JP3457962B2 - 特定Ｆｃεレセプターのための免疫グロブリン変異体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 この発明は、アミノ酸配列変異体抗IgE抗体およびIgE
配列を含有するポリペプチドに関し、とりわけIgEアン
タゴニストおよびFcεR IおよびFcεR IIに対して識別
結合が可能なポリペプチドに関する。

IgEは、喘息、食物アレルギー、第Ｉ型過敏症および
広範囲で患う家族性瘻炎症などのアレルギー応答を媒介
する免疫グロブリン群の一つである。IgEは、Ｂ細胞に
より分泌され、Ｂ細胞の表面上に発現される。Ｂ細胞に
よって合成されたIgEは、短い膜結合領域により成熟IgE
配列に結合した経膜ドメインによりＢ細胞膜内に固着さ
れる（anchored）。IgEはまた、そのFc領域を介してＢ
細胞（および単核細胞、好酸球および血小板）の低親和
性IgEレセプター（FcεR II、以下、「FCEL」と称す
る）に結合する。哺乳動物がアレルゲンに暴露される
と、該アレルゲンに結合するIgEを合成するＢ細胞がク
ローン的に増幅される。このIgEが、今度はＢ細胞によ
って循環血流中に放出され、IgEはマスト細胞および好
塩基球の表面上に認められるいわゆる高親和性レセプタ
ー（FcεR I、以下、「FCEH」と称する）を介してマス
ト細胞および好塩基球により結合される。かくして、そ
のようなマスト細胞および好塩基球はアレルゲンについ
て感作される。該アレルゲンに次に暴露されると、これ
ら細胞上のFcεR Iと交差反応し、それゆえ臨床的過敏
症およびアナフィラキシーの原因であるヒスタミンおよ
び他の因子の放出が活性化される。

当該技術分野では、FCEL−結合IgEには結合し得るがF
CEH上に位置するIgEには結合し得ない抗体が報告されて
いる（たとえば、WO 89/00138および米国特許第4,940,7
82号参照）。これら抗体は、Ｂ細胞上に認められるIgE
または体内を遊離して循環しているIgEには結合するがF
CEHには結合せず、それゆえマスト細胞または好塩基球
を活性化しないであろうので臨床的に有利であることが
開示されている。加えて、免疫グロブリンの種々のアミ
ノ酸配列変異体、たとえば「キメラ」抗体および「ヒト
化」抗体が知られている（たとえば、米国特許第4,816,
567号;WO 91/09968;EP 452,508号；およびWO 91/16927
参照）。ヒト化抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来
する配列を最小しか含まない免疫グロブリン、免疫グロ
ブリン鎖またはそのフラグメント（Fv、Fab、Fab'、Ｆ
（ab'）_２または抗体の他の抗原結合配列など）であ
る。大部分においてヒト化抗体はヒト免疫グロブリン
（レシピエント抗体）であり、レシピエントの相補性決
定部位（CDR）からの残基が所望の特異性、親和性およ
び能力を有するマウス、ラットやウサギなどの非ヒト種
（ドナー抗体）のCDRからの残基で置換されているもの
である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのFv枠組み
残基が対応する非ヒト残基により置換されている。さら
に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたCD
Rもしくは枠組み配列のいずれにも認められない残基を
含有していてよい。これら修飾は、以下でさらに詳細に
記載するように、抗体性能をさらに洗練し最適化するた
めに行う。一価抗体および二特異的（bispecific）抗体
もまた本質的に知られている。

FCEHもまたFCELと同様、IgEの定常（Fc）ドメイン中
の認識部位に結合することが一般に理解される。これら
２つのレセプターに対するIgEの認識部位については、
これまでこの問題を解決するために向けられた相当の努
力にもかかわらず殆ど定められていない。

過去10年間の間に、IgE分子のどの部分がFcεR Iおよ
びFcεR IIへの結合に関与するのかを決定するために幾
つかの研究がなされている。本質的に３つのアプローチ
が試みられている。まず、IgE配列の特定部分に対応す
るペプチドをIgE−レセプター結合の競合インヒビター
として（バート（Burt）ら、Eur.J.Immun.17:437〜440
［1987］；ヘルム（Helm）ら、Nature、331:180〜183
［1988］；ヘルムら、Proc.Natl.Acad.Sci.、86:9465〜
9469［1989］；ベルセリ（Vercelli）ら、Nature、338:
649〜651［1989］；ニオ（Nio）ら、Peptide Chemistr
y、203〜208［1990］）、またはIgE−レセプター相互反
応をブロックする抗IgE抗体を産生させるために（バー
トら、Molec.Immun.24:379〜389［1987］；ロバートソ
ン（Robertson）ら、Molec.Immun.25:103〜113［198
8］；バニヤシュ（Baniyash）ら、Molec.Immun.25:705
〜711［1988］）用いられている。最も有効な競合ペプ
チドは、IgEよりも1000倍活性の低い配列であった（バ
ートら、Eur.J.Immun.17:437〜440［1987］）。

ヘルムら（Proc.Natl.Acad.Sci.、86:9465〜9469（19
89））は、IgE残基329〜409に対応するペプチドがイン
ビボでヒトIgE抗体によるヒト好塩基顆粒球の感作をブ
ロックすることを見いだした。さらに研究をしたとこ
ろ、残基395〜409は該329〜409ペプチドのFcεR Iへの
結合にとって本質的でないことが示された（ヘルムら、
Proc.Natl.Acad.Sci.、86:9465〜9469［1989］）。以下
に記載するIgE配列変異体はパドラン（Padlan）ら（Mol
ec.Immun.、23:1063（1986））の配列を有しているが、
本明細書に用いる免疫グロブリン残基番号はカバット
（Kabat）ら（Sequences of Proteins of Immunologica
l Interest（国立衛生研究所（National Institutes of
Health）、ベセスダ、メリーランド州、1987））のも
のであることに注意すべきである。

ベルセリら（Nature、338:649〜651（1989））は、ヒ
トIgEのＢ細胞（FcεR II）結合部位を調べるために組
換えIgEペプチド並びに抗Fcεモノクローナル抗体を用
いた。彼らは、FcεR II結合部位がK399−V402近くのFc
ε３内に存在すると結論した。

バートら（Eur.J.Immun.、17:437〜440（1987））
は、ラットマスト細胞への結合におけるラットIgEに対
する競合について７つのペプチドを調べた。彼らの最も
活性なペプチドであるp129はIgEよりも1000倍低い活性
であった。p129は、ループEFを含むヒト配列439〜453に
対応する。Fcε３ドメイン中の残基396〜419に対応する
彼らの他のペプチドであるp130は活性を有しなかった。

ロバートソンら（Molec.Immun.、25:103〜113（198
8））は、幾つかの合成ペプチドにより誘発された配列
特異的（sequence−directed）抗体によるIgE結合を評
価した。彼らは、彼らのε−ペプチド−４により定めら
れる配列（残基446〜460に対応）はレセプター結合に有
意に関与していないが、彼らのε−ペプチド−３により
定められる配列（残基387〜401に対応）はIgE−レセプ
ター認識部位の近傍に存在しそうだと結論した。

ニオら（Peptide Chemistry、203〜208（1990））
は、インビトロでのヒト好塩基球によるヒスタミン放出
を阻害する能力に関して多くのペプチドを評価した。一
つのペプチド（ペプチド２、表１）のみが特異的な阻害
を示した；このペプチドは残基376〜388を包含してい
た。しかしながら、この配列を含む一層大きなペプチド
（ペプチド３、表１）は阻害活性を有しなかった。

第二に、IgEにおける変異が部分的に探求されてい
る。シュバルツバウム（Schwarzbaum）ら（Eur.J.Immu
n.、19:1015〜1023［1989］、上記）は、点突然変異体P
404H（本明細書における番号付けによればP442H）はラ
ット好塩基白血病（RBL）細胞上のFcεR Iに対して２倍
減少した親和性を有していることを発見したが、この知
見の解釈は議論の多いものである（ウイートール（Weet
all）ら、J.Immunol.、145:3849〜3854［1990］）。

第三に、キメラ分子が構築されている。ヒトIgEはマ
ウスレセプターに結合しないが（クルツズツキー（Kulc
zycki Jr.）ら、J.Exp.Med.、139:600〜616［197
4］）、齧歯類のIgEはヒトレセプターに減少した親和性
にて結合する（コンラート（Conrad）ら、J.Immunol.、
130:327〜333［1983］）；ヒトIgG1はIgEレセプターに
結合しない（ウイートールら、J.Immunol.、145:3849〜
3854［1990］）。これら観察に基づき、幾つかの研究者
グループがヒト−マウスキメラまたはヒトIgE−IgGキメ
ラを構築した。ウイートールら（J.Immunol.、145:3849
〜3954（1990））は、一連のヒトIgG1−マウスIgEキメ
ラを作製し、Fcε２およびFcε３ドメインはマウスFcε
R Iへの結合に関与するが、Fcε４ドメインはマウスFc
εR Iへの結合に関与していそうにない（しかし、FcεR
IIへの結合には関与している可能性がある）と結論し
た。しかしながら、これら結論は不確かなものである。
というのは、彼らはキメラによる結合の不在に主として
頼っており、５つのキメラのうち３つは幾つかの鎖内ジ
スルフィド結合を欠いていたからである。

ニッシム（Nissim）ら（EMBO J.、10:101〜107（199
1））は、一連のヒト−マウスIgEキメラを構築してRBL
細胞への結合を測定し、RBL細胞上の特定Fcεレセプタ
ーに高親和性で結合するIgEの部分がFcε３に帰するこ
とができると結論した。

これら著者（たとえば、ヘルムらおよびバートら）に
より報告されている結果は首尾一貫していない。さら
に、抗IgE抗体の場合には、立体障害による非特異的な
ブロックの可能性を排除することは困難である（シュバ
ルツバウムら、Eur.J.Immun.、19:1015〜1023［198
9］）。IgEのFCEHの結合に関与するIgEのドメインまた
はFCEHへのIgE結合の原因であるIgEコンフォメーション
の維持に関与するIgEのドメインに関して、当該技術分
野で相当の混乱が存在することは明らかである。

この発明の目的は、FCELおよびFCEHへの識別結合が可
能なポリペプチドを同定することである。

本明細書における目的は、FCEHレセプター結合には係
るがFCELレセプター結合には関与しない（またはその
逆）IgEドメインを決定することである。

本明細書における他の目的は、FcεのFCEHまたはFCEL
レセプター結合ドメインを中和するアンタゴニストを含
む、アレルギー応答を阻害し得るアンタゴニスト、FCEL
には結合するがFCEHには結合しない免疫グロブリン類似
体もしくはFCEHには結合するがFCELには結合しない免疫
グロブリン類似体、およびFCEL結合IgEには結合するがF
CEH結合IgEには結合しないヒト化抗huIgE抗体もしくはI
gEには結合するがヒスタミン放出もしくはマスト細胞の
脱顆粒を誘発しないヒト化抗huIgE抗体を同定すること
にある。

発明の概要 本発明者らは、IgEをそのFCELおよびFCEHレセプター
に結合させるうえで重要な役割を果たすIgEのドメイン
および特定の残基を同定し、この情報に基づき、本発明
者らは、これら２つのレセプターのうちの一方のみに実
質的に結合することができるがこれらレセプターの他方
には実質的に結合することのできないポリペプチドを設
計した。これらポリペプチドは識別結合ポリペプチドと
称される。とりわけ、FCELに結合する識別結合ポリペプ
チドは、ループEFまたはβ鎖Ｄドメイン中の１またはそ
れ以上の残基が変化したIgE配列からなり、またFCEH−
結合ポリペプチドは、ループABおよび／またはβ鎖Ｂ配
列が変化したIgE配列からなる。逆に、本発明に含まれ
るのは、機能性のIgEループEFおよびβ鎖Ｄドメインか
らなるがループABおよび／またはβ鎖Ｂドメインは野性
型に比べて機能性が減少したある種のポリペプチド（FC
EHに識別的に結合する）、および機能性のループABおよ
びβ鎖Ｂドメインからなるがβ鎖Ｄおよび／またはルー
プEFドメインは野性型に比べて機能性が減少したポリペ
プチド（FCELに結合する）である。

この発明の識別結合ポリペプチドは、FCELまたはFCEH
に対する結合能を保持しているのでIgE H鎖のアミノ酸
配列と充分に相同性を有しているが、天然のIgEに比べ
てこれら２つのレセプターの一方に対して減少した結合
能を示す点で変異している。種々の態様において、この
発明のポリペプチドはさらに、細胞毒性ポリペプチド、
検出可能な標識、コンフォメーション制限基および／ま
たはIgEに異種のアミノ酸配列、たとえば以下にさらに
記載するようにレセプターまたは免疫グロブリンに由来
する配列を含む。他の態様において、識別結合ポリペプ
チドは、上記レセプター結合ドメインに加えて、たとえ
ば前以て決定された抗原を結合することのできる少なく
とも一つの可変ドメインを含む。他の態様において、識
別結合ポリペプチドは、前以て決定された抗原に対して
一価のIgE変異体である。さらに別の態様において、識
別結合ポリペプチドは、不活性なIgE可変ドメイン、す
なわちいかなる抗原とも結合することのできないものま
たは可変ドメインもしくは機能性のCDRを欠いたものを
含む。

この発明の識別結合ポリペプチドは、IgEレセプター
のための診断手順またはアレルギーなどのIgEに媒介さ
れた疾患の治療に有用である。該ポリペプチドはまた、
レセプター結合に参画するIgEの領域に結合することの
できる抗体を調製するのに有用である。

本発明は、とりわけ、FCEL−結合IgEには結合するこ
とができるがFCEH−結合IgEには実質的に結合すること
ができない抗体に関する。

一つの態様において、本発明は、FCEL−結合IgEには
結合することができるがFCEH−結合IgEには実質的に結
合することができない抗体であって、ヒトレシピエント
抗体の少なくともFab領域のＬ鎖の残基30、30b、30d、3
3、53、91、92、93および94およびＨ鎖の残基27、28、2
9、29a、31、33、34、50、52、53、54、55、58、95、9
7、98、99、100および101の一つまたはそれ以上を、ド
ナー抗体としての抗ヒトIgEマウスモノクローナル抗体M
AE11、MAE13またはMAE15中の対応位置の残基、またはMA
E11が有する特有を有する他のドナー抗体中の対応位置
の残基で置換してなり、その際、抗体中のアミノ酸残基
の番号付けはカバットらの番号付けに基づくものであ
り、該ドナー抗体MAE11は配列番号２および３にそれぞ
れ示すＬ鎖アミノ酸配列およびＨ鎖アミノ酸配列を有
し、該ドナー抗体MAE13は配列番号４および５にそれぞ
れ示すＬ鎖アミノ酸配列およびＨ鎖アミノ酸配列を有
し、該ドナー抗体MAE15は配列番号６および７にそれぞ
れ示すＬ鎖アミノ酸配列およびＨ鎖アミノ酸配列を有
し、MAE11が有する該特性が、可溶性IgEに結合するこ
と、IgE含有Ｂ細胞に結合すること、FCELおよびFCEHへ
のIgEの結合をブロックすること、インビトロでIgE産生
を抑制すること、およびIgEでコーティングされた好塩
基球には結合することができないことであることを特徴
とする抗体を提供する。

一つの好ましい態様は、ヒト化マウス抗体humae11 1
型、２型、３型、４型、５型、６型、７型、7a型、８
型、8a型、8b型または９型のFab H鎖およびＬ鎖配列を
含む抗体であって、その際、該humae11 1型は配列番号
８および９にそれぞれ示すＨ鎖アミノ酸配列およびＬ鎖
アミノ酸配列を有し、該humae11 2型〜９型は、下記表
９に示すように、該humae11 1型が有するＨ鎖アミノ酸
配列およびＬ鎖アミノ酸配列に対してさらに以下の修飾
を有することを特徴とする抗体である： （ａ）humae11 2型についてはV_L中にL4MおよびM33L; （ｂ）humae11 3型についてはV_L中にE55GおよびG57E; （ｃ）humae11 4型についてはV_H中にI37V; （ｄ）humae11 5型についてはV_H中にV24A; （ｅ）humae11 6型についてはV_H中にF78L; （ｆ）humae11 7型についてはV_L中にL4M、R24K、E55Gお
よびG57E、およびV_H中にV24A、I37V、T57S、A60N、D61
P、V63L、G65NおよびF78L; （ｇ）humae11 7a型についてはV_L中にL4M、R24K、E55G
およびG57E、およびV_H中にV24A、I37V、T57S、A60N、D6
1P、V63LおよびG65N; （ｈ）humae11 8型についてはV_H中にA60NおよびD61P; （ｉ）humae11 8a型についてはV_H中にA60N、D61P、V63L
およびF67I; （ｊ）humae11 8b型についてはV_H中にA60N、D61Pおよび
F67I; （ｋ）humae11 9型についてはV_L中にA13V、V19A、V58
I、L78VおよびV104L、およびV_H中にV48M、A49G、A60N、
V63L、F67I、I69V、M82LおよびL82cA （上記定義において抗体中のアミノ酸残基の番号付けは
カバットらの番号付けに基づくものである）。

他の好ましい態様は、配列番号８および９にそれぞれ
示すヒト化マウス抗体humae11 1型のFab H鎖アミノ酸配
列およびＬ鎖アミノ酸配列を含む抗体であって、残基60
がアスパラギン酸で置換され、残基61がプロリンで置換
され、残基67がイソロイシンで置換されていることを特
徴とする抗体である。

この発明の態様において、アレルギーおよび他のIgE
に媒介される疾患の診断または治療または予防に有用な
変異体抗IgE抗体が提供される。この発明の特定の態様
において、１または２以上のヒト（レシピエント）Ｌ鎖
残基４、13、19、24、29、30、33、55、57、58、78、9
3、94または104、またはＨ鎖残基24、37、48、49、54、
57、60、61、63、65、67、69、78、82、97または100
を、好ましくはドナー（一般にマウス）抗体中の対応位
置に認められる残基で置換することにより修飾した抗Ig
E変異体抗体が提供される。好ましい態様において、選
択される残基は、Ｌ鎖13、19、58、78または104、また
はＨ鎖残基48、49、60、61、63、67、69、82または82c
であり、最も好ましいのはＨ鎖残基60、61またはＬ鎖残
基78である。

他の態様において、本発明者らは、FCEL結合IgEには
結合することができるがFCEH結合IgEには実質的に結合
することができずマスト細胞または好塩基球からのヒス
タミンの放出を誘発するこのできない抗体を提供し、該
抗体は、マウス抗huIgE抗体MAE11、MAE13、MAE15または
MAE17のカバットCDRドメインからの位置的に類似の残基
が置換されたヒトカバットCDRドメインを含む。二特異
的抗体およびIgE一価抗体；およびIgEに対してMAE11の
約0.1〜100倍の新和性を示すヒト化抗体もまた本発明に
おいて提供される。

図面の簡単な記載 図１は、ヒトIgE Fcε２およびFcε３の配列を示す
（SEQ.ID.1）。この特定の配列は、パドランら（Molec.
Immun.、23:1063〜1075（1986））からのものである。
残基の番号付けはカバット（上記）に従った。パドラン
IgE配列をカバットの番号付け方式と整合するために
「Ｘ」残基を含めてある。種々のIgE変異体を調製する
に際して変化させた配列には下線を引いてある；下線の
下の太い数字は、変異体の番号を示す。β鎖残基には、
上に線を引いてある；ループ残基は、２つのβ鎖の間に
介在するすべての残基として定義される。

図２は、MAE11（SEQ.ID.2および３）、MAE13（SEQ.I
D.4および５）およびMAE15（SEQ.ID.6および７）のＬ鎖
およびＨ鎖配列を示す。

図３は、humae11 1型のＨ鎖およびＬ鎖配列（SEQ.ID.
8および９）を示す。同図のＬ鎖において下線を付した
「DYDGD」の配列は、30、30a、30b、30cおよび30dの位
置の残基に対応する。

図4aおよび4bは、それぞれ、マウスモノクローナル抗
体Mae11並びに３つのヒト化変異体（１型、８型および
９型）による、FCELレセプターおよびFCEHレセプターへ
のIgE結合の阻害％を示す。

図5a〜5dは、種々のhuIgE変異体へのMAE11、MAE15お
よびMAE17抗体の結合を比較する。MAE1は、Ｂ細胞結合I
gEおよびマスト細胞結合IgEの両方に結合するコントロ
ールとして提供されている。各図面中の四角の囲みの中
に載せた変異体は表11で同定される。

発明の詳細な記載 この発明のIgE類似ポリペプチドは、天然に存在するI
gEの配列と相同なアミノ酸配列を含有しており、FCELま
たはFCEHに特異的または識別的に結合するが種々の程度
に両方には結合しない能力を有する。そのようなポリペ
プチドの野性型IgEに対する相同性の程度は重要ではな
い。というのは、IgEがこれら２つのレセプターの一方
に識別的または特異的に結合するのを可能にするのに充
分なIgE配列のみを保持する必要があるからである。一
般に、この発明のポリペプチドはIgE Fc類似体であり、
天然に存在するIgE H鎖Fc領域のポリペプチド配列とお
よそ80％〜99％相同であろう。相同性は、すべての置換
（保存的であると非保存的であるとを問わず）を非相同
であるとし、最大の相同性を得るために配列を整合する
従来法により決定する。

本明細書において言及するIgE Fc残基の番号付けはカ
バットのものであることが理解されるであろう。この発
明の残基に関する教示を他のIgE Fcドメインに適用する
に際しては、残基を整合し残基番号を相関させるために
候補配列の全体を図１の配列と比較する必要があるであ
ろう。加えて、所定のカバット部位番号におけるある個
々の残基の同定は、種間相違または対立遺伝子相違のた
めにIgE毎に変化するかもしれない。たとえば、残基R38
3（ヒトIgE）に置換が導入されると言う場合には、この
ことはIgE内の同じ部位に置換が導入されることを意味
し、それはたとえこの同じ部位（ループAB中）が異なる
残基番号に位置していたりカバットによって記載される
ものとは異なる残基によって親のIgEまたは最初のIgE中
で表されていてもそうであることが理解されるであろ
う。しかしながら、明瞭および単純にするため、本明細
書ではカバットのヒトIgE H鎖配列の残基番号および同
定を用いるであろう。幾つかのカバット残基はパドラン
配列中で欠けており、この場合には「Ｘ」と称するスペ
ーサー残基の挿入によりカバットの番号付けを保存する
ことに注意すべきである（図１参照）。

同様に、変異体、たとえばヒト化抗IgE免疫グロブリ
ン（IgG、IgE、IgAまたはIgDなど）の調製に用いる免疫
グロブリン残基を明示するにもカバット系を用いる。好
ましい態様において、レシピエントのヒト免疫グロブリ
ン部位の番号付けはカバットサブグループIII（V_H）共
通配列およびκサブグループＩ（V_L）共通配列に従って
行う。どのドナー残基がこれらカバット共通残基に対応
するかを決定するため、必要ならギャップを導入し、可
変ドメインのシステイン残基を主要は道標として用いる
配列を最大限に整合させる。CDRsは抗体毎に相当変化す
る（そして定義によってカバット共通配列と相同性を示
さないであろう）ことに注意すべきである。枠組み残基
（とりわけシステイン）の最大整合は、ドナー抗体のF_v
領域に使用すべく、番号付け系において「スペーサー」
残基の挿入を必要とするであろう。たとえば、以下で言
及される残基「29a」。これは、対応残基が該共通配列
中に存在しないが共通配列とドナー配列との最大の整合
を得るために必要なマウスドナー抗体V_H1CDR中に認めら
れる余分の断基を表す。実際には、このドナーからヒト
化抗体（１型）を調製する場合には、それは残基29aを
有するV_H1を含有するであろう。

この発明の識別結合ポリペプチドは、一般にIgE H鎖F
c領域に相同な約５〜250残基を含有するが、通常は約10
〜100のそのような残基を含有するであろう。通常、IgE
Fc3およびFc4領域が存在するであろうが、Fc3ドメイン
はレセプター結合に直接関与する残基を提供し、Fc4は
コンフォメーションの完全性を保証するために存在す
る。

一般に、該IgEはヒトIgEであるが、ラット、マウス、
ウマ、ウシ、ネコまたはブタIgEなどの動物IgEも含まれ
る。上記で記載したように、図１の配列と比較したとき
にこれらIgEには残基の同定および番号付けにおいて変
異が存在するであろう。

FCEHおよびFCELは、それぞれ、マスト細胞または好塩
基球上に認められる高親和性IgEレセプター（FCεR I、
イシザカ（Ishizaka）ら、Immunochemistry、7:687〜70
2［1973］）、および単核球、好酸球および血小板など
の炎症に関与する細胞並びにＢ細胞上に認められる低親
和性レセプター（FCεR II、またはCD23）（カプロン
ら、Immun.Today、7:15〜18［1986］）として定義され
る。FCEHおよびFCELには、IgEに結合する対立遺伝子お
よび前決定アミノ酸配列変異体が含まれる。FCEHには幾
つかのポリペプチド鎖が含まれるが、IgEに結合するFCE
Hの部分はα鎖であるので、アッセイする必要のあるの
は候補ポリペプチドのそのα鎖への結合がすべてであ
る。

識別結合とは、相同な天然IgEが結合する程度の少な
くとも約75％の範囲でFCELまたはFCEHの一方に結合する
が、他方のレセプターには相同なIgEが該他方のレセプ
ターに結合する程度の約20％以上では結合しないことを
意味する。結合は実施例３のアッセイにより決定する。
この発明に含まれるのは、これら２つのレセプターの一
方に天然のIgEよりも大きな程度で結合することのでき
るポリペプチドである。

FCEL特異的ポリペプチド これらポリペプチドは、低親和性レセプターに優先的
に結合する。これらポリペプチドは、一般に、β鎖Ｄド
メインまたはループEF内の残基が置換または欠失してい
るか、および／またはそのような残基の一つに隣接して
他の残基が挿入されたFcε３配列を含む。本発明の目的
において、β鎖ＤドメインはN418−X431の範囲であり
（図１、ＸはU266 IgEからは省かれているがカバット配
列には認められる残基を示す）、ループEFはG444−T453
の範囲である。好ましいFCEL特異的態様は変異体６（表
６）であり、ヒトIgE H鎖配列K423−R428内の４残基の
置換が実質的にFCEH結合を破壊している。EFループ変異
を含む他のFCEL特異的態様は、特異体85、89、および4
9、51、52、83、86および87の組み合わせである。これ
ら部位（ＤおよびEFドメイン）は、IgEのFCELへの結合
に関与する主要な部位であると思われる。しかしなが
ら、これらβ鎖ＤおよびループEFドメインが主要な突然
変異誘発の標的であることが理解されれば、当業者であ
れば本実施例に示した方法を用いて最適のFCEL特異的ポ
リペプチドをありきたりにスクリーニングすることがで
きるであろう。

好ましいFCEL特異的ポリペプチドは、β鎖Ｄドメイン
またはループEFまたは両者内で残基が置換または欠失し
たものである。たとえば、変異体６を生成するために４
つの残基が置換されたが、これら置換のうちの一つまた
はそれ以上がFCEL結合を保持しながらFCEH結合を失わせ
ているのかもしれない。ループEF（FCELおよびFCEH結合
の両方に関与している）に関しては、FCEL特異的IgE変
異体を選択するために両方の活性をスクリーニングする
のが望ましい。たとえば、変異体85（９つのIgE残基
が、類似して位置するIgG残基によって置換されてい
る）はFCEHへの結合は検出できないがFCELには結合する
（表11参照）。他方、部位444をGlyからLeuに変換する
といずれのレセプターへの結合も破壊されるが、部位44
7および452は両レセプターへの結合に関与している。と
いうのは、これら位置で変化が起こるとFCELへの結合が
妨げられるがFCEH結合は破壊されないからである。

FCEL特異性のためのβ鎖Ｄ変異体 一般に、Ｄドメインの置換は非保存的である、すなわ
ち、置換された残基は一般に相同な天然IgE内に認めら
れるものと電荷、疎水性または大きさ（bulk）において
実質的に異なっている。一般に、14のβ鎖Ｄドメイン残
基のうち最大４つを変化させる（通常、残基423、424、
426および／または428）が、一般にこれら残基のいずれ
か１〜５が変化に適している。一般にわずかに４つの残
基を変化させる必要があるが、最適には一つだけを変化
させるであろう。

K423および／またはK426は、Arg、His、Cys、Met、Ph
e、Tyr、Trp、Pro、Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Ser、Th
r、Asp、Glu、GlnおよびAsnよりなる群から選ばれた残
基のいずれか、好ましくはGly、Pro、Glu、GlnおよびAs
pよりなる群から選ばれた残基のいずれか、最も好まし
くはProまたはGlnで置換される。

E424および／またはE425は、Asp、Asn、Gln、His、Ly
s、Arg、Cys、Met、Phe、Tyr、Trp、Pro、Gly、Ala、Va
l、Leu、Ile、SerおよびThrよりなる群から選ばれた残
基のいずれか、好ましくはArg、Lys、Pro、GlyおよびHi
sよりなる群から選ばれた残基のいずれか、最も好まし
くはArgで置換される。

R428および／またはR422は、Cys、Met、Phe、Tyr、Tr
p、Pro、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asp、Gl
u、Asn、Gln、HisおよびLys、好ましくはCys、Met、Ph
e、Tyr、Trp、Pro、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Th
r、Asp、Glu、AsnおよびGln、最も好ましくはTyrで置換
される。

T421は、Cys、Met、Phe、Tyr、Trp、Pro、Gly、Ala、
Val、Len、Ile、Ser、Asp、Glu、Asn、Gln、HisおよびL
ys、好ましくはMet、Phe、Tyr、Trp、Pro、Gly、Ala、V
al、Leu、Ile、Asp、Glu、Asn、Gln、HisおよびLys、最
も好ましくはPhe、Trp、Pro、Gly、Ala、Val、Lenおよ
びIleで置換される。

S420は、Met、Phe、Tyr、Trp、Pry、Gly、Ala、Val、
LeuおよびIle、好ましくはProまたはGlyで置換される。

X429は、天然に存在する他のいずれのアミノ酸残基で
も置換される。

最適の識別およびFCEL結合活性は、変異の組み合わせ
によって達成されるであろうと思われる。好ましくは、
FCEHまたはFCEL結合は天然の相同IgEの10％未満であ
り、場合により検出不能から天然の相同IgEの３％の範
囲であり、一方、他のレセプターへの結合は天然の相同
IgEの少なくとも約75％から90％、好ましくは95％から1
00％以上、たとえば125％の範囲であろう。変異は可能
な限り保存的であるべきである、すなわち疎水性、電荷
または大きさの変化が可能な限り穏やかでありながら、
なおこれら識別結合特性を示すポリペプチドが得られる
べきである。

β鎖Ｄドメイン残基のいずれか一つまたはそれ以上が
欠失していてもよい。残基の欠失は、IgE類似体中に免
疫原となる可能性のある部位を導入しないという利点を
有する。

β鎖Ｄドメイン置換または欠失変異体候補の例を下記
表１に示す。各変異体の配列を決定するには、各部位の
下の各変異体番号について残基を同定されたい。たとえ
ば、化合物19の配列はC388 E389 E390などからなる。

β鎖Ｄドメイン内の残基に隣接して１または２以上の
外来残基を挿入することも本発明の範囲に包含される。
一般に、わずかに一つの残基を挿入するが、該ドメイン
内のいずれか一つの部位に隣接して２〜４またはそれ以
上の残基を挿入することもできる。免疫原部位の導入を
回避するため、挿入する残基の数は小さい方が好ましい
であろう。しかしながら、このことは単なる選択の問題
にすぎない。一般に、挿入は単一の部位で行うが、いず
れかの２またはそれ以上のβ鎖Ｄドメイン残基に隣接し
て挿入を行うこともできる。

挿入は一般に下記残基の間に行う:422と423、423と42
4、424と425、425と426、426と427、427と428および／
または428と429。挿入した残基は、一般に、両側の残基
とは異なる電荷、大きさまたは疎水性特性を示すであろ
う。たとえば、挿入候補は下記表２から選択することが
できる。

FCEL特異的ポリペプチドは、実質的にFCEL結合を達成
するのに必要なだけのIgE FcεAB−ＢおよびループEFド
メイン配列を含有しておりさえすればよい。このこと
は、AB−ＢおよびループEFドメインを含むポリペプチド
を調製し、両側または通常介在される残基、たとえばβ
鎖Ａ（Ｎ末端）またはループBC、β鎖Ｃ、ループCD、β
鎖Ｄ、ループDE、β鎖Ｅ、β鎖Ｆ、ループEF、ループF
G、β鎖Ｇ、およびFcε４（Ｃ末端）の数を増加させて
いくことにより容易に決定することができる。一般に、
Fcε３〜Fcε４の全IgE配列を用いるが、とりわけAB−
Ｂドメイン、ループEFおよび介在配列を含有する場合に
はAB−Ｂドメインを含有するFcE3のフラグメントで満足
できるものであり、他はFCELに対する特異性を達成する
ための本発明の教示に従って変化させてよい。

FCEL特異的ポリペプチドは、直線状またはコンフォメ
ーションが制限されたポリペプチドとして提供される。
コンフォメーション的な制限は、好ましくは環状構造を
生成するようにＮ末端またはＣ末端でポリペプチドを架
橋することにより達成する。好ましい態様において、該
環状の形態は下記構造を有する： 上記式中、（a3−a11）は結合または配列−R373−F381
であり;a12およびa18は疎水性アミノ酸残基であり;a13
およびa14は塩基性アミノ酸残基であり;a15、a17および
a19は親水性アミノ酸残基である;R₁は （ａ）ヒドロキシ、 （ｂ）C₁−C₈アルコキシ、 （ｃ）C₃−C₁₂アルケノキシ、 （ｄ）C₆−C₁₂アリールオキシ、 （ｅ）アシルアミノ−C₁−C₈−アルコキシ、 （ｆ）ピバロイルオキシエトキシ、 （ｇ）C₆−C₁₂アリール−C₁−C₈−アルコキシ（式中、
アリール基は非置換であるかまたはニトロ、ハロ、C₁−
C₄−アルコキシおよびアミノ基の１または２以上で置換
されている）； （ｈ）ヒドロキシ置換C₂−C₈置換アルコキシ；および （ｉ）ジヒドロキシ置換C₃−C₈アルコキシ から選ばれる； R₂、R₃、R₅、R₇、R₈は同じかまたは異なり、 （ａ）水素、 （ｂ）C₆−C₁₂アリール（式中、アリール基は非置換で
あるかまたはニトロ、ヒドロキシ、ハロ、C₁−C₈アルキ
ル、ハロ−C₁−C₈アルキル、C₁−C₈アルコキシ、アミ
ノ、フェニル、アセトアミド、ベンズアミド、ジ−C₁−
C₈アルキルアミノ、C₆−C₁₂アロイル、C₁−C₈アルカノ
イル、およびヒドロキシ置換C₁−C₈アルキル基の１また
は２以上で置換されている）、 （ｃ）C₁−C₁₂アルキルまたはアルケニル;C₃−C₁₀シク
ロアルキルまたはC₃−C₁₂（ハロ、C₁−C₈アルコキシ、C
₆−C₁₂アリールオキシ、ヒドロキシ、アミノ、アセトア
ミド、C₁−C₈アルキルアミノ、カルボキシまたはカルボ
キサミドのいずれかで置換されている）； R₂とR₃、R₅とR₆、またはR₇とR₈は、任意におよび独立に
一緒になって４〜７原子（ヘテロ原子はＯ、Ｓ、または
NR₁₀（式中、R₁₀は水素、C₁−C₈−アルキル、C₂−C₈−
アルケニル、C₆−C₁₂−アリール、C₃−C₁₀シクロアルキ
ル、C₆−C₁₂−アリール−C₁−C₈−アルキル、C₁−C₈−
アルカノイル、およびC₆−C₁₂アロイルから選ばれる）
から選ばれる）の炭素環またはヘテロ環を形成する、 R₄は、水素、C₁−C₈−アルキル、C₂−C₈−アルケニル、
C₆−C₁₂−アリール、C₃−C₁₀シクロアルキル、C₆−C₁₂
−アリール−C₁−C₈−アルキル、C₁−C₈−アルカノイ
ル、およびC₆−C₁₂アロイルから選ばれる； R₂またはR₃は、任意にR₄と一緒になってピペリジン、ピ
ロリジンまたはチアゾリジン環を形成する； Ｘは、ＯまたはＳ原子、NR₉（式中、R₉は水素、C₁−C₈
−アルキル、C₃−C₈−アルケニル、C₃−C₁₀シクロアル
キル、C₆−C₁₂−アリール、C₆−C₁₂−アリール−C₁−C₈
−アルキル、C₁−C₈−アルカノイル、またはC₆−C₁₂ア
ロイルから選ばれる）、C₆−C₁₂アリール、C₁−C₈アル
カノイルおよび（CH₂）ｋ（式中、ｋは０〜５の整数）
から選ばれる；および薬理学的に許容し得るその塩。

本明細書において特に断らない限り、アルキルおよび
アルケニルは、それぞれ、直鎖または分枝鎖の飽和また
は不飽和炭化水素鎖を示し;C₆−C₁₂アリール基は、たと
えばフェニルやナフチルなどの非置換の芳香族環または
縮合した芳香族環を示し；ハロは、Ｆ、Cl、BrまたはＩ
原子を示し；アルコキシは指示された部位にＯを介して
結合したアルキル基を示す。C₁−C₈アルキルまたはC₂−
C₈アルケニル基の例としては、メチル、エチル、プロピ
ル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イ
ソペンチル、ヘキシル、ビニル、アリル、ブテニルなど
が挙げられる;C₃−C₁₀−シクロアルキル基の例として
は、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル
などが挙げられる；ヘテロ環としては、ピリジル、チエ
ニル、フリル、インドリル、ベンズチエニル、イミダゾ
リル、チアゾリル、キノリニルおよびイソキノリニルが
含まれるがこれらに限られるものではない。疎水性アミ
ノ酸残基としては、疎水性側鎖を有する天然に存在する
または合成の残基、たとえばPhe、Leu、Ile、Val、Norl
euなどが含まれる。親水性アミノ酸残基としては、荷電
したまたは非荷電の親水性側鎖を有する天然に存在する
または合成の残基、たとえばオルニチン、Ser、Thr、Ty
r、His、Asp、Glu、LysおよびArgなどが含まれる。好ま
しくはa15、a17およびa19は変化させないかまたは直
鎖、第二級または第三級のモノもしくはジヒドロキシ置
換アルキル側鎖を有する。塩基性アミノ酸は、たいてい
の場合、グアニジノまたはアミノ置換側鎖を有する。

この発明のAB−Ｂドメインおよび／またはループEFを
含有するFCEL特異的なポリペプチドは、場合により他の
物質と結合しているかまたは別のポリペプチドと融合し
ている。この発明のポリペプチドは一般にIgE相同な配
列のみを含有するが、診断に使用するために標識してい
てもよい（酵素、放射性同位元素、ビオチンまたはアビ
ジン、安定なフリーラジカル、および化学ルミネセンス
もしくは蛍光残基を通常の方法で用いて）。この発明の
ポリペプチドはまた、非IgEポリペプチド（細胞毒性ま
たは免疫抑制ポリペプチドなど）、他のIgEポリペプチ
ド（たとえば、Fv領域）、または前以て決定したリガン
ドもしくは抗原に結合することのできるポリペプチドと
融合させてもよい。

細胞毒性ポリペプチドとしては、IgG Fcエフェクター
配列およびポリペプチド毒素（ジフテリア毒素またはリ
シンＡ鎖など（米国特許第4,714,749号および同第4,86
1,579号））が挙げられる。好ましい融合は、FCEL特異
的配列（変異体６のFcε３−Fcε４配列のものなど）が
そのＮ末端（すなわち、およそD360）において免疫グロ
ブリンのＣ末端に、またはIgG Fcγ２またはIgG Fcγ３
のＣ末端で終わる免疫グロブリンフラグメントに融合し
たものである。別態様として、FCEL特異的ポリペプチド
は、公知の免疫吸着と類似の仕方でIgG Fvドメインの一
方または両方の代わりにエフェクターIgG配列に融合す
る。

本発明のポリペプチドは、任意に、前以て決定した抗
原またはリガンドと結合することのできるポリペプチド
と融合させる。一般に、これら別のポリペプチドはIgE
または他の免疫グロブリンFvドメインであろうが、任意
にレセプター細胞外ドメイン（たとえばCD4で行われる
ように、免疫吸着の公知の仕方で生成される）などの異
種ポリペプチドであってよい。本発明のFCEL特異的ポリ
ペプチドに融合する免疫グロブリン配列としては、Fcま
たはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM、IgDまたはIgA
のＨ鎖の可変配列が挙げられる。FCEL特異的Ｈ鎖融合
は、任意に、同じ特異性を有するＨ鎖に（ホモポリマー
の生成）、または異なるＨ鎖（異なる抗原に対する特異
性を有する異なるＨ鎖を含む）（ヘテロポリマーの生
成）に通常の仕方でジスルフィド結合する。そのような
ヘテロポリマー性Ｈ鎖にはFCEL特異的でないＨ鎖が含ま
れ、たとえば、これらＨ鎖はFCELおよびFCEHに通常の仕
方で結合する天然IgE配列を含むか、またはこれらＨ鎖
は任意にFCEL特異的な少なくとも一つのＨ鎖とFCEH特異
的な少なくとも一つのＨ鎖を含む。ヘテロポリマー性Ｈ
鎖はまた、非IgE免疫グロブリン、たとえばIgG、IgD、I
gMなどのＨ鎖を含んでいてよい。加えて、Ｈ鎖ヘテロま
たはホモポリマーはまた、前以て決定した抗原に通常の
仕方で協力的に結合することができるように、天然免疫
グロブリンの仕方でＬ鎖に任意にジスルフィド結合して
よい。ヘテロポリマー性Ｈ鎖がIgM H鎖を含むのでない
限り、一般にヘテロダイマーであろう。

幾つかの態様において、FCEL特異的なポリペプチドを
含む免疫グロブリンはまた、免疫グロブリンの可変領
域、好ましくは（いやしくも含有するなら）IgE Fvドメ
インをも含有するであろう。可変領域の抗原特異性は、
ハプテンに結合するものや、ヒト、動物、植物、真菌、
細菌または昆虫源からのポリペプチドやタンパク質に結
合するものを含み、広範囲に変わってよい。特異性は知
られていなくてよいし、または可変領域は前以て決定し
た抗原に結合する能力を有していてもよい。免疫グロブ
リンが機能性の可変ドメインを有すべき場合には（Fce3
またはFce4フラグメントの場合の欠失したFvとは異な
り）、抗原特異性が知られている方が好ましい。抗原特
異性には、細胞毒性または免疫応答に関与する抗原、と
りわけCD3やCD8などのリンパ球抗原、インテグリン、Ｂ
細胞表面抗原、ヘルパーまたはサプレッサー細胞表面抗
原、またはIgGのエフェクターサブタイプの可変領域中
に位置するエピトープなどに結合する能力が含まれる。
患者がアレルギーである特定のアレルゲンと結合するこ
とのできるFCEL特異的なFcドメインもまたFvドメインと
組み合わせて用いることも有用である。これらは一般
に、アレルゲンに対して向けられたヒトIgEであり、FCE
L特異的なFcドメインを含有する。別の態様として、免
疫グロブリン特異性をIgGのエフェクターサブタイプのF
c領域に対して向けるが、この場合には、FCEL特異的ポ
リペプチドは該IgGの補体結合またはADCC機能を抑制し
ないのが好ましい。

抗原またはリガンド結合能を有するこの発明のポリペ
プチドは、該抗原またはリガンドに結合することのでき
る１またはそれ以上の部位を有する。たとえば、本発明
のポリペプチドは、１またはそれ以上のIgEまたは他の
免疫グロブリンのFvドメインを含み、一価または多価免
疫グロブリンを生成する。たいていの場合、そのような
ポリペプチドは、抗原に結合することができないように
免疫グロブリンが欠失したまたは不活化したFvまたはCD
Rを有するＨ−Ｌ鎖ペアを含む場合のように、抗原また
はリガンドに対して一価であるであろう。別の態様とし
て、優勢な場合には該ポリペプチドは二価であり、単一
特異的または二特異的であろう。

他の態様において、FCEL特異的ポリペプチドは、細胞
毒性因子に共有結合で結合する。たとえば、リシヌス・
コムニス（Ricinus communis）植物から単離したポリペ
プチドリシンＤ毒素を、化学的手段によるか、または最
も好ましくは標準組換えDNA法を用いて融合タンパク質
を製造するかのいずれかにより、Fcドメインのカルボキ
シ末端に結合させる。このことにより、細胞表面上にFC
ELを発現している細胞にのみ毒素を選択的に送達する手
段が得られる。

FCEL特異的ポリペプチドは、FCEL結合を実質的に維持
するのに要するだけのIgE Fcε配列を含有しておればよ
い。このことは、生成物を合成または発現させ、その活
性を測定することにより容易に決定される。一般に、Fc
ε２−Fcε４の範囲の全IgE配列を用いることができる
が、FcE3およびFcE4のみを含有するフラグメントも一般
に満足のいくものである。

一般に、免疫グロブリン配列およびFCEL特異的配列
は、IgE類似体で処置しようとする種と同じ種に由来す
るものであろう。好ましくは、免疫グロブリン配列はヒ
トのものである。

この発明のFCEL特異的ポリペプチドは（非IgE配列と
融合することなくそのままで用いる場合には）、ニオら
（上記）により開示された直線状ポリペプチド配列、並
びに天然のIgE AB−ＢドメインまたはループEFを含有す
る他の従来技術のポリペプチド（バートら、上記）を排
除する。

FCEH特異的ポリペプチド これらポペプチドは、AB−ＢまたはループEFドメイン
がもはやFCELに結合することができないようにAB−Ｂま
たはループEFドメイン内の残基が欠失、置換されまたは
他の残基が挿入されており、高親和性レセプターに結合
するに充分なβ鎖Ｄ配列および（任意に）ループEF配列
を含有する、IgEまたはそのフラグメントのアミノ酸配
列変異体である。上記で開示したように、AB−Ｂおよび
ループEFドメインはFCELへの結合に関与していた。とい
うのは、これらドメインにおける変異はIgE変異体の低
親和性レセプターへの結合に対して重篤な影響を及ぼす
からである。とりわけ、ループEFまたはABループのＣ末
端側半分における変異およびβ鎖ＢのＮ末端側半分にお
ける変異は、IgEのFCEL/FCEH特異性に逸脱を生じさせ、
この変異体は高親和性レセプターには結合し続けるが低
親和性レセプターにはほとんど結合することができな
い。加えて、本発明者らは、IgEのループEFおよびＨ鎖
のβ鎖Ｄドメインが高親和性レセプターへの結合に関与
することを見いだした。それゆえ、FCEH特異的な識別結
合ポリペプチドは、少なくともβ鎖ＤのFCEH結合性配列
および好ましくは実質的にFCEHにのみ結合する変異体の
AB−ＢまたはループEFドメイン配列を含有しているであ
ろう。

好ましい態様において、AB−ＢまたはループEFドメイ
ンの低親和性レセプター結合機能中にアミノ酸配列変異
が導入される。好ましくは、残基I382、R383、K384、S3
85、T387、I388、T389、C390、R446、D447、W448、I44
9、E150、G151、E152またはT153の一つまたはそれ以上
が変えられるが、ループAB N末端内に指定したループAB
残基に任意に修飾が導入される。R383、K384、S385、T3
87、Ｔ−389、またはR446−T453のうち一つのみを変異
させさえすればよいが、各ドメインから１、２または３
の残基を変えるのが好ましい。

いやしくも置換する場合は、一般にI382および／また
はI388を独立にAsn、Gln、Leu、Val、His、Lys、Arg、M
et、Phe、Tyr、Trp、Pro、Gly、Ala、Ser、Thr、Aspま
たはGlu、好ましくはTrp、Pro、Gly、Ser、Thr、Aspま
たはGluで置換する。通常、これら２つの残基は修飾し
ない。

R383は、一般にCys、Met、Phe、Tyr、Trp、Pro、Gl
y、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gl
n、HisまたはLys、好ましくはMet、Phe、Tyr、Trp、Pr
o、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asp、Glu、As
nまたはGln、最も好ましくはAla、Glu、AspまたはSerで
置換する。

K384は、一般にArg、His、Cys、Met、Phe、Tyr、Tr
p、Pro、Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Ser、Thr、Asp、Gl
u、GlnおよびAsn、好ましくはAla、Gly、Pro、Glu、Gln
またはAsp、最も好ましくはAla、GluまたはAspで置換す
る。

S385は、Asp、Asn、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Met、
Phe、Tyr、Trp、Pro、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Gluお
よびThr、好ましくはAla、Tyr、Val、Ile、Leu、Phe、A
rg、LysおよびHis、最も好ましくはAla、Val、Ile、Le
u、PheおよびTyrで置換する。

置換する場合には、P386は通常、Gly、Ala、Cys、Va
l、Leu、Ile、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、His、Ly
s、Arg、Phe、Tyr、またはTrp、好ましくはGly、Ala、S
er、Thr、Asn、Glu、Asn、Gln、His、Lys、ArgまたはTr
pで置換する。通常、P386は修飾しない。

T387および／またはT389は、一般に独立にGly、Ala、
Val、Leu、Ile、Ser、Asp、Pro、Glu、Asn、Gln、His、
Lys、Arg、Cys、Phe、TyrおよびTrp、好ましくはGly、A
la、Val、Leu、Ile、Asp、Glu、Asn、Gln、His、Lys、A
rg、Phe、TyrおよびTrp、最も好ましくはAlaで置換す
る。

C390は、通常、式Ｉに示すように環状化基の成員とし
て用いる場合以外は置換しない。

この発明の識別FCEH結合性ポリペプチドは、上記のよ
うに機能性のFCEH結合性β鎖ＤおよびループEFドメイン
の配列を含むであろう。一般に、これら機能性ドメイン
はβ鎖ＤまたはループEFドメイン残基のすべてを含む必
要はない。しかしながら、いやしくも修飾を施すなら、
FCEH結合を保存するためにβ鎖Ｄドメイン残基の修飾は
保存性である必要があるであろう。ループEFはFCEL結合
およびFCEH結合の両方に関与するので、実施例５に示す
ようにその活性を決定するためにこれら変異体をスクリ
ーニングする必要があるであろう。しかしながら、たと
えば変異体50および52のように、FCEH結合を明らかに妨
害することなくFCEL結合を実質的に破壊する幾つかのル
ープEF変異体がすでに同定されている。それゆえ、ルー
プEF変異体はFCEL特異的カテゴリーまたはFCEH特異的カ
テゴリーのいずれかに属する、すなわち各レセプターへ
の結合に等しく影響を及ぼす。

FCEH特異的ポリペプチドの特に好ましい態様は、他の
Ｃ末端配列とともにβ鎖Ｄドメインを含有するものであ
る。この態様の配列は、およそT421からおよそT440の範
囲である。一般に、この態様のＮ末端はS420またはT421
であり、Ｃ末端はT440、L441またはP442である。加え
て、この配列とは外来の１または２以上の残基が該配列
のＮ末端またはＣ末端に融合している。これら外来配列
は、このポリペプチドのＮ末端とＣ末端との間で共有結
合または非共有結合を形成するうえで特に有用である。
これらＮ末端および／またはＣ末端は、残基の側鎖によ
りまたはポリペプチド主鎖により共有結合しているのが
好ましい。たとえば、システイン残基がＮ末端またはＣ
末端に融合し、酸化されてその末端を連結する末端ジス
ルフィド結合を有するポリペプチドが生成され、そのた
め該ポリペプチドのコンフォーメーションが制限され
る。別の態様として、該ポリペプチドのαアミノ基（ま
たはＮ末端側に位置する外来残基のαアミノ基）がＣ末
端側に位置する外来システイン残基の硫黄原子に共有結
合して、式Ｉに示す環状化合物と類似のチオエーテル環
状化合物が生成する。本明細書のいずれかの箇所で記載
するように、他の環状化合物も同様の仕方で調製され
る。この態様の配列に対応する天然のIgE配列アミノ酸
配列変異体も本発明の範囲に包含される。β鎖Ｄ変異体
はFCEHへの結合を高めるために選択されるが、該β鎖Ｄ
ドメインの外側の配列はＮ末端およびＣ末端を天然のIg
E配列の場合と実質的に同じ位置に適切に配置するのに
充分なコンフォーメーション構造を保持するのに必要な
だけである。

本発明のFCEH特異的ポリペプチドは、細胞毒性の官能
基を含むFCEH特異的ポリペプチドは好ましくないことを
除けばFCEL特異的ポリペプチドについて記載したのと全
く同じように非IgEポリペプチドを任意に含有する。加
えて、β鎖ＤドメインのFCEH結合性配列を含有するコン
フォーメーションが制限された（一般に環状の）ポリペ
プチドも本発明の範囲に包含される。そのようなポリペ
プチドは、（a3）−（a19）残基がFCEH結合性β鎖Ｄド
メインで置き換わっているほかは上記式Ｉに示すものと
同一である。置換残基の例としては、S420−R428、T421
−N430、S420−G433およびR422−R428が挙げられる（カ
バット配列からの残基が省かれているU266からのT421−
N430などの配列は該部位に残基を含有するかまたは同位
置に欠失を有し、後者の場合、Asn残基が部位429を占め
ることに注意せよ）。

FCEL結合を実質的に減少させまたは失わせるためにAB
−Ｂドメイン残基のいずれの１またはこれ以上の残基も
欠失させてよい。β鎖Ｄドメインに関しても上記と同じ
理由から残基の欠失が好ましい。

AB−Ｂドメインの置換または欠失変異体の候補の例を
下記表３に示す。各変異体の配列を決定するには、各部
位の下の各変異体番号について残基を同定する。たとえ
ば、化合物98の配列はA383 A384 A385を含み、変異体７
に属する変異のクラスを示す。

AB−Ｂドメイン内の残基に隣接して１または２以上の
外来残基を挿入することもこの発明の範囲に包含される
が、置換または欠失が好ましい。一般に、わずかに一つ
だけの残基を挿入するが、AB−Ｂドメイン内のいずれか
一つの部位に隣接して２〜４またはそれ以上の残基を挿
入することもできる。免疫原部位の導入を回避するた
め、挿入する残基の数は少ない方が好ましいであろう。
しかしながら、このことは単なる選択の問題にすぎな
い。一般に、挿入は単一の部位で行うが、いずれかの２
またはそれ以上のAB−Ｂドメイン残基に隣接して挿入を
行うこともできる。

挿入は一般に下記残基の間で行う:S385とP386、P386
とT387、T387とI388、およびI388とT389。挿入された残
基は、一般に両側の残基と異なる電荷、大きさまたは疎
水性特性を示すであろう。たとえば、挿入の候補は下記
表４から選択することができる。

AB−Ｂドメイン残基の１または２以上が置換もしくは
欠失され、またはそのような残基に隣接して別の残基が
挿入される。一般に、わずかに４つの残基または部位が
変えられ、最適にはわずかに一つのみが変えられるであ
ろう。本明細書における変化には、挿入、欠失または置
換の組み合わせが含まれる。ニオらにより開示されたIg
Eポリペプチドフラグメント（またはそのようなフラグ
メントの天然に存在する配列変異、たとえば対立遺伝子
など）並びに従来技術により開示される他のそのような
フラグメントはFCEH特異的ポリペプチドから排除され
る。

ループEF変異体 ループEFは上記で定義した。実施例に記載していない
ループEF変異体はFCEHアッセイおよびFCELアッセイの両
方に対してスクリーニングする必要がある。というの
は、ループEFはFCEL結合およびFCEH結合の両方に関与し
ているからである。しかしながら、このスクリーニング
は本明細書の指示および原則に従うならばお決まりの手
順であり当業者には自明の範囲である。一般に、FCEHま
たはFCEL結合性の識別ポリペプチドは、残基446、447、
448、449、450、452および453の１または２以上の置換
または欠失（またはそれに隣接した挿入）を含むであろ
う。446および447などの部位もまた（FCEL結合の喪失と
なるAla置換の場合を示してあるが（実施例５））、FCE
Lに対して天然IgEよりも大きな程度で結合する変異体を
選択するための部位として役立つことに注意すべきであ
る。しかしながら、たいていの場合には、目的がFCEL結
合である場合において部位446および447は変異体を導入
するには好ましくない。このため、残基448から453の範
囲の領域、好ましくは残基450、452および453に焦点を
合わせるべきである。一般に、ループEF変異体は、ルー
プAB−β鎖Ｂまたはβ鎖Ｄまたは両方に導入した変異と
ともに用いる。

R446は、一般に、FCEH特異性のため、Gly、Ala、Va
l、Leu、Ile、Ser、His、Lys、Met、Thr、Asp、Pro、Gl
u、Asn、Gln、Cys、Phe、TyrまたはTrp、好ましくはAla
で置換する。

D447は、一般に、FCEH特異性のため、Gly、Ala、Va
l、Leu、Ile、Met、Cys、Ser、Thr、Pro、Glu、Asn、Gl
n、His、Lys、Arg、Phe、TyrまたはTrp、好ましくはAla
で置換する。

W448もまた一般に置換しないが、置換する場合はGl
y、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Ser、Thr、Pro、Gl
u、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Arg、PheまたはTyrを用
いる。

I449も同様に一般に置換しないが、置換する場合はGl
y、Ala、Val、Leu、Met、Cys、Ser、Thr、Pro、Glu、As
n、Asp、Gln、His、Lys、Arg、Phe、TyrまたはTrpを用
いる。

E450は、一般に、FCEH特異性のため、Gly、Ala、Va
l、Ile、Leu、Met、Cys、Ser、Thr、Pro、Gln、Asn、As
p、His、Lys、Arg、Phe、TyrまたはTrp、好ましくはAla
で置換する。

G151は一般に置換しないが、置換する場合にはAla、V
al、Leu、Met、Cys、Ser、Thr、Pro、Glu、Asn、Ile、A
sp、Gln、His、Lys、Arg、Phe、TyrまたはTrpを用い
る。

E452もまた一般に、Ala、Val、Leu、Met、Cys、Ser、
Thr、Pro、Gly、Asn、Ile、Asp、Gln、His、Lys、Arg、
Phe、TyrまたはTrpで置換する。

T453は、一般に、Ala、Val、Leu、Met、Cys、Ser、Pr
o、Gly、Asn、Glu、Ile、Asp、Gln、His、Lys、Arg、Ph
e、Tyr、またはTrpで置換する。

IgE変異体の例を表５に示す。この表には、両レセプ
ターに結合する変異体、一方または他方のレセプターに
識別的に結合する変異体、またはいずれのレセプターに
も結合しない変異体が含まれることが理解されるであろ
う。

変異体抗huIgE抗体 まずFCELには結合することができるがFCEHには結合す
ることのできない一群のマウスモノクローナル抗体を得
ることにより、変異体抗huIgE抗体を製造した。そのよ
うな８つのマウスモノクローナル抗体（MAE10、MAE11、
MAE12、MAE13、MAE14、MAE15、MAE16およびMAE17と称す
る）を、ヒトIgEまたはhuIgEの残基315−547からなるポ
リペプチドでマウスを免疫し抗IgE活性についてスクリ
ーニングすることを含む通常の方法により得た。

MAE11/15およびMAE13は異なるエピトープを認識す
る。MAE13のエピトープはIgEのFCEH結合部位の重要な成
員に３次元的に隣接して位置するように思われる。とい
うのは、高濃度のMAE13でわずかな量のヒスタミン放出
が起こり、ある種の制限された抗体を介したFCEHの架橋
がMAE13で起こることを示唆しているからである。MAE11
およびMAE13が一層大きなIgE親和性を示すという事実に
もかかわらず、MAE17がＢ細胞のIgE合成を抑制するうえ
で最も有効である。このことは、それが補体固着を媒介
する能力を有することに帰することができる（それはIg
G2a同位体（isotope）を有し、それゆえエフェクター機
能を顕現し得るFcを含有する）。

MAE11とMAE15とは同じIgEエピトープを認識すると思
われる。各抗体は、そのアミノ酸配列においてある種の
異常な性質を共通に有していた。たとえば、各抗体のＬ
鎖のCDR1には３つのアスパラギン酸残基が含まれてい
た。MAE11およびMAE15のＨ鎖のCDR3には３つのヒスチジ
ン残基が含まれていた（および、それぞれ２つのアルギ
ニン残基が含まれていた）。

所望のIgE結合特性を有する上記のような抗体をさら
に修飾することができる。そのような修飾は、２つの一
般的なクラスに分けられる。第一のクラスでは、IgEに
対して一価となるように抗体を修飾する。このことは、
抗体の一方の「アーム」のみが、すなわち抗体の一方の
Ｌ−Ｈ鎖フォークのみがIgEに結合し得ることを意味す
る。抗体の残りのFv「アーム」（またはIgMの場合は複
数のアーム）は第二の（非IgM）抗原に特異的であり、
いかなる抗原にも結合することができず、または完全に
欠失している。それゆえ、IgE一価なる語は、IgEに対し
て一価である多価抗体をも包含する。最良の結果は第二
の態様により得ることができる。というのは、この態様
は抗体の構造を最も忠実に保存するものであり、最長の
循環半減期を抗体に付与する傾向があるからである。FC
EL結合IgEに特異的なIgE−一価抗体は、最適には補体結
合およびIgEエフェクター機能を可能にするのに充分な
Ｈ鎖のFcドメインを含むであろう。

IgE一価抗体の一つの態様により認識される第二の抗
原は、該抗体によってFCELに間接的に架橋した場合にい
かなる毒性または有害な応答をも行い、すなわち第二の
抗原がFCEHでないものであり、一般には処置しようとす
る動物内に認められないものである（体内の組織やタン
パク質に抗体が望ましくない吸着を起こさないよう
に）。それゆえ、第二の抗原は通常、FCELではないであ
ろう（しかしFCELであるかもしれない）。しかしなが
ら、ある状況下では、第二の抗原は処置しようとする患
者中に存在するタンパク質であろう（たとえば、そのよ
うなタンパク質が本発明における治療用抗体の担体また
は貯蔵物放出として働く場合）。

そのようなIgE−一価抗体は、それ自体公知の方法に
より製造される。たとえば、抗IgE Fv H鎖およびＬ鎖を
コードするDNAをヒトレシピエント抗体のFcをコードす
るDNAに連結させる。加えて、第二の抗原または未同定
の抗原に結合し得る抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする
DNA、または非IgE抗原結合がもはや起こりえないように
CDRから充分な残基を欠失させたＨ鎖およびＬ鎖をコー
ドするDNAが提供される。通常の組換え宿主を４つのす
べてのDNAで形質転換し、生成物回収する。鎖のランダ
ムな取り合わせを仮定して、抗体生成物の亜集団は抗Ig
E H鎖およびＬ鎖を有する一つのアームおよび第二の抗
原に対して特異性を有するまたはいずれの抗原に対して
も特異性を有しない少なくとも別のアームを有するであ
ろう。ついで、得られた所望の亜集団を通常の方法、た
とえばイムノアフィニティー吸着または分子篩により精
製する。これら抗体はまた、これまでに一価抗体の調製
に用いられてきたように（たとえば、グレニー（Glenni
e）ら、Nature 295:712［1982］）、出発物質の抗体を
還元し、ついで酸化的鎖組換えにより調製することもで
きる。

IgE−一価に加え、他の態様において、最大の比率の
ヒト配列を含有するように（必要なまたは所望の活性の
保持と同程度に）抗体を修飾する、すなわち、キメラに
変換すなわちヒト化する。両方の場合において、機能的
な効果は、マウスまたは他のドナー抗体の抗IgE結合能
をヒト背景中に導入してできるだけ非免疫原性にするこ
とである。キメラの作製および抗体のヒト化のための一
般的な方法が知られている（上記のように）。最小量の
非ヒト抗体配列をレシピエントのヒト抗体中に置換す
る。一般に、非ヒト残基をレシピエントのヒト抗体の
V_H、V_L、V_H−V_L境界またはフレームワーク中に置換す
る。一般に、ヒト化抗体のカバットCDRは非ヒトドナー
のCDRと約80％、さらに一般的には約90％相同である。
一方、ヒト化抗体のV_H−V_L境界およびフレームワーク残
基は、レシピエントのヒト抗体と約80％、通常90％、好
ましくは約95％相同である。相同性は同一残基を最大に
整合させることにより決定する。得られた抗体は、
（ａ）マウス抗体に比べてヒトにおいて免疫原性が小さ
く、また（ｂ）FCELに結合したhuIgEには結合すること
ができるがFCEHに結合したhuIgEには実質的に結合する
ことができない。そのような抗体は、一般に、結合可能
な非ヒト抗IgE抗体の相補性決定領域（CDR）、VL−VH境
界またはフレームワーク領域からのアミノ酸残基によっ
て置換されたヒト抗体である。非ヒトCDRのL1、L2、L
3、H1、H2またはH3のうちの一つまたは二つ、好ましく
はすべてをヒト抗体レシピエント中に置換する。

MAE11抗体が有する特性は治療用に使用するのに好ま
しかった。MAE11は可溶性IgEに結合し、IgE含有Ｂ細胞
に結合し、低親和性IgEレセプターおよび高親和性IgEレ
セプターへのIgEの結合をブロックし、インビトロでIgE
産生を抑制し、IgEでコーティングされた好塩基球には
結合することができなかったので、これをヒト化のため
のドナー抗体として選択した。レシピエント抗体はカバ
ットヒトκ（Ｌ）サブグループＩおよびヒトサブグルー
プIII H鎖であったが、他のいずれのヒト抗体も好適に
用いることができる。驚くべきことに、レシピエントの
ヒト抗体中のCDRをマウスCDRで単に置換することによっ
ては最適の結果は得られなかった（図3;以下の表８）。
その代わり、ドナー抗体と同様の程度のIgE結合の阻害
を達成するためにV_H78、48、49、63、67、69;82または8
2c、またはV_L13、19、58、78または104などのドナーフ
レームワークの疎水性残基を回復する必要があった。こ
れら残基はCDRのコンフォメーションを確立するよう機
能するが、これら残基は一般に抗体の外部には暴露され
ず、それゆえマウス残基の使用は免疫原性に対して有意
の影響を与えるべきでない。結合に影響を与える他の非
CDR残基としては、V_H60、61、37、24、およびV_H50、5
2、58および95（コチア（Chothia）による非CDR）、お
よびV_L4、V_L33（コチアによる非CDR）およびV_L53（コチ
アによる非CDR）が挙げられる。ヒトフレームワークの
疎水性残基は、一般に、バリン、イソロイシン、ロイシ
ン、フェニルアラニンまたはメチオニンなどの他の疎水
性残基（とりわけドナー抗体からのもの）で置換する。
残りの非CDR残基は他のいずれかのアミノ酸残基で置換
するが、この場合も、好ましくは類似位置に認められる
マウス残基で置換するのが好ましい。

一般に、抗IgE抗体の特性は、V_L部位の30、30b、30
d、33、55、57、58、78、93、94または104（ここで、3
0、30a、30b、30cおよび30dの部位は図３のＬ鎖におい
て下線を付した「DYDGD」の配列に対応する）および／
またはV_H残基24、37、48、49、54、57、60、61、63、6
5、67、69、78、82、82c、97、100aまたは100cにてまた
はそれに隣接して残基を置換、欠失または挿入すること
により改良される。

位置V_H−78は、フェニルアラニンで置換するのが最も
好ましい。しかしながら、この位置はまた、ロイシン、
バリン、イソロイシン、メチオニン、アラニンまたは該
抗体の特性が改良される他のいずれかの残基でも置換さ
れる（以下参照）。

位置V_H−60は、アスパラギンで置換するのが最も好ま
しいが、グルタミン、ヒスチジン、リシン、アルギニン
または該抗体の特性が改良される他のいずれかの残基に
よる置換もまたこの発明の範囲に包含される。

位置V_H−61は、プロリンで置換するのが最も好ましい
が、グリシン、アラリン、バリン、ロイシン、イソロイ
シンまたは該抗体の特性が改良される他のいずれかの残
基もまた適している。

CDR残基はMAE1から移入した。これらには、V_L1中の４
つの挿入、30a−30d、並びに91−94（V_L3）、V_H1 27−2
9、29a、31、33および34、V_H2 53−55、およびV_H3 97−
101が含まれていた。V_L 30、30bまたは30d、並びにV_H 9
7、100aまたは100cは、CDRにIgEへの結合能を付与する
うえで重要である。

humae11（ヒト化MAE11）中ではV_H位置の97、100aおよ
び100cはすべてヒスチジンであり、MAE15では２つがア
ルギニンである。これら残基はIgEへの結合において重
要である。これらのうちの一つ、２つまたは３つを塩基
性残基、とりわけリシンやアルギニンで置換して修飾す
るが、アラニン、グリシン、バリン、イソロイシン、セ
リン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ア
スパラギン、グルタミン、メチオニン、フェニルアラニ
ン、チロシン、トリプトファンまたはプロリンでも置換
できる。

V_L位置の30、30bおよび30dもまたIgE結合にとって重
合である。humae11では、これら位置のそれぞれは酸性
残基、アスパラギン酸で占められている。これら位置
は、他の態様においてはグルタミン酸により置換される
が、アラニン、グリシン、バリン、イソロイシン、セリ
ン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、メチオニ
ン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンまた
はプロリンでも置換することができる。位置V_L 30、30b
および30d上の電荷をV_H 97、100aおよび100c上の電荷で
逆転させることを、たとえばこれら３つのV_H部位（ヒト
化MAE15の場合は２つの部位）中のアスパラギン酸およ
びこれら３つのV_L部位中のヒスチジンを用いることによ
り行うこともこの発明の範囲に包含される。

V_H位置の97、100a、100c、60または61、または30、30
b、30dまたは78の位置のV_L残基に隣接して残基を挿入す
ることもできる。挿入する残基は、一般に似た種類のも
のであり、たとえば酸性残基はV_L−30、30bまたは30dに
隣接して挿入し、塩基性残基はV_H−97、100または100c
に隣接して挿入する。これら部位の残基は欠失させても
よい。

ヒト化IgE−一価抗体もまたこの発明の範囲に包含さ
れる。この場合には、ヒト化は抗IgEアームまで及び、
必要なら残りのアームまで及ぶ。非IgE結合アームはも
ちろんヒト抗体由来であってよく、その場合には非ヒト
を必要としないであろう。

上記変異は、前駆体形態の抗体をコードするDNA中に
変異を導入し、該DNAを組換え細胞培養などで発現させ
ることにより行う。このことは、部位特異的突然変異誘
発の常法により行う。ついで、所望の特性について変異
体をそれ自体通常のアッセイでスクリーニングする。抗
huIgEの場合、所望の特性としては、huIgEに対する抗体
親和性を増大させること、FCEL結合IgEに対する収容力
（capacity）および特異性を増大させること、マスト細
胞または好塩基球からのヒスタミン放出を刺激するのに
必要な抗体の濃度を増大させること、ヒトにおける免疫
原性を減少させること、および当業者に明らかな他の改
良が含まれる。これら特性を最適化することには、しば
しば他の改良に対する一方の改良のバランスが必要とさ
れ、それゆえ判断の問題であり、抗体に対して意図され
た使用により指示される性能パラメータに依存する。

ヒト化のためのレシピエント免疫グロブリンとしては
ヒトIgG1（または他の補体結合抗体）を用いるのが好ま
しいが、ヒトIgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM、IgDまたはI
gAもまたレシピエントとして用いることができる。レシ
ピエントは補体結合IgG抗体であるかまたはADCCに参画
し得るIgG抗体が好ましい。

治療、診断および製剤用途 本発明の抗IgE抗体は、FCELまたはFCEH結合ドメイン
が修飾されたIgEアミノ酸配列変異体を同定するのに有
用である。FCELまたはFCEH特異的ポリペプチドの候補を
これら抗体とともにインキュベートし、さらに評価する
ため、たとえばそれぞれFCEHおよびFCELレセプター結合
特性を決定するため、これら抗体が結合することのでき
なかった類似体を選択する。抗体MAE10−MAE17（とりわ
けMAE11/15、MAE13またはMAE17）のいずれかのエピトー
プ特異性を有するいかなる抗体も、その採取源がマウ
ス、ヒトまたは他の動物種であろうと、または上記ヒト
化免疫グロブリンなどのその変異体であろうとも同様に
採用できる。そのような抗体は、適当な動物起源のIgE
で適当な動物を免疫しまたはインビトロFv選択系（たと
えば、ファージミド（phagemid））を用い、IgEに対し
てMAE11/15、13、17または本明細書に記載した抗体と実
質的に同じエピトープ部位をマッピングした他の抗体と
競合する能力を有する動物または生成物をスクリーニン
グすることにより容易に同定される。記載したように、
治療用に用いる場合はこれら抗体はFCEL−結合IgEに対
して一価であるのが望ましい。これら抗体は、血漿、血
清または組換え細胞培養液から精製するのに用いる場合
には二価および／または二特異的であってもよい。

FCEHおよびFCEL特異的な識別結合ポリペプチドは、診
断および治療に有用である。インビトロ診断アッセイに
おいて、これらポリペプチドはそれぞれFCεR IまたはF
CεR IIに対するアッセイにおいて特異的結合試薬とし
て用いる。この発明のポリペプチドは、酵素、蛍光また
は化学ルミネセンス基、放射性同位元素または検出可能
な物質（酵素など）に結合した特異的結合残基などの検
出可能な物質で標識する。典型的な特異的結合物質は、
検出可能な物質に結合し得る免疫グロブリンの可変ドメ
インである。免疫グロブリン可変ドメインを含有するFC
ELおよびFCEH特異的ポリペプチドは上記で一層詳細に記
載する。

この発明のFCELまたはFCEH特異的ポリペプチドを用い
たアッセイ系は、これまでイムノアッセイ分野で一般に
用いられてきたサンドイッチタイプのシステムに類似す
る。本発明においては、該特異的ポリペプチドは、抗原
（FCELまたはFCEHレセプター）に対して向けられた標識
抗体または試験試料からレセプターを単離するためマト
リックス上に不溶化した吸着剤と同様の仕方で用いる。
通常のアッセイ系に用いるため、この発明のポリペプチ
ドに酸化還元標識、加水分解標識、エステル分解標識ま
たは他の通常の酵素標識を結合させる。

この発明の識別結合ポリペプチドはまた、治療または
研究目的でFCELまたはFCEHを調製するうえで細胞培養か
らFCELまたはFCEHを単離するのにも有用である。該ポリ
ペプチドは、イオン交換樹脂、イムノアフィニティーカ
ラム（FCEHまたはFCEL特異的ポリペプチドに融合したポ
リペプチドと結合し得る抗体を含有する）、固定化抗原
（この場合、FCEHまたはFCEL特異的ポリペプチドは該抗
原に結合し得る免疫グロブリンの可変領域を含有する）
または臭化シアン活性化多糖などのマトリックスに共有
結合されるかまたは非共有結合的に吸着される。つい
で、固定化されたFCEHまたはFCEL特異的ポリペプチドを
レセプター調製物とレセプターがFCEHまたはFCEL特異的
ポリペプチドと結合する条件下で接触させる。ついで、
pHまたはイオン条件を変えレセプターからポリペプチド
調製物を分離することによりレセプターを溶出させる。

本発明の識別結合ポリペプチドは、IgEのFCEHまたはF
CEL−結合ドメインに特異的な抗体を調製するうえで有
用である。たとえば、IgEのFCEHまたはFCEL−結合ドメ
インに特異的に結合し得る抗体を選択するには、まず患
者をIgEで免疫する。ついで、天然IgE結合についてモノ
クローナル抗体を通常の仕方で選択し、ついで、モノク
ローナル抗体をスクリーニングしてこの発明のFCEHまた
はFCEL特異的ポリペプチドに結合するものを同定する。
FCEHまたはFCEL特異的ポリペプチドは、もちろんFCEHま
たはFCEL識別結合特異性を付与するのに必要な最小限の
変異は別にして、免疫原として用いたIgEの対応配列と
配列が同一であるのが好ましいであろう。たとえば、変
異体６への結合能についてIgEモノクローナル抗体を選
択することができる。もしも変異体６に結合することが
できないなら、それら抗体はFCEH結合部位に結合し、そ
れゆえFCEHの結合したIgEには結合できないがFCELの結
合したIgEには結合する抗体に依存する診断または治療
手順に有用であると約束されたと結論付けることができ
る。かくして選択した抗体が実際にFCELに結合したIgE
に結合することを設定することにより確証が得られる。
選択した抗体はレセプター結合に関与する重要な部位に
対して高度に特異的であるので、ついで抗体のサイズを
小さくすることが可能である;IgE−レセプター相互作用
の立体障害には抗体のかさばり（bulk）は必要ではな
い。それゆえ、アレルギー治療に抗IgE一価抗体または
他の抗IgEフラグメント（Fab、Fab'など）を使用するこ
とが可能になる。

同様に、FCELまたはFCEH特異的ポリペプチドは、FCEH
またはFCEL特異的ポリペプチドを作製するうえで変化さ
せたドメインの外側のエピトープ部位でのみ天然のIgE
と交差反応し得る抗体を生成させるための免疫原として
有用である。たとえば、変異体６および７は、場合に応
じて変異させたAB−Ｂまたはβ鎖Ｂドメイン以外のIgE
エピトープに特異的な抗体を生成させるのに有用であ
る。

FCEHおよびFCEL特異的ポリペプチドおよび抗IgE抗体
（とりわけ、免疫原性の減少したもの）はアレルギーの
治療または予防のための療法に有用であるが、細胞毒性
官能基を有するFCEH特異的ポリペプチドサブグループは
マスト細胞および好塩基球の脱顆粒を引き起こし得るの
で治療には適していないと考えられる。そうでなけれ
ば、一般に、好ましくは急性のアレルギー応答に先立っ
て、アレルゲンに感作したことがわかっている患者に該
ポリペプチドを投与する。投与量および投与経路は、該
ポリペプチドに付随する付帯的な機能性（たとえば、細
胞毒性剤、免疫グロブリンエフェクター機能など）、患
者の状態（Ｂ細胞またはマスト細胞および好塩基球の個
体数を含む）、該ポリペプチドの半減期、該ポリペプチ
ドのそのレセプターへの親和性および臨床家に公知の他
のパラメータに依存するであろう。FCEH特異的ポリペプ
チドの場合の一般的な規準として、患者中を循環してい
る標的細胞の量を血液検査から決定し、FCEHレセプター
の個体数並びに半減期およびFCEHに対する該ポリペプチ
ドの親和性を考慮して内生IgEと置換しあるいは有効に
競合するポリペプチドの量を決定することができるであ
ろう。ついで、妥当な治療期間の間に天然のFCEH結合Ig
Eを実質的に置き換えるのに必要な循環させるべき過剰
のポリペプチドを投与するであろう。抗IgE抗体またはF
CELポリペプチドの投与量を決定するため同様の分析を
用いる。

治療用ポリペプチドは、静脈内、肺内、腹腔内、皮下
または他の適当な経路で投与する。皮下または静脈内で
該ポリペプチドを必要に応じて約１〜14日の期間かけて
投与するのが好ましい。FCEL特異的ポリペプチドまたは
抗FCEL−結合IgEの場合には、IgEを分泌するＢ細胞集団
の実質部分を阻止、抑制または殺すのに必要な量を決定
する。Ｂ細胞集団の阻止または抑制には、IgE分泌の減
少およびIgEを分泌するＢ細胞の全数の減少のいずれか
または両方が含まれる。候補となる投与量は、インビト
ロ細胞培養または動物モデルを用いて容易に決定され
る。

抗FCEL結合IgEおよびFCELまたはFCEHポリペプチドを
用いたアレルギー疾患の治療は、任意にアレルギーのた
めの他の公知の療法を用いて行う。これらには、γイン
ターフェロンの投与、アレルゲン脱感作、アレルゲンへ
の暴露の減少、抗ヒスタミン剤を用いた治療などが含ま
れる。

FCEH特異的ポリペプチドおよびFCEL特異的ポリペプチド
の調製 この発明のFCEH特異的ポリペプチドまたはFCEL特異的
ポリペプチドは通常の仕方で作製する、すなわち、変異
を有するプライマーを用いたPCR増幅などの一般に利用
できるDNA突然変異誘発により、またはM13突然変異誘発
によりアミノ酸配列の修飾を行い、ついで該変異したDN
Aを組換え宿主細胞中で発現させる。該ポリペプチドは
また、もし充分に小さいなら（一般に約100残基以
下）、メリフィールド（Merrifield）や他のインビトロ
合成法により作製することもできる。しかしながら、該
ポリペプチドは組換え法により作製するのが好ましい。
組換え宿主細胞、ベクター、培養条件および他のパラメ
ータの選択は重要ではないと思われる。一般に、免疫グ
ロブリン（一般にIgG）の組換え発現においてこれまで
用いられてきた宿主、ベクターおよび方法もまた、この
発明のポリペプチド配列を調製するのに有用である。ミ
エローマ、CHO、Cos、293sなどの哺乳動物細胞を宿主に
用い、該ポリペプチドの分泌発現のためにベクターを構
築するのが好ましい。組換え発現系によりFCEL特異的配
列またはFCEH特異的配列を含有する機能性免疫グロブリ
ン変異体の調製が容易になる。というのは、FCEL特異的
配列またはFCEH特異的配列を含む一つのＨ鎖および一つ
のＬ鎖（それぞれ第一の抗原に結合するための可変ドメ
インを含む）をコードするDNAで宿主細胞を形質転換
し、抗原およびFCELまたはFCEHに結合する免疫グロブリ
ンを回収すればよいからである。同様に、FCEL特異的ド
メインまたはFCEH特異的ドメインを含む他のＨ鎖および
他のＬ鎖（それぞれ第二の抗原に結合するための可変ド
メインを含む）をさらにコードするDNAを用いて同じ手
順を行い、二価免疫グロブリンを回収する。適当に組み
立てられた免疫グロブリン類似体を、これら２つの抗原
を含むマトリックス上のアフィニティークロマトグラフ
ィーにより回収する。

この発明のポリペプチドを、溶解した組換え細胞培養
液または（分泌された場合）培養上澄みから回収する。
該ポリペプチドを含有する細胞不含抽出液を、固定化し
たFCELまたはFCEHレセプターアフィニティーマトリック
ス上に通すことにより実質的な精製を達成する。IgEま
たは他の適当な免疫グロブリンを精製するのにこれまで
用いられてきた他の方法もまた同様に本発明に適用で
き、それにはイムノアフィニティーおよび（適当な場合
には）固定化抗原上の吸着が含まれる。

短い配列を含有するこの発明のポリペプチドは、固相
合成法、たとえばメリフィールド（J.Am.Chem.Soc.、8
5:2149（1963））の方法を用いて調製するのが好まし
い。しかしながら、当該技術分野で公知の他の同等の化
学的合成法も採用できる。ついで、組換えまたはインビ
トロ合成したポリペプチドをマトリックスに架橋するか
（診断または調製手順に用いるため）またはコンフォメ
ーションが制限された構造とする。PCT90/01331に記載
されているものや、Lys/AspについてFmoc/9−フルオレ
ニルメチル（Ofm）側鎖保護して固相支持体上のＮα−B
oc−アミノ酸を用い、ついでピペリジン処理して環状に
するLys/Asp環化などの公知の環化法が有用である。残
基の側鎖を介して架橋または環化に依存する方法では、
適当な環化または架橋部位を提供するためにAB−Ｂまた
はβ鎖ＤドメインのＣおよび／またはＮ末端に外来残基
を挿入する必要があるかもしれない。

GluおよびLys側鎖もまた環状ペプチドまたは二環状ペ
プチドを調製するに際して架橋した：このペプチドをｐ
−メチルベンズヒドリルアミン樹脂上の固相化学により
合成し、該樹脂から開裂し脱保護する。環状ペプチドは
希釈メチルホルムアミド中のジフェニルホスホリルアジ
ドを用いて生成させる。別法としては、シラー（Schill
er）ら、Peptide Protein Res.25:171−77（1985）を参
照。また米国特許第4,547,489号をも参照。

ジスルフィド架橋または環状化したペプチドは通常の
方法により生成させる。ペルトン（Pelton）らの方法
（J.Med.Chem.、29:2370−2375（1986））が適してい
る。チオメチレン架橋（Tetrahedron Letters 25:2067
−2068（1984））も有用である。コディー（Cody）らの
J.Med.Chem.:28:583（1985）をも参照。AB−Ｂドメイン
のＣ末端配列中に認められるC390残基は、このドメイン
を架橋または環状化するのに有用である。

一般に、環状化または架橋に関与する外来残基を、該
方法に用いるポリペプチド前駆体の合成の一部として、
選択したAB−Ｂまたはβ鎖Ｄ配列のＮ末端およびＣ末端
に挿入する。得られた所望の環状化または架橋ペプチド
を、ゲル濾過、ついで逆相高速液体クロマトグラフィー
または他の通常の方法により精製する。得られたペプチ
ドを0.2μｍ濾過により滅菌し、通常の薬理学的に許容
し得るビヒクル中に調合する。

この発明で記載される化合物は、遊離の酸もしくは塩
基であってよく、または種々の無機および有機酸および
塩基の塩に変換してもよい。そのような塩の例として
は、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム
およびマグネシウムなどの金属塩；ジシクロヘキシルア
ミンＮ−メチル−Ｄ−グルカミンなどの有機塩基との
塩；およびアルギニンまたはリシンなどのアミノ酸との
塩が挙げられる。無機および有機酸との塩は、たとえば
塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、
メタンスルホン酸、マレイン酸、フマール酸などを用い
て調製することができる。非毒性で生理学的に融和性の
塩が特に有用であるが、他のあまり望ましくない塩も単
離や精製の過程に用いてもよい。

多くの方法が上記塩を調製するために有用であり、当
業者に知られている。たとえば、遊離酸または遊離塩基
の形態の式Ｉの化合物を１モル等量またはそれ以上のモ
ル等量の所望の酸または塩基と該塩が不溶な溶媒もしく
は溶媒混合物中で反応させるか；または水のような溶媒
中で反応させた後、溶媒を蒸発、蒸留または凍結乾燥に
より除去する。別法として、遊離酸または塩基の形態の
生成物をイオン交換樹脂上に通過させて所望の塩を得る
か、または同じ一般的方法を用いて一つの塩の形態の生
成物を他の塩の形態に変換させてもよい。

この発明のポリペプチドの作用持続時間をコントロー
ルするため、別の製薬法を用いることもできる。制御放
出製剤は、目的のポリペプチドと複合体を生成するかま
たは目的のポリペプチドに吸着するポリマーを用いるこ
とにより得られる。制御送達は、該ポリペプチドを適当
な巨大分子物品（たとえば、ポリエステル、ポリアミノ
酸、ポリビニル、ポリピロリドン、エチレンビニルアセ
テート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
ス、またはポリアミンサルフェートから調製されるも
の）に調合することにより達成される。

別法として、該ポリペプチドをポリマー性のマトリッ
クス内に封じ込める代わりに、たとえばコアセルベーシ
ョン法によりまたは界面重合により調製したマイクロカ
プセル中にこれら物質を封じ込めることが可能である。
ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカ
プセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカ
プセルが、それぞれコロイド状薬物送達システム（たと
えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイク
ロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）におい
て有用である。Remington's Pharmaceutical Sciences
（1980）参照。

実施例１ IgEに対するモノクローナル抗体の調製 FCEHへのIgEの結合をブロックする能力を有する８つ
のモノクローナル抗体を用いた。これらモノクローナル
抗体（MAE10−MAE17）を下記のようにして調製した。精
製ヒトIgEを、前以て単離した抗IgE抗体（ジェネンテッ
クMAE1、他の抗huIgE抗体も同様に有用である）上のア
フィニティークロマトグラフィーを用いてU266B1細胞
（ATCC TIB196）の上澄み液から精製した。MAE12につい
ては、５匹のBALB/c雌マウス（６週齢）をリビのアジュ
バント中の精製IgE（10μｇ）で足趾に免疫した。最初
の免疫から１週間および３週間後に引き続き同様にして
注射を行った。最後の注射から３日後に、鼠蹊部および
膝窩部のリンパ節を除去してプールし、組織を金網に通
すことにより単一細胞懸濁液を調製した。MAE14、MAE15
およびMAE13については、同様にして免疫を行ったが、M
AE13については注射当たり30μｇのIgEを用い、前融合
ブースターとしてはIgE315−547を用い;MAE14およびMAE
15については、各50μｇの５つの注射を用い;MAE17のた
めのIgE免疫原はIgE315−547であった。MAE10およびMAE
11については、100μｇの２回の投与量および50μｇの
最終ブースターにて皮下に注射を行い、融合用には脾臓
細胞を用いた。これら細胞をマウスミエローマP3X63−A
g8.653（ATCC CRL 1580）と4:1の比率にて、50％w/vポ
リエチレングリコール4000を含有する高グルコース（DM
EM）中で融合した。

融合した細胞を96ウエル組織培養プレート中にウエル
当たり２×10⁵の密度にてプレーティングした。24時間
後、HAT選択培地（ヒポキサンチン／アミノプテリン／
チミジン、シグマ・ケミカル・カンパニー、＃H0262）
を加えた。プレーティングした1440のウエルのうち、36
5のウエルにHAT選択後の増殖細胞が含まれていた。

融合から15日後、酵素結合抗体免疫アッセイ（ELIS
A）を用い、ヒトIgEに特異的な抗体の存在について上澄
み液を試験した。ELISAは以下のようにして行い、すべ
てのインキュベーションは室温にて行った。試験プレー
ト（ヌンクイムノプレート）をラット抗マウスIgG（ベ
ーリンガーマンハイム、＃605−500）で50mM炭酸ナトリ
ウム緩衝液（pH9.6）中に１μg/mlにて２時間コーティ
ングし、ついでリン酸緩衝食塩水（PBS）中の0.5％ウシ
血清アルブミンで30分間ブロックし、ついで0.05％ツイ
ーン20を含有するPBS（PBST）で４回洗浄した。披験上
澄み液を加え、震盪しながら２時間インキュベートし、
ついでPBSTで４回洗浄した。ヒトIgE（上記のようにし
てU266細胞から精製）を0.5μg/mlにて加え、震盪しな
がら１時間インキュベートし、ついでPBST中で４回洗浄
した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgE
（キルケガール＆ペリー・ラブズ、＃14−10−04、0.5m
g/ml）を1:2500希釈にて加えて１時間インキュベート
し、ついでPBSTで４回洗浄した。ｏ−フェニレンジアミ
ン二塩酸塩（10mg）（シグマ・ケミカル・カンパニー＃
8287）を含有する溶液（100μl/ウエル）およびリン酸
クエン酸緩衝液（pH5.0）（25ml）中の30％過酸化水素
（10μｌ）を加えて発色させた。2.5M硫酸（100μl/ウ
エル）を加えて反応を停止させた。490nmの吸光度にて
自動ELISAプレートリーダー中でプレートを読み取るこ
とによりデータを得た。MAE12については、365の上澄み
液を試験して100の上澄み液がヒトIgEに特異的であっ
た。他の抗体をスクリーニングした場合も同様のIgE特
異性が得られた。MAE17がIgG2bであり、MAE14がIgG2aで
あった他は、本明細書に記載したすべてのモノクローナ
ル抗体がIgG1アイソタイプのものであった。

FCEHへのIgEの結合を阻止しFCEHに結合したIgEには結
合することができないような仕方でIgEに結合した抗体
を選択するため、各IgE特異的抗体をさらに細胞ベース
のプレートアッセイで試験した。これらアッセイの結果
を下記表５および表5aに示す。

1.マウス抗ヒトIgEモノクローナル抗体の分析のためのF
ACSベースのアッセイ CHO 3D10（FcER Iα＋）上のIgE
へのマウス抗体ヒトIgEモノクローナル抗体結合のスク
リーニング a. 試料当たり５×10⁵細胞のCHO 3D10細胞（FcER Iα
鎖安定なトランスフェクション体（transfectant）；ハ
キミ（Hakimi）ら、J.Biol.Chem.265:22079）を100μl
FACS緩衝液（PBS（pH7.4）中の0.1％BSA 10mNアジ化ナ
トリウム）中の10μg/mlのU266 IgE標準（ロット番号13
068−46）とともに４℃にて30分間インキュベートし、
ついでFACS緩衝液で１回洗浄する。IgE含有細胞のアリ
コートを50μg/mlのポリクローナルFITC結合ウサギ抗ヒ
トIgG（アキュレート・ケム（Accurate Chem.Co.）AXL
−475F、ロット番号16）とともに４℃にて30分間インキ
ュベートし、ついでFACS緩衝液で３回洗浄することによ
りIgE結合の量を決定する。

b. IgE含有細胞を100μｌのマウス抗ヒトIgEハイブリ
ドーマ上澄み液（マウスIgGの濃度は１〜20μg/ml）と
ともに４℃にて30分間インキュベートし、ついでFACS緩
衝液で１回洗浄する。結合に対する陽性コントロールと
してはジェネンテックのモノクローナル抗体ヒトIgE（M
AE1）を10μg/mlで用いる。IgEを認識しないジェネンテ
ックのモノクローナル抗体（MAD 6P）を陰性コントロー
ルとして10μg/mlで用いる。

c. 20μg/mlのFITC結合しアフィニティー精製したＦ
（ab）２ヤギ抗マウスIgG（オルガノン・テクニカ（Org
anon Teknica）カタログ番号10711−0081）とともに細
胞を４℃にて30分間インキュベートし、ついでFACS緩衝
液で３回洗浄することにより、CHO細胞上のヒトIgEに対
するモノクローナル抗体結合を決定する。２μg/mlのプ
ロピジウムヨーダイド（propidium iodide）（シグマカ
タログ番号P4170）を含有する400μｌの緩衝液に細胞を
加えて死細胞を染色する。

d. ベックマンディッキンソンPACSCANフローサイトメ
ーター上で細胞を分析する。前方光散乱ゲートおよび90
゜側方ゲートをセットして細胞の均一集団を分析する。
プロピジウムヨーダイドで染色された死細胞は分析から
排除する。CHO 3D10細胞上のIgEに結合しないハイブリ
ドーマ上澄み液が、さらにスクリーニングするための候
補と考えられた。

2.末梢血好塩基球からのヒスタミン放出 正常ドナーからヘパリン処理した血液を得、変性タイ
ロード（Tyrodes）緩衝液（25mMトリス、150mM NaCl、1
0mM CaCl₂、MgCl₂、0.3mg/ml HSA、pH7.35）中に1:4で
希釈し、ついで1nMヒトIgE（ND）とともに４℃にて60分
間インキュベートした。ついで、マウスモノクローナル
抗IgE抗体（10mg/ml）かまたは陽性コントロールとして
ポリクローナル抗ヒト抗血清のいずれかを含有するタイ
ロード緩衝液に細胞を加え、37℃にて30分間インキュベ
ートした。細胞をペレット化し、上澄み液中のヒスタミ
ンをアセチル化し、RIAキット（AMAC,Inc.ウエスブルッ
ク、メイン州）を用いてヒスタミン含量を決定した。凍
結解凍を数回繰り返す操作に供した細胞から全ヒスタミ
ン量を測定した。ヒスタミン放出％は、上澄み液中のヒ
スタミン含量（nM）マイナス自発的に放出されたヒスタ
ミン（nM）を試料中の全ヒスタミン（nM）で除したもの
として計算した。

3.FcER Iα鎖へのFitc結合IgEの結合のブロック Fitc標識したIgEを種々のMAE抗体とともに37℃にて30
分間、PBS（0.1％BSAおよび10mMアジ化ナトリウムを含
有、pH7.4）中でプレインキュベートし、ついで得られ
た複合体を５×10⁵の3D10細胞とともに４℃にて30分間
インキュベートすることにより、IgE結合に対するこれ
ら抗体の作用を調べた。ついで、細胞を３回洗浄し、47
5nMにおける平均チャネル蛍光を測定した。FcER Iα鎖
へのIgE結合をブロックしないマウス抗ヒトIgEモノクロ
ーナル抗体（MAE1）をコントロールとして用いた。

4.膜IgE陽性Ｂ細胞U266へのマウス抗ヒトIgE結合の分析 a.15％熱不活化ウシ胎仔血清（ハイクローン（Hyclon
e）カタログ番号Ａ−1111−Ｌ）、ペニシリン、ストレ
プトマイシン（100単位/ml）およびＬ−グルタミン（2m
M）を添加した基礎培地中でU266B1細胞（膜IgE＋）を培
養する。

b.96ウエル丸底マイクロタイタープレート中、氷上に
て、マウス抗ヒトIgEモノクローナル抗体を10、５、
１、0.5および0.1μg/mlで含有する100μｌのFACS緩衝
液中で細胞（５×10⁵/アリコート）を30分間インキュベ
ートし、ついでFACS緩衝液で２回洗浄する。ジェネンテ
ックのモノクローナル抗体MAE1を陽性コントロールとし
て用いる。

c.50μg/ml（1:20ストック）のFITC結合Ｆ（ab）２アフ
ィニティー精製ヤギ抗マウスIgG（アルガノン・テクニ
カカタログ番号1711−0084）を含有する100μｌのFACS
緩衝液中、氷上で細胞を30分間インキュベートし、つい
でFACS緩衝液で３回洗浄する。２μg/mlのプロピジウム
ヨーダイドを含有する400μｌのFACS緩衝液に細胞を加
えて死細胞を染色する。

5.FcER II（CD23＋）Ｂ細胞IM9に対するFACSベースの結
合アッセイ a. FcER II（CD23）（＋）Ｂ細胞株IM9に対するIgE結
合のFACS分析。IM9ヒトＢ細胞ミエローマATCC CCL 159
（Amm.N.Y.Acad.Sci.、190:221−234［1972］）をGIF基
礎培地（10％熱不活化ウシ胎仔血清、ペニシリン、スト
レプトマイシン（100単位/ml）およびＬ−グルタミン
（2mM）を含有）中で維持した。

b. 96ウエルマイクロタイタープレート中、U266IgE標
準を２μg/mlで含有する100μｌのFACS緩衝液中で細胞
（５×10⁵アリコート）を４℃にてインキュベートし、
ついでFACS緩衝液で２回洗浄した。コントロールとし
て、緩衝液単独中または２μg/mlのヒトIgG1（ベーリン
グ・ダイアグノスティックスカタログ番号400112、ロッ
ト番号801024）を含有する緩衝液中で細胞をインキュベ
ートした。

c. ついで、細胞をマウス抗ヒトIgEモノクローナル抗
体（0.1〜10μg/ml）とともに氷上にて30分間インキュ
ベートした。陽性コントロールとしてジェネンテックの
モノクローナル抗体MAE1を用いた。

d. FITC結合Ｆ（ab'）２ヤギ抗マウスIgG（オルガノン
・テクニカカタログ＃1711−0084）を50μg/mlで含有す
る100μｌのFACS緩衝液中、細胞を４℃にて30分間イン
キュベートし、ついでFACS緩衝液で３回洗浄した。

e. ２μg/mlのプロピジウムヨーダイドを含有する400
μｌの緩衝液に細胞を加えて死細胞を染色した。

f. 細胞をベクトンディッキンソンFACSCANフローサイ
トメーター上で分析した。前方光散乱ゲートおよび90゜
側方ゲートをセットして細胞の均一集団を分析し、プロ
ピジウムヨーダイドで染色された死細胞は分析から排除
した。FITCウサギ抗ヒトIgE単独で染色された細胞に関
して、FITC陽性細胞（IgE結合）を分析した。

g. 各実験におけるIM9細胞の表面上のCD23レベルを決
定するための陽性コントロールとして、細胞のアリコー
トをベクトンディッキンソンマウスモノクローナル抗体
Leu20（抗CD23抗体）（10μg/ml）で４℃にて30分間染
色し、ついで２回染色した。ついで細胞を、FITC結合ｆ
（ab'）２アフィニティー精製ヤギ抗マウスIgG（50μg/
ml）とともにインキュベートした。

6.Fitc結合IgEの低親和性IgEレセプターへの結合の抗体
ブロック Ｂリンパ芽球細胞IM−９上に発現された低親和性IgE
レセプター（CD23）への40nM FITC標識IgEの結合を、FA
CSCANフローサイトメーター上のフローサイトメトリー
により分析した。Fitc IgE結合に対する上記抗体の影響
は、Fitc IgEをマウス抗ヒト抗体（0.1〜10μg/mlキメ
ラ）とともにPBS（0.1％BSAおよび10mMアジ化ナトリウ
ムを含有、pH7.4）中、37℃にて30分間プレインキュベ
ートし、ついで得られた複合体を５×10⁵細胞とともに
４℃にて30分間インキュベートすることより調べた。つ
いで、細胞を３回洗浄し、475nMにおける平均チャネル
蛍光を測定した。

7.IgEインビトロアッセイプロトコール a.末梢血単核細胞を正常ドナーから分離した。

b.細胞をリン酸緩衝食塩水で充分に洗浄してできるだけ
多数の血小板を除去した。

c.単核細胞をカウントし、培地中に１×10⁶細胞/mlにて
再懸濁した。（培地＝DMEM＋ペニシリン／ストレプトマ
イシン＋15％ウマ血清＋IL−２（25U/ml）＋IL−４（20
ng/ml））。

d.抗体を適当な濃度にて０、５および８日目に加えた。

e.培養液を24ウエルファルコン組織培養プレート中で14
日間インキュベートした。

f.14日目に上澄み液を除去し、IgE特異的ELISAプロトコ
ールによりIgE濃度をアッセイした。

8.ヒトIgEに対するマウスモノクローナル抗体の親和性
定数（kd）を下記平衡結合スキャッチャード（Scatchar
d）分析により決定した： a. IgE（NDおよびPSアロタイプ）をクロラミンＴ法に
よりヨード化し、RIA緩衝液:PBS、0.5％ウシ血清アルブ
ミン（シグマカタログ番号Ａ−7888）、0.05％ツイーン
20（シグマカタログ番号Ｐ−1379）、0.01％チメロサー
ル（シグマカタログ番号Ｔ−5125）、pH7.4中のPD10セ
ファデックスG25カラム（ファルマシアカタログ番号17
−0851−01）で遊離の¹²⁵INaから分離した。約78〜95％
のポストカラムカウントが50％トリクロロ酢酸で沈殿
し、ヨード化IgE調製物の比活性は70％のカウント効率
と仮定して1.6〜13μCi/μｇの範囲であった。

b. 12×75mmポリプロピレン試験管中で所定濃度の¹²⁵I
IgE（約５×10⁴cpm）を最終容量0.1mlのRIA緩衝液中の
種々の濃度の非標識IgE（１〜200nM）に加えた。つい
で、RIA緩衝液（0.1ml）中のマウス抗ヒトIgEモノクロ
ーナル抗体（20nM最終濃度）を最終アッセイ容量0.2ml
にて加えた。

c. 継続して撹拌しながら試料を25℃にて16〜18時間イ
ンキュベートした。

d. CN Br活性化セファロース4B（カタログ番号17−043
0−01）および担体プロテインＡセファロース（レプリ
ゲン（Repligen）カタログ番号IPA300）に結合させたア
フィニティー精製ヤギ抗マウスIgG（ベーリンガーマン
ハイムカタログ番号605 208）のRIA緩衝液中の0.3ml混
合液を加え、25℃にて継続して撹拌しながら１〜２時間
インキュベートすることにより、結合した¹²⁵I IgGおよ
び遊離の¹²⁵I IgGを分離した。ついで、RIA緩衝液（1m
l）を加え、試験管を400×ｇにて５分間遠心分離した。
試料をカウントして全カウントを測定した。細く引き出
したパスツールピペットで上澄み液を吸引し、試料を再
びカウントし、遊離カウントに対する結合カウントを計
算した。

e. NIHのマンソン（P.Munson）により書かれたリガン
ドプログラムに基づくフォルトランプログラム（スキャ
ンプロット（scanplot））を利用してスキャッチャード
分析を行った。スキャットプロット（scatplot）には、
ロッドバード（Rodbard）タイプの回帰分析を用い、結
合カウントを全カウントの関数として適用した質量作用
式を用いる。

実施例２ 変異体IgEの調製 パドラン＆デービーズ（Mol.Immunol.23:1063（198
6））によるIgE Fcモデル（ヒトIgG1 Fcの結晶構造（ダ
イセンホーファー（Deisenhofer）、Biochem.20:2361−
2370［1981］）に基づく）に基づき、ヒトIgEのそのレ
セプターへの結合を試験するのに用いることのできる一
連の変異体を設計した。これら変異体はEmut1−13と称
され、下記表６に挙げてある。Fcε３ドメインは７つの
β鎖からなり、これら鎖は全免疫グロブリンドメインを
表すβシート構造を形成する；これら７つのβ鎖を連結
する６つのループが存在する。本発明者らは、これらル
ープをそれが連結する２つのβ鎖により表す、たとえば
ループABはβ鎖ＡおよびＢを連結する。本発明者らは、
Fcε３ドメインループのうち５つを対応ヒトIgG1で置換
したヒトIgEの変異体を構築した（表６、１−５）。６
番目のループにはIgEおよびIgGの両方とも糖付加部位が
含まれるため、本発明においては変化させなかった。一
つの変異体（表６、６）は、ヒトFcε３β鎖ＤをヒトIg
G1Fcγ２対応物と交換することにより作製した。７つの
別の変異体（表６、７−13）は、Fcε３β鎖およびFcε
２内のループ中へのAla残基の置換からなっていた。

ヒトIgE遺伝子を、公的に利用できる細胞株であるU26
6からクローニングした。この遺伝子を、ヒトサイトメ
ガロウイルスエンハンサーおよびプロモーター、5'イン
トロンおよびsv40ポリアデニル化シグナルを含有するす
でに記載されたファージミドベクター（ゴーマン（Gorm
an）ら、DNA and Prot.Eng.Techn.、2:3−10［1990］）
中にクローニングした。バイオラドムタ−ジーン（Muta
−gene）ファージミドインビトロ突然変異誘発キットに
より提供される緩衝液および酵素並びに下記表６に示す
ヒトIgG1配列をコードするオリゴヌクレオチドを用い、
クンケル法（クンケル（T.A.Kunkel）、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA、82:488−492（1985））により突然変異誘発
を行った。変異体IgE DNAの配列は、³⁵Sジデオキシシー
クエンシングを用いて変異の部位のみを調べた。

上記IgE変異体をヒト脾臓293細胞（ゴーマンら、上
記）中で一過的に発現させ、マウス抗ヒトIgE抗体アフ
ィニティーカラム上で精製し、試料をSDS−PAGEを用い
て処理して変異体タンパク質が適切な分子量のものであ
ることを確認した。

実施例３ 可溶性FCEH結合アッセイ このアッセイは、FCEHに対する結合のみを測定する逐
次阻止ELISAである。このアッセイでは、FCEHに対する
モノクローナル抗体を50mM炭酸ナトリウム（pH9.6）中
の１μg/mlの濃度にてELISAプレート上に室温にて２時
間コーティングし、0.5％ウシ血清アルブミンを含有す
るPBS（PBSA）で２時間ブロックし、ついでELISA洗浄緩
衝液（PBS中の0.05％ツイーン20）で３回洗浄する。組
換え手法により製造した可溶性FCEHを50単位/mlの濃度
にて加えて１時間インキュベートし、ついでELISA洗浄
緩衝液中で５回洗浄する。ついで、変異体IgE試料をウ
エルに加え、１〜２時間インキュベートする。過剰の変
異体IgEを吸引により除去し、ついでビオチン化IgEを50
ng/mlの濃度にて15分間加え、ついでELISA洗浄緩衝液で
５回洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した
ストレプトアビジン（シグマ・ケミカル・カンパニー＃
S5512）を1:5000希釈にて15分間加え、ついでELISA洗浄
緩衝液で３回洗浄した。テトラメチルベンジジンペルオ
キシダーゼ基質系（キルケガール＆ペリー・ラブズ＃50
−76−00、ロット番号NA18）で25℃にて７分間発色させ
た。1M HClを加えて反応を停止させた。変異体IgEがFCE
Hに結合する能力は、ビオチン化IgEが結合が妨げられる
程度により評価する。このアッセイは変異体IgEによる
いかなるFCEH結合についても試験すべく設計してあり、
FCEHに対する変異体の新和性を天然IgEと比較して決定
することを意味するものではない。

U266 IgE変異体のためのFACSベースの結合アッセイ U266 IgE cDNAでトランスフェクションした293s細胞
からの組織培養上澄み液をトランスフェクション後48時
間または96時間のいずれかで回収した。組織培養上澄み
液をアミコンセントリプレプ30^R遠心濃縮機（30,000MW
カットオフ）で５×に濃縮した。濃縮した上澄み液をマ
ウスモノクローナル抗U266 IgEアフィニティーカラム
（CnBr−セファロースに結合させたジェネンテックMAE
1）に通した。50mMトリス緩衝液（pH7.8）中の3.0Mシア
ン化カリを用いてU266 IgEをカラムから溶出した。O.D.
280nmで測定したタンパク質を含有する溶出液画分をプ
ールし、アミコンセントリコン^Ｒ濃縮機中に入れた。複
数の容量のPBSを濃縮機に通すことにより溶出緩衝液をP
BSと交換した。アフィニティー精製した上澄み液の最終
容量は0.5〜1mlであった。組換えIgE変異体の構造的完
全さを１〜12％SDSPAGEゲル上で分析し、U266細胞株か
ら得たU266 IgE標準と比較した。また、一連のモノクロ
ーナル抗IgE抗体に結合する能力について変異体を分析
して、適切な畳み込み（folding）および天然IgEとの構
造的同一性をさらに確認した。各IgE変異体についての
免疫反応性IgEの濃度は、下記のようにしてヒトIgE捕捉
ELISAにより決定した。ヌンクイムノプレートマクシソ
ープ（Maxisorp）^Ｒプレート（ヌンク＃４−39451）を
コーティング緩衝液（50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.
6）中の１μg/mlにてジェネンテックのマウスIgG1抗U26
6 IgE（MAE1）で４℃にて一夜コーティングした。コー
ティング抗体をELISA洗浄緩衝液（PBS中の0.05％ツイー
ン20（米国バイオケミカル・コーポレーション＃2060
5））で３回洗浄して除去した。非特異的部位をオービ
タルシェーカー（orbital shaker）上、ELISA希釈緩衝
液（0.5％BSA（シグマ・ケミカル・カンパニー＃Ａ−78
88）、0.05％ツイーン20および2mM EDTAを含有する50mM
トリス緩衝食塩水）で25℃にて２時間ブロックした。ED
TA洗浄緩衝液で３回洗浄して希釈緩衝液を除去した。ED
TA希釈緩衝液中のIgE変異体の２倍系列希釈をプレート
に加えた。U266 IgE標準（ロット13 068−46）を、100
0、500、250、125、62.5、31.3および15.6ng/mlにて２
つずつ標準として加えた。試料および標準を25℃にて２
時間インキュベートし、ついでEDTA洗浄緩衝液で３回洗
浄した。EDTA希釈緩衝液中に1:8000のHRP結合ヒツジ抗
ヒトIgE（ICN＃N060−050−１）でIgEを25℃にて90分間
検出し、ELISA洗浄緩衝液で３回洗浄した。HRP結合体を
テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質系（キル
ケガール＆ペリーラブズ、＃50−76−00、ロット番号NA
18）で25℃にて７分間発色させた。1M HClを加えて反応
を停止させた。570nmでの吸光度を引いた450nmでの二重
波長分光光度計を用いて反応性生成物を分析した。U266
IgE標準を用いて標準曲線を作成し、試料のIgE濃度を
非母数線形回帰分析により外挿した。

FcER Iα（＋）CHO 3D10 B細胞（FCEHを発現する）お
よびFcER II（CD23）（＋）IM9 B細胞（FCELを発現す
る）を用いて結合アッセイを行った。安定にトランスフ
ェクションしたCHO（duk−）細胞クローン3D10（JBC 26
5、22079−22081、1990）を、10％熱不活化ウシ胎仔血
清、80μg/mlゲンタマイシン硫酸塩および５×10^-7Mメ
トトレキセートを添加したイスコーブの変性ダルベッコ
培地中に維持した。IM9ヒトＢ細胞ミエローマATCC CCL
159（Ann.N.Y.Acad.Sci.190:221−234、1972）は、10％
熱不活化ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシ
ン（100単位/ml）およびＬ−グルタミン（2mM）を含有
するGIF基礎培地中に維持した。各実験においてIM9細胞
の表面上のCD23レベルを決定するための陽性コントロー
ルとして、細胞のアリコートをベクトンディッキンソン
マウスモノクローナルLeu20（抗CD23）抗体（10μg/m
l）で４℃にて30分間染色し、ついでFACS緩衝液中で２
回洗浄した。ついで、細胞をFITC結合Ｆ（ab'）２アフ
ィニティー精製ヤギ抗マウスIgG（５μg/ml）とともに
インキュベートした。PBS中の10mM EDTAとともに37℃に
て２分間インキュベートすることにより、吸着したCHO
3D10細胞を組織培養ディッシュから除去した。細胞をカ
ウントし、ついでFACS緩衝液（PBS中の0.1％BSA、10mM
Naアジド、pH7.4）中に５×10⁶/mlの濃度にて再懸濁し
た。CHO 3D10細胞およびIM9細胞（５×10⁵/アリコー
ト）を96ウエルマイクロタイタープレート中、U266 IgE
標準またはIgE変異体（２μg/ml）を含有するFACS緩衝
液（100μｌ）中で４℃にて30分間インキュベートし、
ついでFACS緩衝液で２回洗浄した。コントロールとし
て、緩衝液単独中または２μg/mlヒトIgG1（ベーリング
・ダイアグノスティックス＃400112、ロット番号80102
4）を含有する緩衝液中で細胞をインキュベートした。
ついで、FITCを結合したウサギ抗ヒトIgE（アキュレー
ト・ケム、＃AXL 475F、ロット番号040A）を20μg/mlに
て含有するFACS緩衝液（100μｌ）中で細胞をインキュ
ベートした。プロピジウムヨーダイド（２μg/ml）を含
有する緩衝液（400μｌ）を細胞懸濁液に加えて死細胞
を染色した。ベクトンディッキンソンFACSCANフローサ
イトメーター上で細胞を分析した。前方光散乱ゲートお
よび90゜側方散乱ゲートをセットして細胞の均一な集団
を分析し、プロピジウムヨーダイドで染色された死細胞
は分析から排除した。FITCウサギ抗ヒトIgE単独で染色
された細胞に関してFITC陽性細胞（IgE結合）を分析し
た。

上記アッセイを用いて実施例２のIgE類似体がFCEHお
よびFCELに結合する能力を決定した。その結果を表７に
示す。

３つの変異体IgEはFCEHレセプターに対する結合の完
全な喪失を示した：変異体１、４および６。変異体６
は、Fcε２ドメインに近接したFcε３の末端にあるβ鎖
Ｄが変わっていた。変異体１および４は、Fcε４ドメイ
ンに隣接したおよび近くにある２つのFcε３ループの変
化を含んでいた。変異体７は、ループABの３つのＣ末端
残基がアラニンに変わった変異体１の部分集合であるこ
とに注意すべきである（表６、1vs7）。しかしながら、
変異体７はFCEHへの結合に影響を及ぼさない。本発明者
らは、このことを１）FcεR IがIgE残基377−381の少な
くとも一つに結合するか、または２）IgEループAB（８
残基）に対して置換されたIgG1ループAB（９残基）中の
特別の残基がある種の隣接する結合決定基、おそらくル
ープEFの変形に影響を及ぼしたかのいずれかを意味する
と解釈した。変異体８および10がFcεR I結合に対して
影響を及ぼさないのは、おそらく、ループABおよびβ鎖
Ｄにより結合された空隙中にFCEHレセプターが突出しな
いことを意味する。

変異体４はGly444を置換するLeuを有していたが（表
６）、これはループEFのコンフォメーションには影響を
及ぼさない。残基444は、このα−ヘリックスのＮ末端
の前にある。加えて、マウスIgEは位置444にValを有
し、ラットIgEはAspを有する。α−ヘリックスの中央に
ある２つの埋没した疎水性残基であるW448およびI449
は、α−ヘリックスの末端にあるG451がそうであるよう
に、置換されたIgG1ループ（W448、L449）中に保持され
る。それゆえ、ループEFのコンフォメーションは、IgE
およびIgG1で類似している。

変異体２および３は、FCEHに対して減少した結合を示
した。ループBCはβ鎖Ｄの近くに位置しループCDはルー
プEFの近傍に位置するので、ループBCおよびCD中の１ま
たは２の残基がFCEHと接触していると考えられる。

５つの変異体IgEはFCELレセプターに対する結合を喪
失した：変異体１、3 4、７および８。変異体１および
４については上記で議論した。変異体３にはループCDの
変化が関与していた;FCEHとは対照的に、ループCDは明
らかにFCEL結合において主要な役割を果たしている。変
異体７は上記のように変異体１の部分集合であるが、ル
ープABのＣ末端部分を含み、ループEFに近接している。
加えて、変異体８は２つのThr残基（387、389）のAlaに
よる置換からなっている；これら２つの残基は、β鎖Ｂ
（ループABとβ鎖Ｄとにより結合された上記空隙の底部
にある）の一部である。変異体10は、この空隙中のβ鎖
Ｅ（β鎖Ｂに隣接する）上の２つの異なる残基（438、4
40）を含んでいた。変異体10はFCEL結合に影響を及ぼさ
なかったので、本発明者らは、FCELレセプターは空隙中
に最小限の侵入のみを有しているべきであるが、高親和
性レセプターは該空隙中に突出していないと結論した。

Asn430にある糖付加部位（IgG Fc内の糖付加部位に対
応する）に加えて、ヒトIgEはAsn403に他の糖付加部位
を有する。変異体９では、Asn403およびThr405がアラニ
ンに変換されていた（表６）。炭水化物の喪失はいずれ
のレセプターに対する結合にも影響を及ぼさなかった。

変異体１〜13で得られた情報に基づき、本発明者ら
は、FCEHおよびFCELがIgE Fc上に異なるが重複する結合
部位を有することを提唱する。低親和性レセプターは、
３つの隣接するループ:AB、CDおよびEFが関与するIgE F
cε３ドメインの比較的小部分と相互反応すると思われ
る。対照的に、高親和性レセプターは、IgE Fcε３の一
層大きい部分と相互反応し、該部分はループEF、β鎖
Ｄ、およびおそらくはループABのＮ末端部分の範囲に及
ぶ。ループEFおよびβ鎖Ｄの近傍のループBCおよびCDの
一部もまたFCEHと相互反応する。加えて、FCELはループ
ABとβ鎖Ｄとにより結合された空隙内に突出するが、FC
EHはそのように突出しない。本発明者らはFcε４におい
てはいかなる変異体をも評価せずFcε２については一つ
の変異体のみを評価しただけであるので（変異体13）、
これら２つのドメインの一部がIgEレセプター結合にお
いて役割を果たしている可能性がある。

実施例４ ヒト化MAE11の調製 MAE11から残基を選択し、ヒトFab抗体背景中に挿入ま
たは置換した（V_H領域カバットサブグループIIIおよびV
_L領域κサブグループＩ）。第一の型、humae11v1または
１型を表８に記載する。

１型の親和性をアッセイしたところ、ドナー抗体MAE1
1の親和性に比べて約100倍低いことがわかった（図4aお
よび4b参照）。それゆえ、表９に示すように、１型の配
列においてさらに修飾を行った。これらさらなる修飾が
標識huIgEのFCEHへの結合を阻止する能力の決定を行っ
た。

50％阻止アッセイ（その結果を表９に示す）を以下の
ようにして行った： 96ウエルアッセイプレート（ヌンク製）を、１μg/ml
コーティング緩衝液（50ナノモル炭酸／重炭酸、pH9.
6）中のFcεR Iα鎖IgG1キメラレセプター（0.05ml）で
コーティングした。４〜８℃にて12時間アッセイを行っ
た。ウエルを吸引し、250μｌブロック緩衝液（PBS−−
１％BSA pH7.2）を加え、４℃にて１時間インキュベー
トした。別のアッセイプレートにて、アッセイ緩衝液
（0.5％BSA、0.05％ツイーン20、PBS、pH7.2）で１〜10
倍に希釈することにより試料および参照マウスMAE11抗
体を200μg/mlから滴定し、等容量の10ng/mlビオチン化
IgEを10ng/mlにて加え、プレートを25℃にて２〜３時間
インキュベートした。FcεR IコーティングウエルをPBS
−0.05％ツイーン20で３回洗浄し、ついで試料ウエルか
らの50μｌを移し、撹拌しながら25℃にて30分間インキ
ュベートした。アッセイ緩衝液中に1:5000に希釈した50
μl/ウエルのストレプトアビジン−HRPを撹拌しながら1
5分間インキュベートし、ついで上記と同様に洗浄し
た。50μl/ウエルのマイクロウエルペルオキシダーゼ基
質（キルケガール＆ペリー・ラボラトリーズ）を加え、
30分間発色させた。等容量の１規定HClを加えて反応を
停止させ、450nmにて吸光度を測定した。各抗体につい
てINPLOTを用い、非線形４因子曲線適合でブロックした
抗体の濃度に対して阻止％をプロットすることにより50
％阻止の濃度を計算した。

表９および図4aおよび4bから明らかなように、変異体
８（Ｌ鎖中の部位60および61において変異体１のヒト残
基がMAE11対応物で置換されている）が実質的に増大し
た親和性を示した。変異体8aおよび8b（１または２のマ
ウス残基がヒト残基を置換している）において親和性の
さらなる増大が認められる。他の増大が（少なくとも実
質的にMAE11のレベルまで）、V_HおよびV_H1の内部に認め
られる疎水性ヒト残基をMaE11対応物で置換して変異体
９として示される変異体とすることによって得られる
（表９および図4aおよび4b参照）。従って、この態様の
ヒト化抗体はMAE11の約0.1〜100倍の範囲の親和性を有
するであろう。

表10では、ヒト化MAE11 IgG1変異体の種々の組み合わ
せがFCEH親和性に及ぼす影響を調べる。

実施例５ IgE変異体の調製 IgE変異体（表11）を調製し、抗IgE（とりわけMAE1
1）に対する結合、およびFcεR IおよびFcεR IIに対す
る結合に及ぼす影響を評価した。幾つかの変異体は、特
定のアミノ酸残基を類似のまたは非常に異なる電荷また
はサイズを有する他の残基で置換するよう設計した。こ
れら変化がレセプター結合に及ぼす影響を下記表に示
す。

これらレセプターアッセイは実質的に下記のようにし
て行う： 96−ウエルアッセイプレート（ヌンク製）を１μg/ml
コーティング緩衝液（50ナノモル炭酸／重炭酸、pH9.
6）中のFcεR IおよびR II IgG1キメラレセプター（0.0
5ml）でコーティングした。アッセイを４〜８℃にて12
時間行った。ウエルを吸引し、250μｌブロック緩衝液
（PBS−１％BSA pH7.2）を加え、４℃にて１時間インキ
ュベートした。別のアッセイプレートで、アッセイ緩衝
液（0.5％BSA、0.05％ツイーン20、PBS、pH7.2）で１〜
10倍希釈することにより試料および参照マウスMAE11抗
体を200μg/mlから滴定し、等容量の10ng/mlビオチン化
IgEを10ng/mlにて加え、プレートを25℃にて２〜３時間
インキュベートした。FcεR IコーティングウエルをPBS
−0.05％ツイーン20で３回洗浄し、ついで試料ウエルか
らの50μｌを移し、撹拌しながら25℃にて30分間インキ
ュベートした。アッセイ緩衝液中に1:5000に希釈したス
トレプトアビジン−HRP（50μl/ウエル）を撹拌しなが
ら15分間インキュベートし、ついでプレートを上記のよ
うにした洗浄した。50μl/ウエルのマイクロウエルペル
オキシダーゼ基質（キルケガール＆ペリー・ラボラトリ
ーズ）を加え、30分間発色させた。等容量の１規定HCl
を加えることにより反応を停止させ、450nmにて吸光度
を測定した。吸光度をブロック抗体MAE11の濃度に対し
てプロットし、INPLOTを用いて阻止標準曲線を作成し
た。

配列表 配列番号（SEQ ID NO）:1 配列の長さ:118アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:2 配列の長さ:111アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:3 配列の長さ:134アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:4 配列の長さ:124アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:5 配列の長さ:130アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:6 配列の長さ:106アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:7 配列の長さ:137アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:8 配列の長さ:453アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:9 配列の長さ:218アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:10 配列の長さ:8アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:11 配列の長さ:9アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:12 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:13 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:14 配列の長さ:11アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:15 配列の長さ:11アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:16 配列の長さ:10アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:17 配列の長さ:10アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:18 配列の長さ:4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:19 （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:19: 配列の長さ:4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:20 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:21 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:22 配列の長さ:5アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:23 （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:23: 配列の長さ:5アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:24 配列の長さ:8アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:25 配列の長さ:8アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:26 配列の長さ:4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:27 配列の長さ:8アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:28 配列の長さ:9アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:29 配列の長さ:4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:30 配列の長さ:4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:31 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:32 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:33 配列の長さ:11アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:34 配列の長さ:11アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:35 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:36 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:37 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:38 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:39 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:40 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:41 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:42 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:43 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:44 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:45 配列の長さ:10アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:46 配列の長さ:10アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:47 配列の長さ:4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:48 配列の長さ:4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:49 配列の長さ:9アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:50 配列の長さ:9アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:51 配列の長さ:4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:52 配列の長さ:4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:53 配列の長さ:5アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:54 配列の長さ:5アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:55 配列の長さ:4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:56 配列の長さ:4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:57 配列の長さ:8アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:58 配列の長さ:8アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:59 配列の長さ:4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:60 配列の長さ:4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:61 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:62 配列の長さ:5アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:63 配列の長さ:5アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列： 配列番号（SEQ ID NO）:64 配列の長さ:5アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 16/28 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (36)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】FCEL−結合IgEには結合することができる
   がFCEH−結合IgEには実質的に結合することができない
   抗体であって、ヒトレシピエント抗体の少なくともFab
   領域のＬ鎖の残基30、30b、30d、33、53、91、92、93お
   よび94およびＨ鎖の残基27、28、29、29a、31、33、3
   4、50、52、53、54、55、58、95、97、98、99、100およ
   び101の一つまたはそれ以上を、ドナー抗体としての抗
   ヒトIgEマウスモノクローナル抗体MAE11、MAE13またはM
   AE15中の対応位置の残基、またはMAE11が有する特性を
   有する他のドナー抗体中の対応位置の残基で置換してな
   り、その際、抗体中のアミノ酸残基の番号付けはカバッ
   トらの番号付けに基づくものであり、該ドナー抗体MAE1
   1は配列番号２および３にそれぞれ示すＬ鎖アミノ酸配
   列およびＨ鎖アミノ酸配列を有し、該ドナー抗体MAE13
   は配列番号４および５にそれぞれ示すＬ鎖アミノ酸配列
   およびＨ鎖アミノ酸配列を有し、該ドナー抗体MAE15は
   配列番号６および７にそれぞれ示すＬ鎖アミノ酸配列お
   よびＨ鎖アミノ酸配列を有し、MAE11が有する該特性
   が、可溶性IgEに結合すること、IgE含有Ｂ細胞に結合す
   ること、FCELおよびFCEHへのIgEの結合をブロックする
   こと、インビトロでIgE産生を抑制すること、およびIgE
   でコーティングされた好塩基球には結合することができ
   ないことであることを特徴とする抗体。
2. 【請求項２】該ドナー抗体がMAE11である、請求項１に
   記載の抗体。
3. 【請求項３】該ヒトレシピエント抗体が、カバットのヒ
   トサブグループＩκ（Ｌ）鎖およびヒトサブグループII
   I H鎖を有する、請求項１または２に記載の抗体。
4. 【請求項４】IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4抗体である、
   請求項１ないし３のいずれかに記載の抗体。
5. 【請求項５】補体結合IgG抗体またはADCCに参画し得るI
   gG抗体である、請求項４に記載の抗体。
6. 【請求項６】該ヒトレシピエント抗体の少なくともFab
   領域の該Ｌ鎖の＿残基４、13、19、58、78および104、
   および該Ｈ鎖の＿残基48、49、60、63、67、69、78、82
   および82cから選ばれる一つまたはそれ以上の残基が該
   ドナー抗体中の対応位置の残基でさらに置換されてい
   る、請求項１ないし５のいずれかに記載の抗体。
7. 【請求項７】該ドナー抗体中のＬ鎖の＿疎水性残基13、
   19、58、78および104、およびＨ鎖の＿疎水性残基48、4
   9、63、67、69、78、82および82cを有する、請求項６に
   記載の抗体。
8. 【請求項８】該ドナー抗体中のＬ鎖の残基33および53、
   およびＨ鎖の残基24、37、50、52、58、60、61および95
   を有する、請求項６に記載の抗体。
9. 【請求項９】該ドナー抗体中のＬ鎖の残基30、30b、30
   d、33、55、57、58、78、93、94または104および／また
   はＨ鎖の残基24、37、48、49、54、57、60、61、63、6
   5、67、69、78、82、82c、97、100aまたは100cまたはこ
   れら残基に隣接する残基の置換、欠失または挿入を有す
   る、請求項１ないし５および６ないし８のいずれかに記
   載の抗体。
10. 【請求項１０】V_H中の残基78がフェニルアラニン置換さ
    れている、請求項９に記載の抗体。
11. 【請求項１１】V_H中の残基60がアスパラギンで置換され
    ている、請求項９に記載の抗体。
12. 【請求項１２】V_H中の残基61がプロリンで置換されてい
    る、請求項９に記載の抗体。
13. 【請求項１３】V_L1中の４つの挿入30a−30d並びにV_L3中
    の91−94、V_H1中の27−29、29a、31、33および34、V_H2
    中の53−55、およびV_H3中の97−101を含む残基がドナー
    抗体MAE11から移入されている、請求項６に記載の抗
    体。
14. 【請求項１４】ヒト化マウス抗体humae11 1型、２型、
    ３型、４型、５型、６型、７型、7a型、８型、8a型、8b
    型または９型のFab H鎖およびＬ鎖配列を含む抗体であ
    って、その際、該humae11 1型は配列番号８および９に
    それぞれ示すＨ鎖アミノ酸配列およびＬ鎖アミノ酸配列
    を有し、該humae11 2型〜９型は該humae11 1型が有する
    Ｈ鎖アミノ酸配列およびＬ鎖アミノ酸配列に対してさら
    に以下の修飾を有することを特徴とする抗体： （ａ）humae11 2型についてはV_L中にL4MおよびM33L; （ｂ）humae11 3型についてはV_L中にE55GおよびG57E; （ｃ）humae11 4型についてはV_H中にI37V; （ｄ）humae11 5型についてはV_H中にV24A; （ｅ）humae11 6型についてはV_H中にF78L; （ｆ）humae11 7型についてはV_L中にL4M、R24K、E55Gお
    よびG57E、およびV_H中にV24A、I37V、T57S、A60N、D61
    P、V63L、G65NおよびF78L; （ｇ）humae11 7a型についてはV_L中にL4M、R24K、E55G
    およびG57E、およびV_H中にV24A、I37V、T57S、A60N、D6
    1P、V63LおよびG65N; （ｈ）humae11 8型についてはV_H中にA60NおよびD61P; （ｉ）humae11 8a型についてはV_H中にA60N、D61P、V63L
    およびF67I; （ｊ）humae11 8b型についてはV_H中にA60N、D61Pおよび
    F67I; （ｋ）humae11 9型についてはV_L中にA13V、V19A、V58
    I、L78VおよびV104L、およびV_H中にV48M、A49G、A60N、
    V63L、F67I、I69V、M82LおよびL82cA （上記定義において抗体中のアミノ酸残基の番号付けは
    カバットらの番号付けに基づくものである）。
15. 【請求項１５】配列番号８および９にそれぞれ示すヒト
    化マウス抗体humae11 1型のFab H鎖アミノ酸配列および
    Ｌ鎖アミノ酸配列を含む抗体であって、残基60がアスパ
    ラギン酸で置換され、残基61がプロリンで置換され、残
    基67がイソロイシンで置換されている（抗体中のアミノ
    酸残基の番号付けはカバットらの番号付けに基づく）こ
    とを特徴とする抗体。
16. 【請求項１６】二特異的抗体である、請求項１ないし15
    のいずれかに記載の抗体。
17. 【請求項１７】FCEL結合IgEに対して一価であり、免疫
    グロブリンのエフェクター機能が可能であり、少なくと
    も２つのＨ鎖を含むFcドメインを含む、請求項１ないし
    16のいずれかに記載の抗体。
18. 【請求項１８】ヒト共通Ｈ鎖配列およびヒト共通Ｌ鎖配
    列を含む、請求項１ないし17のいずれかに記載の抗体。
19. 【請求項１９】IgEに対するMAE11の親和性と実質的に同
    じかまたはそれより大きいIgE親和性を有する、請求項
    １ないし18のいずれかに記載の抗体。
20. 【請求項２０】ヒトレシピエント抗体の少なくともFab
    領域のＬ鎖の残基30、30b、30d、33、53、91、92、93お
    よび93およびＨ鎖の残基27、28、29、29a、31、33、3
    4、50、52、53、54、55、58、95、97、98、99、100およ
    び101の一つまたはそれ以上を、ドナー抗体としての抗
    ヒトIgEマウスモノクローナル抗体MAE11、MAE13またはM
    AE15中の対応位置の残基、またはMAE11が有する特性を
    有する他のドナー抗体中の対応位置の残基で置換するこ
    とを含み、その際、抗体中のアミノ酸残基の番号付けは
    カバットらの番号付けに基づくものであり、該ドナー抗
    体MAE11は配列番号２および３にそれぞれ示すＬ鎖アミ
    ノ酸配列およびＨ鎖アミノ酸配列を有し、該ドナー抗体
    MAE13は配列番号４および５にそれぞれ示すＬ鎖アミノ
    酸配列およびＨ鎖アミノ酸配列を有し、該ドナー抗体MA
    E15は配列番号６および７にそれぞれ示すＬ鎖アミノ酸
    配列およびＨ鎖アミノ酸配列を有し、MAE11が有する該
    特性が、可溶性IgEに結合すること、IgE含有Ｂ細胞に結
    合すること、FCELおよびFCEHへのIgEの結合をブロック
    すること、インビトロでIgE産生を抑制すること、およ
    びIgEでコーティングされた好塩基球には結合すること
    ができないことであることを特徴とする、請求項１に記
    載のFCEL−結合IgEには結合することができるがFCEH−
    結合IgEには実質的に結合することができない抗体の製
    造方法。
21. 【請求項２１】該ドナー抗体がMAE11である、請求項20
    に記載の方法。
22. 【請求項２２】該ヒトレシピエント抗体が、カバットの
    ヒトサブグループＩκ（Ｌ）鎖およびヒトサブグループ
    III H鎖を有する、請求項20または21に記載の方法。
23. 【請求項２３】製造された抗体が、IgG1、IgG2、IgG3ま
    たはIgG4抗体である、請求項20ないし22のいずれかに記
    載の方法。
24. 【請求項２４】製造された抗体が、補体結合IgG抗体ま
    たはADCCに参画し得るIgG抗体である、請求項23に記載
    の方法。
25. 【請求項２５】該ヒトレシピエント抗体の少なくともFa
    b領域の該Ｌ鎖の＿残基４、13、19、58、78および104、
    および該Ｈ鎖の＿残基48、49、60、63、67、69、78、82
    および82cから選ばれる一つまたはそれ以上の残基を該
    ドナー抗体中の対応位置の残基でさらに置換する、請求
    項20ないし24のいずれかに記載の方法。
26. 【請求項２６】製造された抗体が、該ドナー抗体中のＬ
    鎖の＿疎水性残基13、19、58、78および104、およびＨ
    鎖の＿疎水性残基48、49、63、67、69、78、82および82
    cを有する、請求項25に記載の方法。
27. 【請求項２７】製造された抗体が、該ドナー抗体中のＬ
    鎖の残基33および53、およびＨ鎖の残基24、37、50、5
    2、58、60、61および95を有する、請求項25に記載の方
    法。
28. 【請求項２８】該ドナー抗体中のＬ鎖の残基30、30b、3
    0d、33、55、57、58、78、93、94または104および／ま
    たはＨ鎖の残基24、37、48、49、54、57、60、61、63、
    65、67、69、78、82、82c、97、100aまたは100cにてま
    たはそれら残基に隣接して置換、欠失または挿入を導入
    する、請求項20ないし27のいずれかに記載の方法。
29. 【請求項２９】V_H中の残基78をフェニルアラニンで置換
    する、請求項28に記載の方法。
30. 【請求項３０】V_H中の残基60をアスパラギンで置換す
    る、請求項28に記載の方法。
31. 【請求項３１】V_H中の残基61をプロリンで置換する、請
    求項28に記載の方法。
32. 【請求項３２】V_L1中の４つの挿入30a−30d並びにV_L3中
    の91−94、V_H1中の27−29、29a、31、33および34、V_H2
    中の53−55、およびV_H3中の97−101を含む残基をドナー
    抗体MAE11から移入する、請求項25に記載の方法。
33. 【請求項３３】製造された抗体が二特異的抗体である、
    請求項20ないし32のいずれかに記載の方法。
34. 【請求項３４】製造された抗体が、FCEL結合IgEに対し
    て一価であり、免疫グロブリンのエフェクター機能が可
    能であり、少なくとも２つのＨ鎖を含むのFcドメインを
    含む、請求項20ないし33のいずれかに記載の方法。
35. 【請求項３５】製造された抗体がヒト共通Ｈ鎖配列およ
    びヒト共通Ｌ鎖配列を含む、請求項20ないし34のいずれ
    かに記載の方法。
36. 【請求項３６】製造された抗体が、IgEに対するMAE11の
    親和性と実質的に同じかまたはそれより大きいIgE親和
    性を有する、請求項20ないし35のいずれかに記載の方
    法。