CN105695439B

CN105695439B - 一种β-葡萄糖苷酶基因的重组表达方法

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Publication number: CN105695439B
Application number: CN201410699758.9A
Authority: CN
Inventors: 曾阿娜; 王刚; 冯奇; 许骏
Original assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2014-11-27
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2034-11-27
Also published as: CN105695439A; EP3224356B1; ES2805092T3; US20170327807A1; US9969995B2; EP3224356A4; EP3224356B9; WO2016082305A1; DK3224356T3; EP3224356A1

Abstract

本发明涉及一种β‑葡萄糖苷酶基因的重组表达方法。本发明具体涉及一种重组表达载体，其包含(a)天冬氨酸蛋白酶或其活性片段的编码序列、(b)β‑葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列、和(c)任选位于(a)和(b)之间的连接序列，还涉及包含所述重组表达载体的重组宿主细胞和重组纤维素降解菌、其制备方法及应用。本发明的方法能在提高β‑葡萄糖苷酶产量的同时缩短发酵周期，对提高纤维素的降解效率、高效的利用废弃的纤维素生产能源，解决当前能源危机具有重要意义。

Description

一种β-葡萄糖苷酶基因的重组表达方法

技术领域

本发明属于生物技术和发酵领域。具体而言，本发明涉及一种采用基因工程方法重组表达里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因的方法、用于该方法中的菌株及其应用。

背景技术

纤维素是植物细胞壁的主要成份，是地球上最大量的可再生碳源物质。利用纤维素进行生物转化生产燃料乙醇等化学品，对于解决人类面临的能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有极其重要的现实意义。

降解纤维素的纤维素酶是一个多酶复合体系，包含内切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。这三种酶协同作用将纤维素降解成葡萄糖。其中β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，其英文名为β-glucosidase(缩写BGL)，在纤维素酶水解纤维素的过程中可以水解纤维二糖从而释放出葡萄糖，成为纤维素彻底水解的关键步骤。

在纤维素水解过程中主要存在以下几方面问题：首先，β-葡萄糖苷酶活性受水解产物葡萄糖的抑制，而纤维二糖又是纤维素酶系中其它酶的抑制剂，从而使整个纤维素的水解过程受到抑制；其次，在产纤维素酶的菌株中，β-葡萄糖苷酶含量都很低(除黑曲霉外)，如里氏木霉分泌的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶含量还不到1％，远达不到实际应用的水平；再次，在反应过程中，由于热抑制作用，大量的β-葡萄糖苷酶活性消失。因此，β-葡萄糖苷酶的活力一般比内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶低一个数量级以上，成为纤维素降解的限速酶(王振宇等，高温厌氧菌产纤维素内切酶和β-葡萄糖苷酶的活性，大连轻工业学院学报，2005，24(2)，110～114)。

目前应用最广泛的纤维素酶生产菌株大多是里氏木霉(Trichoderma reesei)的优良突变株，它能分泌产生内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，包含了完整的纤维素水解酶系(Penttila ME等，Expression of two Trichoderma reesei Endoglucanasein the Yeast Saccharomyces cereviae(两种里氏木霉内切葡聚糖酶在酿酒酵母中的表达)，Yeast.Vol.3，1987(3)：175–185)。

由于天然里氏木霉菌株中的β-葡萄糖苷酶产量低，造成了纤维素的水解过程受限。因此，提高纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶的活力，是提高纤维素酶水解得率和葡萄糖产量的关键措施之一。

有研究者使里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中重组表达，其酶活力随诱导时间的增加而提高，但其发酵周期达8天以上(“里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体、重组菌及在重组菌中的表达”，授权公告号CN 102220369B)。也有研究者通过融合表达的方式在里氏木霉中过量表达β-葡萄糖苷酶，可得到酶活力几倍于原始菌株的产量，但其发酵周期长达6天以上(“提高具有生物学活性之多肽的分泌的方法”，授权公告号CN101516906B)。现有技术中的这些方法普遍存在发酵周期过长的不足。

因此，本领域迫切需要开发出一种能在提高酶活力的同时缩短发酵周期的纤维素降解微生物(例如基因工程化的里氏木霉)，以大大降低生产成本，提高纤维素酶的竞争力。

发明内容

本发明的方法能在提高β-葡萄糖苷酶产量的同时提前产酶周期，克服现有技术里氏木霉中β-葡萄糖苷酶发酵周期长，产酶量低等不足，对提高纤维素的降解效率、高效的利用废弃的纤维素生产能源，解决当前能源危机具有极其重要意义。

在本发明的第一方面中，提供了一种融合蛋白或其编码序列，所述融合蛋白包含：

(a)天冬氨酸蛋白酶或其活性片段；

(b)β-葡萄糖苷酶或其活性片段；和

(c)任选位于(a)和(b)之间的连接序列，例如由SEQ ID NO:4所示序列编码。

在本发明的第二方面中，提供了一种重组表达载体，其包含：

(a)天冬氨酸蛋白酶或其活性片段的编码序列；

(b)β-葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列；和

(c)任选位于(a)和(b)之间的连接序列的编码序列(例如SEQ ID NO:4所示的序列)。

在本发明的一些实施方式中，所述重组表达载体还包含选自下组的一种或多种元件：

(i)启动子，如里氏木霉纤维二糖水解酶I(CbhI)启动子(例如SEQ ID NO:1所示序列的启动子)、里氏木霉纤维二糖水解酶II(CbhII)、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉β-木聚糖酶里氏木霉β-葡糖苷酶启动子、米曲霉TATA淀粉酶启动子、米曲霉碱性蛋白酶启动子、米曲霉丙糖磷酸异构酶、黑曲霉中性α-淀粉酶启动子、黑曲霉糖化酶启动子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶启动子；在酵母中，有用的启动子包括：酿酒酵母烯醇化酶启动子(ENO-1)，酿酒酵母半乳糖激酶启动子、酿酒酵母醇脱氢酶启动子/甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶启动子；

(ii)信号肽编码序列，如里氏木霉纤维二糖水解酶I(CbhI)信号肽(例如SEQ IDNO:2所示序列的编码序列)、米曲霉淀粉酶信号肽，黑曲霉糖化酶信号肽，米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶信号肽的编码序列；

(iii)前导序列编码序列；

(iv)终止子，如里氏木霉纤维二糖水解酶I(CbhI)终止子(例如SEQ ID NO:6所示序列的终止子)、米曲霉淀粉酶终止子、黑曲霉糖化酶终止子、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶终止子；

(v)标记基因，如乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(pyrG)、潮霉素磷酸转移酶基因(hph)，构巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(argB)、硝酸还原酶(niaD)、邻氨基苯甲酸和酶(trpC)；

(vi)聚腺苷酸化序列，例如其获自选自下组的酶的基因的聚腺苷酸化序列：米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶和黑曲霉α-葡糖苷酶；以及CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)类似因子,GATA转录因子等；(vii)转录激活因子。

在本发明的一些实施方式中，所述重组表达载体的基本骨架来自：pCAmbia1300质粒、pCAmbia2300质粒、pCAmbia1301质粒或pBIN19质粒；优选地，所述重组表达载体是pAZ193。

在本发明的一些实施方式中，上述方面中的所述天冬氨酸蛋白酶或其活性片段编码序列选自：源自纤维素降解细菌的天冬氨酸蛋白酶或其它活性片段的编码序列，例如源自木霉(如哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei))、青霉、曲霉、毛霉、葡萄孢霉(Botrytis)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、噬胞菌属(Cytophaga)、产琥珀酸拟杆菌(Bacteroides succinogenes)、牛黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌(R.albus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)；优选所述天冬氨酸蛋白酶或其活性片段包含或7所示的序列或其同源序列编码的氨基酸序列或所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，优选经过保守性取代至少一个氨基酸后得到的序列。

在本发明的一些实施方式中，上述方面中的所述β-葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列选自：源自纤维素降解细菌的β-葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列，例如源自木霉(如哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei))、青霉、曲霉(如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、毛霉、葡萄孢霉(Botrytis)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、噬胞菌属(Cytophaga)、产琥珀酸拟杆菌(Bacteroides succinogenes)、牛黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌(R.albus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)；优选所述β-葡萄糖苷酶或其活性片段包含SEQ ID NO:5所示的序列编码的氨基酸序列或所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，优选经过保守性取代至少一个氨基酸后得到的序列，优选的所述β-葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列是Bgl1基因，更优选所述基因是里氏木霉β-葡萄糖苷酶Bgl1基因，例如具有SEQID NO:5所示的序列。

在本发明的第三方面中，提供了一种重组宿主细胞，其包含本发明所述的编码序列或本发明所述的重组表达载体，优选所述宿主细胞是大肠杆菌、酵母菌(如酿酒酵母、毕赤酵母)、农杆菌(如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。

在本发明的第四方面中，提供了一种重组纤维素降解菌，其特征在于，所述重组纤维素降解菌用本发明所述的重组表达载体或用本发明所述的重组宿主细胞转化从而重组表达天冬氨酸蛋白酶或其活性片段和β-葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列，优选所述纤维素降解菌源自木霉(如哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉(Trichodermareesei))、曲霉(如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae))、青霉，更优选所述纤维素降解菌源自ATCC56765的里氏木霉或为ATCC56765的里氏木霉。

在本发明的一些实施方式中，所述重组纤维素降解菌的β-葡萄糖苷酶活性是未经过基因工程化操作的纤维素降解菌的2～20倍，优选3～10倍；和/或，所述重组纤维素降解菌的纤维素降解发酵周期较未经过基因工程化操作的纤维素降解菌的发酵周期缩短，优选仅为1～3天。

在本发明的第五方面中，提供了一种制备本发明所述重组纤维素降解菌的方法，所述方法包括步骤：

(i)提供本发明所述的重组表达载体或重组宿主细胞；

(ii)在适合转化的条件下，用所述的重组表达载体或重组宿主细胞转化纤维素降解菌，以获得本发明所述重组纤维素降解菌。

在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括(iii)筛选、分离、收集、培养、扩增和/或使用被转化的纤维素降解菌。

在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括针对所述重组表达载体中的标记基因对重组宿主细胞和/或重组纤维素降解菌进行筛选。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤(ii)中的转化通过选自下组的方法进行：农杆菌介导转化法(例如利用根癌农杆菌和发根农杆菌)、基因枪介导转化法、电致孔转化法、超声波辅助转化法、原位转化法、核显微注射法。

在本发明的一些实施方式中，所述重组纤维素降解菌经分离、收集、培养和/或扩增后用于纤维素降解、或不经分离直接用于纤维素降解。

在本发明的第六方面中，提供一种降解纤维素材料或纤维二糖的方法，所述方法包括用有效量的本发明所述的融合蛋白、用有效量的本发明所述的重组纤维素降解菌、和/或用有效量以本发明所述的方法制备的重组纤维素降解菌在适于降解纤维素材料和/或纤维二糖的条件下与纤维素材料和/或纤维二糖接触。

在本发明的一些实施方式中，所述纤维素材料和/或纤维二糖在与所述宿主细胞或基因工程化纤维素降解菌接触之前未经过预处理，或经过预处理(如分离、粉碎、浸渍、酶预处理(例如通过酶处理降解为纤维二糖))；所述降解通过选自下组的一种或多种形式进行：固态发酵、液体深层发酵、分批发酵、连续发酵和流加发酵。

在本发明的一些实施方式中，所述纤维素材料选自农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸、以及纸浆和造纸厂的残余物，例如来自于木材、玉米秸秆、棉花、麦麸、棉短绒、谷物、麦草、稻草、芦苇、麻、桑皮、楮皮和甘蔗渣等。

在本发明的第七方面中还提供了一种重组表达β-葡萄糖苷酶或其活性片段的方法，所述方法包括：提供本发明所述的重组纤维素降解菌；在适合所述重组纤维素降解菌表达的条件下，使其表达β-葡萄糖苷酶或其活性片段。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：表达载体pAZ189的构建，其中的hph为潮霉素抗性基因。

图2：融合表达载体pAZ193的构建，其中的hph为潮霉素抗性基因。

图3：表达载体pAZ301的构建，其中的hph为潮霉素抗性基因。

图4：pAZ189的里氏木霉转化体(B1、B2、B3、B4、B5、B6)和pAZ193的里氏木霉转化体(FB2)的β-葡萄糖苷酶酶活力检测。图中，C30为里氏木霉RUT-C30。

图5：pAZ189的里氏木霉转化体(B1、B2、B3、B4、B5和B6)与pAZ301的里氏木霉转化体(PB2)的β-葡萄糖苷酶酶活力检测。图中，C30为里氏木霉RUT-C30。

具体实施方式

现有技术公开了重组菌株中的天冬氨酸蛋白酶会影响外源蛋白的表达(例如可参见：马腾，高产耐热β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株选育及其基因克隆，河北科技师范学院硕士论文，2012年6月；朱汇源，木聚糖诱导条件下黑曲霉特异基因表达分析及高表达碱性木聚糖酶产黄青霉菌株构建研究，山东大学博士论文，2010年10月)。

然而，本发明人经过长期而深入的研究出乎意料地发现：将天冬氨酸蛋白酶或其活性片段的编码序列与β-葡萄糖苷酶Bgl1基因通过基因工程化操作连接形成表达载体，并用所得的表达载体转化重组菌，不仅未影响β-葡萄糖苷酶Bgl1的表达，相反缩短了重组菌的发酵周期，提高了其酶活力，显著改善了其对纤维素的降解。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

天冬氨酸蛋白酶或其活性片段

如本文所用，术语“天冬氨酸蛋白酶”，是指一类重要的蛋白水解酶，其活性中心包含催化性天冬氨酸残基。

本发明的天冬氨酸蛋白酶可为：由SEQ ID NO：3或8所示的序列所编码的蛋白质或多肽、与该蛋白质或多肽具有相似水解功能的同源序列(例如可通过本领域已知的数据库或比对软件获得所述的同源序列)、其变异体或修饰形式。例如，所述天冬氨酸蛋白酶可选自：(a)SEQ ID NO：3或8所示序列编码的氨基酸序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有蛋白水解的活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽；或(c)具有天冬氨酸蛋白酶活性的其它氨基酸序列，例如SEQ ID NO:3或8编码序列的同源性序列。本发明中天冬氨酸蛋白酶优选由纤维素降解细菌(例如木霉(如哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei))的天冬氨酸蛋白酶基因或其同源基因或家族基因编码。

本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的天冬氨酸蛋白酶可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有蛋白水解的活性。

该多肽的变异形式还包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与天冬氨酸蛋白酶编码序列杂交的序列所编码的蛋白等。

除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了天冬氨酸蛋白酶的可溶性片段，只要其还具有相似的蛋白水解活性。通常，该片段具有天冬氨酸蛋白酶序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括天冬氨酸蛋白酶的活性片段和活性衍生物。

β-葡萄糖苷酶或其活性片段

如本文所用，术语“β-葡萄糖苷酶”，是指纤维素分解酶系中的重要组成成分，其能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。

本发明的β-葡萄糖苷酶可为：由SEQ ID NO：5的序列所编码的蛋白质或多肽、与该蛋白质或多肽具有相似水解功能的同源序列(例如可通过本领域已知的数据库或比对软件获得所述的同源序列)、其变异体或修饰形式。例如，所述β-葡萄糖苷酶可选自：(a)SEQ IDNO：5所示序列编码的氨基酸序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有蛋白水解的活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽；或(c)具有天冬氨酸蛋白酶活性的其它氨基酸序列，例如由SEQ ID NO:5所示序列编码的多肽的同源性序列。本发明中β-葡萄糖苷酶优选由纤维素降解细菌(例如木霉(如哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei))的β-葡萄糖苷酶基因或其同源基因或家族基因编码。

本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的β-葡萄糖苷酶可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有蛋白水解的活性。

该多肽的变异形式还包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与β-葡萄糖苷酶编码序列杂交的序列所编码的蛋白等。

除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了β-葡萄糖苷酶的可溶性片段，只要其还具有相似的蛋白水解活性。通常，该片段具有β-葡萄糖苷酶序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括β-葡萄糖苷酶的活性片段和活性衍生物。

编码序列

如本文所用，术语“基因”、“编码序列”或“蛋白/多肽编码序列”可互换使用，均是指一种编码本发明所需蛋白质或多肽或其活性片段(如天冬氨酸蛋白酶或其活性片段、β-葡萄糖苷酶或其活性片段)的序列。

对于天冬氨酸蛋白酶或其活性片段而言，其编码序列可为例如：SEQ ID NO：3或8所示的序列核苷酸序列、在严格条件下与这些序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表达可产生与β-葡萄糖苷酶或其活性片段融合的天冬氨酸蛋白酶或其活性片段。例如，本发明的天冬氨酸蛋白酶编码序列可选自：(i)SEQ ID NO：3或8所示的核苷酸序列；或(ii)在严格条件下与(i)限定的序列杂交且具有天冬氨酸蛋白酶活性的分子。

对于β-葡萄糖苷酶或其活性片段而言，其编码序列可为例如：SEQ ID NO：5所示的里氏木霉Bfl1序列、在严格条件下与这些序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表达可产生与天冬氨酸蛋白酶或其活性片段融合的β-葡萄糖苷酶或其活性片段。例如，本发明的天冬氨酸蛋白酶编码序列可选自：(i)SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或(ii)在严格条件下与(i)限定的序列杂交且具有β-葡萄糖苷酶活性的分子。

在本发明的融合片段编码序列中，可包含至少一个拷贝(例如1～20个拷贝，1～10个拷贝等)的天冬氨酸蛋白酶或其活性片段编码序列与至少一个拷贝(例如1～20个拷贝，1～10个拷贝等)的β-葡萄糖苷酶Bgl1或其活性片段的编码序列。

在本发明的融合片段编码序列中，所述天冬氨酸蛋白酶或其活性片段的编码序列可位于所述β-葡萄糖苷酶Bgl1或其活性片段的编码序列的上游或下游。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。

本发明的编码序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明的编码序列优选获自纤维素降解细菌，获自其它微生物的与纤维素降解细菌相应编码序列高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、98％甚至99％或以上的序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

重组表达载体、重组表达宿主以及重组纤维素降解菌

本发明涉及包含天冬氨酸蛋白酶或其活性片段的编码序列以及β-葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列的重组表达载体、包含该重组表达载体的宿主细胞、以及通过转化获得的重组纤维素降解菌。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的编码序列可用来表达或生产重组蛋白。例如，可包括以下步骤：

(1)用本发明的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞，并用所述宿主细胞转化纤维素降解菌；或用本发明的重组表达载体直接转化目标菌种(例如纤维素降解菌)，以获得重组纤维素降解菌；

(2)分离、收集、培养、扩增和/或使用被所述重组表达载体直接或间接转化的所述重组纤维素降解菌。

本发明中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含天冬氨酸蛋白酶或其活性片段的编码序列以及β-葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列、和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本发明中优选使用cbhI启动子、cbhI启动子载体、里氏木霉表达***。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于潮霉素筛选法的潮霉素抗性基因、真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其可进一步用于转化适当的目标微生物，以使该目标微生物能够具有所需的纤维素降解活性。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌(如根癌农杆菌和发根农杆菌)；真菌细胞如酵母等。在本发明中，优选采用农杆菌(如根癌农杆菌和发根农杆菌)作为宿主细胞。本领域普通技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本发明中术语“重组纤维素降解菌”是指通过常规转基因的方法获得的转入本发明天冬氨酸蛋白酶或其活性片段的编码序列以及β-葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列并稳定表达所述蛋白或多肽的微生物，优选所述“纤维素降解菌”本身具有纤维素降解活性。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

纤维素降解活性

如本文所用，术语“纤维素材料”是指任何含有纤维素的材料。通常在例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或者树的叶、枝、和木质发现有纤维素。纤维素材料还可以是，但不限于，草本植物材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸、以及纸浆和造纸厂残余物。应当理解本文的纤维素可以是木质纤维素的形式，即在混合基质中含有木质素、纤维素、和半纤维素的植物细胞壁材料。

在一个优选的方面，纤维素材料是玉米秸杆。在另一个优选的方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个优选的方面，纤维素材料是稻草。在另一个优选的方面，纤维素材料是纸和纸浆加工废料。在另一个优选的方面，纤维素材料是木本或草本植物。在另一个优选的方面，纤维素材料是甘蔗渣。

可以使用本领域已知的常规方法来利用纤维素材料，进行或者可进行预处理。例如，物理预处理技术可包括各种类型的碾磨、照射、蒸/蒸汽喷发、和湿热分解作用；化学预处理技术可包括用稀酸、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳、和pH控制的湿热分解作用；及生物预处理技术可包括应用溶解木质素的微生物。

本文中，术语“发酵”是指采用本发明的重组纤维素降解菌分解纤维素材料或其衍生物(如纤维二糖)的过程。该过程可采用本领域中常规使用的发酵设备和工艺进行，本领域普通技术人员可根据实际需要和条件对设备和工艺进行选择。

如本文所用，术语“纤维素降解活性”是指水解纤维素材料的生物学活性，主要包括：纤维素降解过程限速酶β-葡萄糖苷酶的酶量和/或活性、发酵的周期长短等。术语“提高纤维素降解活性”是指与未经基因工程化处理的原目标菌相比，经基因工程化操作的纤维素降解菌具有更多的β-葡萄糖苷酶、更高活性的β-葡萄糖苷酶、和/或更短的发酵周期。

例如，在本发明的一些实施方式中，所述重组纤维素降解菌的β-葡萄糖苷酶活性是未经过基因工程化操作的菌种的2～20倍，优选3～10倍；和/或，所述重组纤维素降解菌的纤维素降解发酵周期较未经过基因工程化操作的菌种的发酵周期缩短，优选仅为1～3天。

本发明的示例性实施方式

以下是本发明的一个示例性实施方式，应理解其中所揭示的所有特征可与本发明的其它形式并用，其中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

A.融合片段来源

如本文所用，术语“融合片段”是指天冬氨酸蛋白酶或其活性片段与β-葡萄糖苷酶Bgl1或其活性片段的融合产物。融合片段中的天冬氨酸蛋白酶可为例如：NCBI数据库中p6281基因(SEQ ID NO:7)编码的天冬氨酸蛋白酶。

在本发明的融合片段中，可包含至少一个拷贝(例如1～20个拷贝，1～10个拷贝等)的天冬氨酸蛋白酶或其活性片段与β-葡萄糖苷酶Bgl1或其活性片段。相应地，本发明融合片段编码序列中，可包含至少一个拷贝(例如1～20个拷贝，1～10个拷贝等)的编码序列。

在本发明的融合片段中，所述天冬氨酸蛋白酶或其活性片段可位于所述β-葡萄糖苷酶Bgl1或其活性片段的上游或下游。相应地，在本发明的融合片段编码序列中，所述天冬氨酸蛋白酶或其活性片段的编码序列可位于所述β-葡萄糖苷酶Bgl1或其活性片段的编码序列的上游或下游。

B.里氏木霉BGL1表达载体的构建

参考《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2002，[美]J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译)所记载的方法，以pCambia1300(购自invitrogen)为基础，在多克隆位点处依次连接入CbhI启动子、CbhI信号肽、Bgl1基因、CbhI终止子。构建如图1中所示的pAZ189表达载体，该表达载体中包含：CbhI启动子、CbhI信号肽、Bgl1基因、CbhI终止子。

参考《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2002，[美]J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译)所记载的方法，以pCambia1300(购自invitrogen)为基础，在多克隆位点处依次连接入CbhI启动子、CbhI信号肽、F1融合片段、连接肽、Bgl1基因、CbhI终止子。构建如图2中所示的pAZ193表达载体，该表达载体中包含：CbhI启动子、CbhI信号肽、F1融合片段、连接肽、Bgl1基因、CbhI终止子。

参考《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2002，[美]J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译)所记载的方法，以pCambia1300(购自invitrogen)为基础，在多克隆位点依次连接入CbhI启动子、CbhI信号肽、p6281融合片段、连接肽、Bgl1基因、CbhI终止子。构建如图3中所示的pAZ301表达载体，该表达载体中包含：CbhI启动子、CbhI信号肽、p6281融合片段、连接肽、Bgl1基因、CbhI终止子。

C.用pAZ189、pAZ193和pAZ301表达载体转化里氏木霉RUT-C30

采用根癌农杆菌转化法转化里氏木霉(里氏木霉具体为RUT-C30，购自ATCC，即ATCC56765)，具体方法参考文献(de Groot,M.J.等，Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi.Nature Biotechnology，1998(16)：839-842)。

D.pAZ193、pAZ189或pAZ301表达载体转化子的筛选及酶活检测

具体方法参考文献(de Groot,M.J.等，Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation of filamentous fungi.Nature Biotechnology，1998(16)：839-842)。

酶活测定方法：β-葡萄糖苷酶活性为β-D-葡糖苷葡糖水解酶(β-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，同时释放β-D-葡萄糖。根据Venturi等(Extracellularβ-D-glucosidase from Chaetomiumthermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemicalproperties，J.Basic Microbiol.2002(42)：55-66)记载的规程测定β-葡萄糖苷酶活性。

将一个酶活力单位的葡萄糖苷酶活性定义为：在50℃、pH 5的条件下，由100mM柠檬酸钠，0.01％20中的4mM作为底物的对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷每分钟产生1.0μM对硝基酚的酶量。

本发明的优点

本发明的重组纤维素降解菌能在较短发酵周期内(发酵周期仅1～3天)高效表达β-葡萄糖苷酶，且酶活力显著高于原始菌株，克服了现有技术中里氏木霉中β-葡萄糖苷酶的表达量低且产酶周期长(发酵周期长达5～8天)的不足。

序列表的对应关系

下表中所示是所附序列表中各序列的序号与序列名称的对应关系：

SEQ ID NO:	序列名称
		1	CbhI启动子序列
2	信号肽编码序列
		3	F1编码序列
4	连接肽编码序列
		5	里氏木霉Bgl1序列
6	CbhI终止子序列
		7	p6281编码序列

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)、《生物化学与分子生物学实验教程》(梁宋平主编高等教育出版社)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.β-葡萄糖苷酶的来源

采用里氏木霉RUT-C30(购自ATCC，即ATCC56765)来表达β-葡萄糖苷酶。将RUT-C30在30℃培养5-7天，用0.8％的生理盐水清洗孢子平板，收集孢子悬浮液，接种250ml玻璃摇瓶中的50ml纤维素酶诱导培养基，培养基配方如下：

(NH4)₂SO₄5g/L；MES缓冲液19.52g/L；酵母膏(OXOID，货号LP0021)9g/L；KH₂PO₄4.5g/L；CaCl₂·2H₂O 1.32g/L；MgSO₄·7H₂O 1g/L；消泡剂(购自南京华兴消泡剂有限公司，货号xp-m-130)5ml/L；400×痕量元素2.5ml/L pH 5.5；乳糖(单独灭菌)40g/L。其中，400×痕量元素溶液为：柠檬酸(无水)175g/L；FeSO₄·7H₂O 200g/L；ZnSO₄·7H₂O 16g/L；CuSO₄·5H₂O 3.2g/L；MnSO₄·4H₂O 1.4g/L；H₃BO₃ 0.8g/l。

将培养物在30℃以200rpm恒定摇动温育。自发酵起始日后的第2天起，取2、3、4、6天发酵培养物1ml，12000×g离心并收集上清液。

实施例2.天冬氨酸蛋白酶编码序列片段来源

用于构建融合蛋白表达载体的天冬氨酸蛋白酶编码序列分别如下：(1)序列F1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其与NCBI数据库中p6281基因的一致性为99％；(2)NCBI数据库中p6281基因，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例3.里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因表达载体pAZ189的构建

参考《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2002，[美]J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译)所记载的方法，以pCambia1300(购自invitrogen)为基础，在多克隆位点处依次连接入CbhI启动子(SEQ ID NO:1)、CbhI信号肽编码序列(SEQ ID NO:2)、Bgl1基因(SEQ IDNO:5)、CbhI终止子(SEQ ID NO:6)，构建里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因表达载体pAZ189。

该表达载体中包含如下序列：CbhI启动子、CbhI信号肽编码序列、Bgl1基因、CbhI终止子。该载体的具体结构参见图1。

实施例4：里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因表达载体pAZ301构建

参考《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2002，[美]J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译)所记载的方法，以pCambia1300(购自invitrogen)为基础，在多克隆位点处依次连接入CbhI启动子(SEQ ID NO:1)、CbhI信号肽编码序列(SEQ ID NO:2)、p6281融合片段编码序列(SEQ ID NO:7)、连接肽编码序列(SEQ ID NO:4)、Bgl1基因(SEQ ID NO:5)、CbhI终止子(SEQ ID NO:6)构建里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因表达载体pAZ301。

该表达载体中包含：CbhI启动子、CbhI信号肽编码序列、p6281融合片段编码序列、连接肽编码序列、Bgl1基因和CbhI终止子。该载体的具体结构参见图3。

实施例5.用β-葡萄糖苷酶表达载体pAZ189转化里氏木霉RUT-C30

将质粒pAZ189通过根癌农杆菌AGL1(购自invitrogen)介导的转化，导入里氏木霉RUT-C30菌株。具体方法参考文献(de Groot,M.J.，Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation of filamentous fungi.，Nature Biotechnology，1998(16)：839-842)，得到总共约200个转化体。

实施例6：用β-葡萄糖苷酶表达载体pAZ301转化里氏木霉RUT-C30

将质粒pAZ301通过根癌农杆菌AGL1介导的转化，导入里氏木霉RUT-C30。具体方法参考文献(de Groot,M.J.,Bundock,P.,Hooykaas,P.J.,Beijersbergen,A.G.1998.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentousfungi.Nature Biotechnology 16,839-842)，得到总共约200个转化体。

实施例7.pAZ189的里氏木霉转化子筛选及酶活检测

在潮霉素抗性筛选平板上对实施例5得到的转化体进行初筛，培养基配方如下(g/L)：

磷酸氢二钾(K₂HPO₄)2.05g/L；磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.45g/L；氯化钠(NaCl)0.15g/L；七水合硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L；六水合氯化钙(CaCl₂·6H₂O)0.1g/L；七水合硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)0.0025g/L；硫酸铵(NH₄)₂SO₄0.5 g/L；葡萄糖2g/L；潮霉素10mg/L。

潮霉素抗性转化子筛选方法，具体方法参考文献(de Groot,M.J.等，Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi.NatureBiotechnology，1998(16)：839-842)。

初筛后，收集转化子的孢子进行产酶发酵(参考专利文献“在木霉中表达过氧化氢酶”(CN200980107269)中里氏木霉菌株转化子的发酵条件)。用3ml0.01％80随机清洗9个转化子的孢子板(挑选初筛后的转化子若干，每个转化子单独接种到潮霉素筛选培养基上，30℃培养5-7天，用0.8％的生理盐水，清洗孢子平板，收集孢子悬浮液)，接种250ml玻璃摇瓶中的50ml纤维素酶诱导培养基，该培养基配方如下：

(NH4)₂SO₄ 5g/L；MES缓冲液19.52g/L；酵母膏(Yeast Extract，OXOID，货号LP0021)9g/L；KH₂PO₄ 4.5g/L；CaCl₂·2H₂O 1.32g/L；MgSO₄·7H₂O 1g/L；消泡剂(购自南京华兴消泡剂有限公司，货号xp-m-130)5ml/L；400×痕量元素2.5ml/L pH 5.5；乳糖(单独灭菌)40g/L。其中，400×痕量元素溶液为：柠檬酸(无水)175g/L；FeSO₄·7H₂O 200g/L；ZnSO₄·7H₂O 16/L；CuSO₄·5H₂O 3.2g/L；MnSO₄·4H₂O 1.4g/L；H₃BO₃ 0.8g/L)。将转化体培养物在30℃以200rpm恒定摇动温育。自发酵起始日起，取2、3、4、6天发酵培养物1ml，12000×g离心并收集上清液。

对转化体的上清液测量β-葡萄糖苷酶活性。酶活测定方法：根据Venturi等(Extracellularβ-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemical properties，J.BasicMicrobiol.2002(42)：55-66)记载的规程测定β-葡萄糖苷酶活性。

试验结果显示，所有转化体与里氏木霉Rut-C30的β-葡萄糖苷酶在整个发酵周期中酶活力相当，图4中示例性地示出了编号为B1～B6的转化体的酶活，其余未示出的转化体的酶活与B1～B6转化体相似。

实施例8.pAZ301的里氏木霉转化子的筛选和酶活检测

转化实验得到了总共约300个转化体。初筛后，收集转化子的孢子进行产酶发酵(参考专利文献“在木霉中表达过氧化氢酶”(CN：200980107269)中里氏木霉菌株转化子的发酵条件)。用3ml 0.01％80随机清洗9个转化子的孢子板(挑选初筛后的转化子若干，每个转化子单独接种到潮霉素抗性筛选培养基上，30度培养5-7天，用0.8％的生理盐水，清洗孢子平板，收集孢子悬浮液)，接种250ml玻璃摇瓶中的50ml纤维素酶诱导培养基，培养基配方如下：

(NH4)₂SO₄ 5g/L；MES缓冲液19.52g/L；酵母膏(OXOID，货号LP0021)9g/L；KH₂PO₄4.5g/L；CaCl₂·2H₂O 1.32g/L；MgSO₄·7H₂O 1g/L；消泡剂(购自南京华兴消泡剂有限公司，货号xp-m-130)5ml/L；400×痕量元素2.5ml/L pH 5.5；乳糖(单独灭菌)40g/L。400×痕量元素溶液为：柠檬酸(无水)175g/L；FeSO₄·7H₂O 200g/L；ZnSO₄·7H₂O 16g/L；CuSO₄·5H₂O3.2g/L；MnSO₄·4H₂O 1.4g/L；H₃BO₃ 0.8g/l。

将转化体培养物在30℃以200rpm恒定摇动温育。取发酵第2、3天发酵培养物1ml，12000×g离心并收集它们的上清液。

对转化体的培养液测量β-葡糖苷酶活性。结果显示：pAZ301里氏木霉BGL1转化体的产酶时间提前且酶活增高，其中编号为PB2的转化体的β-葡萄糖苷酶活性在第2天到第3天即达到里氏木霉Rut-C30的β-葡萄糖苷酶活性的数倍，且显著高于pAZ189里氏木霉BGL1转化体(见图5)，在图5中未示出的其它pAZ301转化体也可达到与PB2相似的效果。

由上述实施例可知，在以天冬氨酸蛋白酶(如F1或p6281)为融合片段的BGL1表达载体，转化里氏木霉RUT-C30后得到的转化体，在发酵第2天到第3天其β-葡萄糖苷酶活性即达到里氏木霉Rut-C30的β-葡萄糖苷酶活性的数倍，且显著高于pAZ189里氏木霉BGL1转化体。表明β-葡萄糖苷酶，在融合了天冬氨酸蛋白酶(例如F1或P6281)的转化体比不加融合片段的转化体表现出酶活力高几倍的性质，且产酶高峰时间由原来的发酵6到7天，缩短到发酵2到3天。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：

(a)由核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的核酸分子编码的天冬氨酸蛋白酶；

(b)由核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的核酸分子编码的β-葡萄糖苷酶；和

(c)位于(a)和(b)之间的由核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的核酸分子编码的连接序列。

2.核酸分子，其编码如权利要求1所述的融合蛋白。

3.一种重组表达载体，其包含：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的核酸分子；

(b)核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的核酸分子；和

(c)位于(a)和(b)之间的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的核酸分子。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包含选自下组的一种或多种元件：

(i)启动子；

(ii)信号肽编码序列；

(iii)前导序列编码序列；

(iv)终止子；

(v)标记基因；

(vi)聚腺苷酸化序列。

5.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的基本骨架来自：pCAmbia1300质粒、pCAmbia2300质粒、pCAmbia1301质粒或pBIN19质粒。

6.一种重组宿主细胞，其包含权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的重组表达载体。

7.如权利要求6所述的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞是大肠杆菌、酵母菌、或农杆菌。

8.如权利要求6所述的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞是酿酒酵母、毕赤酵母、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。

9.一种重组纤维素降解菌，其特征在于，所述重组纤维素降解菌用权利要求3-5中任一项所述的重组表达载体或权利要求6-8中任一项所述的重组宿主细胞转化从而重组表达天冬氨酸蛋白酶和β-葡萄糖苷酶。

10.如权利要求9所述的重组纤维素降解菌，其中，所述纤维素降解菌源自木霉、曲霉或青霉。

11.如权利要求10所述的重组纤维素降解菌，其中，所述木霉为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)或里氏木霉(Trichodermareesei)。

12.如权利要求10所述的重组纤维素降解菌，其中，所述曲霉为黑曲霉(Aspergillusniger)。

13.如权利要求9所述的重组纤维素降解菌，其中，所述纤维素降解菌源自ATCC56765。

14.一种制备权利要求9-13中任一项所述重组纤维素降解菌的方法，所述方法包括步骤：

(i)提供权利要求3-5中任一项所述的重组表达载体或权利要求6-8中任一项所述的重组宿主细胞；

(ii)在适合转化的条件下，用所述的重组表达载体或重组宿主细胞转化纤维素降解菌，以获得权利要求9-13中任一项所述重组纤维素降解菌。

15.一种降解纤维素材料或纤维二糖的方法，所述方法包括用有效量的权利要求1所述的融合蛋白、有效量的权利要求9所述的重组纤维素降解菌、和/或用有效量权利要求14所述的方法制备的重组纤维素降解菌在适于降解纤维素材料和/或纤维二糖的条件下与纤维素材料和/或纤维二糖接触。