NO321043B1 - Peptidimmunogene farmasoytiske sammensetninger, en ligand og anvendelse av disse for vaksinasjon og behandling av allergi. - Google Patents
Peptidimmunogene farmasoytiske sammensetninger, en ligand og anvendelse av disse for vaksinasjon og behandling av allergi. Download PDFInfo
- Publication number
- NO321043B1 NO321043B1 NO19983999A NO983999A NO321043B1 NO 321043 B1 NO321043 B1 NO 321043B1 NO 19983999 A NO19983999 A NO 19983999A NO 983999 A NO983999 A NO 983999A NO 321043 B1 NO321043 B1 NO 321043B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- bsw17
- peptide
- ige
- mimotope
- group
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 105
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- 230000007815 allergy Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims description 36
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 title claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 42
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 22
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 21
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 18
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 18
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 4
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 49
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 36
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 28
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 28
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N bissulfosuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)C(S(O)(=O)=O)CC1=O VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 21
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 20
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 18
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 13
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 10
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 10
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 8
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 6
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 6
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 6
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 6
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 5
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 description 5
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229940070741 purified protein derivative of tuberculin Drugs 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 241000244186 Ascaris Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- TXOUDPQJASQYBZ-UHFFFAOYSA-N n,n'-dihexylmethanediimine Chemical compound CCCCCCN=C=NCCCCCC TXOUDPQJASQYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N peptide a Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCCC[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C/C=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C\C1=CC=CC=C1 LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000000333 X-ray scattering Methods 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001956 neutron scattering Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000009121 systemic therapy Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
- C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/528—CH4 domain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
1. Oppfinnelsens felt
Foreliggende oppfinnelse angår immunogene molekyler og er rettet mot hemming av interaksjoner som normalt vil forårsake utløsning av mastceller og basofiler indusert ved cellebundet IgE bundet til et allergen som resulterer i frigiving av farmakologisk aktive mediatorer såvel som de novo syntese av cytokiner involvert i regulering av allergiske og inflammatoriske reaksjoner. De immunogene molekyler omfatter en gruppe av et BSW17 mimotopt peptid. Oppfinnelsen angår også en farmasøytisk sammensetning, en ligand, fremgangsmåte for å fremstille immunogene molekyler og anvendelse av disse.
2. Bakgrunn
Allergiske symptomer blir frembragt ved frigiving av farmakologisk aktive mediatorer, nemlig histaminer, leukotriener og enzymer, fra celler inn i omgivende vev og vaskulære strukturer. Disse mediatorene blir normalt lagret eller blir syntetisert de novo i spesi-elle celler kjent som mastceller og basofiler granulocytter. Mastceller er spredt gjennom animalsk vev mens basofiler sirkulerer i det vaskulære systemet. Disse cellene syntetise-rer og lagrer mediatorer i cellen, hvis ikke en spesialisert sekvens av hendelser opptrer for å utløse dets frigiving.
Rollen av immunoglobulin E (IgE) antistoffer i mediering av allergiske reaksjoner er velkjent. IgE er et kompleks arrangement av polypeptidkjeder som, som i andre immu-noglobuliner består av to lette og to tunge kjeder bundet sammen med disulfidbindinger i en "Y" formet konfigurasjon. Hver lette kjede har to områder, et variabelt (Vl) område bundet til et område som har en relativt invariant aminosyresekvens, kalt et konstant område (Cl). Tunge kjeder derimot, har et variabelt område (Vh) og for IgE, fire kons-tante områder (ChI, Ch2, Ch3, Ch4, også kjent som Csl, Ce2, Ce3, Ce4). De to "arme-ne" av antistoffet som er ansvarlig for antigenbinding, har to regioner hvor polypep-tidstrukturen varierer og er kalt Fab'-fragmenter eller F(ab')2, som representerer to Fab'-armer bundet sammen ved disulfidbindinger. "Halen" eller sentralaksen til antistoffet inneholder en fiksert eller konstant sekvens av peptider og er kalt Fc-fragmentet. Fc-fragmentet inneholder interaktive seter som mulige antistoffer å kommunisere med andre immunsystemmolekyler eller celler ved binding til deres Fc-reseptorer.
Fc-reseptorer er molekyler som binder spesifikt til aktive molekylære seter i immunoglobulin Fc-regioner. Fc-reseptorer kan eksistere som integrerte membranproteiner i en celles ytre plasmamembran eller kan eksistere som fri "oppløselig" molekyler som fritt sirkulerer i blodplasma eller andre kroppsfluider. I det humane systemet, blir høy affinitetsbinding av IgE til reseptorer FceRI gjort ved en kompleks protein-proteininteraksjon som omfatter to forskjellige deler av den tredje tunge kjedens kons-tante regionområde (Ce3) av IgE, og det membranproksimale, immunoglobulinlignende området (a2) av FceRIa-subenheten.
Selv om rester i Cs3-området av IgE tung kjede konstant region, og regioner som hører til a2-området av FceRIa-reseptoren, har blitt identifisert som viktige for bindingen, er den detaljerte mekanismen for bindingsprosessen fremdeles uklar. Eksperimentelle be-viser har blitt fremskaffet ved fluorescensenergioverføringsmålinger så vel som røntgen og nøytronspredning, at humane IgE har en bøyd struktur som er antatt å bidra til den unike høye affiniteten av IgE for FceRI (Kd ~ IO"<10> M). Dessuten, er det postulert at denne bøyde strukturen er ansvarlig for det likemolare komplekset mellom IgE og cellebundet eller oppløselig FceRIct, selv om IgE-molekylet vil gi identiske epitoper på de to Ce3-områdene for reseptorbinding. Denne monovalensen er en funksjonell nødvendig-het dersom reseptorutløsning i fravær av allergen skal unngås (figur 1). Interaktive seter, avhengig av deres funksjon, kan allerede være eksponert og derfor i stand til å binde cellulære reseptorer. Alternativt, kan de være skjult inntil antistoffet binder til antigenet, hvorpå antistoffet kan endre struktur og deretter eksponere aktive seter som kan utløse en spesifikk immunaktivitet. Basert på data oppnådd fra sirkulært dikroismespekteret, har en konformasjonell rearrangering som påvirker Cs3 etter reseptorbinding, blitt fore-slått som en forklaring for 1:1 støkiometrien for Fce/FceRIa-komplekset på celleoverflaten.
W095/14779 beskriver et mutert glykosylert polypeptid som inkluderer en del av en hlgE-Fc-kjede med tilstrekkelig lengde til å binde FceRI- og FceRII-reseptorsetene på humane celler.
WO95/20606 beskriver en vaksinesammensetning som er nyttig for behandling eller forebyggelse av IgE-type I hypersensitivitetsreaksjoner og inflammatoriske immunsyk-dommer, og for modulering av IgE-syntese.
For allergisk (immunologisk) frigiving av histamin innen organismen fra mastceller og basofiler, må et IgE-molekyl låses til eller feste seg med sin Fc-del på det cellulære Fc-reseptorsetet, for derved å binde IgE-molekylet til masecellen eller basofilen. Fag-delene av de cellebundne IgE-molekylene må være tverrbundet ved et spesielt kompati-belt antigen (allergenet). Når en slik interaksjon opptrer, blir mastcellen eller basofilen automatisk utløse for å frigi histamin til det lokale miljø, for å manifestere kjente allergiske symptomer. Andre biokjemiske hendelser følger i en senfasereaksjon, for å resultere de novo syntese og frigiving av cytokiner og andre mediatorer [Ravetch, J.V. og J.P. Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492].
Konvensjonelle tilnærminger til allergibehandling har omfattet systemisk terapi med antihistaminer eller steroider eller forsøk på å desensitisere pasienter; disse tilnærming-ene er ikke rettet mot den viktige IgE-mastcelleÆasofile interaksjonen. Andre tilnærminger har vært opptatt med produksjon av polypeptidkjeder som er i stand til å blokke-re bindingen av IgE-antistoff til Fc-reseptoren på celleoverflaten og erstatte IgE fra bin-dingssetene på hvilke IgE allerede er bundet. Videre, har undersøkelser blitt utført for å definere naturen til et tenkt "effektor" sete IgE Fc-regionen, som har vært antatt å gi et immunologisk signal som utløser mastcelle/basofiler for mediatorfngjving.
Ved anvendelse av rekombinante IgE-fragmenter som immunogener for dannelsen av en beskyttende anti-IgE-vaksine, har dette blitt forsøkt og vist seg effektivt. Hovedargu-mentet mot en slik vaksine skyldes frykten at anvendelse av store IgE-fragmenter for immunisering kan initiere ikke bare produksjonen av inhibitoriske antistoffer, men også generere tverrbinding og derved anafylaktogeniske antistoffer i pasienten (figur 2).
En strategi for å overvinne dette problemet, vil være rettet mot identifiseringen av de minst mulig IgE-fragmentene, som ideelt kun består av selve reseptorbindingssetet, som er begravd i IgE/FceRI-komplekset etter binding og derfor ikke lenger er tilgjengelig for tverrbinding ved den vaksinegenererte immunresponsen. Forsøk på å rekonstruere en slik kompleks molekylær enhet synes ikke å være sansynlig å få til på grunn av den rommenlige avstanden til de forskjellige Ce3-regionene involvert i IgE/FcsRI-interaksjonen.
3. Oppsummering av oppfinnelsen
Det har nå blitt funnet at problemene som er nært bundet med den "klassiske" vaksinetilnærmingen blir overvunnet ved anvendelse av BSW17-mimotoper for aktiv immunisering, enten som kjemisk syntetiserte peptider bundet til passende bærere, eller som rekombinante fusjonskonstrukter (f.eks. med ovalbumin, IgG, osv.).
BSW17 er et monoklonalt antistoff som gjenkjenner en konformasjonell epitop på Fce og minst en del av den ligger innen Ce3. Hybridomacellelinjen som produserer monoklonalt antistoff BSW17, har blitt deponert 19. desember 1996 hos ECACC under Budapest-konvensjonen for deponering av mikroorganismer, under aksesjonsnummer 96121916. Dette antistoffet har en interessant profil av biologiske aktiviteter, som angitt i figur 3. BSW17 eller BSW17-lignende antistoffer som sirkulerer i det vaskulære systemet, beskytter fra allergiske reaksjoner ved a) hemme utløsningen av mastceller og basofiler ved kompetitiv hemming av IgE/IgERI interaksjonen og b) senke serum IgE-nivåene ved nedregulering av IgE-syntesen på B-cellenivå.
BSW17 "mimotope" peptider har nå blitt identifisert ved random peptidfagdisplaybibliotekscreening, dvs. peptider som etterligner minst en del av den komplekse konformasjonelle epitopen på IgE-molekylet. Kjemisk syntetiserte mimotope peptider koblet til et immunogent bæreprotein, kan bli benyttet f.eks. som vaksiner for den spesifikke genereringen av antistoffet i en allergisk vert som hemmer mastcelle/basofil utløsning ved blokkering av IgE/FceRIa-bindingen og/eller IgE-syntese. Som mimotoper for et anti-IgE-antistoff, induserer de en immunrespons som resulterer i produksjon av BSW17-lignende antistoffer i verten. Da BSW17 har blitt vist å være ikke-anafylaktogenisk, inhibitorisk til IgE/FceRI-binding og IgE-syntese på B-celler, har disse antistoffene som fremkommer mot BSW17 mimotop-baserte vaksiner, analoge beskyttende egenskaper. Immunresponsen er meget spesifikt da, i motsetning til den "klassiske vaksinetilnærmingen", ingen IgE-avledede proteinrfagmenter er tilstede, som kunne generere tverrbinding av antistoffer i den immuniserte pasienten (figur 4).
Oppfinnelsen angår således immunogene molekyler, kjennetegnet ved at de omfatter, (a) minst en gruppe av et BSW17 mimotopt peptid med opp til 15 aminosyrer totalt produsert av hybridomcellelinjen med aksesjonsnr. 96121916, som passende kan omfatte ytterligere komponenter for hapten-bærerbinding, for å muliggjøre kobling til komponent (b) eller ytterligere prosessering; eller når det BSW17 mimotope peptidet er cyklisk, kan det ha to ender holdt sammen av to ytterligere cysteinrester som danner en disulfidbro, eller kjemisk tverrbinding; eller når det BSW17 mimotope peptidet er lineært, kan den karboksyterminale aminosyren være blokkert i amidert form og/eller den aminoterminale aminosyren være blokkert i acylert form; eller kan være flankert av en eller to hjelpegrupper
og/eller en ytterligere koblingsgruppe; og
(b) en gruppe som er i stand til å utvikle en immunrespons mot dette peptidet, hvor komponenten (a) er forskjellig fra Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe.
Det BSW17 mimotope peptidet i komponent (a) har ofte opp til og med 15 aminosyrer, det er f.eks. en av sekvensene (A) til (Q) (Seq.id.no. 1 til 17) nedenfor. Imidlertid, kan det være riktig å omfatte ytterligere komponenter for hapten-bærerbinding, f.eks. for å muliggjøre kobling av komponent (b) eller ytterligere prosessering. Således, når BSW17 mimotopt peptid er cyklisk, kan de to endene f.eks. bli holdt sammen av to ytterligere cysteinrester som danner en disulfidbro eller endene kan være kjemisk tverrbundet, f.eks. med lysin; eller når det BSW17 mimotope peptide er lineært, kan den karboksyterminale aminosyren hensiktsmessig være blokkert ved amidering, og/eller den aminoterminale aminosyren kan hensiktsmessig være blokkert ved acylering. Videre, kan de BSW17 mimotope peptidgruppene i komponent (A), f.eks. de foretrukne gruppene (A) til (Q) nedenfor, være flankert i immunogenene ifølge foreliggende oppfinnelse av noen få, fortrinnsvis en eller to, ytterligere hjelpegrupper, slik som acetyl, cystein eller lysin, og/eller en ytterligere koblingsgruppe, slik som DC eller BSS, f.eks. som angitt for de spesifikke immunogenene ifølge oppfinnelsen beskrevet i eksempel 8 herunder som konjugater (2) til (4), (6) til (11), (13) og (14).
Antistoffene utviklet ved immunogenene ifølge oppfinnelsen vil i motsetning til antistoffer produsert ved hybridoma BSW17, være endogene og således kan de i en human pasient bli benyttet for profylaktisk behandling.
De kan bli fremstilt ved passende kobling av komponent (a) og (b) som beskrevet ovenfor.
4. Detaljert forklaring
Immunogenene ifølge oppfinnelsen er f.eks. i form av et polymert peptid eller et rekombinant fusjonsprotein, hvorved en monomer komponent av det polymere peptidet, eller en partner av fusjonsproteinene, utgjør en gruppe av et BSW17 mimotopt peptid (a) og resten av det polymere peptidet eller fusjonsproteinet utgjør den immunresponsutviklende gruppen (b).
De er spesielt i form av et konjugat av minst en BSW17 mimotopt peptidgruppe (a) og en immunogen bærergruppe (b).
Foretrukne BSW17 mimotope peptidgrupper, dvs. komponent (a), av immunogenene ifølge foreliggende oppfinnelse, består hovedsakelig av en aminosyresekvens valgt blant
Mer foretrukket er (A), (D) og (G) ovenfor, spesielt (A) og (D).
Oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske sammensetninger, spesielt vaksiner, omfattende immunogenmolekyler som definert ovenfor og et hjelpestoff.
Den vedrører også en ligand, kjennetegnet ved at den omfatter et antistoffområde som er spesifikt for en gruppe av et BSW17 mimotopt peptid (aksesjonsnr. 96121916) ifølge oppfinnelsen, hvor antistoffområdet er reaktivt også med sekvensen av aminosyrer på den tunge kjeden av IgE som utgjør den naturlige epitopen gjenkjent av BSW17. Slike ligander kan bli generert i pattedyr som polyklonale eller monoklonale antistoffer; de er fortrinnsvis i form av monoklonale antistoffer, fortrinnsvis i form av et Fab' fragment eller F(ab')2-fragment derav.
Den vedrører videre fremgangsmåter for fremstilling av et immunogen ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at den omfatter kobling av (a) en gruppe av BSW17 mimotopt peptid (ak sesjonsnr. 9612916) med et (b) en gruppe som er i stand til å utvikle en immunrespons mot peptidet.
Den vedrører også anvendelse av et immunogent molekyl for fremstilling av en farma-søytisk sammensetning for behandling av IgE-medierte sykdommer.
Den vedrører også anvendelsen av et immunogent molekyl for fremstilling av en farma-søytisk sammensetning i form av en vaksine for behandling av allergi.
Immunogenene ifølge oppfinnelsen er, mens de er hovedsakelig ute av stand til å medie-re ikke-cytolytisk histaminfrigiving, i stand til å utvikle antistoffer med sterk serologisk kryssreaktivitet med målaminosyresekvenser av Fc-regionen av IgE. De er også nyttige i, eller som, vaksiner.
Den initielle dosen av immunogen (f.eks. fra omkring 0,2 mg til omkring 5 mg, spesielt omkring 1 mg) blir f.eks. adrninistrert intramuskulært fulgt av gjentatte (booster) doser av det samme 14 til 28 dager senere. Doser vil naturligvis avhenge til en viss grad av alder, vekt og generell helse til pasienten. Immunisering kan være "aktiv" eller "passiv".
I "aktiv" immunisering mottar pasienten immunogener ifølge oppfinnelsen og derved blir en anti-hlgE-respons aktivt indusert i pasientens immunsystem.
"Passiv" immunisering blir oppnådd ved administrering av anti-BSW17 mimotope antistoffer, enten polyklonal eller monoklonal, til en pasient som lider av IgE-mediert syk-dom, fortrinnsvis ved injeksjon.
Polyklonal anti-BSW17 mimotope antistoffer kan bli fremstilt ved administrering av immunogener ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis ved anvendelse av et hjelpestoff, til et ikke-humant pattedyr og oppsamling av det resulterende antiserumet. Forbedrede titere kan bli oppnådd ved gjentatte injeksjoner over en tidsperiode. Det er ingen spesiell be-grensning på pattedyrarten som kan bli benyttet for utvikling av antistoffer; det er generelt foretrukket å benyttet kaniner eller marsvin, men hester, katter, hunder, geiter, svin, rotter, kyr, sauer osv., kan også bli benyttet. I produksjonen av antistoffer, blir en endelig mengde immunogen ifølge oppfinnelsen, f.eks. fortynnet med fysiologisk saltvanns-oppløsning til en passende konsentrasjon og den resulterende fortynnde oppløsningen blir blandet med komplett Freund's adjuvant for å fremstille en suspensjon. Suspensjonen blir administrert til et pattedyr, f.eks. intrapeirtonealt, f.eks. til en kanin, ved anvendelse av omkring 50 ug, til omkring 2500 ug immunogen ifølge oppfinnelsen pr. admi-nistrasjon. Suspensjonen blir fortrinnsvis administrert omkring hverannen uke over en periode på opp til omkring 2 til 3 måneder, fortrinnsvis omkring 1 måned, for å gi immunisering. Antistoff blir gjenvunnet ved oppsamling av blod fra immuniserte dyr etter at det har gått 1 til 2 uker etter den siste administrasjonen, sentrifugering av blodet og isolering av serum fra blodet.
Monoklonale anti-BSW17 mimotope antistoffer kan f.eks. være humane eller murine. Fortrinnsvis, vil pasienten bli behandlet med et Fab'-fragmentpreparat fra et murint monoklonalt antistoff eller et chimert humant-mus-antistoff (omfattende human Fc-region og mus-Fab'-region) for å minimalisere eventuelle negative reaksjoner for immunoglo-bulinet fra et fremmed dyr. Murine monoklonale antistoffer kan bli preparert ved fremgangsmåten ifølge Kohler og Milstein (Kohler, G. og Milstein, C, Nature 256
[1975]495), f.eks. ved fusjon av miltceller av hyperimmuniserte mus med en passende musmyelomacellelinje. Tallrike metoder kan bli benyttet for å gi humane monoklonale antistoffer, inkludert produksjon av: (1) Epstein-Barr virus (EBV)-transformerte B-celler; (2) cellelinje for B-lymfocytthybridisering; (3) human-murin hybridomas; (4) human-human hybridomas;
(5) human x human-mus heterohybridomas; og
(6) repertoarkloning (fagdisplay).
Human x human-mus heterohybridomas er mest foretrukket og omfatter kombinering av favoriserbare karakteristikker av både humane og murine parenterale celletyper. Human-mus heterohybridomacellelinjer har blitt gjort passende for B-cellefusjonen (Teng, N.N.M. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80 [1983] 7308).
Når anvendt for immunisering, kan antistoffer bli innført i verten greiest ved intra-muskulær injeksjon. En hvilken som helst konvensjonell flytende eller fast bærer kan bli benyttet dersom den er akseptabel for verten og ikke har noen negative effekter på verten eller negative effekter på vaksinen. Fosfatbuffret saltvann (PBS ved en fysiologisk pH, f.eks. omkring pH 6,8 til 7,2, fortrinnsvis omkring 7,0, kan bli benyttet som en bærer, alene eller sammen med en passende bærer, slik som en aluminiumhydroksydbasert adjuvant. Konsentrasjonen av immunogent antigen kan variere fra omkring 50 ug til omkring 500 ug, fortrinnsvis fra omkring 200 ug til omkring 300 ug pr. injeksjon, i et volum av oppløsningsmiddel som generelt er fra omkring 0,25 ml til omkring 1 ml, fortrinnsvis omkring 0,5 ml. Multiple injeksjoner vil være krevet etter initiell injeksjon og kan bli gitt f.eks. ved årlige intervaller.
Med hensyn på "aktiv immunisering" er dette foretrukket for human anvendelse, men andre mammalske arter kan bli behandlet tilsvarende ved anvendelse av analoge rnimo-toper tilsvarende til IgE fra disse artene, f.eks. hos hund. Uttrykket "immunogen bærer" heri omfatter materialer som har egenskapen til uavhengig å fremkalle en immunogen respons i et vertsdyr og som kan bli kovalent bundet til polypeptid enten direkte via dannelse av peptid eller esterbindinger mellom frie karboksyl-, amino- eller hydroksyl-grupper i polypeptidet og tilsvarende grupper på det immunogene bærematerialet, eller alternativt binde gjennom en konvensjonell bifunksjonell sammenbindende gruppe, eller som et fusjonsprotein.
Eksempler på slike bærere omfatter albuminer slik som BSA; globuliner; tyroglobuliner; hemoglobuliner; hemocyaniner (spesielt Keyhole Limpet Hemocyanin [KLH]); protei-ner ekstrahert fra ascaris, f.eks. ascarisekstrakter slik som de beskrevet i J. Immun. 111
[1973] 260-268, J. Immun. 122 [1979] 302-308, J. Immun. 98 [1967] 893-900, og Am. J. Physiol. 199 [1960] 575-578 eller rensede produkter derav; polylysin; polyglutamin-syre; lysin-glutaminsyrekopolymerer; kopolymerer inneholdende lysin eller ornitin osv. Nylig har det blitt produsert vaksiner ved anvendelse av difteria toksoid eller tetanus toksoid som immunogene bærematerialer (Lepow M.L. et al., J. of Infectious Deseases 150 [1984] 402-406; Coen Beuvery, E. et al., frifection and Immunity 40 [1983] 39-45) og disse toksoidmaterialene kan også bli benyttet i foreliggende oppfinnelse. Det rensede proteinderivatet av tuberkulin (PPD) er spesielt foretrukket for anvendelse i det "aktive" immuniseringsskjemaet (1) som ikke induserer en T-cellerespons i seg selv (dvs. den er i effekt et "T-cellehapten"), og oppfører seg likevel som et fullt prosessert antigen og blir gjenkjent av T-celler som sådan; (2) den er kjent å være en av de mest kraftige hapten "bæreren" i den linkede gjenkjenningsmodus; og (3) den kan bli benyttet hos mennesker uten ytterligere testing.
Som haptenbærerbindende midler, kan de konvensjonelt benyttet i fremstilling av anti-gener bli benyttet, f.eks. de som angitt ovenfor, eller i eksemplene nedenfor.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for kovalent kobling av komponent (a) til gruppe (b) kan bli gjort på en kjent måte. Således er f.eks. direkte kovalent kobling foretrukket ved anvendelse av bis-N-suksimidylderivater, mer foretrukket bis(sulfosuksinimidyl)suberat (BSS) som koblingsmiddel. Glutaraldehyd eller karbodiimid, mer foretrukket dycykloheksyl-karbodiimid (DC) eller l-etyl-3-83-dimetylarninopropyl)karbodiimid kan også bli benyttet for kovalent kobling av peptid (a) til immunogent bæremateriale (b).
Mengden av hapten og haptenbæremiddel [dvs. komponent (a)] og bærer [dvs. komponent (b)] kan lett bli funnet på konvensjonell måte. Det er foretrukket at bæreren blir benyttet i en mengde på omkring 1 til 6 ganger, fortrinnsvis 1 til omkring 5 ganger vek-ten av haptenet og at hapten-bæremateriale kan bli benyttet i mengder fra omkring 5 til omkring 10 ganger molar ekvivlaneten av hapten. Etter reaksjon, blir bæreren bundet til haptenet via hapen-bærebindende middel for å oppnå det ønskede antigen sammensatt av et peptid-bærekompleks. Det resulterende immunogenet ifølge oppfinnelsen kan lett bli isolert på konvensjonell måte, f.eks. ved dialyse, gelfiltrering, fraksjoneringsutfelling osv.
Fremstilling av startmaterialene kan bli utført på konvensjonell måte. Passende peptider for anvendelse som komponent (a) kan f.eks. bli identifisert ved screening av randomiserte peptidfagdisplaybiblioteker og lett bli syntetisert f.eks. ved konvensjonell fastfase-prosedyre, f.eks. for cykliske peptider, eller ved fastfaseprosedyrer ved anvendelse av velkjent "F-moc" prosedyre, eller alternativt bli identifisert ved anvendelse av en pepti-domimetisk strategi ved screening av randomiserte syntetiserte peptider.
Forklaring for figurene;
Figur 1: Interaksjon mellom IgE og dets høyaffinitetsreseptor IgERI
Figur 2: "Klassisk" anti-IgE-vaksinetilnærming
Figur 3: Biologisk aktivitetsprofil for BSW17
Figur 4: BSW17 mimotopbasert immunoterapi
Figur 5; Fag-displayed BSW17 mimotoper som spesifikt gjenkjenner BSW17 Figur 6; Fag-displayed BSW17 mimotoper som hemmer IgE/BSWl7-binding Figur 7: Binding av et kjemisk syntetisert BSW17 mimotopt peptid til BSW17 Figur 8a: Gjenkjenning av cyklisk BSW17 mimotop GEFCINHRGYWVCGDPA - KLH (BSS) konjugat (SDS 236) og Fes (500-509) - KLH (BSS) konjugat (SDS 237)avBSW17 Figur 8b: Gjenkjenning av forskjellige BSW17 mimotope konjugater av BSW17 Figur 9a: Spesifikk gjenkjenning av BSW17 mimotope konjugater [BSA (DC)] og Fce (500-509) konjugat [KLH (glutaraldehyd)] av BSW17 Figur 9b: Spesifikk gjenkjenning av BSW17 mimotope konjugater [KLH (DC);
Lys]avBSW17
Figur 10a: Anti-human IgE-immun respons indusert i kaniner etter immunisering
med BSW17 mimotope konjugater (1)
Figur 10b: Anti-human IgE-immun respons indusert i kaniner etter immunisering
med BSW17 mimotope konjugater (2)
Figur 11: Serumtitere av anti BSW17 mimotope antistoffer generert i kaniner ved
immunisering
Figur 12: Isotyp spesifisitet av anti-human IgE-responsen i BSW17 mimotop im
muniserte kaniner Figur 13: Sammensetning av anti-BSWl 7 mimotopt serum med BSW17 for IgE-
binding Figur 14: Binding av affinitetsrenset anti-BSWl 7 mimotopt antistoff overfor hlgE Figur 15: Test av kanin anti-BSWl7 mimotopt sera og affinitetsrenset anti-BSWl7
mimotopt antistoff for anafylaktogenisitet på humane blodceller:
- R2/0, R4/0: preimmun sera fra kaniner R2 og R4 før BSW17 mimotop vaksinering; - R2/SDS214, R4/SDS213: sera av kaniner R2 og R4 65 dager etter primærimmunise-ring; - antiSDS213, antiSDS214: affinitetsrenset anti-BSWl 7 mimotope antistoffer; - R2/0 PC, R4/0 PC: positiv triggingkontroll (PC) i nærvær av kaninserum.
Prøvekonsentrasj oner:
A = 0,1 ug anti-BSWl7 mimotope antistoffer (eller ekvivalenter i komplett kaninserum) pr. ml.
B = 1,0 jag anti-BSWl 7 mimotope antistoffer (eller ekvivalenter i komplett kaninserum) pr. ml.
C = 5,0 ug anti-BSWl7 mimotope antistoffer (eller ekvivalenter i komplett kaninserum) pr. ml.
Forkortelser:
Ac acetyl
AMS ammoniumsulfat
BSA bovint serumalbumin
BSS bis(sulfosuksinimidyl)suberat
BSW17 et IgG-monoklonalt antistoff rettet mot CH3 epitopen av nativt IgE (J. Knutti-Muller et al., Allergy 41 [1986] 457-
465; S. Miescher et al., Int. Arch.Allergy Immimol. 105
[1994] 75)
BSW 17 mimotopt peptid et peptid som etterligner den naturlige epitopen på humant IgE gjenkjent ved det monoklonale anti-humane IgE-antistoffetBSW17
cfu kolonidannende enheter
DC diheksylkarbodiimide
EBV Epstein-Barr-virus
ELISA enzym-bundet immunosorbentanalyse
FceRI høyaffinitetsreseptor I for konstant region p IgE
FCS fetalt kalveserum
gam geit anti-mus
gar geit anti-kanin
h human
HEPES N-2-hydroksyetylpiperazin-N' -2-etansulfonsyre
HRP horse raddish peroxidase (=POX
HSA humant serumalbumin
IgE immunoglobulin E
IPTG isopropyl-fi-D-tiogalaktosid
KLH keyhole limpet hemocyanin
Le27 et monoklonalt anti-humant IgE-antistoff (Allergy, [1986],
supra; Int. Arch. Allergy Immunol. [1984] supra) Lb-plater Luria-Bertani mediumplater
mimotopt peptid et peptid som etterligner minst deler av den konformasjonelle epitopen av et antistoffmolekyl
pbs fosfatbuffret saltvann
PEG polyetylenglykol
POX horse radish peroxidase (=HRP)
PPD renset proteinderivat av turberkulin
rh IL-3 rekombinant humant interleukin 3
RIA plater radioimmunanalyseplater
RPMI1640 standard cellekulturmedium (Sigma, St. Louis, USA) SB-medium Natrium - Bactomedium (Pharmacia, Uppsala, Sverige) sLt oppløselig leukotrien
TBS tris-buffret saltvann
VCS VCS Ml3 helperfag (Stratagene, USA).
5. Eksempler
I de følgende eksemplene som illustrerer oppfinnelsen, men på noen måte begrenser dets ramme, er temperaturer angitt i grader Celsius.
Eksempel 1: Anti- allergisk potensiale for anti- hlgE monoklonalt antistoff BSW17
Som en modell for testing av antiallergisk kapasitet til BSW17 og BSW17-lignende antistoffer generert i humane pasienter ved aktiv immunisering med BSW17 mimotope peptider, er effekten av BSW17 på histaminfrigiving av humane basofillignende celler, anskaffet fra benmargsceller dyrket med rhIL-3, vist.
Mononukleære celler ble preparert fra benmarg fra pasienter som hadde behov for femur benhodeerstatning, ved Ficoll-Hypaque densitetssedimentering (1,077 g/ml; 400 g). 5xl0<5>/ml blir dyrket i RPMI1640 medium inneholdende 15% FCS og 2 ng/ml human rML-3. Etter 6 dagers dyrking ved 37°C i 5% CO2, ble et likt volum medium inneholdende rhIL-3 tilsatt. På dag 12 ble cellene høstet og benyttet for passiv sensitisering og histaminfrigivingsanalyse. Omkring 5 x 10<5> dyrkede benmargsceller blir inkubert i HA-buffer (20 mM HEPES; pH = 7,4; 0,3 mg/ml HSA) med 500 ng/ml humant IgE i nærvær eller fravær av en 50 ganger overskudd av monoklonalt anti-IgE-antistoff i et totalvolum på 1 ml. Etter inkubering i 2 timer ved 37°C ble cellesupernatanter benyttet for å måle histamin under passiv sensitiering. Cellepellets ble benyttet for å utløse histaminfrigiving. For å bestemme graden av direkte histaminrfigiving, ble passivt sentisierte benmargsceller resuspendert i 0,3 ml HCM buffer (HA-buffer inneholdende 0,6 M CaCh og 1 mM MgCh og inkubert med 0,1 ng/ml anafylaktogenisk monoklonalt anti-IgE-antistoff Le27. Mengden histamin i supernatanten og i det cellulære sedimentet ble målt i en Technicon Autoanalyzer II (Technicon, Tarrytown, New York, USA). Prosent histaminfrigiving ble beregnet [ifølge formelen: histaminfrigiving (%) = histamin i supernatanten delt på histamin i supernatanten + histamin i cellepelleten, multiplisert med 100]. Prosent histaminrfigiving under passiv sensitisering ble beregnet ifølge formelen: histaminfrigiving (%) = histamin i supernatanten (etter passiv sensitisering) dividert med histamin i supernatanten (etter trigging) + histamin i supernatanten (etter sensitisering) + histamin cellepelleten, multiplisert med 100]. Anti-IgE-antistoff spesifik histaminfrigiving ble beregnet [ifølge formelen: spesifikk histaminrfigiving (%) = % total histaminrfigiving minus % spontan histaminrfigiving].
Resultatene i tre uavhengige eksperimenter er oppsummert i tabell 1:
Data i tabell 1 viser klart at benmargsceller inkubert med IgE og BSW17 ikke frigir histamin under sensitiseringen, men hemmer påfølgende triggjng med Le27. Benmargsceller inkubert med IgE og Le27 ble trigget allerede under passiv sensitiering til en grad at intet histamin kan bli frigitt under den andre inkubsjonen med dette anafylaktogene monoklonale antistoffet. Benmargsceller passivit sentisiert i fravær av enten monoklonalt anti-IgE-antistoff, frigir imidlertid effektivt histamin etter påfølgende trigging med Le27.
Det kan bli konkludert at a) BSW17 i seg selv er ikke-anafylaktogenisk og b) BSW17 beskytter humane basofiler fra histaminfrigiving indusert ved utløsende midler. Derfor, kan generering av BSW17-lignende antistoffer i allergiske pasienter ved aktiv immunisering med BSW17 mimotope peptider bli forventet å beskytte immuniserte verter fra utvikling av allergiske reaksjoner.
Eksempel 2: Randomiserte peptidfagdisplaybibliotekscreening og seleksjon av
positive kloner
Bakteriofagpartikler spesifikt gjenkjent av BSW17 blir identifisert ved biopanning av fagbiblioteker som viste lineære eller sirkulære randomiserte peptider med fra 6 til 15 aminosyreresters lengde sammensmeltet med fagpeptid hhv. pIH og pVHI. For amplifi-sering av fagbiblioteker ble 2 ml flytende kultur av E. coli XL-I blue dyrket i SB-medium til OD600 = 1,0 inkubert med 10<10> fag i 15 minutter ved romtemperatur. 10 ml SB-medium inneholdende 10 mg/ml tetracyklin og 20 ng/ml karbenicillin ble tilsatt og hhv. 10 ni, 1 ni og 0,1 ni ble utsådd på LB-plater inneholdende 100 ng/ml karbenicillin. Kulturen ble inkubert ved 37°C ved kraftig risting i 1 time, så ble 100 ml SB inneholdende 10 ng/ml tetracyklin og 50 ng/ml karbenicillin tilsatt og inkuberingen ble fortsatt i 1 time. IO<12> cfu av VCS M13 helperfag ble tilsatt. Etter to timer ved kraftig risting ved 37°C ble kanamycin tilsatt den endelige konsentrasjonen på 70 ng/ml og inkubering fortsatte over natten. Etter sentrifugering ved 4000 g og 4°C i 20 minutter, ble superna-tanter blandet med 38 ml av en iskald sterilfiltrert oppløsning av 12% NaCl og 16% PEG 8000, avkjølt på is i 30 minutter og sentrifugert i 30 minutter ved 10000 g ved 4°. Fagpelleten ble oppløst i 2 ml TBS inneholdende 1,5% kasein og lagret ved 4°. For biopanning ble Costar RIA plater, (Costar 3690) belagt over natten ved 4° med 20 ng/ml av BSW17 i 0,1M karbonatbuffer, pH 9,6, og deretter blokkert med TBS inneholdende 1,5% kasein. 2 x 10<11> cfu fag ble tilsatt og inkubert ved 37°C i 2 timer, så vasket 10 ganger med PBS/0,1% Tween 20. Brønnene ble renset med vann og de bundne fag eluert med totalt 200 ni 0,1 M HC1, pH 2,2 i 10 minutter. Eluerte fag ble nøytralisert med 2M Tris base og amplifisert som beskrevet ovenfor.
For seleksjon av positive kloner ble 50 ni av en E.coli XL-1 blue flytende kultur dyrket i SB-medium til OD600 = 1,0, inkubert med 1 ni av en 10"<8> fortynning av amplifiserte fag etter den 3. gjennomkjøring av panning i 15 minutter ved romtemperautr, så utsådd på LB-plater inneholdende 100 ng/ml karbenicillin og dyrket over natten. Kolonier ble tilfeldig plukket ut og utsådd på LB-plater inneholdende 100 ng/ml karbenicillin. Etter 4 timer ved 37° ble nitrocellulosefilter dynket med 10 mM IPTG satt på toppen og inkuberingen fortsatte over natten 32°. Filteret ble fjernet og inkubert ved 37° i 30 minutter i en CHCh-atmosfære. Bakterielle rester ble fjernet ved inkubering av filterene i 50 mM Tris, pH 8,150 mM NaCl, 5 mM MgCl2,3% BSA, 100 U DNAasel og 40 mg lysozym pr. 100 ml i 1 time, blokkert i TBS inneholdende 1,5% kasein og inkubert over natten med BSW17-POX (BSW17 koblet til POX i TBS inneholdende 1,5% kasein. Filteret ble vasket med TBS, TBS/0,5% Tween 20 og så TBS i 10 minutter hver. For farging ble stripene inkubert i 600 ng 4-klor-l-naftol pr. ml og 0,042% hydrogenperoksyd i TBS.
Eksempel 3: Karakterisering av fagpartikler som viste peptider som etterligner
naturlige BSW17 epitop ( BSW17 mimotope peptider)
Forskjellige fagpartikler som hadde sirkulære peptider inneholdende syv, åtte eller ni
aminosyrer og lineære peptider bestående av ti og femten aminosyrerester hhv., ble funnet å binde til BSW17. Den nukleotide sekvensen til DNA som koder for disse peptidene ble bestemt. Ifølge deres homologi mellom hverandre såvel som de homologe regionene i Fce, kunne 3 grupper fag som viste peptider gjenkjent av BSW17, bli avledet fra DNA-sekvensen. En oversikt er vist i tabell 2:
Som det kan sees fra tabell 2, er de karboksyterminale delene av peptidene fra gruppe A sterkt konserverte og de aminoterminale delene, selv om mer degenererte, inneholder positivt ladde, polare aminosyrer. Denne ladningsdistribusjonen synes å være essensiell for BSW17-gjenkjenning, da en klone som er forskjellig i aminoterminalen fra denne egenskaper viser kun meget binding til BSW17. Ingen etterfølgende sfrekning av aminosyrer med signifikant sekvenshomologi kan bli funnet i Fce. Innretning etter mønsterlik-het tillater imidlertid alllokering av disse peptidene til en strekning av aminosyrer i området fra posisjon 500 til 508 i Ce4-domen. Dekapeptidet Fce 500-509 har blitt postulert av Stanworth et al. [Lancet 336 (1990) 1279] å være involvert i mastcelleutløsningen av reseptorbundet IgE.
Peptider tilhørende gruppe B er også sterkt homologe seg imellom. Videre, er deres aminoterminale del nesten identisk med aminosyreposisjonene 370-375 av Fce. Denne sekvensen er del av Ce3 og inneholder eller er naboliggenede til en region som er blitt vist å være involvert i bindingen av IgE til dets høyaffinitetsreseptor. Dette funnet for-klarer hemmingen av IgE/IgERI interaksjon ved BSW17.
Det kan bli konkluert at den komplekse konformasjonelle epitopen gjenkjent av BSW17 inneholder konformasjonelle strukturer representert ved aminosyrestrekningene 500-508 (uten Ce4) og 370-375 (uten Ce3) i IgE-molekylet (nummerering ifølge E.A. Padlan og D.R. Davies, Molecul. Immunol. 23 (1986) 1063). Antistoffer generert i et individ ved immunisering med mimotoper fra gruppe A og B ovenfor koblet til et immunogent bæ-remolekyl, vil således beskytte fra allergiske reaksjoner ved blokkering av bindingen av IgE til dets affinitetsreseptor og/eller utløsing av degranulering av målceller.
Peptider oppsummert i gruppe C i tabellen viser ingen signifikante homologier mellom seg eller med Fce. Derfor, representerer de "genuine mimotope" som etterligner den tredimensjonale strukturen gjenkjent av BSW17. Anvendelsen av disse mimotopene som immunogener vil således resultere i dannelsen av anti-allergiske, BSW17 lignende antistoffer i den immuniserte vert.
Genereringen av en BSW17-lignende immunrespons er spesifikt rettet mot BSW17-epitopen på human IgE er vist for valgte mimotoper i de følgende eksemplene 4 til 6: Eksempel 4: Bakteriofager som viser BSW17 mimotope peptider blir spesifikt
gjenkjent av BSW17
Binding av mimotope peptider fremvist av fagpartikler (gruppe A i tabell 2: første klone = klone 1 i figur 5 = Cys-Arg-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys=Seq.id.nr. 18; andre klone = klone 18 i figur 5 = Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys = Seq.id.nr. 19) til de antigenspesifikke hypervariable regionene av BSW17, blir vist ved ELISA. 10 fig BSW17 og forskjellige monoklonale antistoffer blir belagt på brønner av COSTAR-plater ifølge standard ELISA-prosedyrer. Etter blokkering med BSA, blir brønnene inkubert med 100 ul standard ELISA-inkuberingsbuffer inneholdende bakteriofagpartikler fremskaffet fra faginfiserte bakterielle kultursupernatanter med en fagtiter på IO<9> cfu/ml. Etter vasking blir platene inkubert med 5 ug hestereddikperoksydase
(HRP) - koblet anti-M13-antiserum (Pharmacia, Uppsala, Sverige) i en inkuberingsbuffer. Alle inkuberingene ble utført ved romtemperatur i 1 time. Etter endelig vasking blir fagpartikler bundet til belagte antistoffer visualisert via det bundne HRP-anti Ml 3 se-rumet ved kromogen substratutvikling fulgt av standard ELIS A-prosedyre. Figur 5 viser at mimotope fag meget spesifikt binder til BSW17 og ikke til andre antistoffer, slik som 8E7, 3G9 og 5H10 som også er monoklonale anti-Ce3 antistoffer og som har blitt generert ved anvendelse av rekombinant Ce3 som et immunogen, eller til 5H5/F8 som representerer et annet antiklonalt antistoff som er rettet mot den ekstracellulære delen av human FcsRIa. Som negativ antistoffkontroll ble rekombinant FceRIcc-kjede og som positiv kontroll, var brønner belagt med monoklonalt anti-M13 antiserum inkludert.
Eksempel 5: Bakteriofager som fremviser BSW17 mimotope peptider hemmer
kompetivt bindingen av BSW17 til IgE
Spesifisiteten til mimotopen BSW17-interaksjonen blir videre demonstrert ved å vise at festingen av mimotope fremvisende fagpartikler forstyrrer BSW17/IgE-bindingen. Bakterielle celler blir dyrket i SB inneholdende 10 ug/ml tetracyklin og 50 ng/ml karbenicillin til OD600 = 0,4, så blir VCS Ml3 hjelpefag tilsatt og inkuberingen fortsatte i 2 timer ved 37°C. Så ble kanamycin tilsatt til den endelige konsentrasjonen på 70 ng/ml og in-kubasjonen fortsatte over natten. Fagpartikler blir utfelt med polyetylenglykol. Myke RIA-plater blir belagt med 20 ng/ml BSW17 i 0,1M karbonatbuffer pH 9,6 og blokkert med TBS inneholdende 1,5% kasein. Humant IgE er <125>I-merket ved kloramin-T-metoden og 100 000 cpm pr. brønn blir benyttet for bindingen av BSW17 belagt på RIA-platene i nærvær av økende konsentrasjoner av ikke-merket IgE (standardkurve) eller fagpartikler. Alle eksperimentene blir utført ved romtemperatur og platene blir vasket tre ganger med 0,9% NaCl og 0,05% Tween 20, skåret i biter og hver brønn ble målt i en y-teller i 1 minutt.
Mimotope fag (PhBSW.6-9 i figur 6 = klone 1 i figur 5 = CRRHNYGFWVC = Seq.id.nr. 18; PhBSW.29-8 i figur 6 = klone 18 i figur 5 = CINHRGYWVC = Seq.id.nr. 19) (se eksempel 4 ovenfor) som viser binding av BSW17 til IgE. Figur 6 viser binding av <125>I-<m>erkede IgE til BSW17 i nærvær av BSW17 mimotopfremvisende fagkloner. Lukkede sirkler viser standard inhiberingskurve med umerket IgE for å tillate en estime-ring av inhibering av merkede IgE som binder i nærvær av 10<11> cfu/ml fagpartikler. In-hiberingen oppnådd med fagklonene er lik ikke-merkede IgE-konsentrasjoner på hhv. 1 Hg/ml og 1,7 ng/ml.
Eksempel 6: Induksjon av en epitopspesifikk immunreaksjon ved immunisering
av kaniner med mimotopfremvisende fagkloner
For å teste anvendeligheten av en BSW17 mimotopbasert vaksinetilnærming, ble kaniner immunisert med fagpartikler fremvisende BSW17 mimotope peptider og hjelpefag VCS Ml3 som kontroll. IO<12> cfu av fersk preparerte fagpartikler ble dialysert mot PBS ved 4°. 1 ml blir emulgert med fullstendig Freund's adjuvant for den første immuniseringen, eller med 1 ml ufullstendig Freund's adjuvant for boosting. Immunisering ble gjentatt subkutant hver 14. dag. Etter den tredje boost, ble 12 ml blod tatt, levret i 4 timer ved romtemperatur i glass og sentrifugert i 10 minutter ved 2000 g. Supernatantene ble testete for nærvær av anti-humant IgE-antistoff ved ELISA. Humant IgE fra tre forskjellige individer (SUSI 1-IgE; PS-IgE; WT-IgE) blir fortynnet i PBS ved en konsentrasjon på 50 ng/ml og 1 ni prøver ble avsatt på nitrocellulose. Nitrocellulosen ble blokkert i TBS inneholdende 1,5% kasein i 1 time. Kaninserum ble fortynnet 1:200 i TBS inneholdende 1,5% kasein og inkubert over natten. Vasking ble utført i TBS, TBS-0,05% Tween 20 og TBS i 10 minutter hver. Geite-anti kanin-HRP for fremkalling ble fortynnet 1:1000 i TBS inneholdende 1,5% kasein inkubert i 4 timer. Vasking og farging ble utført som beskrevet. Som vist i tabell 3, viste kontrollkaniner immunisert med VCS Ml 3 fag, såvel som ikke-immuniserte kaniner en svak reaksjon mot humant IgE i deres sera, noe som sansynligvis reflekterer naturlig tilstedeværende anti-kanin IgE-antistoffer som kryssreagerer med humant IgE. Imidlertid, i tillegg til en massiv immunrespons overfor bakteriofag pVm kappeprotein, inneholder sera av kaniner immunisert med BSW17 mimotope fag også sterkt forhøyede nivåer av antistoffer med spesifikt gjenkjent humant IgE:
BSW17 epitopspesifisitet til disse antisera kan bli demonstrert i konkurranse ELISA: nitrocellulosestrips blir preparert som beskrevet ovenfor og inkubert med kaninserum i en fortynning på 1:50 i TBS inneholdende 1,5% kasein over natten. Etter vasking blir mAb BSW17 merket med hestereddikperoksydase (BSW17-HRP) tilsatt i en 1:50000 fortynning i TBS inneholdende 1,5% kasein i 4 timer. Påfølgende vasking og farging blir utført som beskrevet. Som det kan sees i tabell 4, blir bindingen av BSW17-HRP til IgE-preparater fra forskjellige kilder hemmet ved sera fra kaninene immunisert med BSW17 mimotope fag, mens serum fra kaniner immunisert med hjelpefag ikke viser noen inhibitorisk effekt:
I de følgende eksemplene 7 og 8 blir anvendeligheten ved anvendelsen av kjemisk syntetiserte mimotope peptider koblet til bærerprotein som immunogen for fremstilling av en anti-allergivaksine vist: Eksempel 7: Kjemisk syntetisert BSW17 mimotopt peptid som binder til BSW17
med høv affinitet
For å bekrefte at den bakeriofagavledede delen av BSW17 mimotope fag kan bli utlatt uten å ødelegge den biologiske aktiviteten til den mimotope peptidsekvensen, blir de
følgende peptidene kjemisk syntetisert, omfattende cyklisk BSW17 mimotopt oktapep-tid (A) [vist i lineær form i tabell 2, gruppe A, andre klone som peptid (A) med to ytterligere Cys (Seq.id.nr. 19) og inneholdende her de 7 ytterligere naboliggende bakteriofagavledede aminosyrerestene Gly-Glu-Phe- og -Gly-Asp-Pro-Ala som flankerende sek-venser inkludert for å lette korrekt folding av det sirkulære mimotope peptidet]:
Etter syntese ved standardteknikker ble dette peptidet syklisert via de to cysteinene og fluorescensmerket med Rhodol Green. Binding for å øke konsentrasjoner av BSW17 immobilisert i mikrotiterplatebrønner under ELIS A-betingelser blir bestemt ved fluore-scensmåling og er vist i figur 7.
Eksempel 8: Kjemisk syntetiserte BSW17 mimotope peptider koblet til et bæreprotein blir spesifikt gjenkjent av BSW17
Forskjellige mimotope peptider blir kjemisk syntetisert og koblet til immunogene bære-proteiner. Koblingsreaksjonen blir utført ved et 1:1 masseforhold av peptid og bæreprotein ifølge standard prosedyrer (Shan S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press [1993]). Konjugater fremstilt fra de følgende koblingsvarian-tene ble fremstilt:
- glutaraldehydkobling
- DC (diheksylkarbodiimid)kobling
- BSS [bis(sulfosuksinimidyl)suberat]kobling
- lysinkryssbinding
De resulterende mimotopkonjugatene er:
(1) Pl = lineær KTKGSGFFVF - BSA (glutaraldehyd)
(2) P4 = lineær AcINHRGYWVC - BSA (DC)
(3) P5 = lineær AcRSRSGGYWLWC - BSA (DC)
(4) SAF 1-KLH = cyklisk GEFCINHRGYWVCGDPA - KLH (DC)
(5) SAF2-KLH = lineær KTKGSGFFVF - KLH (DC)
(6) SAF3-KLH = lineær VNLPWSFGLE - KLH (DC)
(7) SAF3-Lys = lineær VNLPWSFGLE - lysinkryssbinding
(8) SAF4-KLH = lineær VNLTWSRASG-KLH (DC)
(9) SAF5-KLH = lineær VNLTWSRASG - KLH (DC)
(10) SDS214 = cyklisk GEFCRRHNYGFWVCGDPA - KLH (BSS)
(11) SDS213, SDS227, SDS236, SDS252 = cyklisk GEFCINHRGYWVCGDPA -
KLH (BSS)
(12) SDS237, SDS253 = lineær KTKGSGFFVF - KLH (BSS)
(13) SDS242, SDS254 = lineær VNLPWSFGLE - KLH (BSS) og
(14) SDS243 = lineær VNLTWSRASG - KLH (BSS),
hvor (1), (5) og (12) er referanseimmunogenmolekyler fremstilt ved hhv. glutaraldehyd, DC og BSS-kobling; således
(1), dvs. Pl, er aminosyrene 500-509 av human IgE, Seq.id.nr. 28, se The Lancet [1990] supra, koblet til BSA ved glutaraldehydkobling; (5), dvs. SAF2-KLH, er det samme peptidet, Seq.id.nr. 28, koblet til KLH ved DC-kobling; og (12), dvs. SDS237 og SDS253, er det samme peptidet, Seq.id.nr. 28, koblet til KLH ved BSS-kobling.
De andre peptidene er immunogener ifølge oppfinnelsen, nemlig:
- (2) (P4) er N-acetylert peptid (A) (Seq.id.nr. 1) med en ytterligere Cys ved C-terminalen (Seq.id.nr. 29), koblet til BSA ved DC-kobling; - (3) (P5) er N-acetylert peptid (C) (Seq.id.nr. 3) med en ytterligere Cys ved C-terminalen (Seq.id.nr. 30), koblet til BSA ved DC-kobling; - (4) (SAF1-KLH) er peptidet i eksempel 7 (Seq.id.nr. 31), cyklisert via en disulfidbro dannet ved de to flankerende Cys, og koblet til KLH ved DC-kobling; - (6) (SAF3-KLH) er peptid (G) (Seq.id.nr. 7), koblet til KLH ved DC-kobling; - (7) (SAF3-Lys) er peptid (G) (Seq.id.nr. 7), koblet ved lysingkryssbinding; - (8) (SAF4-KLH) er peptid (D) (Seq.id.nr. 4), koblet til KLH ved DC-kobling; - (9) (SAF5-KLH) er peptid (Q) (Seq.id.nr. 17), koblet til KLH ved DC-kobling; - (10) (SDS214) er det første peptidet i gruppe A i tabell 2, med de samme 7 naboliggende bakteriofagavledede aminosyreresene som peptidet i eksempel 7 (Seq.id.nr. 32), cyklisert og koblet til KLH ved BSS-kobling; - (11) (SDS213, SDS227, SDS236, SDS252) er det samme peptidet som (4) ovenfor (Seq.id.nr. 31), cyklisert og koblet til KLH ved BSS-kobling; - (13) (SDS242, SDS254) er peptid (G) (Seq.id.nr. 7), koblet til KLH ved BSS-kobling; og
- (14) (SDS243) er peptid (D) (Seq.id.nr. 4), koblet til KLH ved BSS-kobling.
Figur 8a viser at både den cykliske BSW17 mimotopen - KLH (BSS) konjugat (11), dsv. SDS236, og det Fce-avledede "originale" epitopmotivet (12), dvs. SDS237, dvs. Fes (500-509) koblet til lineært peptid til KLH (BSS), blir gjenkjent av BSW17 på en doseavhengig måte, mens fritt KLH ikke viser noen binding. Mikrotiterplatebrønner er belagt med hver 1 ug av SDS236, SDS237 eller fri KLH og inkubert med økende konsentrasjon av BSW17. Bundet antistoff blir detektert med geit anti-mus IgG-HRP (gamlgG-HRP). De viste data representerer midler for duplikering av minus bakgrunnsbinding til ikke-belagte (BSA-blokkerte) brønner. Figur 8a oppsummerer ELISA-data oppnådd ved forskjellige BSW17 mimotope konjugater koblet til bæreproteinet ved anvendelse av forskjellige kjemiske koblingsprosedy-rer. Mikrotiterplatebrønner belagt med 5 ug hver av det mimotope konjugatet, eller fri
KLH, og inkubert med 10 ug BSW17. Bundet antistoff blir detektert med gamlgG-HRP. De viste data representerer middel av duplikater minus bakgrunnsbinding av ikke belagte (BSA-blokkerte) brønner. I motsetning til fri KLH, blir hvert BSW17 mimotopt konjugat funnet å bli gjenkjent ved BSW17. Imidlertid, fra gjentatte eksperimenter utført over flere uker, ble det klart at KLH-konjugatene koblet til DC er mindre stabile og gradvis mister sin bindingskapasitet for BSW7.1 motsetning, er BSW17 mimotope konjugater oppnådd ved BSS-kobling vist å være stabile selv ved +4°.
I figur 9a og 9b er det vist at BSW17 mimotoper koblet til KLH eller BSA blir spesifikt gjenkjent av BSW17 og ikke av de ikke-relaterte monoklonale antistoffene 3G9 (anti-humant Ce3) og 5H5/F8 (anti-human Ria). Igjen, blir mikrotiterplatebrønner belagt med 5 ug hver av de viste mimotope konjugatene og inkubert med 10 ug av det tilsvarende monoklonale antistoff. Bundet antistoff blir detektert med gamlgG-HRP. De viste data representerer gjennomsnitt for duplikater minus bakgrunnsbinding til ikke-belagte (BSA-blokkerte) brønner.
Eksempel 9: Immunisering av kaniner med BSW17 mimotope konjugater resulterer i in vivo generering av anti- hiimane IgE- antistoffer
For å bekrefte spesifisiteten til immunisiteten til BSW17 mimotope konjugater, blir kaniner immunisert med sett av mimotop/bærerpreparater som angitt nedenfor:
Kaniner blir immunisert med 200 ug av det tilsvarende konjugatpreparatet oppløst i et totalvolum på 500 ul fosfatbuffret saltvann (PBSdef.) ved s.c. injeksjon. For den første immuniseringen ble det blandet 1:1 med komplett Freund's adjuvant (kanin R1-R4) eller TiterMax (Sigma; kaniner 1-20). Før den initielle immuniseringen, ble 5 ml blod-prøver tatt. Boosting ble utført på dag 21 og 28 etter den første injeksjonen ved anvendelse av ukomplett Freund's adjuvant. Blodprøver ble tatt på dag 28 og 49 og serum preparart fra alle prøvene.
Genereringen av en anti-human IgE immunrespons i de immuniserte kaninene ble overvåket ved ELISA; mikrotiterplater ble belagt med 5 ug humat IgE (SUS-11; JW8) og inkubert med 100 ni serumprøver, fortynnet 1:50 med ELISA-inkuberingsbuffer. Kanin-antistoffer bundet ved det immobiliserte humane IgE ble detektert ved inkubering med geite anti-kanin IgG-HRP (garlgG-HRP). De målte OD405 verdiene ble korrigert ved utlesningen oppnådd ved preimmunt serum fra hver tilsvarende kanin, fortynnet 1:50. De gitte data i figur 10a og 10b representerer gjennomsnittsverdier av duplikate målinger. Figur 10a og 10b viser klart induksjon av antistoffer i kaniner immunisert med forskjellige BSW17 mimotope konjugater som er direkte mot humant IgE.
Serumtitere av ny genererte antistoffer med hensyn på KLH-bærer, peptidet benyttet som immunogen og human IgE, ble også bestemt ved ELISA, ved anvendelse av serielle serumfortynninger for inkubering med immobilisert KLH, mimotopt peptid - BSA-konjugat og humant IgE. To prøver av slike serumtiterbestemmelser ble vist i figur 11, for (11), dvs. SDS 213, og for (10), dvs. SDS 214.
Eksemplene ovenfor viser anvendeligheten av BSW17 mimotope konjugater som immunogener for induksjon av anti-human IgE-respons.
Eksempel 10: Anti- hlgE- respons indusert i kaniner immunisert med BSW17 mimotope konjugater er isotyp- spesifikk og konkurrerer med BSW17 for IgE- binding
Isotypespesifisiteten til den anti-human IgE-immunresponsen i immuniserte kaniner ble overvåket ved ELISA: mikrotiterplatebrønner ble hver belagt med 3 ug humant IgE (SUS-11), IgA, IgG og lg, og inkubert med 100 ul serumprøver, fortynnet 1:50 med ELISA-inkuberingsbuffer. Kanin antistoffer bundet av immuniserte humane antistoffer, ble detektert ved inkubering med geite garlgG-HRP. De målte OD^s-verdiene er korrigert ved utlesningen oppnådd med 1:50 fortynnet preimmunt serum fra hver tilsvarende kanin, fortynnet 1:50. De gitte data i figur 12 representerer gjennomsnittsverdi av duplikate målinger. Som det kan sees, er immunresponsen generert i kaniner ved immuniseringen med BSW17 mimotope konjugater, spesifikke for IgE, skillt fra en delvis gjenkjenning av humant IgM ved serum fra kaninen immunisert med (10), dvs. SDS214.
I en konkurrerende ELISA ble det videre vist at kanin anti-SDS214 antiserum er i stand til delvis å konkurrere med BSW17 for IgE-binding. Mikrotiterplatebrønner ble belagt med 1 ug humant IgE (SUS-11) og enten inkubert med 5 ug BSW17 eller inkuberingsbuffer uten BSW17. Etter vasking, ble 100 ni anti-SDS213 antiserum, fortynnet 1:50 med ELISA inkuberingsbuffer, tilsatt for en andre inkubering. Kanin-antistoffer bundet med ikke-behandlet immobilisert humant IgE og IgE preinkubert med BSW117 blir detektert ved inkubering med geite garlgG-HRP. Dataene gitt i figur 13 representerer gjennomsnittsverdier av duplikate målinger.
Eksempel 11: Anti- hlgE- antistoffene generert i kaniner ved immunisering med BSW17 mimotope konjugater kan bli renset ved affinitetskromato-grafi ved anvendelse av mimotopt peptid koblet til Sepharose som af-finitetsrea<g>ens
Dette eksemplet demonstrerer at anti-hlgE-responsen indusert i kaniner ved immunisering med BSW17 mimotope konjugater er identisk med den spesifikke anti-mimotope peptidresponsen.
Immunoaffinitetsrensing av polyklonale anti-BSWl 7 mimotope antistoffer fra kaniner:
a) Ammoniumsulfatutfelling:
Til 22 ml kanin antiserum (60 mg/ml av totalt protein ifølge Bradford, BSA-Standard,
BIO-RAD), 5,5 g fast AMS (25% w/v) ble tilsatt, blandingen ble omrørt i 3 timer og inkubert over natten ved romtemperatur. Utfellingen ble fjernet ved sentrifugering ved 18000 omdreininger pr. minutt (Sorvall) i 45 minutter og vasket med 25 ml 25% AMS vandig oppløsning (w/v). Den vaskede utfellingen ble sentrifugert igjen under de samme betingelsene, oppløst i 10 ml PBS, 0,05% NaN3, pH 7,2, og dialysert mot 5 1 av den samme bufferen over natten ved +4°.
b) Immunoaffinitetskromatografi:
Dialysatet filtrert på en 0,2 nm Millex-GV filterenhet (Millipore) ble satt på en Pharmacia XK16/30 kolonne fyllt med 10 ml CH-Sepharose 4B kovalent koblet til 5 mg BSW17 mimotopt peptid SDS227 ved en strømningshastighet på 1 ml/min. med PBS, 0,05% NaN3 som løpemiddel. Etter påsetting og eluering av ikke-bundet proteinfrak-sjon, ble spesifikt bundet antistoff eluert med 0,1M glycin/HCl-buffer, pH 2,8. Eluatet (fraksjon #12-20 i 9 ml) ble oppsamlet under omrøring for umiddelbar nøytralisering til pH 7,4 med 3,3 M TRIS/HAc, 0,8% NaN3 pH 8,0 (50 nl/ml) og til sist dialysert mot 3 1 PBS, 0,05% NaN3, pH 7,2 over natten ved 4°. Totalt protein er omkring 1 mg/ml ifølge Bradford, BIgG Standard (BIO-RAD). Gjenvinningen fra totalt protein påsatt er omkring 0,7%.
Affinitetsrensede IgG-fraksjoner ble testet for MgE-bmding ved ELISA. Mikrotiterpla-tebrønner ble belagt med økende konsentrasjoner av humant IgE (JW8) og inkubert med 5 ug av det rensede hhv. anti-SDS-213-antiserum og anti-SDS-214-antiserum. Bundet antistoff ble detektert med garlgG-HRP. Data vist i figur 14 viser middelverdier av dup-likatene. Som det kan sees fra figuren, blir IgG-antistoffene renset på anti-BSWl 7 mimotop affinitetskolonne doseavhengig gjenkjent av humant IgE. Kun lav bakgrunnsbin-dingsaktivitet ble observert på prøvene med kolonnegjennomsfrømming. Disse data demonstrerer at anti-hlgE-aktiviteten indusert i kaniner er identisk med antistoffene rettet mot det mimotope peptidet.
Eksempel 12: Anti humane TgE- antistoffer generert i kaniner etter immunisering med BSW17 mimotope konjugater er ikke anafylaktogeniske på humane blodceller
Det blir her vist at anti-IgE-antistoffene generert i kaniner ved immunisering med BSW17 mimotope konjugater, er ikke-anafylaktogene på humane blodbasofiler. Som testsystem, ble det benyttet kommersielt tilgjengelig CAST sLt ELISA kit (Buhlmann AG, Alschwil, Sveits). I denne analysen ble frigivingen av oppløselig leukotrien (sLt) fra humane basofiler som konsekvens av utløsning av cellen ved anafylaktogene midler, bestemt ifølge den eksperimentelle protokoll fremskaffet av leverandør. Utlesningen av analysen er gitt som pg sLt tilstede pr. ml human hvit blodcellesupernatant etter inkubering av cellene med testprøven, bestemt ved sammenligning med en standardkurve. Standardkurven er fremskaffet ved seriell fortynning av standard sLt i en konkurrerende ELISA. sLt bakgrunnsnivåer som er resultat av spontan sLt-frigiving fra blodcelleprepa-ratene (PB = "pasientblank") og maksimum sLt som kan bli fritt fra et gitt blodcellepre-parat (PC = "pasientkontroll"; oppnådd etter trigging av celleprøven med et tverrbin-dende anti-IgERIa-antistoff) er inkludert i hver test som hhv. negativ og positiv kontroll.
Komplette sera fra kaniner immunisert med BSW17 mimotope konjugater såvel som affinitetsrenset anti-BSW17 mimotope antistoffer beskrevet i eksempel 11, ble testet for nærvær av basofil trigging og således for anafylaktogene anti-hlgE-antistoffer. Som kil-de for basifiler, ble nylig tatt humant helblod av sunne donorer benyttet og prosessert strengt ifølge protokollen til CAST ELISA settet. Resultatene er oppsummert i figur 15 og viser at hverken ikke renset kaninserum inneholdende anti-hlgE-antistoffer generert ved immunisering med BSW17 mimotope konjufater, eller affinitetsrenset anti-BSW17 mimotope antistoffer, har evnen til å trigge humane blodceller for leukotrienfrigiving; de er således ikke anafylaktogene. Dette er et absolutt krav for anvendelsen av BSW17 mimotoper i en human anti-allergivaksine.
Claims (11)
1.
Et immunogent molekyl, karakterisert ved at det omfatter, (a) minst en gruppe av et BSW17 mimotopt peptid med opp til 15 aminosyrer totalt produsert av hybridomcellelinjen med aksesjonsnr. 96121916, som passende kan omfatte ytterligere komponenter for hapten-bærerbinding, for å muliggjøre kobling til komponent (b) eller ytterligere prosessering; eller når det BSW17 mimotope peptidet er cyklisk, kan det ha to ender holdt sammen av to ytterligere cysteinrester som danner en disulfidbro, eller kjemisk tverrbinding; eller når det BSW17 mimotope peptidet er lineært, kan den karboksyterminale aminosyren være blokkert i amidert form og/eller den aminoterminale aminosyren være blokkert i acylert form; eller kan være flankert av en eller to hjelpegrupper og/eller en ytterligere koblingsgruppe; og (b) en gruppe som er i stand til å utvikle en immunrespons mot dette peptidet, hvor komponenten (a) er forskjellig fra Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe.
2.
Immunogent molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det er i form av et polymert peptid eller et rekombinant fusjonsprotein, hvor en monomer forbindelse av det polymere peptidet eller en del av fusjonsproteinet, utgjør gruppen av et BSW17 mimotopt peptid (aksesjonsnr. 96121916), og resten av det polymere peptidet eller fusjonsproteinet utgjør den immunresponsutviklende gruppe.
3.
Immunogent molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det er i form av et konjugat av et BSW17 mimotopt peptid (aksesjonsnr. 9612916) og en immunogen bærer.
4.
Immunogent molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at den BSW17 mimotope peptidgruppen (aksesjonsnr. 96121916) hovedsakelig utgjøres eller består av en i aminosyresekvens valgt blant
5.
Immunogent molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at den BSW17 mimotope peptidgruppen (aksesjonsnr. 96121916) (a) har aminosyresek-vensen Gly-Glu-Phe-Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala (Seq.id.nr. 27) og er cyklisk, nemlig er peptidet Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A) med to ender holdt sammen av to ytterligere cysteinrester som danner en disulfidbro og som omfatter de ytterligere komponentene Gly-Glu-Phe- og -Gly-Asp-Pro-Ala for hapten-bærerbinding og koblingsmulighet.
6.
Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et immunogent molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, og en adjuvans.
7.
Ligand, karakterisert ved at den omfatter et antistoffområde som er spesifikt for en gruppe av et BSW17 mimotopt peptid (aksesjonsnr.
96121916) som definert ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, hvor antistoffområdet er reaktivt også med sekvensen av aminosyrer på den tunge kjeden av IgE som utgjør den naturlige epitopen gjenkjent av BSW17.
8.
Ligand ifølge krav 7, karakterisert ved at den er i form av et monoklonalt antistoff eller et Fab' eller F(ab')2 fragmenter derav.
9.
Fremgangsmåte for fremstilling av et immunogent molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter kobling av (a) en gruppe av BSW17 mimotopt peptid (aksesjonsnr. 96121916) med et (b) en gruppe som er i stand til å utvikle en immunrespons mot peptidet.
10.
Anvendelse av et immunogent molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av IgE-medierte sykdommer.
11.
Anvendelse av et immunogent molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning i form av en vaksine for behandling av allergi.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9604412.8A GB9604412D0 (en) | 1996-03-01 | 1996-03-01 | Organic compounds |
| GBGB9617702.7A GB9617702D0 (en) | 1996-08-22 | 1996-08-22 | Organic compounds |
| PCT/EP1997/001013 WO1997031948A1 (en) | 1996-03-01 | 1997-02-28 | Peptide immunogens for vaccination against and treatment of allergy |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO983999D0 NO983999D0 (no) | 1998-08-31 |
| NO983999L NO983999L (no) | 1998-11-02 |
| NO321043B1 true NO321043B1 (no) | 2006-03-06 |
Family
ID=26308839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19983999A NO321043B1 (no) | 1996-03-01 | 1998-08-31 | Peptidimmunogene farmasoytiske sammensetninger, en ligand og anvendelse av disse for vaksinasjon og behandling av allergi. |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6610297B1 (no) |
| EP (1) | EP0885244B2 (no) |
| JP (2) | JP3421970B2 (no) |
| KR (2) | KR100498198B1 (no) |
| CN (1) | CN1174998C (no) |
| AT (1) | ATE230417T1 (no) |
| AU (1) | AU719609B2 (no) |
| BR (1) | BR9707819A (no) |
| CA (1) | CA2245497C (no) |
| CY (1) | CY2457B1 (no) |
| CZ (1) | CZ299551B6 (no) |
| DE (1) | DE69718150T3 (no) |
| DK (1) | DK0885244T4 (no) |
| ES (1) | ES2190799T5 (no) |
| HK (1) | HK1014962A1 (no) |
| HU (1) | HUP9901109A3 (no) |
| IL (1) | IL125590A (no) |
| NO (1) | NO321043B1 (no) |
| NZ (1) | NZ331651A (no) |
| PL (1) | PL187209B1 (no) |
| RU (1) | RU2193413C2 (no) |
| SI (1) | SI0885244T2 (no) |
| SK (1) | SK284856B6 (no) |
| TR (1) | TR199801722T2 (no) |
| WO (1) | WO1997031948A1 (no) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1621209A3 (en) * | 1998-11-02 | 2006-04-19 | Resistentia Pharmaceuticals AB | Vaccines based on domains of chimeric immunoglobulin E peptides |
| US6913749B2 (en) | 1998-11-02 | 2005-07-05 | Resistentia Pharmaceuticals Ab | Immunogenic polypeptides for inducing anti-self IgE responses |
| ATE412434T1 (de) | 1998-11-30 | 2008-11-15 | Cytos Biotechnology Ag | Molekulare anordnung von allergenen, verfahren zur deren herstellung und deren verwendung |
| JP2002537354A (ja) * | 1999-02-25 | 2002-11-05 | スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ペプチド、及びＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのプロテインＤ由来の担体を含む免疫原 |
| MXPA01008612A (es) * | 1999-02-25 | 2003-06-24 | Smithkline Beecham Biolog | Epitopos o mimotopos derivados de los dominos c-epsilon-3 o c-epsilon-4 de ige, antagonistas de los mismos y sus usos terapeuticos. |
| GB9908533D0 (en) * | 1999-04-14 | 1999-06-09 | Novartis Ag | Organic compounds |
| CA2405290C (en) * | 2000-04-13 | 2011-06-21 | Bio Life Science Forschungs Und Entwicklungsgesellschaft Mbh | Vaccine against cancerous diseases |
| CA2407897A1 (en) | 2000-05-05 | 2001-11-15 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen arrays and vaccines |
| US6887472B2 (en) | 2000-08-30 | 2005-05-03 | Pfizer Inc. | Anti-IgE vaccines |
| US7320793B2 (en) | 2001-01-19 | 2008-01-22 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
| US7128911B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
| US7094409B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-08-22 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases |
| EP1236740B1 (de) * | 2001-02-28 | 2012-07-18 | Bio Life Science Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. | Vakzine gegen Krebserkrankungen, die mit dem HER-2/neu Onkogen assoziiert sind |
| EP1239032A1 (en) | 2001-03-02 | 2002-09-11 | Société des Produits Nestlé S.A. | Lactic acid bacteria as agents for treating and preventing allergy |
| JP2003047482A (ja) | 2001-05-22 | 2003-02-18 | Pfizer Prod Inc | 非アナフィラキシー誘発性ＩｇＥワクチン |
| EP1497654A4 (en) | 2001-08-13 | 2006-06-07 | Chen Swey Shen Alex | IMMUNOGLOBULIN E VACCINES AND METHODS OF USE |
| US7115266B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-10-03 | Cytos Biotechnology Ag | Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof |
| ATE361097T1 (de) * | 2002-01-15 | 2007-05-15 | Bio Life Science Forschungs & Entwicklungsgesellschaft Mbh | Orale vakzinierung mit dem tumor-antigen-mimotop gln-met-trp-ala-pro-gln-trp-gly-pro-asp |
| JP4726483B2 (ja) | 2002-07-17 | 2011-07-20 | サイトス バイオテクノロジー アーゲー | 分子抗原アレイ |
| CA2487849A1 (en) | 2002-07-18 | 2004-01-29 | Cytos Biotechnology Ag | Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof |
| DK1524994T3 (da) | 2002-07-19 | 2011-08-15 | Cytos Biotechnology Ag | Vaccinesammensætninger indeholdende amyloid beta 1-6-antigen-arrays |
| CA2495251C (en) | 2002-08-14 | 2018-03-06 | Macrogenics, Inc. | Fc.gamma.riib-specific antibodies and methods of use thereof |
| US20050065136A1 (en) * | 2003-08-13 | 2005-03-24 | Roby Russell R. | Methods and compositions for the treatment of infertility using dilute hormone solutions |
| US20050239757A1 (en) * | 2004-04-21 | 2005-10-27 | Roby Russell R | Hormone treatment of macular degeneration |
| US20060025390A1 (en) * | 2004-07-28 | 2006-02-02 | Roby Russell R | Treatment of hormone allergy and related symptoms and disorders |
| ITMI20052517A1 (it) * | 2005-12-29 | 2007-06-30 | Lofarma Spa | Varianbtio ipoallergeniche dell'allergene maggiore bet v 1 di polline di betula verrucosa |
| HUE030269T2 (en) | 2006-06-26 | 2017-04-28 | Macrogenics Inc | FC RIIB-specific antibodies and methods for their use |
| EP2012122A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-01-07 | Medigene AG | Mutated parvovirus structural proteins as vaccines |
| US8865179B2 (en) * | 2008-01-26 | 2014-10-21 | Swey-Shen Alexchen | Aptameric IgE peptides in a protein scaffold as an allergy vaccine |
| EP2865389A1 (en) | 2008-12-09 | 2015-04-29 | Pfizer Vaccines LLC | IgE CH3 peptide vaccine |
| EP2942061A3 (en) * | 2010-06-07 | 2016-01-13 | Pfizer Vaccines LLC | Ige ch3 peptide vaccine |
| RU2761431C9 (ru) * | 2020-10-26 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока в качестве вакцины от аллергии |
Family Cites Families (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2602443A1 (de) | 1975-04-04 | 1976-10-21 | Univ California | Biologisch aktive polypeptide |
| US4171299A (en) | 1975-04-04 | 1979-10-16 | The Regents Of The University Of California | Polypeptide agents for blocking the human allergic response |
| EP0000252B1 (en) | 1977-06-29 | 1982-02-03 | Beecham Group Plc | Peptides, pharmaceutical compositions containing the peptides and a process for the preparation of the peptides |
| JPS5944399A (ja) | 1982-09-07 | 1984-03-12 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａ |
| GB8616166D0 (en) * | 1986-07-02 | 1986-08-06 | Research Corp Ltd | Polypeptide competitor |
| US4892827A (en) | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
| EP0269455A3 (en) | 1986-11-28 | 1989-09-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Highly purified fused protein comprising human ige fc fragment and production thereof |
| WO1988006040A1 (en) | 1987-02-20 | 1988-08-25 | Imclone Systems, Inc. | Monoclonal antibodies in vaccine formulations |
| CA1336818C (en) | 1987-04-16 | 1995-08-29 | International Institute Of Cellular And Molecular Pathology | Treatment of allergy and composition thereof |
| ATE152244T1 (de) | 1987-10-13 | 1997-05-15 | Terrapin Tech Inc | Verfahren zur herstellung von imunodiagnose- mitteln |
| GB8727045D0 (en) | 1987-11-19 | 1987-12-23 | Research Corp Ltd | Immunoglobulin e competitor |
| US5342924A (en) | 1987-12-31 | 1994-08-30 | Tanox Biosystems, Inc. | Extracellular segments of human ε immunoglobulin anchoring peptides and antibodies specific therefor |
| US5449760A (en) | 1987-12-31 | 1995-09-12 | Tanox Biosystems, Inc. | Monoclonal antibodies that bind to soluble IGE but do not bind IGE on IGE expressing B lymphocytes or basophils |
| GB8910263D0 (en) | 1989-05-04 | 1989-06-21 | Ciba Geigy Ag | Monoclonal antibodies specific for an immunoglobulin isotype |
| GB8913737D0 (en) | 1989-06-15 | 1989-08-02 | Univ Birmingham | A novel anti-allergy treatment |
| CA2074089C (en) | 1990-01-23 | 2001-04-10 | Tse-Wen Chang | Extracellular segments of human e immunoglobulin anchoring peptides and antibodies specific therefor |
| ES2077857T3 (es) | 1990-05-25 | 1995-12-01 | Peptide Therapeutics Ltd | Prueba de inmunodiagnostico para artritis reumatoide. |
| US5258289A (en) | 1990-09-05 | 1993-11-02 | Davis Claude G | Method for the selecting of genes encoding catalytic antibodies |
| GB9101550D0 (en) | 1991-01-24 | 1991-03-06 | Mastico Robert A | Antigen-presenting chimaeric protein |
| US5965709A (en) * | 1991-08-14 | 1999-10-12 | Genentech, Inc. | IgE antagonists |
| JP3457962B2 (ja) * | 1991-08-14 | 2003-10-20 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | 特定Ｆｃεレセプターのための免疫グロブリン変異体 |
| SE9102808L (sv) | 1991-09-26 | 1993-03-27 | Lars T Hellman Inst F Immunolo | Vaccin, foer humant bruk, vars avsedda effekt aer att lindra symptomen eller foerhindra uppkomsten av ige-medierade allergiska reaktioner |
| GB9125024D0 (en) | 1991-11-25 | 1992-01-22 | Kirby Julian | Rheumatoid arthritus treatment |
| JPH06113881A (ja) | 1992-10-07 | 1994-04-26 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | ヒト型モノクローナル抗ペプチド抗体及びこれをコードするｄｎａ |
| US5759551A (en) | 1993-04-27 | 1998-06-02 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines |
| JP3795914B2 (ja) | 1993-04-27 | 2006-07-12 | ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレイテッド | ワクチン用免疫原性ｌｈｒｈペプチド構築体および合成普遍免疫刺激器 |
| AU6909194A (en) | 1993-05-14 | 1994-12-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Preparation of n-cyanodithioimino-carbonates and 3-mercapto-5-amino-1h-1,2,4-triazole |
| GB9320897D0 (en) | 1993-10-11 | 1993-12-01 | Peptide Therapeutics Ltd | Compounds useful in anti-allergy treatment |
| GB9324013D0 (en) * | 1993-11-22 | 1994-01-12 | 3I Res Expl Ltd | Polypeptides |
| FR2715304B1 (fr) * | 1994-01-26 | 1996-04-26 | Merieux Serums Vaccins Pasteur | Vaccin anti-allergique. |
| JPH09510975A (ja) * | 1994-03-28 | 1997-11-04 | ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレイテッド | アレルギー治療用合成ペプチドベース免疫原 |
| WO1996001643A1 (en) | 1994-07-08 | 1996-01-25 | Thomas Jefferson University | IgE ANTAGONISTS |
| WO1996012740A1 (en) | 1994-10-25 | 1996-05-02 | United Biomedical, Inc. | SYNTHETIC IgE MEMBRANE ANCHOR PEPTIDE IMMUNOGENS FOR THE TREATMENT OF ALLERGY |
| WO1998024808A2 (en) | 1996-12-06 | 1998-06-11 | THE UNITED STATES OF AMERICA represented by THE SECRETARY DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES, THE NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH | INHIBITION OF IgE-MEDIATED ALLERGIES BY A HUMAN IgE-DERIVED OLIGOPEPTIDE |
| EP0955311A3 (en) | 1998-04-09 | 2000-08-16 | Idexx Laboratories, Inc. | Peptide vaccine for canine allergy |
| TWI229679B (en) | 1998-06-20 | 2005-03-21 | United Biomedical Inc | Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens |
-
1997
- 1997-02-28 HU HU9901109A patent/HUP9901109A3/hu unknown
- 1997-02-28 EP EP97905136A patent/EP0885244B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 SK SK1181-98A patent/SK284856B6/sk unknown
- 1997-02-28 CZ CZ0277198A patent/CZ299551B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 SI SI9730490T patent/SI0885244T2/sl unknown
- 1997-02-28 BR BR9707819A patent/BR9707819A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-28 DE DE69718150T patent/DE69718150T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 AU AU18796/97A patent/AU719609B2/en not_active Ceased
- 1997-02-28 PL PL97328858A patent/PL187209B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 CA CA002245497A patent/CA2245497C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 TR TR1998/01722T patent/TR199801722T2/xx unknown
- 1997-02-28 US US09/125,641 patent/US6610297B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 CN CNB971926719A patent/CN1174998C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 JP JP53063297A patent/JP3421970B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 RU RU98118184/14A patent/RU2193413C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 ES ES97905136T patent/ES2190799T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 KR KR10-1998-0706845A patent/KR100498198B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 IL IL12559097A patent/IL125590A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 KR KR1020057005577A patent/KR100584051B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 NZ NZ331651A patent/NZ331651A/xx unknown
- 1997-02-28 WO PCT/EP1997/001013 patent/WO1997031948A1/en active IP Right Grant
- 1997-02-28 AT AT97905136T patent/ATE230417T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 DK DK97905136T patent/DK0885244T4/da active
-
1998
- 1998-08-31 NO NO19983999A patent/NO321043B1/no unknown
- 1998-12-31 HK HK98119259A patent/HK1014962A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-12-26 JP JP2002377664A patent/JP2003231696A/ja active Pending
-
2004
- 2004-06-04 CY CY0400044A patent/CY2457B1/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0885244B1 (en) | Peptide immunogens for vaccination against and treatment of allergy | |
| KR0181313B1 (ko) | 면역활성 펜티드 및 항체와 이것들의 항-알레르기 치료에의 이용 | |
| CZ20013081A3 (cs) | Epitopy a mimotopy získané z oblastí C-epsilon-2 nebo C-epsilon-4 IgE, jejich antagonisté a jejich terapeutické pouľití | |
| CZ20013673A3 (cs) | Anti-idiotypová protilátka k protilátce inhibující vazbu imunglobulínu E na jeho receptor s vysokou afinitou a farmaceutický přípravek obsahující takovou protilátku | |
| CA1256795A (en) | Anti-idiotype antibodies induced by synthetic polypeptides | |
| WO2000050460A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the c-epsilon-2 domain of ige, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
| US5955076A (en) | Immunoactive peptides and antibodies and their use in anti-allergy treatment | |
| US20030170229A1 (en) | Vaccine | |
| US20030147906A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of lgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
| US20050214285A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of IgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
| AU646808C (en) | Immunoactive peptides and antibodies and their use in anti-allergy treatment | |
| ZA200107016B (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-2 domain of ige, antagonists thereof, and their therapeutic uses. |