NO301121B1

NO301121B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et delesjonsmutantprotein med biologisk aktivitet til faktor VIII, DNA-sekvens, ekspresjonsvektor, samt transformert celle og avkom derav

Info

Publication number: NO301121B1
Application number: NO890587A
Authority: NO
Inventors: Albert Johannes Joseph V Ooyen; Hans Pannekoek; Martinus Philippus Verbeet; Robert Willem Van Leen
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1987-06-12
Filing date: 1989-02-10
Publication date: 1997-09-15
Also published as: DK58789A; US5171844A; PT87721A; IL86693A0; NO890587L; HU211503A9; DE3855523D1; KR970002915B1; DE3855523T2; FI103731B; DE3856505T2; IE69026B1; ES2094111T3; JP2771827B2; PT87721B; JPH02500484A; ES2169095T3; CN1030609A; FI890643A0; DE3856505D1

Description

Foreliggende oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et delesjonsmutantprotein med biologisk aktivitet til faktor VIII, DNA-sekvens, ekspresjonsvektor, samt transformert celle og avkom derav.

Hemophilia A er en kjønnsbundet blødningsforstyrrelse karakterisert ved en mangel på faktor VIII, som er et essentielt element i blodkoagulasjonskaskaden. Sykdommen oppstår i omtrent 0, 01% av hannkjønnspopulasjonen. Hemophilia A kan bli behandlet ved administrering av faktor VIII-inneholdende blodplasma tilveiebragt fra friske givere. Denne behandlingen har derimot flere ulemper. Tilførsel av faktor VIII er begrenset og veldig dyr; konsentrasjonen av faktor VIII i blodet er bare omtrent 100 mg/ml og utbyttet ved anvendelse av for tiden anvendte plasma fraksjonerings-metoder er lav. På grunn av at kilden til faktor VIII består av sammenblandet giverblod, utsettes mottageren for en stor risiko av å få forskjellige infeksjonssykdommer, innbefattende de som blir forårsaket av hepatititt ikke-A, ikke-B, heptatitt B eller AIDS virusene som kan være tilstede i giverblodet. I tillegg kan mottagerene utvikle antistoffer ovenfor exogen faktor VIII, som kan redusere effektiviteten betraktelig.

Faktor VIII består av tre regioner, en N-terminalregion, den såkalte "AIA2-domene", en sentralregion, den såkalte "B domenen"; og en C-terminalregion bestående av A3, Cl og C2 domenene. AIA2-domenen og den C-terminale regionen antas å være essentiell for koaguleringsaktiviteten. Faktor VIII sirkulerer i blodet sammen med et protein, von Willebrand faktor (vWf), som antas å beskytte følsom faktor VIII mot tidlig nedbryting.

Faktor VIII blir tilveiebragt i utilfredsstillende lavt utbytte når den blir produsert ved hjelp av kjente rekombinante DNA prosesser. Proteinene ser ikke ut til å være tilstede som en intakt kjede, siden det er vanskelig å isolere produktene og å rense disse og dermed er omkost-ningene høye. Det er derfor ønskelig å utvikle en effektiv måte hvorpå store mengder av forbindelser som har faktor VIII aktivitet kan bli produsert, hvorved forbindelsene fortrinnsvis har redusert immunogen aktivitet.

Molekylær kloning av faktor VIII cDNA tilveiebragt fra humant mRNA og påfølgende produksjon av proteiner med faktor VIII aktivitet i pattedyr, gjær og bakterielle celler er blitt beskrevet. Se WO 85/01961, EP 0160457, EP 0150735, EP 0253455. En metode for å produsere proteiner med faktor VIII aktivitet på, ved anvendelse av transformerte mikroorganis-mer, er beskrevet i EP 0253455. EP 0150735 og EP 0123945 og Brinkhous et al. (1985) beskriver faktor VIII aktivitet i proteolytiske spaltningsprodukter av faktor VIII. Et kompleks av to proteolytiske spaltningsprodukter av faktor VIII, et 92 kDa og et 80 kDa polypeptid utviser forsterket faktor VIII aktivitet. (fay et al., Biochem. Biophys. Acta

(1986) 871:268-278; Faton et al Biochemistry (1986), 25: 505-512).

Eaton et al., Biochemistry (1986) 25: 8343-8347 beskriver at et polypeptid hvori 766 aminosyrer (797-1562) er blitt deletert fra den sentrale regionen opprettholder faktor VIII aktivitet. Derimot hadde pattedyrceller transformert med en vektor inneholdende DNA som koder for dette delesjonspolypep-tidet et høyere produksjonsnivå enn celler transformert med en vektor inneholdende DNA som koder for polypeptidet i full lengde.

WO 86/06101 beskriver at rekombinante faktor VIII proteiner med delesjoner på opp til 880 aminosyrer i den sentrale regionen utviser faktor VIII aktivitet. Den største delesjonen rekker fra Thr-760 til og med Asn-1639 (nummerert ifølge fig. 1). Vertscellene for preparering av rekombinant faktor VIII innbefattet pattedyrceller, innbefattende kinesisk hamsterovarieceller.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av et delesjonsmutantprotein med biologisk aktivitet til faktor VIII og med en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyresekvensen til faktor VIII med unntagelse av en delesjon av aminosyresekvensen Ser-741 til og med Ser-1637 og a) en delesjon av aminosyresekvens Gln-1638 til og med Ile-1668 eller b) en delesjon av minst en del av aminosyresekvensen Lys-713 til og med Arg-740 og eventuelt en delesjon av i det minste en del av aminosyresekvensen Gln-1638 til og med Ile-1668 og eventuelt innskudd av aminosyresekvensen Pro-Arg-Val-Ala, kjennetegnet ved at den omfatter å dyrke i et næringsmedium en vertscelle omfattende en ekspresjonsvektor som innbefatter, i transkripsjonsretningen, en transkripsjonen regulatorisk region og en translasjonen initeringsregion som er funksjonell i nevnte vertscelle, en DNA-sekvense kodende for nevnte delesjonsmutantprotein og translasjonene og transkripsjonene termineringsregioner funksjonelle i nevnte vertscelle, i det ekspresjonen av nevnte DNA-sekvens er regulert ved nevnte initierings- og termineringsregioner, og isolering av nevnte protein.

Oppfinnelsen vedrører også DNA sekvens kjennetegnet ved at den koder for et protein som angitt ovenfor.

Det er også beskrevet transformert celle og avkom derav som er kjennetegnet ved at cellen omfatter en ekspresjonsvektor som angitt ovenfor omfattende i transkripsjonsretningen en transkripsjonen regulatorisk region og en translasjonen initieringsregion som er funksjonell i vertscellen, en DNA sekvens kodende for et protein som definert ovenfor og translasjonene og transkripsjonene termineringsregioner som er funksjonelle i nevnte vertscelle, i det ekspresjonen av nevnte DNA sekvens er regulert ved nevnte initierings- og termineringsregioner.

Fig. 1 viser faktor VIII cDNA innskuddet i pCLB89 innbefattende aminosyresekvensen Ala-1 til og med Tyr-2332 til faktor VIII og dets signalfrekvens M(-19) til og med S(-l) med de korresponderende nukleotidsekvensene. F-973 er kodet av TTC-kodonet. Fig. 2 viser strukturen av ekspresjonsvektor pCLB201 som koder for faktor VIII proteinet med full lengde. Det sirkulære plasmidet pCLB201 er vist begynnende med EcoRI posisjonen innenfor 4217 bp Eindlll-Bglll fragmentet avledet fra plasmid pSV2 (Gorman, 1985 DNA Cloning (Ed. Glover) IRL Press, s. 143-169; Mulligan and Berg, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1981) 78:2072). Den tidlige SV40-promoterregionen er betegnet: SVep. Vektoren inneholder også et Ndel-Hindlll fragment avledet fra plasmid pRSV-neo (Gorman, 1985, ovenfor) som inneholder Rous Sarcoma virus-lang terminal gjentagelse (LTR) satt inn i et Sali sete. Full-lengde faktor VIII blir kodet av et Sall-Hpal fragment på 7440 bp og betegnet: faktor VIII cDNA (H = Hindlll, Sal = Sali). Restriksjonsendonu-klease-spaltningssetene som blir tapt i løpet av konstruksjonen av pCLB201 er omgitt av parenteser. Størrelsen av plasmidet er gitt i kilobase par (kb). Fig. 3 viser vektorer for transient ekspresjon av delesjonsmutant faktor VIII proteiner:

a. Hovedtrekkene ved pSV2-avledet vektor:

to promotore som er beliggende i tandem i forhold til hverandre: SV40 tidlige transkripsjonspromoteren (SVep) og Rous Sarcoma virus-lang terminal gjentagelse (RSV-LTr); capping sete (Capsite) og 5'-enden til messenger RNA (mRNA); cDNA innskuddet som inneholder full-lengde faktor VIII kodende region med startkodonet (ATG), den åpne leserammen og stoppkodonet (TGA); 3'-ikke-kodende region til mRNA med et kort intron og polyadenyleringssignal (polyA) avledet fra SV40 DNA (sammenlign med fig. 2).

b. 7440 pb (basepar) fragment Sall-Hpal inneholdende full-lengde faktor VIII kodende cDNA er beskrevet. Start og stoppkodonene til leserammen er avmerket. Restriksjons-endonukleasesetene innenfor full-lengde cDNA som er innbefattet i mutagenese for konstruksjon av pCLB202 og pCLB203 er vist.

c. Kart av faktor VIII proteinet. Signalpeptidet med en lengde på 19 aminosyrer og domenen eller den gjentatte strukturen til plasma faktor VIII er vist. Al, A2 og A3 er homologe aminosyresekvenser. B er en unik region, mens Cl og C2 igjen er homologe (Vehar et al., 1984). Aminosyreposi-sjonene som grenser opp til A og C gjentagelsene er angitt. Under kartet er spaltningssetene til de proteolytiske enzymene, som fremgangsmåte faktor VIII, dvs. aktivert protein C (APC), trombin (Ila), aktivert koagulasjonsfaktor X (Xa), og en trypsin-lignende protease (indikert med "?") antydet med piler. Faktor Xa antas å spalte Ila- og APC-spaltningssetene som også er vist (Eaton et al., Biochemistry

(1986) 25: 8343-8347; Fay et al., Biochem. Biophys. Acta

(1986) 871: 268-278). Deres spaltningsseter er angitt. B regionen inneholder multiple spaltningsseter.

d. Subenhetsstrukturen til aktivert faktor VIII.

Faktor VIII av subenhetene på 92 kDa og 80 kDa er angitt som 92k og 80k, respektivt. Deres aminoterminale og karboksyter-minale aminosyreposisjoner innenfor full-lengde sekvensen er angitt.

e. Strukturen til cDNA og proteinet til pCLB202 inneholdende en direkte fusjon mellom Pstl og BamHI setet indikert i b. Det resulterende proteineet er indikert å inneholde en peptidbinding mellom Ala-867 og Asp-1563. Totallengden til proteinet er 1637 aminosyrer. (Hovedtrekkene til de gjentatte grenseposisjonene og de spesifikke proteolytiske spaltningssetene er også avmerket; se ovenfor.)

f. Strukturen til cDNA og protein pCLB203 inneholdende en Mlul-linkersekvens som koder for fire ekstra aminosyrer som brobinder Maelll setet og EgiAT setet, som angitt under b. Totallengden på proteinet er 1411 aminosyrer. (Hovedtrekkene til de gjentatte grenseposisjonene og spesifikke proteolytiske spaltningssetene er angitt; se ovenfor.)

Fig. 4 viser resultatene av en molekylvekt (størrelse) bestemmelse av flere delesjonsmutant faktor VIII proteiner ved anvendelse av immunoprecipitering og elektroforese.

Autoradiografiet viser filene for proteinene som blir tilveiebragt med vektorene pCLB202 (fil 2) og pCLB203 (fil 1). Molekylvektmarkørene er også angitt.

Polypeptidene med faktor VIII aktivitet som blir fremstilt innebefatter delesjonsmutantproteiner av faktor VIII hvori vesentlig hele den sentrale regionen eller "B domenen" og likeledes en del av 92 kg-Dalton (kDa) regionen er blitt deletert. Plasmidkonstruksjoner innbefattende en DNA sekvens som koder for delesjonspolypeptider med faktor VIII aktivitet blir anvendt for å transformere en vertscelle. Vertscellen blir deretter dyrket for å uttrykke genet. Vertscellen kan enten være en eukaryot eller en prokaryot celle.

Human faktor VIII har sekvensen vist i fig. 1. Forkortelsene med enkel bokstav for aminosyrene er anvendt, og har følgende betydning: A = alanin; R = arginin; N = asparagin; D = asparaginsyre; C = cystein, Q = glutamin; E = glutaminsyre; G = glycin; H = histidin; I = isoleucin; L = leucin; K = lysin; M = metionin; F = fenylalanin; p = prolin; S = serin; T = treonin; W = tryptofan; Y = tyrosin og V = valin. Nummereringen av aminosyresekvensen begynner med A-I, den første aminosyren etter signalsekvensen på 19 aminosyrer. Den siste aminosyren til faktor VIII er Y-2332. Denne nummereringen blir anvendt i løpet av beskrivelsen. Faktor VUI-lignende materialer, innbefattende faktor VIII fragmenter, mutanter av polypeptidet og fusjonspeptider innbefattende funksjonelle deler av faktor VIII med biologisk aktivitet til intaktfaktor VIII, innbefattende blodkoaguler-ende aktivitet er også tilveiebragt.

Polypeptidene fremstilt ifølge denne oppfinnelsen innbefatter analoger av faktor VIII, dvs. forbindelser med minst en biologisk aktivitet ifølge faktor VIII og med minst en aminosyresekvens som er vesentlig den samme aminosyresekvensen som faktor VIII. Biologisk aktivitet innbefatter evnen når administrerte pasienter med Hemophilia A, å korrigere koagulasjonsdefekten og/eller immunologisk kryssreaktivitet med naturlig forekommende faktor VIII. Korrigeringen kan dermed bli tilveiebragt enten ved direkte innvirkning i koagulasjonskaskaden eller ved binding til antistoffer mot faktor VIII slik at den biologiske aktiviteten ved påfølgende administrert faktor VIII blir mindre påvirket. Med "immunologisk kryssreaktivitet" menes at et antistoff indusert av et nytt polypeptid fremstilt ifølge denne oppfinnelsen vil kryssreagere med intakt faktor VIII. Polypeptidet vil i det minste ha en biologisk aktiv sekvens, f.eks. immunologisk eller epitopisk, eller ha mer enn en biologisk aktiv sekvens, hvor en slik sekvens kan konkurrere med et naturlig forekommende produkt for den biologiske egenskapen.

Nye polypeptider som er av interesse vil for det meste ha en formel som innbefatter en N-terminal region, Ng, en bin-dingsregion, Lg og en C-terminal region, Cg. Ng er karakterisert ved at det har en aminosyresekvens som korresponderer vesentlig med en etterpåfølgende sekvens som finnes i aminosyresekvens A-I til og med R-740 i full-lengde faktor VIII ("A1A2 domenen" eller 92kDa polypeptidet), hvori ikke mer enn 45$, vanligvis ikke mer enn 2056, fortrinnsvis ikke mer enn 10$, og aller helst ikke mer enn 556 av aminosyrene i A1A2 domenen er blitt deletert. Foretrukne sekvenser korresponderer vesentlig med sekvensene A-I til og med D-712 eller A-I til og med R-740.

Lg kan være en kort bindingsgruppe på fra 1 til 20 aminosyrer, en binding eller en hvilken som helst sekvens av aminosyrer, vanligvis ikke vesentlig lik sekvensen til "B domenen" til full-lengde faktor VIII proteinet. Den kan også innbefatte sekvenser som korresponderer vesentlig med etterpåfølgende sekvenser i B domenen opp til hele S-741 til S-1637 sekvensen, eller en hvilken som helst del derav. Av spesiell interesse er sammensetninger hvori Lg består av minst en av sekvensene S-741 til og med A-867 og D-1563 til og med S-1637.

Cg er karakterisert ved at det har en aminosyresekvens som vesentlig er lik en etterpåfølgende sekvens funnet i sekvensen til faktor VIII som innbefatter aminosyrene Gln-1638 til og med Tyr-2332, hvori ikke mer enn 2556, vanligvis ikke mer enn 2056, fortrinnsvis ikke mer enn 1056 av aminosyrene Q-1638 til og med Y-2332 er blitt deletert. Sekvensen innbefatter fortrinnsvis sekvenser som korresponderer vesentlig med faktor VIII sekvensenea Q-1638 tilog med Y-2332, E-1649 til og med Y-2332, S-1169 til og med Y-2332 og S-1690 til og med Y-2332, fortrinnsvis Q-1638 til og med Y-2332.

Polypeptidene av interesse kan være fragmenter av faktor VIII hvori opptil 7556 av aminosyrene er blitt deletert fra full-lengde faktor VIII, eller fusjonsproteiner hvori 92 kDa proteinet eller et fragment derav er kondensert til 80 kDa polypeptidet eller et fragment derav. Polypeptidet har vanligvis ikke mer enn omtrent 7556 av aminosyrene deletert, vanligvis ikke mer enn omtrent 4556 av aminosyrene deletert, og vanligvis ikke mer enn omtrent 4 056 av aminosyrene deletert.

For å tilveiebringe immunogenisitet, kan faktor VIII analogene bli festet kovalent til en stor immunogen polypep-tidbestanddel. Eksempler på slike immunogene bestanddeler er bovinserumalbumin, keyhole limpet hemocyanin (KLH) og lignende. Disse konjugerte polypeptidene vil være nyttige for indusering av antistoffer i en hensiktsmessig vertsorganisme. Antistoffene kan bli anvendt til å bestemme tilstedeværelse eller fravær og/eller konsentrasjon av faktor III i en kroppsvæske, hvor fravær kan være et tegn på Hemophilia A.

Fremstilling av faktor VIII analoger

Faktor VIII analoger kan bli tilveiebragt på forskjellige måter. De kan bli tilveiebragt ved proteolytisk spaltning av full-lengde faktor VIII til tre regioner, fortrinnsvis ved spaltning før Arg-740 og Gln-1638 etterfulgt av forkorting av amino eller karboksylterminusen til Ala-1 til og med Pro-739 sekvensen, minst en aminosyre ad gangen og/eller forkorting av amino eller karboksylterminusen til sekvensen Gln-1638 til og med Tyr-2332, minst en aminosyre ad gangen. De til-veiebragte polypeptidfragmentene kan deretter bli kondensert direkte eller via en sentral bindingsgruppe, eller fragmentene kan bli kombinert i en komposisjon for å tilveiebringe faktor VIII aktivitet.

Faktor VIII analogene, innbefattende fusjonsproteiner hvori Ng og Cg er kondenserte, kan også bli preparert ved rekombinante DNA teknikker. Teknikker som blir anvendt til isolering av faktor VIII genet er kjent innenfor fagområdet, innbefattende syntese, isolering fra genomt DNA, preparering fra cDNA eller kombinasjoner derav. De forskjellige teknikkene for manipulasjon av genene er velkjente, og innbefatter restriksjoner, spalting, omorientering, ligering, in vitro mutagenese, primer reparering, og polylinkere og adaptere og lignende. Se Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York,1982.

Metoden innbefatter generell preparering av et genomisk bibliotek fra celler som syntetiserer faktor VIII. For å forsterke sannsynligheten av å indentifisere den riktige sekvensen, kan et cDNA bibliotek fra celler som ikke produserer faktor VIII bli anvendt til kryss-hybridisering. En analyse for uttrykking av faktor VIII ved anvendelse av restriksjonsfragmenter satt inn i en prokaryot ekspresjonsvektor så som pTZ 18 eller 19 og screening med antistoffer for faktor VIII for å påvise et kryss-reaktivt pep-tidfragment eller lignende ble anvendt.

Når et fullstendig gen er blitt identifisert, enten som cDNA eller kromosomalt DNA, kan de ønskede delesjonene i det strukturelle genet bli utført på forskjellige måter. Delesjoner kan bli tilveiebragt ved enzymatisk kutting av full-lengde faktor VIII cDNA etterfulgt av modifikasjon og ligering av de rensede fragmentene eller ved sete-rettet mutagenese, spesielt ved loop-out mutagense som beskrevet av Kramer et al., Nucl. Acids Res. (1984) 12: 9441-9456. Genet som blir tilveiebragt på denne måten kan deretter bli manipulert på forskjellige velkjente måter innenfor fagområdet for å tilveiebringe ekspresjon.

Både prokaryote og eukaryote verter kan bli anvendt, som kan innbefatte bakterier, gjær, pattedyrceller, f.eks. CHO celler, C127 celler, humane "293" celler, myeolom celler, eller spesialiserte celler så som leverceller og COS celler. Når et gen skal bli uttrykt i en vert som gjenkjenner vill-type transkripsjonene og transisjonene regulatoriske regioner til faktor VIII, kan hele genet med vill-type 5', og 3'-regulatoriske regioner bli ført inn i en hensiktsmessig ekspresjonsvektor. Forskjellige ekspresjonsvektorer som anvender replikasjonssystemer fra pattedyrviruser, så som simian virus 40, Epstein-Barr virus, bovint papalloma virus, vaccinia virus etc. eksisterer.

Når genet skal bli uttrykt i en vert som ikke gjenkjenner de naturlig forekommende vill-type transkripsjonene og translasjonene regulatoriske regionene, vil ytterligere manipulasjon være nødvendig. Dermed er forskjellige 3'-transkripsjonelle regulatoriske regioner kjent og kan bli satt inn nedstrøms fra stoppkodonene. Den ikke-kodende 5'-regionen oppstrøms i forhold til det strukturelle genet kan bli fjernet ved endonukleaserestriksjon, Bal31 fjerning, eller lignende. Alternativt, når et hensiktsmessig restriksjonssete er tilstede nær 5'-terminusen til det strukturelle genet, kan det strukturelle genet bli spaltet og en adapter kan bli anvendt for binding av det strukturelle genet til promoterregionen, hvor adapteren tilveiebringer de tapte nukleotidene til det strukturelle genet.

Forskjellige strategier kan bli anvendt for å tilveiebringe en fremmed ekspresjonskassett, som i 5'-3'-retningen av transkripsjonen har en transkripsjonen regulatorisk region og en translasjonen initieringsregion, som også innbefatter regulatoriske sekvenser som muliggjør induksjon av reguler-ingen; en åpen leseramme som koder for full-lengde faktor III eller en analog av faktor III, innbefattende delesjonsmutant-proteinene, og fortrinnsvis innbefatter en sekretorisk lederfrekvens gjenkjent av vertscellen; og translasjonene og transkripsjonene termineringsregioner. Ekspresjonskassetten kan i tillegg innbefatte minst et markørgen. Initieringsreg-ionene og termineringsregionene er funksjonelle . i vertscellen, og kan enten være homologe (avledet fra den opprinnelige verten) eller heterologe (avledet fra en fremmed kilde) eller syntetiske DNA frekvenser. Ekspresjonskassetten kan dermed i sin helhet eller delvis avledet fra de naturlige kildene, og enten i sin helhet eller delvis avledet fra kildene som er homologe med vertscellen, eller heterologe med vertscellen. De forskjellige DNA konstruksjonene (DNA sekvensene, vektorene, plasmidene, ekspresjonskassettene) ifølge oppfinnelsen blir isolert og/eller renset, eller syntetisert og er dermed ikke "naturlig forekommende".

For optimal genekspresjon, har nukleotidsekvenser rundt det translasjonene initieringskodonet ATG vist seg å være viktig i dyreceller. F.eks. Kozak, Microbiol. Reviews (1983) 47: 1-45, har studert effekten av disse regionene på uttrykking av polypeptidene så som insulin i COS celler. Det kan dermed være nødvendig å modifisere nukleotidsekvensene rundt initieringskodonet. Dette kan utføres ved sete-rettet mutagenese eller ved kondensering av det eksogene genet til initieringsregionen til et høyt uttrykt gen.

Illustrative transkripsjonene regulatoriske regioner eller promotere innbefatter, for bakterier, beta-gal promoteren, amylase promoteren, lamda venstre og høyre promotere, trp og lac promoterene, trp-lac fusjonspromoterene osv.; for gjær, glykolytiske enzympromotere, så som ADH-1-2 promoterene, PGK promoteren og laktasepromoteren og lignende; for pattedyrceller, SV40 tidlig og sen promotere, cytomegalovirus (CMV) promoter, beta-actin promoter, adenovirus hovedsen promotere og lignende.

I eukaryote celler kan regulatoriske sekvenser f.eks. innbefatte cytomegalovirus forsterkersekvensen som kan bli kondensert til en promotersekvens så som SV40 promoteren, som danner en chimerisk promoter, eller blir innført et annet sted i ekspresjonskassetten, fortrinnsvis i nær avstand fra promotersekvensen.

Ekspresjon av det strukturelle genet kan også bli amplifisert ved, f.eks. ligere et gen for en dominant amplifiserbar genetisk markør 5' eller 3' for det strukturelle genet i tandem og dyrking av vertscellene under selektiv betingelse. Et eksempel på et amplifiserbart gen er genet for dihydrofo-lat reduktase (dhfr), hvor ekspresjonen av dette kan bli øket i celler som er blitt gjort resistente ovenfor metotreksat (mtx), en folatantagonist. Av interesses for ekspresjon i pattedyrceller så som COS celler er ekspresjonskassetter som kan uttrykke faktor VIII eller analoger derav, som anvender et metallotionein promoter, eller SV40 tidlig transkrip-sjonsenhet transkripsjonspromoteren (SVep), spesielt Rous Sarcoma virus-lang terminal gjentagelse (RSV-LTR) promoteren i tandem med SVep promoteren. Eksempler på promotere og promoter/forsterker kombinasjoner som kan bli anvendt i C127 celler i kombinasjon med ekspresjonsvektorene ifølge eksempel 7 er blitt beskrevet i f.eks. Hurwitz et al., Nucl. Acids Res. (1987) 15: 7137-7153. For optimal ekspresjon kan det være fordelaktig å innføre et intron inn i ekspresjonskassetten. Et intron i 5'-delen av mRNA er foretrukket.

I tillegg kan et kondensert gen bli preparert ved å tilveiebringe en 5'-sekvens til det strukturelle genet som koder for en utskillbar leder og et prosesseringssignal. For utskilling av faktor VIII polypeptider anvendes den naturlig forekommende faktor VIII leder sekvensen fortrinnsvis, men andre signalsekvenser innbefattende sekretoriske ledere til penicillinase, alfa-faktor, immunoglobulin, T-celle recep-torer, ytre membranproteiner, serum albumin, vevsplasminogen aktivator, insulin, enzymer fra fordøyelseskanalen og lignende kan også bli anvendt. Ved fusjon av en sekretorisk leder i riktig leseramme til et strukturelt gen for faktor VIII eller en analog derav, kan moden faktor VIII bli skilt ut i kulturmediet.

Termineringsregionen kan bli avledet fra 3'-regionen av genet som initieringsregionen ble tilveiebragt fra eller fra et annet gen. Et stort antall termineringsregioner er kjente og har vist seg å være tilfredsstillende i en mengde verter fra den samme eller fra forskjellige slekt og familie. Termineringsregionen kan innbefatte sekvenser for riktig prosessering av mRNA i en pattedyrcelle: dvs. et lite intron og et polyadenyleringssignal.

I løpet av konstruksjonen av ekspresjonskassetten vil de forskjellige DNA fragmentene vanligvis bli klonet inn i en hensiktsmessig kloningsvektor, som muliggjør ekspansjon av DNA, modifikasjon av DNA eller manipulering ved festing eller fjerning av sekvensene, linkerene eller lignende. Normalt kan vektorene bli replikert i minst et relativt høyt kopiantall i E. coli. Et antall vektorer er lett til-gjengelige for kloning, innbefattende slike vektorer som pBR322, mML2, pUC7-pUC19, pSP64, pSP65, pSP18, pSP19, pTZ18 og pTZ18R,pTZ19 og pTZ19R og lignende.

Kloningsvektorene er karakterisert ved at de har et effektivt replikasjonsorigo som i hvertfall er funksjonelt i E. coli. Kloningsvektoren har også minst et unikt restriksjonssete, vanligvis flere unike restriksjonsseter og kan også innbefatte multiple restriksjonsseter, spesielt to av de samme restriksjonssetene for substitusjon. I tillegg vil kloningsvektoren ha en eller flere markører som muliggjør seleksjon for transformering. Markørene vil vanligvis tilveiebringe resistens ovenfor cytotoksiske midler så som antibiotika, tungmetaller, toksiner eller lignende, komple-mentering av en auksotrof vert, eller immunitet ovenfor et fag. Ved hensiktsmessig restriksjon av vektoren og kasset-ten, og, modifikasjon av endene, ved tygging bakover eller ifylling i overhengene, for å tilveiebringe butteender, ved addisjonslinkere, ved tailing, kan kompi imentære ender bli tilveiebragt for ligering, og sammensetting av vektoren til ekspresjonskassetten eller en komponent derav.

I noen tilfeller vil en skyttelvektor bli anvendt når vektoren kan bli replikert i forskjellige verter som krever forskjellige replikasjonssystemer. Et simian virus 40 (SV40) replikajsonsorigo blir fortrinnsvis anvendt og som tillater at plasmidet blir amplifisert i COS-1, mens bovint Papilloma virus (BVP-1) genomet blir anvendt for episomal opprettholdelse av ekspresjonsvektorene i C127 celler (se f.eks. Howly et al., Meth. Enzymol. 101: 387-402, 1983).

Ekspresjonskassetten kan bli Innbefattet innenfor et replikasjonssystem for episomal opprettholdelse i en hensiktsmessig cellulær vert eller bli tilveiebragt uten et replikasjonssystem, hvor den bli kan bli integrert inn i vertsgenomet. Måten transformasjonen av vertsorganismen med de forskjellige DNA konstruksjonene utføres på, er ikke kritisk i denne oppfinnelsen. DNA kan bli ført inn i verten i henhold til kjente teknikker, så som tranformering, ved anvendelse av kalsiumfosfat presipitert DNA, elektroporasjon, transfeksjon ved kontakting av celler med et virus, mikro-injeksjon av DNA inn i cellene eller lignende.

Som vertsorganisme kan normale primære celler eller cellelinjer avledet fra dyrket primærvev bli anvendt, og likeledes mikrobielle celler. Vertscellen er fortrinnsvis en pattedyrcellelinje, fortrinnsvis hamster CHO celler, mus C127 celler eller human "293" celler, men mikrobielle celler, f.eks. gjær, fortrinnsvis en Kluyveromyces art, eller bakterier, fortrinnsvis en Bacillus art, kan også bli anvendt.

For stabil transformering av en pattedyrcellelinje med ekspresjonsvektoren inneholdende faktor Vlll-analog kodende sekvens og påfølgende amplifikasjon av vektoren satt inn i vertskromosomene. Kinesisk hamsterovarieceller CHO er spesielt egnede for stabil transformering av en pattedyrcellelinje med ekspresjonsvektoren inneholdende faktor VIII-analogkodende sekvens og påfølgende amplifikasjon av vektoren satt inn i vertskromosomene. Transformering innbefatter transfusjon av vertscellen med ekspresjonsvektoren sammen med et selekterbart markørgen så som dhfr eller et G418 (neo-) resistensgen eller lignede, og påfølgende integrering inn i kromosomet og seleksjon for stabil transformering.

En annen metode for stabil transformering for vertscelle-linjer anvender ekspresjonsvektorer inneholdende BPV-1 sekvenser. C127 celler er veldig egnet for dette. Transformering innbefatter transfeksjon av vertscellen med ekspresjonsvektoren inneholdende BVP-1 sekvenser. Transformanter gjenkjennes ved dannelse av foci. Stabile transformanter blir oppnådd og screenet for faktor VIII aktivitet ved anvendelse av Kabi Coatest ifølge eksempel 6 og 7. I kontrast til dette, når ekspresjonen blir utført i et transient transformeringssystem så som COS-1 celler med pSV2-avledede ekspresjonsvektorer, er det ikke noe seleksjons-trinn. Når det strukturelle genet er blitt introdusert inn i den hensiktsmessige verten, kan verten bli dyrket for å uttrykke det strukturelle genet. Vertscellen kan bli dyrket til høy tetthet i et hensiktsmessig medium. Når promoteren er induserbar, så som i et prokaryotsystem, vil godtagbare betingelser bli anvendt, f.eks. temperaturforandring, oppbruking eller overskudd av et metabolsk produkt eller næringsmiddel eller lignende. I et pattedyrsystem hvor det amplifiserbare genet blir anvendt i tandem med det strukturelle genet, vil den hensiktsmessige måten for amplifisering bli anvendt.

Når utskilling blir tilveiebragt, kan ekspresjosproduktet, enten kondensert eller ukondensert, bli isolert fra vekst-mediet ved bruk av konvensjonelle metoder. Når utskilling ikke blir tilveiebragt, blir vertscellene høstet og lysert i henhold til konvensjonelle metoder. Det ønskede produktet blir deretter isolert og renset ved konvensjonelle teknikker, f.eks. affinitetskromatografi med immobiliserte antistoffer, kromatografi på aminoheksyl-sefarose eller den blandede polyelektrolytt metoden.

De rekombinante produktene kan bli glykosylert eller ikke-glykosylert, med vill-type eller annen glykosylering. Mengde glykosylering vil delvis avhenge av sekvensen til det bestemte peptidet og organismen hvori det blir produsert. Ekspresjon av produktet i E. coli celler vil resultere i et uglykosylert produkt, og ekspresjon av produktet i pattedyrceller vil resultere i et produkt med glykosylering som er lik glykosyleringen i vill-type peptidet.

Anvendelse av faktor VIII analoger

Selve forbindelsene kan bli anvendt på mange måter, både in vivo og vitro. Forbindelsene kan bli anvendt som den aktive komponenten i farmasøytiske prepareringer for behandling av pasienter som utviser symptomer på Hemophilia A. Med en farmasøytisk sammensetning menes en hvilken som helst preparering som blir administrert til pattedyr. Et farma-søytisk preparat med faktor VIII aktivitet er dermed et preparat som kan bli administrert til et pattedyr for å lindre symptomer assossiert med Hemophilia A, dvs. mangel på å koagulere blodet skikkelig. Ved preparering av den farmasøytiske sammensetningen blir selve polypeptidene generelt blandet med parenteralt akseptable bærere og andre egnede tilsetningsstoffer i henhold til fremgangsmåter som er kjent innenfor fagområdet. De farmasøytiske preparatene kan fortrinnsvis være et sterilt frysetørket preparat av polypeptidet, som kan bli rekonstituert ved tilsetning av en steril oppløsning som er egnet for produsering av oppløs-ninger, fortrinnsvis isotonisk med blodet til mottageren. Det farmasøytiske preparatet kan være i en enkel enhet eller multi-dose beholdere, f.eks. i forseglede ampuller eller beholdere. Anvendelsen av disse vil være lik det kjente humane faktor VIII polypeptidet, nøyaktig justert i styrke. Selve polypeptidet kan bli administrert in vivo, f.eks. ved injeksjon, intravenøst, peritonealt, subkutant eller lignende.

Forbindelsene kan i tillegg bli anvendt for å produsere antistoffer til disse forbindelsene, som kan bli anvendt in vivo eller in vitro. Antistoffene kan bli produsert ved hjelp av konvensjonelle metoder, enten ved anvendelse av selve polypeptidet som et immunogen og injisering av polypeptidet inn i en pattedyrvert, f. eks. mus, ku, geit, sau, kanin osv., spesielt med et adjuvant, f.eks. fullstendig Freunds adjuvant, aluminiumhydroksydgel eller lignende. Det meste kan tappes og blodet kan bli anvendt for isolering av polyklonale antistoffer, eller når det gjelder mus, kan perifere blodlymfocytter eller miltlymfocytter (B celler) bli anvendt for fusjon med en hensiktsmessig meylomcelle for å udødeliggjøre kromosomene for monoklonal uttrykking av antistoffer som er spesifikke for disse forbindelsene.

Enten polyklonale eller monoklonale antistoffer kan bli produsert, og disse kan bli anvendt for diagnose eller deteksjon av tilstedeværelse av selve polypeptidet i en prøve, så som celler eller en fysiologisk væske, f.eks. blod. Mangel på deteksjon av selve polypeptidet kan tyde på Hemophilia A tilstanden.

Prober innbefattende sekvenser som er komplementære til faktor VIII mRNA kan også bli preparert og anvendt som et diagnostisk hjelpemiddel, f.eks. kan tilstedeværelse og/eller mengden av faktor VIII mRNA i en celle bli anvendt for å bestemme om pasienten lager faktor VIII men har utviklet antistoffer som forhindrer dens aktivitet. En testprøve som omfatter en celle, vevsprøve eller kroppsvæske som antas å inneholde hybridiserende sekvenser kan bli behandlet på en slik måte at eventuelle celler blir lysert, og deretter blir behandlet med et denaturerende middel så som guanidinhydro-klorid for å frigjøre enkelt-trådet mRNA. Proben merket med f.eks. 32p eller biotinylert nukleotider, kan deretter bli hybridisert til cellulært mRNA for å danne et dobbelt-trådet kompleks som kan bli påvist ved hjelp av markøren. I noen tilfeller kan det være ønskelig å kvantitere mengden av faktor mRNA. Dette kan bli utført ved sammenligning av mengden av markør påvist i referanseprøver inneholdende kjente mengder av enkelt-trådet faktor VIII mRNA med mengden av markør påvist i testprøven.

Følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen.

Generelle kloningsteknikker ble anvendt som beskrevet i Maniatis et al., Molecular Cloning: Å Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, CSH, NY, 1982. Alle DNA-modifiserende enzymer ble tilveiebragt fra kommersielle forhandlere. Disse ble anvendt ifølge fremstillerens instruksjoner. Materialer og apparatur for DNA rensing og separering ble anvendt ifølge instruksjonene til forhand-leren .

Eksempel 1

Konstruksjon av ekspresjonsvektor pCLB201

pCLB201 er en ekspresjonsvektor som omfatter RSV-LTR promoteren i riktig orientering for transkripsjonen initiering, og full-lengde faktor VIII cDNA (se fig. 2). Dette er avledet fra pSV2-vektoren til Mulligan og Berg, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1981) 78: 2072.

Det unike Hindlll-setet til plasmidet sSV2.tPA (Van Zonneveld et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1986) 83: 4670-4674) ble modifisert til et Sall-sete ved å danne butte Hindlll klebrige ender og ligering av Sall-linkere (5'-CGTCGACTG-3' ) til de butte endene. Et plasmid inneholdende et Sall-sete ble valgt og identifisert som pCLB91. Dette plasmidet er lik pSV2.tPA med unntagelse av at det inneholder en Sall-linker satt inn i Hindlll-setet.

Isolering av faktor VIII mRNA fra human lever og preparering, rensing og identifisering av cDNA og innføring i plasmid pEP211 som resulterte i plasmid pCLB89 er blitt beskrevet i patentsøknad EP 0253455, og beskrivelsen er inkorporert heri ved referanse. Et 7440 bp langt Sall-Hpal fragment fra pCLB89 inneholdende faktor VIII cDNA (se fig. 1) ble renset og satt inn i pCLB91 spaltet med Sali og BG1II. Den resulterende ekspresjonsvektoren pCLB200 inneholdt et intakt et Sall-sete med Hpall-sete ligert til Bglll-sete som var blitt fylt ut.

Plasmid pRSVneo (Gorman, DNA Cloning, 1985, utg., D. Glover, IRL-press, Washington, Oxford, s. 143-169) ble spaltet med Ndel og HindiII og inkubert med Klenow-fragmentet til DNA polymerase for å danne butte ender og 0,6 kb fragmentet inneholdende en Rous Sarcoma virus-lang terminal gjentagelse (RSV-LTR) sekvens ble isolert og satt inn i Sall-setet til pCLB200 som på lignende måte var blitt påført butte ender for å danne ekspresjonsvektor pCLB201 (fe fig. 2).

Eksempel 2

Konstruksjon av pCLB202

En delesjonsmutant av faktor VIII med en delesjon fra Pstl-setet ved nukleotid-sekvensposisjon 2660 (se fig. 3b) til BamHI-setet i posisjon 4749 (se fig. 3b) ble konstruert i plasmid pGB860 som beskrevet i patentsøknad EP 0253455. Faktor VIII DNA i pGB860 har en delesjon av DNA som koder for 695 aminosyrer i den sentrale regionen.

Ekspresjonsvektor pCLB202 ble avledet fra pGB860 og pCLB201. Begge plasmidene ble spaltet med Kpnl og Xbal restriksjons-enzymer. 3.1 kb Kpnl-Xbal fragmentet i pCG860 ble ligert til 7 kb Kpnl-Xbal fragmentet fra pCLB201. Det resulterende plasmidet pCLB202 har intakte Kpnl og Xbal-seter. Strukturen til dette plasmidet er angitt i fig. 3e.

Eksempel 3

Konstruksjon av pCLB203

(A) pCLBlOO:

Sall-Hpal 7440 bp fragmentet (se fig. 2) fra pCLB89 ble satt inn i plasmid pSP64 (Melton et al., Nucleic Acids Res. (1984) 12: 7035-7056) som var blitt spaltet med Sali og Smal. Det resulterende plasmidet, pCLBlOO, inneholdt et intakt Sall-sete og Hpal-enden bundet til Smal-enden.

(B) pCLBlOl: (tallene i parentesene refererer til fig. 1)

(1) Plasmid pCLBlOO ble spaltet med Kpnl og Tthllll, som

danner et 631 bp fragment: Kpnl (1817) til Tthllll (2447). 631 bp fragmentet ble renset, deretter spaltet med Maelll

(2199). Den klebrige Maelll enden ble fylt som resulterte i et 383bp fragment. (2) Plasmid pCLBlOO ble spaltet med Apal og BanI. 669 bp Apal (6200)-BanI (5532) fragmentet ble isolert. (3) Plasmid pCLBlOO ble spaltet med HgiAI, som førte til et HgiAI-fragment på 634 bp. Fragmentet ble inkubert med T4 DNA polymerase for å danne butte ender, deretter spaltes med BanI for å dannet et 565 bp fragment. (4) Plasmid pCLBlOO ble spaltet med Apal og Kpnl, som dannet et 5,9 kb langt fragment (Apal (6200) til Kpnl (1817)) inneholdende vektorsekvenser for opprettholdelse og amplifikasjon i E. coli. (5) Fragmentene tilveiebragt i trinnene (1) til og med (4) ble renset og ekvimolare mengder av fragmentene og et ti-ganger molart overskudd av Mlul-linker (CCACGCGTGG) ble ligert, og ga plasmid pCLBlOl. Plasmid pCLBlOl inneholdt en Mlul-linker mellom Maelll og HgiAI setene3 (se fig. 3b) i tillegg til Kpnl, BanI og Apal setene. Fire ekstra aminosyrer (P-R-V-A) mellom aminosyrene D-712 og Q-1638 (fig.

1) er vist i fig. 3f.

(C) pCLB203:

pCLBlOl og pCLB201 ble spaltet med enzymene Kpnl og Xbal.

2.4 Kpnl-Xbal fragmentet fra pCLBlOl ble ligert til 7.0 k.b Kpnl-Xbal fragmentet avledet fra pCLB200. Det resulterende plasmidet pCLB203 inneholdt intakte Kpnl og Xbal seter. Strukturen er angitt i fig. 3f.

Eksempel 4

Konstruksjon av pCLB212

pCLB212 ble konstruert ved anvendelse av loop-out mutageneseteknikken som beskrevet i Kramer et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456. Delesjonsmutagenesen av den sentrale regionen til faktor VIII cDNA ble utført ved anvendelse av følgende oligonukleotider:

Primer IV

3' TTC.CAA.AGA.TCA.ACA.CTG.GTT.TTG.GGT.GGT.CAG.AAC 5'

for å danne indre delesjoner av sekvensene som kode for aminosyrene Lys 713 til og med Ser-1637 i faktor VIII cDNA e. t.

Det korresponderende proteinet inneholder en indre delesjon på 925 aminosyreresidier sammenlignet med full-lengde faktor VIII proteinet.

For å tilveiebringe et målfragment for loop-out mutagenese ble et Hindlll-Pstl fragment på 1.4 kb avledet fra pCLB203 (eksempel 3) valgt. Nukleotidposisjonen (fig. 1) til Hindlll-setet er ved 1025 i full-lengde faktor VIII sekvensen oppstrøms for regionen som skal bli modifisert, Pstl setet er i posisjon 5165 nedstrøms for regionen. Disse setene er angitt i fig. 2. 1.4 kb fragmentet ble subklonet i M13mp9 etterfulgt av loop-out mutagenesen.

Etter seleksjon av det fragmentet med den riktige delesjonen, ble Kpnl-Pstl delen av Hindlll-Pstl fragmentet inneholdende den ønskede delesjonen satt inn i en hensiktsmessig ekspresjonsvektor ved å danne fragmenter med klebrige, unike restriksjonsenzymender (tallene refererer til fig. 1) ifølge følgende trinn: Trinn 1. For ekspresjon av de mutante faktor VIII molekylene ble et nytt pCLB211 plasmid konstruert. Sall-Hpal fragmentet på 7440 bp (fig. 1) avledet fra pCLB89 ble satt inn i ekspresjonsvektor pSVL (Pharmacia, nr. 27-4509-01, Uppsala, Sverige) som muliggjør transkripsjon fra en sen SV40 promoter i pattedyrceller. Plasmid pSVL ble spaltet med Xhol og Smal. Det resulterende plasmidet pCLB211 inneholder en Xhol ende bundet til Sali enden, siden begge 5' overhengende ender til disse enzymene er identiske og Smal enden bundet til Hpal enden.

Trinn 2. Plasmid pCLB211 ble spaltet med Apal og Sali. 1.4 kb Apal (6200)-SalI (unikt i pSVL-delen av pCLB211) fragmentet ble isolert.

Trinn 3. Plasmid pCLBlOO ble spaltet med Ndel, Pstl og Apal. To fragmenter ble isolert: et Pstl(5165)-NdeI(5527 ) fragment av 363 bp og et annet fragment, Ndel (5527)-Apal(6200) av 674 bp.

Trinn 4. Plasmid pCLBlOO ble spaltet med Kpnl og Sacl. Et Kpnl (1817)-SacI(19) på 1799 bp ble isolert.

Trinn 5. Plasmid pCLB211 ble spaltet med Sali og Sacl. Et 4.5 kb Sali (unikt i pSVL vektoren)-ScaI(19) fragment ble tilveiebragt.

Trinn 6. En M13-bakteriofag inneholdende et Hindlll-(1025 )-PstI(5165) fragment med den ønskede delesjonen verifisert ved sekvensanalyse, ble spaltet med Kpnl og Pstl. Et 584 bp Pstl(5165)-KpnI(1819) fragment ble isolert.

Trinn 7. De seks isolerte fragmentene fra trinn 2 til og med 6 ble blandet sammen i ekvimolare mengder og ligert. Et plasmid inneholdende alle seks fragmenter ble selektert. Plasmidet pCLB212 uttrykte eksempelforbindelsen 3b (tabell II). Forbindelsen 3b er forskjellig fra forbindelse 3 (illustrert i fig. 3f), idet den mangler Mlul linkeren og korresponderende fire aminosyrer.

Eksempel 5

Konstruksjon av pCLB208, pCLB209 og pCLB210

pCLB208, pCLB209 og pCLB210 ble konstruert ved anvendelse avd loop-out mutageneseteknikken som beskrevet i Kramer et al., Nucleic Acids Res. (1984) 12: 9441-9456.

(a) Loop-out mutagenese

Delesjonsmutagenese av den sentrale regionen til faktor VIII cDNA ble utført ved anvendelse av følgende oligonukleotider:

Primer I:

3' TTA.CGG.TAA.CTT.GGT.TCT.CTT.TAT.TGA.CGA.TGA.TGA 5'

Primer II:

3' TTA.CGG.TAA.CTT.GGT.TCT.AGT.CAA.CTT.TAC.TTC.TTC 5'

Primer III:

3' TTA.CGG.TAA.CTT.GGT.TCT.TCG.AAA.GTT.TTC.TTT.TGT 5'

for å danne indre delesjoner i faktor VIII cDNA av de sekvensene som koder for aminosyrene S-741 til og med R-1648 (Primer I), S-741 til og med 1-1668 (Primer II) og S-741 til og med R-1689 (Primer III). De korresponderende proteinene inneholder indre delesjoner på 908 (I), 928 (II) og 949 (III) aminosyreresidier, respektivt.

B. Preparering av målfragmenter

For å tilveiebringe et målfragment for loop-out mutagenese ble et fragment på 0.8 kb avledet fra pCLBlOl konstruert som følgende.

Plasmid pCLBlOl ble spaltet med EcoRI, EcoRI setene ble fylt og en ytterligere spaltning med Kpnl ble deretter utført. Et 479 bp Kpnl(1819)-EcoRI(2297) fragment (numrene på nukleotid-posisjonene er som beskrevet i fig. 1) ble isolert. Plasmid pCLBlOl ble spaltet med BamHI; de klebrige endene ble fylt og en ytterligere spaltning med Pstl ble utført. Et 416 bp BamHI(4749)-PstI(5165) fragment ble isolert. Disse fragmentene ble ligert i ekvimolare mengder og subklonet i M13mpl9 amber. M13 bakteriofagen inneholdende et Kpnl-Pstl fragment kpå 895 bp fra 1819 oppstrøms fra regionen som skal bli modifisert til 5165 nedstrøms fra den regionen og med en stor delesjon i faktor VIII kodende sekvensen ble selektert for loop-out mutagenesen. Etter selektering av fragmentet med den nøyaktige delesjonen tilveiebragt med Primer I, II eller III i bakteriofag M13, ble Kpnl-Pstl fragmentet inneholdende den ønskede delesjonen satt inn i en hensiktsmessig ekspresjonsvektor avledet fra pCLB211 (se eksempel 4) ved anvendelse av følgende trinn og preparering av fragmenter med klebrige, unike restriksjonsenzymender (tallene refererer til fig. 1): (1) Plasmid pCLB211 ble spaltet med Aoal og Sali. 1.4 kb Apal(6200)-SalI (unikt i pSVL-delen av pCLB211) fragmentet ble isolert. (2) Fra plasmid pCLBlOO spaltet med Ndel, Pstl og Apal ble et 363 bp Pstl (5165 )-NdeI (5527) fragment og et 674 bp Ndel(5527)-Apal(6200) fragment isolert. (3) Plasmid pCLBlOO ble spaltet med Kpnl og Sacl og et 1799 bp Kpnl(1817 )-ScaI(19) fragment ble isolert. (4) Plasmid pCLB211 ble spaltet med Sali og Sacl. 4.5 kb Sali(unikt i pSVL-vektor)-SacI(19) fragmentet ble isolert. (5) M13-bakteriofagen inneholdende det fragmente med den ønskede mutasjonen ble spaltet med Kpnl og Pstl. Kpnl-Pstl fragmentene inneholdende den ønskede mutasjonen ble isolert for alle tre mutagenesene. (6) De seks fragmentene fra (1) til og med (5) ovenfor ble isolert, blandet med ekvimolare mengder og ligert. Plasmidene inneholdende alle de ønskede fragmentene ble selektert ved hybridisering og restriksjonsenzymspaltning. Ved anvendelse av Primerene I, II eller III vist ovenfor, ble tre nye ekspresjonsvektorer konstruert for uttrykking av eksempelforbindelsen beskrevet i tabell I: 1. pCLB208 for forbindelse 7 med Primer I;

2. pCLB209 for forbindelse 8 med Primer II; og

3. pCLB210 for forbindelse 9 med Primer III.

Eksempel 6

Transient uttrykking av rekombinant faktor VIII DNA og analyse av produserte proteiner

A. Transfeksjon av COS-1 celler og metabolisk merking.

Ekspresjonsvektorene tilveiebragt ifølge eksemplene ovenfor ble ført inn i COS-1 celler ved anvendelse av DEAE trans-feksjonsteknikken. Vektor DNA ble precipitert ved inkuber-ing med DEAE-dekstran i 2 timer, etterfulgt av behandling med kloroquinsjokk i 2 timer, som beskrevet av Lopata et al., Nucleic Acids Res. 12, 5707 (1984) og Luthman og Magnusson, Nucleic Acids Res. (1983) 11:1295. Mediet anvendt for vekst av COS-1 cellene og også for det kondisjonerte mediet vare Iscove's DMEM (Flow) supplementert med 10% (v/v) varmeinak-tivert fetalt kalveserum (Flow). Mediet ble forandret 48 timer etter transfeksjon. Det kondisjonerte mediet ble samlet 48 timer senere.

Metabolisk merking proteinene i de transfekterte cellene ble utført ved anvendelse av serumfritt RPMI-medium (Gibco). To dager etter transfeksjonen ble transfektanter inkubert i 4 timer med 50 uCi/ml L-35S-metionin (Amersham, 1985; 370 mBeq/330 ul; spesifikk aktivitet: over 100 Ci/mMol), etterfulgt av inkubasjon natten over med 1 mM L-metionin før høsting av det kondisjonerte mediet. For å undertrykke proteindegradering ble proteasehemmere så som fenylmetansul-fonylfluorid (PMSF) tilsatt til det kondisjonerte mediet etter høsting. For å hemme proteinglykosylering ble tunicamycin satt til det kondisjonerte mediet (finalkon-sentrasjon 0,001 mg/ml). Det kondisjonerte mediete ble høstet 4 dager etter transfeksjon; og produserte proteiner ble analysert.

B. Biologisk aktivitet til rekombinant faktor VIII

Det kondisjonerte mediet ble analysert for faktor VIII aktivitet ved anvendelse av (1) standardkoagulasjons- eller klumpingsanalyse og (2) kromogen aktivitetsanalyse (Kabi Coatest).

Standardkoagulasjonsanalysen eller klumpingsanalysen (såkalt aktivert delvis tromboplastintid) ble utført ved anvendelse av hemofiliplasme som beskrevet av Veldkamp et al., Thromb. Diath. Haemorrh. (1968) 19:279. Det kondisjonerte mediet ble sitrert før undersøkelse.

Den kromogene aktiviteten eller Kabl Coatestanalysen ble utført ifølge fremgangsmåtene fra forhandlerene Kabi-Vitrum, med unntagelse av at alle de foreskrevne volumene ble delt med fire og 25 ul kondisjonert medium ble testet. Faktor Vlll-lignende proteiner ble aktivert i 15 min., hvorpå det kromogene substratet (S2222) ble tilsatt.

Inhibering av faktor VIII aktivitet ble målt ifølge standard Bethesda protokoll (Kasper et al., Thromb. Diath. Haemorrh.

(1975) 34: 869-871. De anvendte immunoglobulinene ble renset ved ionebytting og protein A sefarose kromatografi før bruk.

Standarden for de biologiske aktivitetsanalysene for faktor VIII var en blanding av citratbehandlet plasma (0,5 mM finalkons.) som ble antatt å inneholde 1 U faktor VIII aktivitet eller antigen pr. ml.

Den biologiske aktiviteten til de forskjellige delesjons-proteinene er vist i tabell II. Mutante proteiner med delesjoner utviste faktor VIII koaguleringsaktivitet.

Den etablerte aktiviteten til den rekombinante protein-oppløsningen ble hemmet etter tilsetning av antistoffer som er kjent for å være hemmere av plasma-avledet faktor VIII aktivitet og/eller såkalt hemmer-sera, tilveiebragt fra pasienter med hemmere, dvs. antistoffer mot faktor VIII, i deres blod.

C. Immunologisk kryss-reaktivitet med faktor VIII

(1) Produksjon av monoklonale antistoffer

Balb/c mus ble immunisert med renset human faktor VIII-von Willebrand faktorkompleks tilveiebragt ved agarosegelfiltrer-ing av cryoprecipitat eller et faktor VIII konsentrat anvendt for terapeutiske hensikter (Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterda,. The Netherlands), van Mourik og Mochtar, Biochim. Biophys. Acta 221: 677-679 (1970). Lymfocytthybridisering ble utført som beskrevet av Galfre eteal., Nature (1977) 266: 550-552. Beskrivelse av de anvendte teknikkene for seleksjon av kloner som produserer monoklonale antistoffer mot faktor VIII er tilveiebragt andre steder (Stel, 1984, Ph. D. Thesis, University of Amsterdam, The Netherlands). Monoklonale antistoffer til faktor VIII ble identifisert ifølge deres reaktivitet med faktor VIII polypeptider som beskrevet i Europa patentsøknad EP 0253455. (2) Polyklonale antistoffer til faktor VIII polypeptider.

Kaniner ble immunisert ved bruk av standard fremgangsmåter med et faktor VIII preparat som var blitt renset ved kromatografi (Stel, ovenfor). Antistoffene som ble tilveiebragt på denne måten ble identifisert ved immunoblotting, som beskrevet i Europa patentsøknad EP 0253455, ved anvendelse av renset faktor VIII-von Willebrand faktor eller rensede polypeptider. Antistoffene ble isolert ved poly-acrylamidgelelektroforese og deretter overført til nitro-celluloseark som målproteiner. Tre distinkte polyklonale antisera ble tilveiebragt: RH 63271, RH 63272 og RH63275. Antisera reagerte med 80 kDA dubletten, 92 kDA polypeptidet og større polypeptider. Disse antiseraene reagerte også med mindre fragmenter av faktor VIII.

(£) ELISA

En nyutviklet ELISA (enzymbundet immunosorbentanalyse) ble anvendt til å detektere faktor VIII antigen in kondisjonert medium. Metoden er som følger. ELISA-plater ble belagt ved tilsetting av 200 ul/brønn av en hensiktsmessig fortynning av faktor VIII spesifikt monoklonalt antistoff CLB.CAgA (5 mg/l) i 0,05 M karbonatbuffer, pH 9,8. Platene ble forseglet og inkubert over natten ved 4°C. Mellom alle inkubasjonene ble platene vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,0556 Tween-20, som ble holdt på platene i minst et minutt.

En serie fortynninger av testprøver eller normalt plasma til pipettert inn i brønnene (200 ul/brønn) i duplikat. Platene ble forseglet og inkubert ved 37°C i 2 timer uten omrøring, og deretter vasket som beskrevet ovenfor. For fortynning av antigenet ble en buffer anvendt som inneholdt 50 mM Tris-HCl buffer, 256 bovint serumalbulim og 1,0 M natriumklorid, pH 7,4.

CLB-CAgll7-pepperot peroksydasekonjugater ble fortynnet omtrent 10.000 ganger (avhengig av den nødvendige følsom-heten) i en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl buffer, 0,256 Tween-20 og 1,0 M natriumklorid, pH 7,4. 200 ul av denne fortynningen ble satt til hver brønn og platene ble forseglet og inkubert i 2 timer ved 37"C i mørke.

Etter vasking av platene som beskrevet ovenfor ble 150 ul av en nypreparert oppløsning av tetrametylbenzidin (TMB) (0,1 g/l) og hydrogenperoksyd (0 ,00656) i 0,1 M acetat/sitron-syrebuffer, pH 5,5 satt til hver brønn. Platene ble inkubert i 30 minutter i mørket ved romtemperatur. Enzymreaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 150 ul 2N svovelsyre. Adsorpsjonen ble bestemt ved 450 nm med en ELISA mikro-avleser. Som vist i tabell II var det en økning i faktor VIII aktivitet i suksessivt kondisjonert medium som var omtrent proporsjonalt med økningen i mengde av faktor VIII proteiner i mediet.

D. Størrelsebestemmelse

Størrelsen til de produserte faktor VIII proteinene ble bestemt ved anvendelse av gelelektroforese som angitt nedenfor.

Monoklonalt og polyklonalt sera oppnådd mot plasma-avledet faktor VIII ble anvendt for immunoprecipitering. Antistoffene ble immobilisert på protein A-sefarose (15 ul serum pr. 10 mg protein A-sefarose), og deretter inkubert med metabolsk merket rekombinat faktor Vlll-lignende forbindelser. De immobiliserte rekombinante proteinene ble redusert ved anvendelse av 10$ beta-merkaptoetanol, og deretter separert på et 556 polyacrylamid SDS gel elektroforesesystem (Laemmli, Nature (1972) 227: 680-685). Som vist i fig. 4 og tabell III har de rekombinante faktor Vlll-lignende proteinene den ventede størrelsen for glykosylerte proteiner. De mindre båndene var også tilstede i kontrollfilen.

Basert på resultatene presentert i tabell III kan man konkludere med at de rekombinante faktor VIII-lignende proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen er glykolsylerte, siden det er en betraktelig forskjell mellom størrelsen på proteinene som ble dannet i mediumet med og uten tunicamycin, som er en kjent hemmer av asparagin-bundet glykosylering.

Eksempel 7

Konstruksjon av stabile cellelinjer som produserer proteiner med faktor VIII aktivitet.

A. Ekspresjon i CHO celler

Plasmidene pCLB203 (10 ug) og pAdD26SV(A)-3 (1 ug, Kaufman og Sharp, Mol. Cell Biol. (1982) 2: 1304-1319) ble ført inn i dhfr-manglende CHO celler (Chasin og Urlaub, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1980) 77: 4216-4220) ved anvendelse av kalsiumfosfat precipiteringsteknikken (Graham og Van der Eb, Virology (1973) 52: 456-467). Amplifisering av faktor VIII og dhf r kodende sekvenser blir oppnådd ved trinnvis administrering av økende konsentrasjoner av metotreksat (mtx) som beskrevet av Kaufman og Sharp, J. Mol. Biol. (192) 159: 601-621. Uavhengige transformanter som var resistente ovenfor 200 nM mtx ble plukket og etablert som stabile cellelinjer. Flere av disse cellelinjene produserte omtrent 75 mU av faktor VIII aktivitet/ml kulturmedium. Mengden av faktor VIII aktivitet utskilt i kulturmediet kunne ytterligere bli øket ved ytterligere amplifikasjon av faktor VIII kodende sekvenser ved anvendelse av smtx i økende konsentra-sj oner.

B. Ekspresjon i C127 celler

Som beskrevet ovenfor, kan ekspresjonsvektorer bli ført inn i eukaryote celler, hvor de kan integrere i genomet til vertscellen. Deretter kan ekspresjonskassettene bli amplifisert. Et alternativ til integrering av ekspresjonsvektoren er stabil opprettholdelse av denne som et episom. Et eksempel på det siste er uttrykking av et av "mutant" faktor VIII protein ved anvendelse av det episomale BPV-systemet (Howley et al., Meth. Enzymol. (1983) 101: 387-402). BPV-1 genoment (BamHI spaltet) ble først ført inn i et BamHI spaltet derivat av pTZ18R (Pharmacia) som inneholder Xhol seter på begge sider av BamHI setet. Deretter ble det resulterende pTZX-BPV plasmidet spaltet ved anvendelse av Xhol, som tilveiebringer et 2.9 kb pTZ fragment og et 8 kb PRV fragment med Xhol overhengende ender. Det sistnevnte fragmentet ble ligert inn i plasmid pCLB212 som ble spaltet ved det unike Sali setet (i posisjon 2040 i den opprinnelige pSVL vektoren). Den resulterende ekspresjonsvektoren pCG881 inneholder SV40 sen promoteren, faktor VIII cDNA kodende sekvensen som manglet 2775 bp (hovedsaklig i B-domenet) og SV40sen polyadenyleringssignalet. På grunn av tilstedeværelse av BPV-genomet kan denne vektoren bli opprettholdt som et episom i den riktige vertscellen, så som muse C127 celler. Plasmid pGB881 (10 ug) ble transfektert inn i C127 celler ved anvendelse av kalsiumfosfat precipiteringsteknikken. (Graham og Van der Eb. ovenfor). Foci ble isolert 14 dager etter transfeksjon og påfølgende stabile cellelinjer ble etablert. Flere cellelinjer produserte 40 mU faktor VIII aktivitet/ml kulturmedium.

Eksempel 8

Konstruksjon av pCLB204

pCLB204 ble konstruert ved anvendelse av loop-out mutageneseteknikken som beskrevet i Kramer et al. (1984) (se General Methods, 2). Delesjonsmutagenesen av den sentrale regionen til faktor VII cDNA ble utført ved anvendelse av følgende oligonukleotid:

Primer V:

3' TAG.GTT.TAA.GCG.AGT.CAA.GTT.TTG.GGT.GGT.CAG.AAC 5'

for å produsere interne delesjoner av sekvensene som koder for aminosyrene Ala-375 til og med Ser-1637 (Primer V) i faktor VIII cDNA.

Det korresponderende proteinet inneholder indre delesjoner på 1263 aminosyrer.

For å oppnå et målfragment for loop-out mutagenese ble et Hindlll-Pstl fragment på 1.4 kb avledet fra pCLB203 (eksempel

3) valgt. Nukleotidposisjonen (flg. 1) til Hind III-setet er 1025 i full-lengde faktor VIII sekvensen oppstrøms for regionen som skal bli modifisert; Pstl setet er i posisjon 5165 nedstrøms for regionen. Disse setene er indikert i fig. 2. 1.4 kb fragmentet ble subklonet i M13mp9 etterfulgt av loop-out mutagense. Etter selektering av fragmentet med den riktige delesjonen som er blitt tilveiebragt med primer V i bakteriofag M13, ble Hindlll-Pstl fragmentet inneholdende den ønskede delesjonen satt inn i en hensiktsmessig ekspresjonsvektor avledet fra pCLB201, ved anvendelse av følgende trinn og preparering av fragmenter med klebrige, unike restriksjonsenzymender (tallene refererer til fig. 1): Trinn 1. Plasmid pCLB201 ble spaltet med Aval og Xbal, og dannet et vektorfragment - Aval (737) til Xbal (6951 ) - på omtrent 6 kb.

Trinn 2. Plasmid pCLB201 spaltet med Aval og Hindlll ga et 289 bp langt fragment: Aval (737) til Hindlll (1025).

Trinn 3. Plasmid pCLB201 spaltet med Pstl og Ndel ga et fragment - Pstl (5165) til Ndel (5527) - på 363 bp.

Trinn 4. Plasmid pCLB201 spaltet med Ndel og Xbal ga et fragment - Ndel (5527) til Xbal (6951) på 1425 bp.

Trinn 5. M13 bakteriofagen inneholdende fragmentet med den ønskede mutasjonen ble spaltet med Hindlll og Pstl.

Trinn 6. De fem fragmentene ble isolert, blandet i ekvimolare mengder og ligert. Plasmidene inneholdende alle fragmentene ble selektert. Ved anvendelse av primer V, vist ovenfor, ble en ny ekspresjonsvektor konstruert for ekspresjon av eksempelforbindelsen beskrevet i tabell I:

pCLB204 for forbindelse 4 med primer V.

DNA konstruksjoner og fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en måte som kan anvendes for preparering av polypeptider med faktor VIII aktivitet ved innføring av et delesjonsmutantgen som koder for et faktor VIII analog inn i en vertscelle. Foreliggende sammensetninger kan anvendes for behandling av Hemophilia A symptomer.

Alle publikasjoner og patentsøknader som er nevnt i denne beskrivelsen viser ferdighetsnivåene til de som er trenet innenfor fagområdet og som denne oppfinnelsen er rettet mot. Alle publikasjoner og patentsøknader er inkorporert heri ved referanse.

Brinkhous, K.M. et al., (1985)

Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82, 8752-8756

Burke, R.L. et al., (1986)

J. Biol. Chem. 261, 12574-12578.

Carter, P. et al., (1985)

Nucleic Acids Res. 13., 4431

Chasin, L.A. and Urlaub, G. (1980)

Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, 4216-4220

Eaton, D.L. et al., (1986a)

Biochemistry 25_, 505-512

Eaton, D.L. et al., (1986b)

Biochemistry 25-, 8343-8347

Fay, J.F. et al., (1986)

Biochim. Biophys. Acta 871, 268-278

Galfré, G. et al., (1977)

Nature 266, 550-552

Gluzman, Y., (1981)

Cell 23, 175-182

Gorman, C., (1985)

DMA cloning (Ed.: D. Glover), IRL-press, Washington, Oxford, pp. 143-169

Graham-, F. and Van der Eb, A. (197 3)

v Virology 52, 456-467

Hanahan, D., (1983)

J. Mol. Biol. 166, 557-580

Howley, P.M., Sarver, N. and Law, M.F. (1983)

Meth. Enzymol. 101, 387-402

Hurwitz, D.R., Hodges, R., Drohan, W. and Sarver, H, (.1987^

Nucl. Acids Res. 1_5, 7137-7153

Kasper, C.K. et al., (1975)

Thrombs. Diath. Haemorrh. 34, 869-871

Kaufman, R.J. and Sharp, P.A. (1982)

Mol. Cell. Biol. 2, 1304-1319

Kaufman, R.J. and Sharp, P.A. (1982a)

J. Mol. Biol. 159, 601-621

Kozak, M. (1983)

Microbiol. Rev. 47, 1-45

Kramer, W. et al., (1984)

Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456

Laemmli, U.K., (1970)

Nature 227, 680-685

Luthman, H. and Magnusson, G. (1983)

Nucleic Acids Res. LI, 1295

Maniatis, T. et al., (1982)

Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory

Maxam, A.M. amd Gilbert, U. (1980)

Methods Enzymol. 65, 499-560

Melton, D.A. et al., (1984)

Nucleic Acids Res. 1J2, 7035-7056

Mulligan, R. and Berg, P. (1981)

Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, 2072

Sanger, F. et al., (1977)

Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467

Stel, H.V., (1984)

Ph.D. thesis. University of Amsterdam, The Netherlands

Toole, J.T., et al., (1986)

Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83, 5939-5942

Van Mourik, J.A. and Mochtar, J.A., (1970)

Biochim. Biophys. Acta 221, 677-679

Van Zonneveld, A.J., et al., (1986)

Proe. Nati. Acad. Sei USA §_3, 4670-4674

Vehar, G.A., et al., (1984)

Nature 312, 337-342

Veldkamp, J.J. et al., (1968)

Thromb. Diathes Haemorrh. 19_, 279

Uood, W.I. et al., (1984)

Nature 312, 330-337

Yanisch-Perron, C. et al., (1985)

Gene 33^, 103-119

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et delesjonsmutantprotein med biologisk aktivitet til faktor VIII og med en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyresekvensen til faktor VIII med unntagelse av en delesjon av aminosyresekvensen Ser-741 til og med Ser-1637 og a) en delesjon av aminosyresekvens Gln-1638 til og med Ile-1668 eller b) en delesjon av minst en del av aminosyresekvensen Lys-713 til og med Arg-740 og eventuelt en delesjon av i det minste en del av aminosyresekvensen Gln-1638 til og med Ile-1668 og eventuelt innskudd av aminosyresekvensen Pro-Arg-Val-Ala, karakterisert ved at den omfatter å dyrke i et næringsmedium en vertscelle omfattende en ekspresjonsvektor som innbefatter, i transkripsjonsretningen, en transkripsjonen regulatorisk region og en translasjonen initeringsregion som er funksjonell i nevnte vertscelle, en DNA-sekvense kodende for nevnte delesjonsmutantprotein og translasjonene og transkripsjonene termineringsregioner funksjonelle i nevnte vertscelle, i det ekspresjonen av nevnte DNA-sekvens er regulert ved nevnte initierings- og termineringsregioner, og isolering av nevnte protein.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av et delesjonsmutant protein som har biologisk aktivitet til faktor VIII ifølge krav 1, k arakterisert ved at den kodende sekvensen som anvendes tilsvarer aminosyresekvensen til faktor VIII med unntagelse av en delesjon av aminosyresekvensen Ser-741 til og med Ser-1637 og a) en delesjon av aminosyresekvens Gln-1638 til og med Glu-1648 (forbindelse 7) eller b) en delesjon av aminosyresekvens Lys-713 til og med Arg-740 (forbindelse 3b) eller c) en delesjon av aminosyresekvens Lys-713 til og med Arg-740 og et innskudd av aminosyresekvens Pro-Arg-Val-Ala (forbindelse 3) eller d) en delesjon av aminosyresekvens Gln-1638 til og med Ile-1668 (forbindelse 8).

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet er en -925 delesjonsmutant av faktor VIII med aminosyresekvensen (1-712)-Pro-Arg-Val-Ala-(1638-2332). (Forbindelse 3).

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet er en -928 delesjonsmutant av faktor VIII med aminosyresekvensen (1-738 )-Pro-Arg-Ser-Val-(1671-2332). (Forbindelse 8).

5 . DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for et protein som definert i krav 1.

6. Ekspresjonsvektor kodende for og som uttrykker en faktor VIII delesjonsmutant som definert i krav 1, 2, 3 eller 4, karakterisert ved at den omfatter en DNA sekvens kodende for nevnte faktor VIII delesjonsmutant og transkripsjonene og translasjonene elementer som muliggjør ekspresjon av nevnte faktor VIII delesjonsmutanter i en egnet vertscelle.

7 . Transformert celle og avkom derav, karakterisert ved at cellen omfatter en ekspresjonsvektor ifølge krav 6 som omfatter i transkripsjonsretningen en transkripsjonen regulatorisk region og en translasjonen initieringsregion som er funksjonell i vertscelle, en DNA-sekvens kodende for et protein som definert i hvike som helst av kravene 1-4 og translasjonene og transkripsjonene termineringsregioner som er funksjonelle i nevnte vertscelle, i det ekspresjonen av nevnte DNA sekvens er regulert ved nevnte initierings- og termineringsregioner.

8. Transformert celle og avkom derav ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte celle er en pattedyrcelle.

9. Transformert celle og avkom derav ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte celle er en COS celle, en CHO celle eller en C127 celle.

10. Transformert celle og avkom derav ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte celle er en prokaryot celle eller en gjær celle.

11. Transformert celle og avkom derav ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte celle er fra en Bacillus eller Kluvveromyces art.