NO175434B - Rekombinant DNA-vektor, pattedyrcelle transformert med denne samt fremgangsmåte for fremstilling av human plasminogenaktivator - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en ny rekombinant DNA-vektor, pattedyrceller transformert med det rekombinante DNA,

og en fremgangsmåte for fremstilling av human vevsplasminogenaktivator ved anvendelse av pattedyrcellene.

Ved behandling av trombose anvendes hyppig urokinase

og streptokinase av praktiske grunner. Imidlertid innbefatter disse problemer med hensyn til blødning og antigenisitet og har en svak affinitet overfor fibrin.

Enn videre fremstilles urokinase hovedsakelig ved ekstra-hering av uren urokinase fra human urin hvoretter dette renses. Imidlertid har denne fremstillingsprosess den ulempe at det er vanskelig å sikre en konstant tilførsel av human urin, og frem-gangsmåtetrinnene er enn videre ikke hygieniske.

Følgelig er forskjellige forsøk blitt gjort for å ut-vikle substituttlegemidler. I foreliggende situasjon er imidlertid intet trombolyttisk middel som kan løse de ovenfor beskrevne problemer og som er tilfredsstillende ut fra et sikkerhetssynspunkt og masseproduksjon, tilgjengelig for praktiske formål.

Som et substitutt for konvensjonelle trombolyttiske midler slik som urokinase og lignende, er oppmerksomheten blitt rettet mot vevsplasminogenaktivator (heretter angitt som t-PA) som spiller en hovedrolle ved in vivo fibrinolysereaksjonen og som har en høy affinitet overfor fibrin.

Det finnes et utall velkjente metoder for fremstilling av t-PA. Disse innbefatter en celledyrkningsprosess under anvendelse av Bowes melanoma avledet fra ondartede melanosarcoma-celler som er en type cancer, og en fremgangsmåte omfatter trinn for isolering av et DNA-fragment inneholdende den DNA-sekvens som koder for t-PA fra Bowes melanoma, innarbeidelse av dette DNA-fragment i en ekspresjonsvektor under dannelse av et rekombinant DNA, transformering av vertceller med dette rekombinante DNA, og dyrking av de transformerte vertceller for å bevirke at disse produserer t-PA.

Mekanismen ved carcinogenesis er imidlertid hittil

ikke fullt ut blitt belyst ut fra et vitenskapelig synspunkt,

og følgelig er ikke noe definitivt svar blitt gitt med hensyn til sikkerheten ved trinnene i de ovenfor beskrevne fremgangs-måter under anvendelse av cancerceller, og sikkerheten med hensyn til det resulterende t-PA for anvendelse som legemiddel. Av disse grunner er en omhyggelig og grundig undersøkelse fremdeles nødvendig ved utøvelse av de ovenfor beskrevne frem-gangsmåter og ved anvendelse av det derved fremstilte t-PA.

I lys av de ovenfor beskrevne problemer innen den kjente teknikk er det foretatt et grundig studium med spesiell opp-merksomhet rettet mot humane, normale celler som kan eliminere risikoen forbundet med anvendelse av cancer-avledede cellelinjer slik som Bowes melanoma, og forskning på humane, normale celler som kan anvendes for å oppnå det DNA som koder for t-PA.

Som et resultat av dette er det funnet at en cellelinje bestående av humane, normale celler som er sterkt produktive med hensyn til t-PA, kan avledes fra humane, normale celler, og at i henhold til rekombinant DNA-teknologi under anvendelse av denne cellelinje kan det konstrueres en ny DNA-sekvens inneholdende den DNA-sekvens som koder for t-PA, denne DNA-sekvens kan innarbeides i en repliserbar vektor som mulig-gjør ekspresjon av t-PA, og det således dannede rekombinante DNA kan anvendes for å oppnå transformerte vertceller som er anvendbare ved fremstilling av t-PA. Foreliggende oppfinnelse er utviklet på basis av disse oppdagelser.

Et mål med foreliggende oppfinnelse er følgelig å tilveiebringe den DNA-sekvens som koder for t-PA som kan løse de ovenfor beskrevne problemer med konvensjonelle legemidler slik som urokinase og lignende, som kan eliminere risikoen forbundet med anvendelse av celler (f.eks. Bowes melanoma) avledet fra cancerceller, og som kan hensiktsmessig anvendes ved masseproduksjon av t-PA; et rekombinant DNA som innbefatter DNA-sekvensen, og vertceller transformert med det rekombinante DNA.

Oppfinnelsen angår således en rekombinant DNA-vektor, hvilken vektor er kjennetegnet ved at den omfatter

(a) en del som er i stand til selvreplikasjon i pattedyrceller, (b) en promoter valgt fra musemetallothionein-promoter og human metallothioneinpromoter, og (c) DNA-fragment inneholdende sekvensen som koder for human vevsplasminogenaktivator (t-PA) avledet fra en human fosterepiteliumcelle, hvilket t-PA omfatter 530 aminosyrer, hvis N-ende begynner med glycin, hvori en streng av angitte DNA-sekvens har følgende basesekvens:

hvilket DNA-fragment er operativt kjedet til promoteren.

Oppfinnelsen angår enn videre en pattedyrcelle, hvilken pattedyrcelle er kjennetegnet ved at den er transformert med det rekombinante DNA, og er i stand til å uttrykke det gitte gen.

Oppfinnelsen angår sluttelig en fremgangsmåte for fremstilling av human vevsplasminogenaktivator hvori minst 90 % av denne er enkjedet, hvor forholdet mellom type I-tPA:type II-tPA er tilnærmet 7:3, og hvis DNA stammer fra human fosterepiteliumcelle og har den sekvens som er angitt ovenfor, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: A) dyrkning av pattedyrcellen uten et metallion som en induktor for musemetallothioneinpromoteren eller den humane metallothioneinpromoter; og B) dyrkning av pattedyrcellen i nærvær av metallionet,. og utvinning av den nevnte humane vevsplasminogenaktivator fra kulturmediet til nevnte transformerte pattedyrcelle.

Fig. 1 illustrerer en DNA-basesekvens inneholdende DNA-basesekvensen som koder for human vevsplasminogenaktivator fremstilt av humane, normale celler, og indikerer at denne DNA-basesekvens inneholder en 5' utranslatert region, en enkel sekvens, DNA-sekvensen som koder for t-PA, og en 3' utranslatert region;

fig. 2 er et diagram som illustrerer prosedyren for fremstilling av pMT-l-plasmidet beskrevet i eksempel 2;

fig. 3 er et diagram som illustrerer prosedyren for fremstilling av phT-l-plasmidet beskrevet i eksempel 3,

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan en DNA-sekvens inneholdende den DNA-sekvens som koder for humant t-PA produsert av humane, normale celler, erholdes ved anvendelse av hvilke som helst av forskjellige cellestammer avledet fra humane, normale celler, bestående av humane, normale celler, og med evne til å produsere t-PA.

Slike cellestammer kan erholdes ved dyrkning av forskjellige typer av humane, normale celler (fortrinnsvis humane epidermale fosterceller, pulmonare fosterceller, renale fosterceller og lignende) og screening av disse med hensyn til evnen til å produsere t-PA. Blant andre kan det fortrinnsvis anvendes cellestammer som har større evne til å produsere t-PA og består av humane, normale diploide celler med diploidtall (2n = 46) av kromosomer og som har gjennomgått et endelig antall av subkulturer.

Et eksempel på screeningsteknikk er metoden ifølge

A. Granelli-Piperno og E. Reich [J. Exp., 148, 223 (1978)] som anvendt i de etterfølgende eksempler. Denne metode er karakterisert ved at fibrinolytisk aktivitet på en fibrinplate anvendes som et indeks for evnen til å produsere t-PA.

For å oppnå DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen fra en cellestamme med evne til å produsere t-PA, kan det anvendes hvilke som helst av forskjellige genteknikker. Den prosedyre som her er utviklet og som vil bli beskrevet spesifikt i det etterfølgende, er spesielt anvendbar.

Rensing og størrelsesfraksjonering av mRNA

Totalt RNA ekstraheres først fra celler med evne til å produsere humant t-PA. Deretter anvendes oligo(dT)cellulose til å separere og gjenvinne poly(A) pluss mRNA fra totalt RNA. Det resulterende mRNA underkastes agarosegelelektroforese og fraksjoneres derved i henhold til størrelsen. De resulterende fraksjoner mikroinjiseres separat i oocyter av Xenopus laevis, som dyrkes separat i Barths medium [J.B. Gurdon, The Control of Gene Expression in Animal Development, Oxford University Press, 1974],

Etter endt dyrkning utvelges den fraksjon inneholdende det ønskede mRNA som har en del svarende til DNA-sekvensen som koder for humant t-PA ved bestemmelse av den humane t-PA-aktivitet av hvert kulturmedium i henhold til den ovenfor angitte metode under anvendelse av en fibrinplate. Nærvær av det ønskede mRNA i denne fraksjon kan bekreftes f.eks. ved det faktum at hvis både en prøve av kulturmediet av oocyten med denne fraksjon innført deri, og et anti-humant t-PA-serum an-bringes på en fibrinplate, hindres fibrinolysereaksjonen på fibrinplaten av anti-humant t-PA-serum.

Deretter erholdes den ønskede DNA-sekvens ved anvendelse av den utvalgte fraksjon inneholdende mRNA som har en del svarende til den ønskede DNA-sekvens som koder for t-PA. For dette formål anvendes den ovenfor angitte fraksjon til å syntetisere cDNA svarende til det mRNA som er til stede i fraksjonen og cDNA inneholdende den ønskede DNA-sekvens velges fra disse cDNA ved hjelp av en DNA-prøve. Denne prosedyre vil bli mer fullstendig beskrevet i det etterfølgende.

Konstruksjon av en cDNA- samling inneholdende t- PA- genet

mRNA-fraksjonen som utviser human t-PA-aktivitet og utvalgt på den ovenfor beskrevne måte, anvendes for å syntetisere cDNA svarende til de mRNA som er til stede i fraksjonen. Dette kan f.eks. utføres ved metoden ifølge Gubler og Hoffman

[U. Gubler og B.J. Hoffman, Gene, 25, 263 (1983)]. De således erholdte cDNA innføyes i plasmidet pUCl3.

Blandingen av pUC13-plasmidet med forskjellige cDNA innføyd deri, innføres deretter i E. coli HB101 (ATCC 33694). Ampicillin-resistente kolonier erholdes således.

Som plasmid (vektor) i hvilken cDNA innføyes, og som vertbakterie i hvilken plasmidet innføres, kan et hvilket som helst annet plasmid (vektor) og vertbakterie utvelges etter behov, forutsatt at de kan tilveiebringe en ønsket cDNA-klon inneholdende den DNA-sekvens som koder for humant t-PA.

Fra hver av de således erholdte kolonier overføres en del av cellene til et Whatman 541 filter. Deretter immobiliseres i henhold til metoden ifølge Gergen et al. [J.P. Gergen et al., Nucleic Acids Res., 1_, 2115 (1979)], det DNA som er avledet fra hver koloni på filteret under dannelse av en cDNA-samling.

Fremstilling av en DNA- sonde

Først dyrkes de tidligere utvalgte humane, normale celler som kan fremstille t-PA i kultur. Deretter gjenvinnes i henhold til den metode som er beskrevet i norsk patentsøknad 842468, det således fremstilte humane t-PA fra kulturmediet og renses for anvendelse ved fremstilling av en DNA-sonde.

For å fremstille en sonde bestemmes partielle aminosyresekvenser av dette humane t-PA ved partiell hydrolyse av det humane t-PA-protein med trypsin, hydrolysatene separeres og renses, og deres aminosyresekvenser analyseres fra amino-enden. Deretter utvelges den optimale region for fremstilling av en sonde fra aminosyresekvensene bestemt på den ovenfor beskrevne måte. Som den optimale region har foreliggende oppfinnere valgt sekvensdelen av Tyr-Cys-Trp-Cys-Asn.

Deretter syntetiseres 8 typer av 14-nucleotidoligomerer (14-merer) som er komplementære til DNA-sekvensen som koder for den ovenfor angitte aminosekvens , dvs. 5 1 -dTT >A* CACCA ^A. CA .A TA,

i henhold til fast-fase fosfotriestermetoden [Crea et al., Nucleic Acids Res., 8_, 2331 (1980)].

Isolering og identifisering av bakterielle kloner inneholdende t- PA cDNA- sekvensen

En blanding av de åtte typer av 14-nucleotidoligomerer (14-merer) erholdt på den ovenfor beskrevne måte, behandles

med T4-polynucleotidkinase for å merke deres 5<1->ende med 3 2P. Denne blanding som tjener som en sonde, hybridiseres til den tidligere fremstilte cDNA-samling.

Ifølge den metode som er beskrevet av Birnboim og Doly [Nucleic Acid Res., 1_, 1513 (1979)], isoleres plasmid-DNA fra koloniene som utgjør kildene for DNA som utviser en positiv hybridiseringsreaksjon. Basesekvensen av dets cDNA-innsetning bestemmes ved metoden ifølge Maxara og Gilbert [Proe. Nati.

Acad. Sei. U.S.A., 74.' 560 (1977)]. Nærvær av den ønskede DNA-sekvens i cDNA-innsetningen av dette isolerte plasmid-DNA kan bekreftes ved sammenligning av aminosyresekvensen avledet fra den ovenfor bestemte basesekvens av cDNA-innsetningen med den tidligere bestemte aminosyresekvens av renset, humant t-PA.

cDNA isolert og identifisert på den ovenfor beskrevne måte, inneholder den DNA-sekvens som koder for humant t-PA og er blitt konstruert av foreliggende oppfinnere for første gang. Tilveiebringelse av en slik ny DNA-sekvens har gjort det

mulig å fremstille humant t-PA under anvendelse av vertceller transformert med et rekombinant DNA inneholdende den DNA-sekvens som koder for humant t-PA, og som kan løse de ovenfor beskrevne problemer som den kjente teknikk er beheftet med. Denne fremgangsmåte for fremstilling av humant t-PA vil bli mere detaljert beskrevet i det etterfølgende.

På basis av følgende oppdagelser omfatter de vertceller som anvendes ved foreliggende fremgangsmåte for fremstilling av humant t-PA, fortrinnsvis pattedyrceller.

Spesifikt ble hele aminosyresekvensen av humant t-PA som stammer fra humane, normale celler avledet fra den tidligere bestemte DNA-sekvens av humant t-PA. Ved undersøkelse av denne aminosyresekvens er det blitt antatt at det humane t-PA-molekyl har 4 steder til hvilke sukkerkjeder kan adderes.

I realiteten reduseres molekylvekten av humant t-PA til ca. 50.000 når en cellestamme som kan produsere humant t-PA,

dyrkes i nærvær av tunicamycin som er en antibiotisk substans som inhiberer addisjon av sukkerkjeder. Sukker er følgelig antatt å omfatte ca. 30% av molekylvekten. I betraktning av at addisjon av sukkerkjeder kan delta ved den stabile in vivo-funksjonering av enzymet, og at enzymet uten noen sukkerkjeder kan utvise antigenisitet in vivo, har man konkludert med at det ville være bedre å bevirke at det klonede, humane t-PA-gen uttrykkes i pattedyrceller og derved produsere den naturlige form av humant t-PA med sukkerkjeder tilsatt dertil. Av denne

grunn betraktes det som ønskelig å anvende pattedyrceller som verter -

Pattedyrcellene anvendt som verter, kan være valgt fra et utall av for tiden tilgjengelige etablerte cellelinjer av pattedyropprinnelse.

Foretrukne eksempler innbefatter muse L-celler; thymi-dinkinase-svekkede L-celler; dihydrofolatreduktase-svekkede, kinesiske hamsterovarie(CHO)-celler; muse-C127I-celler

(ATCC CRL1616); muse-NIH3T3-celler (ATCC CRL1658); muse-FM3A-celler; humane Hela-celler (ATCC CCL2); afrikanske umodne ape-COSl-celler (ATCC CCL1650); forskjellige typer av muse- og humane myelomaceller slik som muse-P3/NSl/l-Ag4-l (NS-1)-

celler (ATCC TIB18), muse-P3X63Ag8-celler (ATCC TIB9) og muse-J558-celler (ATCC TIB6); og lignende. Det skal forstås at de foregående celler bare er angitt av illustrative formål og at andre typer av pattedyrceller også kan anvendes.

Som ekspresjonsvektor i hvilken DNA-sekvensen som koder for humant t-PA inkorporeres, kan anvendes en hvilken som helst vektor som kan replisere innen anvendte vertceller og som kan transformere vertcellene slik at det muliggjøres ekspresjon av genet som koder for humant t-PA. Blant andre kan det fortrinnsvis anvendes vektorer inneholdende en promoterregion,

et ribosom-bindingssted, en termineringssekvens, et polyadenylert sted, en replikasjonsopprinnelse og et gen som tjener som en selekterbar markør når vertcellene transfiseres med vektoren.

Som promoterregion og ribosom-bindingssted tilstedeværende i de ovenfor angitte ekspresjonsvektorer, kan generelt anvendes de som er avledet fra virus av pattedyropprinnelse. Eksempelvis er de aktivatorregioner og ribosom-bindingssteder som utvises av papovavirus, adenovirus, retrovirus, humant cyto-megalovirus og lignende, egnet. Enn videre kan promoterregionen og ribosom-bindingsstedet tilstedeværende i en opp-strømsdel av gener avledet fra pattedyrceller, også anvendes. I dette tilfelle er det fordelaktig å anvende promoterregionen av et sterkt uttrykt gen fordi det generelt antas at en slik promoter også tjener som en kraftig promoter for andre gener. Eksempelvis synes det fordelaktig å anvende promoterregionene og ribosom-bindingsstedene av mus, humane og andre pattedyr-gener for metallothionein, immunoglobuliner, insulin, albumin og lignende.

Som termineringssekvens og polyadenylert sted kan det likeledes anvendes de som er avledet fra virus og forskjellige gener.

Med hensyn til replikasjonsopprinnelse kan vektoren konstrueres til å inneholde en eksogen opprinnelse som kan være avledet fra et virus som ovenfor beskrevet, i særdeleshet okse-papillomavirus (heretter angitt som BPV) eller apevirus 40 (heretter angitt som SV 40). Alternativt kan den ønskede ekspresjonsvektor inkorporeres som et fragment i et kromosom av vertcellen for å utnytte replikasjonsmekanismen av kromo-somet.

Genet som tjener som en selekterbar markør når vertceller transfiseres med vektoren, er ikke alltid nødvendig. Imidlertid er dets nærvær fordelaktig ved at de transformerte celler kan utvelges hurtig og nøyaktig.

Gener anvendt for dette formål, innbefatter f.eks. thymidinkinasegenet (TK) av herpes simplex virus (HSV) og dihydrofolatreduktasegenet (DHFR) av mus. I disse tilfeller skal en thymidinkinasesvekket (tk~)-stamme eller en dihydrofolat-reduktasesvekket (dhfr )-stamme anvendes som vertceller.

I tillegg kan det også anvendes xanthin-guanin-fosfo-ribosyltransferasegenet (Ecogpt) av Escherichia coli som utviser resistens overfor mycofenolsyre i pattedyrceller, og det neomycinresistente gen (neo) avledet fra transposon 5 som utviser resistens overfor den antibiotiske substans G418 i pattedyrceller.

Ekspresjonsvektoren som fortrinnsvis inneholder de ovenfor beskrevne forskjellige regioner, kan konstrueres i henhold til velkjente rekombinante genteknikker.

For å transfisere vertceller med vektoren ifølge oppfinnelsen inneholdende DNA-sekvensen som koder for humant t-PA, kan anvendes en hvilken som helst av forskjellige metoder slik som behandling med calcimfosfat [F.L. Graham og A.J. Van der Eb, Virology, _5_2, 546 (1978)], injeksjon i kjernen [A. Graessman

et al., Methods in Enzymology, 6_5, 816 (1980), Academic Press, New York], protoplastfusjon [W. Schaffner, Proe. Nati. Acad.

Sei. USA, 2163 (1980)], innføring ved elektrisk sjokk

[H. Potter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81, 7161 (1984)], behandling med DEAE-dextran [P. Sheldrick et al., Proe. Nati.

Acad. Sei. USA, 70, 3621 (1973) ] og lignende.

Etter at transfeksjonen er utført i henhold til hvilke som helst av de ovenfor beskrevne metoder, dyrkes de resulterende, transformerte celler separat. Deres produksjon av humant t-PA som stammer fra humane, normale celler, kan bekreftes ved bestemmelse av den humane t-PA-aktivitet av supernatanten av slike kulturer.

Således kan t-PA som stammer fra humane, normale celler, masseproduseres ved dyrkning av de transformerte celler slik at disse bevirkes til å utskille humant t-PA i dyrkningsmediet. Enkelte typiske utførelsesformer av denne fremgangsmåte for fremstilling av humant t-PA, er mere spesifikt beskrevet i de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1 (Konstruksjon av en DNA-sekvens som inneholder den DNA-sekvens som koder for humant t-PA] 1. Screening av humane, normale celler som er produktive når det gjelder humant t-PA.

De forskjellige typer av humane, normale celler oppført i tabell 1, ble underkastet en screeningsprosedyre. Celle-linjene tilveiebragt av foreliggende oppfinnere, ble erholdt som følger: En bit av vevskilden ble finskåret med saks eller lignende og ble deretter oppsluttet med trypsin, collagenase, dispase og lignende under dannelse av dispergerte og frigitte celler. Disse celler ble suspendert i et dyrkningsmedium og anbragt på plater. Deretter ble kloner som utviste aktiv vekst, isolert og gjentatte ganger subdyrket. Sluttelig ble stammer som kunne stabilt subdyrkes, utvalgt, og ble anvendt som normale cellelinjer for screeningsformål. De cellelinjer som skulle screenes, ble dyrket inntil en sammenflytende til-stand ble oppnådd. Under anvendelse av 15 ul av supernatanten av hver kultur ble den humane t-PA-aktivitet av supernatanten bestemt. Ved denne bestemmelse ble 15 pl av supernatanten anbragt på en fibrinplate fremstilt ved den ovenfor angitte metode ifølge Granelli-Piperno og Reich. Etter at denne fibrinplate hadde stått ved 37°C i 16 timer, ble den resulterende oppløsningssone målt. På samme tidspunkt ble også en prøve av supernatanten blandet med et anti-urokinaseserum og en prøve av supernatanten blandet med et anti-humant t-PA-serum fremstilt. Oppløsningssonene produsert av disse prøver, ble også målt og sammenlignet med oppløsningssonen produsert av prøven ikke inneholdende noe antiserum.

En standardkurve ble konstruert under anvendelse av renset urokinase som standard, og oppløsningssonene produsert av dets fortynnede løsninger, ble målt. Under anvendelse av denne standardkurve ble fibrinolyttisk aktivitet uttrykt ved internasjonale urokinaseenheter. Enkelte av de screenede celler og deres humane t-PA-aktiviteter og urokinaseaktiviteter er vist i tabell 1. Således ble cellelinje MTC017 funnet å produsere og utskille humant t-PA i relativt store mengder slik at denne cellelinje ble valgt som kildemateriale for isolering av det humane t-PA-gen. Denne cellestamme var avledet fra humant fosterepitel og besto av normale, diploide celler med diploidtall (2n = 46) av kromosomer og som hadde gjennomgått ca. 80 subkulturer.

Screening av humane, normale celler som er produktive når det gjelder humant t- PA

2. Rensing og størrelsesfraksjonering av mRNA.

Under anvendelse av Eagles minimale, essensielle medium inneholdende 10% FCS, ble cellelinje MTC017 dyrket i store mengder for å oppsamle 5 x 10 o celler. De oppsamlede celler ble vasket med 200 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og ble deretter resuspendert i 20 ml av en lOmM tris-HCl bufferløsning (pH 8,6) inneholdende 10 mM KC1, l,5mM MgCl2 og 3mM dithio-threitol. Etter at cellene var lysert ved tilsetning av Nonidet<®>P-40 til suspensjonen (til en sluttkonsentrasjon på 0,5%), ble den resulterende løsning sentrifugert, og supernatanten inneholdende totalt RNA ble ytterligere renset ved ekstraksjon med fenol-kloroform.

Deretter ble natriumacetat tilsatt til den vandige fase til en konsentrasjon på 0,3M, og det totale RNA ble utfelt ved tilsetning av 2 volumer ethanol til løsningen. I henhold til metoden beskrevet av T. Maniatis et al. [TV Maniatis et al., Molecular Cloning, 197-198, Cold Spring Harbor Laboratory,

New York (1982)], ble det således dannede bunnfall behandlet med oligo(dT)cellulose for å separere mRNA fra det totale RNA. Ved den ovenfor beskrevne metode ble 4-5 mg totalt RNA og

—- p

100-150 ug poly(A) pluss mRNA erholdt fra 5 x 10 dyrkede celler.

I henhold til metoden beskrevet av T. Maniatis et al.

[T. Maniatis et al., Molecular Cloning, 204-205, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)], ble poly(A) pluss mRNA erholdt på den ovenfor angitte måte, fraksjonert i lavtsmeltende agarosegel. Denne fraksjonering ble utført ved å behandle poly(A) pluss mRNA med methylkvikksølvhydroxyd, hvoretter det ble underkastet elektroforese i en flat plate av gel inneholdende 1,5% lavtsmeltende agarose, 50mM borsyre, 5mM natrium-borat og lOmM antriumsulfat. Etter endt elektroforese ble gelen nedsenket i en 0,1M dithiothreitolløsning i 30 minutter og ble deretter skivet opp i henhold til størrelsen av molekylvekten. 4 volumer 0,5M ammoniumacetat ble tilsatt til hver skive og ble oppvarmet til 65°C inntil gelen var oppløst. Deretter ble den resulterende løsning gjentatte ganger ekstrahert med fenol og med kloroform for å fjerne agarosekomponentene.

Til slutt ble mRNA-fraksjonen gjenvunnet ved utfelling med ethanol.

Ifølge den ovenfor beskrevne metode ifølge J.B. Gurdon ble deretter 50 ng av hver mRNA-fraksjon mikroinjisert inn i en oocytt av Xenopus laevis. Oocyttene med mRNA innført deri, ble anbragt i Barths medium og fikk stå ved 20°C i 2 4 timer. Deretter ble en prøve av hvert medium anbragt på en fibrinplate fremstilt ved den ovenfor beskrevne metode ifølge Granelli-Piperno og Reich. Denne fibrinplate ble inkubert ved 37°C i 16 timer, og den resulterende oppløsningssone ble målt. Sam-tidig ble en prøve av mediet blandet med et anti-humant t-PA-serum, også inkubert. mRNA-fraksjonen som ga den største opp-løsningssone og som gjennomgikk en delvis fortrengning av fibrinolytisk aktivitet i nærvær av anti-humant t-PA-serum, ble valgt. 3. Konstruksjon av en cDNA-samling inneholdende t-PA-genet.

Ifølge den ovenfor angitte metode ifølge Gubler og Hoffman ble 5 ug av fraksjonen valgt på den ovenfor beskrevne måte og inneholdende det mRNA som koder for t-PA anvendt for å fremstille dobbeltstrengede cDNA. Etter av deoxy(C)-rester var bundet til hvert cDNA, ble de resulterende cDNA behandlet med 1 ug av plasmidet pUC13 med deoxy(G)-rester bundet dertil på Pstl-stedet. Under anvendelse av den behandlende blanding ble E. coli HB101 (ATCC 33694) transformert under dannelse av 5000 ampicillin-resistente kolonier.

I henhold til metoden ifølge Gergen et al., ble en del av hver koloni overført til et Whatman 541 filter. Deretter ble DNA av hver koloni immobilisert til filteret ved at det ble underkastet en serie av behandlinger innbefattende alkali-behandling, nøytralisering, vasking og tørking.

4. Fremstilling av en DNA-probe.

Humant t-PA ble isolert fra human, normal cellestamme MTC017 i henhold til den metode som er beskrevet i norsk patent-søknad 842468, og omfattende en kombinasjon av ionebytter-kromatografi, affinitetskromatografi, gelfiltrering og lignende. Med det formål å fremstille en DNA-probe, ble partielle aminosyresekvenser av humant t-PA bestemt på følgende måte.

1 mg av renset humant t-PA ble oppløst i 3 ml 0,1M ammoniumbicarbonat (pH 7,5). Til den resulterende løsning ble tilsatt trypsin [behandlet med L-l-tosylamido-2-fenylethyl-klormethylketon (TPCK)] i et molarforhold på 100.000:1. Deretter ble partiell hydrolyse utført ved romtemperatur i 2 timer. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av diisopropyl-fluorfosfat (DFP) i en mengde lik 10. 000 ganger antall tilsatt mol av trypsin. Reaksjonsproduktet ble dialysert mot 5iriM maursyre og ble deretter frysetørket. Det frysetørkede protein ble deretter oppløst i 5 ml av en løsning inneholdende 0,56M tris-HCl (pH 8,6), 8M urea og 5mM EDTA. Til den resulterende løsning ble tilsatt 0,1 ml |3-mercaptoethanol for å redusere disulfidbindingene. Reaksjonen ble utført ved 45°C i 2 timer under en nitrogenatmosfære. Deretter ble de reduserte disul-fidbindinger carboxymethylert ved tilsetning av 1,0 ml av en løsning inneholdende 1,4M jodeddiksyre og IN NaOH. Etter henstand ved romtemperatur i 20 minutter ble reaksjonsblandingen dialysert ved romtemperatur mot vann inneholdende 0,01%

Tween<®> 80, og ble deretter frysetørket.

Det frysetørkede carboxymethylerte protein ble oppløst i 5 ml av en 0,1M ammoniumbicarbonat-bufferløsning (pH 7,2) inneholdende 0,1M ammoniumthiocyanat. Den resulterende løsning ble ført gjennom en Red-Sepharose<®> kolonne som var blitt ekvi-librert med samme bufferløsning. Etter at kolonnen var vasket med samme bufferløsning, ble det adsorberte protein eluert ved økning av konsentrasjonen av ammoniumthiocyanat lineært til 1,0M. Som et resultat av dette ble proteintopper erholdt i den uadsorberte fraksjon og den adsorberte fraksjon. Analysert ved SDS-acrylamidgelelektroforese ga hver av proteintoppene et enkelt proteinbånd med en molekylvekt på ca. 3 5.000.

Hver av proteintoppene ble oppsamlet, dialysert mot 0,1M ammoniumbicarbonat (pH 7,5) og ble deretter frysetørket.

Aminosyresekvensene av det rensede, humane t-PA erholdt fra en kultur av cellestammen MTC 017 og proteinene erholdt derfra på den ovenfor beskrevne måte, ble bestemt ved hjelp av en gassfase-proteinsekvenser (Applied Biosystem Co.).

For det rensede, humane t-PA ble sekvensen av N-terminale 3 8 aminosyrerester bestemt og ble funnet å innbefatte Gly-Ala-Arg-Ser-Tyr-Gln- i den N-terminale region. Aminosyresekvensen av den uadsorberte proteinfraksjon startet med Ile-Lys-Gly-Gly-Leu-, og den adsorberte proteinfraksjon hadde aminosyresekvensen Ser-Asn-Arg-Val-Glu-Tyr-Cys-Trp-Cys-Asn-Ser-Gly-Arg-. Det N-terminale Ser av denne adsorberte proteinfraksjon ble funnet å være lokalisert ved stilling 31 når man teller fra N-enden av det rensede, humane t-PA.

Som et resultat av dette ble aminosyresekvensen Tyr-Cys-Trp-Cys-Asn valgt som den optimale region for fremstilling av en sonde.

8 typer av 14-nucleotide oligomerer (14-merer) som var komplementære til DNA-sekvensen som koder for den ovenfor angitte aminosyresekveks, dvs. dTT/A\CACCA/A» CA/A\TA, ble således

^G; W W

kjemisk syntetisert i henhold til den ovenfor angitte fast-fase fosfotriestermetode.

5. Isolering og identifisering av bakterielle kloner inneholdende den humane t-PA cDNA-sekvens. En blanding av de åtte typer av 14-nucleotidoligomerer (14-merer) syntetisert på den ovenfor beskrevne måte, ble behandlet med T4-polynucleotid-kinase for å merke deres 5'-32 ende med P. På den annen side ble de tidligere fremstilte filtere inneholdende en cDNA-samling anbragt i en løsning inneholdende 6 x SSC (1 x SSC; 0,15M NaCl, 0,015M natriumsuccinat, pH 7,0), 10 x Denhardts løsning [1 x Denhardts løsning; 0,02% okseserumalbumin (fraksjon V), 0,02% polyvinylpyrrolidon (3,6 x 10<3->4 x IO4 dalton), 0,02% Ficoll (4 x IO<5> dalton)], 0,1% SDS og 100 ug/ml ultralydbehandlet laksesperm DNA, og prehybridisert ved romtemperatur i 2 timer. Deretter ble de anbragt i en løsning inneholdende 6 x SSC, 10 x Denhardts løs-ning og en merket probe med en konsentrasjon på 5 x 10 tell-inger/min/ml, og hybridisert ved romtemperatur over natten. Deretter ble filterne vasket tre ganger ved romtemperatur i 5 minutter i en løsning inneholdende 6 x SSC og 0,1% SDS, og ble deretter vasket tre ganger ved 30°C i 5 minutter i samme løsning.

Etter at de vaskede filtere var lufttørket, ble de anvendt for å eksponere Kodak XR-5 røntgenfilm i 16 timer ved hjelp av Dupont Kronex Lightening Plus intensifiserende skjermer.

Fra 14 kolonier som utviser en positiv hybridiseringsreaksjon, ble plasmid-DNA isolert i henhold til en modifiser--ing av den ovenfor angitte metode ifølge Birnboim og Doly. Under anvendelse av dette plasmid-DNA ble basesekvensen av dets cDNA-innsetning bestemt i henhold til den ovenfor angitte metode ifølge Maxam og Gilbert.

Ved å sammenligne aminosyresekvensen bestemt fra DNA-basesekvensen av klon T-l (som var en av de 14 kolonier) med den tidligere bestemte aminosyresekvens av renset, humant t-PA,

ble det funnet at denne klon inneholdt cDNA som koder for humant t-PA. Fig. 1 illustrerer basesekvensen av denne cDNA-innsetning. Denne innsetning hadde en størrelse på 2170 bp og inneholdt et åpent, leselig bilde på 1686 bp, en 5' utranslatert region på 76 bp og en 3' utranslatert region på 408 bp.

Når denne DNA-sekvens ble sammenlignet med den DNA-sekvens som koder for humant t-PA som var blitt isolert fra Bowes melanoma, var disse forskjellig fra hverandre ved 3 punkter i den 5' utranslaterte region, ved et punkt i regionen som koder for humant t-PA, og ved 5 punkter i den 3' utranslaterte region.

Eksempel 2 [Ekspresjon av t-PA-genet i pattedyrceller under anvendelse av muse-metallothionein-(MMT)-promoter ]

I henhold til den prosedyre som er illustrert i fig. 2, ble et utall plasmider som skulle innføres i pattedyrceller, fremstilt på følgende måte.

1. Fremstilling av plasmidet pMT-1

Først ble plasmidet pT-1 isolert fra klon T-l erholdt

i eksempel 1. For å fjerne den doble streng av GC basepar dannet under cDNA-syntesen, ble 25 ug av PT-1 splittet med Hindlll og deretter behandlet med 0,4U av Bal31 ved 37°C i 2 timer. Under anvendelse av T4 DNA-ligase ble en Hindlll-kopler bundet til det resulterende DNA-fragment, etterfulgt av splitting med Hindlll og BamHI. Fra den resulterende DNA-fragmentblanding ble et DNA-fragment inneholdende t-PA-genet separert og gjenvunnet ved polyacrylamidgelelektroforese.

På den annen side ble pUC13 splittet med Hindlll og BamHI. Fra den resulterende DNA-fragmentblanding ble et DNA-fragment på 2 700 bp separert og gjenvunnet ved lavtsmeltende agarosegelelektroforese. Under anvendelse av T4 DNA-ligase ble det ovenfor angitte DNA-fragment (med ca. 2700 bp) og det tidligere fremstilte DNA-fragment inneholdende t-PA-genet, bundet til hverandre. Det således dannede rekombinante DNA ble anvendt for å transformere E. coli HB101 på samme måte som beskrevet i eksempel 1.

Plasmider ble fremstilt fra ti av de resulterende ampicillin-resistente kolonier og ble anvendt for å bestemme DNA-basesekvensen av den 5' utranslaterte region av t-PA-genet.

-Plasmidet pT406 fremstilt fra klon T-406, som var en

av de ovenfor angitte ti kolonier, inneholdt en 5' utranslatert region på 39 bp. 20 ug pT406 ble splittet med Hindlll og BamHI. Fra den resulterende DNA-fragmentblanding ble et DNA-fragment på ca. 2.200 bp inneholdende t-PA-genet, separert og gjenvunnet ved polyacrylamidgelelektroforese.

På den annen side ble 10 ug av plasmidet pSV2-dhfr (ATCC 37146) splittet med Hindlll og BamHI. Fra den resulterende DNA- f ragmentblanding ble et DNA-fragment på ca. 4200 bp fritt for dhfr-gen separert og gjenvunnet ved lavtsmeltende agarosegelelektroforese.

Under anvendelse av T4 DNA-ligase ble 0,2 ug av det ovenfor angitte DNA-fragment (på ca. 4200 bp) og 0,1 ug av det tidligere isolerte fragment på ca. 2200 bp inneholdende et humant t-PA-gen, bundet til hverandre. Det således dannede rekombinante DNA ble anvendt for å transformere E. coli HB101 på samme måte som ovenfor beskrevet, under dannelse av ampicillin-resistente kolonier. Små mengder av plasmider ble isolert fra disse kolonier og behandlet med restriksjonsenzymer. På basis av deres splittingsmønstre ble kloner med det ønskede plasmid pMT-1 identifisert, og plasmidet pMT-1 ble isolert derfra.

2. Fremstilling av plasmidet pMT-2

10 ug av plasmidet pMT-1 fremstilt i foregående avsnitt 1, ble splittet med Hindlll og BamHI. Fra den rester-ende DNA-fragmentblanding ble et DNA-fragment på ca. 3 kbp inneholdende t-PA-genet og poly(A)-signalet av SV40, separert og gjenvunnet ved lavtsmeltende agarosegelelektroforese.

På den annen side ble et DNA-fragment inneholdende pML [M. Lusky og M. Botchan, Nature, 293, 79 (1981)] og MMT-aktivatoren, fremstilt fra plasmidet pdBPV-MMTneo (342-12)

[M. Law et al. , Molecular and Cellular Biology, 3_, 2110

(1983)]. Spesifikt ble 10 ug pdBPV-MMTneo (342-12) splittet

med Bglll. Etter denne behandling ble 5 enheter av Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I og 0,lmM hver av dATP, dCTP, dGTP og TTP tilsatt til den resulterende DNA-fragmentblanding. Denne reaksjonsblanding ble inkubert ved 37°C i 10 minutter for å omdanne de cohesive ender dannet ved splitting med Bglll til stumpe ender. Etter endt omsetning ble reaksjonsproduktet renset ved ekstraksjon med fenol, behandling med kloroform og utfelling med ethanol. Under anvendelse av T4 DNA-ligase ble 0,05 ug av en Hindlll kopler bundet til det

rensede produkt etterfulgt av splitting med BamHI og deretter partiell splitting med Hindlll. Fra den resulterende DNA-fragmentblanding ble et fragment inneholdende pML og MMT-promoteren, separert og gjenvunnet ved lavtsmeltende agarosegelelektroforese .

Under anvendelse av T4 DNA-ligase ble 0,05 ug av det ovenfor angitte DNA-fragment og 0,04 ug av det tidligere fremstilte DNA-fragment på 3 kbp inneholdende det humane t-PA-gen og poly(A)-signalet av SV40, bundet til hverandre. Det således dannede rekombinante DNA ble anvendt for å transformere

E. coli HB101 på samme måte som ovenfor beskrevet, under dannelse av ampicillin-resistente kolonier.

Små mengder av plasmider ble isolert fra disse kolonier og behandlet med restriksjonsenzymer. På basis av deres splittingsmønstre ble klonet med det ønskede plasmid pMT-2 identifisert, og plasmidet pMT-2 ble isolert derfra.

3. Fremstilling av plasmidet pMT-3.

Plasmidet pMT-2 fremstilt i foregående avsnitt 2, ble splittet med BamHI. Det resulterende DNA-fragment ble behandlet med alkalisk kalve-intestinal fosfatase (heretter angitt som CIP) for å bevirke defosforylering av 5'-enden.

På den annen side ble pdBPV-1 (142-6) (ATCC 37134) splittet med BamHI. Fra den resulterende DNA-fragmentblanding ble et BPV^QQ,p DNA-fragment på ca. 8 kbp separert og gjenvunnet ved lavtsmeltende agarosegelelektroforese.

Under anvendelse av T4 DNA-ligase ble 0,05 ug av BPV^Q0T DNA-fragment og 0,04 ug av det tidligere BamHI-splittede og CIP-behandlede pMT-2 bundet til hverandre. Det således dannede rekombinante DNA ble anvendt for å transformere E. coli HB101 på samme måte som ovenfor beskrevet, under dannelse av ampicillin-resistente kolonier. Små mengder av plasmider ble isolert fra disse kolonier og behandlet med restriksjonsenzymer. På basis av deres splittingsmønstre ble klonet med det ønskede plasmid pMT-3 identifisert, og plasmidet pMT-3 ble isolert derfra.

4. Fremstilling av plasmidet pMT-4

Plasmidet pMT-2 fremstilt i foregående avsnitt 2, ble partielt splittet med BamHI, behandlet med CIP og ble deretter behandlet med Klenow-fragmentet for å omdanne dets cohesive ender til stumpe ender. Dette DNA-fragment ble anvendt som en vektor.

På den annen side ble pdBPV-MMTneo (342-12) splittet med EcoRI og BamHI og ble deretter behandlet med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I for å omdanne de cohesive ender dannet ved splittingen til stumpe ender. Fra den resulterende DNA-fragmentblanding ble et DNA-fragment på ca. 4 kbp inneholdende neo<r->genet separert og gjenvunnet ved lavtsmeltende agarosegelelektroforese.

Under anvendelse av T4 DNA ligase ble 0,05 ug av det ovenfor angitte DNA-fragment (på ca. 4 kbp) og 0,05 ug av den tidligere fremstilte vektor bundet til hverandre. Det således dannede rekombinante DNA ble anvendt for å transformere E. coli HB101 på samme måte som ovenfor beskrevet. Deretter ble samme prosedyre som beskrevet i foregående avsnitt 3 gjentatt,for å identifisere klonet med det ønskede plasmid pMT-4 og isolere plasmidet pMT-4 derfra.

5. Fremstilling av plasmidet pMT-5

Plasmidet pMT-4 fremstilt i foregående avsnitt 4, ble splittet med BamHI og ble deretter behandlet med CIP. Under anvendelse av T4 DNA-ligase ble 0,05 ug av det resulterende DNA-fragment og 0,05 ug av BPV100T DNA-fragmentet fremstilt i foregående avsnitt 3, bundet til hverandre. Det således dannede rekombinante DNA ble anvendt for å transformere E. coli HB101 på samme måte som ovenfor beskrevet. Deretter ble samme prosedyre som beskrevet i foregående avsnitt 4, gjentatt for å identifisere klonet med det ønskede plasmid pMT-5 og isolere plasmidet pMT-5 derfra. 6. Innføring av de MMT-promoter -bærende plasmider i pattedyrceller og ekspresjon av t-PA-genet

De MMT-promoter -bærende plasmider pMT-2 til -5 for ekspresjon av t-PA-genet, fremstilt i de foregående avsnitt 2-5,

ble separat innført i pattedyrceller. Innføringen ble utført i henhold til en modifikasjon av calciumfosfatutfellingsmetoden utviklet av Graham og Van der Eb. Spesifikt ble en løsning inneholdende 2 x HBS [50mM Hepes (pH 7,1), 280mM NaCl],

l,4mM NaH2P04 og 1,4 niM Na2HP04 fremstilt. Mens steril luft ble

sugt gjennom løsningen, ble et likt volum av en løsning inneholdende et av plasmidene for ekspresjon av t-PA-genet og 250M

CaCl2 dråpevis tilsatt dertil under dannelse av en plasmid-CaPO^-utfelling. Etter endt tilsetning fikk løsningen stå i 20 minutter. Utfellingen ble deretter suspendert med en

pipette, og den resulterende suspensjon ble dråpevis tilsatt

' til vertceller dyrket i en kolbe. Etter at vertcellene var dyrket ved 37°C i flere timer i en C02~inkubator, ble mediet fjernet, og en løsning inneholdende 15% glycerol og 2 x HBS,

ble tilsatt, etterfulgt av henstand ved 37°C i 3 minutter. Etter at denne løsning var fjernet, ble et friskt medium tilsatt, og vertcellene ble dyrket i 2 dager i en CC^-inkubator. Deretter ble vertcellene overført til en plate inneholdende et friskt medium og dyrket i en uke. I dette tilfelle ble et medium inneholdende den antibiotiske substans G418, anvendt fordi neoresistensgenet var anvendt som en markør for valg av trans formanter.

Mediet ble deretter fjernet fra platen. I henhold til Jones et al. [P. Jones et al., Cell, _5, 323 (1975)] ble et casein-agarlag (istedenfor fibrin) anbragt over vertcellene,

og platen ble inkubert over natten. De t-PA-produserende kloner som utviste en transparent oppløsningssone i casein-agarlaget, ble utvalgt. Deretter ble kloner som var meget produktive med hensyn til t-PA, erholdt ved dyrkning av hvert klon og bestemmelse av den humane t-PA-aktivitet av supernatanten av den resulterende kultur. De erholdte resultater er vist i tabell 2. Disse meget produktive kloner ble også dyrket i et medium inneholdende 1 uM Cd<++> eller uM Zn<++>, og human t-PA-aktivitet av supernatanten av den resulterende kultur ble bestemt. De erholdte resultater er også vist i tabell 2.

Klon MT-3 2 5 utviste den høyeste humane t-PA-aktivitet. Spesifikt produserte denne klon 110 enheter/ml/dag av humant t-PA i fravær av Cd<++> eller Zn<++> og 305 eller 310 enheter/ml/dag av humant t-PA i nærvær av Cd++ eller Zn++.

Eksempel 3 [Ekspresjon av det humane t-PA-gen i pattedyr-

celler under anvendelse av den humane metallothionein-(hMT)-promoter ]

I henhold til prosedyren illustrert i fig. 3, ble et antall plasmider med hMT-promoteren fremstilt på følgende måte.

1. Fremstilling av plasmidet phT-1

Først ble plasmidet pMTSVPA (erholdt fra dr. M. Karin, School of Medicine, University of Southern California, U.S.A.) splittet med Xbal og ble deretter behandlet med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I for å omdanne de cohesive ender dannet ved splittingen til stumpe ender.

Under anvendelse av T4 DNA-ligase ble en Hindlll kopler bundet til det resulterende DNA-fragment, etterfulgt av splitting med Hindlll. Fra den resulterende DNA-fragmentblanding ble et DNA-fragment på ca. 840 bp svarende til hMT-promoteren, separert og gjenvunnet ved lavtsmeltende agarosegelelektroforese.

På den annen side ble plasmidet pMT-2 erholdt i avsnitt 2 i eksempel 2, splittet med Hindlll og ble deretter behandlet med CIP. Fra den resulterende DNA-fragmentblanding ble et DNA-fragment på ca. 5,5 kbp omfattende plasmidet pMT-2 fritt for MMT-promoter, separert og gjenvunnet ved lavtsmeltende agarosegelelektroforese.

Under anvendelse av T4 DNA-ligase ble det ovenfor angitte DNA-fragment (på ca. 5,5 kbp) og det tidligere fremstilte DNA-fragment med hMT-promoteren bundet til hverandre. Det således rekombinante DNA ble anvendt for å transformere E. coli HB 101 på samme måte som ovenfor beskrevet.

Små mengder av plasmider ble isolert fra de resulterende ampicillin-resistente kolonier og ble behandlet med restriksjonsenzymer. På basis av deres splittingsmønstre ble klonet med det ønskede plasmid phT-1 identifisert, og plasmidet phT-1 ble isolert derfra.

2. Fremstilling av plasmidet phT-2

Plasmidet phT-2 ble isolert på samme måte som beskrevet

i foregående avsnitt 1, med det unntak at plasmidet pMT-4 er-

holdt i avsnitt 4 i eksempel 1, ble anvendt istedenfor plasmidet pMT-2.

3. Fremstilling av plasmidet phT-3

Plasmidet phT-1 fremstilt i foregående avsnitt 1, ble splittet med BamHI og ble deretter behandlet med CIP. Under anvendelse av T4 DNA-ligase ble det resulterende DNA-fragment og BPVioOT DNA-fragmentet på ca. 8 kbp erholdt ved fremstilling av plasmidet pMT-3, bundet til hverandre. Det således dannede rekombinante DNA ble anvendt for å transformere E. coli HB101 på samme måte som ovenfor beskrevet. Deretter ble samme prosedyre som beskrevet i foregående avsnitt 2, gjentatt for å isolere plasmidet phT-3.

4. Fremstilling av plasmidet phT-4

Plasmidet phT-4 ble isolert på samme måte som beskrevet i foregående avsnitt 3, med det unntak at plasmidet phT-2 erholdt i foregående avsnitt 2, ble anvendt istedenfor plasmidet phT-1.

5. Innføring av de hMT-promoter -bærende plasmider i pattedyrceller og ekspresjon av humant t-PA-gen

De hMT-promoter -bærende plasmider phT-1 til -4 for ekspresjon av t-PA-genet, fremstilt i foregående avsnitt 1-4, ble separat innført i pattedyrceller. Innføringen og screeningen av kloner som var sterkt produktive med hensyn til t-PA, ble ut-ført på samme måte som beskrevet i avsnitt 6 i eksempel 2. De således erholdte resultater er vist i tabell 3. De sterkt produktive kloner ble også dyrket i et medium inneholdende luM Cd++, 50uM Zn<++> eller lum dexamethason, og den humane t-PA-aktivitet av supernatanten av den resulterende kultur ble bestemt. De således erholdte resultater er også vist i tabell 3.

Klon hT-382 utviste den høyeste humane t-PA-aktivitet. Spesifikt produserte denne klon 110 enheter/ml/dag av humant t-PA i fravær av Cd++, Zn++ eller dexamethason og 330-340 enheter/ml/dag av humant t-PA i nærvær av Cd++, Zn++ eller dexamethason.

Effekten av foreliggende oppfinnelse i forhold til EP-A-0093619

DNA-sekvensen ifølge foreliggende oppfinnelse utviser følgende fordeler overfor C6 (EP-A-0093619). 1) Innholdet av enkjedet t-PA i total t-PA: DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringe et t-PA(vevplasminogenaktivator)-preparat som har et høyt en-kj edet t-PA-innhold ved å kombineres med musemetallothionein-(MMT)-promoter eller human metallothionein-(hMT)-promoter.

Generelt fremstilles t-PA in vivo først i enkjedet form. Den enkjedete form kan overføres til tokjedet i nærvær av proteaseaktivitet etc, hvori den enkjedete oppdeles i to kjeder bundet til hverandre gjennom en S-S-binding.

In vivo binder enkjedet t-PA til thrombus og omdannes til tokjedet t-PA som har aktivitet. Hvis den tokjedete t-PA administreres til pasienter kan den også virke i andre deler enn thrombus og forårsake systemisk staxis som bivirkning.

I tillegg inaktiveres tokjedet t-PA mer lett in vivo enn enkjedet t-PA, fordi inhibitorer kan binde til det tokjedete t-PA i blod mer lett enn enkjedet t-PA.

Derfor er enkjedet t-PA foretrukket for medisinsk bruk, og masseproduksjon av t-PA-preparater som har et høyt enkjedet innhold under anvendelse av rekombinant DNA-teknologi, har således vært ønskelig.

Imidlertid er det vanskelig å forhindre transformasjon fra den enkjedete form til den tokjedete form i rekombinant t-PA-produksjon under anvendelse av dyreceller som produserer protease etc. som vert. Derfor er det meget viktig ved produksjon av rekombinant t-PA for medisinsk bruk å under-trykke transformasjon under produksjonsprosessen.

Ved fremgangsmåten for fremstilling av t-PA under anvendelse av kombinasjonen av DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen med MMT- eller hMT-promoter som aktiveres av metallion, kan dyrkningsprosessen for t-PA-produksjon oppdeles i følgende to trinn: A. Dyrkning uten metallionene som er i stand til å aktivere MMT- eller hMT-promoteren

B. Dyrkning i nærvær av metallion.

Da metallion ikke tilsettes i trinn A, virker promotoren ikke, eller dens aktivitet er meget svak. Følgelig uttrykkes t-PA i en meget lav grad. Derfor kan t-PA-ekspre-sjonen undertrykkes til en høy celledensitet som er nødvendig for at effektiv t-PA-produksjon kan oppnås.

I trinn B aktiveres promotoren sterkt av metallionet, og t-PA kan fremstilles i en stor mengde.

I fremgangsmåten omfattende trinn A og B kan, siden mesteparten av det t-PA som fremstilles i trinn B ikke underkastes proteaseaktivitet etc. avledet fra vertscellene gjennom hele dyrkningsprosessen, transformasjon fra den enkjedete form til den tokjedete form undertrykkes. Det er blitt vist at metoden ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringe et høyt innhold av enkjedet t-PA i total t-PA (>, 90 %)

Ved metoden ifølge C6 ble derimot SV40-promoter som virker konstant anvendt (se figur 11 i C6). Med hensyn til den rekombinante t-PA ifølge C6 har Arch. Biochem. Biophys., 285, 373 (1991), side 373, venstre spalte, "Abstract", linje 8-10 og høyre spalte, "Material", linje 1-3, rapportert at det rekombinante t-PA-preparat ifølge Genentech inneholdt 80 % enkjedet t-PA. Dette lavere innhold av enkjedet t-PA ved Genentechs metode betraktes å være et resultat av den konstante ekspresjon av t-PA gjennom hele dyrkningsprosessen under den konstante aktivitet av SV40-promoteren.

Som beskrevet ovenfor kan DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med MMT- eller hMT-promoter tilveiebringe et høyere innhold av enkjedet t-PA enn C6. Derfor med-fører foreliggende oppfinnelse et betydelig oppfinnerisk trinn i forhold til C6.

2) Klinisk effekt:

i. Forskjeller i t-PA-struktur og sammensetning av t-PA-preparat:

a. t-PA-peptidstruktur:

DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen er forskjellig fra den ifølge C6, i særdeleshet er den t-PA som kodes av DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen tre aminosyrerester lengre ved N-enden enn den av C6.

b. Sukkerkj ede:

b-1. Antall sukkerkjeder bundet til peptid:

t-PA er et glycoprotein omfattende et peptid og sukkerkjeder bundet til peptidet. Det er klassifisert i type I og II basert på antallet sukkerkjeder.

J. Biol. Chem., 264, 24, 14100-14111 (1989) rapporterte innholdet av type I og II av Genentechs t-PA (se side 14105, venstre spalte, linje 2-4 i "Materials"). Vedrørende forholdet mellom type I og type II anga denne publikasjon at type I:type II = 1:1 på side 14101, høyre spalte, linje 11-19, og side 14110, høyre spalte, linje 36.

Derimot utviste den t-PA fremstilt ved metoden ifølge oppfinnelsen et t-PA-preparat inneholdende type I:type II = 7:3.

b-2. Antall mannose innbefattende sukkerkjede bundet til Asn<120>(117): Peptidet av t-PA produsert ved metoden ifølge oppfinnelsen har Asn ved den 120. stilling fra N-enden, til hvilken en sukkerkjede hovedsakelig sammensatt av mannose-rester er bundet.

t-PA preparatet inneholdt 1,7 % t-PA-molekyl som har sukkerkjede type Bl med 5 mannoser, 31,9 % t-PA-molekyl med sukkerkjede type B2 med 6 mannoser, 24,9 % t-PA-molekyl med sukkerkjede type B3 med 7 mannoser, 6,8 % t-PA-molekyl med sukkerkjede type B3' med 7 mannoser og 34,6 % t-PA-molekyl med én sukkerkjede med 8 mannoser.

Derimot har t-PA ifølge Dl en sukkerkjede bundet til Asn ved den 117. stilling fra N-enden (svarende til Asn120 i t-PA ifølge oppfinnelsen).

J. Biol Chem., 264, 24, 14100-14111 (1989) rapporterte innholdet av t-PA-molekyler med forskjellige sukkerkjeder ved Asn<117> som Bl, B2, B3 og B3' i tabell V på side 14102.

Basert på de "relative mengder" av B1-B3' i tabell V, inneholdt Genentechs t-PA-preparat 39 % t-PA-molekyl med sukkerkjedetype Bl (5 mannoser), 38 % t-PA-molekyl med sukkerkjede type B2 (6 mannoser), 11 % t-PA-molekyl med sukkerkjede type B3' (7 mannoser) og 11 % t-PA-molekyl med

sukkerkjede type B3' (7 mannoser).

Innholdet av t-PA-molekyler med forskjellige sukkerkjeder ved Asn<120>'<117>' er oppført i etterfølgende tabell:

Som angitt ovenfor tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en t-PA som er forskjellig fra den ifølge C6 i peptidstruktur og strukturen vedrørende sukkerkjeden.

ii. Klinisk test:

Ved den sene fase II-test, var gjenåpningsgraden 85,7 %, dvs. 85,7 % av de totale pasienter hadde gradsfor-bedringer (fra 0 eller 1 til 2 eller 3) under TIMI-standarden etter 60 minutter fra starten av administreringen ved en dose mellom 0,5 mg og 0,6 mg/l kg-vekt.

Derimot rapporterte "Advance in Medical Science", 156, 6 (1991), resultatene ved den sene fase II-test basert på TIMI-standarden (Therapy and Prevention, Thrombolysis; Vol. 76, No. 1, 1987) under anvendelse av t-PA-preparatet fremstilt ved metoden ifølge C6 i Japan.

Side 429, venstre spalte, linje 2-3, i denne publikasjon beskriver at Genentechs rekombinante t-PA (GMK-527) ble anvendt.

Denne publikasjon anga at reåpningsgraden var 69,9 %, dvs. at 68,9 % av de totale pasienter hadde gradsforbedring fra 0 eller 1 til 2 eller 3 basert på TIMI-standarden etter 60 minutter fra starten av administrering ved en dose mellom 0,5 mg og 0,75/1 kg-vekt.

Det er nylig blitt fastslått at medisinsk aktivitet in vivo av glycoproteiner produsert ved rekombinant DNA-teknologi under anvendelse av pattedyrceller som vert avhenger av antall sukkerkjede og/eller sukkerkjedestruktur, så vel som aminosyresammensetning.

Forbedringen vedrørende reåpningsgraden ifølge foreliggende oppfinnelse i forhold til C6 betraktes derfor å være et resultat av forskjellene beskrevet i i. a og b ovenfor.

3) Konklusjon:

Som beskrevet i 1) og 2) ovenfor kan foreliggende oppfinnelse tilveiebringe et t-PA-preparat som har et høyere innhold av enkjedet t-PA, og er derfor mer effektivt, enn det ifølge C6.

Claims (3)

1. Rekombinant DNA-vektor, karakterisert ved at den omfatter (a) en del som er i stand til selvreplikasjon i pattedyrceller, (b) en promoter valgt fra musemetallothionein-promoter og human metallothioneinpromoter, og (c) DNA-fragment inneholdende sekvensen som koder for human vevsplasminogenaktivator (t-PA) avledet fra en human fosterepiteliumcelle, hvilket t-PA omfatter 530 aminosyrer, hvis N-ende begynner med glycin, hvori en streng av angitte DNA-sekvens har følgende basesekvens: hvilket DNA-fragment er operativt kjedet til promoteren.

2. Pattedyrcelle, karakterisert ved at den er transformert med det rekombinante DNA ifølge krav 1, og er i stand til å uttrykke det gitte gen.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av human vevsplasminogenaktivator hvori minst 90 % av denne er enkjedet, hvor forholdet mellom type I-tPA:type II-tPA er tilnærmet 7:3, og hvis DNA stammer fra human fosterepiteliumcelle og har den sekvens som er angitt i krav 1, karakterisert ved at den omfatter trinnene: A) dyrkning av pattedyrcellen ifølge krav 2 uten et metallion som en induktor for musemetallothioneinpromoteren eller den humane metallothioneinpromoter; og B) dyrkning av pattedyrcellen ifølge krav 2 i nærvær av metallionet, og utvinning av den nevnte humane vevsplasminogenaktivator fra kulturmediet til nevnte transformerte pattedyrcelle.