NO326832B1 - Kombinasjon av benzosykloheptapyridinforbindelser og et antineoplastisk midel for fremstilling av et medikament for behandling av proliferative sykdommer. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av FPT-inhibitoren, 4-[2-[4-[(8-klor-3,10-dibrom-6,ll-dihydro-5H-benzo[5,6]syklohepta[1,2-b]pyridin-ll-yl)-1-piperidinyl]-2-oksoetyl]-1-piperidinkarboksamid, (+)-isomeren, for fremstilling av et medikament for anvendelse samtidig eller sekvensvis med det antineoplastiske middel paklitaxel eller et paklitaxelderivat og/eller bestrålingsterapi ved behandling av proliferativ sykdom hos en pasient med behov for slik behandling.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av FPT-inhibitoren, 4-[2-[4-[(8-klor-3,10-dibrom-6,ll-dihydro-5H-benzo-[5,6]syklohepta[1,2-b]pyridin-ll-yl)-l-piperidinyl]-2-okso-etyl]-1-piperidinkarboksamid, (+)-isomeren, for fremstilling av et medikament for anvendelse samtidig eller sekvensvis med et mikrotubuluspåvirkende middel som er en taxoter, ved behandling av proliferativ sykdom hos en pasient med behov for slik behandling.

Oppfinnelsens bakgrunn

Onkogener koder ofte for proteinkomponenter av signaltransduksjonsreaksjonsveier som fører til stimulering av cellevekst og mitogenese. Mutasjon og/eller overekspresjon av visse onkogener er ofte forbundet med cellulær transformasjon og human cancer. For å erverve transformasjonspotensial må forløperen for ras-onkoproteinet gjennomgå farnesylering av cysteinresten lokalisert i et karboksyterminalt tetrapeptid. Inhibitorer av enzymet som katalyserer denne modifikasjonen, farnesylproteintransferase, er derfor blitt foreslått som anticancermidler for tumorer. Muterte, onkogene former av ras bindes hyppig i mange humane cancere, mest bemerkelsesverdig i mer enn 50 % av colon- og pankreaskarsinomer (Kohl et al., Science, vol. 260, 1934-1927 (1993)). Proteiner foruten ras kan spille en rolle ved tumordannelse og kan også fordre farnesylering for biologisk aktivitet.

Internasjonal patentpublikasjon nr. WO 92/11034 (publisert 9. juli 1992) beskriver en metode for økning av sensitiviteten av en tumor overfor et antineoplastisk middel

(i tilfeller hvor tumoren er resistent mot det antineoplastiske middel), ved samtidig administrering av det antineoplastiske middel og { inter alia) et potenseringsmiddel med formel:

hvori den stiplede linje betegner en eventuell dobbeltbinding, X' er hydrogen eller halogen, og Y'' er hydrogen, substituert karboksylat eller substituert sulfonyl. Y' kan f.eks. blant annet være COOR', hvori R' er Ci-C6-alkyl eller substituert alkyl, fenyl, substituert fenyl, Cy-C^-aralkyl eller substituert aralkyl, 2-, 3- eller 4-piperidyl eller N-substituert piperidyl. Y' kan også blant annet være SO2R<1>, hvori R' er Ci-C6-alkyl, fenyl, substituert fenyl, C7-Ci2-aralkyl eller substituert aralkyl. Eksempler på slike potenseringsmidler inkluderer 11- (4-piperidyliden)-5H-benzo[5,6]syklohepta-[1,2-b]pyridiner, slik som Loratadin. Eksempler på antineoplastiske midler er: vinkaalkaloider, epipodofyllotoksiner, antrasyklinantibiotika, aktinomycin D, plikamycin, puromycin, gramicidin D, taxol, kolchicin, cytochalasin B, emetin, maytansin og amsakrin. WO 92/11034 fokuserer på potensering av de antineoplastiske midler gjennom en spesifikk virknings-mekanisme: inhibering av multippel legemiddelresistens.

I betraktning av behovet for forbedrede behandlinger for proliferative sykdommer, spesielt cancere, ville nye metoder for behandling være et velkomment bidrag til teknikkens stand.

WO 9211034 gjør kjent potenserende midler som øker effektiviteten til antineoplastiske midler.

WO 9723478 omhandler trisykliske amider som inhiberer aktiviteten til G-proteinet og derigjennom kan anvendes i forbindelse med behandling av proliferative sykdommer, bl.a. pankreascancer.

WO 9745412 beskriver kombinasjoner av farnesyl-proteintransferaseinhibitorer og en MEK-inhiberende forbindelse for behandling av cancere. MEK-inhibitorer kan sies å være antineoplastiske midler.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av FPT-inhibitoren

for fremstilling av et medikament for anvendelse samtidig eller sekvensvis med det antineoplastiske middel paklitaxel eller et paklitaxelderivat og/eller bestrålingsterapi ved behandling av proliferativ sykdom hos en pasient med behov for slik behandling.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av FPT-inhibitoren for fremstilling av et medikament for anvendelse samtidig eller sekvensvis med et mikrotubuluspåvirkende middel som er en taxoter, ved behandling av proliferativ sykdom hos en pasient med behov for slik behandling.

Kort beskrivelse av figurene

Den FPT-inhibitoriske forbindelse i figurene 1-38 (noen ganger referert til som "forbindelse X") er som følger:

Figurene 1-15 viser tre eksempler hvor det ble observert klar synergi. Lignende resultater ble observert i DLD-1-colon-, HTB177-lunge-, PA-l-ovarie-, LNCaP-prostata-, AsPC-1-pankreas- og PANC-l-pankreasmodellene (data ikke vist). Klar antagonisme ble observert i én cellelinje MDA-MB-231 (figurer 16-20). Blandede resultater ble observert i MDA-MB-468 (figurer 21-35) .

Mer spesifikt viser figur 1 et isobologram for MiaPaCa2-pankreastumorceller behandlet med en FPT-inhibitorisk forbindelse og paklitaxel in vitro. X-aksen indikerer mengden av paklitaxel uttrykt som ng/ml. Y-aksen indikerer mengden av forbindelse X i uM-enheter. Når eksperimentkurven faller under den rette, diagonale linjen, som er tilfellet her, betegner dette en synergistisk interaksjon (se f.eks. 0'Connell, M.A. og Wolfinger, R.D., J. Computational and Graphical Statistics, 6:224-241, 1997, og Berenbaum, M.C., Pharmacol. Rev., 41:93-141, 1989). Figur 2 viser en tredimensjonal celleproliferasjons-modell fra hvilken figur 1 ble avledet. Figur 3 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for legemiddelinteraksjoner av paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml langs x-aksen) og forbindelse X (doser i uM-enheter, som angitt på høyre side av kurvene) i MiaPaCa2-celler. Y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 4 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for forbindelse X (doser i uM-enheter, som indikert langs x-aksen) i MiaPaCa2-celler, der y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 5 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml, som indikert langs x-aksen) i MiaPaCa2-celler, der y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 6 viser et isobologram for DU-145-prostatatumorceller behandlet med en FPT-inhibitorisk forbindelse og paklitaxel in vitro. X-aksen indikerer mengden paklitaxel uttrykt som ng/ml. X-aksen indikerer mengden av forbindelse X i uM-enheter. Figur 7 viser en tredimensjonal modell fra hvilken figur 6 ble dannet. Figur 8 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for legemiddelinteraksjoner av paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml langs x-aksen) og forbindelse X (doser i uM-enheter, som indikert på høyre side av kurvene) i DU-145-celler. Y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 9 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for forbindelse X (doser i uM-enheter, som indikert langs x-aksen) i DU-145-celler, der y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 10 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml, som indikert langs x-aksen) i DU-145-celler, der y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 11 viser et isobologram for MidT#2-l-musemammatumorceller behandlet med en FPT-inhibitorisk forbindelse og paklitaxel in vitro. X-aksen indikerer mengden paklitaxel uttrykt som ng/ml. Y-aksen indikerer mengden av forbindelse X i uM-enheter. Figur 12 viser en tredimensjonal celleproliferasjons-modell fra hvilken figur 11 er avledet. Figur 13 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for legemiddelinteraksjoner av paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml langs x-aksen) og forbindelse X (doser i uM-enheter, som indikert på høyre side av kurvene) i MidT#2-l-celler. Y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 14 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for forbindelse X (doser i uM-enheter, som indikert langs x-aksen) i MidT#2-l-celler, der y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 15 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml, som indikert langs x-aksen) i MidT#2-l-celler, der Y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 16 viser et isobologram for MDA-MB-231-brysttumorceller behandlet med en FPT-inhibitorisk forbindelse og paklitaxel in vitro. X-aksen indikerer mengden paklitaxel uttrykt som ng/ml. Y-aksen indikerer mengden av forbindelse X i uM-enheter. Figur 17 viser en tredimensjonal celleproliferasjons-modell fra hvilken figur 16 ble dannet. Figur 18 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for legemiddelinteraksjoner av paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml langs x-aksen) og forbindelse X (doser i uM-enheter, som indikert på høyre side av kurvene) i MDA-MB-231-celler. Y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 19 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for forbindelse X (doser i uM-enheter, som indikert langs x-aksen) i MDA-MB-231-celler, der y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 20 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml, som indikert langs x-aksen) i MDA-MB-231-celler, der Y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 21 viser et isobologram for studium nr. 1 av MDA-MB-4 68-brysttumorceller behandlet med en FPT-inhibitorisk forbindelse og paklitaxel in vitro (eksempel E heri). X-aksen indikerer mengden paklitaxel uttrykt som ng/ml. Y-aksen indikerer mengden av forbindelse X i uM-enheter. Figur 22 viser en tredimensjonal celleproliferasjons-modell fra hvilken figur 21 ble dannet. Figur 23 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for legemiddelinteraksjoner av paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml langs x-aksen) og forbindelse X (doser i uM-enheter, som angitt på høyre side av kurvene) i MDA-MB-4 68-celler. Y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 24 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml, som indikert langs x-aksen) i MDA-MB-468-celler, der Y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 25 viser en dose-responskurve før statistisk ■ analyse for forbindelse X (doser i uM-enheter, som indikert langs x-aksen) i MDA-MB-468-celler, der y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 26 viser et isobologram for studium nr. 2 av MDA-MB-468-brysttumorceller behandlet med en FPT-inhibitorisk forbindelse og paklitaxel in vitro (eksempel F heri). X-aksen indikerer mengden paklitaxel uttrykt som ng/ml. Y-aksen indikerer mengden av forbindelse X i uM-enheter. Figur 27 viser en tredimensjonal celleproliferasjons-modell fra hvilken figur 26 ble dannet. Figur 28 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for legemiddelinteraksjoner av paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml langs x-aksen) og forbindelse X (doser i uM-enheter, som indikert på høyre side av kurvene) i MDA-MB-468-celler. Y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 29 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for forbindelse X (doser i uM-enheter, som indikert langs x-aksen) i MDA-MB-468-celler, der y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 30 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml, som indikert langs x-aksen) i MDA-MB-468-celler, der Y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 31 viser et isobologram for studium nr. 3 av MDA-MB-468-brysttumorceller behandlet med en FPT-inhibitorisk forbindelse og paklitaxel in vitro (eksempel G heri). X-aksen indikerer mengden paklitaxel uttrykt som ng/ml. Y-aksen indikerer mengden av forbindelse X i uM-enheter. Figur 32 viser en tredimensjonal celleproliferasjons-modell fra hvilken figur 31 ble dannet. Figur 33 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for legemiddelinteraksjoner av paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml langs x-aksen) og forbindelse X (doser i uM-enheter, som angitt på høyre side av kurvene) i MDA-MB-468-celler. Y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 34 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for forbindelse X (doser i uM-enheter, som indikert langs x-aksen) i MDA-MB-468-celler, der y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 35 viser en dose-responskurve før statistisk analyse for paklitaxel (doser uttrykt som ng/ml, som indikert langs x-aksen) i MDA-MB-468-celler, der Y-aksen indikerer prosent celleoverlevelse. Figur 36 betegner grafisk dataene tilveiebrakt i tabell 2, som er vist senere i foreliggende patentbeskrivelse. Y-aksen (vertikal akse, nr. 0-1500) betegner tumorvolumet i mm3 på dag 25. X-aksen (horisontal akse, nr. 1-8) betegner de

administrerte stoffer. Numrene 1-8 betegner: 1 er vehikkel; 2 er den FPT-inhibitoriske forbindelse (identifisert som "forbindelse X" i tabell 2); 3 er "Cytoxan"; 4 er 5-FU; 5 er vinkristin; 6 er den FPT-inhibitoriske forbindelse pluss "Cytoxan"; 7 er den FPT-inhibitoriske forbindelse pluss 5-FU; og 8 er den FPT-inhibitoriske forbindelse pluss vinkristin.

Figur 36 betegner eksperimenter hvori HTB177-celler ble implantert subkutant i nakenmus på dag 0. Den FPT-inhibitoriske forbindelse, dosert oralt med 40 mpk fire ganger pr. dag på dagene 1-26, resulterte i 68 % tumorvekstinhibering. Kjemoterapeutiske midler ble administrert intraperitonealt på dag 13. Når de ble anvendt som enkle midler, ga de cytotoksiske midler 9 %, 28 % og 7 % inhibering for henholdsvis "Cytoxan"

(syklofosfamid) (200 mpk), 5-fluorurasil (5-FU) (50 mpk) og vinkristin (1 mpk). Når den FPT-inhibitoriske forbindelse X (40 mpk) ble anvendt i kombinasjon med de cytotoksiske midler, ble tumorvekstinhibering på 81 %, 80 % og 80 % observert for kombinasjonen med henholdsvis "Cytoxan", 5-FU og vinkristin. Disse resultater indikerer at økt effektivitet observeres når FPT-forbindelsen kombineres med de cytotoksiske, kjemoterapeutiske midler, sammenlignet med behandling med enkle midler. Lignende resultater ble observert når FPT-forbindelsen ble dosert to ganger pr. dag. Dataene i figur 36, representert ved søyler 6, 7 og 8, hadde en P-verdi < 0,05, sammenlignet med behandling med hvert enkelt middel.

Figur 37 betegner grafisk tumorregresjonsdata. Y-aksen (vertikal akse, nr. 0-200) betegner tumorvolumet i mm<3>. X-aksen (horisontal akse, nr. 1-7) betegner de administrerte stoffer. Numrene 1-7 betegner: 1 er 20 % HPBCD (vehikkel); 2 er den FPT-inhibitoriske forbindelse X dosert med 2,5 mpk; 3 er den FPT-inhibitoriske forbindelse X dosert med 10 mpk; 4 er den FPT-inhibitoriske forbindelse X dosert med 20 mpk; 5 er den FPT-inhibitoriske forbindelse X dosert med 30 mpk; 6 er den FPT-inhibitoriske forbindelse X dosert med 10 mpk og "Cytoxan" dosert med 200 mpk; og 7 er "Cytoxan" dosert med 200 mpk. Antallet dager (0, 7, 14, 21 eller 28), representert ved en bestemt søyle i diagrammet, er indikert på den øvre høyre del av figur 37. Dataene i figur 37 ble oppnådd fra evaluering av den FPT-inhibitoriske forbindelse i en transgen musemodell, hvori et aktivert H-ras-onkogen uttrykkes fra sur mysepromotor (Nielsen et al., Evaluation of the wap- ras Trans-genic Mouse as a Model System for Testing Anticancer Drugs, Cancer Research, 52, 3733-3788, 1. Juli 1992). Fordi trans-genet bæres på Y-kromosomet, utvikler transgene hannmus reproduserbart tumorer (bryst og spyttkjertel) ved ca. 1,5 til 2 måneders alder. Denne modellen er bitt undersøkt på en terapeutisk måte, hvori behandling ble initiert etter at musene hadde utviklet merkbare tumorer (gjennomsnittlig tumorstørrel-se ved starten av dosering var 200 mm3) . Musene ble dosert oralt fire ganger pr. dag med 2,5, 10, 20 eller 30 mpk av den FPT-inhibitoriske forbindelse i 4 uker. Noen mus ble også behandlet med ukentlig intraperitoneal injeksjon med "Cytoxan"

(syklofosfamid), 200 mpk. Vekstkurver for de forskjellige behandlingsgrupper er vist i søylediagrammet i figur 37. I den vehikkelbehandlede kontrollgruppe vokste tumorer gjennom hele forløpet av eksperimentet til et volum > 1500 mm<3> ved slutten av undersøkelsen. "Cytoxan" alene resulterte i nesten full-stendig inhibering av tumorvekst, men ikke noen signifikant tumorregresjon. Den FPT-inhibitoriske forbindelse i dose-nivåene på 20 og 30 mpk resulterte i signifikant tumorregresjon. Den FPT-inhibitoriske forbindelse ved 2,5 eller 10 mpk reduserte hastigheten av tumorvekst, men resulterte ikke i tumorregresjon. Mens "Cytoxan" eller 10 mpk av den FPT-inhibitoriske forbindelse som enkeltmidler ikke resulterte i tumor-regresjoner, var det overraskende at kombinasjonen av disse behandlinger resulterte i signifikant tumorregresjon. Dette indikerer at når den anvendes i kombinasjon med et standard kjemoterapeutisk middel, slik som "Cytoxan", kan det oppnås høyere tumorresponser ved lavere doser av den FPT-inhibitoriske forbindelse.

Figur 38 viser data for kombinasjonsterapi (i den Wap-ras-transgene modell) med forbindelse X og paklitaxel i forhold til gjennomsnittlig tumorvolum (uttrykt i mm<3> langs y-aksen) over tid. Kurven med hvite kvadrater betegner paklitaxel alene (5 mpk), de hvite sirkler betegner forbindelse X alene (20 mpk), de skråskraverte kvadrater betegner kombinasjonen av paklitaxel (5 mpk) pluss forbindelse X (20 mpk), og de svarte kvadrater betegner vehikkel uten legemiddel.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av FPT-inhibitoren

for fremstilling av et medikament for anvendelse samtidig eller sekvensvis med det antineoplastiske middel paklitaxel eller et paklitaxelderivat og/eller bestrålingsterapi ved behandling av proliferativ sykdom hos en pasient med behov for slik behandling samt anvendelse av FPT-inhibitoren

for fremstilling av et medikament for anvendelse samtidig eller sekvensvis med et mikrotubuluspåvirkende middel som er en taxoter, ved behandling av proliferativ sykdom hos en pasient med behov for slik behandling.

FPT-inhibitorer er forbindelser som: (i) potent inhiberer FPT (men fortrinnsvis ikke geranylgeranylprotein-transferase I in vitro) ; (ii) blokkerer den fenotypiske endring indusert av en form av transformerende H-ras, som er en farnesylakseptor, men fortrinnsvis ikke av en form for transformerende H-ras utformet til å være en geranylgeranyl-akseptor; (iii) blokkerer intracellulær farnesylering av ras; og (iv) blokkerer abnormal cellevekst.

Behandling av proliferative sykdommer inkluderer en fremgangsmåte for behandling (inhibering) av den abnormale vekst av celler, inkludert transformerte celler, i en pasient med behov for en slik behandling (f.eks. et pattedyr, slik som et menneske), ved administrering, samtidig eller sekvensielt, av en effektiv mengde av en FPT-inhibitor og en effektiv mengde av et kjemoterapeutisk middel og/eller stråling. Abnormal vekst av celler betyr cellevekst som er uavhengig av normale regulatoriske mekanismer (f.eks. tap av kontakt-inhibering), inkludert den abnormale vekst av: (1) tumorceller (tumorer) som uttrykker et aktivert ras-onkogen; (2) tumorceller hvori ras-proteinet er aktivert som et resultat av onkogen mutasjon i et annet gen; og (3) benigne og maligne celler fra andre proliferative sykdommer.

Eksempler på tumorer som kan behandles, inkluderer epitelcancere, f.eks. prostatacancer, lungecancer (f.eks. lungeadenokarsinom), pankreascancere (f.eks. pankreaskarsinom, slik som f.eks. eksokrint pankreaskarsinom), brystcancere, coloncancere (f.eks. colorektale karsinomer, slik som f.eks. colonadenokarsinom og colonadenom), ovariecancer og blærekarsinom. Andre cancere som kan behandles, inkluderer melan-omer, myeloide leukemier (f.eks. akutt myelogen leukemi), sarkomer, tyreoidfollikkelcancer og myelodysplastisk syndrom.

Behandling av proliferative sykdommer inkluderer også en fremgangsmåte for behandling (inhibering) av proliferative sykdommer, både benigne og maligne, hvori ras-proteiner blir avvikende aktivert som et resultat av onkogen mutasjon i andre gener - det vil si at selve ras-genet ikke blir aktivert ved mutasjon til en onkogen form. Denne fremgangsmåten omfatter administrering, samtidig eller sekvensielt, av en effektiv mengde av en FPT-inhibitor og en effektiv mengde av et neo-plastisk middel (og/eller strålingsterapi) til en pasient med behov for en slik behandling (f.eks. et pattedyr, slik som et menneske). Eksempler på slike proliferative sykdommer som kan behandles, inkluderer: den benigne proliferative forstyrrelse neurofibromatose, eller tumorer hvori ras aktiveres på grunn av mutasjon eller overekspresjon av tyrosinkinaseonkogener (f.eks. neu, src, abl, lek, lyn, fyn).

Som anvendt heri, har de følgende uttrykk de følgende betydninger dersom ikke annet er angitt: antineoplastisk middel - et kjemoterapeutisk middel som er effektivt mot cancer;

samtidig - (1) samtidig med hensyn til tid, eller

(2) forskjellige tidspunkter under forløpet av et felles behandlingsskjema; og

sekvensielt - (1) administrering av én komponent i fremgangsmåten ((a) FPT-inhibitor, eller (b) antineoplastisk middel og/eller strålingsterapi), etterfulgt av administrering av den andre komponent; etter administrering av én komponent kan den andre komponent administreres vesentlig umiddelbart etter den første komponent, eller den andre komponent kan administreres etter en effektiv tidsperiode etter den første komponent; den effektive tidsperiode er tiden gitt for reali-sering av maksimal fordel fra administreringen av den første komponent.

Kjemoterapeutiske midler

Klasser av forbindelser som kan anvendes som kjemoterapeutisk middel (antineoplastisk middel), inkluderer: alkyleringsmidler, antimetabolitter, naturlige produkter og deres derivater, hormoner og steroider (inkludert syntetiske analoger) og syntetiske forbindelser. Eksempler på forbindelser innenfor disse klasser er gitt nedenfor: alkyleringsmidler (inkludert nitrogensenneper, etyleniminderivater, alkylsulfonater, nitrosoureaforbindelser og triazener): uracilsennep, klormetin, syklofosfamid ("Cytoxan"), ifosfamid, melfalan, klorambucil, pipobroman, trietylenmelamin, trietylentiofosforamin, busulfan, carmustin, lomustin, streptozocin, dakarbazin og temozolomid;

antimetabolitter (inkludert folsyreantagonister, pyrimidinanaloger, purinanaloger og adenosindeaminaseinhibi-torer): metotreksat, 5-fluoruracil, floxuridin, cytarabin, 6-

merkaptopurin, 6-tioguanin, fludarabinfosfat, pentostatin og gemcitabin;

naturlige produkter og deres derivater (inkludert vinkaalkaloider, antitumorantibiotika, enzymer, lymfokiner og epipodofyllotoksiner): vinblastin, vinkristin, vindesin, bleo-mycin, daktinomycin, daunorubicin, doksorubicin, epirubicin, idarubicin, paklitaxel (paklitaxel er kommersielt tilgjengelig som "Taxol" og er beskrevet i nærmere detalj nedenfor i avsnittet betegnet "Mikrotubuluspåvirkende midler"), mitra-mycin, deoksykoformycin, mitomycin-C, L-asparginase, inter-feroner (spesielt IFN-a), etoposid og teniposid;

hormoner og steroider (inkludert syntetiske analoger): 17a-etynyløstradiol, dietylstilbestrol, testo-steron, prednison, fluoksymesteron, dromostanolonpropionat, testolakton, megestrolacetat, tamoksifen, metylprednisolon, metyltestosteron, prednisolon, triamcinolon, klortrianisen, hydroksyprogesteron, aminoglutetimid, østramustin, medroksy-progesteronacetat, leuprolid, flutamid, toremifen, zoladex;

syntetiske forbindelser (inkludert uorganiske komplekser, slik som platinakoordinasjonskomplekser): cisplatin, karboplatin, hydroksyurea, amsakrin, prokarbazin, mitotan, mitoksantron, levamisol og heksametylmelamin.

Metoder for sikker og effektiv administrering av de fleste av disse kjemoterapeutiske midler er kjent for fagfolk. Deres administrering er dessuten beskrevet i standardlittera-turen. Administreringen av mange av de kjemoterapeutiske midler er f.eks. beskrevet i "Physicians' Desk Reference"

(PDR), f.eks. 1996-utgaven (Medical Economics Company, Montvale, NJ 07645-1742, USA); som er inkorporert heri ved referanse.

Mikrotubuluspåvirkende midler

Som anvendt heri, er et mikrotubuluspåvirkende middel en forbindelse som forstyrrer cellulær mitose, det vil si har en antimitotisk effekt, ved å påvirke mikrotubulusdannelse og/eller virkning. Slike midler kan f.eks. være mikrotubulus-stabiliserende midler eller midler som ødelegger mikrotubulusdannelse .

Mikrotubuluspåvirkende midler er vel kjent for fagfolk og inkluderer allokolchicin (NSC 406042), halichondrin B (NSC 609395), kolchicin (NSC 757), kolchicinderivater (f.eks. NSC 33410), dolastatin 10 (NSC 376128), maytansin (NSC 153858), rhizoxin (NSC 332598), paklitaxel ("Taxol", NSC 125973), "Taxol"-derivater (f.eks. NSC 608832), tiokolchicin (NSC 361792), tritylcystein (NSC 83265), vinblastinsulfat (NSC 49842), vinkristinsulfat (NSC 67574), epotilon A, epotilon og diskodermolid (se Service (1996) Sience, 274:2009), østramustin, nokodazol, MAP4 og lignende.

Eksempler på slike midler er også beskrevet i den vitenskapelige litteratur og patentlitteraturen, se f.eks. Bulinski (1997), J. Cell Sei., 120:3055-3064; Panda (1997), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 94:10560-10564; Muhlradt (1997), Cancer Res., 57:3344-3346; Nicolaou (1997), Nature, 387:268-272; Vasquez (1997), Mol. Biol. Cell., 8:973-985; Panda

(1996), J. Biol. Chem., 271:29807-29812.

Spesielt foretrukne midler er forbindelser med paklitaxellignende aktivitet. Disse inkluderer paklitaxel og paklitaxelderivater (paklitaxel-lignende forbindelser) og analoger. Paklitaxel og dets derivater er kommersielt tilgjengelige. Metoder for fremstilling av paklitaxel og paklitaxelderivater og analoger er dessuten vel kjent for fagfolk (se f.eks. US-patenter nr. 5 569 729, 5 565 478, 5 530 020,

5 527 924, 5 508 447, 5 489 589, 5 488 116, 5 484 809, 5 478 854, 5 478 736, 5 475 120, 5 468 769, 5 461 169, 5 440 057, 5 422 364, 5 411 984, 5 405 972 og 5 296 506).

Mer spesifikt refererer betegnelsen "paklitaxel", som anvendt heri, til legemidlet som er kommersielt tilgjengelig som "Taxol" (NSC-nummer: 125973). "Taxol" inhiberer eukaryot cellereplikasjon ved å øke polymerisering av tubulinkompo-nenter i stabiliserte mikrotubulusbunter som ikke er i stand til å reorganisere til de riktige strukturer for mitose. Av de mange tilgjengelige kjemoterapeutiske midler har paklitaxel skapt interesse på grunn av sin effektivitet i kliniske forsøk mot legemiddelavvisende tumorer, inkludert ovarie- og mamma-kjerteltumorer (Hawkins (1992), Oncology, 6:17-23; Horwitz

(1992), Trends Pharmacol. Sei., 13:134-146; Rowinsky (1990), J. Nati. Canc. Inst. 82:1247-1259).

Ytterligere mikrotubuluspåvirkende midler kan under-søkes ved anvendelse av én av mange slike analyser kjent i teknikken, f.eks. en semiautomatisrt analyse som måler den tubulinpolymeriserende aktivitet av paklitaxelanaloger, i kombinasjon med en cellulær analyse for å måle potensialet hos disse forbindelser til å blokkere celler i mitose (se Lopes

(1987), Cancer Chemother. Pharmacol., 41:37-47).

Generelt bestemmes aktiviteten av en testforbindelse ved å bringe en celle i kontakt med forbindelsen og bestemme hvorvidt cellesyklusen forstyrres eller ikke, spesielt gjennom inhibering av en mitotisk hendelse. En slik inhibering kan formidles ved ødeleggelse av den mitotiske apparatur, f.eks. ødeleggelse av normal spindeldannelse. Celler hvori mitose er ødelagt, kan karakteriseres ved endret morfologi (f.eks. mikrotubuluskomprimering, økt kromosomtall etc).

I en foretrukket utførelsesform blir forbindelser med mulig tubilinpolymeriseringsaktivifet screenet in vitro. I en foretrukket utførelsesform blir forbindelsene screenet mot dyrkede WR21-celler (avledet fra linje 69-2 wap-ras-mus) for inhibering av proliferasjon og/eller for endret cellulær morfologi, spesielt for mikrotubuluskomprimering. In vivo-screening av positive testforbindelser kan deretter utføres ved anvendelse av nakenmus som inneholder WR21-tumorcellene. Detaljerte protokoller for denne screeningsmetoden er beskrevet av Porter (1995), Lab. Anim. Sei., 45(2):145-150.

Andre metoder for screening av forbindelser for ønsket aktivitet er vel kjent for fagfolk. Slike analyser involverer typisk analyser for inhibering av mikrotubulus-sammensetning og/eller demontering. Analyser for mikrotubulus-sammensetning er f.eks. beskrevet av Gaskin et al. (1974), J. Molec. Biol., 89:737-758. US-patent nr. 5 569 720 tilveie-bringer også in vitro- og in vivo-analyser for forbindelser med paklitaxellignende aktivitet.

Metoder for sikker og effektiv administrering av de ovennevnte mikrotubuluspåvirkende midler er kjent for fagfolk. Deres administrering er dessuten beskrevet i standardlittera-turen. Administreringen av mange av de kjemoterapeutiske midler er f.eks. bekrevet i "Physicians' Desk Reference"

(PDR), f.eks. 1996-utgaven (Medical Economics Company,

Montvale, NJ 07645-1742, USA); som er inkorporert heri ved referanse.

FPT- inhibitorer

Klasser av forbindelser som kan anvendes som FPT-inhibitor, inkluderer: oligopeptider, peptidetterlignende forbindelser, farnesylerte, peptidetterlignende forbindelser, fusjonert ring-trisykliske benzosykloheptapyridiner, karbonyl-piperazinylforbindelser, karbonylpiperidinylforbindelser, farnesylderivater og naturlige produkter og derivater.

En foretrukket forbindelse for anvendelse som en FPT-inhibitor ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse har formelen: det vil si forbindelsen 4-[2-[4-[(8-klor-3,10-dibrom-6,11-di-hydro-5H-benzo[5,6]syklohepta[1,2-b]pyridin-ll-yl)-1-piperi-dinyl]-2-oksoetyl]-1-piperidinkarboksamid, (+)-isomeren av denne, som har strukturen

Se også US-patent nr. 5 719 148, som ble meddelt 17. februar 1998, og er uttrykkelig inkorporert heri ved referanse.

Eksempler

Eksemplene A-G nedenfor beskriver en undersøkelse av in vitro- effekten av å kombinere paklitaxel med den følgende FPT-inhibitoriske forbindelse (referert til som "forbindelse X" i tabellene nedenfor):

Som nevnt ovenfor, viser figurene 1-15 tre eksempler hvor det ble observert klar synergi. Disse tre eksempler er eksempler A-C, som diskutert nedenfor. Lignende resultater ble observert i modellene DLD-l-colon, HTB177-lunge, PA-l-ovarie, LNCaP-prostata, AsPC-l-pankreas og PANC-l-pankreas (oppsummert i tabellen nedenfor; data ikke vist). Klar antagonisme ble observert i én cellelinje MDA-MB-231 (figurene 16-20, eksempel D). Blandede resultater ble observert i MDA-MB-468 (figurene 21-35, eksempler E-G).

Analyse av in vitro-legemiddelinteraksjoner mellom forbindelse X og paklitaxel

For å fremstille preparater av forbindelse X for de følgende eksempler ble forbindelsen oppløst i 100 % DMSO. Sluttkonsentrasjonen av DMSO i cellene var < 0,02 % DMSO i cellekulturmedium. For paklitaxel ble en lagervare av paklitaxel oppløst i 100 % etanol. Sluttkonsentrasjonen av etanol var < 0,001 % i cellekulturmedium.

Eksempel A

Forbindelse X synergiserer med paklitaxel for å inhibere proliferasjon av MiaPaCa2- pankreastumorceller

Metoder: Aliquoter av MiaPaCa2-pankreastumorceller ble tilsatt i dyrkningsbrønner og tillatt å feste seg i 3 timer. Cellene ble inkubert med paklitaxel i 4 timer, vasket, deretter ble forbindelse X tilsatt, og inkubasjonen ble fortsatt i 7 dager. Celleproliferasjon ble kvantifisert ved anvendelse av MTT-analysen ifølge Mosmann (se Mosmann, T.

(1983), J. Immunol. Meth., 65:55-63). Data ble analysert ved anvendelse av Thin Plate Spline-metodikken ifølge 0'Connel og Wolfinger (1997) (se 0'Connel, M.A. og Wolfinger, R.D., J. Computational and Graphical Statistics, 6:224-241, 1997).

Resultater: Forbindelse X og paklitaxel hadde synergistisk effektivitet (p = 0,0002). Figur 1 viser isobol-analysen for interaksjonen av disse legemidler, mens figur 2 viser den tredimensjonale modell for celleproliferasjon, fra hvilken figur 1 ble avledet. Figurene 3, 4 og 5 viser dose-responskurvene før statistisk analyse.

Eksempel B

Forbindelse X synergiserer med paklitaxel for å inhibere proliferasjon av p53mut- DU- 145- prostatatumorceller

Metoder: Aliquoter av p53<mut->DU-145-prostatatumorceller ble tilsatt i dyrkningsbrønner og tillatt å feste seg i 3 timer. Cellene ble inkubert med paklitaxel i 4 timer, vasket, deretter ble forbindelse X tilsatt, og inkubasjonen ble fortsatt i 7 dager. Celleproliferasjon ble kvantifisert ved anvendelse av MTT-analysen ifølge Mosmann. Data ble analysert ved anvendelse av Thin Plate Spline-metodikken ifølge 0'Connel og Wolfinger (1997).

Resultater: Forbindelse X og paklitaxel hadde synergistisk effektivitet (p = 0,0238). Figur 6 viser isobol-analysen for interaksjonen av disse legemidler, mens figur 7 viser den tredimensjonale modell for celleproliferasjon, fra hvilken figur 6 ble avledet. Figurene 8, 9 og 10 viser dose-responskurvene før statistisk analyse.

Eksempel C

Forbindelse X synergiserer med paklitaxel for å inhibere proliferasjon av MidT# 2- l- transgene musemammatumorceller

Metoder: Aliquoter av MidT#2-l-musetumorceller ble tilsatt i dyrkningsbrønner og tillatt å feste seg i 3 timer. Cellene ble inkubert med paklitaxel i 4 timer, vasket, deretter ble forbindelse X tilsatt, og inkubasjonen ble fortsatt i 7 dager. Celleproliferasjon ble kvantifisert ved anvendelse av MTT-analysen ifølge Mosmann. Data ble analysert ved anvendelse av Thin Plate Spline-metodikken ifølge 0'Connel og

Wolfinger (1997).

Resultater: Forbindelse X og paklitaxel hadde synergistisk effektivitet (p = 0,0110). Figur 11 viser isobol-analysen for interaksjonen av disse legemidler, mens figur 12 viser den tredimensjonale modell for celleproliferasjon, fra hvilken figur 11 ble avledet. Figurene 13, 14 og 15 viser dose-responskurvene før statistisk analyse.

Eksempel D

Forbindelse X og paklitaxel har antagonistisk interaksjon i p53mut- MDA- MB- 231- brystcancerceller

Metoder: Aliquoter av p53<mut->MDA-MB-231-tumorceller ble tilsatt i dyrkningsbrønner og tillatt å feste seg i 3 timer. Cellene ble inkubert med paklitaxel i 4 timer, vasket, deretter ble forbindelse X tilsatt, og inkubasjonen ble fortsatt i 7 dager. Celleproliferasjon ble kvantifisert ved anvendelse av MTT-analysen ifølge Mosmann. Data ble analysert ved anvendelse av Thin Plate Spline-metodikken ifølge 0'Connel og Wolfinger (1997).

Resultater: Forbindelse X og paklitaxel hadde antagonistisk interaksjon (p = 0,0093). Figur 16 viser isobol-analysen for interaksjonen av disse legemidler, mens figur 17 viser den tredimensjonale modell for celleproliferasjon, fra hvilken figur 16 ble avledet. Figurene 18, 19 og 20 viser dose-responskurvene før statistisk analyse.

Eksempler E, F og G

Studier av forbindelse X og paklitaxel i p53mut- MDA- MB- 468-brystcancerceller

I de følgende tre eksempler (E-G) ble effektene av forbindelse X og paklitaxel studert i p53mut-MDA-MB-4 68-brystcancerceller. I to av eksemplene (eksemplene F og G) hadde forbindelse X og paklitaxel synergistisk interaksjon, men i eksempel E ble interaksjonen funnet å være antagonistisk. Cellene i eksemplene F og G synes å ha et bedre proliferasjonstempo enn cellene i eksempel E, hvilket kan ha påvirket resultatet, selv om isobolkurvene er atypiske i alle tre av disse studier med p53mut-MDA-MB-4 68-brystcancerceller.

Data basert på en kombinasjon av en spesiell peptidetterlignende FTI-forbindelse med flere forskjellige kjemoterapeutiske midler (f.eks. "Taxol" (paklitaxel), doksorubicin, cisplatin og vinblastin) i brystcancercellelinjer MDA-MB-468 og MCF-7 er presentert av Moasser, M.M. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 95:1369-1374, 1998. Resultater av ytterligere eksperimenter med kombinasjon av FTI-forbindelsen med "Taxol" ble rapportert i Moasser-publikasjonen (data ikke vist) for T47D-, MDA-MB-231- og MCF-7-brystcancerceller, og for DU-145-prostatacancerceller. Ytterligere resultater ble rapportert i publikasjonen (data ikke vist) for fluoruracil i brystcancerceller.

Eksempel E

Forbindelse X og paklitaxel har en antagonistisk interaksjon i p53mut- MDA- MB- 468- brystcancerceller ( undersøkelse nr. 1)

Metoder: Aliquoter av p53mut-MDA-MB-4 68-tumorceller ble tilsatt i dyrkningsbrønner og tillatt å feste seg i 3 timer. Cellene ble inkubert med paklitaxel i 4 timer, vasket, deretter ble forbindelse X tilsatt, og inkubasjonen ble fortsatt i 7 dager. Celleproliferasjon ble kvantifisert ved anvendelse av MTT-analysen ifølge Mosmann. Data ble analysert ved anvendelse av Thin Plate Spline-metodikken ifølge 0'Connel og Wolfinger (1997).

Resultater: Forbindelse X og paklitaxel hadde antagonistisk interaksjon (p = 0,0001). Figur 21 viser isobol-analysen for interaksjonen av disse legemidler, mens figur 22 viser den tredimensjonale modell for celleproliferasjon, fra hvilken figur 21 ble avledet. Figurene 23, 24 og 25 viser dose-responskurvene før statistisk analyse.

Eksempel F

Forbindelse X og paklitaxel har en synergistisk interaksjon i p53mut- MDA- MB- 4 68- brystcancerceller ( undersøkelse nr. 2)

Metoder: Aliquoter av p53<mut->MDA-MB-468-tumorceller ble tilsatt i dyrkningsbrønner og tillatt å feste seg i 3 timer. Cellene ble inkubert med paklitaxel i 4 timer, vasket, deretter ble forbindelse X tilsatt, og inkubasjonen ble fortsatt i 7 dager. Celleproliferasjon ble kvantifisert ved anvendelse av MTT-analysen ifølge Mosmann. Data ble analysert ved anvendelse av Thin Plate Spline-metodikken ifølge 0'Connel og Wolfinger (1997) .

Resultater: Forbindelse X og paklitaxel hadde en synergistisk interaksjon (p = 0,0237). Figur 26 viser isobol-analysen for interaksjonen av disse legemidler, mens figur 27 viser den tredimensjonale modell for all proliferasjon som figur 26 ble avledet fra. Figurene 28, 29 og 30 viser dose-responskurvene før statistisk analyse. Cellene i denne under-søkelsen hadde et bedre proliferativt tempo enn cellene i den tidligere undersøkelsen (eksempel E), hvilket kan ha påvirket resultatet, selv om isobolkurvene er atypiske i begge under-søkelser .

Eksempel G

Forbindelse X og paklitaxel har en synergistisk interaksjon i p53mut- MDA- MB- 4 68- brystcancerceller ( undersøkelse nr. 3)

Metoder: Aliquoter av p53<mut->MDA-MB-468-tumorceller ble tilsatt i dyrkningsbrønner og tillatt å feste seg i 3 timer. Cellene ble inkubert med paklitaxel i 4 timer, vasket, deretter ble forbindelse X tilsatt, og inkubasjonen ble fortsatt i 7 dager. Celleproliferasjon ble kvantifisert ved anvendelse av MTT-analysen ifølge Mosmann. Data ble analysert ved anvendelse av Thin Plate Spline-metodikken ifølge 0'Connel og Wolfinger (1997).

Resultater: Forbindelse X og paklitaxel hadde en synergistisk interaksjon (p = 0,0094). Figur 31 viser isobol-analysen for interaksjonen av disse legemidler, mens figur 32 viser den tredimensjonale modell for all proliferasjon som figur 31 ble avledet fra. Figurene 33, 34 og 35 viser dose-responskurvene før statistisk analyse. Som for eksempel F synes cellene i eksempel G å ha et bedre proliferasjonstempo enn cellene i eksempel E, hvilket kan ha påvirket resultatet, selv om isobolkurvene er atypiske i alle disse undersøkelser med p53mut-MDA-MB-4 68-brystcancerceller.

Eksempel H

In vivo- kombinasjonsterapi - B. I. D.

Effekten av in vivo-kombinasjonsterapi med en FPT-inhibitorisk forbindelse (referert til som "forbindelse X" i

tabellene nedenfor)

og paklitaxel på HTB-177-xenotransplantater (NCI-H460, et humant lungestorcellekarsinom) ved anvendelse av dosering to ganger pr. dag ble bestemt.

Atymiske nu/nu-hunnmus, 5-6 uker gamle, ble anvendt. På dag 0 ble HTB-177-celler, 3 x IO<6>, injisert subkutant i flanken til 120 mus. En oversikt over gruppene er vist nedenfor:

Formulering

Forbindelse X for grupper 3, 4, 7, 8, 9 og 10 ble oppløst i 20 % hydroksypropylbetasyklodekstran (vehikkel I). 0,2 ml av løsningen av forbindelse X var doseringsvolumet. Paklitaxel ble oppløst i en fortynnet etanol-/kemofor EL-løsning (vehikkel II), og i.p.-doseringsvolumet for paklitaxel var 0,1 ml. 80 mpk-doseringsløsningen av forbindelse X ble tillaget ved tilsetning av 17 ml 20 % HPBCD til et 50 ml rør inneholdende 136 mg av forbindelse X for å oppløse forbindelsen. Blandingen ble sonikert inntil det var dannet en ferdig løsning. 20 mpk-doseringsløsningen ble tillaget ved å plassere

2 ml av 80 mpk-løsningen i et 15 ml rør, tilsetning av 6 ml

20 % HPBCD og virvling av løsningen for å blande den.

Protokoll

Tumorceller ble inokulert i 120 mus om morgenen på dag 0, og musene ble veid, fordelt tilfeldig og deretter øremerket. Legemiddelbehandling startet kl 0730 på dag 4. Dyrene i grupper 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10 og 11 ble dosert p.o., B.I.D. med forbindelse X eller vehikkel I-løsning (HPBCD),

kl 0730 og 1930 7 dager pr. uke. Grupper 5, 6, 7, 8, 9, 10 og 11 ble dosert i.p. på dagene 4-7 med paklitaxel eller vehikkel II-løsning. Tumorvekst ble kvantifisert ved å måle tumorvolum på dag 7 og dag 14.

Resultatene er vist i tabell 1 nedenfor.

For tabell 1 ovenfor er det spesielt verdt å legge merke til at selv om forbindelse X alene ved 20 mpk kun oppviste 52 % gjennomsnittlig inhibering (eksperiment 4), og paklitaxel alene ved 5 mpk kun oppviste 61 % gjennomsnittlig inhibering (eksperiment 6), ga kombinasjonen av forbindelse X ved 20 mpk pluss paklitaxel ved 5 mpk 86 % gjennomsnittlig inhibering (se eksperiment 10).

Eksempel J

In vivo- kombinasjonsterapi - Q. I. D.

Effekten av in vivo-kombinasjonsterapi med en FPT-inhibitorisk forbindelse (referert til som "forbindelse X" i tabell 2 nedenfor)

og kjemoterapeutiske midler på HTB-177 (NCI-H4 60, et humant lungestorcellekarsinom) ved anvendelse av dosering fire ganger pr. dag ble bestemt.

Atymiske nu/nu-hunnmus, 5-6 uker gamle, ble anvendt. På dag 0 ble HTB-177, 3 x IO<6>, injisert subkutant i flanken til 170 mus. Deretter ble musene veid og vilkårlig delt i 17 grupper på 10 mus pr. gruppe. Legemiddelbehandling startet ca. kl 0600 på dag 1. Musene i gruppene 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 og 17 ble dosert p.o., q.i.d., ca. kl 0600, 1200, 1800 og 2400, 7 dager pr. uke i 4 uker. Musene i grupper 6-17 ble dosert i.p. én gang med det angitte cytotoksiske middel (se tabell 1) på dag 13. De primære tumorer ble målt to ganger pr. uke. Resultatene er gitt i tabell 2.

Forbindelse X (FPT-inhibitorisk forbindelse) for grupper 3, 4, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 og 17 ble opp-løst i 20 % hydroksypropylbetasyklodekstran (HPBCD). "Cytoxan", 5-FU og vinkristin ble oppløst i sterilt vann. 40 mpk-doseringsløsningen av forbindelse X ble tillaget ved tilsetning av 39,6 ml 20 % HPBCD til et 50 ml rør inneholdende 320 mg av forbindelse X for å oppløse forbindelsen. Blandingen ble sonikert inntil det var dannet en ferdig løsning. Aliquoter av løsningen ble preparert i god tid for det nødvendige antall doser for den etterfølgende 24 timers periode. Aliquoter av 20 % HPBCD ble preparert i god tid for det nødvendige antall doseringer med vehikkel-kontroll på den spesifikke doseringsdag. 20 mpk-doseringsløsningen ble tillaget ved å plassere 2 ml av 80 mpk-løsningen i et 15 ml rør, tilsetning av 6 ml 40 % HPBCD og virvling av løsningen for å blande den.

Eksempel K

In vi vo- kombinasjonsterapi - B. I. D.

Effekten av in vi vo-kombinasjonsterapi med en FPT-inhibitorisk forbindelse (referert til som "forbindelse X" i tabell 3 nedenfor)

og det kjemoterapeutiske middel "Cytoxan" på HTB-177 (NCI-H4 60, et humant lungestorcellekarsinom) ved anvendelse av dosering to ganger pr. dag ble bestemt.

Atymiske nu/nu-hunnmus, 5-6 uker gamle, ble anvendt. På dag 0 ble HTB-177, 3 x 10<6>, injisert subkutant i flanken til 100 mus. Deretter ble musene veid og vilkårlig delt i 10 grupper på 10 mus pr. gruppe. Legemiddelbehandling startet ca. kl 0800 på dag 1. Musene i gruppene 2, 5, 6, 7, 8, 9 og 10 ble dosert p.o., b.i.d., ca. kl 0800 og 2000, 7 dager pr. uke i 4 uker. Musene i grupper 3, 4, 6, 7, 9 og 10 ble dosert i.p. med den angitte dose "Cytoxan" (se tabell 2) på dagene 5, 12 og 19. De primære tumorer ble målt én gang pr. uke med start når den gjennomsnittlige størrelse var ca. 50-100 mm<3>. Resultatene er gitt i tabell 3.

Forbindelse X (FPT-inhibitorisk forbindelse) for grupper 5, 6, 7, 8, 9 og 10 ble oppløst i 40 % hydroksypropylbetasyklodekstran (HPBCD). "Cytoxan" ble oppløst i sterilt vann. 80 mpk-doseringsløsningen av forbindelse X ble tillaget ved tilsetning av 10,8 ml 40 % HPBCD til et 50 ml rør inneholdende 17 6 mg av forbindelse X for å oppløse forbindelsen. Blandingen ble sonikert inntil det var dannet en ferdig løsning. 20 mpk-doseringsløsningen ble tillaget ved å plassere

2 ml av 80 mpk-løsningen i et 15 ml rør, tilsetning av 6 ml

40 % HPBCD og virvling av løsningen for å blande den.

Eksempel L

In vi vo- kombinasjonsterapi - B. I. D.

Effekten av in vi vo-kombinasjonsterapi med den følgende FPT-inhibitoriske forbindelse (referert til som "forbindelse X" i tabellene nedenfor)

og "Gemzar" (gemcitabin-HCl) på MIA-PaCa-xenotransplantater (et humant pankreaskarsinom) ble bestemt. Atymiske nu/nu-hunnmus, 7 uker gamle, ble anvendt. På dag 0 ble humane pankreascancer-MIA-PaCa-celler, 6 x IO<6>, injisert subkutant i flanken til 50 mus. En oversikt over gruppene er vist nedenfor :

Formulering

"Gemzar" ble oppløst i normal saltløsning (vehikkel I). Forbindelse X ble oppløst i 20 % hydroksypropylbetasyklo-

dekstran (vehikkel II). 0,2 ml av forbindelse X-løsningen var det orale doseringsvolum, og i.p.-doseringsvolumet for "Gemzar" var 0,1 ml. 80 mpk-doseringsløsningen av forbindelse X ble tillaget ved tilsetning av 15 ml 20 % HPBCD til et 50 ml rør inneholdende 120 mg av forbindelse X for å oppløse forbindelsen. Blandingen ble sonikert inntil det var dannet en ferdig løsning.

"Gemzar"-doseringsløsningen ble tillaget ved tilsetning av 16,6 ml fysiologisk saltvann til en ampulle med "Gemzar" for injeksjon (200 mg gemcitabin-HCl), og virvling for å blande løsningen. ("Gemzar" er en kommersielt tilgjengelig form av gemcitabin (2',2'-difluordeoksycytidin, dFdC, "Gemzar"), som er en pyrimidinanalog av deoksycytidin, hvori deoksyribosekomponenten inneholder to fluoratomer i 2'-posi-sjonen (se Heinemann et al., Cancer Res., 1988, 48:4024). Som anført av DeVita et al. (red.), Cancer: Principles and Practice of Oncology (Lippencott-Raven, Phila., Pa., 5. utg., 1997), er gemcitabin kjent for å ha et bredt spektrum av anti-tumoraktivitet mot leukemier og faste tumorer (referanse: Hertel et al., Evaluation of the antitumor activity of gemci-tabine (2',2'-difluor-2'-deoksycytidin), Cancer Res., 1990, 50:4417). Ifølge DeVita et al.: "Det mest vanlig anvendte kliniske skjema er en 30 minutters IV-infusjon ukentlig i 3 uker, etterfulgt av 1 ukes hvile, og den anbefalte dose er 1000 mg/m<2>. I fase II-forsøk ved anvendelse av dette skjemaet (800-1250 dFdC mg/m<2> pr. uke) ble det rapportert responsgrader i området 16-24 % hos pasienter med ikke-småcellelungecancer (tidligere ubehandlet) og småcellelungecancer, brystcancer-pasienter som ikke hadde mottatt mer enn ett tidligere regime for metastatisk sykdom, og pasienter med refraktær ovariecancer, hormonrefraktær prostatacancer og hode- og hals-cancer"; DeVita et al. (red.), Cancer: Principles and Practice of Oncology (Lippencott-Raven, Phila., Pa., 5. utg., 1997)).

Protokoll

Tumorceller ble inokulert i 50 mus om morgenen på dag 0, og musene ble veid, fordelt tilfeldig og deretter øremerket. Legemiddelbehandling med forbindelse X eller vehikkel II startet på dag 1 og fortsatte to ganger pr. dag kl 0700 og 1900 inntil dag 32. Behandlinger med ""Gemzar" og vehikkel I startet på dag 7 og fortsatte hver 3. dag (dagene 10 og 13). Tumorvekst ble kvantifisert ved å måle tumorvolum i tre dimensjoner på dagene 10, 15, 21, 26 og 32.

Resultatene er vist i tabell 4 nedenfor.

Med hensyn til tabell 4 ovenfor er det spesielt bemerkelsesverdig at mens forbindelse X alene ved 80 mpk kun oppviste 57 % gjennomsnittlig inhibering, og "Gemzar" alene ved 120 mpk kun oppviste 60 % gjennomsnittlig inhibering, ga kombinasjonen av forbindelse X ved 80 mpk pluss "Gemzar" ved 120 mpk 88 % gjennomsnittlig inhibering. Prosent inhibering observert med kombinasjonen av forbindelse X og "Gemzar" er statistisk signifikant i forhold til den observerte prosent med hvert middel alene (p < 0,05).

Eksempel M

In vivo- terapi i Wap- ras- transgen modell

Effektiviteten av kombinasjonen av forbindelse X og paklitaxel ble også evaluert i den Wap-ras-transgene modell. Denne modell ble anvendt på en terapeutisk måte, hvori behandlinger ble initiert etter at musene hadde utviklet tumorer. En oversikt over gruppene er vist nedenfor:

Formulering

Forbindelse X ble oppløst i 20 % hydroksypropylbetasyklodekstran (vehikkel I). 0,2 ml av løsningen av forbindelse X er det orale doseringsvolumet. Paklitaxel ble oppløst i en fortynnet etanol-/kemofor EL-løsning (vehikkel II), og i.p.-doseringsvolumet for paklitaxel var 0,1 ml.

Protokoll

Musene ble veid, vilkårlig fordelt og øremerket på dag 0. Behandling med forbindelse X og med vehikkel I startet på dag 0 og fortsatte hver 12. time inntil dag 21. Behandlinger med paklitaxel og vehikkel II startet på dag 4 og fortsatte daglig på dagene 5, 6 og 7.

Resultat

Resultatene er vist i figur 38. Wap-ras-tumorer reagerte ikke på behandling med paklitaxel. De reagerte (89 % vekstinhibering) på behandling med forbindelse X alene ved

20 mpk. Når 20 mpk av forbindelse X og 5 mpk av paklitaxel ble kombinert, ble det observert økt effektivitet (tumorregresjon, ekvivalent med 180 % vekstinhibering), sammenlignet med midlet alene. I tillegg til økt effektivitet, som resulterer fra

kombinasjonen av forbindelse X og paklitaxel, indikerte resultatene også at forbindelse X var i stand til å sensibilisere paklitaxelresistente tumorer.

Farmasøytiske preparater

Inerte, farmasøytisk akseptable bærere anvendt for fremstilling av farmasøytiske preparater av FPT-inhibitorene og de kjemoterapeutiske midler beskrevet heri, kan enten være faste eller flytende. Faste preparater inkluderer pulvere, tabletter, dispergerbare granuler, kapsler, poser og suppositorier. Pulverne og tablettene kan omfatte fra ca. 5 til ca. 70 % aktiv ingrediens. Egnede faste bærere er kjent i teknikken, f.eks. magnesiumkarbonat, magnesiumstearat, talkum, sukker og/eller laktose. Tabletter, pulvere, poser og kapsler kan anvendes som faste doseringsformer egnet for oral administrering .

For fremstilling av suppositorier blir en lavt-smeltende voks, slik som en blanding av fettsyreglyserider eller kakaosmør, først smeltet, og den aktive ingrediens dispergeres homogent deri ved f.eks. omrøring. Den smeltede homogene blanding helles deretter over i støpeformer med passende størrelse, tillates å avkjøles og stivner derved.

Flytende preparater inkluderer løsninger, suspensjoner og emulsjoner. Som eksempel kan det nevnes vann eller vann-propylenglykolløsninger for parenteral injeksjon. Flytende preparater kan også inkludere løsninger for intra-nasal administrering.

Aerosolpreparater egnet for inhalasjon kan inkludere løsninger og faste stoffer i pulverform, som kan foreligge i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer, slik som en inert, komprimert gass.

Også inkludert er faste preparater som er ment for omdannelse, kort tid før bruk, til flytende preparater for enten oral eller parenteral administrering. Slike flytende former inkluderer løsninger, suspensjoner og emulsjoner.

FPT-inhibitorene og de kjemoterapeutiske midler beskrevet heri kan også utleveres transdermalt. De trans-dermale preparater kan innta form av kremer, lotions, aerosoler og/eller emulsjoner, og kan inkluderes i et transdermalt plaster av matriks- eller reservoartypen som er konvensjonelle i teknikken for dette formål.

Fortrinnsvis blir forbindelsene administrert oralt.

Fortrinnsvis foreligger det farmasøytiske preparat i enhetsdoseform. I en slik form er preparatet delt i enhets-doser som inneholder passende mengder av den aktive komponent, f.eks. en effektiv mengde for å oppnå det ønskede formål.

Mengden av aktiv forbindelse i en enhetsdose av preparatet kan varieres eller justeres fra ca. 0,1 mg til 1000 mg, fortrinnsvis fra ca. 1 mg til 300 mg, mer foretrukket 10 mg til 200 mg, i overensstemmelse med den spesielle anvendelse .

Den virkelige anvendte dose kan varieres, avhengig av pasientens krav og alvorligheten av tilstanden som behandles. Bestemmelse av den riktige dosering for en spesiell situasjon ligger innenfor teknikkens stand. Generell behandling startes med mindre doser som er mindre enn den optimale dose av forbindelsen. Deretter økes dosen med små mengder inntil den optimale effekt under forholdene er nådd. Den totale dose kan passende deles og administreres i porsjoner i løpet av dagen hvis ønskelig.

Mengden og hyppigheten for administrering av FPT-inhibitorene og de kjemoterapeutiske midler og/eller strålingsterapi vil reguleres i overensstemmelse med bedømmelsen av den behandlende lege, ved å ta i betraktning slike faktorer som pasientens alder, tilstand og størrelse, så vel som alvorligheten av sykdommen som behandles. Et doseringsregime av FPT-inhibitorene kan være oral administrering av fra 10 mg til 2000 mg/dag, fortrinnsvis 10-1000 mg/dag, mer foretrukket 50-600 mg/dag, i to til fire (fortrinnsvis to) delte doser for å blokkere tumorvekst. I en foretrukket utførelsesform, i tilfeller hvor FPT-inhibitoren er et fusjonert ring-trisyklisk benzosykloheptapyridin, er den foretrukne dosering av inhibitoren oral administrering av fra 50 til 600 mg/dag, mer foretrukket 50 til 400 mg/dag, i to delte doser. Periodisk terapi (f.eks. 1 uke av 3 uker eller 3 av 4 uker) kan også anvendes.

Det kjemoterapeutiske middel og/eller strålingsterapi kan administreres i overensstemmelse med de terapeutiske protokoller som er vel kjent i teknikken. Det vil fremgå for fagfolk at administrering av det kjemoterapeutiske middel og/eller strålingsterapi kan varieres, avhengig av sykdommen som behandles og de kjente effekter av det kjemoterapeutiske middel og/eller strålingsterapi på denne sykdom. I overensstemmelse med kunnskapen til en fagperson kan også de terapeutiske protokoller (f.eks. doseringsmengder og administrer-ingstidspunkter) varieres i betraktning av de observerte effekter av de administrerte terapeutiske midler (det vil si antineoplastisk middel eller stråling) på pasienten, og i betraktning av de observerte responser av sykdommen på de administrerte terapeutiske midler.

I et foretrukket eksempel på kombinasjonsterapi ved behandling av pankreascancer er FPT-inhibitoren "forbindelse X", som identifisert ovenfor, administrert oralt i et område fra 50 til 400 mg/dag, i to delte doser, på et kontinuerlig doseringsregime; og det antineoplastiske middel er gemcitabin administrert i en dose fra 750 til 1350 mg/m<2>, ukentlig i 3 av 4 uker under forløpet av behandlingen.

I et foretrukket eksempel på kombinasjonsterapi ved behandling av lungecancer er FPT-inhibitoren "forbindelse X", som identifisert ovenfor, administrert oralt i et område fra 50 til 400 mg/dag, i to delte doser, på et kontinuerlig doseringsregime; og det antineoplastiske middel er paklitaxel administrert i en dose fra 65 til 175 mg/m<2>, én gang hver 3. uke.

I et foretrukket eksempel på kombinasjonsterapi ved behandling av gliomer er FPT-inhibitoren "forbindelse X", som identifisert ovenfor, administrert oralt i et område fra 50 til 400 mg/dag, i to delte doser; og det antineoplastiske middel er temozolomid administrert i en dose fra 100 til 250 mg/m<2>.

I et annet eksempel på kombinasjonsterapi er FPT-inhibitoren "forbindelse X", som identifisert ovenfor, administrert oralt i et område fra 50 til 400 mg/dag, i to delte doser, på et kontinuerlig doseringsregime; og det antineoplastiske middel er 5-fluoruracil (5-FU) administrert enten i en dose på 500 mg/m<2> pr. uke (én gang pr. uke) eller i en dose på 200-300 mg/m<2> pr. dag i tilfellet med kontinuerlig infusjon av 5-FU. I tilfellet med administrering av 5-FU i en ukentlig injeksjon kan 5-FU administreres i kombinasjon med en folat-agonist (f.eks. leukovoran i en dose på 20 mg/m<2>/uke).

Ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse blir en FPT-inhibitor administrert samtidig eller sekvensielt med et kjemoterapeutisk middel og/eller stråling. Det er således ikke nødvendig at f.eks. det kjemoterapeutiske middel og FPT-inhibitoren, eller strålingen og FPT-inhibitoren, bør administreres samtidig eller vesentlig samtidig. Fordelen med en samtidig eller vesentlig samtidig administrering er vel kjent for den dyktige lege.

FPT-inhibitoren og det kjemoterapeutiske middel må generelt ikke administreres i det samme farmasøytiske preparat, og kan på grunn av forskjellige fysiske og kjemiske karakteristika måtte administreres på forskjellige måter. FPT-inhibitoren kan f.eks. administreres oralt for å gi og opp-rettholde gode blodnivåer av inhibitoren, mens det kjemoterapeutiske middel kan administreres intravenøst. Bestemmelsen av administreringsmåten og tilrådeligheten for administrering, hvor mulig, i det samme farmasøytiske preparat ligger godt innenfor kunnskapen til den dyktige kliniker. Den første administrering kan utføres i overensstemmelse med etablerte protokoller kjent i teknikken og deretter, basert på de observerte effekter, kan dosering, administreringsmåter og admini-streringstidspunkter modifiseres av den dyktige kliniker.

Det spesielle valg av FPT-inhibitor og kjemoterapeutisk middel og/eller stråling vil avhenge av diagnosen fra de behandlende leger og deres bedømmelse av pasientens tilstand og den egnede behandlingsprotokoll.

FPT-inhibitoren og det kjemoterapeutiske middel og/eller stråling kan administreres sammen (f.eks. samtidig, vesentlig samtidig eller innen den samme behandlingsprotokoll) eller sekvensielt, avhengig av beskaffenheten av den proliferative sykdom, pasientens tilstand og det aktuelle valg av kjemoterapeutisk middel og/eller stråling som skal administreres i forbindelse med (det vil si innen en enkelt behandlingsprotokoll) FPT-inhibitoren.

Hvis FPT-inhibitoren og det kjemoterapeutiske middel og/eller stråling ikke administreres samtidig eller vesentlig samtidig, så behøver den initielle rekkefølge for administrering av FPT-inhibitoren og det kjemoterapeutiske middel og/eller stråling ikke være viktig. FPT-inhibitoren kan således administreres først, etterfulgt av administrering av det kjemoterapeutiske middel og/eller stråling; eller det kjemoterapeutiske middel og/eller stråling kan administreres først, etterfulgt av administrering av FPT-inhibitoren. Denne alter-native administrering kan gjentas under en enkelt behandlingsprotokoll. Bestemmelsen av administreringsrekkefølgen og antallet repetisjoner av administrering av hvert terapeutisk middel under en behandlingsprotokoll ligger godt innenfor kunnskapen til den dyktige lege, etter evaluering av sykdommen som behandles og pasientens tilstand. Det kjemoterapeutiske middel og/eller stråling kan f.eks. administreres først, spesielt dersom det er et cytotoksisk middel, og behandlingen kan deretter fortsettes med administreringen av FPT-inhibitoren, etterfulgt av, når det bestemmes som fordelaktig, administrering av det kjemoterapeutiske middel og/eller stråling, og så videre, inntil behandlingsprotokollen er full-stendig .

I overensstemmelse med erfaring og kunnskap kan således den praktiserende lege modifisere hver protokoll for administrering av en komponent (terapeutisk middel - det vil si FPT-inhibitor, kjemoterapeutisk middel eller stråling) av behandlingen i overensstemmelse med behovene til den indi-viduelle pasient, når behandlingen fortsetter.

Den behandlende kliniker vil under bedømmelse av hvorvidt behandling er effektiv i den administrerte dose vurdere pasientens generelle velvære, så vel som mer bestemte tegn, slik som lindring av sykdomsrelaterte symptomer, inhibering av tumorvekst, reell innskrumping av tumoren eller inhibering av metastase. Størrelsen av tumoren kan måles ved hjelp av standardmetoder, slik som radiologiske studier, f.eks. CAT- eller MRI-skan, og suksessive målinger kan anvendes for å bedømme hvorvidt veksten av tumoren er blitt retar-dert eller til og med reversert eller ikke. Lindring av sykdomsrelaterte symptomer, slik som smerte, og forbedring av generell tilstand kan også anvendes som en hjelp til bedøm-melse av effektiviteten av behandling.

De følgende er eksempler (eksempler 1-4) på kapselformuleringer for den FPT-inhibitoriske forbindelse:

Eksempler 1 og 2

Kapselformulering

Metode ( eksempler 1 og 2) Fremstilling av fast oppløsning

Krystallinsk FPT-inhibitorisk forbindelse og povidon ble oppløst i metylenklorid. Oppløsningen ble tørket ved anvendelse av en egnet løsningsmiddelspraytørker. Resten ble deretter redusert til fine partikler ved finmaling. Pulveret ble deretter passert gjennom en 30 mesh sikt. Pulveret ble funnet å være amorft ved hjelp av røntgenanalyse.

Den faste oppløsning, silisiumdioksid'<1>' og magnesiumstearat'<2>' ble blandet i en egnet blander i 10 minutter. Blandingen ble komprimert ved anvendelse av et egnet valsekomprimeringsapparat, og oppmalt ved anvendelse av en passende kvern utstyrt med en 30 mesh sikt. Croskarmellose-natrium, Pluronic F68 og silisiumdioksid<<3>) tilsettes til den oppmalte blanding og blandes i ytterligere 10 minutter. En forblanding ble utført med magnesiumstearat(<4>) og like store porsjoner av blandingen. Forblandingen ble tilsatt til resten av blandingen og blandet i 5 minutter. Blandingen ble inn-kapslet i harde gelatinkapsler.

Eksempler 3 og 4

Kapselformulering

Metode ( eksempler 3 og 4) Fremstilling av fast oppløsning

For informasjon av formuleringer kan det også refereres til US-patentsøknader nr. 08/997168 og 60/068387 (innsendt 22. desember 1997), inkorporert heri ved referanse.

Krystallinsk FPT-inhibitorisk forbindelse og povidon ble oppløst i en blanding av metylenklorid og metanol. Opp-løsningen ble tørket ved anvendelse av en egnet løsnings-middelspraytørker. Resten ble deretter redusert til fine partikler ved finmaling. Pulveret ble deretter passert gjennom en 30 mesh sikt. Pulveret ble funnet å være amorft ved hjelp av røntgenanalyse.

Den faste oppløsning, silisiumdioksid'<1>' og magnesiumstearat'<2>' ble blandet i en egnet blander i 10 minutter. Blandingen ble komprimert ved anvendelse av et egnet valsekomprimeringsapparat, og oppmalt ved anvendelse av en passende kvern utstyrt med en 30 mesh sikt. Croskarmellose-natrium, Pluronic F68 og silisiumdioksid(<3>) tilsettes til den oppmalte blanding og blandes i ytterligere 10 minutter. En forblanding ble utført med magnesiumstearat<<4>) og like store porsjoner av blandingen. Forblandingen ble tilsatt til resten av blandingen og blandet i 5 minutter. Blandingen ble inn-kapslet i harde gelatinkapsler.

Claims (8)

1. Anvendelse av FPT-inhibitoren for fremstilling av et medikament for anvendelse samtidig eller sekvensvis med det antineoplastiske middel paklitaxel eller et paklitaxelderivat og/eller bestrålingsterapi ved behandling av proliferativ sykdom hos en pasient med behov for slik behandling.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori angitte antineoplastiske middel er docetaxel.

3. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 2, hvori angitte proliferative sykdom er: lungekreft, pankreatisk kreft, tykktarmskreft, myeloid leukemi, melanom, gliom, tyreoidfollikkelkreft, blærekarsinom, myelodysplastisk syndrom, brystkreft eller prostatakreft.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvori angitte medikament er i en form for samtidig, simultan eller sekvensvis administrering med angitte antineoplastiske middel og/eller bestråling.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvori angitte medikament foreligger i en form for første administrering, eller angitte antineoplastiske middel og/eller bestråling foreligger i en form for første administrering.

6. Anvendelse av FPT-inhibitoren for fremstilling av et medikament for anvendelse samtidig eller sekvensvis med et mikrotubuluspåvirkende middel som er en taxoter, ved behandling av proliferativ sykdom hos en pasient med behov for slik behandling.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvori angitte mikrotubuluspåvirkende middel er paklitaxel eller paklitaxelderivat.

8. Anvendelse ifølge krav 6, hvori angitte proliferative sykdom er: prostatakreft, pankreatisk kreft eller lungekreft.