果

如图8所示，来自3个供体的TCR T15.8-4.3-83转导的效应子的共培养导致仅识别人工负载KVL肽的细胞，代表靶细胞在MHC分子背景下在其细胞表面正确呈递TCR表位的潜力。未修饰的正常细胞不被表达转基因TCR T15.8-4.3-83的效应子识别，表明所研究受体的安全性良好。

为了使由TCR转导的效应子介导的对靶细胞的潜在毒性作用可视化，对单独培养、与TCR T15.8-4.3-83转导的效应子共培养的不同靶细胞或与表达TCR的效应子共培养的负载KVL肽的靶细胞拍摄相差图像。图9示出了与来自三个供体之一的与效应细胞共培养的代表性图片。虽然所有负载KVL的靶细胞都有明显的TCR介导的裂解(细胞层的完全破坏)，但表达TCR的效应细胞不会裂解未修饰的正常细胞。

9实验：功能亲合力

为了测量不同KVL肽特异性TCR的功能亲合力，确定了与负载有梯度量的KVL肽的T2细胞共培养时的半数最大相对IFN-γ释放(EC50值)。

功能亲合力是指转基因TCR和pMHC复合物之间各个非共价结合相互作用的多重亲和力的累积强度。

9.1实验布局(图12)

TCR转基因T细胞群体的功能亲合力被确定为与负载有梯度量的KVL肽(10^-4M至10^-12M)的T2细胞共培养时的半数最大相对IFN-γ释放(EC50值)。共培养20小时后进行标准IFN-γELISA(大于4000pg的值使用三次多项式外推)。

9.2结果(图12)

不同的KVL特异性TCR对负载有KVL肽的T2细胞具有不同的功能亲合力。TCRT15.8-4.3-83显示出较低的EC50值，即与WO2018/170338中公开的TCR FH1、FH2、FH3和FH4和WO2018/104438中公开的R37P1C9相比，对负载有KVL肽的2种细胞具有高功能亲合力。

10实验：细胞因子分泌

比较了用不同TCR转导的T细胞的TH2特异性细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的TCR分泌模式。Th2型炎症已被提出促进肿瘤生长(Jager MJ,Desjardins L,

T,Damato BE(eds):Current Concepts in Uveal Melanoma.Dev Ophthalmol.Basel,Karger,2012,第49卷,第137–149页,J Immunother.2018Oct；41(8):369-378)。因此，Th2的低或不可检测的分泌水平可能有利于肿瘤消退。

10.1实验布局(图14)

将20000个TCR转基因效应T细胞与20000个肿瘤细胞在圆底96孔板中共培养。使用

MAP Kit根据

***中的方案分析无细胞上清液中分泌的细胞因子。

10.2结果(图14)

用T1367 TCR转导的T细胞分泌多种TH2细胞因子，尤其是IL-4、IL-5和IL-13。用15.8-4.3-83TCR转导的T细胞未表现出等量的TH2细胞因子分泌，而WO2014/118236中公开的T1367表现出这些细胞因子的显著分泌。

本申请还包括以下实施方案：

实施方案1：对MAGEA1特异的分离的T细胞受体(TCR)。

实施方案2：根据实施方案1的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别氨基酸序列SEQID NO:1或其片段。

实施方案3：根据实施方案1和2的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HLA-A2和/或HLA-A26结合形式，优选HLA-A2结合形式。

实施方案4：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别由选自由HLA-A*02:01、HLA-HLA-A*02:04、HLA-A*02:16和HLA-A*02:17组成的组的基因编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

实施方案5：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别由选自由HLA-A*02:01、HLA-A*02:04、HLA-A*02:16和HLA-A*02:17组成的组的基因编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

实施方案6：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

实施方案7：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR包含

-包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的TCRα链，

-包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3的TCRβ链。

实施方案8：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR包含

具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRα区和具有与SEQ IDNO:9至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRβ区。

实施方案9：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR包含

具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCRα区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区。

实施方案10：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR包含

具有与SEQ ID NO:10至少80％相同的氨基酸序列的TCRα链和具有与SEQ ID NO:11至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ链。

实施方案11：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR包含

具有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的氨基酸序列的TCRβ链。

实施方案12：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR包含TCRα链和TCRβ链，其中

-可变TCRα区具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列，并且包含具有在SEQ ID NO:4中示出的氨基酸序列的CDR3，

-可变TCRβ区具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列，并且包含具有在SEQ IDNO:7中示出的氨基酸序列的CDR3。

实施方案13：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR是纯化的。

实施方案14：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR的氨基酸序列包含一个或多个表型沉默替换。

实施方案15：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR的氨基酸序列被修饰以包含可检测标记、治疗剂或药代动力学修饰部分。

实施方案16：根据实施方案15的分离的TCR，其中所述治疗剂选自由免疫效应分子、细胞毒剂和放射性核素组成的组。

实施方案17：根据实施方案16的分离的TCR，其中所述免疫效应分子是细胞因子。

实施方案18：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR是可溶的或膜结合的。

实施方案19：根据实施方案15的分离的TCR，其中所述药代动力学修饰部分是至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团或其组合。

实施方案20：根据前述实施方案中任一项的分离的TCR，其中所述TCR为单链型，其中所述TCRα链和所述TCRβ链通过接头序列连接。

实施方案21：根据实施方案1至20的分离的TCR，其中所述TCRα链或所述TCRβ链被修饰以包含表位标签。

实施方案22：分离的多肽，包含实施方案1至21中任一项的TCR的功能部分，其中所述功能部分包含SEQ ID NO:4和7的氨基酸序列中的至少一个。

实施方案23：分离的多肽，包含实施方案1至21中任一项的TCR的功能部分，其中所述功能部分包含SEQ ID NO:2、3、4、5、6和7的氨基酸序列。

实施方案24：根据实施方案21的分离的多肽，其中所述功能部分包含TCRα可变链和/或TCRβ可变链。

实施方案25：多价TCR复合物，包含如实施方案1至21中任一项所体现的TCR。

实施方案26：根据实施方案1至21的分离的TCR、根据实施方案22至24的多肽、根据实施方案25的多价TCR复合物，其中通过与由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列结合诱导IFN-γ分泌。

实施方案27：核酸，编码根据实施方案1至21中任一项的TCR或编码根据实施方案22至24的多肽。

实施方案28：载体，包含实施方案27的核酸。

实施方案29：根据实施方案28的载体，其中所述载体是表达载体。

实施方案30：根据实施方案28或29的载体，其中所述载体是逆转录病毒载体。

实施方案31：根据实施方案28或29的载体，其中所述载体是慢病毒载体。

实施方案32：细胞，表达根据实施方案1至21的TCR。

实施方案33：根据实施方案32的细胞，其中所述细胞是分离的或非天然存在的。

实施方案34：根据实施方案32和33的细胞，其中所述细胞包含根据实施方案27的核酸或根据实施方案28至31的载体。

实施方案35：根据实施方案32至34所述的细胞，其中所述细胞包含：

a)包含至少一种如实施方案27中所体现的核酸的表达载体，或

b)包含编码如实施方案1至21中任一项所体现的TCR的α链的核酸的第一表达载体，和包含编码如实施方案1至21中任一项所体现的TCR的β链的核酸的第二表达载体。

实施方案36：根据实施方案32至35中任一项的细胞，其中所述细胞是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。

实施方案37：根据实施方案32至36中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。

实施方案38：抗体或其抗原结合片段，特异性结合根据实施方案1至21的TCR的介导对MAGEA1的特异性的部分。

实施方案39：根据实施方案38的抗体，其中所述TCR的介导MAGEA1特异性的部分包含SEQ ID NO:2、3、4、5、6和7中示出的CDR中的至少一个，优选SEQ ID NO:4的α链CDR3和/或SEQ ID NO:7的β链CDR3，更优选SEQ ID NO:2、3和4中示出的α链CDR，和SEQ ID 5、6和7的β链CDR。

实施方案40：药物组合物，包含根据实施方案1至21的TCR、根据实施方案22至24的多肽、根据实施方案25的多价TCR复合物、根据实施方案27的核酸、根据实施方案28至31的载体、根据实施方案32至37中任一项的细胞，或根据实施方案38至39的抗体。

实施方案41：根据实施方案40的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体。

实施方案42：根据实施方案1至21的TCR、根据实施方案22至24的多肽、根据实施方案25的多价TCR复合物、根据实施方案27的核酸、根据实施方案28至31的载体、根据实施方案32至37中任一项的细胞、或根据实施方案38至39的抗体，用于作为药物使用。

实施方案43：根据实施方案1至21的TCR、根据实施方案22至24的多肽、根据实施方案25的多价TCR复合物、根据实施方案27的核酸、根据权利要求28至31的载体或根据实施方案32至37中任一项的细胞，用于在治疗癌症中使用。

实施方案44：根据实施方案43的TCR、多肽、多价TCR复合物、核酸、载体或细胞，其中所述癌症是血液癌症或实体瘤。

实施方案45：根据实施方案43和44的TCR、多肽、多价TCR复合物、核酸、载体或细胞，其中所述癌症选自由以下组成的组：***癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、***、结直肠癌、胃腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、髓细胞白血病和急性淋巴母细胞白血病、肉瘤或骨肉瘤。

实施方案46：根据实施方案43和44的TCR、多肽、多价TCR复合物、核酸、载体或细胞，其中所述癌症优选地选自由肉瘤或骨肉瘤组成的组。

序列表

<110> 基因医疗免疫疗法有限责任公司（Medigene Immunotherapies GmbH）

<120> MAGEA1特异性T细胞受体及其用途

<130> M11421

<150> EP19167440

<151> 2019-04-04

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Thr Arg Asp Thr Thr Tyr Tyr

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Arg Asn Ser Phe Asp Glu Gln Asn

1 5

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Cys Ala Leu Ser Glu Val Ala Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr

1 5 10 15

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Gly Thr Ser Asn Pro Asn

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Ser Val Gly Ile Gly

1 5

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Cys Ala Trp Ser Gly Ser Gly Gly Asn Gln Pro Gln His Phe

1 5 10

<210> 8

<211> 138

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Met Leu Thr Ala Ser Leu Leu Arg Ala Val Ile Ala Ser Ile Cys Val

1 5 10 15

Val Ser Ser Met Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Thr Glu Ile Ser

20 25 30

Val Val Glu Lys Glu Asp Val Thr Leu Asp Cys Val Tyr Glu Thr Arg

35 40 45

Asp Thr Thr Tyr Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Gly Glu

50 55 60

Leu Val Phe Leu Ile Arg Arg Asn Ser Phe Asp Glu Gln Asn Glu Ile

65 70 75 80

Ser Gly Arg Tyr Ser Trp Asn Phe Gln Lys Ser Thr Ser Ser Phe Asn

85 90 95

Phe Thr Ile Thr Ala Ser Gln Val Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

100 105 110

Ala Leu Ser Glu Val Ala Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly

115 120 125

Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val His Pro Tyr

130 135

<210> 9

<211> 130

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Met Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Thr Phe Phe Gly Val

1 5 10 15

Arg Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val

20 25 30

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro

35 40 45

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu

50 55 60

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn

65 70 75 80

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys

85 90 95

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Asn Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser

115 120 125

Ile Leu

130

<210> 10

<211> 278

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 最小鼠源化恒定区

<400> 10

Met Leu Thr Ala Ser Leu Leu Arg Ala Val Ile Ala Ser Ile Cys Val

1 5 10 15

Val Ser Ser Met Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Thr Glu Ile Ser

20 25 30

Val Val Glu Lys Glu Asp Val Thr Leu Asp Cys Val Tyr Glu Thr Arg

35 40 45

Asp Thr Thr Tyr Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Gly Glu

50 55 60

Leu Val Phe Leu Ile Arg Arg Asn Ser Phe Asp Glu Gln Asn Glu Ile

65 70 75 80

Ser Gly Arg Tyr Ser Trp Asn Phe Gln Lys Ser Thr Ser Ser Phe Asn

85 90 95

Phe Thr Ile Thr Ala Ser Gln Val Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

100 105 110

Ala Leu Ser Glu Val Ala Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly

115 120 125

Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro

130 135 140

Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys

145 150 155 160

Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met

180 185 190

Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe

195 200 205

Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe

210 215 220

Phe Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser

225 230 235 240

Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly

245 250 255

Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr

260 265 270

Leu Arg Leu Trp Ser Ser

275

<210> 11

<211> 307

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 最小鼠源化恒定区

<400> 11

Met Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Thr Phe Phe Gly Val

1 5 10 15

Arg Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val

20 25 30

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro

35 40 45

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu

50 55 60

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn

65 70 75 80

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys

85 90 95

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Asn Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser

115 120 125

Ile Leu Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe

130 135 140

Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val

145 150 155 160

Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp

165 170 175

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro

180 185 190

Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser

195 200 205

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe

210 215 220

Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr

225 230 235 240

Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp

245 250 255

Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val

260 265 270

Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu

275 280 285

Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg

290 295 300

Lys Asp Phe

305

<210> 12

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠恒定区

<400> 12

Met Leu Thr Ala Ser Leu Leu Arg Ala Val Ile Ala Ser Ile Cys Val

1 5 10 15

Val Ser Ser Met Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Thr Glu Ile Ser

20 25 30

Val Val Glu Lys Glu Asp Val Thr Leu Asp Cys Val Tyr Glu Thr Arg

35 40 45

Asp Thr Thr Tyr Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Gly Glu

50 55 60

Leu Val Phe Leu Ile Arg Arg Asn Ser Phe Asp Glu Gln Asn Glu Ile

65 70 75 80

Ser Gly Arg Tyr Ser Trp Asn Phe Gln Lys Ser Thr Ser Ser Phe Asn

85 90 95

Phe Thr Ile Thr Ala Ser Gln Val Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

100 105 110

Ala Leu Ser Glu Val Ala Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly

115 120 125

Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Glu Pro

130 135 140

Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys

145 150 155 160

Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu

165 170 175

Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met

180 185 190

Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe

195 200 205

Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser

210 215 220

Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp

225 230 235 240

Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu

245 250 255

Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp

260 265 270

Ser Ser

<210> 13

<211> 303

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠恒定区

<400> 13

Met Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Thr Phe Phe Gly Val

1 5 10 15

Arg Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val

20 25 30

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro

35 40 45

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu

50 55 60

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn

65 70 75 80

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys

85 90 95

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Asn Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser

115 120 125

Ile Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Thr Leu Phe

130 135 140

Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val

145 150 155 160

Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp

165 170 175

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala

180 185 190

Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val

195 200 205

Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val

210 215 220

Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro

225 230 235 240

Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp

245 250 255

Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr

260 265 270

Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu

275 280 285

Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Lys Lys Asn Ser

290 295 300

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化

<400> 14

acacgggaca ccacctacta c 21

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化

<400> 15

cggaacagct tcgacgagca gaac 24

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化

<400> 16

tgcgccctga gcgaagtggc cagcggcggc tcttacatcc ctaca 45

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化

<400> 17

ggcaccagca atcccaac 18

<210> 18

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化

<400> 18

agcgtcggca tcggc 15

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化

<400> 19

tgtgcttgga gtggcagcgg cggcaatcag cctcagcact tt 42

<210> 20

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化

<400> 20

atgctgacag cctctctgct gagagccgtg atcgccagca tctgtgtggt gtctagcatg 60

gcccagaaag tgacacaggc ccagaccgag atcagcgtgg tggaaaaaga agatgtgacc 120

ctggactgcg tgtacgagac acgggacacc acctactacc tgttctggta caagcagcct 180

cctagcggcg agctggtgtt cctgatcaga cggaacagct tcgacgagca gaacgagatc 240

tccggccggt acagctggaa cttccagaag tccaccagca gcttcaactt caccatcacc 300

gccagccagg tggtggatag cgccgtgtat ttttgcgccc tgagcgaagt ggccagcggc 360

ggctcttaca tccctacatt tggcagaggc accagcctga tcgtgcaccc ttat 414

<210> 21

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化

<400> 21

atgctgtgtt ctctgctggc tctgctgctg ggcacctttt ttggcgtcag aagccagacc 60

atccaccagt ggcctgctac actggtgcag cctgttggaa gccctctgag cctggaatgt 120

accgtggaag gcaccagcaa tcccaacctg tactggtaca gacaggccgc tggaagagga 180

ctgcagctgc tgttttacag cgtcggcatc ggccagatca gcagcgaggt tccacagaat 240

ctgagcgcca gcagacccca ggacagacag tttatcctga gcagcaagaa gctgctgctg 300

agcgacagcg gcttctacct gtgtgcttgg agtggcagcg gcggcaatca gcctcagcac 360

tttggagatg gcacccggct gagcatcctg 390

<210> 22

<211> 837

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 最小鼠源化恒定区, 密码子优化

<400> 22

atgctgacag cctctctgct gagagccgtg atcgccagca tctgtgtggt gtctagcatg 60

gcccagaaag tgacacaggc ccagaccgag atcagcgtgg tggaaaaaga agatgtgacc 120

ctggactgcg tgtacgagac acgggacacc acctactacc tgttctggta caagcagcct 180

cctagcggcg agctggtgtt cctgatcaga cggaacagct tcgacgagca gaacgagatc 240

tccggccggt acagctggaa cttccagaag tccaccagca gcttcaactt caccatcacc 300

gccagccagg tggtggatag cgccgtgtat ttttgcgccc tgagcgaagt ggccagcggc 360

ggctcttaca tccctacatt tggcagaggc accagcctga tcgtgcaccc ttatattcag 420

aaccccgatc ctgccgtgta ccagctgaga gacagcaaga gcagcgacaa gagcgtgtgt 480

ctgttcaccg acttcgacag ccagaccaac gtgtcccaga gcaaggacag cgacgtgtac 540

atcaccgaca agaccgtgct ggacatgcgg agcatggact tcaagagcaa cagcgccgtg 600

gcctggtcca acaagagcga tttcgcctgc gccaacgcct tcaacaatag cattatcccc 660

gaggacacat tcttccccag ctccgatgtg ccctgcgacg tgaagctggt ggaaaagagc 720

ttcgagacag acaccaacct gaacttccag aacctgagcg tgatcggctt cagaatcctg 780

ctgctgaagg tggccggctt caatctgctg atgaccctga gactgtggtc cagctga 837

<210> 23

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 最小鼠源化恒定区, 密码子优化

<400> 23

atgctgtgtt ctctgctggc tctgctgctg ggcacctttt ttggcgtcag aagccagacc 60

atccaccagt ggcctgctac actggtgcag cctgttggaa gccctctgag cctggaatgt 120

accgtggaag gcaccagcaa tcccaacctg tactggtaca gacaggccgc tggaagagga 180

ctgcagctgc tgttttacag cgtcggcatc ggccagatca gcagcgaggt tccacagaat 240

ctgagcgcca gcagacccca ggacagacag tttatcctga gcagcaagaa gctgctgctg 300

agcgacagcg gcttctacct gtgtgcttgg agtggcagcg gcggcaatca gcctcagcac 360

tttggagatg gcacccggct gagcatcctg gaagatctga acaaggtgtt ccctccagag 420

gtggccgtgt tcgagccttc taaggccgag attgcccaca cacagaaagc cacactcgtg 480

tgcctggcta ccggcttctt tcctgaccac gtggaactgt cttggtgggt caacggcaaa 540

gaggtgcaca gcggcgtcag cacagatccc cagcctctga aagaacagcc cgctctgaac 600

gacagccggt actgtctgag cagcagactg agagtgtccg ccacattctg gcagaacccc 660

agaaaccact tcagatgcca ggtgcagttc tacggcctga gcgagaacga tgagtggacc 720

caggatagag ccaagcctgt gacacagatc gtgtctgccg aagcctgggg cagagccgat 780

tgtggaatta ccagcgccag ctaccatcag ggcgtgctgt ctgccacaat cctgtacgag 840

atcctgctgg gcaaagccac tctgtacgcc gtgctggtgt ctgccctggt gctgatggcc 900

atggtcaaga gaaaggactt ttga 924

<210> 24

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠恒定区, 密码子优化

<400> 24

atgctgacag cctctctgct gagagccgtg atcgccagca tctgtgtggt gtctagcatg 60

gcccagaaag tgacacaggc ccagaccgag atcagcgtgg tggaaaaaga agatgtgacc 120

ctggactgcg tgtacgagac acgggacacc acctactacc tgttctggta caagcagcct 180

cctagcggcg agctggtgtt cctgatcaga cggaacagct tcgacgagca gaacgagatc 240

tccggccggt acagctggaa cttccagaag tccaccagca gcttcaactt caccatcacc 300

gccagccagg tggtggatag cgccgtgtat ttttgcgccc tgagcgaagt ggccagcggc 360

ggctcttaca tccctacatt tggcagaggc accagcctga tcgtgcaccc ttatatccag 420

aatccggagc ccgccgtata ccagctgaag gaccctagaa gccaggacag caccctgtgc 480

ctgttcaccg acttcgacag ccagatcaac gtgcccaaga ccatggaaag cggcaccttc 540

atcaccgaca agacagtgct ggacatgaag gccatggaca gcaagtccaa cggcgcaatc 600

gcctggtcca accagaccag cttcacatgc caggacatct tcaaagagac aaacgccaca 660

taccccagca gcgacgtgcc ctgtgatgcc accctgacag agaagtcctt cgagacagac 720

atgaacctga acttccagaa tctgtccgtg atgggcctga gaatcctgct gctgaaggtg 780

gccggcttca atctgctgat gaccctgcgg ctgtggtcca gctga 825

<210> 25

<211> 912

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠恒定区

<400> 25

atgctgtgtt ctctgctggc tctgctgctg ggcacctttt ttggcgtcag aagccagacc 60

atccaccagt ggcctgctac actggtgcag cctgttggaa gccctctgag cctggaatgt 120

accgtggaag gcaccagcaa tcccaacctg tactggtaca gacaggccgc tggaagagga 180

ctgcagctgc tgttttacag cgtcggcatc ggccagatca gcagcgaggt tccacagaat 240

ctgagcgcca gcagacccca ggacagacag tttatcctga gcagcaagaa gctgctgctg 300

agcgacagcg gcttctacct gtgtgcttgg agtggcagcg gcggcaatca gcctcagcac 360

tttggagatg gcacccggct gagcatcctg gaagatctcc ggaacgtgac cccccctaaa 420

gtgaccctgt tcgaacccag caaggccgag atcgccaaca agcagaaagc caccctcgtg 480

tgcctggcca gaggcttctt ccccgaccat gtggaactgt cttggtgggt caacggcaaa 540

gaggtgcaca gcggagtgtc caccgaccct caggcctaca aagagagcaa ctacagctac 600

tgcctgagca gcagactgcg ggtgtccgcc accttctggc acaacccccg gaaccacttc 660

aggtgccagg tgcagtttca cggcctgagc gaagaggaca agtggcccga aggctccccc 720

aagcccgtga cccagaatat ctctgccgag gcctggggca gagccgactg tggaattacc 780

agcgccagct accaccaggg cgtgctgtct gccaccatcc tgtacgagat cctgctgggc 840

aaggccaccc tgtacgccgt gctggtgtct ggcctggtgc tgatggccat ggtcaagaag 900

aagaacagct ga 912

<210> 26

<211> 395

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 26

Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly

1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu

20 25 30

Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala

35 40 45

Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala

50 55 60

His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu

65 70 75 80

Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe

85 90 95

Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg

100 105 110

Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu

115 120 125

Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln

130 135 140

Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile

145 150 155 160

Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu

165 170 175

His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val

180 185 190

Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr

195 200 205

Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln

210 215 220

Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro

225 230 235 240

Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr

245 250 255

Ile Val Ala Asn Pro His His His His His His Tyr Phe Ser Lys Glu

260 265 270

Glu Trp Glu Lys Met Lys Ala Ser Glu Lys Ile Phe Tyr Val Tyr Met

275 280 285

Lys Arg Lys Tyr Glu Ala Met Thr His His His His His His Asp Lys

290 295 300

Thr Gly Phe His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Glu Asp Trp Val

305 310 315 320

Val Thr Ala Ala His Cys Gly Val Arg Thr Ser His His His His His

325 330 335

His Ser Ser Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Thr Lys Leu Ile Pro Trp

340 345 350

Val Gln Lys Ile Leu Ala Ala Asn His His His His His His Pro Arg

355 360 365

Ala Leu Ala Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys

370 375 380

Val Ser Ala Arg Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser

385 390 395

<210> 27

<211> 1188

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 27

atgtgggtcc cggttgtctt cctcaccctg tccgtgacgt ggattggtgc tgcacccctc 60

atcctgtctc ggattgtggg aggctgggag tgcgagaagc attcccaacc ctggcaggtg 120

cttgtggcct ctcgtggcag ggcagtctgc ggcggtgttc tggtgcaccc ccagtgggtc 180

ctcacagctg cccactgcat caggaacaaa agcgtgatct tgctgggtcg gcacagcctg 240

tttcatcctg aagacacagg ccaggtattt caggtcagcc acagcttccc acacccgctc 300

tacgatatga gcctcctgaa gaatcgattc ctcaggccag gtgatgactc cagccacgac 360

ctcatgctgc tccgcctgtc agagcctgcc gagctcacgg atgctgtgaa ggtcatggac 420

ctgcccaccc aggagccagc actggggacc acctgctacg cctcaggctg gggcagcatt 480

gaaccagagg agttcttgac cccaaagaaa cttcagtgtg tggacctcca cgttatttcc 540

aacgacgtgt gtgcgcaagt tcaccctcag aaggtgacca agttcatgct gtgtgctgga 600

cgctggacag ggggcaaaag cacctgctcg ggtgattctg ggggcccact tgtctgtaac 660

ggtgtgcttc aaggtatcac gtcatggggc agtgaaccgt gtgccctgcc cgaaaggcct 720

tccctgtaca ccaaggtggt gcattaccgg aagtggatca aggacaccat cgtggccaac 780

ccccatcacc atcaccacca ctacttctct aaggaagagt gggaaaagat gaaagcctcg 840

gagaaaatct tctatgtgta tatgaagaga aagtatgagg ctatgactca tcaccatcac 900

caccacgaca aaaccggctt ccacttctgc gggggctccc tcatcagcga ggactgggtg 960

gtcaccgctg cccactgcgg ggtcaggacc tcccatcacc atcaccacca ctccagccct 1020

ggcgtgtacg cccgtgtcac caagctcata ccttgggtgc agaagatcct ggctgccaac 1080

catcaccatc accaccaccc aagggccctc gctgaaacca gctatgtgaa agtccttgag 1140

tatgtgatca aggtcagtgc aagagttcgc tttttcttcc catcctga 1188

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

Lys Leu Tyr Gly Leu Asp Trp Ala Glu Leu

1 5 10

Claims

1.对MAGEA1特异的分离的T细胞受体(TCR)。

2.根据实施方案1所述的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别氨基酸序列SEQ ID NO:1或其片段。

3.根据实施方案1和2所述的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HLA-A2结合形式。

4.根据前述实施方案中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR特异性识别由选自由HLA-A*02:01、HLA-A*02:04、HLA-A*02:16和HLA-A*02:17组成的组的基因编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，优选地其中所述TCR特异性识别由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

5.根据前述实施方案中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR包含：

6.根据前述实施方案中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR包含具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRα区和具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRβ区。

7.分离的多肽，包含实施方案1至21中任一项所述的TCR的功能部分，其中所述功能部分包含SEQ ID NO:4和7的氨基酸序列中的至少一个，优选地其中所述功能部分包含SEQ IDNO:2、3、4、5、6和7的氨基酸序列。

8.多价TCR复合物，包含至少两个如权利要求1至6中任一项所述的TCR。

9.根据权利要求1至6所述的分离的TCR、根据权利要求7所述的多肽、根据权利要求8所述的多价TCR复合物，其中通过与由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列结合来诱导IFN-γ分泌。

10.核酸，编码根据权利要求1至6中任一项所述的TCR或编码根据权利要求7所述的分离的多肽。

11.载体，包含权利要求10所述的核酸，其中所述载体优选为表达载体，更优选为逆转录病毒载体或慢病毒载体。

12.细胞，表达根据权利要求1至6所述的TCR。

13.抗体或其抗原结合片段，特异性结合根据权利要求1至6所述的TCR的介导MAGEA1特异性的部分，优选地其中所述TCR的介导MAGEA1特异性的部分包含SEQ ID NO:4的α链CDR3和/或SEQ ID NO:7的β链CDR3。

14.根据权利要求1至6所述的TCR、根据权利要求7所述的多肽、根据权利要求8所述的多价TCR复合物、根据权利要求10所述的核酸、根据权利要求11所述的载体、根据权利要求12所述的细胞或根据权利要求13所述的抗体，用于作为药物使用。

15.根据权利要求1至6所述的TCR、根据权利要求7所述的多肽、根据权利要求8所述的多价TCR复合物、根据权利要求10所述的核酸、根据权利要求11所述的载体、根据权利要求12所述的细胞或根据权利要求13所述的抗体，用于在治疗癌症中使用，其中所述癌症选自由以下组成的组：***癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、***、结直肠癌、胃腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、髓细胞白血病和急性淋巴母细胞白血病、肉瘤或骨肉瘤。