NO166618B - Fremgangsmaate for fremstilling av immunoenzymatiske konjugater som ved kovalent binding binder sammen et enzym og et antistoff. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av nye konjugater som, ved kovalent binding binder sammen et enzym og et antistoff, som angitt i kravet.

De nye produkter som oppnås i henhold til oppfinnelsen,

er altså konjugater dannet ved kovalent binding av et spesifikt enzym med antistoffer eller fragmenter av antistoffer rettet mot en antigen båret av målceller.

I denne beskrivelse vil slike forbindelser bli betegnet immunoenzymatiske konjugater.

De immunoenzymatiske konjugater er kunstige, blandete mo-lekyler i hvilke enzymet ved kovalent binding er bundet til et antistoff rettet mot et antigen båret av målceller.

De anvendte enzymer er kjente forbindelser. Det anvendte antistoff vil være enten av polyklonal karakter hvis det resul-terer, i en vanlig immunisering når det tilføres dyret, eller av monoklonal karakter hvis det er dannet av en klon av cellehyb-rider som er oppstått ved sammensmelting mellom lymfocyter og myelomceller. Dette antistoff vil kunne brukes enten i form av hele immuno-globulinmolekyler som innehar evnen til å gjenkjenne det valgte antigen eller i form av bare fragmenter av disse im-munoglobulinmolekyler som har bevart evnen til å gjenkjenne det valgte antigen, og særlig fragmentene kjent under benevnelsene F (ab ')2 , Fab og Fab ' .

Den kjemiske kobling mellom antistoff (eller fragment av antistoff) og enzym kan utføres via tallrike metoder under for-behold av at den valgte metode: - bevarer de respektive biologiske aktiviteter til de to konjugerte forbindelser; antistoff og enzym; - via fremgangsmåten sikrer en tilfredsstillende grad av reproduksjon og et godt sammenkoblingsutbytte; •- tillater å få svar på verdien av forholdet enzym/antistoff i det oppnådde konjugat; - fører til et produkt som er stabilt og løselig i vann.

Blant metodene som svarer til disse karakteristika må man foretrekke dem som tar i bruk en eller flere tiolfunksjoner for etablering av binding mellom de to proteiner. Disse tiolfunksjoner kan uten forskjell tilhøre det ene eller det andre av proteinene som skal kobles, eller gjerne være kunstig innført i det ene eller det andre av disse proteiner, som ikke naturlig inneholder tiol.

Hvis en eller flere grupper av tiol således må føres kunstig inn i et av proteinene, vil dette kunne utføres gjennom virkning på dette protein av S-acetylmerkaptoravsyreanhydridet som er i stand til å acylere de aminerte funksjoner til proteinet. Man vil videre kunne frigjøre tiolfunksjonene ved eliminering

av beskyttelsesacetylradikalet ved innvirkning av hydroksylamin slik som dette er beskrevet LArchives of Biochemistry and Biophysics, 119 , 41-4.9 , (1967)]. En dialyse tillater å eliminere overskudd av reagenser, slik som reaksjonsprodukter med lav molekylvekt. Andre metoder beskrevet i litteraturen kan også

.brukes for å innføre, tiolfunksjoner i et av koblingsproteinene.

I henhold til oppfinnelsen blir det av de to proteiner

som alene innehar en. eller flere tiolfunksjoner, brakt til å reagere med det andre protein i hvilket det forutgående vil ha vært innført en eller flere funksjoner tilbøyelig til å reagere med tiolene, i vandig miljø ved en pH-verdi mellom 5 og 9 og ved en temperatur som ikke overskrider 30°C, for å frembringe en stabil og definert kovalent binding. Denne kovalente binding vil spesielt være enten en disulfidbinding eller en tio-eter-binding. Man betegner i det følgende det av de to proteiner som bærer en eller flere tiolfunksjoner og med P2 det andre protein som skal kobl"es. 1) Tilfelle med disulfidbindin<g>;

Fremstillingen av konjugater kan i såfall representeres ved skjemaet:

i hvilket:

-S-S-X betegner: en aktivert blandet disulfidgruppe, hvor

X er aktiveringsradikalet.

Protein P2 substituert med et atom aktivert svovel fåes

ut fra protein P2 selv, ved substitusjon ved hjelp av et reagens som selv er bærer av et aktivert svovelatom ifølge skjemaet:

i hvilket:

~ ?2 betegner proteinet som skal substitueres

Y representerer en funksjon som tillater den kovalente fiksering av reagens til protein

R betegner en gruppe som samtidig kan bære substituentene Y og

-S-S-X

X betegner aktiveringsradikalet.

Den funksjonelle gruppe Y er en funksjon som er i stand til å binde seg på kovalent måte med hvilken som helst av funk-sjonene båret av sidekjedene til grunnaminosyrene i proteinet som skal substitueres. Blant disse påpekes spesielt de termina-le aminerte funksjoner hos lysylradikalene som inneholdes i proteinet. I dette tilfelle vil Y særlig kunne representere: - en karboksylgruppe som vil kunne binde seg til de 'aminerte funksjoner i proteinet i nærvær av et koblingsmiddel slik som et karbodiimid og særlig et derivat løselig i vann slik som l-etyl-3-(3-dietylaminopropyl)-karbodiimid, - et karboksylsyreklorid som er i stand til å reagere direkte med de aminerte funksjoner for å acylere dem, - en ester kalt "aktivert" slik som en ester av orto-eller para-, nitro- eller dinitrofenyl eller også en ester av N-hydroksysuksinimid som reagerer direkte med de aminerte funk-sjonene for å acylere dem, - et internt anhydrid av en karboksyldisyre slik som f.eks. ravsyreanhydrid som reagerer spontant med de aminerte funksjoner for å danne amidbindinger, - en imidoestergruppe hvor R^ er en alkylgruppe som reagerer med de aminerte grupper i proteiner ifølge reaksjonen

Radikalet -S-S-X betegner en aktivert disulfidblanding som kan reagere med fritt tiolradikal. Spesielt i disulfidblandin-gen vil X betegne en gruppe 2-pyridyl eller 4-pyridyl som even-tuelt er substituert med et eller flere radikaler av alkyl,

halogen eller karboksyl. X kan også betegne en fenylgruppe fortrinnsvis substituert med en eller flere nitro- eller karbok-

sylgrupper. X kan også representere en alkoksykarbonylgruppe, slik som gruppen metoksykarbonyl.

Radikalet R betegner ethvert radikal som er i stand til samtidig å bære substituentene Y og S-S-X. Det vil måtte velges på en slik måte: at det ikke tillater funksjoner som er i stand til å interferere med de anvendte reagenser og de synteti-serte produkter i løpet av de senere reaksjoner. Spesielt kan gruppen R være en gruppe -(CH2)n hvor n er et tall mellom 1 og 10 eller også en gruppe:

i hvilken R^ betegner hydrogen eller en alkylgruppe som har fra

1 til 8 karbonatomer og R^ betegner en substituent som er inert .overfor reagensene anvendt senere, slik som en karbamatgruppe -NH-C-0Rq, hvor R,-- betegner en rettlinjet eller forgrenet alkyl-

gruppe som har fra; 1 til 5 karbonatomer, og spesielt tert.-butyl-gruppen.

Reaksjonen; til forbindelsen Y-R-S-S-X med protein P2 utfø-res i homogen væskefase, oftest i vann eller en pufferløsning. Når løseligheten av. reagensene krever det, er det mulig å tilsette reaksjonsmiljøet opp til 20 % i volum av et organisk løs-ningsmiddel som er blandbart med vann, slik som en alkohol, særlig tert.-butanol.

Reaksjonen utføres i omgivende temperatur i løpet av en tid som varierer fra noen timer til 24 timer, hvoretter en dialyse tillater å eliminere produkter med lav molekylvekt og særlig overskudd av reagenser. Denne fremgangsmåte tillater å inn-føre et antall substituent-grupper pr. mol protein, vanligvis mellom 1 og 15.

Idet man bruker slike forbindelser, blir koblingen med protein utført ved at de bringes i nærvær av de to proteiner i en vandig løsning- ved cn temperatur som ikke overskrider 30°C, i løpet av en. tid som varierer fra noen timer til én dag. Den vandige løsning: som fåes, blir dialysert for å eliminere produkter med lav molekylvekt, deretter kan konjugatet renses ved forskjellige kjente metoder.

2) Tilfelle med tioeterbinding:

Fremstillingen av konjugatet består i så fall i å få P^-SH til å reagere med protein P^ i hvilket det forutgående

- vil ha vært innført et maleimidradikal.

Reaksjonen kan da representeres ved skjemaet:

i hvilket

Z representerer en avstandsstruktur, alifatisk eller aromatisk som inneholder fra 1 til 10 karbonatomer.

Protein P2 substituert med maleimid fåes ut fra protein P2 selv ved substitusjon av aminerte funksjoner til proteinet ved hjelp av et reagens som selv er bærer av maleimidgruppen, ifølge skjemaet:

i hvilket Y^ representerer:

- enten en karboksylgruppe, idet reaksjonen i så fall blir utført etter aktivering av karboksylfunksjonen i nærvær av et koblingsmiddel slik som et karbodiimid og særlig et derivat løse-lig i vann slik som l-etyl-3-(3-dietylaminopropyl)-karbodiimid, - eller en ester kalt "aktivert" slik som en ester av orto-eller para-, nitro- eller dinitrofenyl, eller også en ester av N-hydroksysuksinimid som reagerer direkte med de aminerte funksjoner for å acylere dem.

Fremstillingen av slike reagenser er spesielt beskrevet

i Helvetica Chimica Acta _58, 531-541 (1975) . Andre reagenser av samme type er disponible i handelen.

Reaksjonen, av forbindelsen

med protein P_ blir

utført i homogen væskefase, oftest i vann eller en pufferløsning. Når løseligheten til reagensene krever det, er det mulig å til-føre reaksjonsmiljøet opptil 20 % i volum av et organisk løs-ningsmiddel blandbart med vann, slik som en alkohol og særlig tertiær-butanol.

Reaksjonen utføres ved omgivelsestemperatur i løpet av en tid som varierer fra noen timer til 24 timer, hvoretter en dialyse tillater å eliminere produkter med lav molekylvekt og særlig overskudd av reagenser. Denne fremgangsmåte tillater å inn-føre et antall substituentgrupper pr. mol protein, vanligvis mellom 1 og 15.

Idet det brukes slike forbindelser, blir koblingen med protein Pi utført ved at de bringes i nærvær av de to proteiner i en vandig løsning ved en temperatur som ikke overskrider 30°C' i løpet av en tid som varierer fra noen timer til én dag. Løs-ningen som fåes, blir dialysert for å eliminere produkter med lav molekylvekt, deretter kan konjugatet renses via forskjellige kjente metoder.

Slike immunoenzymatiske konjugater kan bli dannet med et hvilket som helst:enzym. Allikevel er, i lys av deres terapeu-tiske anvendelse,, som det vil bli redegjort for senere, de foretrukne enzymer de som er i stand til å frigjøre ammoniumioner ut-ifrå naturlige substrater som tåles godt av høyerestående dyreorganismer. Ifølge den internasjonale klassifisering slik som den er presentert £br eksempel i "Comprehensive Biochemistry", bind 13, 3.utgave (1973), M.Florkin og Stortz Editors (Elsevier), befinner enzymene som er brukbare i terapi innen rammen av den foreliggende oppfinnelse seg hovedsakelig: - i gruppe 1 (oksydoreduktaser) og særlig i undergruppe 1-4 som inneholder aminosyredehydrogenaser og aminooksydaser; - i gruppe 3 (hydrolaser) og særlig i undergruppe 3-5 som inneholder enzymene s.onv hydrolyserer. amider, amidiner og andre C-N-bindinger (unntatt: peptidfcindinger)

- i gruppe '4 (tlyatser)) og særlig i undergruppene 4-2 og 4-3

som inneholder enisymerae som' katalyserer nedbrytningsreaksjoner med dannelse av umettede forbindelser.

Man viser nedenfor listen over de foretrukne enzymer

for å fremstille immunoenzymatiske konjugater i henhold til oppfinnelsen. I hvert tilfelle har man -likeledes angitt den anvendte kode for å beregne disse enzymer i den internasjonale nomenklatur.

1-4-1-1 : alanin-dehydrogenase

1-4-1-3 : glutamat-dehydrogenase NAD (P)<+>

1-4-1-5 : L-aminosyre-dehydrogenase

1-4-3-2 : L-aminosyre-oxydase

3-5-1-1 : asparaginase

3-5-1-2 : glutaminase

3-5-1-4 : amidase

3-5-1-5 : urease

3-5-3-6 : arginin-deaminase

3-5-4-4 : adenosin-deaminase

3-5-4-6 : adenosinmonofosfat-deaminase

3- 5-4-21: kreatinin-deaminase

4- 2-1-13: L-serin-dehydratase

4-2-1-16: L-theonin-dehydratase

4-3-1-1: ammoniumaspartat-lyase (eller -aspartase)

4-3-1-3: ammoniumhistidin-lyase (eller -histidase)

4-3-1-5: ammoniumfenylalanin-lyase.

I de tidligere søknader om franske patenter, særlig

nr. 78 27 838, 79 24 655, 81 07 596 og 81 21 836, er det beskrevet fremstillinger av produkter mot cancer, dvs. konjugater fått ved kobling, ved kovalent kobling av kjede A i ricin med antistoffer eller fragmenter av antistoffer rettet mot et antigen båret av en celle som skal ødelegges. Produkter av denne type er i den foreliggende søknad betegnet med det generiske navn immunotoksiner.

I den franske søknad 81 21 836 er det dessuten beskrevet egenskapen hos ammoniumioner (i form av et hvilket som helst av deres salter og særlig klorid) til å potensialisere den cytotoksiske virkning av disse immunotoksiner på en effektiv måte.

Ammoniumsalters evne til selektivt å potensialisere den cytotoksiske aktivitet hos immunotoksiner frembyr tallrike for-

deler i to typer av situasjoner:

a) Hver gang et immunotoksin blir brukt i egenskap av selektivt cytotoksisk stoff in vitro for' å ødelegge målceller.

I tilfelle av terapeutisk bruk påtreffes denne situasjon særlig når immunotoksiner brukes som cytotoksisk stoff i behandling av benmargen hos leukemiske pasienter hos hvilke den slik behandlete benmarg senere vil bli transplantert, slik som dette er beskrevet i søkerens franske patentsøknad nr. 81 21 826.

b) Når immunotoksinet blir anvendt in vivo og i egenskap av terapeutisk stoff hos mennesket, hver gang det er mulig å

administrere til den syke forutgående for, samtidig med eller senere enn immunotoksinet et ammoniumsalt som sikrer potensialisering av virkningen av immunotoksinet slik som det er beskrevet i patentsøknaden angitt ovenfor.

Likevel, i dette siste tilfelle av anvendelse, kjenner an-vendelsen, in vivo av immunotoksin, på -samme måte in vivo av et ammoniumsalt, for å kunne dra fordel av potensialiseringseffekten, bestemte begrensninger uadskillelig forbundet med den spesielle toksisitet av ammonium, og det er faktisk relativt vanskelig på varig måte å opprettholde en tilstrekkelig konsentrasjon i de biologiske væsker hos den syke.

De fortsatte arbeidene til søkeren har på en meget viktig måte tillatt å redusere begrensningene knyttet til bruken av ammoniumioner samtidig med at fordelene med potensialisering av den cytotoksiske aktivitet og akselerering av aksjonskine-tikken til immunotoksinene ved disse ioner bevares. Disse arbeider har virkelig vist at potensialiserings- og akselererings-effekten ved å tilføre et ammoniumsalt i passende konsentrasjon til immunotoksinene også godt kunne fåes hvis ammoniumionene var produsert i de umiddelbare omgivelser av målcellene, ved en enzymatisk reaksjon ut fra et ikke-toksisk substrat naturlig tilstede eller kunstig tilført til omgivelsene til disse celler.

Dessuten har disse arbeider vist at dette resultat blir oppnådd på en spesielt effektiv måte når enzymet som katalyserer reaksjonen, som produserer ammoniumionene, kobles til et antistoff (eller fragment av antistoff) med evne til å gjenkjenne et antigen tilstede på overflaten av målcellene.

Denne isåte å gå frem på medfører flere fordeler av stor viktighet og særlig følgende: a) Det anvendte enzym er altså konsentrert på celleveggen til målcellene som følge av affiniteten til antistoff

(eller fragment av antistoff) for et antigen tilstede på denne cellevegg. Som følge av dette vil frigjøring av NH^+-ioner som produkt av den enzymatiske reaksjon bare finne sted i umiddelbare omgivelser av celleveggen til målcellene, hvilket re-duserer risikoen knyttet til den generelle toksisitet av ammonium-ioner, samtidig med at interaksjonen av disse ioner med målcellene gjøres lettere, hvilket er nødvendig for å produsere potensialisering.

b) Idet den enzymatiske reaksjon produserer NH4<+->ioner på en kontinuerlig måte så lenge som substratet er tilstede, og

dette substrat er valgt å være ikke-toksisk, tillater denne fremgangsmåte en meget stor føyelighet ved anvendelse som poten-sialiseringsmekanisme. Således, hvis substratet er endogent

og har tilstrekkelig konsentrasjon, kan administrering av poten-sialiseringsstoff til det immunoenzymatiske konjugat gjøres på forhånd eller samtidig med eller etter administrering av immunotoksin, i henhold til de optimale retningslinjer som bestemmes for hver pasient.

Hvis dessuten enzymet velges av en slik type at dets substrat ikke eksisterer i blodet og de ekstracellulære væsker i en for høy konsentrasjon og slik at dette substrat da også kan administreres til den syke, viser den maksimale føyelighet for anvendelse av medikamentet seg ved at man kan bestemme fritt og uavhengig øyeblikket for administrering, varighet av administrering og dose av hver av de tre administrerte forbindelser, nemlig immunotoksin, det immunoenzymatiske konjugat og substrat, i henhold til de optimale retningslinjer for behandling av hver pasient.

c) I betingelsene angitt ovenfor vil man på en selektiv måte mot målcellene rette minst to utførende stoffer, uunnvær-. _

lig for det etterforskede resultat:

- på den ene side kjede A av ricin som har den cytotoksiske virkning inkludert i konjugatet kalt immunotoksin; - på den annen side enzymet som er en vesentlig bestanddel av potensialiseringssystemet, inkludert i det immunoenzymatiske konjugat. . Disse utførende stoffer er i alle tilfeller, i lys av deres styring og deres selektive fiksering til målcellene bundet til antistoffer (eller fragmenter av antistoffer) som gjenkjenner antigener tilstede på overflaten av målceller. - Hvis man har til rådighet et antistoff som kan gjenkjenne et antigen som er stringent spesifikt for cellepopulasjonen som.skal ødelegges, kan man da bruke det samme antistoff for binding til de forskjellige utførende stoffer. Likevel har man i det mest generelle tilfelle nytte av å velge forskjellige antistoffer som gjenkjenner forskjellige antigener, men er båret sammen av målcellene. Således, selv om hvert av disse antigener ikke er stringent spesifikt til målcellene, blir sannsynligheten for at de to valgte antigener skal være tilstede sammen på ikke-målcellene, meget liten, og man har derfor til rådighet et middel som er ekstremt virksomt for ytterligere å forsterke den spesi-.fikke karakter av cytotoksisiteten til immunotoksinene.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen uten å be-grense rekkevidden av den.

Eksempel 1

Immunoenzymatisk konjugat oppnådd ved reaksjon mellom antistoff anti-dinitrofenyl substituert med en aktivert disulfidgruppe og en urease av vegetabilsk opprinnelse.

a) Antistoff anti- dinitrofenyl ( anti- DNP)

Dette antistoff er et monoklonalt antistoff som er blitt

renset ved konvensjonelle teknikker fra bukvæske til mus av stamme Balb/C i hvilke hybridomet F 9 er blitt transplantert.

Dette hybridom er selv blitt dannet ved sammensmelting av miltceller fra mus av stamme Balb/C immunisert ved hjelp av bovint Y-globulin på hvilket man forutgående har fiksert 20 DNP-radikaler pr. mol med celler som stammer fra murint myelom NS 1, og isolert ved. kloning, i henhold til de klassiske teknikker. Det dannete antistoff er et immunoglobulin av klasse G og av isotype 2b hvori affinitetskonstanten (målt for liganden e-DNP-lysin) er på 1,8 . 10<8>M<-1>.

b) Antistoff aktivert anti- DNP

Dette produkt har man fått fra antistoffet ovenfor i henhold til en teknikk, analog den som er beskrevet i de foran nevnte patentsøknader nr. 78 27 838 og tillegg 79 24 655, nr. 81 07 596 og nr. 81 2:1 8:3:6.. Man har således fått 20 mg antistoff anti-DNP som har 1,2 aktiveringsgrupper pr. mol.

c) Urease

Det anvendte enzym er urease av opprinnelse SIGMA (type

VII, referanse U 0376), som titrerer 170 'enheter pr. mg. En. enhet er mengden av enzym som tillater frigjøring av 1 mikromol NH4+ pr. min. ved 20°C og ved pH 7,0, fra urea.

Dette enzym inneholder naturlig 27 tiolgrupper pr. mole-kyl, av molekylvekt 480 000. Disse tiolgrupper, som er titrer-bare ved metoden til ELLMAN, er ikke alle nødvendige for den enzymatiske aktivitet. Noen kan likevel tjene til å sikre kobling med det aktiverte antistoff.

d) Kobling av antistoff og enzym

5 mg urease løses i 0,625 ml av en løsning av aktivert antistoff i 0,125 M fosfatpuffer, pH 7,0, altså 4,5 mg aktivert antistoff, og man foretar inkubering ved 25°C i 14 timer.

Man kromatograferer reaksjonsblandingen på en gelkolonne Sepharose 6B ekvilibrert i en PBS-puffer (10 mM fos-fat, 140 mM natriumklorat, pH 7,4). Elueringen følges ved å måle den optiske tetthet ved 280 nm og ved å måle urease-aktiviteten i henhold til teknikken til SUMMER (Methods in Enzymo-logy, Vol. II, s.378, S.B. Colowick og N.O. Kaplan Ed., Academic Press, 1955).

Man samler fraksjonene som inneholder de sterkeste urease-aktiviteter, og man får således 8 ml løsning av konjugat med 6,5 enheter/ml. Hvis en alikvot av denne løsning absorberes på en kolonne av bovint serum-albumin substituert med 6 DNP-radikaler pr. mol og gjøres uoppløselig på en matriks Sepharose 4 B som på forhånd er aktivert med cyanogenbromat, konstaterer man at ureaseaktiviteten blir helt absorbert på kolonnen. Dette viser at antistoffer tilstede i konjugatet har bevart evnen til å kjenne igjen haptenet DNP og at urease er godt koblet til dette antistoff.

Eksempel 2

Potensialisering av immunotoksin anti- T65

Konjugater oppnådd som angitt foran, ble studert med henblikk på sine biologiske egenskaper og mer spesielt sin evne til å potensialisere aktiviteten av immunotoksin anti T65 i en passende cellulær modell.

Denne modell består av celler fra den humane lymfoblast-oide linje CEM som naturlig bærer antigen T65. Dette antigen mot hvilket det anvendte immunotoksin er rettet, utgjør det første mål-antigen i. modellen. Man kan dessuten merke disse celler ved hjelp av haptenet trinitrofenyl (TNP) i henhold til teknikken beskrevet; i patentsøknad nr. 78 27 838. Dette hapten blir meget godt gjenkjent av antistoffet anti-DNP inneholdt i det studerte immunoenzymatiske konjugat og utgjør altså det andre mål-antigen i modellen. Det er blitt vist at merkingen av cellene med haptenet TNP ikke endrer cellenes levedyktighet og ikke forstyrrer fikseringen på cellene av immunotoksin anti-T6 5.

Idet den fundamentale egenskap ved immunotoksinene er å inhibere proteinsyntesen i målcellene, består den anvendte test i å måle virkningen av de studerte stoffer på inkorporeringen

14

av C-leucin i cancerceller i kultur.

Denne måling utføres i henhold til en teknikk tilpasset fra den som er beskrevet i Journal of Biological Chemistry, 1974, 249 (11), 3557-3562, idet man bruker merkestoffet <14>C-leucin for bestemmelsen av graden av proteinsyntese. Bestemmelsen av inkorporert- radioaktivitet ble her utført på celler som var helt isolert ved filtrering.

Ut fra disse bestemmelser kan man tegne kurver effekt/doser idet man i abscissen fremstiller den molare konsentrasjon i kjede A av de studerte stoffer og i ordinaten inkorporeringen av 14 C-leucin uttrykt i prosent av inkorporeringen i kontrollcel-ler i fravær av alt stoff som påvirker proteinsyntesen.

Man kan således for hvert av de studerte stoffer bestera-14

me konsentrasjonen som inhiberer 50 % av inkorporering av C-leucin eller "inhiberingskonsentrasjon 50" (CI 50).

De forskjellige forsøk i dette eksperiment har vært kjørt som følger. De tilsvarende forsøksresultater er vist i fig.l.

a) - Celler CEM inkuberes i 18 timer ved 37°C i nærvær av kjente konsentrasjoner av ricin eller isolert kjede A, anvendt

i egenskap av referansestoffer. Så blir cellene underlagt en fase med inkorporering av radioaktiv markør. CI 50 som fåes,

—12 — 8

er henholdsvis 4.10.' M' og 4,5.10 M for ricin og for kjede A. Det er på den annen side blitt vist at disse verdier ikke kan skilles fra dem som. man får på celler CEM merket med haptenet TNP (kurve 1, ricin. på CEM og kurve 2, kjede A av ricin på CEM) .

b) - Celler CEM merket med TNP inkuberes i 18 timer ved

37°C i nærvær av et immunotoksin med spesifisitet anti-DNP, oppnådd som angitt i patentsøknad nr. 78 27 838 og tillegg 79 24 655, deretter underlagt fasen med inkorporering med radioaktiv markør. Formen på kurven for cytotoksisitet som fåes, og verdien til CI 50 (1,5.10 -9M) viser at disse celler normalt er følsomme for den cytotoksiske virkning av immunotoksin anti-DNP, som således beviser at merkingen med TNP av disse celler er riktig utført (kurve 3).

c) - Celler CEM merket med TNP inkuberes først i én time ved 4°C i nærvær av ikke-konjugert urease i forholdet 4 U/ml, blir deretter vasket, inkubert i 18 timer ved 37°C i nærvær av immunotoksin anti-T65 og 5 mM urea og til slutt underlagt fasen med inkorporering av radioaktiv markør. CI 50 som fåes, er på 5. 10 -9M. Denne verdi er identisk med den som man får når man under de samme betingelser anvender CEM-celler som ikke er merket med TNP, uten behandling med urease og i fravær av urea i inkubasjonsmiljøet etter utvasking av urease. Dette forsøk viser at inkubering i nærvær av ikke-konjugert urease ikke med-fører noen binding av urease til cellene og som følge av dette ingen potensialisering av virkningen av immunotoksin anti T65 (kurve 4). d) - Celler CEM merket med TNP blir først inkubert i én time ved 4°C i nærvær av det immunoenzymatiske konjugat beskrevet foran, anvendt i konsentrasjon på 6,5 U/ml. Det er forøvrig blitt bevist at dette konjugat anvendt under disse betingelser, ikke viser noen spesiell cytotoksisitet på de anvendte celler. Disse celler blir videre vasket for å eliminere alt konjugat som ikke er fiksert, deretter blir de inkubert i 18 timer ved 37°C i nærvær av immunotoksin anti T65 og 5 mM urea. De blir til slutt underlagt fasen med inkorporering av radioaktiv markør. CI 50 som fåes, er på 3,5.10~<13>M (kurve 5).

Dette resultat viser at potentialiseringseffekten til det immunoenzymatiske konjugat forøker den cytotoksiske aktivitet av immunotoksinet på målcellene omtrent 14 000 ganger. Dette forsøk viser at denne potensialiseringseffekt medfører fiksering av dets immunologiske spesifisitet. Denne fiksering holder seg ved vasking av cellene og lar bli igjen på overflaten av disse den enzymatisk aktiverte urease som produserer NH^<+->ioner fra urea tilstede i inkubasjonsmiljøet med immunotoksin, hvilket medfører den godt kjente potensialiseringseffekt hos NH^<+->ionene. Potensialiseringseffekten som fåes, er helt analog med den som tidligere er vist ved å tilsette 10 mM ammoniumklorid i inkuba-sjonsmiljøet.

Som i tilfellet med kunstig tilsetning av ammoniumklorid fåes denne potensialiseringseffekt hverken med ricin eller med kjede A av ricin eller med et immunotoksin som er uspesifikt for de studerte celler.

Under betingelsene i dette eksempel er den cytotoksiske aktivitet av immunotoksin anti T6 5 i nærvær av det anvendte immunoenzymatiske konjugat omtrent 130 000 ganger den for kjede

A av ricin, og den overskrider til og med i styrke den for

ricin med en faktor på omtrent 11 ganger.

Eksempel 3

Immunoenzymatisk konjugat fått ved reaksjon mellom et antistoff anti- dinitrofenyl substituert med en maleimidgruppe og en urease av vegetabilsk opprinnelse.

a) Antistoff anti- dinitrofenyl ( anti- DNP)

Dette antistoff er et monoklonalt antistoff som er renset

ved konvensjonelle teknikker ut fra bukvæske av mus av stamme Balb/C på hvilke det er blitt transplantert hybridom .

Dette hybridom er selv dannet ved sammensmelting mellom miltceller fra mus av stamme Balb/C immunisert ved hjelp av bovint y-globulin på hvilket man forutgående har fiksert 20 DNP-radikaler pr. mol med celler fra linjen av murint myelom

NS 1 og isolert ved kloning, i henhold til de klassiske teknikker. Det oppnådde antistoff er et immunoglobulin av klasse G

og av isotype 2b hvori affinitetskonstanten (målt for liganden e-DNP-lysin) er på 1,8»108M_1.

b) Antistoff anti- DNP aktivert

2,5 ml av antistoff anti-DNP på 9,7 mg/ml i 125 mM fosfatpuffer, pH 7,0 blir tilsatt 10 pl dimetylformamid som inneholder 0,4 mg av N-hydroksysuksinimidesteren av m-maleimidobenzo-syre. Blandingen inkuberes i 1/2 time ved 25°C. Løsningen blir videre avsatt på kolonne Sephadex G 25 på 10 ml ekvilibrert i 125mM fosfatpuffer, pH 7,0. Elueringen følges ved å

måle den optiske tetthet ved 280 nm. Man samler opp 2,5 ml fra eksklusjonsvolumet fra kolonnen. Måling av substitusjons-graden utføres på en alikvot ved reaksjon med et overskudd av

14

C-cystein.

Man får således en løsning på 8 mg antistoff pr. ml med

en substitusjonsgrad på 3,6 maleimidgrupper pr. mol antistoff.

c) Urease

Det anvendte enzym er urease av opprinnelse SIGMA (type

VII, referanse U 0376), som titrerer 170 enheter pr. mg. En enhet er mengden enzym som tillater frigjøring av 1 mikromol av NH4+ pr. minutt ved 20°C og pH 7,0 fra urea.

Dette enzym inneholder naturlig 27 tiolgrupper pr. mole-kyl,med molekylvekt 480 000. Disse tiolgrupper som er titrer-bare ved metoden til ELLMAN, er ikke alle nødvendige for den enzymatiske aktivitet. Noen kan dog tjene til å sikre koblingen med aktivert antistoff.

d) Kobling av antistoff og enzym

Umiddelbart etter avsalting på G 25 blir 2,4 ml av den

aktiverte antistoffløsning blandet med 2,0 ml av urease-løsning på 24 mg/ml i 125 mM fosfatpuffer, pH 7,0. Man inkuberer blandingen ilt ved 25°C, og etter sentrifugering har man den på en kolonne med 4 50 ml Sephadex gel G 200 ekvilibrert i puffer PBS. Elueringen følges ved å måle den optiske tetthet ved 280 nm og ved å måle urease-aktiviteten i henhold til teknikken til SUMMER.

Man samler fraksjonene som inneholder de sterkeste urease-aktiviteter, og man får således 14 ml konjugatløsning på 102 enheter pr. ml.

Hvis en alikvot fraksjon av denne løsning blir kromatogra-fert på en Protein A-Sepharose gelkolonne, konstaterer man at 30 % av ureaseaktiviteten ikke blir holdt tilbake på kolonnen. Resten av ureaseaktiviteten blir eluert på samme tid som antistoffet ved hjelp av pufferen med pH 3,5. Et kontrollforsøk beviser at urease som ikke er koblet til antistoff, ikke i det hele tatt fikseres på kolonnen. Dette viser at 70 % av urease-aktiviteten til de samlede fraksjoner nettopp tilhører et antistoff -urease-konjugat. For forsøkene beskrevet heretter er løs-ningen ikke blitt frigjort fra den frie, forurensende urease som er uten virkning under de anvendte betingelser, som det er beskrevet heretter.

Eksempel 4

Potensialisering av immunotoksin anti T65 ved det immunoenzymatiske konjugat fra eksempel 3.

Konjugatet som ble oppnådd som angitt foran

(eksempel 3), ble studert ut fra det som angår dets biologiske egenskaper og mer spesielt dets evne til å potensialisere aktiviteten til immunotoksin T65 i en egnet cellulær modell. Denne modell består av celler fra den humane lymfoblast-oide linje CEM'som naturlig bærer antigen T 65. Dette antigen mot hvilket det anvendte immunotoksin er rettet, utgjør det før-ste mål-antigen i modellen. Man kan dessuten merke cellene ved hjelp av haptenet trinitrofenyl (TNP) i henhold til teknikken beskrevet i patentsøknad nr. 78 27 838. Dette hapten blir meget lett gjenkjent av antistoff anti-DNP inneholdt i det studerte immunoenzymatiske konjugat og utgjør altså det andre mål-antigen i modellen. Det er blitt vist at merkingen av cellene med haptenet TNP ikke endrer cellenes levedyktighet og ikke forstyrrer fikseringen av immunotoksin anti T6 5 på cellene.

Idet den fundamentale egenskap ved immunotoksinene er å inhibere proteinsyntesen i målcellene, består den anvendte test i å måle virkningen av de studerte stoffer på inkorpore-14

ringen av C-leucin i cancerceller i kultur.

Denne måling utføres i henhold til en teknikk tillempet fra den som er beskrevet i Journal of Biological Chemistry, 1974, 249 (11), 3557-3562 som bruker markøren <14>C-leucin til bestemmelsen av graden av proteinsyntese. Bestemmelser av inkorporert radioaktivitet er her utført på celler som er helt isolert ved filtrering.

Ut fra disse bestemmelser kan man tegne kurver over virkning/doser idet man på abscissen angir den molare konsentrasjon i kjede A av de studerte stoffer og på ordinaten inkorporering

14

av C-leucin uttrykt i prosent av inkorporering i kontroll-celler i fravær av alle stoffer som påvirker proteinsyntesen. Man kan således for hvert av de studerte stoffer bestemme den

14 konsentrasjon som inhiberer 50 % av inkorporeringen i C-leucin eller "inhiberingskonsentrasjon 50" (CI 50).

De forskjellige forsøk i dette eksperiment ble kjørt som følger. De tilsvarende forsøksresultater er presentert i fig.2.

a) - Kontrollforsøkene utført i eksempel 2 a) ble ikke gjentatt, da de kan betraktes som gyldige i det foreliggende eksempel.

b) - Celler CEM merket med TPN ble inkubert i 18 t ved 37°C i nærvær av et immunotoksin med spesifisitet anti T65 oppnådd som angitt i vår tidligere søknad nr. 81 21-836, deretter-underlagt fasen med inkorporering av radioaktiv markør. Formen på kurven over cytotoksisitet er identisk med den som man får

med de samme celler som ikke er merket med TNP under de samme betingelser for inkubering, som således beviser at merkingen av disse celler med TPN er riktig utført (kurve 6).

c) - Celler CEM merket med TNP inkuberes først ilt ved 4°C i nærvær av ikke-konjugert urease i forholdet 1 U/ml, blir

deretter vasket, inkubert i 18 t ved 3 7°C i nærvær av immuno--9

toksin anti T65, kun i en konsentrasjon pa 10 M, og 5 mM urea og til slutt underlagt fasen med inkorporering av radioaktiv markør.

14

Verdien av inkorporering av C-leucin oppnådd i dette for-søk (65%), adskiller seg ikke fra den som er oppnådd ved samme konsentrasjon av immunotoksin anti T65 i forsøk b). Dette resultat viser at inkubering i nærvær av ikke-konjugert urease ikke medfører noen binding av urease til cellene, og som følge av dette ingen potensialisering av virkningen av immunotoksin anti T6 5. d) - Celler CEM merket med TNP blir først inkubert ilt ved 4°C i nærvær av det immunoenzymatiske konjugat beskrevet foran, anvendt i en konsentrasjon på 1,02 U/ml. Det er på annet hold bevist at dette konjugat anvendt under disse betingelser ikke utviser noen spesiell cytotoksisitet på de anvendte celler. Disse celler blir så vasket for å fjerne alt konjugat som ikke er fiksert, så blir de inkubert i 18 t ved 37°C i nærvær av immunotoksin anti T65 og 5 mM urea. De blir til slutt underlagt fasen med inkorporering av radioaktiv markør. CI 50

-13

som oppnås, er 2,4.10 M (kurve 7).

Denne verdi som er helt sammenlignbar med den som man fikk ved anvendelse av konjugatet i eksempel 1, representerer en be-tydelig potensialiseringseffekt utøvd av det immunoenzymatiske konjugat overfor immunotoksinet.

Dette forsøk viser at denne potensialiseringseffekt med-fører fiksering av det immunoenzymatiske konjugat til antigenet svarende til dets immunologiske spesifisitet. Denne fiksering motstår vasking av cellene og lar være igjen på overflaten av disse enzymatisk aktiv urease som produserer NH^-ioner fra urea tilstede i inkubasjonsmiljøet med immunotoksin, hvilket medfører potensialiseringseffekten til NH*-ionene.

Den oppnådde potensialiseringseffekt er helt analog med den som vises når inkuberingen finner sted i nærvær av 10 mM ammoniumklorid tilsatt til inkubasjonsmiljøet istedenfor systemet immnoenzymatisk konjugat/substrat.

I tilfellet med tilsetning av ammoniumklorid er CI 50

som oppnås, da også 3,8»lO — 13M, som den tilsvarende kurve på figur 2 viser (kurve 8).

Eksemplene ovenfor viser at produktene som fremstilles ved oppfinnelsen kan brukes i human-terapi.

De nye medikamenter fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes via injiserbar vei og særlig via intravenøs vei. De kan også brukes til behandling av lidelser, cancerøse eller ikke, som vil være følsomme for antistoffet som blir anvendt til fremstilling av immunotoksinet. De vil bli brukt i doser og under betingelser som det vil passe å bestemme i hvert tilfelle i forhold til årsaken til og typen av den lidelse som skal behandles.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av immunoenzymatiske konjugater for anvendelse som potensiatorer for immunotoksin i medisinsk assosiasjon som inneholder et immunotoksin, oppnådd ved kobling, ved kovalent binding av kjede A i ricin med antistoffer eller fragmenter av antistoffer rettet mot et antigen som bæres av målceller,

   karakterisert ved at den består i kobling, ved kovalent binding, av et antistoff eller et fragment av antistoff som har bevart sin evne til å gjenkjenne et antigen som bæres av den samme målcelle, med et enzym som har evne til å frigjøre ammoniumioner fra naturlige substrater som tolereres godt i høyere dyreorganismer, idet den nevnte kobling enten utføres ved at et protein som har en tiolfunksjon, nemlig P^SH, omsettes med et annet protein P2 i hvilket en funksjon som omfatter en disulfidbro er blitt innført, for eksempel P2-S-S-X, hvor X er et aktiveringsradikal, idet reaksjonen utføres i vandig miljø, ved pH 7 og 25°C, eller ved at et protein som har en tiolfunksjon, nemlig P^SH, omsettes med et annet protein P2 , i hvilket maleimid-funksjonen er blitt innført, nemlig forbindelsen av formel

   hvor Z er en avstandsstruktur, idet reaksjonen utføres i vandig miljø ved pH 7 og ved 25°C, idet proteinene P^ og P2 er henholdsvis antistoffet og enzymet.