HU211503A9 - Proteins with factor viii activity, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents

Proteins with factor viii activity, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them Download PDF

Info

Publication number
HU211503A9
HU211503A9 HU95P/P00758P HU9500758P HU211503A9 HU 211503 A9 HU211503 A9 HU 211503A9 HU 9500758 P HU9500758 P HU 9500758P HU 211503 A9 HU211503 A9 HU 211503A9
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
factor
viii
amino acid
sequence
protein
Prior art date
Application number
HU95P/P00758P
Other languages
English (en)
Inventor
Ooyen Albert Johannes Jose Van
Hans Pannekoek
Martinus Philippus Verbeet
Leen Robert Willem Van
Original Assignee
Immuno Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immuno Ag filed Critical Immuno Ag
Publication of HU211503A9 publication Critical patent/HU211503A9/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/829—Blood
    • Y10S530/83—Plasma; serum

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány VIII. faktor aktivitású új proteinekre és előállításukra szolgáló, génsebészeti technikával manipulált sejtvonalakat és mikroorganizmusokat alkalmazó eljárásokra vonatkozik.
Az A-hemofília nemhez kötött véralvadási rendellenesség, amelyet a VIII. faktor hiánya jellemez. A VIII. faktor lényeges eleme a véralvadási folyamatnak. A betegség a férfi népesség körülbelül 0,01%-ánál fordul elő. Az A-hemofília egészséges donoroktól származó, VIII. faktort tartalmazó plazma adásával kezelhető. A kezelés azonban számos hátránnyal jár. A VIII. faktorból korlátozott az ellátás, és a készítmény nagyon drága. A vérben a Vili. faktor koncentrációja csupán körülbelül 100 gg/ml, és a szokásos plazmafrakcionálási módszereket alkalmazva a kitermelés nagyon alacsony. Minthogy a VIII. faktor donorvérek keverékéből nyerhető, igen nagy a kockázata annak, hogy a recipiens olyan fertőző betegségeket kap meg, mint amilyeneket a donor-vérekben esetleg jelenlévő hepatitisz non-A, non-B. a hepatitisz B és az AIDS vírus okoz. Ezenkívül a recipiens az exogén eredetű VIII. faktorral szemben antitesteket termelhet, és ezek nagyban csökkenthetik a hatékonyságát.
A Vili. faktor három szakaszt foglal magába: egy N-terminális szakaszt, ez az ún. ,AlA2-domén; egy középső szakaszt, amely a „B-domén” és a C-terminális szakaszt, amely az A3, Cl és C2 domént tartalmazza. Az AlA2-domént és a C-terminális szakaszt tartják eszenciálisnak az alvadási aktivitás szempontjából. A Vili. faktor egy proteinnel együtt kering a vérben, s ez a protein a von Willebrand (vWf), amely feltehetően az érzékeny VIII. faktort védi a korai degradálódástól.
A Vili. faktor kitermelése igen alacsony, ha ismert rekombináns DNS technológiával állítjuk elő. Ezenfelül úgy találták, hogy a proteineket nem intakt lánc alakjában kapják meg, mivel a termékek izolálása és tisztítása nehézkes, ugyanakkor ennek következtében a költségek is magasak. Ennélfogva egy olyan hatékony eljárás kidolgozása volt kívánatos, amellyel VIII. faktor aktivitású vegyületek termelhetők nagy mennyiségben. s e vegyületek előnyösen csökkentett immunogén hatással rendelkeznek.
Közlések állnak rendelkezésre a humán mRNSből kapott VIII. faktor cDNS molekuláris klónozásáról és ezen VIII. faktor aktivitású proteineknek emlős, élesztő és bakteriális sejtekben való termeléséről. Lásd a WO 85/01 961 számú nemzetközi szabadalmi bejelentést, valamint az EP 0 160 457, EP 0 150 735 és EP 0 253 455 számú európai szabadalmi bejelentéseket. VIII. faktoraktivitású proteineknek transzformáit mikroorganizmusok használatával történő termelési eljárásiét tartalmazza a 0 253 455 európai szabadalmi bejelentés. Az EP 0 150 735 és EP 0 123 945 számú európai szabadalmi bejelentésben és Brinkhous és mtsai közleményben (1985) a Vili. faktor hasítási termékeinek VIII. faktor aktivitásáról van szó. A VIII. faktor két proteolitikus hasítási terméke, egy 92 kD és egy 80 kD polipeptid, fokozott VIII. faktor aktivitási fejt ki [Fay és mtsai, Biochem. Biophys.
Acta, 871, 268-278 (1986); Faton és mtsai, Biochemistry, 25, 505-512 (1986)].
Eaton és mtsai [Biochemistry, 25,8343-8347 (1986)] arról számoltak be, hogy egy polipeptid, amelynél a középső szakaszból 766 aminosavat (797-1562) töröltek, megtartotta VIII. faktor aktivitását, sőt azokkal az emlős sejtekkel, amelyeket ezen deletált polipeptidet kódoló DNS-t tartalmazó vektorral transzformáltak, magasabb termelési szintet értek el, mint azokkal a sejtekkel, amelyeket a teljes hosszúságú polipeptidet kódoló DNS-t tartalmazó vektorral transzformáltak.
A WO 86/06 101 számú nemzetközi szabadalmi bejelenés szerint azok a rekombináns VIII. faktor proteinek, amelyeknek a középső szkaszában egészen 880 aminosavig terjedő deléció van, VIII. faktor aktivitást fejtenek ki. A legnagyobb deléció Thr-760-tól Asn1639-ig terjed (a számozás az 1. ábra szerinti). A rekombináns VIII. faktor előállításához gazdasejtekként emlős sejteket használtak, többek között kínai hörcsög petefészek sejteket.
A találmány olyan új készítményre vonatkozik beleértve az expressziós vektorokat és az előállítás módszereit - , amelyek a VIII. faktor mindhárom N-terminális, középső és C-terminális - szakaszában deletált származékait és fragmentumait tartalmazzák. A készítmény előállítását úgy végezzük, hogy gazdasejtet, előnyösen emlős sejtet transzformálunk olyan expressziós vektorral, amely egy VIII. faktorral rokon vegyületet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz, a gazdasejtet tenyésztjük az idegen DNS szekvencia kifejezése céljából, majd a sejtek lizátumából vagy a kondicionált táptalajból izoláljuk a kapott VIII. faktor származékot vagy fragmentumot. A készítmények fokozott VIII. faktor aktivitással és/vagy csökkentebb immunogenitással rendelkeznek. A készítmények felhasználási területe magába foglalja az A-hemofília kezelését.
Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik. Az
Lábra bemutatja a pCLB89 vektorban lévő VIII.
faktor cDNS inszertumot, mely magába foglalja a VIII. faktor Alá-1-től Tyr-2332-ig terjedő aminosav szekvenciáját és ennek M(-l9)-tőI S(-l)-ig terjedő szignál szekvenciáját. Az ábra a megfelelő nukleotid szekvenciákat is feltünteti. Az F-973-at a TTC kódon kódolja. A
2. ábrán a teljes hosszúságú VIII. faktor proteint kódoló pCLB201 expressziós vektor szerkezete látható.
A pCLB201 cirkuláris plazmid bemutatása az EcoRI pozícióval kezdődik, amely a pSV2 plazmidból [Gorman, DNA Cloning, (szerkesztette Glover), IRL Press, 143-169 oldal (1985). Mulligan és Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 2072 (1981)] származó 4217 bp HindlIIBglll fragmentumon belül helyezkedik el. A korai SV40 promoter szakaszt a SVep jel mutatja. A vektor egy pRSV-neo plazmidból [Gorman. lásd fentebb (1985)] származó Ndel-HindlII fragmentumot tartalmaz, amely a Rous-szarkómavírus (RSV) hosszú ismétlődő végszakaszát (LTR - Long Terminál Repeat) hordozza a Sáli hely2
HU 211 503 A9 re beépítve. A teljes hosszúságú VIII. faktort a 7440 bp hosszú Sall-Hpal fragmentum kódolja, melynek jele: VIΠ. faktor cDNS (H = Hindül, Sál = Sáli). A pCLB201 szerkesztése folyamán elvesztett restrikciós endonukleáz hasítási helyeket zárójelbe tettük. A plazmid méretét kilobázis-párban adjuk meg. A
3. ábra a deléciós mutáns Vili. faktor proteineket tranziens módon kifejező vektorokat ábrázolja:
a. A pSV2 vektor-származék szakasz-határainak jelzése: a két egymásután következő promotemél az SV40 korai transzkripciós promoter jele (SVep) és a Rous-szarkómavírus hosszú ismétlődő végszakaszáé (RSV-LTR): a capping hely jele (Capsite) és a meszszendzser RNS 5' végének jele (mRNS); ezt követi a cDNS inszertum, mely a teljes hosszúságú VIÜ. faktor kódoló régiót tartalmazza a start kodonnal (ATG), a nyílt leolvasási kerettel és a stop kodonnal (TGA) együtt; végül a mRNS 3' nem kódoló szakasza egy rövid intronnal és az SV40 DNS-ből származó poliadenilációs szignál (polyA) látható (összehasonlításul lásd a 2. ábrát).
b. A 7440 bp (bázis pár) hosszú Sall-Hpal fragmentum rajza, amely a teljes hosszúságú VIII. faktort kódoló cDNS-t hordozza. Megjelöltük a leolvasási keret start és stop kodonját. Bemutatjuk a teljes hosszúságú cDNS-en belül lévő azon restrikciós endonukleáz helyeket, amelyek a pCLB202 és pCLB203 szerkesztéséhez szolgáló mutagenezisekben szerepet játszanak.
c. A Vili. faktor térképe. Látható a 19 aminosav hosszú szignál peptid és a plazma eredetű Vili. faktor dómén vagy repeal szerkezete. Az Al, A2, A3 homológ aminosav szekvenciák. A B egy egyedi régió, míg a Cl és C2 ismét homológ [Vehar és mtsai, (1984)]. Az A és C repeat-eket határoló aminosav pozíciókat jeleztük. Alul nyíllal jelöljük azon proteolitikus enzimek hasítási helyeit, amelyek a VIII. faktort bontják: aktivált protein C (APC), trombin (Ila), aktivált alvadási X. faktor (Xa) és egy tripszin-szerű proteáz (”?”-el jelezve). Feltehető, hogy a Xa faktor a Ha és APC hasítási helyeket hasítja [Eaton és mtsai, Biochemistry, 25, 8343-8347 (1986); Fay és mtsai, Biochim. Ciphys. Acta, 871, 268-278 (1986)]. A hasítási helyeket megjelöljük. A B szakasz sok hasítási helyet tartalmaz.
d. Az aktivált VUI. faktor alegység szerkezete. A Villa, faktor 92 kD és 80 kD alegységeit 92K-val, illetve 80K-val jelöltük. Ezek amino-terminális és karboxi-terminális aminosav pozícióit megjelöltük a teljes hosszúságú szekvencián belül.
e. ApCLB202 cDNS és protein szerkezete.
A pCLB202 a b. rajzon látható PstI és BamHI hely között egy közvetlen fúziót tartalmaz. A keletkezett proteint, amelyben az Ala-867 és Asp-1563 között peptidkötés van, megjelöltük. A protein teljes hossza 1637 aminosav. (A repeat-eket határoló jelzéseket és a specifikus proteolitikus hasítási helyeket bejelöltük; lásd fentebb).
f. A b. rajzon látható MaelII és HgiAT helyet összekötő cDNS-nek és a 4 extra aminosavat kódoló Mlullinker szekvenciát tartalmazó pCLB2O3 proteinnek a szerkezete. A protein teljes hossza 1411 aminosav. (A repeat-eket határoló jelzéseket és a speciális proteolitikus hasítási helyeket bejelöltük; lásd fentebb).
A 4. ábra néhány deléciós mutáns VHI. faktor protein molekulatömegének (méretének) meghatározása során kapott eredményeket mutatja be. A meghatározásokat immunprecipitációval és elektroforézissel végeztük.
Az autoradiogramon a pCLB202 (2-es sáv) és pCLB203 (1-es sáv) vektor által termelt proteinek sávjai láthatók. A molekulatömegmarkereket megjelöltük.
A találmány tárgyát új DNS szerkezetek és olyan új készítmények képezik, amelyek gazdasejtek által termelt VIÜ. faktor aktivitású kifejtő polipeptideket tartalmaznak. A VIII. faktor aktivitású polipeptidek közé tartoznak a VÜI. faktor protein deléciós mutánsai, amelyekből lényegében a teljes centrális szakasz, azaz a „B-domén”, valamint a 92 kD szakasz egy része törlődött. VIÜ. faktor aktivitású deletált polipeptideket kódoló DNS szekvenciát tartalmazó plazmid szerkezeteket használunk a gazdasejt transzformálására. A gazdasejtet ezután tenyésztjük a gén kifejezése céljából. A gazdasejt lehet eukarióta vagy prokarióta sejt.
A humán VIII. faktor szekvenciáját az 1. ábra mutatja be. Az aminosavak rövidítésére egybetűs jeleket használunk, s ezek a következők:
A = alanin,
R = arginin,
N = aszparagin,
D = aszparaginsav,
C = cisztein,
Q = glutamin,
E = glutaminsav,
G = glicin,
H = hisztidin,
I = izoleucin,
L =leucin,
K = lizin,
M = metionin,
F = fenilalanin,
P = prolin,
S = szerint,T = treonin,
W = triptofán, Y = tirozin,
V = valin.
Az aminosav szekvencia számozása A-l-el kezdődik, ami a 19 aminosavből álló szignál szekvencia utáni első aminosavat jelenti. A VÜI. faktor utolsó aminosava az Y-2332. Ezt a számozást használjuk végig az eljárás folyamán. A találmány tárgyát képezik azok a VIII. faktor-szerű anyagok is - beleértve a VIII. faktor fragmentumokat, a polipeptid mutánsait és azokat a fúziós peptideket, amelyek a VIH. faktor funkcionális részeit tartalmazzák - amelyeknek a biológiai aktivitása - beleértve a véralvadásra ható aktivitást olyan, mint a VIII. faktoré.
A találmány szerinti polipeptidekhez tartoznak a VIII. faktorral rokon polipeptidek, azaz olyan vegyületek, amelyek legalább egy olyan biológiai hatással rendelkeznek, mint a VIII. faktor és legalább egy olyan aminosav szekvenciájuk van, ami lényegében a VIII. faktor aminosav szekvenciájával azonos. A rokon polipeptid aminosav szekvenciája lehet hosszabb vagy rö3
HU 211 503 A9 videbb, mint a VIII. faktoré. A biológiai aktivitás A-hemofíliás betegeknél alkalmazva úgy nyilvánul meg. hogy az alvadási zavar javul és/vagy a természetben előforduló VIII. faktorral immunológiai keresztreakció lép fel. A javulás előidézhető az alvadási kaszkádba való közvetken beavatkozással vagy a VIII. faktor elleni antitestek megkötésével, hogy az ezután beadott Vin. faktor kevésbé károsodjék. Az immunológiái keresztreakció” alatt azt értjük, hogy egy jelen találmány szerinti új polipeptiddel szemben képződött antitest keresztreagál az intakt VIII. faktorral. E polipeptidnek legalább egy biológiailag aktív szekvenciája van, például amely immunológiailag vagy mint epitóp aktív, de egynél több biológiailag aktív szekvenciája is lehet és az ilyen szekvencia biológiai tulajdonság szempontjából versenyképes lehet a természetben előforduló termékkel.
A szóbanforgó uj polipeptidek nagy részének képlete egy N-terminális szakaszt (NR = N-terminal region), egy összekötő szakaszt (LR = linking region) és egy C-terminális szakaszt (CR = C-terminál region) tartalmaz. Az NR-re jellemző aminosav szekvencia lényegében megfelel egy olyan összefüggő szekvenciának, amely a teljes hosszúságú VIII. faktor A-l-től R-740-ig terjedő aminosav szekvenciájában található (AlA2-domén vagy 92K.D polipeptid) vagy az A1A2doménban lévő aminosavakból 45%-nál nem több, mint 20%, előnyösen 10%-nál nem több, a legelőnyösebben 5%-nál nem több aminosav törlődött. Az előnyös szekvenciák lényegében az A-l-től D-712-ig vagy az A-l-től R-740-ig terjedő szekvenciák.
Az Lr egy 1-20 aminosav terjedelmű rövid összekötő csoport, egy kötés vagy bármilyen aminosav szekvencia lehet, amely alapjában véve a teljes hosszúságú VIII. faktor proteinben lévő „B-domén szekvenciájához általában nem hasonlít. Tartalmazhat olyan szekvenciákat is, amelyek lényegében a B-domén S-741-től S-1637-ig terjedő teljes összefüggő szekvenciájának vagy e szekvencia bármely részének megfelelnek. Különleges fontosságúak azok az összetételek, amelyekben az Lr az S-741 - A-867 és a D-1563 - S-1637 terjedelmű szekvenciák valamelyikét tartalmazza.
A CR-re jellemző aminosav szekvencia lényegében hasonló ahhoz az összefüggő szekvenciához, amely a Gln-1638-tól a Tyr-2332-ig terjedő aminosavakat tartalmazó teljes hosszúságú VM. faktor szekvenciában található és amelyből a Q-1638-tól Υ-2332-ig tartó aminosavaknak nem több, mint 25%-a, rendszerint nem több, mint 20%-a, előnyösen 10%-nál nem több aminosav törlődött.
Ez a szekvencia előnyösen lényegében a következő Vili. faktor szekvenciájának megfelelő szekvenciákat tartalmazza: Q-1638 - Y-2332, E-1649 - Y-2332, S1669 - Y-2332 és S-1690 - Y-2332, előnyösebben a Q-1638 - Y-2332 szekvenciát.
A szóbanforgó polipeptidek lehetnek a Vili. faktor fragmentumai, amelyekből a teljes hosszúságú VIII. faktorhoz képest az aminosavak 75%-a törlődött, vagy lehetnek fúziós proteinek, amelyekben a 92KD protein vagy egy fragmentuma a 80KD polipeptiddel vagy fragmentumával fuzionált. A polipeptidből az aminosavaknak nem több, mint körülbelül 75%-a, rendesen az aminosavaknak nem több, mint körülbelül 45%-a, még gyakrabban az aminosavaknak nem több, mint 40%-a törlődött.
Az immunogenítás biztosítása érdekében a VIII. faktorral rokon anyagokat nagyméretű immunogén polipeptid egységhez kapcsolhatjuk kovalens kötéssel. Ilyen immunogén polipeptidek például a következők: marha szérum albumin, keyhole limpet hemocianin (KLH) és hasonlók.
Ezek a konjugált polipeptidek antitest termelésre használhatók megfelelő gazdaszervezetben. Az antitestek felhasználhatók a VIII. faktor jelenlétének vagy távollétének és/vagy koncentrációjának a meghatározására testfolyadékokban. A VIII. faktor hiánya A-hemofíliára utal.
VIII. fakton-al rokon anyagokat különbözőképpen állíthatunk elő. Előállíthatjuk úgy, hogy a teljes hosszúságú VIII. faktort proteolitikusan három régióra hasítjuk, előnyösen az Arg-740 és Gln-1638 előtt hasítunk, majd egyszer megrövidítjük az Ala-1 - Pro-739 szekvencia amino- vagy karboxil-lerminuszát legalább egy aminosavval és/vagy másszor megrövidítjük a Gln1638 - Tyr-2332 szekvencia amino- vagy karboxil-terminuszát legalább egy aminosavval. Az így kapott polipeptid fragmentumokat ezután vagy közvetlenül vagy egy közbülső összekötő csoporton keresztül fuzionálhatjuk vagy olyan összetételben kombináljuk a fragmentumokat, hogy VIII. faktor aktivitást kaphassunk.
A VIII. faktorral rokon anyagokat - ide sorolhatók azok a fuzionált proteinek, amelyekben az NR és CR van egymással fuzionálva - rekombiáns DNS technológiával is előállíthatjuk. A VIII. faktor gén izolálására használt módszerek ismertek e szakterületen, ilyenek a szintetizálás, a genomiálís DNS-ből való izolálás, a cDNS-ből való előállítás vagy ezek kombinációi. A gének manipulációjára szolgáló különböző technikák jól ismertek, ilyen a restrikció, emésztés, rezekció, ligálás, in vitro mutagenezis, primer repair, valamint a polilinkerek, az adapterek és hasonlók. Lásd: Maniatis és mtsai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982.
Az eljárás általában abból áll, hogy a VIII. faktort szintetizáló sejtekből egy genomiálís gyűjteményt hozunk létre. A korrekt szekvencia azonosítása valószínűségének fokozására egy VIII. faktort nem termelő sejtekből előállított cDNS gyűjteményt használhatunk a kereszt hibridizáláshoz. A VIII. faktor kifejeződés vizsgálatánál prokarióta expressziós vektorba - mint a pTZ18 és 19 - beépített restrikciós fragmentumokat használunk és a szűrést adó peptidek észlelése céljából.
Ha már azonosítottuk a komplett gént, legyen az cDNS vagy krimoszomális DNS, a strukturális génben kívánt deléciókat többféleképpen valósíthatjuk meg. A deléciókat úgy lehet véghezvinni, hogy vagy enzimatikus úton hasítjuk a teljes hosszúságú VIII. faktor cDNS-t, s ezt követően a tisztított fragmentumokat módosítjuk és ligáljuk, vagy helyre irányuló mulagenezissel. főként a Kramer és mtsai által leírt [Nucl. Acids
HU 211 503 A9
Rés., 12, 9441-9456 (1984)] loop-out mutagenezissel. Az így kapott gént ezután különböző jólismert módon manipulálhatjuk, hogy létrejöjjön a kifejeződés.
Használhatunk prokarióta és eukarióta sejteket egyaránt, ezek lehetnek bakteriális, élesztő és emlős sejtek, például CHO sejtek, Cl27 sejtek, humán „293” sejtek, myeloma sejtek vagy specializált sejtek, mint a máj sejtek és a COS sejtek. Azaz amikor a gént egy olyan gazdasejtben szándékozunk kifejezni, amely felismeri a VIII. faktor vad típusú transzkripciós és transzlációs szabályozó szakaszait, az egész gént - vad típusú 5’- és 3’- szabályozó régióval együtt - vezetjük be egy megfelelő expressziós vektorba. Különböző olyan expressziós vektorok léteznek, amelyek emlősöket fertőző vírusok replikációs rendszerét használják, ilyenek a Simian vírus 40, Epstein-Barr vírus, a bovin papilloma vírus, vaccinia vírus, stb.
Ha a gént egy olyan gazdasejtben óhajtjuk kifejezni. amely nem ismeri fel a természetben előforduló vad-típusú transzkripciós és transzlációs szabályozó szakaszokat, további manipulációra van szükség. Előnyös, hogy számos 3’-transzkripciót szabályozó régiót ismerünk és ezeket be lehet építeni a stop kodonoktól a leolvasási irányban (downstream). A strukturális géntől upstream elhelyezkedő nem kódoló 5’ szakaszt el lehet távolítani endonukleázos restrikcióval. Bal 31 rezekcióval, vagy ehhez hasonló módszerekkel. Másképpen úgy járhatunk el, hogy egy megfelelő restrikciós hely található a strukturális gén 5’ terminuszának közelében, lehasíthatjuk a strukturális gént és egy adapter használatával hozzákötjük a strukturális gént a promoter szakaszhoz, amikoris az adapter szolgáltatja a strukturális gén elvesztett nukleotidjait.
Különböző stratégiákat alkalmazhatunk egy olyan idegen expressziós kazetta elkészítése céljából, amely a transzkripció 5’ -» 3’ irányában egy transzkripciót szabályozó szakaszt és egy transzlációt indító szakaszt tartalmaz és amely még magába foglalhat olyan szabályozó szekvenciákat, amelyek a szabályozás indukcióját teszik lehetővé; a kazetta tartalmazhat egy nyitott leolvasási keretet, amely a teljes hosszúságú VIII. faktort vagy a Vili. faktorral rokon anyagokat, így a deletált mutáns proteineket is kódolja; kívánatos még, hogy olyan szekréciós vezérszekvenciát tartalmazzon, amelyet a kiszemelt gazdasejt felismer; tartalmaz még transzlációt és transzkripciót leállító szakaszokat. Az expressziós kazetta ezenkívül még legalább egy marker gént is tartalmazhat. A gazdasejtben indító és leállító szakaszok működnek és ezek vagy homológ (az eredeti gazdából származó) vagy heterológ (idegen forrásból származó) vagy szintetikus DNS szekvenciák lehetnek. Azaz az expressziós kazetta egészben vagy részben természetes forrásokból származhat, továbbá vagy teljesen vagy részben a gazdasejttel homológ vagy a gazdasejthez viszonyítva heterológ forrásból származhat. A találmány szerinti különböző szerkezetek (DNS szekvenciák, vektorok, plazmidok, expreszsziós kazetták) izoláljuk és/vagy tisztítjuk vagy szintetizáljuk, tehát nem „természetben előforduló” szerkezetek.
Megállapították, hogy azok a nukleotid szekvenciák, amelyek az ATG transzlációt indító kodont körülveszik, az optimális gén expresszió szempontjából igen fontosak az állati sejtekben. Kozák [Microbiol. Reviews, 47, 1-45 (1983) behatóan tanulmányozta ezeknek a szakaszoknak a hatását a polipeptidek expresziójára, például COS sejtekben az inzulin expressziójára.
Tehát feltehetőleg szükség van az iniciációs kodon körüli nukleotid szekvenciák módosítására. Ez megoldható helyre irányuló mutagenezissel vagy pedig úgy, hogy fuzionáljuk az idegen gént egy igen magas színvonalon kifejeződő gén iniciációs szakaszával.
Transzkripciós szabályozó szakaszok vagy promoterek például a következők: baktériumoknál a béta-gal promoler, amiláz promoter, a lambda fág bal és jobb promoterei, a trp és lac promoter, a trp-lac fúziós promoter, stb.: élesztőnél a glükolitikus enzimek promoterei, mint az ADH-1 és ADH-2 promoter, a PGK promoter és laktáz promoter és ezekhez hasonlók; emlős sejtek esetében az SV40 korai és késői promoterek, a cytomegalovírus (CMW) promoter, béta-akti promoter, az adenovírus főbb késői promoterei és hasonlók.
Eukarióta sejtekben a szabályozó szekvenciák tartalmazhatják például a cytomegalovírus enhancer szekvenciáját, amely egy promoter szekvenciával, például az SV40 promoterrel fuzionált, miáltal egy kimére promoter jön létre, vagy pedig be van építve az expressziós kazettában máshol, előnyösen a promoter szekvencia szoros közelségében.
A strukturális gén kifejeződést meg lehet úgy is sokszorozni, hogy például egymásután ligálunk egy domináns, sokszorozható gén-markert meghatározó gént a strukturális génhez 5’ vagy 3’ felé és a gazdasejteket szelektív körülmények között tenyésztjük. Sokszorozható gén például a dihidrofolát reduktáz (dhff) génje, amelynek megnövelhetjük a kifejeződését olyan sejtekben, amelyeket a folát antagonista metotrexáttal (mtx) szemben rezisztenssé tettünk. Az emlős sejtekben - mint például COS sejtekben - megvalósuló expresszió szempontjából fontosak az olyan expressziós kazetták, amelyek ki tudják fejezni a VIII. faktort vagy a vele rokon anyagokat, s ezek metallotoinein promotert használnak vagy az SV40 transzkripciós promotere korai transzkripciós egységet (SVep), főként pedig a Rous-szarkómavírus hosszú ismétlődő végszakasz (RSV-LTR) promotert a SVep-el együtt egymásutáni elhelyezkedésben.
Hurwitz és mtsai [Nucl. Acids Rés., 15, 7137-7153 (1987) leírtak olyan promotereket és promoter/enhancer kombinációkat példaként, amelyeket a C127 sejtekben lehet használni - 7. példa szerint - expressziós vektorokkal kombinációban. Az optimális expresszió érdekében jó hatású lehet egy intron bevezetése az expressziós kazettába. A mRNS 5’ részében előnyös egy intron jelenléte.
Fuzionált gént ezenkívül úgy készíthetünk el, hogy a strukturális gén részére olyan 5’- szekvenciáról gondoskodunk, amely egy szekréciós vezér szekvenciát és egy processzor szignált kódol. A VIII. faktor polipeptidek szekretálásához előnybe helyezzük a természetben
HU 211 503 A9 előforduló VIII. faktor vezérszekvenciáját, de fel lehel használni más szignál szekvenciákat is, mint a penicillináz, alfa-faktor, immun-globulin, T-sejt receptorok, külső membrán proteinek, szérum albumin, szöveti plazminogén aktivátor, inzulin, az emésztő traktus enzimeinek és ehhez hasonlónak a szekréciós vezérszekvenciáit. Ha egy szekréciós vezérszekvenciát a VIII. faktor vagy rokonai strukturális génjével fuzionálunk a megfelelő leolvasási keretben - az érett VIII. faktor a táptalajba szekretálődhat.
A terminációs szakasz annak a génnek a 3’ szakaszából származhat, amelyből az iniciációs szakaszt vettük vagy pedig egy másik génből. A terminációs régiók nagy választékát ismerjük, amelyekről megállapították, hogy számos azonos és különböző nembéli és fajtájú gazdasejtben megfelelnek. A terminációs szakasz tartalmazhat olyan szekvenciákat, amelyek a mRNS-nek emlős sejtekben való megfelelő feldolgozását szolgálják, például egy kis intront és egy poliadenilációs szignált.
Az expressziós kazetta szerkesztése folyamán a különböző DNS fragmentumokat rendszerint beklónozzuk egy megfelelő klónozó vektorba, amelyben lehetőség van a DNS meghosszabbítására, a DNS módosítására vagy manipulálására szekvenciák, linkerek összekapcsolása vagy eltávolítása révén vagy hasonló módon. Rendes körülmények között a vektorok végülis viszonylag nagy kópiaszámmal képesek replikálódni E. coliban. Klónozáshoz számos vektor könnyen beszerezhető, ilyenek például a következők: pBR322, pML2, pUC7 - pUC19, pSP64, pSP65, pSP18, pSP19, pTZ18 és pTZ18R, pTZ19 és pTZ19R és hasonlók.
A klónozó vektorokat az jellemzi, hogy hatékony replikációs origójuk van és legalább E. coliban működőképesek. A klónozó vektor legalább egy egyedi restrikciós hellyel rendelkezik, rendszerint azonban több egyedi restrikciós hellyel, de tartalmazhat sokszoros klónozó helyeket is, főként pedig ugyanazon restrikciós helyből kettőt, szusztitúció céljára. A klónozó vektor ezenkívül egy vagy több olyan markert tartalmaz, amely(ek) lehetővé teszi(k) a transzláció szempontjából való szelektálást. A markerek a citotoxikus szerekkel - ilyenek az antibiotikumok, nehéz fémek, toxinok és hasonlók - szemben rezisztenciát kölcsönöznek, vagy auxotróf gazdasejt esetében kiegészülést vagy egy fág elleni immunitást biztosítanak. A vektornak az expressziós kazettához vagy ennek egy részéhez való kapcsolását úgy oldjuk meg, hogy a vektort és a kazettát megfelelő módon hasítjuk és ha szükséges, módosítjuk a végeket akár úgy, hogy a túllógó végeket viszszavágjuk vagy betöltjük, hogy tompa végekhez jussunk vagy linkerek hozzáadásával vagy farkazással alakítunk ki komplementer végeket a ligáláshoz.
Bizonyos esetekben ingázó vektort használunk, amikoris a vektor különböző replikációs rendszereket igénylő különböző gazdasejtekben képes replikálódni. Előnybe helyezzük a simian vírus 40 (SV40) replikációs origójának a használatát, amely lehetővé teszi, hogy a plazmid COS-1 sejtekben szaporodjék, míg a bovin papilloma vírus (BPV-1) genomját arra használjuk.
hogy az expressziós vektorokat Cl 27 sejtekban episzomálisan tartsuk fenn [lásd például: Howley és mtsai, Meth. Enzymol., 101, 387-402 (1983)].
Az expressziós kazetta része lehet egy olyan replikációs rendszernek, amely egy megfelelő gazdasejtben az episzomális fennmaradást biztosítja, de az is lehetséges, hogy nincs ellátva replikációs rendszerrel és akkor a gazda genomjába van integrálva. Az a mód, ahogyan a gazdasejtet a különböző DNS szerkezetekkel transzformáljuk, lényeges a találmány szempontjából. A DNS-t ismert technikák szerint építhetjük be a gazdasejtbe, ilyen a kalcium-foszfáttal precipitált DNS használatával való transzformálás, az elektroporáció, a transzfekció, amikor a sejteket vírussal hozzuk érintkezésbe, a DNS-nek a sejtekbe való mikroinjiciálása és ehhez hasonló módszerek.
Gazdasejt gyanánt normál primer sejteket vagy tenyésztett primer szövetekből származó sejtvonalakat, valamint mikrobiális sejteket használhatunk. Előnyös, ha a gazda egy emlős sejtvonal, ilyenek a hörcsög CHO sejtek, az egér Cl27 sejtek vagy a humán „293” sejtek, de használhatók a mikrobiális sejtek is, például az élesztő sejtek, előnyösen a Kluyveromyces fajok, vagy a baktériumok, előnyösen a Bacillus fajok.
Egy emlős sejtvonal stabil transzformálásához, melyet úgy végzünk, hogy VIII. faktorral rokon anyagot kódoló szekvenciát hordozó expressziós vektort használunk és ezután a gazda kromoszómájába beépített vektort szaporítjuk, a kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek különösen alkalmasak. A transzformálás abból áll, hogy a gazdasejtet szelekciós marker gént - ilyen a dhfr vagy a G418 (neo-) rezisztencia gén vagy ehhez hasonlók - tartalmazó expressziős vektorral transzficiáljuk, ez ezután beépül a kromoszómába, majd a stabil transzformáció alapján szelekciót végzünk.
A gazdasejtvonalak stabil transzformálásának egy másik módszere szerint BPV-1 szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorokat használunk. Erre a célra a Cl27 sejtek igen alkalmasak. Transzformáláskor a BPV-1 szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorral transzfíciáljuk a gazdasejtet. A transzformált sejtek tarfoltok révén ismerhetők fel. Stabil transzformált sejtek előállítása és VIII. faktor aktivitásra való szűrése a KABI Coatest segítségével végezhető a 6. és 7. példában leírtak szerint. Ezzel szemben, ha a kifejezést tranziens transzformációs rendszerben végezzük - ilyenek a pSV2-ből származó expressziós vektorokkal transzformált COS-a sejtek - akkor nincs szelekciós lépés. Amint a strukturális gént bevittük a megfelelő gazdasejtbe, a gazdasejtet el szaporíthatjuk a strukturális gén kifejezése céljából. A gazdasejt nagy sűrűséget érhet el egy megfelelő tápoldatban. Ahol a promoter indukálható, mint például prokarióta rendszerben, permisszív feltételeket kell használnunk, például hőmérséklet változtatást, kimerítést, vagy egy anyagcsere termék vagy tápanyag túlsúlyát, vagy ehhez hasonló módszereket. Emlős rendszerben, ahol a strukturális gént követően egy sokszorozható gént használunk, a sokszorozáshoz megfelelő módszereket kell alkalmazni.
Szekréció esetén a fuzionált vagy fuzionálatlan
HU 211 503 A9 expressziós terméket a táptalajból hagyományos módszerekkel izolálhatjuk. Ha nem történik szekréció, a gazdasejteket learatjuk és a szokásos módon lizáljuk. A kívánt terméket ezután a szokásos módszerek segítségével izoláljuk és tisztítjuk, például affinitás kromatográfiásan, immobilizált antitestekkel, aminohexil-Sepharose kromatográfiával, vagy kevert polielektrolit módszerrel.
A rekombiáns termék lehet glükozilált és nem glükozilált, s a glükoziláció lehet vad-típusú vagy más típusú. A glükoiláciő mértéke részben a konkrét peptid szekvenciájától függ, részben attól a szervezettől, amelyben termelődött. így tehát E. coli sejtekben a termék kifejeződése nem glükozilált terméket eredményez, míg az emlős sejtekben való kifejeződés olyan terméket eredményez, amelynek a glükozilációja a vad-típusú peptidéhez hasonló.
A találmány szerinti vegyületeket sokféle módon fel lehet használni, úgy in vivő, mint in vitro. A szóbanforgó vegyületeket A-típusú hemofília tüneteit mutató betegek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények hatóanyagaként használhatjuk fel. Azaz egy VIII. faktor hatású gyógyszerkészítmény egy olyan készítmény, amely emlősöknél alkalmazható az A-hemofíliával kapcsolatos tünetek enyhítésére. A gyógyszerkészítmény előállításánál a találmány szerinti polipeptidekhez általában parenterálisan adható hordozókat és más megfelelő kötőanyagokat keverünk az ezen szakterületen ismert eljárások szerint.
A gyógyszerkészítményben a szóbanforgó polipeptid alkalmas módon, mint steril liofilizált készítmény jelenik meg, amelyet oldatok készítésére alkalmas olyan steril oldat hozzáadásával vihetünk újra oldatba, amely a recipiens véréhez viszonyítva előnyösen izotóniás. A gyógyszerkészítmény egyadagos és többadagos tartályokban kerülhet forgalomba, például leforrasztott ampullákban vagy üvegekben. Felhasználásuk az ismert humán VIII. faktorral analóg módon történhet, megfelelően beállítva a hatékonyságát. A találmány szerinti polipeptid in vivő alkalmazható, például injekcióban. intravénásán, peritoneálisan, szubkután vagy hasonló módon.
A szóbanforgó vegyületeket ezenkívül fel lehet használni az ezen vegyületekkel szembeni antitestek előállítására, amelyek in vivő és in vitro egyaránt alkalmazást nyerhetnek. Az antitestek előállíthatók hagyományos módon, akár úgy, hogy az említett polipeptidet immunogén gyanánt használjuk, s egy emlős gazdába injiciáljuk, például egérbe, marhába, kecskébe, birkába, nyálba, stb., mégpedig adjuvánssal, például komplett Freund adjuvánssal, alumínium-hidroxid géllel vagy hasonlókkal. Legtöbbjüket ezután elvéreztetjük és a vérből a poliklonális antitesteket izoláljuk. Egér esetében a perifériás vér-limfocitákat vagy a lép limfocitákat (B sejtek) megfelelő myeloma sejttel fuzionáljuk abból a célból, hogy a szóbanforgó vegyületekre specifikus antitestek monoklonális expresszióját meghatározó kromoszómák örökéletűvé váljanak.
Akár poliklonális, akár monoklonális antitesteket állítunk elő, ezekkel az illető polipeptidnek egy mintában - ami állhat sejtekből vagy lehet egy fiziológiás folyadék, mint a vér - való jelenlétét diagnosztizálhatjuk, illetve határozhatjuk meg. Ha nem sikerül a szóbanforgő polipeptidet kimutatni, ez A-hemofília esetére utalhat.
VIII. faktor mRNS-el komplementer szekvenciákat tartalmazó szondákat szintén készíthetünk és ezeket diagnosztikumként használhatjuk. Például egy sejtben a VIII. faktor mRNS jelenléte és/vagy mennyisége alapján meghatározható, hogy a beteg által termelt VIII. faktor hatását a képződött antitestek gátolják-e. Egy sejteket tartalmazó vizsgálati minta, szövet minta vagy testfolyadék - amelyről feltételezzük, hogy hibridizáló szekvenciákat tartalmaznak - esetén úgy járunk el, hogy a sejteket lizáljuk, majd denaturáló szerrel, például guanidinhidrokloriddal kezeljük, hogy felszabadítsuk az egyszálú mRNS-t. A jelzett szondákat (például 32 P-vel vagy biotinnal módosított nukleotidokat) a sejt mRNS-ével hibridizáljuk, s a keletkezett kettősszálú komplexet a jelzés alapján határozhatjuk meg. Bizonyos célokra kívánatos lehet, hogy a VU1. faktor mRNS-t mennyiségileg határozzuk meg. Ezt úgy végezzük, hogy az ismert mennyiségű egyszálú VIII. faktor mRNS-t tartalmazó referencia mintákban észlelt jelzett anyag mennyiségét összehasonlítjuk a vizsgálati mintában észlelt anyag mennyiségével.
A következő példák a találmány magyarázatául szolgálnak és nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.
Általános klónozó technikákat használtunk, ahogyan Maniatis és mtsai leírták [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, NY, (1982)]. Minden DNS-módosító enzimet a kereskedelemből szereztünk be és ezeket az előállítók előírásai szerint alkalmaztuk. A DNS tisztításához és elválasztásához szükséges anyagokat és készülékeket a szállító cégek előírásai szerint használtuk.
/. Példa
A pCLB20J expressziós vektor szerkesztése
A pCLB201 egy olyan expressziós vektor, amely az RSV-LTR promotert a transzkripció megindításához megfelelő irányban tartalmazza, valamint a teljes hosszúságú VIII. faktor cDNS-t (lásd a 2. ábrát). A vektor a Mulligan- és Berg- féle [Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 2072 (1981)] pSV2 vektorból származik.
A pSV2.tPA plazmid [Van Zonneveld és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 4670-4674 (1986)] egyetlen HindlII helyét Sáli hellyé módosítjuk azáltal, hogy a ragadós HindlII végeket tompa végekké alakítjuk és Sáli linkereket (5’-CGTCGACG-3') kapcsolunk a tompa végekhez. Kiválasztottunk egy Sáli helyet tartalmazó plazmidot és pCLB91-nek neveztük el. Ez a plazmid azonos a pSV2.tPA plazmiddal, kivéve, hogy a HindHI helyre beépítve Sáli linkért tartalmaz.
Az EP 0253455 számú európai szabadalmi bejelentés - melynek megállapításai itt referenciaként szerepelnek - leírja a Vili. faktor mRNS izolálását humán májból, majd cDNS-ének előállítását, tisztítását és azonosítását és beépítését a pEP121 plazmidba, melynek
HU 211 503 A9 következtében a pCLB89 plazmid keletkezik. A pCLB89 plazmid 7440 bp hosszú Sall-Hpal fragmentumát, amely a Vili. faktor cDNS-t tartalmazza, tisztítjuk és beépítjük a Sall-gyel és BglII-vel emésztett pCLB91 -be. A kapott pCLB200 expressziós vektor egy intakt Sáli helyet tartalmaz egy BglII helyhez ligáit Hpal hellyel együtt, amelyet betöltöttünk.
A pRSVneo plazmidot [Gorman, DNA Cloning, D. Glover, IRL-press, Washington, Oxford (1985) 143— 169 oldal] Ndel-el és Hindül-al emésztjük és a DNS polimeráz Klenow fragmentjével inkubáljuk a tompa végek kialakítása érdekében, majd izoláljuk a Rousszarkómavírus hosszú ismétlődő végszakasz (RSVLTR) szekvenciát tartalmazó 0,6 kb hosszú fragmentumot és beépítjük a pCLB200 Sáli helyére, amelyet hasonló módon tompa végűvé alakítottunk. A keletkezett expressziós vektor a pCLB201 (lásd a 2. ábrát).
2. példa
A pCLB202 szerkesztése
A pGB860 plazmidban megszerkesztjük a VIII. faktor egy deléciós mutánsát, amelyben a deléció a 2660 nukleotid pozíciónál lévő PstI helyről a 4749 pozícióban lévő BamHi helyig tart (lásd a 3. ábrát). Ezt a míveletel az EP 0253455 számú európai szabadalmi bejelentés leírja.
A pGB860-ban lévő Vili. faktor DNS-ben a centrális szakasz 695 aminosavát kódoló DNS törlődött.
A pCLB202 expressziós vektor a pGB860-ból és pCLB201-ből származik. Mindkét plazmidot KpnI és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük. A pGB860-ból származó 3,1 kb KpnI-Xbal fragmentumot a pCLB201ből származó 7 kb KpnI-Xbal fragmentummal ligáljuk. A kapott pCLB202 plazmid intakt KpnI és Xbal helyet tartalmaz. Szerkezete a 3e. ábrán látható.
3. példa
A pCLD203 szerkesztése (A) pCLBlOO:
A pCLB89-ből származó 7440 bp Sall-Hpal fragmentumot (lásd a 2. ábrát) a Sall-gyel és Smal-gyel hasítottpSP64 plazmidba [Mellon és mtsai, Nucl. Acids. Rés., 12, 7035-7056 (1984) építjük be. Ekkor a pCLBlOO plazmid keletkezik, amely egy intakt Sáli helyet és a Smal-véghez kapcsolódó egy Spal véget tartalmaz.
(B) pCLBlOl:
(A zárójelben lévő számok az 1. ábra számozásának felelnek meg.)
1- A pCLBlOO plazmidot KpnI-gyel és Tthl 111gyel emésztjük, s így egy 631 bp fragmentumot kapunk: Kpnl< 1817) - Tthl 111(2447). A 631 bp fragmentumot tisztítjuk, majd hasítunk MaeIII(2!99)-al. A MaelII ragadós véget betöltjük, s így egy 383 bp fragmentumhoz jutunk.
2. pCLBlOO plazmidot Apai-gyei és Banl-gyel emésztjük. A 669 bp ApaI(6200) - Banl(5532) fragmentumot izoláljuk.
3. A pCLBlOO plazmidot HgiAI-gyel emésztjük, s így kapjuk a 634 bp hosszú HgiAI fragmentumot. A fragmentumot T4 DNS polimerázzal inkubáljuk, hogy tompa végekhez jussunk, majd Banl-gyel emésztünk, miáltal egy 565 bp fragmentum keletkezik.
4. A pCLBlOO plazmidot Apai-gyei és KpnI-gyel emésztjük, s ekkor egy 5,9 kb hosszú fragmentum [ApaI(6200) - Kpnl(1817)] keletkezik, amely vektor szekvenciákat tartalmaz az E. coliban való fenntartás és szaporítás céljára.
5. Az (1) - (4) lépésekben kapott fragmentumokat tisztítjuk és a fragmentumok ekvimoláris mennyiségeit és a tízszeres moláris túlsúlyban lévő Mlul-linkert (CCACGCGTGG) ligáljuk, s így keletkezik a pCLBlOl plazmid. A KpnI, Báni és Apai helyeken kívül a pCLBlOl plazmid egy Mlul-linkert tartalmaz a MaelII és HgiAI helyek között (lásd a 3b. ábrát). A 3f. ábrán látható, hogy négy további aminosav (R-R-V-A) található a D-172 és Q-1638 aminosavak (1. ábra) között.
(C) pCLB203:
A pCLBlOl-et és pCLB201-et a KpnI és Xbal enzimekkel emésztjük. A pCLBlOl-ből származó 2,4 kb KpnI-Xbal fragmentumot a pCLB201-ből származó 7.0 kb KpnI-Xbal fragmentummal ligáljuk. A kapott pCLB203 plazmid intakt KpnI és Xbal helyet tartalmaz. Szerkezetét a 3f. ábra mutatja be.
4. példa
A pCLB212 szerkesztése
A pCLB212 szerkesztését a Kramer és mtsai [Nucl. Acids Rés., 12, 9441 - 9456 (1984)] álul lein loop-out mutagenezis technikával végezzük. A VIII. faktor cDNS centrális szakaszának deléciós mutagenezisét az alábbi nukleotid használatával végezzük: a 3'TTC.CAA.AGA.TCA.ACA.CTG.GTT.TTG.GGT. GGT.CAG.AAC 5’ primer IV a VIII. faktor cDNSben azoknak a belső szekvenciáknak a törlését idézi elő, amelyek a Lys-713-tól a Ser-1637-ig terjedő aminosavakat kódolják.
A megfelelő proteinben - összehasonlítva a teljes hosszúságú VIII. faktor proteinnel - 925 aminosav csoportot érintő belső deléció van.
Hogy a loop-out mutagenezishez egy cél-fragmentumot kapjunk, kiválasztottuk a pCLB2O3-ból származó 1,4 kb HindlII-Pstl fragmentumot (3. példa). A teljes hosszúságú VIII. faktor szekvenciában a Hindin hely nukleolid pozíciója (1. ábra) 1025 a módosítható szakasz felett (upstream), a PstI hely pozíciója pedig 5165 e szakasz alatt (downstream). Ezeket a helyeket a
2. ábrán megjelöltük. Az 1,4 kb fragmentumot az M13mp9-be szubklónozzuk, majd a loop-out muUgenezis következett. Kiválasztjuk a pontos deléciól Urtalmazó fragmentumot, ezután a kívánt deléciót tartalmazó HindlII-Pstl fragmentum Kpnl-Pstl részét beépítjük egy megfelelő expressziós vektorba oly módon, hogy ragadós, egyedi restrikciós enzimes végű fragmentumot készítünk (a számok az 1. ábra számozásának felelnek meg) a következő lépések szerint:
1. lépés. A mutáns VIII. faktor molekulák expreszsziójához egy új plazmidot szerkesztünk, s ez a pCLB211 plazmid. A pCLB89-ből származó 7440 bp
HU 211 503 A9
Sall-Hpal fragmentumot (1. ábra) beépítjük a pSVL expressziós vektorba (Pharmacia, Uppsala, Svédország; No. 27-4509-01), amely emlős sejtekben lehetővé teszi a transzkripciót egy késői SV40 promoter révén. A pSVL plazmidot Xhol-gyel és Smal-gyel hasítjuk. A kapott pCLB211 plazmid a Sáli véghez kapcsoltan egy Xhol véget tartalmaz, mivel mindkét 5’ kinyúló vége ezeknek az enzimeknek azonos és egy Smal véget a Hpal véghez kapcsoltan.
2. lépés. A pCLB211 plazmidot Apai-gyei és Sallgyel emésztjük. Izoláljuk az 1,4 kb Apal(6200) - Sáli (a pCLB211 pSVL részében egyetlen ilyen hely) fragmentumot.
3. lépés. A pCLBlOO plazmidot Ndel-gyel, Pstlgyel és Apai-gyei emésztjük. Két fragmentumot izolálunk: az egyik a 363 bp PstI (5165) - Ndel (5527) fragmentum, a másik a 674 bp Ndel (5527) - Apai (6200) fragmentum.
4. lépés. A pCLBlOO plazmidot KpnI-gyel és Saclgyel hasítjuk. Izoláljuk az 1799 bp KpnI (1817) - SacI (19) fragmentumot.
5. lépés. A pCLB211 plazmidot Sall-gyel és Saclgyel emésztjük. A 4,5 kb Sáli (a pSVL vektorban az egyetlen ilyen hely) - Sacl(19) fragmentumot izoláljuk.
6. lépés. A kívánt deléciót szekvencia analízissel bizonyítottan tartalmazó M13 bakteriofágot KpnI-gyel és Pstl-gyel emésztjük. Egy 584 bp Pstl(5165) Kpnl( 1819) fragmentumot izolálunk.
7. lépés. A 2-6 lépésben izolált hal fragmentum ekvimoláris mennyiségeit összekeverjük és ligázzal reagáltatjuk. Egy olyan plazmidot szelektálunk, amely mind a hat fragmentumot tartalmazza. A pCLB212 plazmidban fejeződik ki a 3b vegyület.
(II. táblázat). A 3b vegyület abban különbözik a 3 vegyülettől (a 3f. ábra mutatja be), hogy elvesztette a Mlul-linkert és a megfelelő négy aminosavat.
5. példa
A pCLB208, pCLB209 és pCLB2I0 szerkesztése a pCLB208, pCLB209 és pCLB210 plazmidokat loop-out mutagenezis technikával szerkesztjük meg, Kramer és mtsai szerint [Nucl. Acids Rés., 12, 9441 — 9456(1984)].
(A) Loop-out mutagenezis
A VIII. faktor cDNS középső szakaszának deléciós mutagenezisét az alábbi oligonukieotidokkal végezzük: Primer I:
3’ TTA.CGGTAA.CTT.GGT.TCT.CTT.TAT.TGA. GCA.TGA.TGA. 5’
Primer II:
3' TTA.CGG.TAA.CTT.GGT.TCT
AGT.CAA.CTT.TAC.TTC.TTC. 5’
Primer III:
3’ TTA.CGG.TAA.CTT.GGT.TCT.TCG.AAA.GTT. TTC.TTT.TGT. 5’
A mutagenezisek következtében a Vili. faktor cDNS-ből a következő aminosavakat kódoló szekvenciák törlődnek: S-741 - R-l648 (primer I), s-741 1-1668 (primer II) és S-741 - 1-1689 (primer III). A megfelelő proteinekben 908 (I), 928 (II), illetve 949 (III) aminosav belső deléciója valósul meg.
(B) A cél-fragmentumok előállítása
Loop-out mutagenezishez alkalmas fragmentumhoz úgy jutunk el, hogy egy pCLB 101-ből származó 0,8 kb fragmentumot készítünk a következőképpen:
A pCLBlOl plazmidot EcoRI-gyel emésztjük, az EcoRI helyeket betöltjük, majd KpnI-gyel emésztünk. Egy 479 bp Kpnl(1819) - EcoRI(2297) fragmentumot izolálunk (a nukleotid pozíciók számozását az 1. ábra tartalmazza). A pCLBlOl plazmidot BamHI-gyel emésztjük, a ragadós végeket betöltjük, majd újból emésztünk Pstl-gyel. Egy 416 bp BamHI (4749) - PstI (5165) fragmentumot izolálunk. Az izolált fragmentumok ekvimoláris mennyiségeit Egáljuk és az M13mpl9-be szubklónozzuk. Az M13 bakteriofágban lévő 895 bp KpnI - PstI fragmentumot - ez a módosítandó szakasztól upstream helyű 1819-es nukleotidtól az e szakasztól downstream helyű 5165 - nukleotidig terjed és a VIII. faktort kódoló szekvenciákban nagy deléciót tartalmaz - választjuk ki a loop-out mutagenezishez. Az I, II és ΠΙ príménél kapott pontos deléciókkal rendelkező fragmentumot szelektáljuk az M13 bakteriofágban. A kívánt deléciót tartalmazó KpnI-PstI fragmentumot a pCLB211-ből (lásd a 4. példát) származó egy megfelelő expressziós vektorba építjük be a következő lépések szerint, ragadós, egyedi restrikciós enzimes végeket tartalmazó fragmentumok készítésével (a számozás az 1. ábra szerinti):
(1) A pCLB211 plazmidot Apai-gyei és Sall-gyel emésztjük. Izoláljuk az 1,4 kb ApaI(6200) - Sáli (a pCLB211 pSVL részében lévő egyedi ilyen hely) fragmentumot.
(2) Az Ndel-gyel, Pstl-gyel és Apai-gyei emésztett pCLBlOO plazmidból izolálunk egy 363 bp Pstl(5156)
- Ndel(5527) fragmentumot és egy 674 bp Ndel(5527)
- ApaI(6200) fragmentumot.
(3) A pCLBlOO plazmidot KpnI-gyel és Sacl-gyel emésztjük és izoláljuk az 1799 bp Kpnl(1817) —
Sacl( 19) fragmentumot.
(4) A pCLB211 plazmidot Sall-gyel és Sacl-gyel emésztjük. Izoláljuk a 4,5 kb Sall(egyedi ilyen hely a pSVL vektorban) - Sacl(19) fragmentumot.
(5) A kívánt mutációval rendelkező fragmentumot tartalmazó M13 bakteriofágot KpnI-gyel és Pstl-gyel emésztjük. A kívánt mutációt tartalmazó KpnI-PstI fragmentumot izoláljuk mindhárom mutagenezis szempontjából.
(6) A fenti (1) - (5) lépésekben izolált hat fragmentum ekvimoláris mennyiségeit összekeverjük és ligáz reakciót végzünk. Hibridizálás és restrikciós enzimes emésztés segítségével szelektáljuk az összes kívánt fragmentumot tartalmazó plazmidokat. A fenti I, II és III primerek használatával az alábbi három új expressziós vektort szerkeszthetjük meg az I. táblázatban feltüntetett minta-vegyületek kifejezésére:
1. pCLB208 a 7. vegyülethez a primer I-gyei,
2. pCLB2O9 a 8. vegyülethez a primer Il-vel és
3. pCLB210 a 9. vegyülethez a primer II-mal.
HU 211 503 A9
6. példa
A rekombináns Vili. faktor DNS tranziens expreszsziója és a kapott proteinek vizsgálata (A) A COS-1 sejtek transzfekciója és metabolikus jelzés.
Az előző példák szerint előállított expressziós vektorokat COS-1 sejtekbe vezetjük be DEAE transzfekciós technikával. A vektor DNS kicsapását úgy végezzük, hogy 2 órán át inkubáljuk DEAE-dextránnal, majd klorokin sokkot alkalmazunk 2 órán át Lopata és mtsai [Nucl. Acids Rés., 12, 5707 (1984)], valamint Luthman és Magnusson [Nucl. Acids Rés., 11, 1295 (1983)) szerint. A COS-1 sejtek tenyésztéséhez és a kondicionált táptalajhoz az Iscove-féle DMEM (FLOW cég) oldatot használjuk, 10% (térf/térf) hővel inaktivált fetális borjú-szérummal (FLOW) kiegészítve. A tápoldatot a transzfekció után 48 óra múlva kicseréljük. A kondicionált tápoldatot 48 órával később összegyűjtjük.
A transzficiált sejtekben a proteinek metabolikus jelzését szérum mentes RPMI-tápoldat (GIBCO cég) használatával végezzük. A transzfekció utáni második napon a transzficiált sejteket 4 órán át 50 pCi/ml L-35S-metioninnal (Amersham cég, 1985; 370
MBeq/300 pl; specifikus aktivitás: >100 ci/mmól) inkubáljuk, majd egy éjszakán át inkubáljuk ImM L-metioninnal. mielőtt a kondicionált táptalajt learatnánk. Abból a célból, hogy megakadályozzuk a protein degradációját, az aratás előtt proteáz inhibitorokat, ilyen a fenii-metil-szulfonil-fluorid (PMSF), adunk a kondicionált tápoldathoz. A protein glükozilációjának a gátlására tunicamycint adhatunk a kondicionált táptalajhoz 0,001 mg/ml végkoncentrációban. A kondicionált táptalajokat a transzfekciót követő 4. napon fejtjük le és a termelt proteineket megvizsgáljuk.
(B) Arekombináns VIII. faktor biológiai aktivitása
A kondicionált táptalaj VIII. faktor aktivitásának meghatározásához 1) standard koagulációs vagy alvadási vizsgálatot és 2) kromogén aktivitási vizsgálatot (KABI Coatest) használhatunk. A standard koagulációs vagy alvadási vizsgálatot (az ún. aktivált parciális tromboplasztin időt) Veldkamp és mtsai [Thromb. Diath. Haemorrh., 19, 279 (1968)] szerint végezzük, hemofíliás plazma használatával. A kondicionált táptalajhoz citrátot adunk a vizsgálat előtt.
A kromogén aktivitási vizsgálatot vagy Kabi Coatesl-et a Kabi-Vitrum cég által rendelkezésünkre bocsátott eljárás szerint végezzük, azt kivéve, hogy az előírt térfogatokat néggyel osztottuk és 25 pl kondicionált táptalajt teszteltünk. A VIII. faktor-szerű proteineket 15 percig aktiváljuk, mialatt hozzáadjuk a kromogén szubsztrátumot (S2222).
A VIII. faktor aktivitás gátlását a standard Bethesda technológia [Kasper és mtsai, Thromb. Diath. Haemorrh., 34, 869-871 (1975)] szerint mérjük. A használt immunglobulinokat ioncserélő és protein-A-Sepharose kromatográfiával tisztítjuk a felhasználás előtt.
A VIII. faktor biológiai aktivitása vizsgálatánál használt standard egy citrátos plazma (0,05 mM végkoncentrációval) pool volt, amelyről feltételezzük, hogy 1 egységnyi VIII. faktor aktivitást vagy antigént tartalmaz ml-ként.
A deletált proteinek biológiai aktivitása különbözött, amint ezt a II. táblázat mutatja.
A deletált proteinek VIII. faktor alvadási aktivitást fejtettek ki.
Ezenfelül azt találtuk, hogy a rekombináns protein oldatban megállapított biológiai aktivitás gátlódik olyan antitestek hozzáadása után, amelyekről tudjuk, hogy a plazma eredetű VIII. faktor aktivitás inhibitorai és/vagy olyan ún. inhibitor-szérumok hozzáadására, amelyeket inhibitorokat tartalmazó betegektől vettünk le, azaz olyanoktól, akiknek VIII. faktor elleni antitesteket tartalmazott a vérük.
(C) Immunológiai kereszt-reakciók Vili. faktorral (1) Monoklonális antitestek előállítása Balb/c egereket immunizálunk tisztított humán VIII. faktor-von Willebrand faktor komplex-szel, amelyet gyógyászati célra használt krioprecipitátumból vagy Vili. faktor koncentrátumából (Holland Vöröskereszt Vértranszfúziós Szolgálatának Központi Laboratóriuma, Amszterdam, Hollandia) agaróz gél szűréssel állítunk elő [Van Mourik és Mochtar, Biochim. Biophys. Acta, 221, 677-679 (1970)]. A limfocita hibridizálását Galfre és mtsai [Natúré, 266, 550-552 (1977)] leírása szerint végezzük. A VIII. faktorral szemben monoklonális antitestet termelő kiónok kiválasztására használt technikák leírását doktori tézis tartalmazza (Stel, doktori tézisek, Amszterdami Egyetem, Hollandia, 1984). A VIII. faktor elleni monoklonális antitestek azonosítását a Vili. faktor polipeptidekkel való reakciójuk alapján végeztük az EP 0254355 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak szerint.
(2) VIII. faktor polipeptidek elleni poliklonális antitestek előállítása
Nyulakat immunizálunk kromatográfiásan tisztított VIII. faktor készítményekkel (Slel, lásd fentebb) standard eljárásokkal. Az így kapott antitestek vizsgálatát immunoblot módszerrel végeztük az EP 0253455 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak szerint, tisztított VIII. faktor - von Willebrand faktor komplex vagy tisztított polipeptidek használatával. Az antitesteket poliakriamid gél elektroforézissel izoláljuk, majd nitrocellulóz lemezekre visszük, cél-proteinek gyanánt. Három különböző antiszérumot kaptunk: RH 63271, RH 63272 és RH 63275. Az antiszérumok a 80 KD dublettel, a 92 KD polipeptiddel. továbbá nagyobb molekulatömegű polipeptidekkel reagálnak. Ezek az antiszérumok a VIII. faktor kisebb fragmentumaival is reagáltak.
13) ELISA
Egy újonnan kidolgozott ELlSA-t (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) használtunk a VIII. faktor antigénnek a kondicionált táptalajban való kimutatására. A CLB.CAgA Vili. faktor-specifikus monoklonális antitestet megfelelően hígítjuk (5 mg/1) 0,05 mólos karbonát-pufferrel (pH = 9,8) és az oldatból 200 μΙ-eket
I
HU 211 503 A9 mérünk az ELISA lemezek tartályaiba a fedés végett. A lemezeket zárjuk és 4 ‘C-on inkubáljuk egy éjszakán át. Minden inkubálás között a lemezeket háromszor mossuk 0,05% Tween-20 tartalmú PBS-el úgy, hogy az oldatot legalább 1 percig hagyjuk a lemezeken.
A vizsgálandó mintákból vagy normál plazmából hígítási sort készítünk, s a hígításokból kétszer 200 μΙ-eket pipettázunk a tartályokba. A lemezeket zárjuk és 37 ’C-on inkubáljuk 2 órán át rázás nélkül, majd mosás következik a fent leírtak szerint. Az antigén hígításához puffért (pH = 7,4) használunk, amely 50 mM trisz.HCl-puffert, 2% marhaszérum albumint és 1,0 M nátrium-kloridot tartalmaz.
A CLB.CAgll7-torma-peroxidáz konjugátumokat körülbelül 10 000-szeresre hígítjuk (a kívánt érzékenységtől függően) 50 mM trisz.HCl-t, 0,2% Tween-20-at és 1,0 M kloridot tartalmazó pufferrel (pH = 7,4). Ebből a hígításból 200 μΙ-eket mérünk minden tartályba, a lemezeket lezárjuk és 2 órán át 37 ’C-on inkubáljuk sötét helyen.
A lemezeket mossuk, mint fent leírtuk, majd tetrametilbenzidin (TMB; 0,1 g/1) és hidrogén-peroxid (0,006%) 0,1 mólos acetát/citromsav pufferben (pH = 5,5) készített oldatából 150 μΙ-eket adunk minden tartályhoz. A lemezeket 30 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, sötét helyen. Az enzim-reakciót 150 μΐ 2 n kénsav hozzáadásával állítjuk le. Az abszorpciót 450 nm-en határozzuk meg ELISA mikro-leolvasó készülékben. A II. táblázatból kitűnik, hogy a mind erősebben kondicionált tápoldatok Vili. faktor aktivitása növekedett és ez közel arányos volt a tápoldatban lévő Vili. faktor proteinek mennyiségi növekedésével.
(D) Méret meghatározás
A termelt VEI. faktor proteinek méretét gél-elektroforézissel határozzuk meg az alábbiak szerint.
A plazma-eredetű Vili. faktorral szembeni monoklonális és poliklonális szérumokat használjuk az immunprecipitációhoz. Az antitesteket A-Sepharose-os immobilizáljuk (15 μΙ szérum/lOmg protein-A-Sepharose), majd a metabolikus úton jelzett rekombináns Vili. faktor-szerű vegyületekkel inkubáljuk. Az immobilizált rekombináns proteineket 10%-os béta-merkapto-etanollal redukáljuk, ezután 5%-os poliakrilamid-SDS gél-elektroforézis rendszerben [Laemmli, Natura, 227,680-685 (1972)] választjuk el. A 4. ábra és a El. táblázat mutatja, hogy a VIH. faktor-szerű proteinek méretére olyan értékeket kaptunk, mint amiket a glükozilált proteinekre vártunk. Kisebb sávok szintén látszanak a kontroll nyomvonalán.
A III. táblázatban bemutatott eredmények alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a jelen találmány szerinti rekombináns Vili. faktor-szerű proteinek glükoziláltak, mivel szignifikáns különbség van a tunicamycint tartalmazó és tunicamycint nem tartalmazó táptalajban képződött proteinek mérete között, ugyanis a tunicamycin ismert inhibitora az aszparagtnhoz kapcsolódó glükozilációnak.
7. példa
VIH. faktor aktivitású proteineket termelő stabil sejtvonal szerkesztése (A) Kifejeződés CHO sejtekben
A pCLB203 plazmidot (10 pg) és a pAdD26SV/A/3 plazmidot [1 μg; Kaufman és Sharp, Mól. Cell. Biok, 2,1304-1319 (1982)] bevezetjük dhfr deficiens CHO sejtekbe [Chasin és Urlaub, Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 4216-4220 (1980)], kalcium-foszfát precipitációs technika [Graham és Van dér Eb, Virology, 52, 456-467 (1973)] segítségével. A VEI. faktor és dhfr kódoló szekvenciák szaporítását úgy érjük el, hogy a sejtekhez hozzáadunk fokozatosan növekvő koncentrációban metotrexátot (mtx) Kaufman és Sharp [J. Mól. Biok, 159, 601-621 (1982)] előírása szerint. Egymástól független, 200 nM mtx-re rezisztens transzformált sejteket szűrtünk ki és megállapítottuk, hogy ezek stabil sejtvonalak. Számos ilyen sejtvonal mintegy 75 mE VIII. faktor aktivitást termelt táptalaj ml-enként. A táptalajba szekretálódott Vili. faktor aktivitás mennyiséget tovább növelhetjük, ha a VIII. faktor kódoló szekvenciákat tovább szaporítjuk növekvő mtx koncentrációk használatával.
(B) Kifejeződés C!27 sejtekben
A fent leírtak szerint, az expressziós vektorok eukarióta sejtekbe is bevezethetők, ahol a gazdasejt genomjába integrálódnak. Az expressziós kazetták ezt követően sokszorozódhatnak. Az expressziós vektor integrálásának egy másik formája, ha episzomálisan stabilan fennmarad. Ez utóbbira példa az egyik „mutáns” VIII. faktor protein expressziója episzomális BPV-rendszer alkalmazása esetén [Howley és mtsai, Meth. Enzymol., 101, 387-402 (1983)]. A BPV-a genomot (BamHI-gyel hasítva) először a pTZ18R (Pharmacia) egy BamHIgyel hasított származékába vezetjük be, amely a BamHI hely mindkét oldalán Xhol helyeket tartalmaz. Ezután a kapott pTZX-BPV plazmidot Xhol-gyel hasítjuk, amikoris egy 2,9 kb pTZ-fragmentumot és egy 9 kb BPV-fragmentumot kapunk Xhol kiálló végekkel. Ez utóbbi fragmentumot a pCLB212 plazmidba ligáljuk, amelyet előzőleg egyetlen Sáli helyén (az eredeti pSLV vektor 2040, pozíciója) hasítottunk. A keletkezett pGB881 vektor az SV40 késői promotert, a VIII. faktor cDNS-t kódoló szekvenciát - melyből 2775 bp hiányzik (főként a B-domén) - és az SV40 késői poliadenilációs szignálját tartalmazza. A BPV-genom jelenlétére következtében ez a vektor episzomálisan tartható fenn olyan megfelelő gazdasejtekben, mint amilyenek az egér Cl27 sejtek.
A pGB881 plazmiddal (10 pg) transzficiáljuk a Cl27 sejteket kalcium-foszfát precipitációs technika segítségével (Graham és Van dér Eb, lásd fentebb). A transzfekció után 14 nappal izoláljuk a transzficiált sejteket, majd stabil sejtvonalakat állítunk elő. Számos sejtvonal táptalaj ml-enként 40 mE értékű VIII. faktor aktivitást termelt.
8. példa
A pCLB204 szerkesztése
A pCLB204 plazmidot a Kramer és mtsai által leírt [lásd: General Methods, 2 (1984)] loop-out mutagenezis technikával szerkesztjük meg. A VEI. faktor cDNS
II
HU 211 503 A9 középső szakaszának deléciós mutagenezisét a 3’ TAG.GTT.TAA.GCG.AGT.CAA.GTr.TTG.GGT. GGT.CAG.AAC 5’ képletű primer IV-gyel végezzük, amikoris a VIII. faktor cDNS-ben belső delációs keletkezik az Ala-375-től Ser-1637-ig (primer IV) terjedő aminosavakat kódoló szekvenciákban. A megfelelő protein belsejéből 1263 aminosav törlődött.
Hogy a loop-out mutagenezishez egy cél-fragmentumhoz jussunk, kiválasztottuk a pCLB203-ból (3. példa) származó 1,4 kb HindlII-PstI fragmentumot. A HindlII hely nukleotid pozíciója a teljes hosszúségú VIII. faktor szekvenciában 1025-nél (1. ábra) van, a módosítandó szakasz felett (upstream), a PstI hely 5165. pozíciója a szakasz alatt (downstream) található. Ezek a helyek a 2. ábrán láthatók. Az 1,4 kb fragmentumot az M13mp9-be szubklónozzuk, majd elvégezzük a loop-out mutagenezist. Az Ml3 bakteriofágban a primer V-tel kapott pontos deléciót tartalmazó fragmentumot kiválasztjuk, majd a kívánt deléciót tartalmazó HindlII-PstI fragmentumot beépítjük a pCLB201-ből származó megfelelő expreszsziós vektorba a következő lépések alkalmazásával és ragadós, egyedi restrikciós enzim végekkel ellátott fragmentumok előállításával (a számozás az 1. ábra számozásának felel meg).
1. lépés. A pCLB201 plazmidot Aval-gyel és Xbalgyel emésztjük, s ekkor egy körülbelül 6 kb Aval(737) - Xbal(6951) vektor fragmentum keletkezik.
2. lépés. A pCLB201 plazmidot Aval-gyel és HindlII-mal emésztjük, amikoris egy 289 bp hosszú Aval(737) - HindIH( 1025) fragmentum keletkezik.
3. lépés. A pCLB plazmidot Pstl-gyel és Ndel-gyel emésztjük, miáltal egy 363 bp hosszú Pstl(5165) Ndel(5527) fragmentumot kapunk.
4. lépés. A pCLB201 plazmidot Ndel-gyel és Sbalgyel emésztjük, melynek eredményeképpen az 1425 bp Ndel(5527) - Xbal(6951) fragmentumhoz jutunk.
5. lépés. A kívánt mutációval rendelkező fragmentumot tartalmazó M13 bakteriofágot HindlII-mal és Pstl-gyel emésztjük.
6. lépés. Az öt fragmentumot izoláljuk, ekvimoláris mennyiségeit összekeverjük és ligáljuk. Azokat a plazmidokat választjuk ki, amelyek az összes fragmentumot tartalmazzák. A fent bemutatott primer IV segítségével egy új expressziós vektort szerkesztünk az 1. táblázatban szereplő minta-vegyület expressziója céljára:
pCLB204 a 4. vegyület számára a primer IV-gyel.
A jelen találmányban leírt DNS szerkezetek és módszerek Vili. faktor aktivitású polipeptidek előállítására adnak eljárást, mely szerint egy VIII. faktorral rokon anyagot kódoló deléciós mutáns gént vezetünk be egy gazdasejtbe. A találmány tárgyát képező készítmények az A-hemofíliás kórképek kezelésében nyernek felhasználást.
A leírásban említett minden közlemény és szadadalmi bejelentés a szakismeretek szintjére utal azok számára, akik e találmánnyal kapcsolatos szakterületen tevékenykednek. Minden irodalmi közlemény és szabadalmi bejelentés olyan mértékben tekintendő a leírásban referenciakénl, amennyire az egyes közleményeket vagy szabadalmi bejelentéseket speciálisan és egyedileg szükséges referenciaként alkalmazni.
A találmány teljes leírása az ezen szakterületen átlagos jártassággal rendelkezők számára világosan megmutatja, hogy a leíráshoz képest számtalan változtatást és módosítást végezhetnek anélkül, hogy a szabadalmi igénypontok szellemétől vagy oltalmi körétől eltérnének.
IRODALOM
Brinkhous, K. M. et al., (1985)
Proc. Natl. Acad. Sci. USAS2, 8752-8756
Bürke, R. L. et al., (1986)
J. Bioi. Chem. 20/, 12574-12578
Carter, P. et al., (1985)
Nucleic Acids Rés. 13,4431
Chasin, L. A. and Urlaub, G. (1980)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220
Eaton, D. L. et al., (1986b)
Biochemistry 25, 505-512
Eaton, D, L. et al., (1986a)
Biochemistry 25, 8343-8347
Fay.J. F.et al., (1986)
Biochem. Biophys. Acta<577, 268-278
Galfré, G. et al., (1977)
Natúré 266, 550-552
Gulzman, Y„ (1981)
Cell 23, 175-182
Gorman, C., (1985)
DNA cloning (Ed.: D. Glover), IRL-press, Washington,
Oxford, pp. 143-169
Graham, F. and Van dér Eb, A. (1973)
Virology 52, 456-467
Hanahan, D., (1983)
J. Mól. Bioi. /óó, 557-580
Howley, P. M„ Sarver, N. and Law, M. F. (1983)
Meth. Enzymol. 101,387—402
Hurwitz, D. R., Hodges, R., Drohan, W. and Sarver, H. (1987)
Nucl. Acids Rés. 15, 7137-7153
Kasper, C. K. et al., (1975)
Thrombs. Diath. Haemorrh. 34, 869-871
Kaufman, R. J. and Sharp, P. A. (1982)
Mól. Cell. Bioi. 2, 1304-1319
Kaufman, R. J. and Sharp, P. A. (1982a)
Mól. Cell. Bioi./59, 601-621
Kozák, M. (1983)
Microbiol. Rév. 47, 1-45
Kramer, W. et al., (1984)
Nucleic Acids Rés. 12, 9441-9456
Laemmli, U. K., (1970)
Natúré 227, 680-685
Luthman, H. and Magnusson, G. (1983)
Nucleic Acids Rés. 11, 1295
Maniatis, T. et al., (1982)
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980)
Methods Enzymol. 65, 499-560
Méltón. D. A. et al., (1984)
HU 211 503 A9
Nucleic Acids rés. 12, 7035-7056 Mulligan, R. and Berg, P. (1981)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072 Sanger, F. et al., (1977)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 Stel, H.V.,(1984)
Ph. D. thesis, University of Amsterdam, The Netherlands
Toole, J. T, et al., (1986)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5939-5942 Van Mourik, J. A. and Mochtar, J, A., (1970)
Biochim. Biophys. Acta 221, 677-679 Van Zonneveld, A. J„ etal., (1986)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4670-4674 Vehar, G. A., et al., (1984)
Natúré 312, 337-342
Veldkamp, J. J. et al., (1968)
Thromb. Diathes Haemorrh. 19, 279 Wood, W. I. et al., (1984)
Natúré, 312, 330-337
Yanisch-Perron, C. et al., (1985)
Gene 33, 103-119
I. táblázat
Deléciós mutáns Vili. faktor proteinek
Vegyület Nr NR*Del. lr Lr ‘Del, CR CR ‘Del. expressziós vektor
1. A-l—>R-740 0 S-741 —>S1637 0 Q-1638—>Y2332 0 pCLB201
2. A-1 —>R-740 0 S-741—»A867+D1563—»S-1637 695 Q-1638—>Y2332 0 pCLB202
3. A-l—)D-712 28 P-R-V-A 897 Q-1638—»Y2332 0 pCLB203
3b. A-l—>d-712 28 peptidkötés 897 q-1638—>Y2332 0 pCLB212
4. _ A-l-V-374 366 peptidkötés 897 Q-1638—>Y2332 0 pCLB204
7. A-l-R-740 0 peptidkötés 897 E-1649—»Y2332 11 pCLB208
8. Λ-l—>R-740 0 peptidkötés 897 S-1669—>Y2332 31 pCLB209
9. A-l—kR-740 0 peptidkötés 897 S-1690—>Y2332 52 pCLB210
-> A Vili. faktor aminosavak egy megszakítás nélküli szekvenciája * A Del. jelzéssel ellátott oszlopokban az illető szakaszban törlődött aminosavak száma szerepel a teljes hosszúságú VIII. faktorral összevetve. Az aminosavak számozása az 1. ábra számainak felel meg
II. táblázat
VIII. faktor aktivitás és a proteinek mennyisége
Vegyület1* Vili. faktor aktivitás (mE/ml)7) Maradék akti vitás22'*3 Antigén meghatározás 8*
CLB.CAg pat.J51
hossza (delációja) kromogén2* standard3* antitest hozzáadása után
vizs gálát
1 2332 (0) 1,0 _6) _6) <5 mU
2 1637 (695) 6,7 2 <1% <1% 7 mii
3 1411 (925) 17,3 5 <2% <1% 20 mU
3b 1407 (925) 15,0 ND9’ ND91 ND9* 20 mU
4 1069 (1263 0 0 0 0 20 ml
7 1424 (908) 15,0 ND ND ND ND
HU 211 503 A9
Vegyület11 VIII. faktor aktivitás (mE/ml)7) Maradék aktivitás2741 Antigén meghatározás 81
CLB.CAg patJ51
hossza (deláciőja) kromogén21 standard31 antitest hozzáadása után
vizs gálát
8 1404 (928) 15,0 ND ND ND ND
9 1383 (949) 0 ND ND ND ND
(pSV2) 0 0 0
1) Lásd az I táblázatot
2) Kromogén meghatározás (KAB1 Coates)
3) Standard alvadási vizsgálat
4) CLB.CAgA Vili faktor elleni monoklonális antitest (Stel, doktori tézisek; Amszterdami Egyelem, Hollandia, 1984)
5) J. beteg szérumából izolált inhibitor
6) A kezdeti aktivitás túl alacsony volt ahhoz, hogy az esetleges inaktiválódást észlelni lehessen
7) Kondicionált táptalajok aktivitása 48 órás inkubálás után Egy egység (El Vili faktor 100 ng Vili. faktor proteinnek felel meg
8) EL1SA (= enzyme-linked immunosorbent assay)
9) ND (= nőt determincdl nem vizsgáltuk
111. táblázat
A szekretált Vili. faktor proteinek mérete
Vegyület11 Expressziós vektor Hosszúság21 □elécié11 Méret számított41! meghatározott51 Glükoziláciö gátlás61
1 pCLB201 2332 0 265 kD
2 pCLB2O2 1637 695 188kD 192 kD 185 kD
3 pCLB2O3 1411 925 162 kD 1 168 kD 158 kD
3b pCLB212 1407 925 162 kD i 168 kD
4 pCLB2O4 1069 1263 123 kD 135 kD
1) Lásd az I. táblázatot
2) Hosszúság = az expressziós vektorban lévő Vili. faktort kódoló szekvencia által meghatározott aminosavak száma
Deléció = a megfelelő expressziós vektorban lévő teljes hosszúságú Vili, faktort kódoló szekvenciából törlődött aminosavak száma
4) Az ismert aminosav összetétel alapján számított méret kilodaltonban kifejezve.
5) A jelzett protein immunprecipitációval majd elektroforézissel meghatározott mérete kilodaltonban kifejezve
6) Tunicamycint tartalmazó táptalajban tenyésztett sejtekből származó proteinek mérete kilodaltonban kifejezve.

Claims (21)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Egy VIII. faktor biológiai aktivitással rendelkező protein, amelynek aminosavszekvenciája az NR~Lr-Cr általános képlettel ábrázolható, amely képletben
    NRegy lényegében a VIÜ. faktor AlA2-doménjából származó folytonos szekvencia legalább egy részével azonos olyan szekvencia, amelyben az említett AlA2-doménban lévő összes aminosav legfeljebb körülbelül 45%-a deletált, és az illető szekvencia lényegében a VIII. faktor egész N-terminális régióját tartalmazza;
    Lr egy pept’dkötés, egy 1-20 aminosavból álló szekvencia vagy legalább egy aminosav;
    CR egy lényegében a VIII. faktor 1638-tól 2333. aminosaváig terjedő folytonos szekvencia legalább egy részével azonos olyan szekvencia, amelyben a ΟΙ 638-tól Υ-2332-ig terjedő összes aminosav legfeljebb körülbelül 25%-a deletált, és az illető szekven45 cia lényegében a Vili. faktor egész C-terminális régióját tartalmazza.
  2. 2. Egy 1. igénypont szerinti protein, amelyben
    Nr egy olyan aminosavszekvencia, amelyben az említett Al A2-doménben lévő összes aminosav legfeljebb körülbelül 5%-a deletált.
  3. 3. Egy 1. igénypont szerinti protein, amelyben
    Nr egy lényegében a VIII. faktor 1 -töl 712. vagy 740. aminosavainak megfelelő aminosavszekvencia.
  4. 4. Egy 1. igénypont szerinti protein, amelyben
    CR egy olyan aminosavszekvencia, amelyben a Q1638-tól Υ-2332-ig terjedő összes aminosav legfeljebb körülbelül 10%-a deletált.
  5. 5. Egy 1. igénypont szerinti protein, amelyben
    CR egy lényegében VIII. faktor 1638-tól, 1649-től, 1669-től vagy 1690-től 2332-ig terjedő aminosavainak megfelelő aminosavszekvencia.
  6. 6. Egy 1. igénypont szerinti protein, amelyben
    Lr egy peptidkötés, P - R - V - A szekvencia vagy a VIII. faktor körülbelül 741-től körülbelül 867-ig és
    HU 211 503 A9 körülbelül 1563-tól körülbelül 1637-ig terjedő aminsavainak legalább egyike.
  7. 7. Egy 1. igénypont szerinti protein, amelyben Lr egy peptidkötés;
    Nr egy lényegében az 1-től 712-ig vagy 1-től 740-ig terjedő aminosavainak megfelelő aminosavszekvencia; és
    CRegy lényegében VIII. faktor 1638-tól 2332-ig, 1649-től 2332-ig, 1669-től 2332-ig vagy 1690-től 2332-ig terjedő aminosavainak megfelelő aminosavszekvencia.
  8. 8. Egy 1. igénypont szerinti protein, amelyben
    Lr P-R-V-A szekvencia;
    NRegy lényegében a VIII. faktor 1-tŐl 712-ig teijedő aminosavainak megfelelő aminosavszekvencia; és
    CR egy lényegében VIII. faktor 1638-tól 2332-ig terjedő aminosavainak megfelelő aminosavszekvencia.
  9. 9. Egy 1. igénypont szerinti protein, amelyben
    Lr egy lényegében VIII. faktor 741-től 867-ig és 1563tól 1637-ig terjedő aminosavai legalább egyikének megfelelő szekvencia;
    NRegy lényegében a VIII. faktor 1-től 740-ig teijedő aminosavainak megfelelő aminosavszekvencia; és
    CR egy lényegében VIII. faktor 1638-tól 2332-ig terjedő aminosavainak megfelelő aminosavszekvencia.
  10. 10. Egy 9. igénypont szerinti protein, amelyben
    Lr egy lényegében a 741-től 867-ig terjedő, az 1563tól 1637-ig terjedő aminosavakhoz kapcsolódó szekvencia.
  11. 11 Egy, az 1 - 10. igénypont bármelyikében meghatározott proteinek bármelyikét kódoló DNS szekvencia.
  12. 12. Egy expressziós vektor, amely a transzkripciós irányba haladva egy transzkripciós szabályozó szakaszt és egy gazdasejtben működő transzlációs iniciátor szakaszt. egy, az 1-10. igénypont valamelyikében meghatározott protein kódoló DNS szekvenciát és abban az illető gazdasejtben működőképes transzlációs és transzkripciós terminátor szakaszokat tartalmaz, amelyben az említett DNS szekvencia expressziója az említett iniciációs és terminátor szakaszok szabályozzák.
  13. 13. Egy 12. igénypont szerinti expressziós vektor, amelyben az említett transzkripciós szabályozó szakasz egy RSV-LTR promotertől 5’-irányban tandem kapcsolódó SV40 korai promotert tartalmaz.
  14. 14. A pCLB201, pCLB202, pCLB203, pCLB208, pCLB209, pCLB210, pCLB212 vagy pCLB881 expressziós vektor.
  15. 15. Egy transzformált gazdasejt és utódja, amely egy olyan expressziós vektort tartalmaz, amelyben a transzkripció irányába haladva egy gazdasejtben működőképes transzkripciós szabályozó szakasz és egy transzlációs iniciációs szabályozó szakasz; egy, az ΙΙΟ. igénypontok bármelyikében meghatározott proteinek valamelyikéi kódoló DNS szekvencia; és abban az említett gazdasejtben működőképes transzlációs és transzkripciós termintor szakaszok vannak, amelyben az említett DNS szekvencia expressziója az említett iniciációs és terminációs szakaszok szabályozzák.
  16. 16. Egy 15. igénypont szerinti transzformált gazdasejt és utódja, amely sejt egy emlős sejt.
  17. 17. Egy 16. igénypont szerinti transzformált gazdasejt és utódja, amely sejt egy COS sejt, egy CHO sejt vagy egy Cl27 sejt.
  18. 18. Egy 15. igénypont szerinti transzformált gazdasejt és utódja, amely sejt egy prokarióta sejt vagy egy élesztősejt.
  19. 19. Egy 18. igénypont szerinti transzformált gazdasejt és utódja, amely sejt egy Bacillus vagy Kluyveromyces fajhoz tartozó sejt.
  20. 20. Eljárás egy protein előállítására, amely protein egy VIII. faktor deléciós mutáns, azzal jellemezve. hogy egy táptalajban tenyésztünk egy olyan gazdasejtet, amely a transzkripció irányába haladva egy, a gazdasejtben működőképes transzkripciós szabályozó szakaszt és egy transzlációs iniciációs szabályozó szakaszt, egy. az 1-10. igénypontok bármelyikében meghatározott proteinek valamelyikét kódoló DNS szekvenciát és abban a gazdasejtben működőképes transzlációs és transzkripciós terminátor szakaszokat tartalmazó expressziós vektort tartalmaz, amely gazdasejtben az illető DNS szekvencia expresszióját az említett iniciációs és terminációs szakaszok szabályozzák, és az említeti proteint izoláljuk.
  21. 21. Egy VIII. faktor hiány kórképet enyhítő készítmény, amely egy VIII. faktor deléciós mutáns proteinnek - amely protein az 1-10. igénypotok bármelyikében meghatározott - a kórképei enyhítő mennyiségét tartalmazza egy fiziológiásán elfogadható hordozóban.
HU95P/P00758P 1987-06-12 1995-07-04 Proteins with factor viii activity, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them HU211503A9 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP87201121 1987-06-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU211503A9 true HU211503A9 (en) 1995-11-28

Family

ID=8197627

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU883818A HU213300B (en) 1987-06-12 1988-06-13 Process for producing novel proteins with factor viii activity and pharmaceutical preparations containing them
HU95P/P00758P HU211503A9 (en) 1987-06-12 1995-07-04 Proteins with factor viii activity, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU883818A HU213300B (en) 1987-06-12 1988-06-13 Process for producing novel proteins with factor viii activity and pharmaceutical preparations containing them

Country Status (19)

Country Link
US (2) US5171844A (hu)
JP (1) JP2771827B2 (hu)
KR (1) KR970002915B1 (hu)
CN (1) CN1033760C (hu)
AT (2) ATE142691T1 (hu)
CA (1) CA1341208C (hu)
DE (2) DE3856505T2 (hu)
DK (1) DK172631B1 (hu)
ES (2) ES2169095T3 (hu)
FI (1) FI103731B1 (hu)
GR (1) GR3021545T3 (hu)
HU (2) HU213300B (hu)
IE (1) IE69026B1 (hu)
IL (1) IL86693A (hu)
NO (1) NO301121B1 (hu)
NZ (1) NZ224992A (hu)
PT (1) PT87721B (hu)
WO (1) WO1988009813A1 (hu)
ZA (1) ZA884216B (hu)

Families Citing this family (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595886A (en) * 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5422260A (en) * 1986-05-29 1995-06-06 Genetics Institute, Inc. -Legal Affairs Human factor VIII:c muteins
US6060447A (en) * 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
JPH0387173A (ja) * 1987-09-10 1991-04-11 Teijin Ltd ヒト活性化天然型ファクター８ｃの製造方法及びそれに用いる形質転換体
FR2657884B1 (fr) * 1990-02-05 1994-09-02 Tm Innovation Procede pour la preparation du facteur viii humain et d'analogues du facteur viii.
ATE177472T1 (de) * 1990-09-14 1999-03-15 Chiron Corp Expression von makrophagen-induzierbaren proteinen (mips) in hefezellen
US20060122376A1 (en) * 1991-02-07 2006-06-08 Chiron Corporation Protein complexes having factor VIII:C activity and production thereof
US5859204A (en) * 1992-04-07 1999-01-12 Emory University Modified factor VIII
US5888974A (en) * 1992-04-07 1999-03-30 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
SE504074C2 (sv) * 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
US5576291A (en) * 1993-09-13 1996-11-19 Baxter International Inc. Activated factor VIII as a therapeutic agent and method of treating factor VIII deficiency
AT403167B (de) * 1994-11-14 1997-11-25 Immuno Ag Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems
US5641655A (en) * 1994-11-30 1997-06-24 Zymogenetics, Inc. Methods for producing thrombopoietin polypeptides using a mammalian tissue plasminogen activator secretory peptide
WO1996039490A1 (en) * 1995-06-06 1996-12-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Organ function replacement compositions and methods of making and using the same
US7560107B2 (en) * 1996-06-26 2009-07-14 Emory University Modified factor VIII
CA2312291A1 (en) * 1997-12-05 1999-06-17 The Immune Response Corporation Novel vectors and genes exhibiting increased expression
US6200560B1 (en) * 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
US6221349B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Avigen, Inc. Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells
US6358703B1 (en) * 1998-12-10 2002-03-19 Bayer Corporation Expression system for factor VIII
EP1325681A1 (en) * 2001-12-11 2003-07-09 Société des Produits Nestlé S.A. Composition for promotion of bone growth and maintenance of bone health
AU2003241599A1 (en) * 2002-05-22 2003-12-12 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for the treatment of hemophilia a
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
DK3211085T3 (da) 2003-09-30 2021-06-21 Univ Pennsylvania Klader af adeno-associeret virus (aav), sekvenser, vektorer indeholdende disse og anvendelser deraf
US7566701B2 (en) 2004-09-07 2009-07-28 Archemix Corp. Aptamers to von Willebrand Factor and their use as thrombotic disease therapeutics
BRPI0514984A (pt) 2004-09-07 2008-07-01 Archemix Corp aptámeros para o fator de von willebrand e sua utilização como terapêuticos para doença trombótica
WO2006029258A2 (en) 2004-09-07 2006-03-16 Archemix Corp. Aptamer medicinal chemistry
WO2006053299A2 (en) 2004-11-12 2006-05-18 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of fviii
DK2359867T3 (en) 2005-04-07 2015-01-05 Univ Pennsylvania A method for increasing an AAV vector function
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
EP3255152A1 (en) * 2007-12-27 2017-12-13 Baxalta GmbH Cell culture processes
JP5624891B2 (ja) * 2007-12-31 2014-11-12 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ ヒト血液凝固因子を発現するトランスジェニック非ヒト動物
MX362028B (es) 2009-02-03 2019-01-04 Amunix Pharmaceuticals Inc Polipeptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos.
WO2011017414A2 (en) 2009-08-04 2011-02-10 Baxter International Inc. Transgenic mouse lacking endogenous fviii and vwf - a model of hemophilia a
AU2010290077C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
ES2880038T3 (es) 2009-12-06 2021-11-23 Bioverativ Therapeutics Inc Polipéptidos quiméricos e híbridos de factor VIII-Fc, y métodos de uso de los mismos
CA2793633A1 (en) 2010-03-29 2011-10-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
MX2013000301A (es) 2010-07-09 2013-05-09 Biogen Idec Hemophilia Inc Factores quimericos de coagulacion.
WO2012006623A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
SG10201601110VA (en) 2011-02-17 2016-03-30 Univ Pennsylvania Compositions and methods for altering tissue specificity and improving aav9-mediated gene transfer
PL2717898T3 (pl) 2011-06-10 2019-06-28 Bioverativ Therapeutics Inc. Związki o działaniu prokoagulacyjnym i sposoby ich stosowania
RS58578B1 (sr) 2011-07-08 2019-05-31 Bioverativ Therapeutics Inc Faktor viii himernih i hibridnih polipeptida i postupci za njihovu upotrebu
US10656167B2 (en) 2011-07-25 2020-05-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Assays to monitor bleeding disorders
CA2850579A1 (en) 2011-10-18 2013-04-25 Carsten Horn Method for improving the stability of purified factor viii after reconstitution
EP3453402B1 (en) 2012-01-12 2021-07-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Reducing immunogenicity against factor viii in individuals undergoing factor viii therapy
BR112014017165B1 (pt) 2012-01-12 2023-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica compreendendo uma proteína de fator viii, composição farmacêutica, e seus usos
EP3549953A1 (en) 2012-02-15 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
ES2771208T3 (es) 2012-02-15 2020-07-06 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
CN104427995A (zh) 2012-06-08 2015-03-18 比奥根艾迪克Ma公司 嵌合凝血因子
CA2875246A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant compounds
EP2870250B2 (en) 2012-07-06 2022-06-29 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
CN110054699A (zh) 2012-07-11 2019-07-26 比奥贝拉蒂治疗公司 具有xten和血管性血友病因子蛋白的因子viii复合物、及其用途
EP2877202A4 (en) 2012-07-25 2016-06-01 Biogen Ma Inc BLOOD FACTOR MONITORING TEST AND USES THEREOF
EP2908847B1 (en) 2012-10-18 2022-03-30 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
WO2014070953A1 (en) 2012-10-30 2014-05-08 Biogen Idec Ma Inc. Methods of Using FVIII Polypeptide
ES2959747T3 (es) 2013-02-15 2024-02-28 Bioverativ Therapeutics Inc Gen del factor VIII optimizado
AU2014228938B2 (en) 2013-03-15 2019-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX polypeptide formulations
LT2968477T (lt) 2013-03-15 2020-03-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Faktoriaus viii polipeptido kompozicijos
US9719106B2 (en) 2013-04-29 2017-08-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and uses thereof
CN105392495A (zh) 2013-06-28 2016-03-09 比奥根Ma公司 具有xten的凝血酶可裂解连接子和其用途
US10947269B2 (en) 2013-08-08 2021-03-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Purification of chimeric FVIII molecules
WO2015023891A2 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
ES2967617T3 (es) 2013-12-06 2024-05-03 Bioverativ Therapeutics Inc Herramientas de farmacocinética poblacional y sus usos
CN106456718A (zh) 2014-01-10 2017-02-22 比奥根Ma公司 因子viii嵌合蛋白及其用途
KR102382402B1 (ko) 2014-02-04 2022-04-01 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온 교환 크로마토그래피의 용도
CN105017410B (zh) * 2014-04-18 2018-06-08 北京诺思兰德生物技术股份有限公司 一种b区部分缺失型重组人凝血因子ⅷ
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
US10058624B2 (en) 2015-04-16 2018-08-28 Emory University Recombinant promoters and vectors for protein expression in liver and use thereof
EA201890423A1 (ru) 2015-08-03 2018-07-31 Биовератив Терапьютикс Инк. Слитые белки фактора ix, способы их получения и применения
US10189889B2 (en) 2015-11-13 2019-01-29 Baxalta Incorporated Viral vectors encoding recombinant FVIII variants with increased expression for gene therapy of hemophilia A
TWI777175B (zh) 2015-11-13 2022-09-11 日商武田藥品工業股份有限公司 用於ａ型血友病基因治療之編碼表現增加之重組ｆｖｉｉｉ變異體之病毒載體
LT3411478T (lt) 2016-02-01 2022-09-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimizuoti viii faktoriaus genai
CN109790529A (zh) 2016-06-24 2019-05-21 财团法人牧岩生命科学研究所 包含FVIII和vWF因子的嵌合蛋白及其用途
BR112019011115A2 (pt) 2016-12-02 2019-10-01 Bioverativ Therapeutics Inc métodos para tratar artropatia hemofílica usando fatores de coagulação quiméricos
BR112019011198A2 (pt) 2016-12-02 2019-12-17 Bioverativ Therapeutics Inc métodos de indução de tolerância imune a fatores de coagulação
TW201920255A (zh) 2017-08-09 2019-06-01 美商生物化學醫療公司 核酸分子及其用途
KR101952102B1 (ko) * 2017-12-07 2019-02-26 주식회사 지앤피바이오사이언스 단백질 발현량이 증대된 인자 ⅷ 변이체 발현벡터
WO2019152692A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Bioverativ Therapeutics, Inc. Use of lentiviral vectors expressing factor viii
IL312315A (en) 2018-04-04 2024-06-01 Sigilon Therapeutics Inc Implantable particles and related methods
JP2021523878A (ja) 2018-05-18 2021-09-09 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 血友病ａを処置する方法
MX2021000582A (es) 2018-07-16 2021-04-12 Baxalta Inc Terapia genica de hemofilia a mediante el uso de vectores virales que codifican variantes del factor viii (fviii) recombinantes con mayor expresion.
BR112021002017A2 (pt) 2018-08-09 2021-05-11 Bioverativ Therapeutics Inc. moléculas de ácido nucleico e usos das mesmas para terapia genética não viral
UY38389A (es) 2018-09-27 2020-04-30 Sigilon Therapeutics Inc Dispositivos implantables para terapia celular y métodos relacionados
TW202039546A (zh) 2019-01-16 2020-11-01 美商巴克斯歐塔公司 用於a型血友病基因治療之編碼表現增加之重組fviii變異體的病毒載體
EP3736286A1 (en) 2019-05-09 2020-11-11 Biotest AG Single chain factor viii molecule
TW202115127A (zh) 2019-06-19 2021-04-16 美商百歐維拉提夫治療公司 治療血友病及低骨質密度之方法及組成物
JP2023506171A (ja) 2019-12-12 2023-02-15 武田薬品工業株式会社 発現が上昇した組換えｆｖｉｉｉバリアントをコードするウイルスベクターを使用する、血友病ａの遺伝子療法
US20240043494A1 (en) 2020-08-07 2024-02-08 Amicus Therapeutics, Inc. Vesicle Targeting Proteins And Uses Of Same
CN117858895A (zh) 2021-06-14 2024-04-09 武田药品工业株式会社 使用表达增强的编码重组fviii变体的病毒载体的血友病a基因疗法
TW202323274A (zh) 2021-08-23 2023-06-16 美商百歐維拉提夫治療公司 優化因子viii基因
CN118019758A (zh) 2021-09-30 2024-05-10 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 编码免疫原性降低的因子viii多肽的核酸
WO2024081309A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Sigilon Therapeutics, Inc. Engineered cells and implantable elements for treatment of disease

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4886876A (en) 1983-03-31 1989-12-12 Scripps Clinic And Research Foundation Factor VIII coagulant polypeptides
US4657894A (en) 1983-03-31 1987-04-14 Scripps Clinic & Research Foundation New factor VIII coagulant polypeptides
US4857635A (en) 1983-03-31 1989-08-15 Scripps Clinic And Research Foundation Factor VIII coagulant polypeptides and monoclonal antibodies tof them
US5004804A (en) * 1984-01-12 1991-04-02 Nordisk Gentofte Method and composition for preparation of factor VIIIC
US4965199A (en) * 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
FI86885C (fi) * 1984-04-20 1992-10-26 Genentech Inc Foerfarande foer framstaellning av human rekombinantfaktor viii och nukleinsyrasekvenser och vektorer anvaend daertill
SE8501050D0 (sv) 1985-03-05 1985-03-05 Kabivitrum Ab Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof
US4868112A (en) * 1985-04-12 1989-09-19 Genetics Institute, Inc. Novel procoagulant proteins
US4769336A (en) 1985-05-24 1988-09-06 Scripps Clinic And Research Foundation Treatment of factor VIII inhibitors
KR910006424B1 (ko) * 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
FI98829C (fi) * 1986-01-27 1997-08-25 Chiron Corp Menetelmä rekombinoidun proteiinikompleksin valmistamiseksi, jolla on humaanitekijä VIII:C-aktiivisuutta
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5451521A (en) * 1986-05-29 1995-09-19 Genetics Institute, Inc. Procoagulant proteins
US5422260A (en) 1986-05-29 1995-06-06 Genetics Institute, Inc. -Legal Affairs Human factor VIII:c muteins
EP0251843A1 (fr) 1986-06-06 1988-01-07 Transgene S.A. Procédé de préparation de facteur VIII à partir de cellules de mammifères
US5610278A (en) 1986-06-24 1997-03-11 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
IL83192A (en) * 1986-07-18 1992-11-15 Gist Brocades Nv Method for the preparation of proteins with factor viii activity by microbial host cells;expression vectors,host cells,antibodies
IL84168A0 (en) * 1986-10-15 1988-03-31 Rorer Int Overseas Human factor viii-c analogs,process for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing the same
US4980456A (en) * 1987-04-06 1990-12-25 Scripps Clinic And Research Foundation Recombinant factor VIIIC derived fragments
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
JPH025890A (ja) 1988-06-24 1990-01-10 Chemo Sero Therapeut Res Inst ニワトリのβ−アクチンプロモーターを用いたヒトファクター８Ｃの製造方法
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning

Also Published As

Publication number Publication date
DK58789A (da) 1989-02-09
US5171844A (en) 1992-12-15
PT87721A (pt) 1988-07-01
IL86693A0 (en) 1988-11-30
NO890587L (no) 1989-02-10
DE3855523D1 (de) 1996-10-17
KR970002915B1 (ko) 1997-03-12
DE3855523T2 (de) 1997-02-06
FI103731B (fi) 1999-08-31
DE3856505T2 (de) 2002-08-08
IE69026B1 (en) 1996-08-07
ES2094111T3 (es) 1997-01-16
JP2771827B2 (ja) 1998-07-02
PT87721B (pt) 1992-10-30
JPH02500484A (ja) 1990-02-22
ES2169095T3 (es) 2002-07-01
CN1030609A (zh) 1989-01-25
FI890643A0 (fi) 1989-02-10
DE3856505D1 (de) 2002-01-10
HU213300B (en) 1997-05-28
NO301121B1 (no) 1997-09-15
CN1033760C (zh) 1997-01-08
FI103731B1 (fi) 1999-08-31
WO1988009813A1 (en) 1988-12-15
GR3021545T3 (en) 1997-02-28
NZ224992A (en) 1991-07-26
CA1341208C (en) 2001-03-27
US6316226B1 (en) 2001-11-13
ATE209679T1 (de) 2001-12-15
IL86693A (en) 1994-06-24
DK58789D0 (da) 1989-02-09
IE881755L (en) 1988-12-12
ATE142691T1 (de) 1996-09-15
ZA884216B (en) 1989-02-22
FI890643A (fi) 1989-02-10
NO890587D0 (no) 1989-02-10
DK172631B1 (da) 1999-03-22
KR890701739A (ko) 1989-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU211503A9 (en) Proteins with factor viii activity, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US6346513B1 (en) Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
EP0506757B1 (en) A recombinant human factor viii derivative
US5422260A (en) Human factor VIII:c muteins
US5595886A (en) Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
EP0672138B1 (en) Chimeric procoagulant proteins
EP0442961B1 (en) Hybrid procoagulant proteins
US5451521A (en) Procoagulant proteins
EP0294910B1 (en) Novel proteins with factor VIII activity, process for their preparation using genetically engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
JP2771129B2 (ja) 第ｖｉｉｉ：ｃ因子活性を有するタンパク質複合体およびその製法
AU1209695A (en) Hybrid human/animal factor viii
AU627150B2 (en) Novel proteins with factor viii activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them