NO328913B1 - P38-inhibitorer, deres anvendelse og farmasoytiske sammensetninger omfattende forbindelsene - Google Patents

Abstract

Det beskrives inhibitorer av p38 samt fremgangsmåter for fremstilling av disse inhibitorer. Det beskrives videre farmasøytiske preparater omfattende inhibitorene og fremgangsmåter for anvendelse av disse samt farmasøytiske preparater ved terapi og prevensjon av forskjellige lidelser som er mediert av p38.

Description

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår nye inhibitorer av p38 MAP-kinase og relaterte kinaser, farmasøytiske preparater inneholdende inhibitorer og anvendelse av forbindelsene. De er brukbare for behandling av inflammasjon, osteoartritt, reumatoid artritt, psoriasis, Crohns sykdom, inflammatorisk tarmsykdom, cancer, autoimmune sykdommer og for behandling av andre cytokinmedierte sykdommer.

Beskrivelse av kjent teknikk

Et antall kroniske og akutte inflammatoriske tilstander er assosiert med overproduksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner. Slike cytokiner inkluderer, men er ikke begrenset til, tumornekrosefaktor a (TNF-a), interleukin l-p\ (IL-ip), interleukin 8 (IL-8) og interleukin 6 (IL-6). Reumatoid artritt (RA) er en kronisk sykdom der TNF-a og IL-ip er implikert i starten av sykdommen og ved progresjonen av ben- og leddestruk-sjon man ser ved denne debihterende tilstand. Nylig godkjente, terapeutiske behandlinger for RA har inkludert oppløst TNF-a-reseptor (etanresept) og IL-l-reseptoranta-gonist (anakinra). Disse behandlinger bevirker blokkering av evnen for de respektive cytokinene til å binde til sine naturlige reseptorer. Alternative metoder for å behandle cytokin-medierte sykdommer er i dag under undersøkelse. En slik metode involverer inhibering av signaleringsveien som regulerer syntesen og produksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner som p38.

P38 (også CSBP eller RK) er en serin/treonin-mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) som er påvist å regulere pro-inflammatoriske cytokiner. P38 ble først identifisert som en kinase som ble tyrosinfosforylert i musemonocytter etter behandling med lipopolysakkarider (LPS). En forbindelse mellom p38 og responsen hos celler på cytokiner ble først fastslått av J. Saklatvala et al., Cell, 78: 1039-1049 (1994), som påviste at IL-1 aktiverer en proteinkinasekaskade som resulterer i fosforylering av det lille varmesjokk-protein Hsp27, sannsynligvis ved mitogenaktivert proteinaktivert proteinkinase 2 (MAPKAP-kinase-2). Analyse av peptidsekvenser avledet fra den rensede kinase antyder at den var relatert til p38 MAPK aktivert av LPS i muse-monocytter, se J. Han et al., Science, 265: 808-811 (1994). Samtidig ble det påvist at p39 MAPK i sin tur ble aktivert av en oppstrømskinase som respons på et spektrum av cellulært stress inkludert eksponering til UV-stråling og osmotisk sjokk, og at identiteten for kinasen som direkte fosforylerer Hsp27 ble bekreftet som MAPKAP-kinase-2, se J. Rouse, et al., Cell, 78: 1027-1037 (1994). Deretter har forskere hos SmithKline Beecham vist at p38 MAPK var det molekylære mål for en serie pyridinylimidazol forbindelser som inhiberte produksjonen av TNF fra LPS-utfordrede humane monocytter, se J. Lee et al., Nature, 372, 739-746. Dette var en nøkkeloppdagelse og har ført til utvikling av et antall selektive inhibitorer av p38 MAPK og klargjøring av dennes rolle ved cytokinsignaler-ing.

Det er nå kjent at diverse former for p38 MAPK (a, P, y, 8), hver kodet av et separat gen, utgjør en del av en kinasekaskade som er involvert i responsen av celler på en varietet av stimuli inkludert osmotisk stress, UV-lys og cytokinmedierte hendelser. Disse fire isoformer av p38 er antatt å regulere forskjellige aspekter ved intracellulær signalering. Aktiveringen er en del av en kaskade av signaleringshendelsen som fører til syntesen og produksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner som TNF-a. P38-funksjonerer ved fosforyleringen nedstrøms substrater som inkluderer andre kinaser og transkripsjonsfaktorer. Midler som inhiberer p38-kinase er også påvist å blokkere produksjonen av cytokiner inkludert, men ikke begrenset til TNF-a, IL-6, IL-8 og IL-lp in vitro- og -in vivo-modeller, se J.L. Adams, Progress in Medicinal Chemistry, 38: 1-60 (2001).

Perifere blodmonocytter (PBMCer) er påvist å uttrykke og skille ut pro-inflammatoriske cytokiner når de stimuleres med lipopolysakkarid (LPS) in vitro. P38-inhibitorer blokkerer effektivt denne effekt når PBMCer forbehandles med slike forbindelser før stimulering med LPS, se J.C. Lee, et al., i Int. J. ImmunopharmacoL, 10: 835-843

(1988). Effektiviteten for p38-inhibitorer i dyremodeller av inflammatoriske sykdommer har utløst en undersøkelse av den eller de underliggende mekanismer som kunne gjøres ansvarlig for effekten av disse inhibitorer. Rollen for p38 i responsen hos celler og IL-1 og TNF er undersøkt i et antall cellesystemer som er relevante for inflammatorisk respons ved bruk av en pyridinylimidazolinhibitor: endotelialceller og IL-8, S. Hashimoto et al. i J. Pharmacol. Exp. Ther., 293: 370-375 (2001), fibroblaster og IL-6/GM-CSF/PGE2 Beyaert, R, et al. i EMBO J., 15: 1914-1923 (1996), neutrofiler og IL-8-, E.A. Albanyan et al. i Infect.Immun., 68: 2053-2060 (2000), makrofager og IL-1, M. Caviano og P. Cohen i J. hnmunol., 164: 3018-3025 (2000); og glattmuskelceller og RANTES, se S. Maruoka et al. i Am. J. Respir. Crit. Care med., 161: 659-668 (1999). De destruktive effekter for mange sykdomstilstander er forårsaket av overproduksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner. Evnen hos p38-inhibitorer til å regulere denne overproduksjon gjør dem til utmerkede kandidater for sykdomsmodifiserende midler. Inhibitorer av p38 er aktive i et antall bredt erkjente sykdomsmodeller og viser positiv effektivitet i et antall standard dyremodeller på inflammasjon, inkludert rottecollagen-indusert artritt, se J.R. Jackson et al. i J. Pharmacol. Exp. Ther., 284: 687-692 (1998); rotteadjuvant-indusert artritt, se A.M. Badger et al., Arthritis Rheum., 43: 175-183

(2000); se A.M. Badger et al. i J. Pharmacol. Exp. Ther. 279: 1453-1461 (1996); og karrageenanindusert puteødem i mus, se T. Nishikori et al. i Eur. J. Pharm., 451: 327-333 (2002). Molekyler som blokker p38-funksjonen er påvist å være effektive ved inhibering av benresorpsjon, inflammasjon og andre immun- og inflammasjonsbaserte patologier i disse dyremodeller. Således vil en sikker og effektiv p38-inhibitor gi et middel for å behandle debiliterende sykdommer eller som kan reguleres ved modulering av p38-signalering som, men ikke begrenset til, RA.

P38-inhibitorer er velkjente for fagmannen. Oversikter over tidligere inhibitorer har bidratt til å etablere strukturaktivitetssammenhenger som er viktige for forsterket aktivitet både in vitro og in vivo, se E.G. Salituro et al. i Current Medicinal Chemistry, 6: 807-823 (1999) og M.L. Foster et al. i Drug News Perspect., 13: 488-497 (2000).

Nyere oversikter har fokusert på den strukturelle diversitet for nye inhibitorer undersøkt som p38-inhibitorer, se J.D. Boehm og J.L. Adams i Exp. Opin. Ther. Patents, 10: 25-37

(2000). Foreliggende oppfinnelse beskriver en ny serie substituerte 2-aza-[4.3.0]-bisyk-liske heteroaromatiske forbindelser som p38-inhibitorer som er brukbare for behandling av inflammasjon, osteoartritt, reumatoid artritt, cancer, autoimmun sykdom og for

behandling av andre cytokinmedierte sykdommer.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forbindelser og farmasøytiske preparater inneholdende forbindelsene som inhiberer p38-cc og de assosierte p38-medierte hendelser som inhibering av cytokinproduksjon. Slike forbindelser, generelt angitt som 2-aza-[4.3.0]bisykliske, heteroaromatiske ringer, har brukbarhet som terapeutiske midler for sykdommer som kan behandles ved inhibering av p38-signaleirngsveien.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

De ledsagende figurer som utgjør en del av beskrivelsen, viser utførelsesformer av oppfinnelsen og tjener sammen med beskrivelsen til å forklare prinsippene i oppfinnelsen.

I figurene viser

Figurene 1A-1C viser et reaksjonsskjema for syntesen av forbindelser som har den generiske strukturen 11; Figur 2 viser et reaksjonsskjema for syntesen av forbindelse 17d.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbindelse, innbefattende solvater og farmasøytisk akseptable salter derav, som er valgt fra: 5-(4-fluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (2-dimeetylaminoetyl)amid; (S)-metyl-2-(5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-yl-karboksamido)-4-dimetylamino)-butanoat;

(S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-N-(4-dimetylamino)-1 -hydroksybutan-2-yl)-1 -isobutyl- 1H-indazol-6-karboksamid;

(S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-1 -isobutyl-1 H-indazol-6-karboksylsyre (1 -hydroksymetyl-3-isopropylaminopropyl)amid;

(S)-2-{[5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karbonyl]-amino}-4-dimetyl-aminosmørsyre;

(S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-1 -isobutyl- lH-indazol-6-karboksylsyre (3-dimetylamino-1 - dimetylkarbamoylpropyl)amid;

(S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-1 -isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (3-dimetylamino-1 - metylkarbamoylpropyl)amid; og

(S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (l-karbamoyl3-dimetylaminopropyl)amid.

Forbindelsene kan representeres ved den generelle formel I

Uttrykket "solvat" henviser til et aggregat av et molekyl med et eller flere oppløsningsmiddelmolekyler.

Et "farmasøytisk akseptabelt salt" er et salt som bibeholder den biologiske effektiviteten til de frie syrer og baser av de spesifiserte forbindelser og som ikke er uønsket, verken biologisk eller på annen måte. En forbindelse ifølge oppfinnelsen kan ha en tilstrekkelig sur, en tilstrekkelig basisk gruppe eller begge deler, og kan i henhold til dette reagere med en hvilken som helst av et antall uorganiske eller organiske baser, og uorganiske og organiske syrer, for å danne farmasøytisk akseptable salter. Eksempler på farmasøytisk akseptable salter inkluderer de salter som fremstilles ved omsetning av forbindelsene ifølge oppfinnelsen med mineral- eller organiske syrer eller en uorganisk base idet slike salter inkluderer sulfater, pyrosulfater, bisulfater, sulfitter, bisulfitter, fosfater, mono-hydrogenfosfater, dihydrogenfosfater, metafosfater, pyrofosfater, klorider, bromider, jodider, acetater, propionater, dekanoater, kaprylater, akrylater, formater, iso-butyrater, kaproater, heptanoater, propionlater, oksalater, malonater, suksinater, suberater, seba-cater, fumarater, maleater, butyn-l,4-dioater, heksyn-l,6-dioater, benzoater, klorbenzo-ater, metylbenzoater, dinitrobenzoater, hydroksybenzoater, metoksybenzoater, ftalater, sulfonater, xylensulfonater, fenylacetater, fenylpropionater, fenylbutyrater, citrater, laktater, y-hydroksybutyrater, glykollater, tartrater, metansulfonater, propansulfonater, naftalen-1-sulfonater, naftalen-2-sulfonater og mandelater.

Hvis oppfinnelsens forbindelse er en base kan de ønskede, farmasøytisk akseptable salter, fremstilles på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, for eksempel ved behandling av den frie base med en uorganisk syre som salt-, hydrobrom-, svovel-, salpeter- og fosforsyre eller lignende, eller med en organisk syre som eddik-, malein-, rav-, mandel-, fumar-, malon-, pyruvin-, oksal-, glykol-, salisyl- eller en pyranosidyl-syre som glukuron- eller galaturonsyre, en alfahydroksysyre som sitron- eller vinsyre, en aminosyre som aspartin- eller glutaminsyre, en aromatisk syre som benzo- eller kanelsyre, en sulfonsyre som p-toluensulfon- eller etansufonsyre, eller lignende.

Hvis oppfinnelsens forbindelse er en syre kan det ønskede farmasøytisk akseptable saltet fremstilles på en hvilken som helst egnet måte, for eksempel behandling av den frie syren med en organisk eller uorganisk base som et amin (primært, sekundært eller tertiært), et alkali- eller jordalkalimetallhydroksid eller lignende. Illustrerende eksempler på egnede salter inkluderer organiske salter avledet fra aminosyrer som glysin og arginin, ammoniakk, primær, sekundær eller tertiære aminer, og sykliske aminer som piperidin, morfolin og piperazin og uorganiske salter avledet fra natrium, kalsium, kalium, magnesium, mangan, jern, kobber, sink, aluminium og litium. Oppfinnelsens forbindelser kan fremstilles ved bruk av reaksjonsveiene og syntese-skjemaene som beskrevet nedenfor og som benytter teknikker som er tilgjengelige i teknikken ved bruk av utgangsmaterialer som er lett tilgjengelige.

Figurene 1A-1C viser et eksempel på syntesen av en spesifikk forbindelse med den generelle Formel 1.1 en generell synteseprosess fremstilles forbindelser med Formel I som følger. l-Fluor-3-metylbenzen undergår en addisjonsreaksjon for å gi 2-fluor-4-metylbenzosyre, fulgt av nitrering for å gi 2-fluor-4-metyl-5-nitrobenzosyre. Syren-gruppen forestres og deretter erstattes fluorgruppen med ArO ved behandling med ArOH og en sterk base. Reduksjon av nitrogruppen fulgt av diazotering og ringslutning gir 5-OAr-6-C02Me indazolderivat som så behandles med RBr i nærvær av en base for å gi det 1-N-subtituerte derivat. Hydrolyse av estergruppen fulgt av amidering gir 6-amidindazolderivatet med Formel I.

Terapeutisk effektive mengder av forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan benyttes for å behandle sykdommer er mediert ved modulering eller regulering av proteinkinaser. En "effektiv mengde" er ment å bety en mengde av forbindelsen som, ved administrering til et pattedyr som trenger slik behandling, er tilstrekkelig til å bevirke behandling for en sykdom mediert av aktiviteten av en eller flere proteinkinaser som p38-cc og de assosierte p38-medierte hendelsene som cytokinproduksjon. For eksempel er en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse valgt av formel I eller et salt i en mengde som er tilstrekkelig til å modulere, regulere eller inhibere aktiviteten av en eller flere proteinkinaser slik at en sykomdomstilstand som er mediert ved denne aktivitet reduseres eller lindres.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en farmasøytisk sammensetning omfattende en forbindelse som omtalt ovenfor sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller en bærer.

Oppfinnelsen omfatter videre anvendelse av en forbindelse som omtalt ovenfor for fremstilling av et medikament for behandling av inflammatorisk sykdom, autoimmun sykdom, destruktiv benlidelse, proliferativ lidelse, infektiøs sykdom, viral sykdom eller en neurodegenerativ sykdom.

Mengden av et gitt middel som vil tilsvare en slik mengde vil variere avhengig av faktorer som den spesielle forbindelse, sykdomstilstanden og dennes alvor, identiteten (for eksempel vekten) til pattedyret som trenger behandling, mengden kan imidlertid ikke desto mindre bestemmes ved rutineforsøk av fagmannen på området. "Behandling" eller tilsvarende uttrykk er ment å bety en mitigering av en sykdomstilstand i et pattedyr som et menneske, som er påvirket, i det minste delvis, ved aktiviteten av en eller flere proteinkinaser som p38 og inkluderer til å forhindre sykdomstilstanden fra å opptre i et pattedyr, særlig når pattedyret er funnet å være disponert for sykdomstilstanden, men ennå ikke er diagnostisert til å ha den; modulering og/eller inhibering av sykdomstilstanden; og/eller lindring av sykdomstilstanden.

For å benytte en forbindelse med Formel I, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for terapeutisk behandling (inkludert profylaktisk behandling) av pattedyr inkludert mennesker, formuleres den vanligvis i henhold til farmasøytisk standardpraksis som et farmasøytisk preparat. I henhold til dette aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes et farmasøytisk preparat som omfatter en forbindelse med Formel I eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, som definert ovenfor, sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

Preparatene ifølge oppfinnelsen kan være i en form som er egnet for oral anvendelse (for eksempel som tabletter, drops, hård- og mykkapsler, vandige- eller oljesuspensjoner, emulsjoner, dispergerbare pulvere eller granuler, siruper eller eliksirer), for topisk anvendelse (for eksempel som kremer, salver, geler eller vandige eller oljeopp-løsninger eller -suspensjoner), for administrering ved inhalering (for eksempel som et finoppdelt pulver eller som en flytende aerosol), for administrering ved insufflering (for eksempel som et finoppdelt pulver), eller for parenteral administrering (for eksempel som en steril, vandig eller oljeoppløsning for intravenøs, subkutan eller intramuskulær dosering eller som et suppositorium for rektal dosering). For eksempel kan preparater som er ment for oral bruk inneholde et eller flere fargestoffer, søtnere, smaksstoffer og/eller preserveringsmidler.

Egnede farmasøytisk akseptable eksipienser for en tablettformulering inkluderer for eksempel inerte fortynningsmidler som laktose, natriumkarbonat, kalsiumfosfat eller kalsiumkarbonat, granulering- og desintegreirngsmidler som maisstivelse eller algin-syre; bindemidler som stivelse; smøremidler som magnesiumstearat, stearinsyre eller talkum; preserveirngsmidler som etyl- eller propyl-p-hydroksybenzoat, og antioksidanter som askorbinsyre. Tablettformuleringer kan være ubelagte eller belagte enten for å modifisere desintegrering og den etterfølgende absorpsjon av aktiv bestanddel i fordøyelseskanalen, eller for å forbedre stabiliteten og/eller utseende, i begge tilfeller ved bruk av konvensjonelle belegningsmidler og prosedyrer som velkjente i teknikken.

Preparater for oral bruk kan foreligge i form av hårdgelatinkapsler hvori den aktive bestanddel blandes med en inert, fast bærer, for eksempel kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat eller kaolin, eller som mykgelatinkapsler hvori den aktive bestanddel blandes med vann eller en olje som jordnøtt- eller olivenolje eller flytende parafin.

Vandige suspensjoner inneholder generelt den aktive bestanddel i fint pulverisert form sammen med et eller flere suspenderingsmidler som natriumkarboksymetylcellulose, metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, natriumalginat, polyvinylpyrrolidon, tragakant- og akasia-gummi; dispergerings- eller fuktemidler som lecitin eller kondensasjonsprodukter av et alkylenoksid med fettsyrer (for eksempel polyoksyetylenstearat) eller kondensasjonsprodukter av etylenoksid med langkjedede alifatiske alkoholer, for eksempel heptadekaetylenoksycetanol eller kondensasjonsprodukter av etylenoksid med partialestere avledet fra fettsyrene og en heksitol slik som polyoksyetylensorbitolmono-oleat, eller kondensasjonsprodukter av etylenoksid med partialestere avledet fra fettsyrer og heksitolanhydrider, for eksempel polyetylensorbitanmonooleat. De vandige suspensjoner kan også inneholde et eller flere preserveringsmidler (som etyl- eller propyl-p-hydroksybenzoat), antioksidanter (som askorbinsyre), fargestoffer, smaksstoffer og/eller søtningsmidler (som sukrose, sakkarin eller aspartam).

Oljesuspensjoner kan formuleres ved å suspendere den aktive bestanddel i en vegetabilsk olje (som arakis-, oliven-, sesam eller kokosnøttolje) eller i en mineralolje (som flytende parafin). Olj esuspensj oner kan også inneholde fortykkere som bivoks, hard parafin eller cetylalkohol. Søtnere som angitt ovenfor og smaksstoffer kan tilsettes for å gi et spiselig, oralpreparat. Disse preparater kan preserveres ved tilsetning av en antioksidant som askorbinsyre.

Dispergerbare pulvere og granuler som er egnet for fremstilling av en vandig suspensjon ved tilsetning av vann inneholder generelt den aktive bestanddel sammen med dispergeringsmidler eller fuktemidler, et suspenderingsmiddel og et eller flere preserveringsmidler. Egnede dispergerings- eller fuktemidler og suspenderingsmidler er eksemplifisert ved de som allerede er nevnt ovenfor. Ytterligere eksipienter som søtnere, farge- eller smaksstoffer kan også være tilstede.

Farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan også foreligge i form av olje-i-vann emulsjoner. Oljefasen kan være en vegetabilsk olje som oliven- eller arakisolje, eller en mineralolje som for eksempel flytende parafin, eller en blanding av hvilke som helst av disse. Egnede emulgeringsmidler kan for eksempel være naturlig forekommende gummier som akasia- eller tragakantgummi, naturlig forekommende fosfatider som soyabønne, lecitin og estere eller partialestere avledet fra fettsyrer og heksitolanhydrider (for eksempel sorbitanmonooleat) og kondensasjonsprodukter av de nevnte partialestere med etylenoksid som polyoksyetylensorbitanmonooleat. Emulsjonene kan også inneholde søtnere, smaks- og preserveringsmidler.

Siruper og eliksierer kan formuleres med søtningsmidler som glyserol, propylenglykol, sorbitol, aspartam eller sukrose, og kan også inneholde et demulgerings-, preserver-ings-, smaks- og/eller fargemiddel.

De farmasøytiske preparater kan også foreligge i form av en steril, injiserbar vandig eller oljesuspensjon som kan formuleres i henhold til kjente prosedyrer ved bruk av et eller flere av de egnede dispergerings- eller fuktemidler, og suspenderingsmidler slik de er nevnt ovenfor. Et sterilt, injiserbart preparat kan også være en steril, injiserbar oppløsning eller suspensjon i et ikke-toksisk parenteralt aksepterbart fortynningsmiddel eller løsningsmiddel, for eksempel en oppløsning i 1,3-butandiol.

Suppositorieformuleringer kan fremstilles ved å blande den aktive bestanddel med en egnet, ikke-irriterende eksipient som er fast ved vanlig temperatur, men flytende ved rektaltemperaturen og som derfor smelter i rektum og frigir medikamentbruk. Egnede eksipienter inkluderer for eksempel kakaosmør og polyetylenglykoler.

Topiske formuleringer som kremer, salver, geler eller vandige eller oljeoppløsninger eller -suspensjoner kan generelt oppnås ved formulering av en aktiv bestanddel ved en konvensjonell, topisk aksepterbar bærer eller et fortynningsmiddel ved bruk av konvensjonelle prosedyrer som velkjent i denne teknologien.

Preparater for administrering ved insufflering kan foreligge i form av finoppdelte pulvere inneholdende partikler med en midlere diameter på for eksempel 30 um eller meget mindre, der pulveret per se omfatter enten aktiv bestanddel alene eller fortynnet med en eller flere fysiologisk aksepterbare bærere som laktose. Pulvere for insufflering blir så hensiktsmessig holdt i en kapsel som for eksempel inneholder 1 til 50 mg aktiv bestanddel for bruk med en turboinhalatorinnretning slik det for eksempel benyttes for insufflering av det kjente middelet natriumkromoglykat.

Preparater for administrering ved inhalering kan foreligge i form av en konvensjonell, trykksatt aerosol anordnet for å avgi den aktive bestanddel enten som en aerosol inneholdende finoppdelte faststoffer eller væskedråper. Konvensjonelle aerosoldrivemidler som flyktige, fluorerte hydrokarboner eller hydrokarboner kan benyttes og aerosol-innretningen er hensiktsmessig anordnet til å avgi en tildosert mengde aktiv bestanddel.

For ytterligere informasjon hva angår formuleringer henvises det til kapitel 25.2 i vol. 5 av Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990.

Mengden av en forbindelse ifølge oppfinnelsen som kombineres med en eller flere eksipienter for å gi en enkelt doseringsform vil nødvendigvis variere avhengig av verten som behandles og den spesielle administreringsvei. For eksempel kan en formulering ment for oral administrering til mennesker inneholde fra 0,5 til 2 g aktivt middel sammen med en egnet og hensiktsmessig mengde eksipienter som kan variere fra rundt 5 til 98 vekt% av det totale preparat. Enhetsdoseformen vil generelt inneholde rundt 1 mg til rundt 500 mg aktiv bestanddel. For ytterligere informasjon når det gjelder administreirngsveier og doseringsregimer henvises det til kaptiel 25.3 i Vol. 5 av Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990.

Størrelsen på dosen for terapeutiske eller profylaktiske formål av en forbindelse med Formel I vil naturligvis variere i henhold til arten og alvoret av tilstanden, alder og kjønn hos dyret eller pasienten samt administreringsvei, i henhold til velkjente medisinske prinsipper.

I et aspekt ved oppfinnelsen kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen eller farmasøytiske salter derav formuleres i farmasøytiske preparater for administrering til dyr eller mennesker for å behandle eller forhindre en p38-mediert tilstand. Uttrykket "p38-mediert tilstand" som benyttet her betyr en hvilken som helst sykdom eller annen skadelig tilstand der p38 er kjent for å spille en rolle. Dette inkluderer tilstander som er kjente for å være forårsaket av IL-1-, TNF-, IL-6- eller IL-8-overproduksjon. Slike tilstander inkluderer inflammatoriske sykdommer, autoimmunsykdommer, destruktive benlidelser, proliferative lidelser, infeksiøse sykdommer, virale sykdommer og neurodegenerative sykdommer.

Inflammatoriske sykdommer som kan behandles eller forhindres inkluderer akutt pankreatitt, kronisk pankreatitt, astma, allergier og adult respiratonsk distressyndrom.

Autoimmunsykdommer som kan behandles eller forhindres inkluderer glomerulonefritt, reumatoid artritt, systemisk lupus erytematose, skleroderma, kronisk tyroiditt, Graves sykdom, autoimmun gastritt, insulinavhengig diabetes mellitus (Type I), autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun neutropeni, trombocytopeni, atopisk dermatitt, kronisk aktiv hepatitt, myastenia gravis, multiple sklerose, inflammatorisk tarmsykdom, ulcerativ kolitt, Crohns sykdom, psoriasis, eller graft-versus-vert sykdom.

Destruktive benlidelser som kan behandles eller forhindres inkluderer osteoporose, osteoartritt og multiple myelomarelatert benlidelse.

Proliferative sykdommer som kan behandles eller forhindres inkluderer akutt myelogen leukemi, kronisk myelogen leukmi, metastatisk melanoma, Kaposis sarkom og multiple myeloma.

Infeksiøse sykdommer som kan behandles eller forhindres inkluderer sepsis, septisk sjokk og Shigellose.

Virale sykdommer som kan behandles eller forhindres inkluderer akutt hepatittinfeksjon (inkludert hepatitt A, hepatitt B og hepatitt C), HIV-infeksjon og CMV-retinitt.

Degenerative tilstander eller sykdommer som kan behandles eller forhindres ved hjelp av forbindelsene ifølge oppfinnelsen inkluderer Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, cerebral iskemi og andre neurodegenerative lidelser. "p38-medierte tilstander" inkluderer også iskemi/reperfusjon ved slag, hjerteattakk, myokardialt iskemi, organ-hypoksi, vaskulær hyperplasi, kardial hypertrofi og trombininduert plateaggregering.

I tillegg er p38-inhibitorene ifølge oppfinnelsen også i stand til å inhibere ekspresjon av induserbare, pro-inflammatoriske proteiner som prostaglandinendoperoksid syntase 2 (PGHS-2), også angitt som syklooksygenase-2 (COX-2). Derfor er andre "p38-medierte tilstander" ødem, analgesi, feber og smerte som neuromuskulær smerte, Tilstandene og sykdommene som kan behandles eller forhindres ved hjelp av p38-inhibitorene ifølge oppfinnelsen kan også hensiktsmessig grupperes ved det cytokin (for eksempel IL-1, TNF, IL-6, IL-8) som antas å være ansvarlig for sykdommen.

Således inkluderer en IL-1-mediert sykdom eller tilstand reumatoid artritt, osteoartritt, slag, endotoksemi og/eller toksisk sjokksyndrom, inflammatorisk reaksjon indusert av endotoksin, inflammatorisk tarmsykdom, tuberkulose, aterosklerose, muskeldegenerer-ing, kakeksi, psoriatisk artritt, Reiters syndrom, gikt, traumatisk artritt, rubella artritt, akutt synovitt, diabetes, pankreatiske P-cellesykdommer og Alzheimers sykdom.

En TNF-mediert sykdom eller tilstand inkluderer reumatoid artritt, reumatoid spondylitt, osteoartritt, gikt artritt og andre artritiske tilstander, sepsis, septisk sjokk, endotoksisk sjokk, gram-negativ sepsis, toksisk sjokksyndrom, adult respiratorisk distressyndrom, cerebral malaria, kronisk pulmonær inflammatorisk sykdom, silikose, pulmonær sarkoidose, benresorpsjonssykdommer, reperfusjonsskade, graft-versus-vertsreaksjon, allograft rejeksjoner, feber og myalgier på grunn av infeksjon, kakeksi sekundær til infeksjon, AIDS, ARC eller malignans, keloiddannelse, arrvevdannelse, Crohns sykdom, ulcerativ kolitt eller pyresis. TNF-medierte sykdommer inkluderer også virale infeksjoner som HIV, CMV, influensa og herpes; og veterinærvirale infeksjoner som lentivirusinfeksjoner som inkluderer ekvin infeksiøs anemivirus, kaprinartirttvirus, visnavirus eller maedivirus; eller retrovirusinfeksjoner inkludert felin immunodefekt virus, bovin immunodefekt virus eller canin immunodefekt virus. IL-8-medierte sykdommer eller tilstander inkluderer sykdommer som karakteriseres ved massiv, neutrofil infiltrering som psoriasis, inflammatorisk tarmsykdom, astma, kardial og renal reperfusjonsskade, adult respiratorisk distressyndrom, trombose og glomerulonefritt.

I tillegg kan forbindelsene ifølge oppfinnelsene benyttes topisk for å behandle eller forhindre tilstander forårsaket eller forverret av IL-1 eller TNF. Slike tilstander inkluderer betente ledd, eksem, psoriasis, inflammatoriske hudtilstander som solbrenthet, inflammatoriske øyetilstander som konjunktivitt, pyresis, smerte og andre tilstander assosiert med inflammasjon.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan benyttes i kombinasjon med andre medikamenter og terapier som benyttes ved behandling av sykdomstilstander som ville trekke fordel av inhibering av cytokiner, og særlig IL-1, TNF, IL-6 eller IL-8.

For eksempel, og på grunn av evnen til å inhibere cytokiner, er forbindelsene med Formel I av verdi ved behandling av visse inflammatoriske eller ikke-inflammatoriske tilstander som i dag behandles med syklooksygenaseinhibitorisk, ikke-steroid, anti-inflammatorisk medikament (NSAJD) som indometacinketorolak, acetylsalisylsyre, ibuprofen, sulindak, tolmetin og piroksikam. Ko-administrering av en forbindelse med Formel I med en NS AID kan resultere i en reduksjon av mengden av det sistenevnte middel som er nødvendig for å gi en terapeutisk effekt og således reduseres sannsynlig-heten for uønskede bivirkninger fra det benyttede NSAJD, for eksempel gastrointesti-nale virkninger. I henhold til et ytterligere trekk ved oppfinnelsen tilveiebringes det således et farmasøytisk preparat som omfatter en forbindelse med Formel I eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, i forbindelse eller blanding med et syklooksygenaseinhibitorisk, ikke-steriod, anti-inflammatorisk medikament, og en farmasøytisk akseptabel fortynningsmiddel eller bærer.

Forbindelsene med Formlene I kan også benyttes ved behandling av tilstander som reumatoid artritt i kombinasjon med anti-artrittiske midler som gull, metotreksat, steroider eller penicillinamin, og ved tilstander som osteoartritt i kombinasjon med steroider.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også administreres i degradative sykdommer som osteoartritt med kondroprotektive, anti-degradative og/eller reparative midler som diacerhein, hyaluronsyreformuleringer som hyalan, rumalon, arteparon og glukosamin-salter som antril.

Forbindelsene med Formel I kan også benyttes ved behandling av astma i kombinasjon med anti-astmamidler som bronkodilatorer og leukotrienantagonister.

Selv om forbindelsene med Formel I primært er av verdi som terapeutiske midler for anvendelse i varmblodige dyr (inkludert mennesker) er de også brukbare når det er nødvendig å inhibere virkningene av cytokiner. Således er de brukbare som farmako-logiske standarder for anvendelser i utvikling av nye biologiske tester og forskning etter nye, farmasøytiske midler.

Aktiviteten for forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan analyseres med henblikk på p38-inhibering in vitro, in vivo eller i en cellelinje. In vitro-analysene inkluderer analyser som bestemmer inhibering av enten kinaseaktiviteten eller ATPase-aktiviteten for til p38 og kan måles enten ved radiomerking av inhibitoren før binding, isolering av inhibitor-p38-kompleks og å bestemme omfanget av bundet radiomerking, eller ved å gjennomføre et konkurranseeksperiment der nye inhibitorer inkluderes med p38 bundet til kjente radio ligander. Disse og andre brukbare in vitro- og cellekulturanalyser er velkjente for fagfolk på området.

Cellekulturanalyser av den inhibitoriske effekt for forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan benyttes for å bestemme mengden av TNF-a, IL-1, IL-6 eller IL-8 som produseres i hel-blod eller cellefraksjoner derav i celler som er behandlet med inhibitor sammenlignet med celler som er behandlet med negative kontroller. Nivå av disse cytokiner kan bestemmes ved bruk av kommersielt tilgjengelige ELISAer eller som beskrevet i avsnittet nedenfor som biologiske eksempler.

BIOLOGISKE EKSEMPLER

Den biologiske aktivitet for forbindelsene ifølge oppfinnelsen ble vist ved de følgende in vitro-analyser.

P38 biokjemisk analyse

P38-aktiviteten ble analysert ved romtemperatur i en 100 ul reaksjon inneholdende 5 nM aktivert p38a-enzym og 1 uM ATF-2 (aktiverende transkripsjonsfaktor 2 fusjons-protein) som substrat i 25 raM HEPES (pH 7,4), 100 uM vanadat, 1 mM DTT, 10 raM MgCl2 og 10 uM [D-<33>P]-ATP (-0,1 uCi P<33>/reaksjon). Reaksjonene ble avsluttet etter 30-40 minutter ved å tilsette 25% TC A, henstand i 5 minutter hvoretter det hele direkte ble overført til en GF-B membranfilterplate. Filteret ble vasket to ganger i 30 sekunder med 0,5% fosforsyre ved bruk av en Tomtec Mach III Automated Harvestor. Etter vasking ble vakuum beholdt i 30 sekunder for å tørke filteret. Ca. 30 ul scintillasjons-væske ble satt til filterplaten per brønn og deretter avlest i en væske scintillasjonsteller (Packard TopCount HTS).

PBMC-analyse

Evnen hos forbindelsene ifølge oppfinnelsen til å inhibere TNF-a-produksjonen ble bedømt ved å benytte humane perifere blodmononukleære celler ("PBMC") som syntetiserer og skiller ut TNF-a ved stimulering med lipopolysakkarid.

Forbindelses testoppløsningene ble tildannet ved å foreta 5 ganger seriefortynninger med DMSO der fortynningene så ble fortynnet til 5x forråd med fortynning med MEM, 2% vandig inaktivert fetalt bovinserum ("FBS"), 20 mM HEPES, 2 raM L-glutamin og 1% penicillin/streptomycin.

PBMCene ble isolert fra humant blod som følger. Hele blodprøver ble samlet fra voksne frivillige i Vacutainer™ CPT fra Becton Dickinson. Rørene ble samlet og sentrifugert ved romtemperatur (18-25°C) i en horisontal rotor i minst 15 minutter ved 1500 - 1800 RCF (relativ sentrifugalkraft). For hver donor ble buffy coat-sjiktene slått sammen i et enkelt rør og vasket to ganger med fosfatbufret saltoppløsning ("PBS"). Cellepelleten ble resuspendert i MEM, 2% varmeinaktivert fetalt bovinserum ("FBS"), 20 mM HEPES, 2 mM L-glutamin og 1% penicillin/streptomycin. Totalt celleantall ble bestemt ved bruk av et hemocytometer og cellesuspensjonen ble justert til 2 x 106 celler/ml.

0,1 ml av cellesuspensjonen ble satt til hver brønn av en 96-brønners cellekulturplat. 30 ul av en forbindelses testoppløsning ble tilsatt og cellene inkubert i en 37°C 5% C02-inkubator i 1 time. 20 ul 7,5 ng/ml lipopolysakkand (LPS E. Coli K-235) ble så satt til hver brønn og cellene brakt tilbake til 37°C/5% C02-inkubatoren i 16-20 timer. Cellene ble sentrifugert i 15 minutter ved 1100 RCF. Rundt 0,12 ml av supernatanten ble over-ført til en ren 96-brønners polypropylenplate. Prøvene ble enten analysert umiddelbart eller lagret ved -80°C inntil de var ferdige for analyse. TNF-a-nivåene ble bestemt i hver prøve ved bruk av en human TNF-a ELISA-analyse som den som er beskrevet ovenfor.

TNF-a-nivåene ble bestemt ved bruk av følgende analyse. TNF-a antistoffbelagte plater ble preparert ved å sette 150 fil 2 ug/ml anti-TNF-a-renset muse monoklonalt IgG i karbonat-bikarbonatbuffer (BupH™ Carbonate-Bicarbonate Buffer Pack) til brønner i en 96-brønners Immulon 4 plate (Immulon 4 ELISA Flat Bottom Plate; Cynex, katalog nr. 011-010-3855) og inkubert over natten ved 2-8°C. Belegnings-oppløsningen ble fjernet og 200 ul "blokkeringsbuffer" (20 mM HEPES pH 7,4,150 mM NaCl, 2% BS A) ble satt til platene og disse ble lagret ved 2-8°C inntil de var klare til bruk. En 10-punkts rekombinant human TNF-a standardkurve ble preparert ved en 1:2 seriefortynning i "prøvefortynningsmiddel" (20 mM HEPES; pH 7,4,150 mM NaCl, 2 mM MgCh, 1% BSA) med en toppkonsentrasjon på 6 000 pg/ml.

Blokkeringsoppløsning ble fjernet fra TNF-a ELISA-platene ved vasking 5 ganger med 300 ul "vaskebuffer" (20 mM HEPE, pH 7,4,150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0,02% enten 50 ul av en TNF-a standardkurveoppløsning eller testforbindelsessupernatant satt til brønnene. Platen ble inkubert ved romtemperatur i 1 time under risting (300 omdr/min). Platen ble vasket 5 ganger med 300 ul "vaskebuffer". 100 ul 0,2 ug/ml biotinylert geite anti-human TNF-a i "antistoff-fortynningsmiddel" (20 mM HEPES, pH 7,4,150 mM NaCl, 2 mM MgCl2,1% BSA, 0,02% Tween-20) ble satt til per brønn og platen inkubert ved romtemperatur i 1 time ved risting (300 omdr/min). Platen ble vasket 5 ganger med 300 ul "vaskebuffer" per brønn. 100 ul 0,02 ug/ml streptavidin alkalisk fosfatase i "antistoff-fortynningsmiddel" ble tilsatt per brønn og platen inkubert ved romtemperatur i 1 time med risting (300 omdr/min). Platen ble vasket 5 ganger med 300 ul vaskebuffer per brønn. 200 ul 1 mg/ml pNPP (p-nitrofenylfosfat) i dietanolaminbuffer med 0,5 mm MgCl2 ble tilsatt per brønn, og platen inkubert i 30 til 45 minutter ved romtemperatur med risting (300 omdr/min). Reaksjonsforløpet ble overvåket ved å bestemme optisk densitet, når toppstandarden nådde en OD mellom 2,0 og 3,0 ble 50 ul 2N NaOH tilsatt per brønn. Den optiske densitet for hver brønn ble bestemt i løpet av 30 minutter ved bruk av en mikrotiterplateleser innstilt på 405 nm. Data ble analysert i XL-tilpasning ved bruk av 4-parameter kurvetilpasning.

De følgende reagenser ble benyttet i de ovenfor angitte analyser. Dulbeccos fosfat-bufrede saltoppløsning uten kalsium eller magnesium (Gibco katalog nr. 14190); minimum essensielt medium Eagle (MEM, Gibco katalog nr. 11090), penicillinstreptomycin (Gibco katalog nr. 15140); L-glutamin, 200 mM (Gibco katalog nr. 25030); HEPES, IM (Gibco katalog nr. 15630); fetalt bovinserum ("FBS"; HyClone katalog nr. SH300870.03); lipopolysakkarider fra Escherichia coli K-235 ("LPS", Sigma katalog nr. L2018); anti-TNF-a, Purified Mouse Monoclonal IgG (R&D Systems katalog nr. MAB210); BupH™ Carbonate, Bicarbonate Buffer Pack (Pierce katalog nr. 28382); HEPES (FW 238.3; Sigma katalog nr. H3575); NaCl (Sigma katalog nr. S7653); bovint serumalbumin ("BSA", Jackson ImmunoResearch katalog nr. 001-000-162); polyoksyetylen 20 sorbitanmonoleurat (Sigma katalog nr. P2287); magnesium-klorid. heksahydrat (Sigma katalog nr. M2670); rekombinant humant TNF-a (R&D Systems katalog nr. 210TA010); biotinylert TNF-a-affinitetsrenset geite IgG (R&D Systems katalog nr. BAF210); streptavidin alkalisk fosfatase (Jackson ImmunoResearch katalog nr. 016-050-084); dietanolamin substratbuffer (Pierce katalog nr. 34064); p-nitrofenylfosfat (Sigma katalog nr. N2765).

Tabell 3 viser resultatene av p38-inhibenng og inhibering av LPS-mdusert TNF-a-sekresjon fra human perifer blodmononukleære celler ("PBMC"). En "aktiv" forbindelse er definert som en forbindelse med en IC50 under 500 nM.

PREPARATIVE EKSEMPLER

For å illustrere oppfinnelsen er de følgende eksempler innbefattet.

EKSEMPLER

I eksemplene som er beskrevet nedenfor, og hvis ikke annet er sagt, er alle temperaturer angitt i grader Celsius. Reagensene ble ervervet fra kommersielle leverandører som Aldrich Chemical Company, Lancaster, TCI eller Maybndge og ble benyttet uten ytterligere rensing hvis ikke annet er sagt. Tetrahydrofuran (THF), N,N-dimetylforma-mid (DMF), diklormetan (DCM), to luen, dioksan og 1,2-difluoretan ble ervervet fra Aldrich i "Sure seal" flasker og benyttet som mottatt.

Reaksjonene som angitt nedenfor ble foretatt generelt under et positivt trykk av nitrogen eller argon eller med et tørkerør (hvis ikke annet er sagt) i vannfrie oppløsningsmidler og reaksjonskolbene ble typisk utstyrt med gummisepta for innføring av substrater og reagenser via sprøyte. Glassvarene var ovnstørket og/eller varmetørket.

Kolonnekromatografi ble gjennomført på et Biotage system (produsent: Dyax Corporation) med en silikagel kolonne eller en silika "SepPak" patron (Waters).

lH-NMR-spektra ble tatt opp på et Bruker-instrument ved 300 MHz eller på et Varian-instrument ved 400 MHz. 'H-NMR-spektra ble oppnådd som CDCl3-oppløsninger (angitt i ppm) ved bruk av kloroform som referansestandard (7,25 ppm). Andre NMR-oppløsningsmidler ble benyttet etter behov. Når toppmultiplisiteter angis benyttes de følgende forkortelser: s (singlett), d (dublett), t (triplett), m (multiplett), br (bred), dd (dublett av dubletter), dt (dublett av tripletter). Koblingskonstanter er, hvis de gis, angitt i Hertz (Hz).

Eksemplene 1-2 beskriver syntesen av amidforbindelsen ifølge oppfinnelsen med den generiske Formel XIII. Figur IA til 1C viser reaksjonsskjema for synteseforbindelsene med den generiske struktur 1 lg.

Eksempel 1 (referanse)

Fremstilling av 5-(4-fluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyreamid

(llg-1)

Trinn A: l-fluor-3-metylbenzen (forbindelse lg, 18,7 g, 170 mmol) ble satt til en 500 ml trehalskolbe og avkjølt til -78°C. Deretter ble en oppløsning av kalium-t-butoksid (11,0 g, 170 mmol) i THF tilsatt langsomt ved hjelp av en sprøyte. Etter 10 minutter ble t-BuLi (19,0 g, 170 mmol) i pentan tilsatt langsomt via en kanyle under nitrogen. Etter 2,5 timers omrøring ble reaksjonsblandingen stoppet med en stor mengde knust, frisk tørris, tatt av fra -78°C bad og omrørt manuelt med en metallspatel for å bringe det mørkebrune materialet til en meget lysere, gul oppslemming. Etter 20 minutters blanding for hånd ble ca. 500 ml vann tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt. Reaksjonsblandingen ble så vasket med Et20 og surgjort med 6N HC1 til en pH-verdi under 3 og så ekstrahert med Et20. Det organiske materialet ble vasket med saltvannsløsning, tørket over MgSCU, filtrert og konsentrert og man oppnådde 10 g tilsvarende et utbytte på 45% av forbindelse 2g.

<!>H NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,90 (t, 1H), 7,04 (d, 1H), 6,97 (d, 1H), 2,39 (s, 3H).

Trinn B: Forbindelse 2g (8,0 g, 52 mmol) ble satt til en 500 ml kolbe og avkjølt til saltvanmisbad temperatur. 150 ml H2SO4 ble tilsatt og blandingen omrørt. Deretter ble en blanding av nyfremstilt H2S04 (6,11 g, 62,3 mmol) og HNO3 (5,2 g, 83 mmol) dryppet til reaksjonsblandingen i løpet av 10 minutter. Etter 3 timer ved 0°C var reaksjonen ferdig og blandingen ble satt til 1500 ml is/isvann og omrørt i 1 time. Reaksjonsblandingen ble filtrert og vasket flere ganger med kaldt vann og tørket under høyvakuum og man oppnådde 8 g tilsvarende et utbytte på 80% av forbindelse 3g.

'H NMR (400 MHz, CDC13) 8 8,74 (d, 1H), 7,20 (d, 1H), 2,69 (s, 3H).

Trinn C: Forbindelse 3g (8 g, 40,0 mmol) ble oppløst i MeOH og H2S04 (20,0 g, 201 mmol) ble tilsatt langsomt. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 65°C i 20 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert, fortynnet med is og vann, ultralydsbehandlet, filtrert, vasket flere ganger med kaldt vann og tørket under høyvakuum i 2 dager. Råproduktet, forbindelse 4g, ble benyttet direkte i det neste trinn.

<*>H NMR (400 MHz, CDC13) 8 8,66 (d, 1H), 7,01 (d, 1H), 3,95 (s, 3H), 2,68 (s, 3H).

Trinn D: Forbindelse 4g (5,4 g, 41 mmol) ble satt til THF og avkjølt til 0°C. Til blandingen ble det satt 4-fluorfenol (5,1 g, 45 mmol). Deretter ble 60% NaH i olje (1,8 g, 45 mmol) tilsatt i porsjoner. Etter 1 time ble reaksjonsblandingen oppvarmet til romtemperatur og omrørt i ytterligere 2 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert og stoppet med et stort overskudd av 0,5N Na2CC<3 til pH = 7,0. Reaksjonsblandingen ble ultralydsbehandlet i 30 minutter, filtrert og vasket med mer buffer og H2O. Reaksjonsblandingen ble tørket under høyvakuum i 1 time og deretter satt til THF og MgS04 for tørking, som filtrert og fordampet og man oppnådde rundt 8 g tilsvarende et utbytte på 75% av forbindelse 5g.

<*>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 8,66 (d, 1H), 7,01 (d, 1H), 3,95 (s, 3H), 2,68 (s, 3H).

Trinn E: Forbindelse 5g (10,0 g, 33,0 mmol) og sink (11,0 g, 164 mmol) ble satt til metanol og så omrørt. Eddiksyre (4,0 g, 66 mmol) ble tilsatt langsomt. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten, ultralydsbehandlet og passert gjennom celit. Oppløs-ningen ble konsentrert og man oppnådde rundt 14 g av forbindelse 6g og sinkbi-produkter. Det urene materialet ble brakt videre til det neste trinn.

Trinn F: Forbindelse 6g (9,0 g, 33,0 mmol), ammoniumtetrafluorborat (6,0 g, 65 mmol) og HC1 (17,0 g, 163 mmol) ble satt til 200 ml AcOH:H20 2:1 og ultralydsbehandlet. Materialet ble skrapt av sidene av rundkolben og NaN02 (2,7 g, 3 mmol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble ultralydsbehandlet i 10 minutter og ble mørkebrun mens det opptrådte et nytt presipitat (produktsalt). Reaksjonen ble omrørt i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble ultralydsbehandlet på et multivakuum ved 65°C g så tatt opp i toluen og fordampet til tørr tilstand. Råproduktet, forbindelse 7g, ble brakt direkte til neste trinn uten opparbeiding.

Trinn G: Forbindelse 7g (11,0 g, 31 mmol), kaliumacetat (5,2 g, 53 mmol) og 18-krone-6 (0,1 ekvivalenter) ble satt til kloroform og ultralydsbehandlet i 10 minutter. Reaksjonen løp over natten ved romtemperatur. En kolonne ble pakket i en 100 ml filterkolbe bestående av rundt 5,1 cm silikagel, 12,7 cm celit lagt på toppen av silika-papiret. Kolonnen ble vasket med CHCI3. Det urene materialet ble fylt på kolonnen direkte i CHCI3 og kolonnen ble eluert med CHCI3 inntil en stor mengde gult materiale kom ut. Deretter ble produktet eluert fra kolonnen med etylacetat og etylacetatfrak-sj onene slått sammen og konsentrert og man oppnådde rundt 7 g tilsvarende 95% utbytte av forbindelse 8g.

MS (ESI+) m/z 287 (M+H) ble funnet.

Trinn H: Forbindelse 8g (0,250 g, 0,87 mmol) ble satt til tørr DMF og dertil ble det satt isobutylbromid (0,15 ml, 1,2 mmol) og K2CO3 (0,5 g, 3,6 mmol). Reaksjonsblandingen ble så anbrakt i en septumdekket prøveflaske og omrørt ved 95°C over natten. Materialet ble renset med kolonnekromatografi med dietyleter:heksaner 1:1 og man oppnådde 0,1 g tilsvarende et utbytte på 33% av forbindelse 9g-l.

MS (ESI+) m(/z 343 (M+H) ble funnet.

Trinn I: Forbindelse 9g-l (0,100 g, 0,292 mmol) ble satt til en IN LiOH:THF 1:1 blanding og omrørt ved 55°C. Etter 4 timer ble THF fordampet og IN HC1 tilsatt. Reaksjonsblandingen ble ultralydsbehandlet og filtrert for å isolere rundt 0,075 g tilsvarende 78% utbytte av forbindelse 10g som et rent materiale.

MS (ESI+) m/z 329 (M+H) ble funnet.

Trinn J: En oppløsning av forbindelse 10g (20 mg, 0,061 mmol) i 1 ml THF ble behandlet med 1,2 ekvivalenter CDI ved romtemperatur under nitrogen. Etter omrøring i 18 timer ble reaksjonsblandingen behandlet med 0,5M NH4 i dioksan (0,11 ml, 0,67 mmol). Etter ytterligere 18 timer ble oppløsningsmiddelet tillatt langsomt å fordampe og blandingen ble renset i en SepPak patron og eluert med CH2CI2 - 5% MeOH:CH2Cl2 og man oppnådde 2,2 mg tilsvarende et utbytte på 12% av forbindelse llg-1 som en olje.

'H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 8,01 (s, 1H), 7,99 (s, 1H), 7,73 (s, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,26 (s, 1H), 7,20 (m, 2H), 7,05 (m, 2H), 4,27 (d, 2H), 2,24 (m, 1H), 0,86 (d, 6H).

Eksempel 2

Fremstilling av 5-(4-fluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre-(2-dimetyIaminoetyl)-amid (llg-10)

En oppløsning av 5-(4-fluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (forbindelse 10g, fremstilt som beskrevet i Eksempel 1) i THF ble behandlet med 1,2 ekvivalenter karbonyldiimidazol ved romtemperatur under nitrogen. Etter omrøring i 18 timer ble reaksjonsblandingen behandlet med 1 ekvivalent Nl-dimetyletan-l,2-diamin. Etter ytterligere 18 timer ble oppløsningsmiddelet tillatt langsomt å fordampe og resten ble renset på en SepPak patron og eluert med en gradient 100% CH2CI2 -> 5% MeOH:CH2Cl2 og man oppnådde forbindelse 1 lg-10 i et utbytte på 58% som en olje.

Eksempel 3 (Referanse)

Fremstilling av 5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (17d) Reaksjonsskjema for syntesen av forbindelse 17d i henhold til dette eksempel er vist i

Figur 2.

Trinn A: l,2-Dibrom-4-metyl-5-nitrobenzen:

3,4-Dibromtoluen (108,11 ml, 6000 mmol) ble dråpevis og i løpet av 4 timer satt til 90% salpetersyre (280 ml, 6000 mmol) som så ble avkjølt til 0°C under en nitrogen-atmosfære under mekanisk omrøring. Den indre temperatur i blandingen ble holdt under 10°C under tilsetningen og det hele ble omrørt i 1 time ved 0°C etter ferdig tilsetning. 840 ml vann ble dråpevis satt til blandingen mens den indre temperatur ble holdt under 10°C. Det urene produkt ble samlet ved filtrering og vasket med 5 x 500 ml vann for å fjerne overskytende salpetersyre. Faststoffene ble tørket under høyvakuum og renset ved ornkrystallisering fra 800 ml etanol og man oppnådde 180,9 g tilsvarende 77% utbytte av det ønskede produkt som et faststoff.

<*>H NMR (400 MHz, CDC13) 8 8,24 (s, 1H), 7,64 (s, 1H), 2,55 (s, 3H).

Trinn B: l-Brom-2-(2,4-difluorfenoksy)-4-metyl-5-nitrogenzen:

En blanding av l,2-dibrom-4-metyl-5-nitrobenzen (84,3 g, 286 mmol), 2,4-difluorfenol (37,2 g, 286 mmol) og K2C03 (43,5 g, 315 mmol) ble oppvarmet til 100°C i 45 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og så satt hen ved 5°C i kjøleskap over natten. Reaksjonsblandingen ble helt i 1200 ml isvann på en gang. Det resulterende, fuktige faststoff ble samlet, delvis oppmalt og omrørt i 900 ml H20 i 45 minutter. Faststoffet ble samlet ved filtrering og vasket porsjonsvis med 700 ml vann. Det resulterende faststoff ble tørket under høyvakuum over natten og man oppnådde 93,5 g tilsvarende 95% utbytte av et brunt faststoff.

'H NMR (400 MHz, CDC13) 6 8,38 (s, 1H), 7,18 (m, 1H), 7,03 (m, 1H), 6,97 (m, 1H), 6,52 (s, 1H), 2,50 (s, 3H).

Trinn C: 5-Brom-4-(2,4-difiuorfenoksy)-2-metyIfenylamin: l-Brom-2-(2,4-difluorfenoksy)-4-metyl-5-nitrobenzen (87,0 g, 253 mmol) ble oppløst i 300 ml THF og fortynnet med 900 ml MeOH. Sinkstøv (82,7 g, 1,26 mmol) ble tilsatt og 11 mettet NH4CI ble tilsatt langsomt slik at reaksjonstemperaturen aldri overskred 42°C. Reaksjonen ble omrørt heftig mekanisk i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom celit og filterkaken vasket med etylacetat. Filtratet ble så konsentrert med 1,2 1 mettet NH4OAC. Når THF/MeOH var fjernet ble faststoffene samlet og vasket med vann. Faststoffene ble så omrørt i 11 vann i 30 minutter og så samlet via filtrering og vasket med 11 vann i tre porsjoner. Det resulterende faststoff ble tørket under høyvakuum i 48 timer og man oppnådde 64 g av det ønskede produkt i et utbytte på 81%.

MS (ESI+) m/z 314, 316 (M+l, Br-mønster) ble funnet;

<!>H NMR (400 MHz, CDC13) 5 6,92 (m, 1H), 6,91 (s, 1H), 6,75 (m, 2H), 6,70 (s, 1H), 3,57 (br s, 2H), 2,08 (s, 3H).

Trinn D: 6-Brom-5-(2,4-difluorfenoksy)-lH-indazol (14d): 5- Brom- 4-( 2, 4- dilfuorfenoksyV2- metvlbenzendiazoniumtetrafluorborat: 5- Brom-4-(2,4-difluorfenoksy)-2-metylfenylamin (30,0 g, 96 mmol) ble oppløst i 960 ml AcOH:H20 2:1. NH4BF4 (20,0 g, 191 mmol) ble tilsatt og blandingen avkjølt til 3°C i ca. 30 min. 40 ml konsentrert HC1 ble så tilsatt på en gang og blandingen oppvarmet til 60°C. Blandingen ble avkjølt til 2°C og deretter ble NaN02 (7,25 g, 105 mmol) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i isbad og så omrørt i 1 time ved romtemperatur. Blandingen ble konsentrert under redusert trykk og resten azeotropert med 3 x 400 ml toluen. Det urene materialet (5-brom-4-(2,4-difluorfenoksy)-2-metylbenzendiazon-iumtetrafluorborat) ble benyttet i den neste reaksjonen uten ytterligere rensing.

6- Brom- 5-( 2, 4- difluorfenoksv)- lH- indazol:

Urent 5-brom-4-(2,4-difluorfenoksy)-2-metylbenzendiazoniumtetrafluorborat ble suspendert i 650 ml etylacetat og behandlet med 10 ekvivalenter KOAc. Blandingen ble heftig omrørt ved romtemperatur i 1,5 time og så filtrert og fortynnet til et total-volum på 11 med etylacetat. Blandingen ble vasket med 800 ml NaHCC^saltvanns-løsning 1:1. Den vandige fase ble ekstrahert med 400 ml etylacetat. De organiske væsker ble kombinert og tørket over MgSCv og konsentrert til et brunt faststoff (31 g, 99% utbytte).

'H NMR (400 MHz, CDC13) 8 10,55 (br. s, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 7,20 (s, 1H), 6,99 (m, 1H), 6,94 (m, 1H), 6,84 (m, 1H).

Trinn E: 6-Brom-5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyI-lH-indazoI (15d): 6-Brom-5-(2,4-difluorfenoksy)-lH-indazol (60,0 g, 185 mmol) ble oppløst IDMF og behandlet med K2C03 (76,5 g, 554 mmol) og med isobutylbromid (126,4 g, 923 mmol). Blandingen ble omrørt og oppvarmet til 80°C i 16 timer. Ytterligere 15 g K2CO3 ble tilsatt og blandingen omrørt heftig i ytterligere 24 timer. Reaksjonsblandingen ble så avkjølt til romtemperatur og filtrert. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk og oppløst i 1 1 eter. Blandingen ble vasket med 2 x 600 ml saltvannsløsning:vann 1:5. De vandige faser ble ekstrahert med 300 ml eter og de kombinerte, organiske væsker tørket over MgSCU og konsentrert under redusert trykk. Det urene produkt ble kromatografert på en Biotage Flash 75 i to satser på rundt 35 g hver og eluert med 5% etylacetat i heksaner. De kombinerte, rensede produkter ga 30,1 g av det ønskede produkt som et faststoff, tilsvarende et utbytte på 43%.

MS (ESI+) m/z 381, 383 (M+l, Br-mønster) ble funnet;

'H NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,86 (s, 1H), 7,72 (s, 1H), 7,16 (s, 1H), 6,98 (m, 1H), 6,92 (m, 1H), 6,82 (m, 1H), 4,12 (d, 2H), 2,34 (m, 1H), 0,94 (d, 6H).

Trinn F: 5-(2,4-Difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karbonitril (16d): 6-Brom-5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol (31,2 g, 82 mmol) og Cu(I)CN (13,9 g, 156 mmol) ble oppløst i DMA og avgasset med nitrogen under vakuum. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 150°C i 16 timer. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur og fortynnet med etylacetat før vasking to ganger med 7M NH4OH. De organiske væsker med vasket med saltvannsløsning og avgasset med nitrogen før tørking over MgS04 og konsentrert med redusert trykk. Det urene produkt ble kromatografert og eluert med 10% etylacetat i heksaner og man oppnådde 25,1 g med produkt tilsvarende et utbytte på 95%.

Trinn G: 5-(2,4-Difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (17d): 5-(2,4-Difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karbonitril (25,1 g, 77 mmol) ble suspendert i 620 ml etanol og KOH (2,5 M, 310 ml) og oppvarmet til tilbakeløp i 24 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og konsentrert under redusert trykk for å fjerne etanolen. Den resulterende, vandige oppløsning ble fortynnet med vann og vasket med eter. Det vandige sjikt ble surgjort med konsentrert HC1 til pH 1 og ekstrahert med etylacetat flere ganger. De organiske sjikt ble kombinert og konsentrert under redusert trykk og man oppnådde 25,5 g tilsvarende 96% utbytte av det ønskede produkt.

'H NMR (400 MHz, CDC13) 5 8,37 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,20 (m, 1H), 7,07 (s, 1H), 7,04 (m, 1H), 6,95 (m, 1H), 4,24 (d, 2H), 2,36 (m, 1H), 0,94 (d, 6H).

Eksempel 4

Fremstilling av (S)-metyl-2-(5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksamido)-4-(dimetylamino)butanoat (30d)

Trinn A: (S)-2-(tert-butoksykarbonyl)-4-hydroksybutansyre:

Til en oppløsning av L-homoserin (49,9 g, 419 mmol) i 460 ml IN NaOH og 400 ml EtOH ble det satt en oppløsning av Boc-anhydrid (100,6 g, 461 mmol) i 400 ml THF i løpet av 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Blandingen ble så vasket med 3 x 500 ml eter, surgjort med IN HC1 til pH 2 og ekstrahert med 6 x 250 ml etylacetat. De kombinerte, organiske ekstrakter ble vasket med 2 x 250 ml saltvannsløsning, tørket over MgSCU, filtrert gjennom celit og konsentrert under redusert trykk og man oppnådde 72,6 g av et hvitt faststoff tilsvarende et utbytte på 79%.

Trinn B: (S)-2-(tert-butoksykarbonyl)-4-hydroksybutansyre-disykloheksylaminkompleks: Til en oppløsning av (S)-2-(tert-butoksykarbonyl)-4-hydroksybutansyre (72,6 g, 331 mmol) i 500 ml EtOH ble det dråpevis satt disykloheksylamin (73 ml, 364 mmol). Blandingen ble omrørt i 2 timer ved romtemperatur og så konsentrert under redusert trykk. Det hvite faststoff ble tørket under høyvakuum og så triturert med 1000 ml eter. Det fine, hvite pulver ble samlet ved filtrering, vasket med eter og tørket under høyvakuum (125,6 g, 95% utbytte).

Trinn C: (S)-2-tert-butoksykarbonylamino-4-hydroksysmørsyremetylester: Til en suspensjon av (S)-2-(tert-butoksykarbonyl)-4-hydroksybutansyre-disykloheksyl-aminkompleks (119 g, 275 mmol) i 900 ml DMF ble det satt jodmetan (20,5 ml, 330 mmol). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Den klare oppløsningen ble konsentrert under redusert trykk og azeotropert med 5 x 200 ml toluen. Resten ble fortynnet med 500 ml vann og 500 ml etylacetat og så omrørt i 2 timer før sjiktene ble separert. Det vandige sjikt ble ekstrahert med 9 x 250 ml etylacetat. De kombinerte ekstrakter ble vasket med 250 ml saltvannsløsning, tørket over MgS04, filtrert gjennom celit og konsentrert under redusert trykk for å gi en gul olje. Den urene olje ble kromatografert over silikagel og eluert med eterrheksaner 3:1 og man oppnådde 53 g fargeløs olje tilsvarende et utbytte på 83%.

Trinn D: (S)-4-brom-2-tert-butoksykarbonylaminosmørsyremetylester:

Til en til 0°C avkjølt oppløsning av (S)-2-tert-butoksykarbonylamino-4-hydroksysmør-syremetylester (28,7 g, 123 mmol) i 500 ml diklormetan ble det satt CBr4 (51,0 g, 154 mmol). Blandingen ble omrørt i 5 minutter før porsjonsvis tilsetning av trifenylfosfin (48,41 g, 185 mmol). Blandingen ble omrørt videre ved 0°C i 1 time og så tillatt opp-varming til romtemperatur. Opp løsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk og det hele så fortynnet med 500 ml eter og omrørt i 3 minutter. Blandingen ble filtrert og filtratet konsentrert under redusert trykk. Resten ble kromatografert og eluert med etenheksaner 1:2 og man oppnådde 27,5 g av et hvitt faststoff tilsvarende 76% utbytte.

Trinn E: (S)-2-tert-butoksykarbonylamino-4-dimetylaminosmørsyremetylester: Til en oppløsning av (S)-4-brom-2-tert-butoksykarbonylaminosmørsyremetylester (27,5 g, 93 mmol) i 100 ml THF i en trykkreaksjonsbeholder ble det satt 26 ml trietylamin og 93 ml 2,0M dimetylamin i THF. Reaksjonsbeholderen ble forseglet og oppvarmet til 60°C i 16 timer og så avkjølt til romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble konsentrert under redusert trykk og så oppløst i 500 ml diklormetan. Oppløsningen ble vasket med 3 x 200 ml vann og 200 ml saltvannsløsning og så tørket over MgS04, filtrert gjennom celit og konsentrert under redusert trykk. Resten ble tørket under høyvakuum og man oppnådde 23,4 g tilsvarende 97% utbytte av en gul olje.

Trinn F: (S)-metyl-2-amino-4-(dimetylamino)butanoatdihydroklorid:

Til en til 0°C avkjølt oppløsning av (S)-2-tert-butoksykarbonylamino-4-dimetylamino-smørsyremetylester (23,4 g, 90 mmol) i 100 ml dioksan ble det dråpevis satt 225 ml 4M HC1 i dioksan. Blandingen ble oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 3 timer. Faststoffet ble filtrert, vasket med 3 x 100 ml eter og tørket under høyvakuum og man oppnådde 20,2 g tilsvarende 96% utbytte av produktet.

Trinn G: (S)-metyl-2-(5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksamido)-4-(dimetylamino)butanoat (30d): 5-(2,4-Difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (17d; fremstilt i henhold til Eksempel 3) (0,396 g, 1,14 mmol) ble omrørt med HOBt (0,192 g, 1,26 mmol) og EDC1 (0,241 g, 1,26 mmol) i 2 ml dikloretan i 10 minutter ved romtemperatur. Denne blanding ble så satt til en suspensjon av (S)-metyl-2-amino-4-(dimetylamino)butanoat-dihydroklorid (0,280 g, 1,20 mmol) og trietylamin (1 ml, 6,9 mmol) i 6 ml diklormetan. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 3 timer og ble deretter konsentrert under redusert trykk. Resten ble fortynnet med 50 ml kloroform og vasket med 2 x 25 ml IN HC1, 2 x 50 ml mettet K2CO3, 25 ml vann, 25 ml saltvannsløsning og så tørket over MgS04. Den filtrerte oppløsning ble konsentrert under redusert trykk og man oppnådde en gul olje. Denne ble kromatografert ved bruk av 5% MeOH i diklormetan for å gi en viskøs, fargeløs olje som størknet ved tørking under høyvakuum (0,393 g, 71% utbytte).

MS (ESI+) m/z 489 (M+l) ble funnet;

'H NMR (400 MHz, CDCI3) 8 8,91 (d, 1H), 8,36 (s, 1H), 7,86 (s, 1H), 7,16 (m, 1H), 7,03 (m, 1H); 7,00 (s, 1H), 6,93 (m, 1H), 4,88 (m, 1H), 4,21 (d, 2H), 3,74 (s, 3H), 2,34 (m, 3H), 2,06 (s, 6H), 2,01 (m, 2H), 0,92 (d, 6H).

Eksempel 5

Fremstilling av (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-N-(4-(dimetylamino)-l-hydroksybutan-2-yl)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksamid (31 d)

En blanding av (S)-metyl-2-(5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboks-amid)-4-(dimetylamino)butanoat (3 Od, Eksempel 4, Trinn A-E) (0,370 g, 0,76 mmol) og

NaBH4 (0,114 g, 3,04 mmol) i 20 ml THF:EtOH 3:2 ble oppvarmet til 60°C i 7 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert under redusert trykk og fortynnet med diklormetan. Oppslemmingen ble kromatografert på Biotage ved bruk av 10% MeOH i diklormetan med 1% trietylamin. Produktet ble oppnådd som 0,337 g viskøs olje tilsvarende et utbytte på 97%.

MS (ESI+) m/z 461 (M+l) ble funnet;

'H NMR (400 MHz, CDC13) 5 8,34 (d, 1H), 8,31 (s, 1H), 7,86 (s, 1H), 7,13 (m, 1H), 7,02 (s, 1H), 7,00 (m, 1H), 6,90 (m, 1H), 4,33 (m, 1H), 4,22 (d, 2H), 3,64 (m, 2H), 2,37 (m, 1H), 2,17 (s, 6H), 2,10 (m, 1H); 1,82 (m, 1H), 1,07 (m, 2H), 0,93 (d, 6H).

Eksempel 6

Fremstilling av (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyI-lH-indazol-6-karboksylsyre-(1 -hydroksymetyl-3-isopropylaminopropyl)-amid (32d)

Trinn A: Isopropyl-(4-metoksybenzyl)-amin:

En blanding av 4-metoksybenzylamin (1,37 g, 10 mmol) i aceton (0,81 ml, 11 mmol) i 20 ml tørr dikloretan ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. Til oppløsningen ble det satt natriumtriacetoksyborhydrid (3,18 g, 15 mmol) og den resulterende blandingen omrørt ved romtemperatur i 17 timer. Reaksjonsblandingen ble stoppet med 50 ml IN NaOH og sjiktene separert. Det vandige sjikt ble ekstrahert med 2 x 20 ml diklormetan. De kombinerte ekstrakter ble vasket med 20 ml vann, 20 ml saltvannsløsning, tørket over MgS04, filtrert gjennom celit og konsentrert under redusert trykk. Resten ble kromatografert og eluert med 10% MeOH i diklormetan med 1% trietylamin og man oppnådde 1,53 g olje tilsvarende et utbytte på 85%.

Trinn B: (S)-metyl-4-brom-2-(tert-butoksykarbonyl)butanoat:

Til en til 0°C avkjølt oppløsning av (S)-metyl-2-amino-4-brombutanoat (1,80 g, 6,5 mmol) i 20 ml THF ble det satt trietylamin (4,53 g, 32,5 mmol) og Boc-anhydrid (1,49 g, 6,83 mmol, oppløsning i 20 ml THF). Blandingen ble omrørt ved 0°C i 30 minutter og så oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble kvensjet med 50 ml IN HC1 og sjiktene separert. Det vandige sjikt ble ekstrahert med 2 x 20 ml eter og de kombinerte, organiske ekstrakter vasket med 20 ml vann og 20 ml saltvannsløsning, så tørket over MgS04, filtrert gjennom celit og konsentrert under redusert trykk for å gi en blekgul olje. Oljen ble kromatografert og eluert med etenheksaner 1:2 og man oppnådde 1,54 g tilsvarende et utbytte på 75% av en fargeløs olje som størknet under høyvakuum.

Trinn C: (S)-metyI-4-((4-metoksybenzyl)(isopropyI)amino)-2-(tert-butoksykarbonyl)butanoathydroklorid: En blanding av isopropyl-(4-metoksybenzyl)-amin (0,111 g, 0,62 mmol), (S)-metyl-4-brom-2-(tert-butoksykarbonyl)butanoat (0,150 g, 0,51 mmol) og trietylamin (0,21 ml, 1,52 mmol) i 5 ml THF ble oppvarmet til tilbakeløp i 65 timer. Blandingen ble så avkjølt til romtemperatur og konsentrert under redusert trykk. Resten ble kromatografert og eluert med 5% MeOH i diklormetan og man oppnådde 0,026 g fargeløs olje tilsvarende et utbytte på 13%. Forbindelsene ble så behandlet med 1 ml 4N HC1 i dioksan ved romtemperatur i 3 timer. Blandingen ble konsentrert under redusert trykk og tørket under høyvakuum.

Trinn D: (S)-metyl-4-((4-metoksybenzyl)(isopropyl)amino)-2-(5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksamido)butanoat: 5-(2,4-Difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (17d, fremstilt i henhold til Eksempel 3 (0,022 g, 0,064 mmol) ble omrørt med HOBt (0,011 g, 0,070 mmol) og EDC1 (0,014 g, 0,070 mmol) i 1 ml diklormetan i 10 minutter ved romtemperatur. Til denne blanding ble det så satt en suspensjon av (S)-metyl-4-((4-metoksybenzyl)-(isopropyl)amino)-2-(tert-butoksykarbonyl)butanoathydroklorid (0,025 g, 0,067 mmol) og trietylamin (0,054 ml, 0,384 mmol) i 2 ml diklormetan. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Oppløsningen ble filtrert gjennom celit og konsentrert under redusert trykk. Den urene olje ble kromatografert og eluert med 2% MeOH i diklormetan med 1% trietylamin for å gi 0,035 g tilsvarende et utbytte på 89% av en viskøs, blekgul olje.

Trinn E: (S)-N-(4-((4-metoksybenzyl)(isopropyl)amino)-l-hydroksybutan-2-yl)-5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksamid: (S)-metyl-4-((4-metoksybenzyl)(isopropyl)amino)-2-(5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksamido)butanoat (0,035 g, 0,057 mmol) og HaBH4 (0,022 g, 0,57 mmol) ble oppløst i 5 ml THF:MeOH 3:2 og så oppvarmet til 50°C i 3 timer. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur og konsentrert under redusert trykk. Resten ble kromatografert og eluert med 5% MeOH i diklormetan med 1% trietylamin for derved å gi 0,020 g gel i et utbytte på 59%. Trinn F: (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre-(l- hydroksymetyl-3-isopropylaminopropyl)-amid (32d): Til en oppløsning av (S)-N-(4-((4-metoksybenzyl)(isopropyl)amino)-l-hydroksybutan-2-yl)-5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksamid (0,020 g, 0,033 mmol) i 5 ml MeOH ble det satt 0,020 g våt 10 vekt% Pd/C. Blandingen ble spylt med hydrogen flere ganger og så omrørt ved romtemperatur under H2-atmosfære i 5 timer. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og filtratet konsentrert under redusert trykk. Resten ble kromatografert og eluert med 10% MeOH i diklormetan med 2% trietylamin og man oppnådde 9,4 mg fargeløs olje tilsvarende et utbytte på 60%.

MS (ESI+) m/z 475 (M+l) ble funnet;

'H NMR (400 MHz, CDC13) 8 8,40 (d, 1H), 8,31 (s, 1H), 7,87 (s, 1H), 7,13 (m, 1H), 7,03 (s, 1H), 7,01 (m, 1H), 6,91 (m, 1H), 4,33 (m, 1H), 4,22 (d, 2H), 3,69 (m, 2H), 2,69 (m, 2H), 2,37 (m, 2H), 1,32 (m, 2H), 1,09 (d, 3H), 1,01 (d, 3H), 0,93 (d, 6H).

Eksempel 7

Fremstilling av (S)-2-{[5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karbonyI]-amino}-4-dimetylaminosmørsyre (33d)

Trinn A: 5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazoI-6-karboksylsyre-2,5-dioksopyrrolidin-l-yl-ester: 5-(2,4-Difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (17d, fremstilt i henhold til Eksempel 3) (25,0 g, 72,2 mmol), EDC1 (18,0 g, 93,8 mmol) og 1-hydroksypyrroli-din-2,5-dion (9,97 g, 86,6 mmol) ble suspendert i diklormetan og omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Blandingen ble fortynnet med 500 ml diklormetan og vasket med 2 x 200 ml mettet NH4C1, 2 x 200 ml mettet NaHC03 og 200 ml saltvannsløsning. De organiske væsker ble tørket over MgS04 og konsentrert under redusert trykk og man oppnådde råproduktet som et gult skum.

Trinn B: (S)-2-{[5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karbonyl]-amino}-4-dimetyIaminosmørsyremetylester: Til en oppløsning av 5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre-2,5-dioksopyrrolidin-l-yl-ester (32,0 g, 72,2 mmol) og 2-amino-4-dimetylaminosmørsyre-metylesterdihydroklorid (19,35 g, 83,0 mmol) i diklormetan ble det satt trietylamin (35 ml, 253 mmol) og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 4 timer. Reaksjonsbland-U1~ ~+ _± i ~ J _± — c t _i i ann i j:i.i a løsningen ble vasket med 2 x 200 ml mettet NH4CI, 2 x 200 ml mettet NaHC03 og 200 ml saltvannsløsning. De organiske væsker ble tørket over MgSCU og konsentrert under redusert trykk og man oppnådde råproduktet.

Trinn C: (S)-2-{[5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karbonyI]-amino}-4-dimetylaminosmørsyre (33d): Kaliumtrimetylsilanolat (1,77 g, 13,8 mmol) ble satt til en oppløsning av (S)-2-{[5-(2,4-difluorfenoksy)-1 -isobutyl-1 H-indazol-6-karbonyl] -amino} -4-dimetylaminosmørsyre-metylester (3,36 g, 6,88 mmol) i 5 ml THF. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 4 timer. 17 ml 4M HC1 i dioksan ble satt til blandingen før den ble konsentrert under redusert trykk. Resten ble suspendert i diklormetan og filtrert. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk og man oppnådde 2,23 g tilsvarende 68% utbytte av produktet.

MS (ESI+) m/z 475 (M+l) ble funnet;

<!>H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 8,81 (d, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,99 (s, 1H), 7,48 (m, 1H), 7,25 (m, 1H), 7,22 (s, 1H), 7,11 (m, 1H), 4,50 (m, 1H), 4,28 (d, 2H), 3,17 (m, 1H), 3,04 (m, 1H), 2,70 (s, 6H), 2,25 (m, 2H), 2,13 (m, 1H), 0,87 (d, 6H).

Eksempel 8

Fremstilling av (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre-(3-dimetyIamino-l-dimetylkarbamoylpropyl)-amid (35d)

Til en oppløsning av (S)-2-{[5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karbonyl]-ammo}-4-dimetylaminosmørsyre (33d, Eksempel 7) (0,100 g, 0,21 mmol), dimetylamin (0,095 g, 2,11 mmol), EDC1 (0,053 g, 0,27 mmol), HOBt (0,037 g, 0,27 mmol) oppløst i diklormetan, ble det dråpevis satt DIEA (0,082 g, 0,63 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur inntil fullstendig forbruk av utgangsmateriale, bestemt ved HPLC-analyse. Reaksjonsblandingen ble så fortynnet med diklormetan og vasket med mettet NaHC03, tørket over MgSC>4 og konsentrert under redusert trykk. Resten ble kromatografert på Isolute SPE-kolonne flash Si (5 g) og eluert med en gradient 100 ml TEA:diklormetan 0,3:99,7 -» 100 ml TEA:MeOH:diklormetan 0,3:0,5:99,2 -> 100 ml TEA:MeOH:diklormetan 0,3:2,5:97,2 ->■ 100 ml TEA:MeOH:diklormetan 0,3:5:94,7. Sluttproduktet ble oppnådd i et utbytte på 86%.

MS (ESI+) m/z 502 (M+l) ble funnet;

<l>H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 8,63 (d, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,48 (m, 1H), 7,23 (m, 1H), 7,20 (s, 1H), 7,09 (m, 1H), 4,98 (m, 1H), 4,26 (d, 2H), 3,07 (s, 3H), 2,84 (s, 3H), 2,23 (m, 2H), 2,13 (m, 1H), 2,03 (s, 6H), 1,80 (m, 1H), 1,65 (m, 1H), 0,86 (d, 6H).

Eksempel 9

Fremstilling av (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre-(3-dimetylamino-l-metylkarbamoylpropyl)-amid (36d)

Fremstilt i henhold til prosedyren i Eksempel 8, men ved å benytte metylamin i stedet for dimetylamin. Produktet bie oppnådd i et utbytte på 78%.

MS (ESI+) m/z 488 (M+l) ble funnet;

'H NMR (400 MHz, CDC13) 8 9,05 (d, 1H), 8,29 (s, 1H), 7,86 (s, 1H), 7,44 (m, 1H), 7,19 (m, 1H), 7,02 (m, 1H), 7,01 (s, 1H), 6,93 (m, 1H), 4,78 (m, 1H); 4,21 (d, 2H), 2,81 (d, 3H), 2,50 (m, 1H), 2,42 (m, 1H), 2,36 (m, 1H), 2,23 (s, 6H), 2,15 (m, 1H), 1,88 (m, 1H), 0,92 (d, 6H).

Eksempel 10

Fremstilling av (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre-(l-karbamoyl-3-dimetylaminopropyl)-amid (37d)

Fremstilt i henhold til prosedyren i Eksempel 8, men ved å benytte ammoniakk i stedet for dimetylamin. Produktet ble oppnådd i et utbytte på 70%.

MS (APCI+) m/z 474 (M+l) ble funnet;

'H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 8,59 (d, 1H), 8,07 (s, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,50 (m, 1H), 7,39 (s, 1H), 7,27 (m, 1H), 7,19 (s, 1H), 7,11 (m, 2H), 4,44 (m, 1H), 4,27 (d, 2H), 2,24 (m, 2H), 2,15 (m, 1H), 2,00 (s, 6H), 1,88 (m, 1H), 1,71 (m, 1H), 0,86 (d, 6H).

Claims (10)

1. Forbindelse, innbefattende solvater og farmasøytisk akseptable salter derav, karakterisert ved at den er valgt fra: 5-(4-fluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (2-dimeetylaminoetyl)amid; (S)-metyl-2-(5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-yl-karboksamido)-4-dimetylamino)-butanoat; (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-N-(4-dimetylamino)-l -hydroksybutan-2-yl)-1 -isobutyl- 1H-indazol-6-karboksamid; (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (l-hydroksymetyl-3-isopropylaminopropyl)amid; (S)-2-{[5-(2,4-difluorfenoksy)-1-isobutyl-1 H-indazol-6-karbonyl]-amino}-4-dimetyl-aminosmørsyre; (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-1 -isobutyl-1 H-indazol-6-karboksylsyre (3-dimetylamino-1 - dimetylkarbamoylpropyl)amid; (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-1 -isobutyl-1 H-indazol-6-karboksylsyre (3-dimetylamino-1 - metylkarbamoylpropyl)amid; og (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-1 -isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (1 -karbamoyl3-dimetylaminopropyl)amid.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-1 -isobutyl-1 H-indazol-6-karboksylsyre (1 -karbamoyl-3-dimetylaminopropyl)amid.

3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er 5-(4-fluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (2-dimetylaminoetyl)amid.

4. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er (S)-metyl 2-(5-(2,4-difluorfenoksy)-l-isobutyl-lH-indazol-6-karboksamido)-4-(dimetylamino)butanoat.

5. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er (S)-5 -(254-difluorfenoksy)-N-(4-(dimetylamino)-1 -hydroksybutan-2-yl)-1 -isobutyl-1H-indazol-6-karboksamid.

6. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-1 -isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (1 -hydroksymetyl-3-isopropylaminopropyl)amid.

7. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-1 -isobutyl-lH-indazol-6-karboksylsyre (3-dimetylamino-1 - dimetylkarbamoylpropyl)amid.

8. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er (S)-5-(2,4-difluorfenoksy)-1 -isobutyl-1 H-indazol-6-karboksylsyre (3-dimetylamino-1 - metylkarbamoylpropyl)amid.

9. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-8 i kombinasjon med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller en bærer.

10. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av krav 1-8 for fremstilling av et medikament for behandling av inflammatorisk sykdom, autoimmun sykdom, destruktiv benlidelse, proliferativ lidelse, infeksiøs sykdom, viral sykdom eller neurodegenerativ sykdom.