JPH06113881A - ヒト型モノクローナル抗ペプチド抗体及びこれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒトＩｇＥ抗体のＣＨ４領域に存在し、アレ
ルゲン感作された肥満細胞からのケミカルメディエータ
ー放出のシグナルとなる次に示されるアミノ酸配列を有
するペプチドに対して結合性を有し、アレルゲン刺激に
よる肥満細胞からのヒスタミン遊離を抑制するヒト型モ
ノクローナル抗体。 H-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-NH₂ 【効果】 アレルギー反応に関係する特定のアミノ酸配
列を示すペプチドに対して結合性を有するヒト型モノク
ローナル抗体であるので、医薬品あるいは試薬として有
用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫グロブリンＥに存
在し、アレルギー反応に関係する特定のアミノ酸配列を
示すペプチドに対して結合性を有するヒト型の新規なモ
ノクローナル抗体およびこの抗体をコードするＤＮＡに
関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫反応は生体を感染などの外来性異物
の進入を防御する機構であるが、この反応が生体にとっ
て有害な形で働く場合があり、これをアレルギーと総称
している。アレルギーはその発生するプロセスによっ
て、Ｉ型からIV型に分類されている。このうちＩ型は即
時型アレルギーとしてアレルギー反応の代表的なもの
で、一般的にはアレルギーとはこのＩ型をさしている。
Ｉ型アレルギーは免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）により仲
介されて起きる。その機構としては、まず組織の肥満細
胞または血中の好塩基球の表面に存在するＦｃεレセプ
ターにＩｇＥが結合し、ついでアレルゲンがＩｇＥ抗体
の抗原結合部位に結合してＩｇＥ抗体間に架橋構造を形
成する。この架橋により肥満細胞や好塩基球が刺激され
種々のケミカルメディエーターが放出され、喘息や浮腫
など種々のアレルギー反応を引き起こす。

【０００３】このような作用機序が明らかになるにつれ
て、アレルギーの対策としてＩｇＥに対して作用する薬
剤を使用して、アレルギーの予防や治療に用いる事が検
討されている。特にＩｇＥに対する抗体を用いて治療や
予防を行うことが試みられている。このなかで、Stanwo
rth らは、ＩｇＥ抗体間が架橋されたのちの肥満細胞や
好塩基球からのケミカルメディエーター放出のシグナル
伝達機構の解析から、肥満細胞からのヒスタミン遊離を
促進することが期待されるアミノ酸配列をＩｇＥ抗体の
ＣＨ４領域に見出し(Stanworth,D.R.,et.al., Biochem
J., 180,pp665-668(1979))、下記に示す特定のアミノ酸
配列を有するペプチドが肥満細胞からのヒスタミン遊離
を促進することをin vitroで観察している。なおこの配
列は配列表配列番号１として記載した配列と同一であ
る。

【０００４】 H-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-NH₂

【０００５】さらに、彼らはこのペプチドを免疫して得
たウサギ抗血清が、抗原刺激時のラット肥満細胞からの
ヒスタミン遊離を阻害することをin vitroおよびin viv
o で証明し、ワクチンとしてこのペプチドを用いた新し
いアレルギー疾患の免疫療法の可能性を報告している
(Stanworth, D.R., et.al., Lancet, 339, pp1279-81(1
990)) 。

【０００６】アレルギー性疾患の治療を目的として当該
ペプチドに対する抗体をヒトに用いるためにはヒト型モ
ノクローナル抗体が最適であるが、ヒト抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞の樹立は技術的に難しく、またマウ
ス抗体ほど一般化しておらず、少数の成功例が報告され
ているに過ぎない。例えば、ヒトハイブリドーマの樹立
に関しては、１９８０年に相次いで２例の最初の報告が
存在している（Olsson,L, and Kaplan,H.S.,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,77,5429 (1980), Croce,C.M.et.al.,Natu
re,288,488 (1980))。しかし、目的とする特異抗体を産
生するハイブリドーマの取得効率は低く、抗原を自由に
選んでin vitroで抗体を産生させる技術が殆ど未開発で
あることなど、マウスの系に比べると多くの問題点が残
されている。

【０００７】しかしこれらの問題点は徐々に解決される
方向にある。細胞融合の親株としては、融合効率が高
く、増殖性や抗体の安定性などに優れた細胞株が得られ
ている。例えば、 LICR-LON-HMy2----Edwards,P.A.W.,et.al.,J.Immunol.,
12?,641 (1982) , WI-L2/729 HF₂---Abrams,P.G.,et.al.,J.Immunol.,131,
1201(1983) , 8226 AR/NIP4-1----Pickering,J.W, and Gelder,F.B.
J.Immunol.,129, 406(1982), K6H6/B5----Carrol,W.L. et.al., J.Immunol.Methods,8
9,61 (1986) また、リンパ球源としてヒトの場合、最も容易に入手で
きるのは末梢血リンパ球であり、手術などにより脾臓、
扁桃、リンパ節などが利用可能である。 末梢血リンパ球----Croce,C.M.et.al.,Nature,288,488
(1980) 脾臓----- Olsson,L, and Kaplan,H.S.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,77,5429(1980) 扁桃----- Edwards,P.A.W.,et.al.,J.Immunol.,12?,641
(1982) in vivo で感作されたリンパ球をin vitroで刺激する方
法として、ポリクローナルにB 細胞を活性化する方法が
あり、このような物質としてPWM やEBV がある(PWM----
Warenius,H.M.et.al.,Eur.J.Cancer Clin.Oncol.,19,34
7 (1983),EBV----Kozbor,D. and Roder,J.C.,Eur.J.Imm
unol.,14,23 (1984))。しかしながら、invivo で感作し
ていない抗原に対してin vitroのみの刺激で自由に抗体
産生を誘導することは困難であるとされていたが、Stri
keらによりin vitro感作法でヒツジ赤血球に対する抗体
を産生するハイブリドーマ細胞の樹立が報告されている
(Strike,L.E.,et.al.,J.Immunol.,132,1798(1984)) 。
しかし本発明で提供されるような、ヒト型の抗ＩｇＥモ
ノクローナル抗体は得られていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】アレルギー性疾患の治
療を目的として上記ペプチドに対する抗体をヒトに用い
るためには、ヒト型抗ペプチド抗体が最適と考えれる
が、現在までにそのような抗体は文献上存在しない。そ
のため本発明は、Stanworth らにより見出されたヒトIg
E に存在するメディエーター放出の刺激伝達に関与する
ペプチドを認識する新規なヒト型モノクローナル抗体お
よびこの抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを提供
することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の抗体は、当該ペ
プチドによりin vitro感作したヒトリンパ球を用いて、
ヒトミエローマ細胞と融合して作製した多数のハイブリ
ドーマ細胞の中から、目的とする抗体を産生しているハ
イブリドーマ細胞を選択することにより初めて得ること
が可能となる。このようにして得られた抗体生産ハイブ
リドーマより、抗体のアミノ酸配列をコードしているｃ
ＤＮＡを得て、そのｃＤＮＡを分析し、さらに抗体のＮ
末端アミノ酸配列を分析することにより、ヒト型抗体の
全アミノ酸配列を決定することができる。この抗体はそ
の可変領域が、抗原としたペプチドに対して特定の配列
を有しており、他の抗体と明瞭に区別できる。

【００１０】本発明による抗体は以下のようにして調製
することができる。 (1) 抗原の調製 ヒトＩｇＥ抗体のＣＨ４領域に存在し、アレルゲン感作
された肥満細胞からのケミカルメディエーター放出のシ
グナルとなる１０アミノ酸残基から構成される先に示し
たペプチド（構造式１）はＦｍｏｃ法によりアプライド
社製自動ペプチド合成装置（４３１Ａ）を用いて合成
し、逆相ＨＰＬＣにて精製した。 H-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-NH₂ （構造式１） 精製ペプチドを1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbo
diimide(EDC)を用いてニワトリ卵アルブミンと結合さ
せ、in vitro感作のための抗原として使用した。

【００１１】(2) ハイブリドーマの作製 ヒトリンパ球源として、末梢血、脾臓、扁桃およびリン
パ節を利用することが可能であり、これをin vitroで抗
原感作したのちにミエローマ細胞株と細胞融合を行う。
細胞融合の親株としては、LICR-LON-HMy2 、WI-L2/729
HF₂ 、8226 AR/NIP4-1、K6H6/B5 などが代表的な細胞株
としてあげられる。細胞融合は常法により行うが、PEG
法、センダイウィルスを用いる方法、電気パルス法など
を例示できる。

【００１２】(3) ハイブリドーマ細胞の選択 目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マの選択は、本発明の実施例で開示するK6H6/B5 株を用
いる場合は、アザセリンを含む選択培地を用い融合株を
選択する。さらに融合株は、培養上清の分析を行い、目
的とする抗体を生産する細胞を選択する。培養上清の分
析としては、プラークアッセイ法、ラジオイムノアッセ
イ法、ELISA 法などが例示できる。

【００１３】(4) ハイブリドーマの培養 得られたハイブリドーマは、ヌードマウスやSCIDマウス
に移植して抗体を腹水や血清より回収することが可能で
ある。またRPMI-1640 培地(10%牛胎仔血清含有) を用い
て細胞を培養した培養上清や牛胎仔血清を含まない培地
での培養で得られる培養上清からも抗体を調製できる。

【００１４】(5) 抗体の精製 培養上清もしくは腹水からの抗体の精製は常法により行
う。例えば、硫安分画、ゲル濾過、イオン交換クロマロ
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが
使用できるし、また必要に応じて適宜組合せて行うこと
ができる。

【００１５】(6) 抗体の特性 本方法により得られたモノクローナル抗体は下記の特性
により特定される。 １．合成ペプチド H-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe
-Val-Phe-NH₂と結合性を有する。 ２．アレルゲン刺激を受けた肥満細胞のヒスタミン遊離
を抑制する。 ３．非還元条件下で分子量約150000、ヒトIgG サブクラ
スがIgG3( κ) に分類される。

【００１６】本発明の抗体を生産する生産株を得て、こ
の細胞から常法により抗体の生産をコードするＤＮＡを
得て、このＤＮＡを用いることにより遺伝子組み換え抗
体を生産することもできる。この場合得られる抗体はＨ
鎖、またはＬ鎖を単独で得ることができる。本発明はこ
のような単鎖の抗体およびこのような抗体をコードする
ＤＮＡも提供する。本発明の抗体は、ヒト型であるため
繰り返し患者に投与することが可能である。また、Ｉｇ
Ｅにより発生するアレルギー反応、たとえば花粉症、喘
息、ＳＬＥ、など種々の疾患に使用することができる。
また人型であるため、静脈内投与などの投与が可能であ
り、即発性のアレルギー症状に対する早期の治療が可能
となる。

【００１７】以下に実施例を示しさらに発明を詳細に説
明する。

【実施例１】 ヒト型抗ペプチド抗体産生ハイブリドーマの作製 (1) 免疫原の調製 アレルゲン感作された肥満細胞からのケミカルメディエ
ーター放出のシグナルとなる１０アミノ酸残基から構成
されるペプチド（構造式１）はＦｍｏｃ法によりアプラ
イド社製自動ペプチド合成装置（４３１Ａ）にて0.25mm
ole のレジンに各1mmoleのアミノ酸を用いて合成した。
合成終了後、レジンよりペプチドをTFMSA 法により切り
出しを行い、粗ペプチドを130mg 得た。このペプチドを
逆相ＨＰＬＣ（アプライドカートリッジカラムRP-300,C
8,φ4.6 x 250mm)にて精製し、99% 以上の高純度を示す
ペプチドを50mg得た。クロマトグラムを図１に示す。精
製ペプチドをピアス社製 Imject Immunogen EDC Conjug
ation Kit を用いてニワトリ卵アルブミンと結合させ、
in vitro感作のための抗原として使用した。

【００１８】(2) 抗原感作リンパ球の調製 健常人よりヘパリン添加末梢血20mlを採取し、リンホセ
パール溶液（免疫生物研究所製）を用いてリンパ球を分
離した。このリンパ球をRPMI-1640 培地に懸濁しロイシ
ン-O- メチルエステル処理したのち、抗原( ペプチド-O
VA結合物1 〜10μg)を添加し、37°C で20分間in vitro
抗原感作したのち、ムラミルジペプチド、ヒトIL4 およ
びヒトIL6 および牛胎仔血清( 終濃度20%)を添加して、
37℃にてCO₂ インキュベーター内で4 日間培養した。一
方、上記細胞と融合させるヒトミエローマ細胞K6H6/B5
をRPMI-1640 培地(10%牛胎仔血清含有) を用いて常法に
従って調製した。

【００１９】(3) 細胞融合 上記で調製したヒトリンパ球とミエローマ細胞をそれぞ
れ細胞数が２：１の比になるように混合した後遠心し、
上清を除去した。ついで細胞に37℃に温めた42%PEG4000
-17%DMSO含有RPMI-1640 培地1ml をゆっくり滴下した。
RPMI-1640 培地(FCS不含)10ml を攪拌しながら添加した
後、遠心して上清を除去し、最終的にリンパ球細胞が2
〜5X10⁶ /ml となるようにRPMI-1640 培地(10%FCS 含
有) にて希釈後96ウェルプレートに0.1ml/ウェルの割合
で分注した。

【００２０】(4) ハイブリドーマの選択 上記融合操作から4 日目、6 日目、9 日目にアザセリン
含有HT培地を追加して10〜14日間培養を行った。なお、
上記のアザセリン含有HT培地は、RPMI-1640 培地(10%FC
S 含有) に0.1mM ヒポキサンチン、１μg/mlアザセリ
ン、1.6 μM チミジン、5X10^-6M 2-メルカプトエタノー
ル、1ng/mlヒトIL6 、100U/ml ペニシリン、および0.1m
g/mlストレプトマイシンを添加したものである。ついで
培養上清の分析を以下の手順で行った。

【００２１】(5) 分析用プレートの調製 96ウェルプレート(Nunc 社製) の各ウェルに2%ウシ血清
アルブミンを0.2ml ずつ入れ４℃で一晩静置した。洗浄
後10μg/mlのペプチドと0.25% グルタルアルデヒドを含
むPBS(pH7.4)溶液を0.1ml ずつ添加し室温で1 時間反応
させた。洗浄後、25mM Tris(pH7.4)溶液を0.2ml ずつ添
加し４℃で一晩静置して分析用プレートを調製した。

【００２２】(6) ハイブリドーマの選択 細胞の増殖が確認されたウェルの上清をとり、上記の分
析用プレートのウェルに0.1ml ずつ添加した。室温で２
時間放置後PBS-0.05%Tween20(PBS-T) で３回洗浄した
後、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG 抗体(DAKO
社) を0.1ml/ウェル添加し、室温で２時間インキュベー
トした。PBS-T で３回洗浄した後、酵素活性測定の基質
として0.1M酢酸ナトリウム−0.05M リン酸二水素ナトリ
ウム緩衝液20mlにABTS(2,2'-azino-di-(3-ethyl-benzot
hiazolin-sulfonate)40mM を1.0ml,および0.25M 過酸化
水素水0.2ml を溶解したものを使用直前に調製し、これ
を 0.2ml/ ウェルの割合で注入後室温で反応を行った。
反応後イムノリーダーNJ-2000（日本インターメッド社
製) で405nm の吸光度を測定した。ペプチドに対して特
異的に反応する抗体を含む各ウェルのハイブリドーマ細
胞を96ウェルプレートに1 個/ ウェルでまき、限界希釈
法により３回クローニングして選択した。これらハイブ
リドーマの産生する抗体について、以下に示す実施例に
従ってその特性を分析し、本発明に適した抗体生産株を
選別し、これを13-8G と命名した。このハイブリドーマ
は微生物工業技術研究所に微工研菌寄第13187 号として
寄託した。

【００２３】

【実施例２】ハイブリドーマ細胞の培養および抗体の精製 ハイブリドーマ細胞をRPMI-1640 培地(10%FCS 含有) に
て、37℃，5%炭酸ガス存在下CO₂ インキュベーターで培
養した。FCS 含有培養上清を採取したのち、細胞をＰＢ
Ｓで３回洗浄し、RPMI-1640 培地(FCS不含) に1x10⁶/ml
の濃度で懸濁し、37℃でCO₂ インキュベーター内で3 日
間培養した。FCS 不含の培養上清を遠心にて調製した。
FCS 含有培養上清からは、抗体を硫安分画ついで抗ヒト
IgG 抗体固定化セファロース(Cappel 社製) を用いて精
製した。また、FCS 不含の培養上清からは、限外ろ過に
よる濃縮後Protein G 固定化セファロース(Zymed社製)
を用いて特異的に抗体を精製した。

【００２４】

【実施例３】モノクローナル抗体の物理化学的性質の測定 実施例１で得られたハイブリドーマクローンの生産する
抗体について分析を行った。 (1) 分子量測定 SDS-ポリアクリルアミゲルによる電気泳動をLaemmli の
緩衝液を用いて行った。抗体の分子量はバイオラッド社
製の分子量マーカーを用いて比較した結果、非還元条件
下で約150000であった。

【００２５】(2) 抗体のアイソタイプ分析 バインディング サイト社製のヒトIgG サブクラス タ
イピングキットを用いて分析を行った。その結果、ハイ
ブリドーマクローン13-8G の産生する抗体は、IgG3(
κ) のサブクラスに分類された。

【００２６】(3) N 末端アミノ酸配列 精製した抗体を２μg/μl の濃度に1mM EDTA,2.5% SDS,
0.01% ブロムフェノールブルー, 10% 2-メルカプトエタ
ノール, 10% グリセロールを含む10mMトリス塩酸緩衝液
(pH8) に溶解した。これを100 ℃で30分間加熱し、1500
0rpm 3分間遠心して上清を回収した。これをSDS-ポリア
クリルアミゲル(10%) による電気泳動を行い、H 鎖とL
鎖を分離した。これをポリビニリデンジフルオライド膜
へ電気的にブロットしてクマシーブリリアントブルーで
染色した膜を7%酢酸を含む25% メタノール溶液で脱色後
風乾した。それぞれの鎖に相当する膜を切取り、それを
直接気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシ
ステムズ社製モデル４７７Ａ）に導入し、自動的にcoup
ling cleavage conversion反応を行った。得られたPTH-
アミノ酸を20% アセトニトリルに溶解し、逆相高圧液体
クロマトグラフィー（アプライドバイオシステムズ社製
モデル１２０Ａ，カラムＣ−１８，φ2.1mmx 220mm)を
行い、保持時間から各アミノ酸を同定した。クローン13
-8G が産生する抗体のL 鎖のN 末端アミノ酸配列を以下
に示す。また、H 鎖のN 末端アミノ酸はブロックされて
おり、この方法では分析できなかった。

【００２７】クローン13-8G が産生する抗体のL 鎖のN
末端アミノ酸配列 1 2 3 4 5 6 7 8 91011121314151617181920 E I V M T Q S P A T L S V S P G G R A A

【００２８】

【実施例４】モノクローナル抗体の生化学的性質 実施例１で得られたハイブリドーマクローンの生産する
抗体について分析を行った。(1) モノクローナル抗体の
ペプチドに対する結合性 実施例 1-(6)で使用したELISA 法を用いて、モノクロー
ナル抗体のペプチドに対する結合性について調べた。ハ
イブリドーマの培養上清中に含まれるヒトIgG濃度をEIA
ヒトIgG キット(MBL社製) にて測定した。分析用プレ
ートの各ウェルに2%BSA-PBS 溶液で段階希釈した培養上
清を0.1ml ずつ添加して同様に吸光度を測定した結果を
図 2に示した。添加したハイブリドーマ培養上清の希釈
に比例した吸光度の低下が観察されたことから、抗体が
用量依存的にペプチドと結合していることが確認され
た。また、培養上清の希釈に2%BSA を使用しているた
め、この結合はペプチドに特異的であると判断された。

【００２９】 (2) クローン13-8G の抗体遺伝子のcDNAクローニング ハイブリドーマ株13-8G ( 1.2 x 10⁸ 細胞) よりFast-T
rack(InVitrogen 社製) を用いてポリA 付加RNA を分離
した。その５μg を用いて 1.7μg の二本鎖cDNAを合成
した。この半量を用いて、その両端にEcoRI アダプター
を付加した後セファロースを担体としたゲルクロマトグ
ラフィーを行った。このcDNAをλgt10ファージDNA に挿
入してパッケージングを行い、λgt10 cDNA ライブラリ
ー調製した。スクリーニング用プローブはPCR 法によっ
て合成した。すでに知られているヒトIgG 抗体のH 鎖と
L 鎖の塩基配列に従ってPCR プライマーをそれぞれ一組
合成し、cDNAライブラリーをテンプレートとしてPCR 増
幅を行った。増幅されたDNAをアガロース電気泳動によ
って精製し、³²P でラベルしたのちプローブとして用い
た。このH 鎖とL 鎖用のプローブを用いてcDNAライブラ
リーをスクリーニングし、陽性を示す純粋クローン（Ｋ
11とＨ71）をそれぞれ選択した。これらを制限酵素(Eco
RIとBamHI)で切断し、1.4 〜2.0Kb のフラグメントを得
た後、プラスミドベクター(pBLUESCRIPT SK ⁺ ) に挿入
してサブクローニングを行った。抗体遺伝子を含む大腸
菌コロニーをPCR にてスクリーニングし、プラスミドDN
A を精製した。このプラスミドについて,DyeDeoxy ^TM T
erminator Cycle Sequencing Kit(ABI社製) を用いてシ
ークエンスを行った。このＤＮＡ配列を図３と図４及び
図５に示した。図３はL 鎖のcDNA配列、図４及び図５
（なお、図４及び図５はひと続きのcDNA配列である。）
はH 鎖のcDNA配列をあらわす。塩基配列のうち、L 鎖の
非コーディング領域の３塩基が同定できないためN で示
した。またこの配列から推定した抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のア
ミノ酸を塩基配列の上段に記載した。またこの配列か
ら、抗体のH 鎖とL 鎖の可変領域の配列を決定した。 Ｌ鎖可変領域 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly Arg Ala Ala Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Ｈ鎖可変領域 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Ala Thr Leu Ser Leu Lys Cys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asn Asn Tyr Asp Trp Ile Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Val Ile Gly Glu Phe Glu Arg Gly Gly Arg Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Asn Asn Val Phe Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Phe Gly Pro Arg Phe Thr Trp Asn Tyr Leu Tyr Tyr Leu Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

【００３０】(3) ペプチドで刺激したラット肥満細胞か
らの抗ペプチド抗体によるヒスタミン遊離の抑制試験 Wistar系ラット（雄７週令) の腹腔内浸潤細胞を常法に
従って採取し、肥満細胞として使用した。肥満細胞(1x1
0⁶個) に構造式1 に示したペプチドを5x10^-5Mの濃度で3
7°C で30分間作用させると、ヒスタミンの遊離が観察
された。この時に抗ペプチド抗体を0.1mg/mlの濃度で共
存させると、ペプチドによるヒスタミン遊離は完全に認
められなくなり、当該抗体によるヒスタミン遊離抑制が
確認された。その結果を、図６に示した。なお、ヒスタ
ミンの定量はHistamine ReleaseTest（マイルス社製)
を用いて行った。

【００３１】

【発明の効果】本発明の実施により、アレルゲンで刺激
された肥満細胞や好塩基球へのケミカルメディエーター
遊離のシグナル伝達を抑制するヒト型モノクローナル抗
体およびこの抗体をコードするＤＮＡが提供される。こ
の抗体は抗原特異性が明らかなヒト型抗体であり、その
抗原結合部位である可変領域の塩基配列が特定されてお
り、医薬品や試薬として利用できる。

【００３２】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：10 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド

【００３３】配列番号:2 配列の長さ:234 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 不明 配列の種類: タンパク質 配列 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro -20 -15 -10 -5 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser -1 +1 5 10 Val Ser Pro Gly Gly Arg Ala Ala Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 15 20 25 Val Ser Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Gln Ala Pro 30 35 40 Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 45 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser 80 85 90 Ser Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly 95 100 105 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 110 115 120 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 125 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 160 165 170 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 175 180 185 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 190 195 200 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 205 210

【００３４】配列番号:3 配列の長さ:528 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 不明 配列の種類: タンパク質 配列 Met Asp Pro Leu His Lys Asn Met Glu His Leu Trp Phe Phe Leu Leu -25 -20 -15 Leu Val Ala Val Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln -10 -5 -1 +1 5 Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Ala Thr Leu Ser Leu Lys Cys 10 15 20 Ala Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asn Asn Tyr Asp Trp Ile Trp Val Arg 25 30 35 Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Val Ile Gly Glu Phe Glu Arg Gly 40 45 50 Gly Arg Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser 55 60 65 70 Leu Asp Thr Ser Asn Asn Val Phe Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr 75 80 85 Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr TYr Cys Ala Arg Gly Pro Phe Gly Pro 90 95 100 Arg Phe Thr Trp Asn Tyr Leu Tyr Tyr Leu Glu Ser Trp Gly Gln Gly 105 110 115 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 120 125 130 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 135 140 145 150 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 155 160 165 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 170 175 180 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 195 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 210 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly 215 220 225 230 Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp 235 240 245 Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr 250 255 260 Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro 265 270 275 Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 280 285 290 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 295 300 305 310 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 315 320 325 Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 330 335 340 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val 345 350 355 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 360 365 370 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 375 380 385 390 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 395 400 405 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 410 415 420 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 425 430 435 Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 440 445 450 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 455 460 465 470 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 475 480 485 Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 490 495 500

【図面の簡単な説明】

【図１】抗原として使用した合成ペプチドのHPLCパター
ンを示す。

【図２】発明の抗体を生産するハイブリドーマの培養上
清と抗原ペプチドの結合性を示す。

【図３】発明抗体のL 鎖のアミノ酸配列をコードするcD
NAの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。

【図４】発明抗体のH 鎖のアミノ酸配列をコードするcD
NAの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。（図５に続
く）

【図５】図４の続きで発明抗体のH 鎖のアミノ酸配列を
コードするcDNAの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。

【図６】ペプチドで刺激したラット肥満細胞からの抗ペ
プチド抗体によるヒスタミン遊離の抑制試験結果を示
す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/07 15/13 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 5/24 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/24 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 後藤 雅昭 栃木県下都賀郡石橋町大字下古山456−１ (72)発明者 小林 文枝 栃木県河内郡河内町大字下岡本3777−４

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＩｇＥ抗体のＣＨ４領域に存在し、
   アレルゲン感作された肥満細胞からのケミカルメディエ
   ーター放出のシグナルとなる下記ペプチドに示すアミノ
   酸配列を有するペプチドに対して結合性を有し、アレル
   ゲン刺激による肥満細胞からのヒスタミン遊離を抑制す
   ることを特徴とするヒト型モノクローナル抗体。 H-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-NH₂
2. 【請求項２】 ヒト型モノクローナル抗体のＨ鎖の可変
   領域のアミノ酸配列、Ｌ鎖の可変領域のアミノ酸配列が
   下記配列の一部または全部を含む配列を有する請求項１
   記載のヒト型モノクローナル抗体。 Ｌ鎖可変領域 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly Arg Ala Ala Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Ｈ鎖可変領域 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Ala Thr Leu Ser Leu Lys Cys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asn Asn Tyr Asp Trp Ile Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Val Ile Gly Glu Phe Glu Arg Gly Gly Arg Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Asn Asn Val Phe Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Phe Gly Pro Arg Phe Thr Trp Asn Tyr Leu Tyr Tyr Leu Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
3. 【請求項３】 ヒト型モノクローナル抗体のＬ鎖の全ア
   ミノ酸配列及びＨ鎖の全アミノ酸配列が下記の配列の一
   部または全部を含む配列を有する請求項１記載のヒト型
   モノクローナル抗体。 Ｌ鎖アミノ酸配列 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly Arg Ala Ala Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ｈ鎖アミノ酸配列 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Ala Thr Leu Ser Leu Lys Cys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asn Asn Tyr Asp Trp Ile Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Val Ile Gly Glu Phe Glu Arg Gly Gly Arg Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Asn Asn Val Phe Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Phe Gly Pro Arg Phe Thr Trp Asn Tyr Leu Tyr Tyr Leu Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
4. 【請求項４】 配列表配列番号２記載のアミノ酸配列を
   コードするＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列表配列番号３記載のアミノ酸配列を
   コードするＤＮＡ。