NO309946B1

NO309946B1 - FremgangsmÕte og blanding for behandling av celluloseholdige tekstiler ved bruk av kuttede cellulase-enzympreparater

Info

Publication number: NO309946B1
Application number: NO973517A
Authority: NO
Inventors: Timothy Fowler; Kathleen A Clarkson; Michael Ward; Katherine D Collier; Edmund Larenas
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 1995-02-01
Filing date: 1997-07-30
Publication date: 2001-04-23
Also published as: MX9705756A; NZ302866A; ATE350529T1; CN1172511A; US6620605B2; WO1996023928A1; FI973182A; BR9607160A; CA2211885A1; KR19980701825A; FI973182A0; DE69636809T2; EP0807193A1; US6268196B1; JPH10513230A; FI119820B; DE69636809D1; NO973517D0; US20020164774A1; EP0807193B1

Description

A. Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår forbedrede fremgangsmåter for behandling av bomullsholdige tekstiler og ikke-bomullsholdige cellulosetekstiler med cellulase. Særlig er de forbedrede fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen rettet mot å bringe bomullsholdige tekstiler og ikke-bomullsholdige tekstiler i kontakt med en vandig oppløsning inneholdende en cellulaseblanding som omfatter ett eller flere kuttede eller trunkerte cellulase-enzymer.

Oppfinnelsen angår også en blanding til bruk ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for behandling av en celluloseholdig tekstil.

B. Den k. jente teknikk

Under eller kun efter sin fremstilling kan bomullsholdige tekstiler behandles med cellulase for å gi tekstilene ønskede egenskaper. I celluloseindustrien er for eksempel cellulase benyttet for å forbedre grepet og/eller utseende av bomullsholdige tekstiler, for å fjerne overflatefibere fra bomullsholdige strikkevarer, for å gi bomullsholdige denim-utseende av stenvasking, og lignende.

Særlig har JP 58-36217 og 58-54032 så vel som Ohishi et al., "Eeformation of Cotton Fabric by Cellulase" samt JTN, desember 1988, artikkelen "What's New - Weight Loss Treatment to Soften the Touch of Cotton Fabric", alle beskrevet behandling av bomullsholdige tekstiler med cellulase med som resultat et forbedret grep for tekstilen. Det antas generelt at denne cellulasebehandling fjerner dun og/eller overflatefibere, noe som reduserer tekstilens vekt. Kombinasjonen av disse effekter gir tekstilen et forbedret grep.

I tillegg var det tidligere kjent ved denne teknikk å behandle strikkede, bomullsholdige tekstiler med en cellulaseoppløsning under omrørings- og kaskadebetingelser, for eksempel ved bruk av en stråle, for å fjerne brukne fibere og tråder felles for disse strikkede tekstiler.

Klær fremstilt fra cellulosetekstil som bomullsdenim, har en stiv tekstur på grunn av nærværet av limpreparater som benyttes for å lette fremstilling, behandling og montering av klesgjenstander og har karakteristisk et friskt, mørkfarvet utseende. Et ønskelig karakteristikum for indigo-farvet denimtøy er alterneringen av farvede tråder med hvite tråder, noe som gir denim et "hvitt-på-blått"-utseende.

Efter en periode med utstrakt slitasje og vasking kan klesgjenstandene, særlig denim, i klesflater eller på sømmer utvikle lokaliserte variasjonsarealer i form av en lysgjøring i dybden eller densiteten av farven. Generelt kan det skje en generell bleking av klærne, en viss rynking i sømmer og en viss krølling i tekstilf låtene. I tillegg blir lim efter vasking i det vesentlige fjernet fra tekstilen, noe som resulterer i en mykere grep. I den senere tid er et slikt brukt eller "stenvasket" utseende, særlig for denimklær, blitt meget populært for en vesentlig andel av publikum.

Tidligere metoder for å oppnå et brukt utseende inkluderte stenvasking av en klesgjenstand eller -gjenstander i et stort kar med pimpsten med en størrelse på ca. 2,5 til 25 cm og med mindre pimpstenpartikler dannet ved den abrasive art ved denne prosess. Når karakteristisk klesgjenstander tumles med pimpsten i våt tilstand i et tilstrekkelig tidsrom, slik at pimpstenen sliter på tekstilen for i tekstilgjenstandene å gi lokalisert nedslitte arealer med lysere farve og tilsvarende lysgjorte områder i sømmene. I tillegg mykgjør pimpstenene tekstilen og gir en dunet overflate som tilsvarer den som oppstår ved lang tids bruk og vasking. Denne metode gir den ønskede "hvit-på-blå"-kontrast som er beskrevet ovenfor.

Bruken av pimpsten har flere mangler inkludert over-belastningsskade på maskinmotorene, mekanisk skade på transportmekanismer og vasketromler, omgivelsesproblemer for grusen som dannes og høye arbeidsomkostninger i forbindelse med den manuelle fjerning av stenene fra plaggenes lommer.

I lys av de problemer som følger med pimpsten ved stenvasking, benyttes cellulaseoppløsninger som en erstatning for pimpsten under agiterings- og kaskadebetingelser, det vil si i vaskemaskiner med roterende trommel, for å gi denim et "stenvasket" utseende, se US 4 832 864.

Cellulaser er enzymer som hydrolyserer cellulose (g<->l,4-D-glukan-bindinger) og gir glukose, cellobiose, cellooligosakkarider og lignende som primærprodukter. Cellulaser fremstilles av et antall mikroorganismer og omfatter flere forskjellige enzymklassifikasjoner inkludert de som identifiseres som ekso-cellobiohydrolaser (CHB), endoglukanaser (EG) og p<->glukosidaser (BG) (se M. Schulein, 1988, "Methods in Enzymology", 160: 235-242).

Enzymene innen disse klassifikasjoner kan separeres i individuelle komponenter. For eksempel består cellulasen som fremstilles av den filamentøse fungus Trichoderma longibrachiatum, herefter kalt T. longibrachiatum, av minst to CBE-komponenter, nemlig CBHI og CBHII, og minst fire EG-komponenter, nemlig EGI, EGII, EGIII og EGV (A. Saloheimo et al., 1993, "Proceedings of the second TRICEL symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases", Espoo, Finland, utgitt av P. Suominen & T. Reinikainen, "Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research" 8: 139-146), og minst en g<->glukosidase. Genene som koder disse komponenter er nemlig respektivt cbhl, cbh2, egil, egl2, egl3 og egl5.

Det komplette cellulasesystem omfattende CBH-, EG- og BG-komponenter virker synergistisk for å konvertere krystallinsk cellulose til glukose. De to ekso-cellobiohydrolaser og de fire i dag kjente endoglukanaser virker sammen for å hydrolysere cellulose til små cello-oligosakkarider. Oligosakkaridene (hovedsakelig cellobioser) blir derefter hydrolysert til glukose ved en hoved-e-glukosidase (med mulig ytterligere hydrolyse fra mindre g-glukosidasekomponenter).

Et problem i forbindelse med bruken av komplette cellulose-preparater fra Trichoderma sp.-mikroorganismer og andre funguskilder for stenvasking av farvet denim, er en ufullstendig fjerning av farvestoff som benyttes på grunn av redeponering eller tilbakeflekking av noe av farvestoffet tilbake på tøyet under stenvaskingsprosessen. Når det gjelder denimtekstiler forårsaker dette omfarving av de blå tråder og blåfarving av de hvite tråder, noe som resulterer i mindre kontrast mellom de blå og hvite tråder og slitasjepunkter (det vil si et "blått-på-blått"-utseende heller enn det foretrukne "hvitt-på-blått"), se til dette "American Dyestuff Reporter", september 1990, sidene 24-28. Denne gjenavsetning er lite akseptert av enkelte brukere.

Trichoderma-cellulaser er, selv om de resulterer i tilbakeflekking, foretrukne på grunn av deres høyere aktivitet på denimmaterialet. I tillegg kan cellulaser med en høyere grad av renhet være fordelaktige ifølge oppfinnelsen. Høy spesifikk aktivitet eller høye nivåer av renhet resulterer i en høyere grad av slitasje i signifikant kortere behandlings-tidsrom og er derfor foretrukket for denimprodusentene.

Forsøk på å redusere mengden av gjenavsetning av farvestoff har inkludert tilsetning av ekstra kjemikalier eller enzymer som overflateaktive midler eller surfaktanter, proteaser eller andre midler, til cellulosevasken for å understøtte dispergering av utløst farvestoff. I tillegg har produsentene benyttet mindre aktiv hel cellulase sammen med ekstra vasking. Imidlertid resulterer dette i ytterligere kjemi-kal ieomkostninger og lengere behandlingstider. En ytterligere metode inkluderer bruken av et mildt blekemiddel eller et flekkfjerningsmiddel i prosessen. Denne metode påvirker tøyets endelige sjattering og øker behandlingstiden. Til slutt medfører bruken av enzymer og sten sammen at produ-senten sitter tilbake med alle problemene som forårsakes ved bruken av kun sten. I tillegg ville det være ønskelig å finne en metode for å forhindre gjenavsetning av farvestoff under stenvasking med cellulaser.

Proteinanalyse av cellobiohydrolasene (CBHI og CBHII) og de vesentlige endoglukanaser (EGI og EGII) av T. longibrachiatum har vist at en bifunksjonell organisering foreligger i form av et katalytisk kjerneområde og et mindre cellulosebindings-område separert av en linker eller en fleksibel hengsel-streng av aminosyrer som er rike på prolin og hydroksyamino-syrer. Gener for de to cellobiohydrolaser, CBHI og CBHII (se S. Shoemaker et al., 1983, "Bio/Technology", 1, 696-699 og T. Teeri et al., 1987, "Gene", 51, 43-52) og to hovedendogluka-naser, EGI og EGII (M. Penttila et al., 1986, "Gene", 45, 253-263, J.N. Van Ardell et al., 1987, "Bio/Technology", 5, 60-64 og M. Saloheimo et al., 1988, "Gene", 63, 11-21) er isolert fra T. longibrachiatum og proteindomenestrukturen er bekreftet.

En lignende bifunksjonell organisasjon av cellulaseenzymer er funnet i bakterielle cellulaser. Cellulosebindingsdomenet (CB) og den katalytiske kjerne av Cellulomonas fimi-endoglukanase A (C. fimi Cen A) er studert utstrakt (E. Ong et al., 1989, "Trends Biotechnol.", 7: 239-243, Pilz et al., 1990, "Biochem. J.", 271: 277-280 og Warren et al., 1987, "Proteins", 1: 335-341). Genfragmenter som koder CBD og CBD med linkeren er klonet, uttrykt i E. coli og vist å ha nye aktiviteter på cellulosefibere (N.R. Gilkes et al., 1991, "Microbiol. Rev.", 55: 305-315 og N. Din et al., 1991, "Bio/Technology", 9: 1096-1099). For eksempel avbryter isolert CBD fra C. fimi Cen A genetisk uttrykt i E. coli, strukturen av cellulosefibere og frigir små partikler, men har ingen detekterbar hydrolytisk aktivitet. CBD har videre et vidt anvendelsesområde ved proteinrensing og enzymimmobi-lisering. På den andre side brøt det katalytiske området av C. fimi Cen A, isolert fra proteasespaltet cellulase, ikke fibrilstrukturen for cellulose og glattet tvert imot fiber-overflaten.

Trichoderma longibrachiatum CBHI-kjerneområdet er separert proteolytisk og renset, men kun mg-mengder er isolert ved denne biokjemiske prosedyre (D. Offord et al., 1991, "Applied Biochem. and Biotech.", 28/29: 377-386). Tilsvarende studier ble gjort i en analyse av kjerne- og bindingsdomenet av CBHI, CBHII, EGI og EGII isolert fra T. longibrachiatum efter biokjemiske proteolyser, men kun tilstrekkelig protein ble gjenvunnet for strukturell og funksjonell analyse (P. Tomme et al., 1988, "Eur. J. Biochem.", 170: 575-581 og S. Ajo, 1991, "FEBS", 291: 45-49). I henhold til dette har den kjente teknikk ikke erkjent de forbedringer som er mulige ved tekstilbearbeiding ved bruk av cellulasekjerneområdet eller cellulosebindingsdomeneområdene.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

En gjenstand for foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for behandling av celluloseholdlge tekstiler som resulterer i redusert gjenavsetning av farvestoff ved et ekvivalent nivå av slitasje av tekstilen som behandles, i forhold til den kjente teknikk.

Ytterligere en gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe en vaskemiddelsblanding med egenskaper av redusert gjenavsetning av farvestoff ved et ekvivalent nivå av slitasje i forhold til vaskemiddelsblandinger ifølge den kjente teknikk.

Nok en gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe en stenvaskingsblanding med egenskaper for redusert gjenavsetning av farvestoff ved et ekvivalent nivå av slitasje i forhold til kjente stenvaskingsblandinger.

I henhold til oppfinnelsen tilveiebringes det en fremgangsmåte for behandling av celluloseholdlge tekstiler med cellulase og som karakteriseres ved trinnene: (a) å bringe den ceulluloseholdige tekstil i kontakt med en behandlingsblanding omfattende 0,1 til 1000 ppm trunkert cellulase, trunkert cellulaseadditiv eller en naturlig opptredende cellulase som mangler et cellulosebindingsdomene, valgt blant EGI-typekjerne, EGII-typekjerne, EGV-typekjerne, CBHI-typekjerne, CBHII-typekjerne eller

derivater derav; og

(b) inkubering av den celluloseholdlge tekstil i kontakt med den trunkerte cellulase eller trunkerte cellulasederivat under betingelser som bevirker behandling av tekstilen.

Videre angår oppfinnelsen en blanding for behandling av en celluloseholdig tekstil og denne blanding karakteriseres ved at den omfatter 0,1 til 1000 ppm av en trunkert cellulase eller et derivat derav, valgt blant EGI-typekjerne, EGII-typekjerne, EGV-typekjerne, CBHI-typekj erne, CBHII-typekjerne eller derivater derav.

I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringes det en vaskemiddels- eller stenvaskingsblanding omfattende trunkert cellulaseenzym. På grunn av den overraskende redusert gjenavsetningsaktivitet for det trunkerte cellulaseenzympreparat ifølge oppfinnelsen, vil celluloseholdlge tekstiler forbedres i en overraskende grad ved rengjøring eller stenvasking med et egnet blanding omfattende trunkert enzym.

En fordel ved oppfinnelsen er at det tilveiebringes et cellulasepreparat omfattende trunkerte cellulosekjerne-enzymer, alene eller i kombinasjon med andre trunkerte cellulosekjerne- eller ikke-trunkerte cellulaser, noe som gir ønskelige kvaliteter til de celluloseholdige tekstiler.

TEGNINGSBESKRIVELSE

Figurene l(a) - l(b) viser den genomiske DNA og aminosyresekvensen for CBHI avledet fra Trichoderma longibrachiatum. Signalsekvensen begynner ved basepar 210 og slutter ved basepar 260 (SEQ ID nr. 25). Det katalytiske kjerneområdet begynner ved basepar 261 til og med basepar 671 av exon 1, basepar 739 til og med basepar 1434 av exon 2 og basepar 1498 til og med basepar 713 i exon 3 (SEQ ID nr. 9). Linkersekvensen begynner ved basepar 714 og slutter ved basepar 1785 (SEQ ID nr. 17). Cellulosebindingsdomenet begynner ved basepar 1786 og slutter ved basepar 1888 (SEQ ID nr. 1). SEQ ID nr. 26, 10, 18 og 2 representerer aminosyresekvensen for respektivt CBHI-signalsekvensen, det katalytiske kjernedomenet, linkerområdet og bindingsdomenet. Figur 2(a) - 2(b) viser den genomiske DNA og aminosyresekvensen for CBHII avledet fra Trichoderma longibrachiatum. Signalsekvensen begynner ved basepar 614 og slutter ved basepar 685 (SEQ ID nr. 27). Cellulosebindingsdomenet begynner ved basepar 686 til og med basepar 707 av exon 1, og basepar 755 til og med basepar 851 av exon 2 (SEQ ID nr. 3). Linkersekvensen begynner ved basepar 852 og slutter ved basepar 980 (SEQ ID nr. 19). Den katalytiske kjerne begynner ved basepar 981 til og med basepar 1141 av exon 2, basepar 1199 til og med basepar 1445 av exon 3 og basepar 1536 til og med basepar 2221 av exon 4 (SEQ ID nr. 11). SEQ ID nr. 28, 4, 20 og 12 representerer aminosyresekvensen av respektivt CBHII-signalsekvensen, bindingsdomenet, linkerområdet og det katalytiske kjernedomenet. Figur 3 viser den genomiske DNA og aminosyresekvensen av EGI. Den signalsekvens begynner ved basepar 113 og slutter ved basepar 178 (SEQ ID nr. 29). Det katalytiske kjerneområdet begynner ved basepar 179 til og med basepar 882 av exon 1, og basepar 963 til og med basepar 1379 av exon 2 (SEQ ID nr. 13). Linkerområdet begynner ved basepar 1380 og slutter ved basepar 1460 (SEQ ID nr. 21). Cellulosebindingsdomenet begynner ved basepar 1461 og slutter ved basepar 1616 (SEQ ID nr. 5). SEQ ID nr. 30, 14, 22 og 6 representerer aminosyresekvensen respektivt for EGI-signalsekvensen, det katalytiske kjernedomenet, linkerområdet og bindingsdomenet. Figur 4 viser den genomiske DNA og aminosyresekvensen for EGII. Signalsekvensen begynner ved basepar 262 og slutter ved basepar 324 (SEQ ID nr. 31). Cellulosebindingsdomenet begynner ved basepar 325 og slutter ved basepar 432 (SEQ ID nr. 7). Linkerområdet begynner ved basepar 433 og slutter ved basepar 534 (SEQ ID nr. 23). Det katalytiske kjernedomenet begynner ved basepar 535 til og med basepar 590 i exon 1, og basepar 765 til og med basepar 1689 i exon 2 (SEQ ID nr. 15). SEQ ID nr. 32, 8, 24 og 16 representerer aminosyresekvensen respektivt for EGII-signalsekvensen, bindingsdomenet, linkerområdet og det katalytiske kjernedomenet. Figur 5 viser den genomiske DNA og aminosyresekvensen for EGIII. Signalsekvensen begynner ved basepar 151 og slutter ved basepar 198 (SEQ ID nr. 35). Det katalytiske kjerneområdet begynner ved basepar 199 til og med basepar 557 i exon 1, basepar 613 til og med basepar 833 i exon 2 og basepar 900 til og med basepar 973 i exon 3 (SEQ ID nr. 33). SEG ID nr. 36 og 34 representerer aminosyresekvensen av respektivt EGIII-signalsekvensen og det katalytiske kjernedomenet . Figur 6 viser konstruksjonen av EGI-kjernedomene-ekspresjonsvektoren (SEQ ID nr. 37). Figur 7 viser konstruksjonen av ekspresjonsplasmid pTEX (SEQ

ID nr. 39-41).

Figur 8 viser konstruksjonen av CBHI-kjernedomene-ekspresjonsvektoren (SEQ ID nr. 38). Figur 9 viser konstruksjonen av CBHII-kjernedomene-eks-presj onsvektoren. Figur 10 viser abrasjons/gjenavsetningsresultatene som oppnås ved sammenligning av EGI med EGI-kjerne og EGII med EGII-kjerne. Figur 11 viser forbedringen i abrasjons/gjenavsetnings-resultatene for EGIII-behandlet denim, når CBHI-kjerne blir tilsatt.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

I. Def inisjoner

"Bomullsholdig tekstil" betyr sydd eller ikke-sydd tekstil fremstilt fra ren bomull eller bomullsblandinger inneholdende bomullsvevede tekstiler, bomullsstrikkevarer, bomullsdenim, bomullsgarn og lignende. Når bomullsblandinger benyttes, bør bomullsmengden i tekstilen være minst 40 vekt-# og fortrinnsvis er det til stede mer enn 60 vekt-# bomull, aller helst mer enn 75 vekt-$ bomull. Ved benyttelse som blandinger kan det ledsagende materialet som benyttes i tekstilen inkludere en eller flere ikke-bomullsfibere inkludert syntetiske fibere som polyamidfibere (for eksempel nylon 6 og nylon 66), akrylfibere (for eksempel polyakrylnitrilfibere) og poly-esterfibere (for eksempel polyetylentereftalat), polyvinyl-alkoholfibere (for eksempel Vinylon), polyvinylkloridfibere, polyvinylidenkloridfibere, polyuretanfibere, polyureafibere og aramidfibere.

"Celluloseholdig tekstil" betyr en hvilken som helst bomulls-eller ikke-bomullsholdig cellulosetekstil eller bomulls-eller ikke-bomullsholdig celluloseblanding inkludert naturlige cellulosestoffer og menneskefremstilte cellulosestoffer (som jute, flaks, ramle, rayon, TENCEL®). Inkludert under betegnelsen menneskelaget celluloseholdlge tekstiler ligger regenererte tekstiler som er velkjente i teknikken, for eksempel rayon. Andre menneskelagte celluloseholdlge tekstiler inkluderer kjemisk modifisert cellulosefibere (for eksempel cellulose som er derivatisert med acetat) og oppløsningsmiddelspunnede cellulosefibere (for eksempel lyocell). Inkludert i definisjonen av celluloseholdig tekstil er selvfølgelig et hvilket som helst plagg eller garn fremstilt av slike materialer. På samme måte inkluderer "celluloseholdig tekstil" tekstilfibere fremstilt av slike materialer.

"Behandlingsblanding" betyr en blanding omfattende en trunkert cellulasekomponent som kan benyttes ved behandling av en celluloseholdig tekstil. En slik behandling inkluderer, men er ikke begrenset til stenvasking, modifisering av teksturen, grepet og/eller utseende av celluloseholdlge tekstiler eller andre teknikker som benyttes under fremstilling av celluloseholdlge tekstiler. I tillegg er behandling innenfor foreliggende oppfinnelseskontekst også ment å omfatte fjerning av "død bomull" fra cellulosetekstiler eller —fibere, det vil si immatur bomull som er signifikant mere amorf enn maturbomull. Dødbomull er kjent å forårsake ujevn farving. I tillegg betyr "behandlingsblanding" en blanding som omfatter en trunkert cellulasekomponent som kan benyttes ved vasking av en tilsmusset, fremstilt celluloseholdig tekstil. For eksempel kan trunkert cellulose benyttes i en vaskemiddelsblanding for maskinvasking. Vaskemiddelsblandinger som kan benyttes ifølge oppfinnelsen omfatter spesielle formuleringer som forvask-, forbløtings- og hjemmefarverestaureringsblandinger. Behand-

lingsb landinger kan foreligge i form av et konsentrat som krever fortynning eller i form av en fortynnet oppløsning eller en form som kan bringes direkte på den celluloseholdlge tekstil.

Det er foreliggende oppfinneres antagelse at virknings-mønsteret for cellulase på celluloseholdlge tekstiler ikke blir vesentlige anderledes uansett om det brukes som en stenvaskingsblanding under fremstilling eller under maskinvasking av en tilsmusset celluloseholdig tekstil. Således vil forbedrede egenskaper som abrasjon, gjenavsetning av farvestoff, styrketap og forbedret grep som oppnås ved en viss cellulase eller en blanding av cellulaser, oppnås i både vaskemiddels- og fremstillingsprosesser som omfatter cellulase. Selvfølgelig kan formuleringene for spesifikke blandinger for de forskjellige tekstilanvendelser av cellulase, for eksempel stenvaskings- eller maskinvaske-middels eller forbløting, skille seg fra hverandre på grunn av de forskjellige anvendelsesformer mot hvilke de forskjellige blandinger er rettet, som her antydet. Imidlertid vil forbedringene som oppnås ved tilsetning av cellulasepreparater generelt være konsistente gjennom hver av de forskjellige tekstilanvendelser.

"Stenvaskingsblanding" betyr en formulering for bruk ved stenvasking av celluloseholdlge tekstiler. Stenvaskingsblandinger eller —blandinger benyttes for å modifisere celluloseholdlge tekstiler før de presenteres for salg til forbruker, det vil si under fremstillingsprosessen, i motsetning til vaskemiddelblandinger som er ment for ren-gjøring av tilsmussede plagg.

"Stenvasking" betyr behandling av farvet celluloseholdig tekstil med en cellulaseoppløsning under betingelser for agitering og kaskadering, det vil si en vaskemaskin med roterende trommel, som gir denim et "stenvasket" utseende. Fremgangsmåter for å tilveiebringe et stenvasket utseende for

denim er beskrevet i US 4 832 864. Generelt anvendes stenvaskingsteknikker på farvet denim.

"Vaskemiddelblanding" betyr en blanding som er ment for anvendelse i et vaskemedium for rengjøring av tilsmussede celluloseholdlge tekstiler. Innenfor oppfinnelsens kontekst kan slike blandinger i tillegg til cellulaser og surfaktanter, inneholde mange additiver, inkludert, men ikke begrenset til, ytterligere hydrolytiske enzymer, byggere, blekemidler, blåfarvingsmidler og fluorescensfarvestoffer, klumpinhibitorer, maskeringsmidler, cellulaseaktivatorer, antioksydanter og oppløseliggjørere. Slike blandinger benyttes generelt for rengjøring av tilsmussede plagg og benyttes ikke under fremstillingsprosessen, i motsetning til stenvaskingsblandinger.

"Gjenavsetningscellulase" betyr cellulaser der den enzymatiske stenvasking eller annen behandling av celluloseholdlge tekstiler ved bruk av cellulaseoppløsninger, særlig denim, resulterer i gjenavsetning av farvestoff på substratet. Denne effekt kalles også ofte tilbakeflekking. Slik tilbakeflekking av tekstilen fører til ufullstendig stenvasking fordi gjenavsetningen, i stedet for den ønskede blå-på-hvit-kontrast oppstår en blå-på-blå-farve. Gjenavsetningscellu-laser inkluderer de som er avledet fra mikroorganismer som fungal mikroorganismen Trichoderma sp. og lignende. Særlig er EGI, EGII, CBHI og CBHII kjent å vise signifikant gjenavset-ningsoppførsel i ikke-trunkert tilstand.

"Overflateaktivt middel eller surfaktant" betyr anioniske, ikke-ioniske og amfolytiske surfaktanter som er velkjente for deres anvendelse i vaskemiddelblandinger.

"Vaskemedium" betyr en vandig vaskeoppløsning som fremstilles ved å sette en nødvendig mengde av en vaskemiddelblanding til vann. Vaskemediet inneholder generelt en rengjørende effektiv mengde av vaskemiddelsen.

"Cellulolytiske enzymer" eller "cellulaseenzymer" betyr fungal ekso-glukanaser eller ekso-cellobiohydrolaser, endoglukanaser og p<->glukosidaser. Disse tre forskjellige typer av cellulaseenzymer virker synergistisk for å konvertere cellulose eller derivater derav, til glukose. Analyse av genene som koder for CBHI, CBHII, EGI, EGII og EGV i Trichoderma longibrachiatum viser en domenestruktur omfattende et katalytisk kjerneområde eller domene (CCD), et hengsel- eller linkerområde (benyttet om hverandre her) og cellulosebindingsregion eller —område (CDB).

Et cellulasepreparat som fremstilles fra en naturlig forekommende kilde og som omfatter en eller flere cellobiohydrolasetype- og endoglukanasetypekomponenter der hver av disse komponenter finnes i det forhold i hvilket de fremstilles av kilden, kalles noen ganger her et "komplett cellulasesystem" eller et "komplett cellulasepreparat" for å skille det fra klassifikasjoner og komponenter av cellulase som er isolert derfra, fra ikke-komplette cellulasepreparater som fremstilles av bakterier og visse fungi, fra en cellulaseblanding oppnådd fra en mikroorganisme som er genetisk modifisert for å overprodusere, underprodusere eller ikke produsere en eller flere av cellobiohydrolasetype- og/eller endoglukanasetypekomponentene av cellulase, eller fra en trunkert cellulaseenzymblanding, som her definert.

Foreliggende oppfinnelse kontemplerer spesifikt applikabili-teten på cellulaser som inneholder kjerne- og bindings-domeneområder som her definert. For eksempel er bakterielle cellulaser fra Thermonospora sp., Cellulomonas sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp. kjent for å ha både et bindingsdomeneområde og et kjerneområde.

Foretrukket for anvendelse ifølge oppfinnelsen er fungale cellulaser. Mere spesielt er de fungale cellulaser avledet fra Trichoderma sp., inkludert Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Pencillium sp., Humicola sp., inkludert Humicola insolens, Aspergillus sp. og Fumarium sp. Slik uttrykkene her er brukt, betyr "Trichoderma" eller "Trichoderma sp." hvilke som helst fungale stammer som tidligere er klassifisert som Trichoderma og som i dag er klassifisert som Trichoderma. Aller helst er cellulasene avledet fra Trichoderma longibrachiatum eller Trichoderma viride.

"Fungal cellulase" betyr et enzympreparat som er avledet fra fungale kilder eller mikroorganismer som genetisk er modifisert til å innarbeide og uttrykke alle eller en del av cellulasegenene som oppnås fra en fungal kilde. Fungi som er i stand til å produsere cellulaser som kan benyttes ved fremstilling av cellulasepreparater som her beskrevet, er beskrevet i GB 2 094 826A.

De fleste fungale cellulaser har generelt sin optimale aktivitet i det sure eller- nøytrale pH-området, selv om enkelte fungale cellulaser er kjent å ha signifikant aktivitet under nøytrale eller lett alkaliske betingelser, således er for eksempel cellulase avledet fra Humicola insolens kjent for å ha aktivitet under nøytrale til lett alkaliske betingelser.

Fungale cellulaser er kjent for å være omfattet av flere enzymklassifikasjoner med forskjellige substratspesifisitet, enzymatiske virkningsmønstere og lignende. I tillegg kan enzymkomponenter innen hver klassifikasjon vise forskjellige molekylvekter, forskjellige grader av glykosylering, forskjellige isoelektriske punkter, forskjellig substrat-spesif isitet og så videre. For eksempel kan fungalcellulaser inneholde cellulaseklassifikasjoner som inkluderer endoglukanasetypekomponenter (herefter kalt "EG-type"), ekso-cellobiohydrolasetypekomponenter (herefter kalt "CBH-type"), e-glukosidasetypekomponenter (herefter kalt "BG-type"), og så videre. På den annen side og mens bakterielle cellulaser er angitt i litteraturen som inneholdende lite eller ingen CBH-typekomponenter, er det noen få tilfeller der CBH-typekomponenter som er avledet fra bakterielle cellulaser er angitt å ha ekso-cellobiohydrolaseaktivitet.

Fermenteringsprosedyrene for dyrking av fungi og for produksjon av cellulaser er kjent per se. For eksempel kan cellulasesystemer fremstilles enten ved fast eller neddykket kultur inkludert sats-, mate-sats- og kontinuerligstrøm-prosesser. Samling og rensing av cellulasesystemene fra fermenteringsbuljongen kan også gjennomføres ved prosedyrer i og for seg kjent i teknikken.

"Endoglukanasetypekomponenter" eller "EG-type" betyr fungale cellulasekomponenter eller en kombinasjon av komponenter som viser tekstilaktivitetsegenskaper lik de til endoglukanasekomponentene av Trichoderma longibrachiatum (tidligere klassifisert som Trichoderma reesei). I denne forbindelse er endoglukanasekomponentene av Trichoderma longibrachiatum (for eksempel EGI, EGII, EGIII og EGV, enten alene eller i kombinasjon) kjent å gi forbedret grep, forbedret utseende, mykgjøring, farveforbedring og/eller stenvaskutseende til denimtekstiler (sammenlignet med tekstilet før behandling) når disse komponenter innarbeides i et tekstilbehandlings-medium og tekstilen behandles med dette medium.

I henhold til dette er endoglukanasetypekomponenter de cellulasekomponenter som gir spesifikke forbedringer til celluloseholdige tekstiler som nettopp forbedret grep, forbedret utseende, mykgjøring, farveforbedring og/eller et stenvasket utseende (sammenlignet med tekstilen før behandling) når disse komponenter innarbeides i et medium som benyttes for å behandle tekstilene. Visse EG-typekomponenter inkludert EGI, EGII og EGIII kan gi redusert styrketap til denimtekstiler sammenlignet med det styrketap som oppstår fra behandling med et tilsvarende cellulasepreparat, men som i tillegg inneholder CBHI-typekomponenter. Endoglukanasetypekomponenter som her definert, behøver ikke inkludere komponenter som tradisjonelt er klassifisert som endoglukanaser ved bruk av aktivitetstester som evnen for komponenten

(a) til å hydrolysere oppløselige cellulosederivater som karboksymetylcellulose (CMC), for derved å redusere

viskositeten av CMC-holdige oppløsninger,

(b) lett å hydrolysere hydratiserte former av cellulose som fosforsyre-svellet cellulose (for eksempel Walseth-cellulose) og hydrolysere mindre lett de høyere krystal-linske former av cellulose (for eksempel Avicel,

Solkafloc, og så videre).

På den annen side antas det at ikke alle endoglukanasekompo-nenter, slik de er definert ved slike aktivitetstester, vil gi en eller flere av forbedringene til celluloseholdlge tekstiler, inkludert redusert styrketap. For foreliggende oppfinnelses formål er det i henhold til dette hensiktsmessig å definere endoglukanasetypekomponenter som de komponenter av fungal cellulase som har tilsvarende tekstilmodifikasjons-egenskaper som endoglukanasekomponentene av Trichoderma longibrachiatum har.

De forskjellige komponenter har generelt forskjellige egenskaper som isoelektrisk punkt, molekylvekt, glykosy-leringsgrad, substratspesifisitet og enzymatiske virk-ningsmønstere. De forskjellige isoelektriske punkter for komponentene tillater deres separering via teknikker som ionebyttekromatografi. I tillegg er isolasjonen av komponentene fra forskjellige kilder, velkjent. Se for eksempel Bjørk et al. i US 5 120 463; Schulein et al. i V/0 89/09259; Wood et al. i "Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation", sidene 31-52 (1988); Wood et al. i "Carbohydrate Research", vol. 190, sidene 279-297 (1988); Schulein i "Methods in Enzymology", vol. 160, sidene 234-242 (1988); og lignende. Uttrykket "EGI" henviser til en endoglukanasetypekomponent som karakteristisk avledes fra eller inkorporerer de identifiserende karakteristika for de som avledes fra EGI av Trichoderma sp. Således henviser EGI til en endoglukanase som er avledet fra Trichoderma sp. karakterisert ved et pH-optimum på ca. 4,0 til 6,0, et isoelektrisk punkt (pl) fra 4,5 til 4,7 samt en molekylvekt på 47 til 49 kDalton. Fortrinnsvis er EGI avledet fra enten Trichoderma longibrachiatum eller fra Trichoderma viride. EGI avledet fra Trichoderma longibrachiatum har et pH-optimum på ca. 5,0, et isoelektrisk punkt (pl) på ca. 4,7 og en molekylvekt på ca. 47 til 49 kDalton. EGI-cellulase avledet fra Trichoderma viride har et pH-optimum på ca. 5,0, et isoelektrisk punkt (pl) på ca. 5,3 og en molekylvekt på ca. 50 kDalton.

Uttrykket "EGII" slik det her er definert, henviser til en endoglukanasetypekomponent som karakteristisk avledes fra eller omfatter de identifiserende karakteristika for de som avledes fra EGII av Trichoderma sp. Det skal påpekes at EGII tidligere er betegnet ved nomenklaturen "EGIII" av enkelte forfattere, men dagens nomenklatur benytter uttrykket EGII. I ethvert tilfelle er EGII-proteinet slik det her er definert, i det vesentlig forskjellig fra EGIII-proteinet når det gjelder molekylvekt, pl og pH-optimum. Uttrykket "EGII-cellulase" henviser til endoglukanasekomponenten som er avledet fra Trichoderma spp. karakterisert ved et pH-optimum på ca. 4,0 til 6,0, et isoelektrisk punkt (pl) fra ca. 5,5 og en molekylvekt på 48 kDalton. Fortrinnsvis er EGII-cellulasen avledet fra enten Trichoderma longibrachiatum eller fra Trichoderma viride.

Uttrykket "EGIII-cellulase" slik det her defineres, henviser til en endoglukanasetypekomponent som karakteristisk avledes fra eller inkorporerer de identifiserende karakteristika for de som er avledet fra EGIII av Trichoderma sp. Således henviser EGIII til den endoglukanasekomponent som er avledet fra Trichoderma spp. karakterisert ved et pH-optimum på ca. 5,0 til 7,0, et isoelektrisk punkt (pl) fra ca. 7,2 til 8,0 og en molekylvekt fra ca. 23 til 28 kDalton. Fortrinnsvis er EGIII-cellulasen avledet fra enten Trichoderma longibrachiatum eller fra Trichoderma viride. EGIII-cellulaser som er avledet fra Trichoderma longibrachiatum har et pH-optimum på 5,5 til 6,0, et isolelektrisk punkt (pl) på 7,4 og en molekylvekt på 25 til 28 kDalton. EGIII-cellulaser som er avledet fra Trichoderma viride har et pE-optimum på ca. 5,5, et isoelektrisk punkt på ca. 7,7 og en molekylvekt på ca. 23,5 kDalton.

Uttrykket "EGV-cellulase" slik det her defineres, henviser til en endoglukanasetypekomponent som karakteristisk er avledet fra, eller som inkorporerer de identifiserende karakteristika for de som er avledet fra EGV av Trichoderma sp. Således henviser EGV til den endoglukanasekomponent som er avledet fra Trichoderma sp. slik den er karakterisert av Saloheimo et al., "Molecular Microbiology", 13(2): 219-228

(1994); samt "Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and other Eydrolases" Espoo, Finland, 1993, utgitt av P. Suominen & J.T. Reinikainen, "Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research" 8, sidene 139-146 (1993).

"Ekso-cellobiohydrolasetypekomponenter" eller "CBE-type" betyr fungale cellulasekomponenter som viser tekstilaktivitetsegenskaper lik CBEI- og/eller CBEII-cellulasekomponenter av Trichoderma longibrachiatum. I denne forbindelse og benyttet i fravær av EG-type-cellulasekomponenter (som definert ovenfor), erkjennes CBEI- og CBEII-komponenter av Trichoderma longibrachiatum alene som ikke å gi noen vesentlige forbedringer i grep, utseende, mykning, farveforbedring og/eller stenvaskingsutseende for denimtekstiler. Benyttet i kombinasjon med enkelt EG-typekomponenter i et forhold på ca. 2,5:1 CBEI:EG-komponenter, gir i tillegg CBEI-komponenten av Trichoderma longibrachiatum forbedret styrketap for denimtekstilene.

I henhold til dette henviser CBHI-typekomponenter og CBHII-typekomponenter til de fungale cellulasekomponenter som viser tekstilaktivitetsegenskaper tilsvarende CBHI- og CBHII-komponenter av Trichoderma longibrachiatum. Som angitt ovenfor inkluderer dette, for CBHI-typekomponenter, egen-skapen av å øke styrketapet i denimtekstiler som er behandlet med CBHI i nærvær av EG-typekomponenter.

Ekso-cellobiohydrolasetypekomponentene som her definert, behøver ikke inkludere komponenter som tradisjonelt er klassifisert som ekso-cellobiohydrolaser ved bruk av aktivitetstestene som de som ble benyttet for å karakterisere CBHI og CBHII fra Trichoderma longibrachiatum. For eksempel blir ekso-cellobiohydrolasetypekomponenter (a) kompetitivt inhibert av cellobiose (K-^ ca. 1 mM); (b) ikke i stand til å hydrolysere substituerte celluloser i noen vesentlig grad, for eksempel karboksymetylcellulose,

og

(c) hydrolyserer fosforsyre-svellet cellulose og i mindre

grad sterkt krystallinsk cellulose.

På den annen side antas det at noen cellulasekomponenter som karakteriseres som CBH-typekomponenter ved disse aktivitetstester, vil gi forbedret grep, utseende, mykgjøring, farveforbedring og/eller stenvasket utseende til celluloseholdlge tekstiler når de benyttes alene i cellulaseprepara-tene. I henhold til dette antas det å være mere nøyaktig for oppfinnelsens formål å definere slik ekso-cellobiohydrolaser som EG-typekomponenter på grunn av at disse komponenter har tilsvarende funksjonelle egenskaper i tekstilanvendelser som endoglukanasekomponentene av Trichoderma longibrachiatum har.

Generelt kan cellulaseblandinger eller -preparater som omfatter de forskjellige komponenter av en komplett cellulaseblanding ("helcellulase") oppnås ved renseteknikker som er basert på deres kjente karakteristika og egenskaper. Spesielt kan helcellulasen renses til i det vesentlige rene komponenter ved velkjente separasjonsteknikker som er publisert i litteraturen, inkludert ionebyttingskromatografi ved egnet pH-verdi, affinitetskromatografi, størrelses-eksklusjon og lignende. For eksempel er det ved ionebyttekromatografi (vanligvis anionbyttekromatografi) mulig å separere cellulasekomponentene ved eluering med en pH-gradient, eller en saltgradient, eller både en pH- og saltgradient. Efter rensing kan den nødvendige mengde av de ønskede komponenter rekombineres.

Uttrykket "trunkert cellulase", slik det her benyttes, henviser til et protein omfattende en trunkert cellulase-katalytisk kjerne eller trunkert cellulosebindingsdomene av ekso-cellobiohydrolase eller endoglukanase, for eksempel EGI-type, EGII-type, EGIII-type, EGV-type, CBHI-type, CBHII-type eller derivater derav. Som angitt ovenfor antas mange cellulaseenzymer å være bifunksjonelle dithen at de inneholder domener som er rettet mot katalytisk eller hydrolytisk aktivitet med henblikk på cellosesubstratet, og også ikke-katalytisk cellulosebindingsaktivitet. Således er en trunkert cellulase en cellulase som i en intakt form inneholder både en kjerne- og et bindingsdomene, men som er behandlet til å mangle det ene eller andre domene.

Det katalytiske kjerne- og cellulosebindingsdomene for et cellulaseenzym antas å virke sammen på synergistisk måte for å bevirke effektiv og ofte skadelig hydrolyse av cellulosefibere i celluloseholdlge tekstiler. Videre antas katalytisk cellulaseaktivitet og cellulosebindingsaktivitet å være spesifikk for distinkte, strukturelle domener. Som antydet ovenfor er mange cellulaseenzymer, inkludert cellulaser fra for eksempel T. longibrachiatum og Humicola insolens, kjent for å omfatte en katalytisk kjernedomene-subenhet som er festet via et linkerområde til en cellulosebindingsdomene-subenhet.

Et "trunkert cellulasederivat" omfatter en trunkert cellulasekjerne eller trunkert cellulosebindingsdomene som definert her, der det kan være en addisjon eller en delesjon av en eller flere aminosyrer ved både den C- og N-terminale ende av den trunkerte cellulase, eller en substitusjon, et innskudd eller en delesjon av en eller flere aminosyrer ved ett eller flere seter gjennom den trunkerte cellulase. Derivater inkluderer mutanter som bevarer deres karakter som trunkert cellulasekjerne eller trunkert cellulosebindingsdomene, som antydet ovenfor. Med uttrykket "derivat av en trunkert cellulase" er det også ment å inkludere kjerne-eller bindingsdomener av ekso-glukanase- eller endoglucanase-enzymer som til seg har festet en eller flere aminosyrer fra linkerområdet.

Et trunkert cellulasederivat henviser videre til et protein som i det vesentlige er likt i struktur og biologisk aktivitet med en trunkert cellulasekjerne- eller trunkert cellulosebindingsdomeneprotein, mens som genetisk er behandlet for å inneholde en modifisert aminosyresekvens. Forutsatt at de to proteiner har i det vesentlige tilsvarende aktivitet, ansees de således om "derivater" selv om primær-strukturen for et protein ikke har den identiske aminosyresekvens med den som finnes i den andre.

Det er tatt sikte på at et trunkert cellulasederivat kan avledes fra et DNA-fragment som koder en katalytisk trunkert kjerne eller et trunkert cellulosebindingsdomene som videre inneholder en addisjon av ett eller flere nukleotider internt eller ved 5'- eller 3'-enden av DNA-fragmentet, en delesjon av en eller flere nukleotider internt eller ved 5'- eller 3'-enden av DNA-fragmentet, eller en substitusjon av ett eller flere nukleotider internt eller ved 5'- eller 3'-enden av DNA-fragmentet, der den funksjonelle aktivitet av det uttrykte, trunkerte cellulosebindings- eller katalytiske kjernedomene (trunkert cellulasederivat er bibeholdt.

Et DNA-fragment som koder et katalytisk cellulasekjerne-eller cellulosebindingsdomene kan videre inkludere en linker-

eller hengsel-DNÅ-sekvens eller en del derav, festet til kjerne- eller bindingsdomene-DNA-sekvensen ved enten 5'-eller 3'-enden der den funksjonelle aktivitet for det kodede, trunkerte cellulosebindingsdomene eller cellulasekjernedomene (trunkert cellulasederivat) er bibeholdt.

Uttrykket "trunkert cellulasekjerne" eller "trunkert cellulaseområde" er heri ment å bety et peptid omfattende det katalytiske kjerneområdet av ekso-cellobiohydrolase eller endoglukanase, for eksempel EGI-type, EGII-type, EGV-type, CBHI-type eller CBHII-type eller et derivat derav som er i stand til enzymatisk å spalte cellulosepolymerer, inkludert, men ikke begrenset til masse eller fosforsyre-svellet cellulose. Imidlertid vil en trunkert cellulasekjerne ikke ha cellulosebindingsaktivitet som kan skyldes et cellulosebindingsdomene. En trunkert cellulasekjerne skiller seg fra en ikke-trunkert cellulase som, i intakt form, har dårlig cellulosebindingsaktivitet. En trunkert cellulasekjerne kan inkludere andre enn entiteter som ikke inkluderer cellulosebindingsaktivitet som kan tilskrives et cellulosebindingsdomene. For eksempel er det tatt sikte på nærværet av en linker eller et hengsel. På tilsvarende måte er den kovalente festing av en annen enzymatisk entitet til den trunkerte cellulasekjerne, også spesielt tatt sikte på.

Ytelsen (eller aktiviteten) for et protein inneholdende en trunkert, katalytisk kjerne eller et derivat derav, kan bestemmes ved i og for seg kjente metoder, se til dette T.M.

V/ood et al. i "Methods in Enzymology", vol. 160, utgivere: W.A. Wood og S.T. Kellogg, Academic Press, sidene 87-116, 1988). For eksempel kan slike aktiviteter bestemmes ved hydrolyse av fosforsyre-svellet cellulose og/eller opp-løselige oligosakkarider, fulgt av kvantifisering av de frigitte, reduserende sukkere. I dette tilfellet kan de oppløselige sukkerprodukter, frigitt ved virkningen av CBH-eller EG-cellulasekjernedomener eller derivater derav, detekteres med HPLC-analyse eller ved bruk av kolorimetrisk analyser for måling av reduserende sukkere. Det er ventet at disse katalytiske domener eller derivater derav vil behold minst 10% av aktiviteten som vises av det intakte enzym, når hvert analyseres under tilsvarende betingelser og dosert basert på tilsvarende mengder av katalytisk domeneprotein.

Uttrykket "trunkert cellulosebindingsdomene" henviser her til et peptid eller en gruppe av beslektede peptider omfattende cellulosebindingsaktivitet av en ekso-cellobiohydrolase eller en endoglukanase, for eksempel EGI-type, EGII-type, EGV-type, CBHI-type eller CBHII-type, eller et derivat derav som ikke-kovalent binder til et polysakkarid som cellulose. Det antas at cellulosebindingsdomenene fester enzymet til cellulosen og virker uavhengig av den katalytiske kjerne av cellulaseenzymet. Et trunkert cellulosebindingsdomene vil ikke ha den signifikante hydrolytiske aktivitet som kan tilskrives en katalytisk kjerne. Et trunkert cellulosebindingsdomene skiller seg fra en ikke-trunkert cellulase som, i intakt form, ikke har noen katalytisk cellulasekjerne. Et trunkert cellulosebindingsdomene kan inkludere andre entiteter som ikke inkluderer cellulosespaltingsaktivitet som kan tilskrives katalytisk cellulasekjerne. For eksempel er det særlig tatt sikte på nærværet av en linker eller et hengsel. På tilsvarende måte er det også spesifikt tatt sikte på kovalent festing av en annen enzymatisk entitet til det trunkerte cellulosebindingsdomenet.

Ytelsen (eller aktiviteten) for et trunkert cellulosebindingsdomene eller et derivat derav som beskrevet ifølge oppfinnelsen kan bestemme ved cellulosebindingsanalyser ved bruk av cellulosesubstrater som Avicel, masse eller bomull. Det er ventet at disse nye, trunkerte cellulosebindingsdomener eller derivater derav vil bibeholde minst 10% av bindingsaffiniteten sammenlignet med den som vises av det ikke-trunkerte enzym, når hver analyseres under tilsvarende forbindelser, og doseres basert på tilsvarende mengder av bindingsdomeneprotein. Mengden av ikke-bundet bindingsdomene kan kvantifiseres ved direkte proteinanalyse, ved kromatografiske metoder eller eventuelt ved immunologiske metoder.

Andre metoder som er velkjente i teknikken og som måler katalytisk cellulase- og/eller bindingsaktivitet via de fysikalske eller kjemiske egenskaper for spesielt behandlede substrater, kan også være egnet ifølge oppfinnelsen. For metoder som måler fysikalske egenskaper av et behandlet substrat, blir for eksempel substratet analysert for modifikasjon av form, tekstur, overflate eller strukturelle egenskaper, modifikasjon av "fukte"-evnen, for eksempel substratets evne til å absorbere vann, eller modifikasjon av svell ingen. Andre parametere som kan bestemme aktiviteten inkluderer måling av endringen i de kjemiske egenskaper av de behandlede, faste substrater. For eksempel kan diffusjons-egenskapene av farvestoffer eller kjemikalier undersøkes efter behandling av fast substrat med det trunkerte cellu-lasebindingsprotein eller derivat derav som beskrevet ifølge oppfinnelsen. Egnede substrater for evaluering av aktiviteten inkluderer Avicel, rayon, massefibere, bomulls- eller ramiefibere, papir, kraft- eller malt tremasse, se også T.M. Wood et al. i "Methods in Enzymology", vol. 160, utgivere: W.A. Wood og S.T. Kellogg, Academic Press, sidene 87-116,

(1988).

I tillegg til trunkert cellulasekjerne har naturlig forekommende cellulaser som mangler et bindingsdomene, fordelen av de her' definerte, trunkerte, katalytiske kjerner. For eksempel antas bakteriell cellulase som er avledet fra Erwinia catotovora å ikke ha noe bindingsområde, se for eksempel Saarilahti et al. "Gene", vol. 90, sidene 9-14

(1990). På samme måte antas cellulaser som er avledet fra Clostridium thermocellum heller ikke å ha noe bindingsdomene, se for eksempel Gilkes et al. i "Micobiological Reviews", sidene 303-315 (1991). Således vil bruken av naturlig forekommende cellulaser uten bindingsdomene gi en redusert tilbakeflekking ved ekvivalente nivåer av abrasjon i forhold til kjente cellulaser.

"g—glukosidase-(BG)komponenter" betyr komponenter av en komplett cellulaseblanding som viser BG-aktivitet; det vil si at slike komponenter vil virke fra den ikke-reduserende ende av cellobiose og andre oppløselige cellooligosakkarider ("cellobiose") og gi glukose som eneste produkt. BG-komponentene adsorberer ikke på eller reagerer med cellulosepolymerer. Videre er slike BG-komponenter kompetitivt inhibert av glukose (K^ ca. 1 mM). Mens BG-komponenter i strikt betydning ikke bokstavelig er cellulaser fordi de ikke kan bryte ned cellulose, er slike BG-komponenter inkludert innenfor rammen av cellulasesystemet, fordi disse enzymer letter den totale nedbrytning av cellulose ved videre nedbrytning av de inhibitoriske cellulosenedbrytnings-produkter (spesielt cellobiose) som produseres ved den kombinerte virkning av CBH-typekomponenter og EG-typekomponenter .

Metoder for enten å øke eller å redusere mengden av BG-komponenter i cellulaseblandinger er beskrevet i WO 92/10581.

"Linker- eller hengselområde" betyr et kort peptidområde som forbinder strukturelt distinkte katalytisk kjerne- og cellulosebindingsdomener av en cellulase. Disse domener i T. longibrachiatum-cellulaser er for eksempel forbundet via et peptid som er rikt på Ser, Thr og Pro.

"Signalsekvens" betyr en sekvens av aminosyrer som er bundet til den N-terminale del av et protein og som letter sekre-sjonen av den mature form av proteinet utenfor cellen. Denne definisjon av en signalsekvens er en funksjonell. Den mature form av det ekstracellulære protein mangler signalsekvensen som spaltes av under sekresjonsprosessen.

"Vertscelle" betyr en celle som virker som en vert for en rekombinant DNA-vektor. I en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen betyr "vertscelle" både cellene og protoplaster som er dannet fra celler av Trichoderma sp.

"DNA-konstrukt eller —vektor" slik uttrykket her benyttes, betyr en nukleotidsekvens som omfatter ett eller flere DNA-fragmenter eller DNA-variantfragmenter som koder for en hvilken som helst av de nye, trunkerte cellulaser eller derivater som beskrevet ovenfor.

"Funksjonelt festet til" betyr at et regulatorisk område, for eksempel en promoter, terminator, sekresjonssignal eller enhancerområdet er festet til et strukturelt gen og kontrol-lerer ekspresjonen av dette gen.

"Buffer" betyr i teknikken velkjente syre/base-reagenser som stabiliserer cellulaseoppløsningen mot uønskede pH-skift under cellulasebehandlingen av den celluloseholdlge tekstil. I denne forbindelse er det velkjent at cellulaseaktiviteten er pH-avhengig. For eksempel vil et spesifikt cellulasepreparat vise cellulolytisk aktivitet innen et definert pH-område med optimal cellulolytisk aktivitet generelt funnet innen en liten del av dette definerte området. Det spesifikke pH-området for cellulolytisk aktivitet vil variere med hver cellulaseblanding. Mens de fleste cellulaser vil vise cellulolytisk aktivitet innen en sur til nøytral pH-profil, er det, som angitt ovenfor, visse cellulasepreparater eller —blandinger som viser cellulolytisk aktivitet i alkaliske pH-omgivelser.

Under cellulasebehandling av celluloseholdlge tekstiler er det mulig at pH-verdien i den opprinnelige cellulaseoppløs-ning kan ligge utenfor området som er krevet for cellulaseaktivitet. Det er videre mulig at pH-verdien endres under behandlingen av den celluloseholdlge tekstil, for eksempel ved dannelse av et reaksjonsprodukt som endrer oppløsningens pE-verdi. I ethvert tilfelle kan pH-verdien for en ikke-bufret cellulaseoppløsning ligge utenfor det området som er nødvendig for cellulolytisk aktivitet. Når dette skjer inntrer det uønsket reduksjon eller opphør av cellulolytisk aktivitet i cellulaseoppløsningen.

I lys av det ovenfor anførte bør pH-verdien for cellulase-oppløsningen holdes innen det området som er krevet for cellulolytisk aktivitet. Et middel for oppnåelse av dette er ved ganske enkelt å overvåke pH-verdien i systemet og justere pE-verdien som krevet ved tilsetning av enten en syre eller en base. Imidlertid opprettholdes, i en foretrukken ut-førelsesf orm , pE-verdien i systemet fortrinnsvis innen det ønskede pE-området ved bruk av en buffer i cellulaseoppløs-ningen. Generelt benyttes det en tilstrekkelig mengde buffer slik at pH-verdien i oppløsningen holdes innen det området der den benyttede cellulase viser aktivitet. I den grad forskjellige cellulasepreparater har forskjellige pE-områder for å vise cellulaseaktivitet, blir den spesifikke, benyttede buffer valgt i lys av den benyttede, spesifikke cellulaseblanding. Den eller de valgte buffere for anvendelse sammen med cellulaseblandingen som benyttes kan lett bestemmes av fagmannen tatt i betraktning pE-området og optimum for cellulasepreparatet som benyttes, så vel som pE-verdien for cellulaseoppløsningen. Fortrinnsvis er bufferen som benyttes en som er kompatibel med cellulasepreparatet og som vil opprettholde pE-verdien i cellulaseoppløsningen til innenfor det pE-området som er krevet for optimal aktivitet. Egnede buffere omfatter natriumcitrat, ammoniumacetat, natrium-acetat, dinatriumfosfat og hvilke som helst andre velkjente buffere.

II. Fremstilling av trunkerte cellulaseenzymer

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelsen av trunkerte cellulaser og derivater av trunkerte cellulaser. Disse enzymer fremstilles fortrinnsvis ved rekombinante metoder. I tillegg kan trunkerte cellulaseproteiner for anvendelse i forbindelse med foreliggende oppfinnelse oppnås ved andre kjente metoder som kjemisk spalting eller proteolyse av komplett cellulaseprotein.

En foretrukken måte for fremstilling av trunkert cellulase omfatter å oppnå en modifisert Trichoderma sp.-vertscelle som mangler en eller flere cellulaseaktiviteter. Den modifiserte Trichoderma sp.-celle transformeres med et DNA-konstrukt omfattende minst et fragment av DNA som koder en del eller hele av bindings- eller kjerneområdet av en ekso-cellobiohydrolase eller en endoglukanase, for eksempel EGI, EGII, EGV, CBHI eller CBHII, funksjonelt festet til en promoter. Den transformerte vertscelle dyrkes så under betingelser som muliggjør ekspresjon av det ønskede protein. Derefter blir det ønskede proteinproduktet renset til i det vesentlige homogenitet.

Fortrinnsvis er mikroorganismen som skal transformeres, en stamme som er avledet fra Trichoderma sp. Fortrinnsvis omfatter stammen T. longibrachiatum-cellulase over-produ-serende stamme. For eksempel er EL-P37, beskrevet av Sheir-Neiss et al. i "Appl. Microbiol. Biotechnology", 20 (1984) sidene 46-53 kjent å skille ut høye mengder av cellulase-enzymer. Funksjonelle ekvivalenter av RL-P37 inkluderer Trichoderma longibrachiatum, stamme RUT-C30 (deponert under ATCC nr. 56765) samt ATCC-deponeringsnumrene 58351, 58352 og 58353.

Ennu mere foretrukket har Trichoderma-vertscellestammene ett eller flere cellulasegener deletert før innføring av et DNA-konstrukt eller -plasmid inneholdende DNA-fragmentet som koder det trunkerte cellulaseprotein. Slike stammer kan fremstilles ved den metode som er beskrevet av US 5 246 853 og V/0 92/06209. Ved å uttrykke en trunkert cellulase i en vertsmikroorganisme som mangler ett eller flere cellulasegener, forenkles identifiseringen og den efterfølgende renseprosedyre. Et hvilket som helst gen fra Trichoderma sp. som er klonet, kan deleteres, for eksempel genene cbhl, cbh2, egil og egl3.

Gendelesjon kan gjennomføres ved å skyte inn en form av det ønskede gen som skal deleteres eller disrupteres inn i et plasmid ved i og for seg kjente metoder. Et egnet delesjons-plasmid vil generelt ha tilstedeværende, unike restrik-sjonsenzymseter som muliggjør at fragmentet av homolog Trichoderma sp. DNA kan fjernes som et enkelt, lineært stykke. Delesjonsplasmidet kuttes så ved egnede restrik-sjonsenzymseter, internt til det kodende området, og den gen-kodende sekvens eller en del av denne erstattes med en selekterbar markør. Flankerende DNA-sekvenser fra locus av genet som skal deleteres eller disrupteres, fortrinnsvis mellom 0,5 og 2,0 kb, forblir på hver side av det selekterbare markørgen.

En selekterbar markør må velges for å muliggjøre deteksjon av den transformerte fungus. Et hvilket som helst selekterbart markørgen som uttrykkes i den selekterte mikroorganisme vil egne seg. Med Trichoderma sp. blir for eksempel den selekterbare markør valgt slik at nærværet av den selekterbare markør i transformantene ikke signifikant påvirker disses egenskaper. En slik selekterbar markør kan være et gen som koder et analyserbart produkt. For eksempel kan en funksjonell kopi av et Trichoderma sp.-gen benyttes som, hvis det mangler i vertsstammen, resultere i at vertsstammen viser en auksotro-fisk fenotype.

I en foretrukken utførelsesform blir en pyr4"-derivatstamme av Trichoderma sp. transformert slik at ett eller flere cellulasegener erstattes med pyr4-genet for derved å tilveiebringe en selekterbar markør. En pyr4~-derivatstamme kan oppnås ved å underkaste Trichoderma sp.-stammer behandling med fluororonsyre, FOA. pyr4-genet koder orotidin-5'-monofosfatdekarboksylase, et enzym som er nødvendig for biosyntesen av uridin. Stammer med et intakt pyr4-gen vokser i et medium som mangler uridin, men er sensitivt overfor fluororonsyre. Det er mulig å selektere pyr4~-derivatstammer som mangler funksjonelt orotidinmonofosfatdekarboksylaseenzym og krever uridin for vekst, ved å selektere på FOA-resistens. Ved bruk av FOA-seleksjonsteknikken er det også mulig å oppnå uridin-krevende stammer som mangler en funksjonell orotatpyrofosforibosyltransferase. Det er mulig å transformere disse celler med en funksjonell kopi av genet som koder dette enzym, se Berges og Barreau, 1991, "Curr. Genet.", 19, sidene 359-365). Seleksjonen av derivatstammer er lett gjennomført ved bruk av FOA-resistentteknikken som er nevnt ovenfor og derfor er pyr4-genet fortrinnsvis benyttet som selekterbar markør.

For å transformere pyr4" Trichoderma sp. til å mangle evnen til å uttrykke ett eller flere cellulasegener, blir et enkelt DNA-fragment omfattende et disruptert eller deletert cellulasegen så isolert fra delesjonsplasmidet og benyttet for å transformere en egnet pyr- Trichoderma-vert. Transformanter identifiseres derefter og selekteres basert på evnen til å uttrykke pyr4-genproduktet og derved også uridin-auksotrofien hos vertsstammen. Southern-blott-analyse gjennomføres derefter på de resulterende transformanter for å identifisere og å bekrefte en dobbelt cross-over-integrasjon og som erstatter deler av eller hele det kodende området av genet som skal deleteres med de pyr4-selekterbare markører.

Selv om de spesifikke plasmidvektorer som er beskrevet ovenfor angår fremstilling av pyr~-transformanter, er oppfinnelsen ikke begrenset til disse vektorer. Forskjellige gener kan deleteres og erstattes i Trichoderma sp.-stammen ved bruk av teknikkene ovenfor. I tillegg kan en hvilken som helst tilgjengelig, selekterbar markør benyttes slik det er diskutert ovenfor. Derfor kan et hvilket som helst Trichoderma sp.-gen som er klonet og således identifisert, deleteres fra genomet ved bruk av strategien ovenfor.

Som angitt ovenfor er vertsstammene som benyttes derivater av Trichoderma sp. som mangler eller har et ikke-funksjonelt gen eller gener som tilsvarer den valgte, selekterbare markør. Hvis for eksempel den selekterbare markør for pyr4 velges, benyttes så en spesifikk pyr-derivatstamme som resipient i transformeringsprosedyren. På tilsvarende måte kan det benyttes selekterbare markører omfattende Trichoderma sp.-gener ekvivalent til Aspergillus nidulans-genene argB, trpC, niaD. Den tilsvarende resipientstamme må derfor være en derivatstamme som respektivt argB-, trpC<->, niaD-.

DNA som koder det trunkerte cellulaseprotein prepareres så for innskyting i en egnet mikroorganisme. I henhold til oppfinnelsen omfatter DNA som koder for et trunkert cellulaseenzym DNA som koder for et protein som tilsvarer det katalytiske kjerneområdet av cellulaseenzymet. I henhold til dette kan DNA avledes fra en hvilken som helst mikrobiell kilde som er kjent for å produsere cellulase, der genet er identifisert og isolert. I en foretrukken utførelsesform koder DNA for et trunkert cellulaseprotein avledet fra Trichoderma sp. og fortrinnsvis fra Trichoderma longibrachiatum. Således kan DNA'et kode for et EGI-, EGII-, CBHI-eller CBHII-kjerneprotein. Fortrinnsvis koder DNA-gen-fragmentet eller variant-DNA-fragmentet for kjerne- eller bindedomenene av en Trichoderma sp.-cellulase eller et derivat derav som i tillegg bibeholder den funksjonelle aktivitet for respektivt den trunkerte kjerne- eller bindingsdomene. Videre kan DNA-fragmentet eller varianten derav omfattende sekvensen av kjerne- eller bindingsdomene-områdene i tillegg til seg bundet en linker eller et hengselområde-DNA-sekvens eller en del derav, der den kodede, trunkerte cellulase fremdeles beholder enten cellulasekjerne-eller bindingsdomeneaktiviteten.

DNA-fragmentet eller DNA-variantfragmentet som koder trunkert cellulase eller et derivat kan funksjonelt festes til en fungal promotersekvens, for eksempel promoteren av cbhl-eller egll-genet. Det er også tatt sikte på at mer enn en kopi av DNA som koder en trunkert cellulase, kan rekombineres inn i stammen.

DNA'en som koder det trunkerte cellulaseprotein kan fremstilles ved konstruksjon av en ekspresjonsvektor som bærer DNA'en som koder den trunkerte cellulase. Ekspresjonsvektoren som bærer det innskutte DNA-fragment som koder den trunkerte cellulase kan være en hvilken som helst vektor som er i stand til autonomt å replikere i en gitt vertsorganisme, karakteristisk et plasmid. I foretrukne utførelsesformer tas det sikte på to typer ekspresjonsvektorer for å oppnå ekspresjon av gener eller trunkasjoner derav. Den første inneholder DNA-sekvenser hvori promoteren, genkodeområdet, og terminator-sekvensen alle stammer fra genet som skal uttrykkes. Gentrunkasjonen oppnås ved å deletere de uønskede DNA-sekvenser (som koder for uønskede domener) for å efterlate domenet som skal uttrykkes under kontroll av sine egne transkripsjonene og translasjonene regulatoriske sekvenser. En selekterbar markør er også inneholdt på vektoren, noe som tillater seleksjon for integrasjon inn i verten av multiple kopier av de sine gensekvenser.

For eksempel inneholder pEGlA3'pyr EGI-cellulasekjernedomenet under kontroll av EGI-promoter-, terminator- og signal-sekvensene. 3'-enden av det EGI-kodende området inneholdende cellulosebindingsdomenet, er deletert. Plasmidet inneholder også pyr4-genet for seleksjonsformål.

Den andre type ekspresjonsvektor er satt sammen på forhånd og inneholder sekvenser som er nødvendige for høynivå-transkrip-sjon og en selekterbar markør. Det tas sikte på at det kodende området for et gen eller en del derav kan skytes inn i denne generelle formålsekspresjonsvektor slik at den er under transkripsjonen kontroll av ekspresjonskassett-promoter- og terminatersekvensene.

For eksempel er PTEX en slik generell formålsekspresjonsvektor. Gener eller deler derav kan skytes inn nedstrøms den sterke CBHI-promoter. Det skal senere gis eksempler der det vises at katalytisk kjerne- og bindingsdomener uttrykkes ved bruk av dette system.

I vektoren blir DNA-sekvensen som koder den trunkerte cellulase eller andre nye proteiner operativt være bundet til transkripsjonene og translasjonene sekvenser, det vil si en egnet promotersekvens og signalsekvens i leserammen til det strukturelle gen. Promoteren kan være en hvilken som helst DNA-sekvens som viser transkripsjonen aktivitet i vertscellen og kan avledes fra gener som koder proteiner enten homologt eller heterologt til vertscellen. Signalpeptidet gir ekstracellulær ekspresjon av den trunkerte cellulase eller derivater derav. DNA-signalsekvensen er fortrinnsvis signalsekvensen som naturlig er assosiert med det trunkerte gen som skal uttrykkes, imidlertid er det ifølge oppfinnelsen tatt sikte på signalsekvensen fra en hvilken som helst ekso-cellobiohydrolase eller endoglukanase.

Prosedyrene som benyttes for ligere DNA-sekvensene som koder for de trunkerte cellulaser, derivater derav eller andre nye cellulaser ifølge oppfinnelsen med promoteren, og innskyting i egnede vektorer inneholdende den nødvendige informasjon for replikasjon i vertscellen, er velkjent i denne teknikk.

DNA-vektoren eller konstruktet som beskrevet ovenfor kan innføres i vertscellen i henhold til en hvilken som helst kjent teknikk som transformasjon, transfeksjon, mikro-injeksjon, mikroporering, biolistisk bombardering og lignende.

I den foretrukne transformasjonsteknikk må man ta med i betraktning at permeabiliteten for celleveggen i Trichoderma sp. er meget lav. I henhold til dette er opptaket av den ønskede DNA-sekvens, gen eller genfragment, i beste fall minimal. Det finnes et antall metoder for å øke permeabiliteten for Trichoderma sp.-celleveggen i derivatstammen (det vil si mangelen av et funksjonelt gen tilsvarende den benyttede selekterbare markør) før transformasjonsprosessen.

Den foretrukne metode ifølge foreliggende oppfinnelse for å preparere Trichoderma sp. for transformasjon involverer preparering av protoplaster fra fungalt mycelium. Myceliet kan oppnås fra germinerte, vegetative sporer. Mycelet behandles med et enzym som fermenterer celleveggen, noe som resulterer i protoplaster. Protoplastene blir så beskyttet ved nærværet av en osmotisk stabilisator i det suspenderende medium. Disse stabilisatorer inkluderer sorbitol, mannitol, kaliumklorid, magnesiumsulfat og lignende. Vanligvis varierer konsentrasjonen for disse stabilisatorer mellom 0,8M og 1,2M. Det er foretrukket å benytte en ca. 1,2M oppløsning av sorbitol i suspensjonsmediet.

Opptaket av DNA i verts-Trichoderma sp.-stammen er avhengig av kalsiumionekonsentrasjonen. Generelt benyttes mellom 10 og 50 mM CaCl2 i en opptaksoppløsning. Ved siden av behovet for kalsiumioner i opptaksoppløsningen, er andre bestanddeler som generelt innarbeides, et buffersystem, for eksempel en TE-buffer (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA) eller 10 mM MOPS, pH 6,0-buffer (morfolinpropansulfonsyre) og polyetylenglykol (PEG). Det antas at polyetylenglykolen virker for å fusere cellemembranen og derved tillate innholdet i mediet å kunne avleveres til cytoplasmaet i Trichoderma sp.-stammen og at plasmid-DNA'et overføres til kjernen. Denne fusjon efterlater hyppig flere kopier av plasmid-DNA'et, tandemintegrert inn i vertskromosomet.

Vanligvis benyttes det en suspensjon inneholdende Trichoderma sp.-protoplaster eller —celler som er underkastet en permeabilitetsbehandling ved en densitet på IO<8> til 10<9>/ml, og fortrinnsvis 2 x 10<8>/ml ved transformasjonen. Disse protoplaster eller celler settes til opptaksoppløsningen sammen med den ønskede, lineariserte, selekterbare markør med i det vesentlige homologe flankeringsregioner på hver side av markøren for å danne en transformasjonsblanding. Generelt tilsettes en høy konsentrasjon av PEG til opptaksoppløs-ningen. Fra 0,1 til 1 volum 25$ PEG 4000 kan settes til protoplastsuspensjonen. Imidlertid er det foretrukket å sette ca. 0,25 volumer til protoplastsuspensjonen. Additiver som dimetylsulfoksyd, heparin, spermidin, kaliumklorid og lignende, kan også settes til opptaksoppløsningen og understøtte transformeringen.

Generelt blir blandingen så inkubert ved ca. 0°C i et tidsrom mellom 10 og 30 minutter. Ytterligere PEG settes så til blandingen for ytterligere å øke opptaket av det ønskede gen eller DNA-sekvens. 25% PEG 4000 tilsettes generelt i volumer på 5 til 15 ganger volumet av transformasjonsblandingen, imidlertid kan større eller mindre volum være hensiktsmessig. Fortrinnsvis benyttes 25% PEG 4000 i 10 ganger volumet av transformasjonsblandingen. Efter at PEG er tilsatt, blir transformasjonsblandingen inkubert ved romtemperatur før tilsetning av en sorbitol- eller CaCl2-oppløsning. Protoplastsuspensjonen settes så ytterligere til smeltede aliquoter av et styrkingsmedium. Dette dyrkingsmedium tillater dyrking kun av transformanter. Et hvilket som helst dyrkingsmedium kan benyttes ifølge oppfinnelsen som er egnet for dyrking av de ønskede transformanter. Evis imidlertid Pyr<±->transformanter selekteres, er det foretrukket å benytte et vekstmedium som ikke inneholder uridin. De efterfølgende kolonier overføres og renses på et dyrkingsmedium som er berøvet for uridin.

På dette trinn atskilles stabile transformanter fra ustabile transformanter på grunn av deres høyere veksthastighet og dannelsen av sirkulære kolonier med en glatt, i stedet for en ujevn kontur på fast kulturmedium uten uridin. I tillegg ble i enkelte tilfeller en ytterligere stabilitetstest gjennom-ført ved å dyrke transformantene på fast, ikke-selektivt medium (det vil si inneholdende uridin), og å høste sporene fra dette kulturmedium og bestemme prosentandelen av disse sporer som derefter vil germinere og vokse på selektivt medium uten uridin.

I en spesiell utførelsesform av metoden ovenfor blir de trunkerte cellulaser eller derivater derav gjenvunnet i aktiv form fra vertscellen som et resultat av egnet post-transla-sjonell behandling av den nye, trunkerte cellulase eller derivatet derav.

De trunkerte cellulaser gjenvinnes fra mediet ved konvensjonelle teknikker inkludert separering av cellene fra mediet ved sentrifugering, filtrering og precipitering av proteinene i supernatanten eller filtratet med et salt, for eksempel ammoniumsulfat. I tillegg kan man benytte kromatografiske prosedyrer som ionebyttekromatografi, affinitetskromatografi eller andre. Alternativt kan det utskilte proteinprodukt isoleres og renses ved binding til et polysakkaridsubstrat eller en antistoffmatriks. Antistoffene (polyklonale eller monoklonale) kan dyrkes mot cellulasekjerne- eller bindings-domenepeptider, eller det kan fremstilles syntetiske peptider fra deler av kjernedomenet eller bindingsdomenet og benyttes for å dyrke polyklonale antistoffer.

DNA som transformeres inn i vertscellen kan omfatte ytterligere utførelsesformer. For eksempel kan man tenke seg cellulaseenzymer som kombinerer et kjerneområde avledet fra en homolog eller en heterolog mikrobiell kilde.

III. Metoder for behandling av celluloseholdig tekstil ved

bruk av trunkerte cellulaseenz<y>mer

Som angitt ovenfor angår foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for behandling av celluloseholdlge tekstiler med et trunkert cellulaseenzym. Bruken av den trunkerte cellulaseblanding ifølge oppfinnelsen gir som nytt og overraskende resultat et relativt lavt nivå av farvegjenavsetning, mens det samtidig opprettholdes et ekvivalent nivå av abrasjon, sammenlignet med tidligere cellulasebehandling. Fordi abrasjonsnivået virker som en indikator på kvaliteten og effektiviteten for en spesiell cellulasebehandlingsteknikk, for eksempel stenvasking eller maskinvasking, gir bruken av foreliggende oppfinnelse en overraskende høykvalitets, tekstilbehandlingsblanding. I maskinvaskingskonteksten kalles abrasjon noen ganger en farveklaring, dunfjerning eller biopolering.

Foreliggende oppfinnelse tar spesifikt sikte på bruken av trunkert cellulasekjerne, alene eller i kombinasjon med ytterligere cellulasekomponenter, for å oppnå utmerket abrasjon med redusert gjenavsetning, sammenlignet med bruk av ikke-trunkert cellulase. I tillegg tas det også sikte på naturlig forekommende cellulaseenzymer som mangler et bindingsdomene. Det tas også sikte på at metodene ifølge oppfinnelsen vil gi ytterligere forbedringer for den behandlede celluloseholdlge tekstil inkludert forbedringer i grep og/eller utseende.

A. Metode for stenvasking med trunkerte cellulaseblandinger Ifølge oppfinnelsen kan de trunkerte cellulaseblandinger som beskrevet ovenfor benyttes som et stenvaskingspreparat. Fortrinnsvis omfatter dette stenvaskingspreparat eller blanding ifølge oppfinnelsen en vandig oppløsning som inneholder en effektiv mengde av en trunkert cellulase sammen med andre eventuelle bestanddeler, for eksempel en buffer, er surfaktant eller et "scouring"middel.

En effektiv mengde av et trunkert cellulaseenzympreparat er en konsentrasjon av trunkert cellulaseenzym som er tilstrekkelig for det tilsiktede formål. Således er en "effektiv mengde" trunkert cellulase i stenvaskingspreparatet ifølge oppfinnelsen den mengde som gir det ønskede behandlings-resultat, for eksempel ved stenvasking. Mengden av trunkert cellulase som benyttes er også avhengig av det benyttede utstyr, de benyttede prosessparametere (temperaturen i behandlingsoppløsningen med trunkert cellulase, eksponerings-tiden til cellulaseoppløsninger og lignende) samt cellulaseaktiviteten (for eksempel vil en spesiell oppløsning kreve en lavere konsentrasjon av cellulase der det benyttes et mere aktivt cellulasepreparat sammenlignet med bruken av et mindre aktivt cellulasepreparat). Den nøyaktige konsentrasjon av trunkert cellulase kan lett bestemmes av fagmannen basert på de ovenfor angitte faktorer, så vel som på det ønskede resultat. Fortrinnsvis er den trunkerte cellulaseblanding til stede i en konsentrasjon fra 1 til 1000 ppm og helst 10 til 400 ppm, aller helst 20 til 100 ppm protein totalt.

Eventuelt benyttes det en buffer i stenvaskingsblandingen slik at konsentrasjonen av buffer er den som er tilstrekkelig til å holde pH-verdien i oppløsningen innen det området der den benyttede, trunkerte cellulase viser aktivitet, noe som i sin tur avhenger av arten av den benyttede, trunkerte cellulase. Den nøyaktige konsentrasjon av buffer som vil benyttes, vil derved avhenge av flere faktorer som fagmannen lett kan ta i betraktning. I en foretrukken utførelsesform velges både buffer og bufferkonsentrasjon slik at pH-verdien i den endelige, trunkerte cellulaseoppløsning holdes innen det pE-området som er nødvendig for optimal cellulaseaktivitet. Fortrinnsvis er bufferkonsentrasjonen i stenvaskingsblandingen ca. 0,001N eller større. Egnede buffere er for eksempel citrat eller acetat.

I tillegg til trunkert cellulase og en buffer kan stenvaskingsblandingen i tillegg eventuelt inneholde en surfaktant. Fortrinnsvis er surfaktanten til stede i en konsentrasjon i de fortynnede vaskemedier på over 100 ppm og fortrinnsvis fra 200 til 15 000 ppm. Egnede surfaktanter er en hvilken som helst surfaktant som er kompatibel med cellulasen og tekstilen og omfatter for eksempel anioniske, ikke-ioniske og amfolytiske surfaktanter. Egnede anioniske surfaktanter for bruk innenfor oppfinnelsens kontekst er rette eller forgrenede alkylbenzensulfonater, alkyl- eller alkenyleter-sulfater med rette eller forgrenede alkylgrupper eller alkenylgrupper, alkyl- eller alkenylsulfater, olefinsulfonater, alkansulfonater og lignende. Egnede motioner for anioniske surfaktanter er alkalimetallioner som natrium og kalium, jordalkalimetallioner som kalsium og magnesium, ammoniumioner og alkanolaminer med 1 til 3 Cg_g-alkanol-grupper. Amfolytiske surfaktanter inkluderer kvaternære ammoniumsaltsulfonater samt amfolytiske surfaktanter av betaintypen. Slike amfolytiske surfaktanter har både positivt og negativt ladede grupper i det samme molekyl. Ikke-ioniske surfaktanter omfatter generelt polyoksyalkylenetere, så vel som høyere fettsyrealkanolamider eller alkylenoksydaddukter derav, og fettsyreglycerolmonoestere. Blandinger av surfaktanter kan også benyttes på i og for seg kjent måte.

I en foretrukken utførelsesform kan det fremstilles en konsentrert stenvaskingsblanding for bruk i de her beskrevne metoder. Slike konsentrater vil inneholde konsentrerte mengder av det ovenfor beskrevne, trunkerte cellulasepreparat, buffer og surfaktant, fortrinnsvis i vandig oppløsning. Formulert på denne måte kan stenvaskingskonsentratet lett fortynnes med vann for hurtig og nøyaktig å preparere stenvaskingspreparater ifølge oppfinnelsen med den krevede konsentrasjon av disse additiver. Fortrinnsvis vil slike konsentrater omfatte fra 0,1 til 50 vekt-# av en fungal cellulaseblanding som beskrevet ovenfor (protein), fra 0,1 til 80 vekt-# buffer, fra 0 til 50 vekt-# surfaktant og resten vann. Når det formuleres vandige konsentrater, kan disse konsentrater fortynnes for å komme frem den ønskede konsentrasjon av komponentene i den trunkerte cellulase-oppløsning som indikert ovenfor. Slik det vil være klart, vil slike stenvaskingskonsentrater tillate lett formulering av oppløsninger av trunkert cellulose, så vel som å muliggjøre lett transport av konsentratene til de lokasjoner der de skal benyttes. Stenvaskingskonsentratet kan foreligge i en hvilken som helst i teknikken kjent form som væske, emulsjon, gel eller pasta. Slike former er velkjente for fagmannen.

Når det benyttes et fast stenvaskingskonsentrat, kan cellulasepreparatet foreligge som et granulat, et pulver, et agglomerat eller en fast fiber. Når det benyttes granuler, er disse fortrinnsvis formulert slik at de inneholder et cellulasebeskyttende middel, det skal i denne forbindelse vises til US-SN 07/642 669 av 17. januar 1991. På samme måte kan granulene formuleres til å inneholde materialer for å redusere oppløsningshastigheten for granulene i vaskemediet. Slike materialer og granuler er beskrevet i US 5 254 283A.

Andre materialer kan også benyttes eller anbringes i stenvaskingspreparatet ifølge oppfinnelsen efter ønske, inkludert sten, pimpsten, fyllstoffer, oppløsningsmidler, enzymaktivatorer og andre anti-gjenavsetningsmidler.

Den celluloseholdige tekstil bringes i kontakt med stenvaskingsblandingen inneholdende en effektiv mengde av det trunkerte cellulaseenzym eller dets derivat, ved blanding av behandlingsblandingen med stenvaskingsblandingen og derved å bringe det trunkerte, cellulaseenzym nær tekstilen. Hvis for eksempel behandlingsblandingen er en vandig oppløsning, kan tekstilen bløtes direkte i oppløsningen. Hvis på tilsvarende måte stenvaskingsblandingen er et konsentrat, blir konsen-tratet fortynnet til et vannbad med den celluloseholdige tekstil. Hvis stenvaskingsblandingen foreligger i fast form, for eksempel en forvaskgel eller en fast stav, kan stenvaskingsblandingen bringes i kontakt ved direkte å bringe blandingen på tekstilen eller i vaskevæsken.

Den celluloseholdige tekstil inkuberes med stenvaskings-oppløsningen under betingelser som tillater at den enzymatiske virkning gir den celluloseholdige tekstil et stenvasket utseende. Under stenvaskingen kan for eksempel pH-verdi, væskeforhold, temperatur og reaksjonstid justeres for å optimalisere de betingelser under hvilke stenvaskingsblandingen virker. "Effektive betingelser" henviser nød-vendigvis til pH, væskeforhold og temperatur som tillater at det trunkerte cellulaseenzym reagerer effektivt med den celluloseholdige tekstil. Reaksjonsbetingelsene for den trunkerte cellulosekjerne og således betingelsene som er effektive for stenvaskingsblandingen ifølge oppfinnelsen, er i det vesentlige like velkjente metoder som benyttes med tilsvarende, ikke-trunkerte cellulaser. I henhold til dette er betingelsene som er effektive for behandling av en celluloseholdig tekstil med en stenvaskingsblanding inneholdende CBHI-typekjerne ifølge oppfinnelsen, i det vesentlige lik de betingelser som benyttes i den kjente teknikk ved anvendelse av villtype CBHI-type cellulaseblandinger. Der en blanding av trunkert og ikke-trunkert cellulase benyttes, bør på tilsvarende måte betingelsene optimaliseres på samme måte som der en tilsvarende kombinasjon har vært benyttet. I henhold til dette ligger det innenfor fagmannens kunnskaps-område å maksimalisere betingelsene for å benytte sten-vaskingsblandingene ifølge oppfinnelsen.

Væskeforholdene under stenvaskingen, det vil si forholdet mellom vekten av oppløsningen av stenvaskingsblanding (det vil si vaskevæsken) og vekten av tekstilen, er innenfor oppfinnelsens kontekst generelt en mengde som er tilstrekkelig til å oppnå den ønskede stenvaskingseffekt i denim-tekstilen og er avhengig av den benyttede prosess. Fortrinnsvis ligger væskeforholdene fra 4:1 til 50:1, helst fra 5:1 til 20:1 og aller helst fra 10:1 til 15:1. Reaksjonstemperaturene under stenvasking med de her beskrevne stenvaskingsblandinger styres av to motstridende faktorer. For det første tilsvarer høyere temperaturer generelt forbedret reaksjonskinetikk, det vil si hurtigere reaksjoner, noe som i sin tur tillater reduserte reaksjonstider sammenlignet med de reaksjonstider som kreves ved lavere temperaturer. I henhold til dette er reaksjonstemperaturene generelt minst 10°C og derover. For det andre er cellulase et protein som mister aktivitet utover en gitt reaksjonstemperatur, der temperaturen er avhengig av arten av den benyttede cellulase. Hvis således reaksjonstemperaturen tillates å stige for meget, går den cellulolytiske aktivitet tapt som et resultat av denatureringen av cellulasen. Som et resultat er de maksimale reaksjonstemperaturer som her benyttes, generelt rundt 65°C. I lys av det ovenfor anførte, ligger reaksjonstemperaturene generelt fra 30°C til 65°C, fortrinnsvis fra 35°C til 60° C og aller helst fra 35°C til 55°C.

Reaksjonstidene er avhengig av de spesifikke betingelser under hvilke stenvaskingen skjer. For eksempel vil pH-verdi, temperatur og konsentrasjon av trunkert cellulose alle ha innvirkning på den optimale reaksjonstid. Generelt er reaksjonstidene fra 5 minutter til 5 timer, fortrinnsvis fra 10 minutter til 3 timer og aller helst fra 20 minutter til 1 time.

Celluloseholdige tekstiler som er behandlet ved stenvaskings-metodene som beskrevet ovenfor ved bruk av trunkerte cellulaseblandinger ifølge oppfinnelsen, viser redusert gjenavsetning av farvestoff sammenlignet med de samme celluloseholdige tekstiler, behandlet på samme måte, men med en ikke-trunkert cellulaseblanding.

B. Metodologi for behandling av celluloseholdige tekstiler med en vaskemiddelblanding omfattende trunkerte cellulaseenzymer

Ifølge oppfinnelsen kan den trunkerte cellulaseblanding som beskrives ovenfor benyttes som vaskemiddelblanding. Vaske-middelsblandingen ifølge oppfinnelsen kan benyttes som forvaskblanding, forbløtingsblanding eller for vaskemiddels-rengjøring under den regulære vaskecyklus. Fortrinnsvis omfatter vaskemiddelblandingen ifølge oppfinnelsen en effektiv mengde trunkert cellulase, og en surfaktant, og omfatter eventuelt også andre bestanddeler som beskrevet nedenfor.

En effektiv mengde av en trunkert cellulase som benyttet i vaskemiddelblandingen ifølge oppfinnelsen, er en mengde som er tilstrekkelig til å gi forbedret abrasjon i celluloseholdige tekstiler. Fortrinnsvis har den trunkerte cellulase som benyttes en konsentrasjon på rundt 0,001 til 25$, fortrinnsvis 0,02 til 10 vekt-# av vaskemiddelsen.

Den spesifikke konsentrasjon av trunkert cellulaseenzym som benyttes i vaskemiddelblandingen velges fortrinnsvis slik at konsentrasjonen av trunkert cellulase ved fortynning i et vaskemedium, ligger i området 0,1 til 1000 ppm og fortrinnsvis 0,2 til 500 ppm, aller helst fra 0,5 til 250 ppm totalt protein. Således vil den spesifikke mengde av trunkert cellulaseenzym som benyttes i vaskemiddelblandingen avhenge av den grad ved hvilken vaskemiddelsen fortynnes ved tilsetning av vann for å danne en vaskeoppløsning.

Ved lavere konsentrasjoner av trunkert cellulaseenzym, det vil si konsentrasjoner av trunkert enzym under 20 ppm, vil den reduserte tilbakeflekking eller gjenavsetning med ekvivalent overflatefiberabrasjon, sammenlignet med tidligere kjente blandinger, bli tydelig efter gjentatte vaskinger. Ved høyere konsentrasjoner, det vil si konsentrasjoner av trunkerte cellulaseenzymer på over 40 ppm, vil den reduserte tilbakeflekking med ekvivalent overflatefiberfjerning bli åpenbar efter en enkel vasking.

Vaskemiddelblandingen ifølge oppfinnelsen kan foreligge i en hvilken som helst kjent form, for eksempel som flytende fortynningsmiddel, i granuler, emulsjoner, geler eller i pastaer. Slike former er velkjente for fagmannen. Når det benyttes en fast vaskemiddelblanding, blir den trunkerte cellulase fortrinnsvis formulert som granuler. Fortrinnsvis kan granulene formuleres til i tillegg å inneholde et cellulasebeskyttende middel, se for eksempel US-søknad 07/642 669 av 17. januar 1991. På samme måte kan granulene formuleres til å inneholde materialer som reduserer oppløs-ningshastigheten for granulene i vaskemediet. Slike materialer og granuler er beskrevet i US 5 254 283A.

Vaskemiddelblandingen ifølge oppfinnelsen benytter et overflateaktivt middel, det vil si en surfaktant, inkludert anioniske, ikke-ioniske og amfolytiske surfaktanter som velkjent for anvendelse i vaskemiddelblandinger.

Egnede, anioniske surfaktanter for bruk i vaskemiddelblandinger ifølge oppfinnelsen omfatter rette eller forgrenede alkylbenzensulfonater, alkyl- eller alkenyleter-sulfater med rette eller forgrenede alkyl- eller alkenylgrupper, alkyl- eller alkenylsulfater, olefinsulfonater, alkansulfonater og lignende. Egnede motioner for anioniske surfaktanter er alkalimetallioner som natrium og kalium, jordalkalimetallioner som kalsium og magnesium, ammoniumioner samt alkanolaminer med 1 til 3 C,,_3-alkanolgrupper.

Amfolytiske surfaktanter inkluderer kvaternære ammoniumsaltsulfonater, amfolytiske surfaktanter av betaintypen og lignende. Slike amfolytiske surfaktanter har både positivt og negativt ladede grupper i det samme molekyl.

Ikke-ioniske surfaktanter omfatter generelt polyoksyalkylenetere, så vel som høyere fettsyrealkanolamider eller alkylenoksydaddukter derav, fettsyreglycerolmonoestere og lignende.

Egnede surfaktanter for anvendelse ifølge oppfinnelsen er beskrevet i GB 2 094 826A.

Blandinger av slike surfaktanter kan også benyttes.

Surfaktanten eller blandingen av surfaktanter benyttes generelt i vaskemiddelblandingene ifølge oppfinnelsen i mengder fra 1 til 95 vekt-# av den totale vaskemiddelblanding, fortrinnsvis fra 5 til 45 vekt-# av den totale vaskemiddelblanding. Ved fortynning i vaskemediet er surfak-tantkonsentrasjonen generelt 500 ppm eller mer, fortrinnsvis fra 1000 ppm til 15 000 ppm.

I tillegg til cellulaseblandingen og en eller flere surfaktanter, kan vaskemiddelblandingen ifølge oppfinnelsen eventuelt inneholde en eller flere av de følgende komponenter :

Hydrolaser bortsett fra cellulase

Slike hydrolaser inkluderer karboksylatesterhydrolase, tioesterhydrolase, fosfatmonoesterhydrolase og fosfatdiester-hydrolase som virker på esterbindingen; glykosidhydrolase som virker på glykosylforbindelser; et enzym som hydrolyserer N—glykosylforbindelser; tioeterhydrolase som virker på eter-bindingen; og cx—aminoacylpeptidhydrolase, peptidyl-aminosyre-hydrolase, acylaminosyrehydrolase, dipeptidhydrolase og peptidyl-peptidhydrolase som virker på peptidbindingen. Foretrukket blant disse er karboksylatesterhydrolase, glykosidhydrolase og peptidyl-peptidhydrolase. Egnede hydrolaser omfatter

(1) proteaser tilhørende peptidylpeptidhydrolaser som pepsin, pepsin B, rennin, trypsin, chymotrypsin A, chymotrypsin

B, elastase, enterokinase, catepsin C, papain, chymo-papain, ficin, trombin, fibrinolysin, renin, subtilisin, aspergillopeptidase A, collagenase, klostridiopeptidase B, kallikrein, gastrisin, catepsin D, bromelin, kerati-nase, chymotrypsin C, pepsin C, aspergillopeptidase B,

urokinase, karboksypeptidase A og B, og aminopeptidase;

(2) glykosidhydrolaser (cellulase som er en essensiell bestanddel er utelukket fra denne gruppe) a—amylase, <g>—amylase, glukoamylase, invertase, lysozym, pektinase, chitinase og dekstranase. Foretrukket blant disse er oc-amylase og g-amylase. Disse virker i sure til nøytrale systemer, men en som oppnås fra bakterier viser høy

aktivitet i alkaliske systemer; (3) karboksylatesterhydrolase inkludert karboksylesterase, lipase, pektinesterase og klorofyllase. Særlig effektiv blant disse er lipase.

Handelsnavnene for kommersielle produkter og produsenter er som følger: "Alkalase", "Esperase", "Savinase", "AMG", "BAN", "Fungamill", "Sweetzyme"» "Thermamyl" (Novo Industrier, København, Danmark); "Maksatase", "High-alkaline protease", "Amylase THC", "Lipase" (Gist Brocades, N.V., Delft, Holland); "Protease B-400", "Protease B-4000", "Protease AP", "Protease AP2100" (Schweizerische Ferment A.G., Basel, Sveits); "CRD Protease" (Monsanto Company, St. Louis, Missouri); "Piocase" (Piopin Corporation, Monticello, Illinois); "Pronase P", "Pronase AS", "Pronase AF" (Kaken Chemical Co., Ltd., Japan); "Lapidase P-2000" (Lapidas, Secran, Frankrike); proteaseprodukter (Tyler standard sikt, 100$ gjennom 16 mesh og 100$ tilbake på 150 mesh) (Clington Corn Products, Division of Standard Brands Corp., New York); "Takamine", "Bromelain 1:10", "HT Protease 200", "Enzym L-W"

(oppnådd fra fungi, ikke fra bakterier) (Miles Chemical Company, Elkhart, Ind.); "Rhozyme P-ll Conc", "Pectinol", "Lipase B", "Rhozyme PF", "Rhozyme J-25" (Rohm & Haas, Genencor, South San Francisco, CA); "Ambrozyme 200" (Jack Wolf & Co., Ltd., datterselskap av Nopco Chemical Company,

Newark, N.J.); "ATP 40", "ATP 120", "ATP 160" (Lapidas, Secran, Frankrike); "Oripase" (Nagase & Co., Ltd., Japan).

Hydrolasene andre enn cellulase innarbeides i vaskemiddelblandingen i så stor mengde som er nødvendig i henhold til formålet. Fortrinnsvis innarbeides de i en mengde av 0,001 til 5 vekt-# og helst 0,02 til 3 vekt-#, beregnet på rent produkt. Dette enzym bør benyttes i form av granuler fremstilt fra råenzymet alene eller i kombinasjon med andre komponenter i vaskemiddelblandingen. Granuler av råenzym benyttes i en slik mengde at det rensede enzym er 0,001 til 50 vekt-# av granulene. Granulene benyttes i en mengde av 0,002 til 20 vekt-#, fortrinnsvis 0,1 til 10 vekt-#. På samme måte som med cellulasene, kan disse granuler formuleres til å inneholde et enzymbeskyttende middel og et oppløsnings-forsinkende middel.

Kationiske surfaktanter og langkjedefettsyresalter

Slike kationiske surfaktanter og langkjedefettsyresalter inkluderer mettede og umettede fettsyresalter, alkyl- eller alkenyleterkarboksylsyresalter, a—sulfofettsyresalter eller —estere, aminosyre-type surfaktanter, fosfatestersurfak-tanter, kvaternære ammoniumsalter inkludert de med 3 til 4 alkylsubstituenter og opptil 1 fenyl-substituert alkylsubsti-tuent. Egnede kationiske surfaktanter og langkjedefettsyresalter er beskrevet i GB 2 094 826A. Blandingen kan inneholde fra 1 til 20 vekt-# slike kationiske surfaktanter og langkjedefettsyresalter.

Byggere

A. Divalent sekvesteringsmidler

Blandingen kan inneholde fra 0 til 50 vekt-# av en eller flere byggerkomponenter valgt blant gruppen omfattende alkalimetallsalter og alkanolaminsalter av de følgende forbindelser: fosfater, fosfonater, fosfonokarboksylater, salter av aminosyrer, aminopolyacetater, høymolekylære elektrolytter, ikke-dissosierende polymerer, salter av dikarboksylsyrer og aluminosilikatsalter. Egnede, divalente sekvesteringsmidler er beskrevet i GB 2 094 826A.

B. Alkali eller uorganiske elektrolytter

Blandingen kan inneholde fra 1 til 50 vekt-#, fortrinnsvis fra 5 til 30 vekt-#, beregnet på blandingen, av ett eller flere alkalimetallsalter av de følgende forbindelser som alkali eller uorganiske elektrolytter: silikater, karbonater og sulfater så vel som organisk alkali i form av trietanol-amin, dietanolamin, monoetanolamin og triisopropanolamin.

Antig. ienavsetningsmidler

Blandingen kan inneholde fra 0,1 til 5 vekt-# av en eller flere av de følgende forbindelser som antigjenavsetnings-midler: polyetylenglykol, polyvinylalkohol, polyvinylpyrro-lidon og karboksymetylcellulose.

Blant disse gir en kombinasjon av karboksymetylcellulose og/eller polyetylenglykol med cellulaseblandingen ifølge oppfinnelsen, er særlig brukbar smussfjernende blanding.

Blekemidler

Bruken av cellulasen som her beskrevet i kombinasjon med et blekemiddel som natriumperkarbonat, natriumperborat, natriumsulfat/hydrogenperoksydaddukt og natriumklorid/- hydrogenperoksydaddukt og/eller et fotosensitivt bleke-farvestoff som sink eller ammoniumsalt av sulfonert ftalo-cyanin, forbedrer ytterligere vaskemiddelseffektene.

Blåtoningsmidler og fluorescensfarvestoffer

Forskjellige blåmidler og fluorescensfarvestoffer kan innarbeides i blandingene hvis nødvendig. Egnede slike midler og fluorescensfarvestoffer er beskrevet i GB 2 094 826A.

Kakingsinhibitorer

De følgende kakingsinhibitorer kan innarbeides i pulver-formede vaskemiddelser: p-toluensulfonsyresalter, xylen-sulfonsyresalter , eddiksyresalter, sulforavsyresalter, talkum, finpulverisert silisiumdioksyd, leire, kalsiumsilikat (som Micro-Cell fra Johns Manville Co.), kalsiumkarbonat og magnes iumoksyd.

Maskeringsmidler for faktorer som inhiberer cellulaseaktiviteten

Cellulaseblandingen ifølge oppfinnelsen deaktiveres i enkelte tilfeller av kobber-, sink-, krom-, kvikksølv-, bly-, aiangan-eller sølvioner eller deres forbindelser. Forskjellige metallchelaterende midler og metallprecipiterende midler er effektive mot disse inhibitorer. De omfatter for eksempel divalent metallionsekvesteringsmidler som angitt i punktet ovenfor under henvisning til eventuelle additiver så vel som magnesiumsilikat og magnesiumsulfat.

Cellobiose, glukose og glukonolakton virker noen ganger som inhibitorer. Det er foretrukket å unngå mednærværet av disse sakkarider med cellulasen i så stor grad som mulig. Hvis et mednærvær er uunngåelig, er det nødvendig å unngå direkte kontakt mellom sakkaridene og cellulasen ved for eksempel å belegge dem.

Langkjedefettsyresalter og kationiske surfaktanter virker som inhibitorer i enkelte tilfeller. Imidlertid er mednærværet av disse substanser med cellulasen tillatelig hvis den direkte kontakt forhindres i en viss grad som for eksempel ved

tablettering eller belegning.

De ovenfor nevnte maskeringsmidler og metoder kan, hvis nødvendig, benyttes ifølge oppfinnelsen.

Cellulase- aktivatorer

Aktivatorene varierer avhengig av varieteten av cellulasene. I nærvær av proteiner, kobolt og salter derav, magnesium og salter derav og kalsium og salter derav, kalium og salter derav, natrium og salter derav eller monosakkarider som mannose eller xylose, aktiverer cellulasene og deres vaskemiddelskraft forbedres betydelig.

Antioksydanter

Antioksydanter er for eksempel tert-butylhydroksytoluen, 4,4'-butylidenbis(6-tert-butyl-3-metylfenol), 2,2'-butyliden-bis(6-tert-butyl-4-metylfenol), monostyrert kresol, distyrert kresol, monostyrert fenol, distyrert fenol og l,l-bis(4-hydroksyfenyl)cykloheksan.

Oppløsningsmidler

Oppløsningsmidler er for eksempel laverealkoholer som etanol, benzensulfonatsalter, laverealkylbenzensulfonatsalter som p—toluensulfonatsalter, glykoler som propylenglykol, acetyl-benzensulfonatsalter, acetamider, pyridindikarboksylsyre-amider, benzoatsalter og urea.

Vaskemiddelblandingen ifølge oppfinnelsen kan benyttes innenfor et bredt pH-område fra sur til alkalisk pH-verdi. I en foretrukken utførelsesform kan vaskemiddelblandingen ifølge oppfinnelsen benyttes i alkaliske vaskemiddelsvaskemedia og helst alkaliske vaskemiddelsvaskemedia med en pH fra over 7 til ikke mer enn rundt 11.

Bortsett fra de ovenfor angitte bestanddeler kan parfymer, buffere, preserveringsmidler, farvestoffer og lignende, hvis ønskelig, benyttes i blandingene ifølge oppfinnelsen. Slike komponenter benyttes vanligvis i de mengder i hvilke de hittil har vært benyttet.

Når en vaskemiddelsbase, benyttet ifølge oppfinnelsen, foreligger i form av et pulver, kan det være en som fremstilles ved en hvilken som helst kjent fremstillingsmetode inkludert en spraytørkingsmetode og en granuleringsmetode. Vaskemiddelsbaser oppnådd særlig ved spraytørking eller ved spraytørking-granulering, er foretrukket. Vaskemiddelsbasen som oppnås ved spraytørking er ikke begrenset med henblikk på fremstillingsbetingelser. Vaskemiddelsbasen som oppnås ved spraytørkingsmetoden er hule granuler som oppnås ved spraying i en vandig oppslemming av varmeresistente bestanddeler som overflateaktive midler og byggere, inn i et varmt rom. Granulene har en størrelse fra 50 til 2000 mikrometer. Efter spraytørking kan parfymer, enzymer, blekemidler, uorganiske, alkaliske byggere tilsettes. Med en høydensitetsgranulær vaskemiddelsbase, oppnådd for eksempel ved spraytørking-granuleringsmetoden, kan forskjellige bestanddeler også tilsettes efter fremstilling av basen.

Når vaskemiddelsbasen er en væske, kan den enten være en homogen oppløsning eller en uhomogen dispersjon. For å unngå dekomponering av karboksymetylcellulose på grunn av cellulase i vaskemiddelsen, er det ønskelig at karboksymetylcellulosen er granulert eller belagt før innarbeiding i blandingen.

Vaskemiddelblandingen ifølge oppfinnelsen kan inkuberes med celluloseholdig tekstil, for eksempel tilsmussede tekstiler, i industriell eller husholdningsanvendelse ved temperaturer, reaksjonstider og væskeforhold som vanligvis benyttes i slike omgivelser. Inkuberingsbetingelsene, det vil si betingelsene som er effektive for behandling av celluloseholdige tekstiler med vaskemiddelblandinger ifølge oppfinnelsen, vil lett kunne fastslås av fagmannen. I henhold til dette vil egnede betingelser som er effektive for behandling med de herværende vaskemiddelser, tilsvare de betingelser som benyttes med tilsvarende vaskemiddelblandinger som inkluderer villtype cellulaser.

Som nevnt ovenfor kan vaskemiddelser ifølge oppfinnelsen i tillegg formuleres som en forvask i den egnede oppløsning ved en mellomliggende pH-verdi der tilstrekkelig aktivitet foreligger til å gi de ønskede forbedringer i abrasjon og redusert styrketap. Når vaskemiddelblandingen er en for-bløtings (for eksempel forvaskings- eller forbehandlings-)-blanding, enten som væske, spray, gel eller pasta, benyttes det trunkerte cellulaseenzym generelt fra 0,0001 til 1 vekt—%, beregnet på den totale vekt av forbløtings- eller forbehandlingsblandingen. I slike blandinger kan en surfaktant eventuelt benyttes og hvis ja, er den generelt til stede ved en konsentrasjon fra 0,005 til 20 vekt-$, beregnet på den totale vekt av forbløtingen. Resten av blandingen omfatter konvensjonelle komponenter som benyttes i slike forbløtings-blandinger, for eksempel fortynningsmidler, buffere, andre enzymer (proteaser) og lignende i de konvensjonelle konsentrasjoner .

Videre er det tatt sikte på at blandinger omfattende trunkerte cellulaseenzymer som her beskrevet, kan benyttes i husholdninger som alenestående blandinger som egnet for gjenoppretting av farve i blekede tekstiler, se for eksempel US 4 738 682A, så vel som ved anvendelse som flekkfjerner.

For å illustrere oppfinnelsen ytterligere, må det henvises til de følgende eksempler.

Eksempel 1

Kloning og ekspresjon av EGl-kjernedomene ved bruk av dets egen promoter-, terminator- og signalsekvens.

Del 1. Kloning

Det komplette egll-gen som benyttes ved konstruksjonen av EGl-kjernedomeneekspresjonsplasmidet, PEGlA3'pyr, ble oppnådd fra plasmidet PUC218::EG1, se figur 6. 3'-terminatorområdet av egil ble ligert inn i PUC218 (D. Korman et al., "Curr. Genet", 17:203-212, 1990) som et 300 bp Bsml-EcoRI-fragment sammen med en syntetisk linker ment for å erstatte 3'-intronen og cellulosebindingsdomenet med en stoppkodon og fortsette med egll-terminatorsekvensene. Det resulterende plasmid, PEGlt, ble fermentert med Hindlll og Bsml og vektorfragmentet ble isolert fra digestet ved agarose-gelelektroforese, fulgt av elektroeluering. egll-genpromoter-sekvensen og kjernedomenet av egil ble isolert fra PUC218::EG1 som et 2,3 kb EindIII-SstI-fragment og ligert med det samme syntetiske linkerfragment og det Hindlll-Bsml-fermenterte PEG1T under dannelse av PEG1A3'.

Nettoresultatet av disse operasjoner er å erstatte 3'-intronen og cellulosebindingsdomenet av egil med syntetiske oligonukleotider på 53 og 55 bp. Dette plasserer en TAG-stoppkodon efter serin 415 og fortsettes derefter med egll-terminatoren opp til Bsml-setet.

Derefter ble den T. longibrachiatum-sélekterbare markør, pyr4, oppnådd fra en tidligere klon p219M (Smith et al., 1991) som et isolert 1,6 kb EcoRI-HindIII-fragment. Dette ble innarbeidet i det endelig ekspresjonsplasmid, PEGlA3'pyr, i en tre-veisligering med PUC18-plasmid, fermentert med EcoRI og defosforylert ved bruk av kalve-alkalisk fosfatase og et HindiII-EcoRI-fragment inneholdende egil-kjernedomenet fra PEG1A3<*>.

Del 2. Transformasjon og ekspresjon

Et storskala DNA-prep ble fremstilt av PEGlA3'pyr og fra dette ble EcoRI-fragmentet inneholdende egll-kjernedomenet og pyr4-genet isolert ved preparativ gelelektroforese. Det isolerte fragment ble transformert inn i den uridinauksotrope versjon av den quad-deleterte stamme, 1A52 pyr13 (se US-SN 07/770 049, 08/048 728 og 08/048 881) og stabile transformanter ble identifisert.

For å selektere hvilke transformanter som uttrykte egll-kjernedomenet ble transformantene dyrket i rystekolber under betingelser som favoriserte induksjon av cellulasegenene (Vogels + 1$ laktose). Efter 4-5 dagers vekst ble protein fra supernatantene konsentrert og enten 1) kjørt på SDS-poly-akrylamidgel før detektering av egll-kjernedomenet ved Western-analyse ved bruk av EGI-polyklonale antistoffer, eller 2) de konsentrerte supernatanter ble analysert direkte ved bruk av RBB-karboksymetylcellulose som et endoglukanase-spesifikt substrat, hvorefter resultatene ble sammenlignet med opphavsstammen 1A52 som kontroll. Transformantkandidatene ble identifisert som mulige til å produsere et trunkert EGI-kjernedomeneprotein. Genomisk DNA og total mRNA ble isolert fra disse stammer efter dyrking på Vogels + 1% laktose og Southern- og Northern-blott-forsøk, gjennomført ved bruk av et isolert DNA-fragment som kun inneholdt egll-kjernedomene. Disse forsøk viste at transformantene ikke isoleres med en kopi av egll-kjernedomene-ekspresjonskassetten integrert i genomet av 1A52 og at disse samme transformanter ga egll-kjernedomene mRNA.

En transformant ble så dyrket ved bruk av media egnet for cellulaseproduksjon i Trichoderma, velkjent i teknikken, supplert med laktose (se M. Warzymoda et al. i FR 2 555 603) i en 14L-fermentor. Resultatbulj ongen ble konsentrert og de inneholdte proteiner ble separert ved SDS-polyakrylamid-gelelektroforese og Egll-kjernedomeneproteinet identifisert ved Western-analyse (se eksempel 3 nedenfor). Det ble derefter estimert at proteinkonsentrasjonen i fermenteringssupernatanten var 5-6 g/l, hvorav ca. 1,7-4,4 g/l var EGI-kjernedomene, basert på CMCase-aktivitet. Denne verdi er basert på et gjennomsnitt av flere EGI-kjernefermenteringer som ble gjennomført.

På tilsvarende måte kan mange andre cellulasedomener eller derivater derav fremstilles ved prosedyrer tilsvarende det som er beskrevet ovenfor.

Eksempel 2

Rensing av EGI- og EGII-katalytiske kjerner

Del 1. EGI- katalvtisk k. ierne

EGI-kjernen ble renset på følgende måte. Den konsentrerte (UF) buljong ble fortynnet til 14 mg/ml i en 23 mN Na-acetat, pH 5,0. 200 g avicelcellulosegel (FMC Bioproducts, type PH-101) ble satt til den fortynnede EGI-kjernebuljong og blandet ved romtemperatur i 45 minutter. Tilstedeværende avicel ble fjernet fra buljongen ved sentr ifugering, noe som ga en anriket EGI-kjerneoppløsning. Denne oppløsning ble så bufferbyttet til 10 mM TES, pH 7,5, ved bruk av en Amicon-omrøringscellekonsentrator med en PM-10-membran (diaflo-ultrafiltreringsmembraner, Amicon kat. nr. 1313MEM 546A). EGI-kjerneprøven ble så lastet på en anionbyttekolonne (Q-sepharose fast flow, Pharmacia kat. nr. 17-0510-01) og eluert i en saltgradient fra 0 til 0,5M NaCl i 10 mM TES, pH 7,5. Fraksjonene som inneholdt EGI-kjernene ble kombinert og konsentrert ved bruk av den omrørte Amicon-cellekonsentrator som nevnt ovenfor.

Del 2. EGII- katalvtisk kjerne

EGII-kjernen ble renset på følgende måte. Den konsentrerte (UF) buljong ble filtrert ved bruk av diatomejord. Ammoniumsulfat ble tilsatt til buljongen til en sluttkonsentrasjon på IM (NH4)2S04 og denne blanding ble så lastet på en hydrofob kolonne (fenyl-sepharose fast flow, Pharmacia kat. nr. 17-0965-01). Kolonnen ble vasket med 0.75M ammoniumsulfat før eluering av EGII-kjernen med 0,5M ammoniumsulfat. Fraksjonene inneholdende kjernen ble slått sammen og konsentrert ved bruk av en tagentialstrøm-ultrafiltreringsmembran (Filtron Minisette Ultrafiltration System, kat. nr. FS018k01) med et Omega lOK-membran (Filtron, kat nr. FS010K75). 100 g avicelcellulosegel (FMC Bioproducts, type PH-101) ble satt til for hvert gram konsentrert EGII-kjerne og blandet i 40 minutter. Avicelen ble fjernet ved sentrifugering, noe som ga en anriket EGII-kjerneoppløsning.

TCkRfim pel 3

Kloning og ekspresjon av CBHII-kjernedomene ved bruk av CBHI-promoteren, terminatoren og signalsekvensen fra CBHII

Del 1. Konstruksjon av T. longibrachiatum genereltformål-ekspres. ionsplasmid- PTEX

Plasmidet, PTEX, ble konsentrert ved å følge retningslinjene i henhold til Sambrook et al. (1989), supra og er illustrert i figur 7. Dette plasmid var ment som en multi-formålsekspresjonsvektor for anvendelse i filamentøs fungus Trichoderma longibrachiatum. Ekspresjonskassetten har flere unike trekk som gjør den brukbar for denne funksjon. Transkripsjonen reguleres ved bruk av den sterke CBHI-genpromoter og terminatorsekvensene for T. longibrachiatum. Mellom CBHI-promoteren og terminatoren er det unike Pmel— og Sstl-restriksjonsseter som benyttes for å skyte inn genet som skal uttrykkes. Det T. longibrachiatum pyr4 selekterbare markørgen er skutt inn i CBHI-terminatoren og hele ekspresjonskassetten (CBHI-promoter-innskytningsseter-CBI-terminator-pyr4-gen-CBHI-terminator) kan skjæres ut ved bruk av det unike Notl-restriksjonssetet eller det unike Noti- og NheI-restriksjonssetet.

Denne vektor er basert på den bakterielle vektor, pSL1180 (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey) som er PUC-type-vektor med et forlenget multippelkloningssete. Fagmannen vil være i stand til å konstruere denne vektor basert på flytdiagrammet som vist i figur 7, se imidlertid også US-søknad 07/954 113 av 30. september 1992.

Det ville også være mulig å konstruere plasmider tilsvarende PTEX-trunkerte cellulaser eller derivater derav som beskrevet ifølge oppfinnelsen inneholdende et hvilket som helst annet stykke av DNA-sekvensen som erstatning for det trunkerte cellulasegen.

Del 2. Kloning

Det komplette cbh2-gen som benyttes ved konstruksjonen av CBHII-kjernedomene-ekspresjonsplasmidet, PTEX CBEII-kjernen, ble oppnådd fra plasmidet PUC219::CBHII (D. Korman et al., 1990, Curr. Genet, 17:203-212). Cellulosebindingsdomenet, posisjonert ved 5'-enden av cbh2-genet, er hensiktsmessig lokalisert mellom Xbal- og SnaBI-restriksjonsseter. For å benytte Xbal-setet ble et ytterligere Xbal-sete i poly-linkeren ødelagt. PUC219::CBHII ble partielt digestert med Xbal slik at hovedandelen av produktet var lineært. Xbal-overhengene ble fylt ved bruk av T4 DNA-polymerase og ligert sammen under betingelser som favoriserte selvligering av plasmidet. Dette hadde virkningen av å ødelegge det stumpe setet som, i 50% av plasmidene, var Xbal-setet i poly-linkeren. Et slikt plasmid ble identifisert og digestert med Xbal og SnaBI for å frigjøre cellulosebindingsdomenet. Vektor-CBHII-kjernedomenet ble isolert og ligert med de følgende, syntetiske oligonukleotider designert til å forene Xbal-setet med SnaBI-setet ved signalpeptidasespaltingssetet og papainspaltingspunktet i linkerdomenet.

Det resulterende plasmid, pUCACBD CBHII, ble digestert med Nhel og endene gjort stumpe ved inkubering med T4 DNA-polymerase og dNTP'er, hvorefter det lineære, stumpgjorte plasmid-DNA ble digestert med Bglll og det Nhe (stumpe) BglII-fragment inneholdende CBHII-signalsekvensen og kjernedomenet ble isolert.

Det endelige ekspresjonsplasmid ble tildannet ved digestering av generelt-formålsekspresjonsplasmidet, pTEX (beskrevet i US-søknad 07/954 113) med Sstll og Pmel og ligering av CBHII Nhel (stump)-Bgl11-fragmentet fra pUXACBD CBHII nedstrøms cbhl-promoteren ved bruk av et syntetisk oligonukleotid med sekvensen CGCTAG for å fylle BglII-overhenget med Sstll-overhenget. Konstruksjonen av den resulterende pTEX CBHII-kjerneekspresjonsvektor er oppsummert i figur 9.

pTEX-CBHI-kjerneekspresjonsplasmidet ble fremstilt på tilsvarende måte som pTEX-CBHII-kjernen beskrevet i eksemplet ovenfor. Dette konstruksjon er eksemplifisert i figur 8.

Del 2. Transformasjon og ekspresjon

Et storskala DNA-prep ble gjort av pTEX CBHII-kjerne og fra dette ble Noti-fragmentet inneholdende CBHII-kjernedomenet under kontroll av cbhl-transkripsjonelle elementer og pyr4-genet, isolert ved preparativ gelelektroforese. Det isolerte fragment ble transformert inn i den uridin-auksotrofe versjon av den quad-deleterte stamme, 1A52 pyrl3 og stabile transformanter ble identifisert.

For å selektere hvilke transformanter som uttrykker cbh2-kjernedomenet ble genomisk DNA isolert fra stammene fulgt av dyrking på Vogels + 1% glukose og Southern blott-forsøk ble gjennomført ved bruk av et isolert DNA-fragment inneholdende kun cbh2-kjernedomenet. Transformantene ble isolert med en kopi av cbh2-kjernedomene-ekspresjonskassetten integrert inn i genomet av 1A52. Total mRNA ble isolert fra de to stammer fulgt av dyrking 1 dag på Vogels + 1% laktose. mRNA ble underkastet Northern-analyse ved bruk av cbh2-kodingsområdet som probe. Transformanter som utviklet cbh2-kjernedomenet mRNA ble identifisert.

Transformanter ble dyrket under de samme betingelser som beskrevet ovenfor i eksempel 1 i 14L-fermentere. Resultant-buljongen ble konsentrert og proteinene ble separert ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese og CBHII-kjernedomeneproteinet identifisert ved VJestern-analyse. En transf ormant, nr. 15, ga et protein med korrekt størrelse og reaktivitet mot CBHII-polyklonale antistoffer.

Det ble derefter estimert at proteinkonsentrasjonen i fermenteringssupernatanten efter rensing var 10 g/l hvorav 30-5056 var CBHI I-kjernedomenet (se eksempel 4).

Man kan oppnå et hvilket som helst annet nytt, trunkert cellulasekjernedomeneprotein eller derivat derav ved å benytte metodene som beskrevet ovenfor.

Eksempel 4

Rensing av CBHI- og CBHII-katalytiske kjerner

Del 1. CBHI- katalvtisk k. ierne

CBHI-kjernen ble renset fra buljong på følgende måte. CBHI-kjerne-ultrafUtrert (UF) buljong ble filtrert ved bruk av diatomejord og fortynnet i 10 mM TES, pH 6,8, til en konduktivitet på 1,5 mOhm. Den fortynnede CBHI-kjerne ble så lastet på en anionbyttekolonnen (Q-Sepharose fast flow, Pharmacia, kat. nr. 17-0510-01), og så ekvilibrert i 10 mM TES, pH 6,8. CBHI-kjernen ble separert fra hovedandelen av de andre proteiner i buljongen ved bruk av en gradienteluering i 10 mM TES, pH 6,8 fra 0 til IM NaCl. Fraksjonene inneholdende CBHI-kjernen ble så konsentrert på en Amicon-omrørte cellekonsentrator med et PM 10-membran (diaflo ultra-filtreringsmembraner, Amicon, kat. nr. 13132MEM 5468A). Dette trinn konsentrerte kjernen og bevirker i tillegg separering av kjernen fra laveremolekylvektsproteiner. De resulterende fraksjoner var mer enn 85% ren CBHI-kjerne. Den reneste fraksjon ble sekvensverifisert til å være CBHI-kjernen.

Del 2. CBHII- katalvtisk k. ierne

Det ble gått ut fra at CBHII-katalytisk kjerne renses på en måte tilsvarende CBHII-cellulase på grunn av de tilsvarende biokjemiske egenskaper. Den teoretiske pl-verdi for CBHII-kjernen er mindre enn en halv pH-enhet lavere enn den til CBHII. I tillegg utgjør CBHII-katalytisk kjerne ca. 80% av molekylvekten for CBHII. Derfor er den følgende, foreslåtte renseprotokoll basert på rensemetoden som ble benyttet for CBHII. Diatomejord-behandlet og ultrafiltert CBHII-kjernebuljong fortynnes i 10 mM TES, pH 6,8 til en konduktivitet på

< 0,7 mOhm. Den fortynnede CBHII-kjerne lastes så på en anionbyttekolonne (Q-Sepharose fast flow, Pharmacia, kat. nr. 17-0510-01), og ekvilibrert i 10 mM TES, pH 6,8. En saltgradient fra 0 til IM NaCl i 10 mM TES, pH 6,8 benyttes for å eluere CBHII-kjernen fra kolonnen. Fraksjonene som inneholdt CBHII-kjernen bufferbyttes så inn i 2 mM natriumsuccinat-buffer og lastes på en kationbyttekolonne (SP-Sephadex C-50). CBHII-kjernen elueres derefter fra kolonnen med en saltgradient fra 0 til 100 mM NaCl.

Eksempel 5

Stenvasking med trunkert cellulaseenzym

Dette eksempel viser at bruken av trunkert cellulasekatalytiske kjerner og særlig trunkert endoglukanasekatalytiske kjerner, overraskende resulterer i en redusert gjenavsetning av farvestoffet på en celluloseholdig (denim) tekstil under stenvasking ved et ekvivalent nivå av abrasjon, i forhold til ikke-trunkerte cellulase. Videre resulterte kombinasjonen av trunkert CBH-type katalytisk kjerne og ikke-trunkert EG-type cellulase i en signifikant forbedret tilbakeflekkingskarakte-ristikk sammenlignet med ikke-trunkerte kombinasjoner ved ekvivalente abrasjonsnivåer. Denim er bomullstøy som er farvet. Metoder for å gi denimtekstiler et stenvasket utseende er beskrevet i US 4 832 864A samt i US-søknad 07/954 113.

Trunkert cellulasekatalytiske kjerner og cellulasekomponenter ble renset for bruk i dette eksempel som følger: a) EGIII-cellulasekomponenten ble renset i henhold til den metode som er beskrevet i US 5 328 841A. b) Trunkert EGI-katalytisk cellulasekjerne ble renset ved metoden ifølge eksempel 2. c) Trunkert EGII-katalytisk celluloasekjerne ble renset i henhold til metoden Ifølge eksempel 3. d) Trunkert CBHI-katalytisk kjerne ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 4. e) EGI-cellulasekomponenten ble renset for bruk ved stenvaskingsanvendelser på følgende måte. Den konsentrerte

(UF) buljong ble fortynnet i 25 mM natriumacetatbuffer, pH 5,0 til en konsentrasjon på 7 mg/ml protein. 450 g avicelcellulosegel (FMC Bioproducts, type PH-101) ble satt til den fortynnede buljong og blandet ved romtemperatur i 30 minutter. Avicelen ble fjernet fra buljongen ved

sentrifugering og man oppnådde en anriket EGI-katalytisk kj erne.

f) EGII-cellulasekomponenten ble renset for anvendelse ved stenvasking på følgende måte. Den konsentrerte (UF)

buljong ble filtrert i en diatomejord og bufferbyttet inn i ci trat-f osf at, pH 7, 0,4 mOhm ved bruk av en ultra-f iltreringsenhet (Filtron Minisette Ul trafiltration System, kat. nr. FS018K01) med en Omega 10K membran (Filtron, kat. nr. FS10K75). Dette materialet lastes så på en anionbyttekolonne (Q-Sepharose fast flow, Pharmacia, kat. nr. 17-0510-01), ekvilibrert i den ovenfor angitte citrat-fosfatbuffer. EGII ble samlet i kolonnegjennomløpet og byttet videre inn i natriumcitratet, pH 3,25, 0,5 mOhm, ved bruk av den ovenfor nevnte ultrafiltreringsenhet. Dette materialet ble så lastet på en kationbyttekolonne (SP-Spherodex LS, IBF Biotechnics, kat. nr. 262041). EGII ble så eluert fra kolonnen i en lineær gradient fra pH 3,25 til 5,4. Fraksjonene inneholdende EGII ble slått sammen og derefter brukt ved stenvaskingsanvendelser.

g) CBHI-cellulasekomponenten ble renset i henhold til den metode som er beskrevet i eksempel 15 i US-søknad

07/954 113.

Disse trunkerte cellulasekalytiske kjernedomener og cellulasekomponenter ble prøvet alene eller i kombinasjon med henblikk på evnen til å gi farvet denim et stenvasket utseende. Spesielt ble stenvaskede denimtekstiler fremstilt ved bruk av en industriell vasker og tørker under følgende betingelser:

citrat/fosfatbuffer, pH 5

totalt volum 38 liter

temperatur 120-135°F

6 par denimbukser med samme ballastvekt

1 time kjøretid

15-30 ppm GI, EGII, EGIII;

50 ppm CBHI og CBHI-katalytisk kjerne; og

30-70 ppm EGI-katalytisk kjerne og EGII-katalytisk kjerne.

En vaskemiddels eftervasking inkluderte 90 g AATCC-vaskemiddels uten lysgjørere når det gjaldt CBHI, CBHI-katalytisk kjerne, EGIII pluss CBHI og EGIII pluss CBHI-katalytisk kjerne.

Tekstilene ble evaluert på stenvasket utseende (abrasjon) og også med henblikk på gjenavsetning av farvestoff på tekstilen ved hjelp av et panel på 5 deltagere. Tekstilene ble gradert ved bruk av en skala omfattende denimgjenstander som hadde inkrementelt økende nivåer av abrasjon eller gjenavsetning. Skalaene ble nummerert fra 1 til 10, der 1 representerte jeans med den minste mengde abrasjon eller gjenavsetning (desize denim), og 10 representerte sterkt abradert eller gjenavsatt denim. Utseende av de behandlede jeans ble sammenlignet direkte med denimelementene i skalaen og gitt et nummer basert på elementet i skalaen som syntes mest passende. Resultatene av denne evaluering er vist i figurene 10 og 11.

Som vist i figur 10 ga trunkert EGI-katalytisk kjerne og trunkert EGII-katalytisk kjerne signifikante fordeler i forhold til sine ikke-modifiserte, nativtilstandsmotstykker i abrasjon og redusert gjenavsetning.

Som vist i figur 11 resulterte tilsetningen av CBHI-cellulasekomponenten til EGIII i en lett forbedring av stenvaskingen med en sterk økning av tilbakeflekking (gjenavsetning) av farvestoff på tekstilen. Imidlertid forbedret tilsetningen av trunkert CBHI-katalytisk kjerne til EGIII-oppløsningen resultatene både når det gjaldt øket abrasjon og redusert gjenavsetning. Således reduserte tilsetningen av trunkert CBHI-katalytisk kjerne til EGIII-cellulase, gjenavsetningen til et nivå under det til EGIII alene.

Som disse resultater viser resulterer bruken av trunkert cellulasekjerne under behandlingen av celluloseholdige tekstiler overraskende resultater med henblikk på redusert tilbakeflekking under enten opprettholdelse av et ekvivalent eller oppnåelse av et overlegent nivå av abrasjon. Videre oppnås dette resultat enten når den trunkerte cellulase benyttes alene eller når den blandes med en annen villtype eller trunkert cellulase. Disse resultater er både uventet og overraskende.

Claims

1. Fremgangsmåte for behandling av celluloseholdige tekstiler med cellulase, karakterisert ved trinnene: (a) å bringe den celluloseholdige tekstil i kontakt med en behandlingsblanding omfattende 0,1 til 1000 ppm trunkert cellulase, trunkert cellulaseadditiv eller en naturlig opptredende cellulase som mangler et cellulosebindingsdomene valgt blant EGI-typekjerne, EGII-typekjerne, EGV-typekjerne, CBHI-typekjerne, CBHII-typekjerne eller derivater derav; og (b) inkubering av den celluloseholdig tekstil i kontakt med den trunkerte cellulase eller trunkerte cellulasederivat under betingelser som bevirker behandling av tekstilen.

2 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at behandlingsblandingen videre omfatter EGIII.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den celluloseholdige tekstil omfatter en bomullsholdig tekstil, fortrinnsvis tørket denim.

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den trunkerte cellulase eller derivatet derav stammer fra en mikroorganisme som er en fungus eller en bakterie.

5 . Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte fungus er Trichoderma sp., fortrinnsvis Trichoderma longibrachiatum.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at behandlingsmetoden omfatter stenvasking av den celluloseholdige tekstil og at behandlingsblandingen omfatter en stenvaskingsblanding.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at den videre omfatter behandling av tekstilen med pimpsten samtidig med, før eller efter behandlingstrinnet.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at den trunkerte cellulasekjerne er til stede i en konsentrasjon av 3 til 400 ppm totalt protein, fortrinnsvis i en mengde av 20 til 100 ppm totalt protein.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at behandlingsmåten omfatter vasking av den celluloseholdige tekstilet og at behandlingsblandingen er en vaskemiddelblanding omfattende en surfaktant.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte surfaktant omfatter ikke-ioniske, etoksylerte alkylfenoler eller ikke-ioniske, etoksylerte alkoholer.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 6 og 9, karakterisert ved at behandlingsblandingen omfatter trunkert cellulasekjerne eller derivater derav.

12 . Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at den celluloseholdige tekstil er farvet, fortrinnsvis farvet denim.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 10, karakterisert ved at den trunkerte cellulasekjerne eller derivatene derav er til stede i en konsentrasjon av 0,2 til 500 ppm.

14 . Blanding for behandling av en celluloseholdig tekstil, karakterisert ved at den omfatter 0,1 til 1000 ppm av en trunkert cellulase eller et derivat derav valgt blant EGI-typekjerne, EGII-typekjerne, EGV-typekjerne, CBHI-typekjerne, CBHII-typekjerne eller derivater derav.

15 . Blanding ifølge krav 14, karakterisert ved at den trunkerte cellulase eller derivatet derav omfatter trunkert cellulasekjerne.

16. Blanding ifølge krav 14, karakterisert ved at blandingen finner anvendelse for stenvasking av celluloseholdig tekstil og videre inneholder en surfaktant.

17. Blanding ifølge krav 14, karakterisert ved at blandingen er brukbar som vaskemiddel og videre omfatter en surfaktant.

18. Blanding ifølge krav 17, karakterisert ved at surfaktanten omfatter ikke-ioniske, etoksylerte alkylfenoler eller ikke-ioniske, etoksylerte alkoholer.

19. Blanding ifølge krav 17, karakterisert ved at behandlingsblandingen er formulert som en forbløting.