HU189246B - Process for preparing conjugates of an enzyme and an antobody formed by covalents bonds - Google Patents
Process for preparing conjugates of an enzyme and an antobody formed by covalents bonds Download PDFInfo
- Publication number
- HU189246B HU189246B HU83906A HU90683A HU189246B HU 189246 B HU189246 B HU 189246B HU 83906 A HU83906 A HU 83906A HU 90683 A HU90683 A HU 90683A HU 189246 B HU189246 B HU 189246B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antibody
- enzyme
- cells
- immunotoxin
- protein
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6817—Toxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
- A61K47/6899—Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy [ADEPT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
A jelen találmány egy új konjugátum előállítási eljárásával foglalkozik, amely konjugátumban egy enzim és egy antitest kovalens kötéssel kapcsolódik össze.
A találmány szerinti eljárással nyert új termék tehát egy olyan konjugátum, amely valamely enzimet és egy cél-sejt által hordozott antigén ellen irányuló antitestet vagy ennek az antitestnek egy fragmensét kovalens kötéssel összekötve keletkezik.
Az igy kapott anyagokat immuno-enzim konjugátumnak nevezhetjük.
Ezek az immuno-enzim konjugátumok tehát mesterségesen összekapcsolt kevert molekulák, amelyekben az enzim kovalens kötéssel van összekapcsolva egy cél-sejt által hordozott antigén ellen irányuló antitesttel.
Az alkalmazott enzimek ismertek. Az alkalmazott antitestek vagy poliklonálisak, ha az állatokon végrehajtott hagyományos immunizálással nyerjük azokat, vagy monoklonálisak, ha limfocita és mielóma sejtek közti fúzióval nyert hibrid-sejtek Honjával termeljük. Az említett antitestet lehet alkalmazni vagy mint teljes immuno-globulin molekulát, amely képes felismerni a kiválasztott antigént, vagy mint ennek az immunoglobulin molekulának bármely olyan fragmensét, amely megőrizte azt a képességét, hogy a kiválasztott antigént felismerje; főleg a F(ab’)2, Fab és Fab’ néven ismert fragmensekről van szó.
Az antitestnek (vagy az antitest fragmensének) összekapcsolását az enzimmel többféle módszer szerint is végre lehet hajtani, feltéve, hogy a kiválasztott módszer
- megőrzi a konjugátum mindkét komponensének: az antitestnek és az enzimnek a biológiai aktivitását, biztosítja az eljárás kielégítő reprodukálhatóságát és a jó kitermelést a kapcsolási folyamatban,
- lehetővé teszi az enzim/antitest arány értékének szabályozását a kapott konjugátumban és végül stabil és vízoldható terméket nyújt.
Azok között a módszerek között, amelyek kielégítik a fenti követelményeket, a legelőnyösebbek azok, amelyek egy vagy több tiol-funkciót használnak a két fehérje közti kapcsolat létrehozásához. Az említett tiol-funkciók szempontjából közömbös, hogy ezek az összekapcsolandó fehérjék valamelyikéhez tartoznak, vagy mesterségesen vezetjük be azokat egyik vagy másik fehérjébe, amely eredetileg nem tartalmaz tiol-csoportot.
Ha egy vagy több tiol-csoportot kell mesterségesen bevezetni a fehérjébe, ezt végrehajthatjuk a szóbanforgó fehérje és a fehérje néhány aminocsoportját acilezni képes 5-acetil-merkapto-borostyánkősav-anhidrid reakciójával. A tiol-csoportot azután fel lehet szabadítani az acetil-védőcsoport eltávolításával, amelyet hidroxil-aminnal végezhetünk el, amint ez az „ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND. BIOPHYSICS” 119, 41-49 (1967) irodalmi helyen olvasható. Dialízissel hajtható végre a reagensek feleslegének, valamint a kis molekulasúlyú reakciótermékeknek az eltávolítása. Más módszerek is ismeretesek az irodalomban a tiolfunkciók bevezetésére az összekapcsolandó fehérjék valamelyikébe.
A találmány szerint a két fehérje egyikét, amely egyedül rendelkezik tiol funkcióval, reagáltatjuk a másik fehérjével, amelybe előzőleg bevezettünk egy vagy több olyan funkciót, amely képes reagáltatni tiolokkal. A reakciót vizes közegben végezzük, 5 és 9 pH értékek közt, 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten, így jutunk stabil, specifikus kovalens kötéshez. Az említett kovalens kötés főleg diszulfidhid, vagy tioéter-kötés. Ρ,-nek nevezzük ezután a két fehérje közül azt, amely a tiol-funkciót vagy funkciókat hordozza és P2-nek nevezzük a másik, kapcsolandó fehérjét.
1. Diszulfid-híd
A konjugátum képződését a következő reakcióvázlattal szemléltethetjük:
P,-SH + P2-S-S-X->P, — S-S-P2 + XSH ahol -S-S-X aktivált kevert diszulfidot jelent, ahol az X csoport az aktivátor-gyök, és jelentése 2-piridil- vagy 4-piridilcsoport.
Az aktivált kénatommal helyettesített P2 fehérjét a P2 fehérjéből lehet nyerni, egy olyan reagens segítségével végzett helyettesítéssel, amely reagens az aktivált kénatomot hordozza. A folyamatot az alábbi reakcióvázlat szemlélteti p2+y-r~s-s-x-*p2-r -s-s-x ahol P2 a szubsztituálandó fehérje, Υ a reagensnek a fehérjéhez történő kovalens kötését lehetővé tevő csoport, R olyan csoport, amely egyszerre hordozhatja az Υ szubsztituenst és az -S-S-X szubsztituenst X az aktivátor-gyök.
Az Υ funkciós csoport olyan csoport, amely képes kovalens kötést létesíteni a szubsztituálandó fehérjét alkotó aminosavak oldalláncain hordozott valamelyik csoporttal. Ezek közül a fehérjében levő lizil-gyök terminális aminocsoportja különösen javasolt. Ebben az esetben Υ főleg a következő csoportokat jelentheti:
- karboxil-csoportot, amely a fehérje amínocsoportjaival kötést létesíthet egy kötő-ágens, mint pl. karbödiimid, és főleg ennek egy vízoldható származéka, mint pl. 1 -etil-3-(3-dietil-amino-propil) karbödiimid jelenlétében,
- karbonsav-kloridot, amely közvetlenül képes reagálni az amino-csoportokkal. acilezve azokat,
- úgynevezett „aktivált” észtert, mint pl. egy orto- vagy para-, nitro- vagy dinitro-fenil észtert, vagy egy N-hidroxi-szukcinimid-észtert, amely közvetlenül képes reagálni az aminocsoportok kai , acilezve azokat,
- két karboxil-csoporttal rendelkező savak belső anhidridjeit, mint pl. borostyánkősav-anhidridet, amely spontán reagál az amino-csoportokkal, amid-kötést képezve, ^NH
- imido-észter csoportot ( — Q qr , ahol Ri alkil-csoport), amely a fehérje amino-csoportjával a következő reakcióvázlat szerint reagál:
Fehérje—NH, + fp ' C R2 NH
II — Fehérje—NH— C —R2+R,OH
189 246
Az - S - S - X gyök aktivált kevert diszulfidot jelent, amely reagálni képes szabad tiol-gyökkel. Ebben a kevert diszulfidban X főleg 2-piridil vagy 4-piridil-csoportot jelent, amelyek egy vagy több alkil, halogén vagy karboxil-gyökkel lehetnek helyettesítve. X jelenthet fenil-csoportot, amely előnyösen egy vagy több nitro- vagy karboxil-csoporttal van helyettesítve. X továbbá jelenthet alkoxikarbonil-csoportot is, pl. metoxikarbonil-csoportot.
Az R gyök bármilyen olyan gyököt jelenthet, amely egyszerre képes hordozni az Y és az — S —S —X szubsztituenseket. Ezt úgy kell kiválasztani, hogy ne tartalmazzon olyan csoportokat, amelyek a későbbi reakciók folyamán alkalmazott reagensekkel vagy a szintetizált termékekkel reakcióba lépve zavart okoznának. Az R csoport főleg -(CH2)n csoport lehet, ahol η 1 és 10 közti egész szám, vagy egy R3—CH—
I
CH
R4 csoport, amelyben R4 jelentése hidrogénatom vagy 1-8 szénatomszámú alkil-csoport és R3 olyan szubsztituens, amely a további reakciókhoz szükséges reagensekhez közömbös (pl. karbamát-csoport, NH—C—OR5
I!
o ahol R5 1-5 szénatomos, egyenes vagy elágazó szénláncú alkilcsoport, elsősorban tere. butilcsoport).
Az Y-R-S-S-X vegyület reakcióját a P2 fehérjével homogén folyadék-fázisban hajtjuk végre, leggyakrabban vízben vagy puffer-oldatban. Amikor a reagens oldhatósága ezt megköveteli, lehetséges a reakcióközeghez vízzel elegyedő szerves oldószert, pl. valamilyen alkoholt, főleg tercier butanolt adni 20 tf % mennyiségig.
A reakciót szobahőmérsékleten hajtjuk végre, a reakció időtartama néhány óra és 24 óra közt változhat. Ez után a dialízis teszi lehetővé, hogy a kis molekulasúlyú termékeket és a reagensek fölöslegét eltávolítsuk. Ez a folyamat teszi lehetővé nagy számú szubsztituens bevezetését egy mól fehérjébe, ez a szám általában 1 és 15 között van.
Ilyen vegyületeket használva a kapcsolás a P, fehérjével megtörténik a két fehérje vizes oldatának összehozásával 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten, a reakció időtartama néhány órától egy napig terjedhet. A nyert oldatot dializáljuk a kis molekulasúlyú termékek eltávolítása érdekében, majd a konjugátumot különböző ismert módszerekkel tisztítjuk.
2. Tioéter-kötés
A konjugátum készítése abban áll, hogy Pi-SH-t reagáltatunk P2 fehérjével, amelybe előzőleg maleimid-csoportot vezettünk be.
A reakciót az 1. reakcióvázlat szemlélteti; a reakcióvázlatban, az (I) és (II) általános képletben Z jelentése fenil- vagy naftilcsoport mint térkitöltő csoport.
A maleimiddel szubsztituált P2 fehérjét ((I) általános képlet) magából a P2 fehérjéből nyerjük, a fehérje amino-csoportjait valamely maleimidcscportot hordozó reagens segítségével szubsztituálva. A folyamatot a 2. reakcióvázlat szemlélteti, a reakcióvázlatban a (III) általános képletben Y, jelentése a következő lehet;
- vagy karboxil-csoport, az ezzel kivitelezett reakció a karboxil-csoport aktiválásával történik egy kö’ő-ágens, mint pl. karbodiimid, és elsősorban ennek vízoldható származékai, pl. l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)karbodiimid, jelenlétében,
- vagy egy ún. „aktivált észter”, mint pl. egy orto- vagy para-, nitro- vagy dinitro-fenil-észter, vagy egy N-hidroxiszukcinimid-észter, amely közvetlenül képes reagálni az amino-csoportokkal, acilezve azokat.
Az ilyen reagensek készítését írja le pl. a Helvetica Chimica Acta 58, 521-541 (1975) irodalmi hely. Ugyanilyen típusú reagensek rendelkezésre állnak a kereskedelemben is.
Á (III) általános képletű vegyület reakciója a P2 fehérjével homogén folyadékfázisban történik, leginkább vízben vagy pufferoldatban. Amikor a reagensek oldhatósága ezt szükségessé teszi, a reakcióközegben 20 térfogat %-ig lehet vízzel elegyedő oldószert adni, mint pl. alkoholt, elsősorban tercier butanolt.
A reakciót szobahőmérsékleten hajtjuk végre, a reakció időtartama néhány óra és 24 óra közt változhat. Ez után a dialízis teszi lehetővé, hogy a kis molekulasúlyú termékeket és főleg a reagensek feleslegét eltávolítsuk. Ezeknek a folyamatoknak a segítségével nagyszámú szubsztituenst vezethetünk be egy mól fehérjébe, ez a szám általában 1 és 15 között van.
Ilyen vegyületeket használva a kapcsolás a P, fehérjével megtörténik a két fehérje vizes oldatának összehozásával 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten, a reakció időtartama néhány órától egy napig terjedhet. A nyert oldatot dializáljuk a kis molekulasúlyú termékek eltávolítása érdekében, majd a kenjugátumot különböző ismert módszerekkel tisztítjuk.
Ilyen immuno-enzim konjugátumot bármilyen enzimmel lehet készíteni. Gyógyászati alkalmazása azonban, amelyre ezeket a konjugátumokat szánjuk, és amelyet ez után leírunk, az előnyös enzimek azok, amelyek képesek ammónium-ionokat felszabadítani természetes szubsztrátumokból, és amelyeket a felnőtt állati szervezetek jól tűrnek.
A nemzetközi osztályozás szerint, amely pl. a „Comprehensive Biochemistry” (Általános Biokénra) 13. kötet, 3. kiadásában (M. Florkin; Ε. H. Stortz, Elsevier, 1973) jelent meg, a gyógyászatilag alkalmas enzimek, amelyek a találmányban is szerepelnek, főleg a következő csoportokban találhatók;
- az 1. csoportban (oxido-reduktázok) és főleg az U4 alcsoportban, amely az aminosa v-dehidrogenázokat és az aminooxidázokat tartalmazza,
- a 3. csoportban (hidrolázok) és főleg a 3-5 alcsoportba, amely az amidokat, amidineket és más C—N kötéseket (beleértve a peptid-kötéseket is) hidrolizáló enzimeket tartalmazza,
- a 4. csoportban (liázok) és főleg a 4-2 és 4-3
189 246 alcsoportokban, amelyek a telítetlen vegyületek képződésével járó bomlási reakciókat katalizáló enzimeket tartalmazza.
A következőkben felsoroljuk azokat az enzimeket, amelyeket a találmányunk szerinti immunoenzim konjugátumok előállításához alkalmasnak tekinthetünk. Minden esetben jelezzük a nemzetközi nevezéktanban az enzim megjelölésére alkalmazott kódot is:
1-4-1-1 alanin-dehidrogenáz
1-4-1-3 glutamát-NAD(P)+ dehidrogenáz 1—4 15 L-aminosav-dehidrogenáz 1-4-3-2 L-aminosav-oxidáz
3-5-1-1 aszparagináz
3-5-1-2 glutamináz
3-5-1-4 amidáz
3-5-1-5 ureáz
3-5-3-6 arginin deamináz
3-5-4-4 adenozin deamináz
3- 5-4-6 kreatinin deamináz
4- 2-1-13 L-szerin dehidratáz
4-2-1-16 L-treonin-dehidratáz
4-3-1-1 aszpartát-ammónia-liáz (vagy aszpartáz)
4-3-1-3 hisztidin-ammónia-liáz (vagy hisztidáz)
4-3-1-5 fenilalanin-ammónia-liáz
A találmánynak egy másik szempontja ezeknek az immuno-enzim konjugátumoknak az alkalmazása az ember-gyógyászatban.
Korábbi francia szabadalmi bejelentésekben (78 27 838, 79 24 655, 81 07 596 és 81 21 836) a bejelentők leírták egy ún. rák-ellenes konjugátum előállítását, amelyet egy, az elpusztítandó sejt által hordozott antigén ellen irányuló antitest vagy ennek egy fragmense és a ricin vagy a ricin „A” lánca között kovalens kötéssel létesül. Az ilyen típusú termékeket a jelen bejelentésben „immuno-toxin” általános néven nevezzük.
A 81 21 836 számú francia szabadalmi bejelentésben leírják az ammónium-ionoknak (bármely sója, de elsősorban kloridja formájában) azt a tulajdonságát, hogy hatásosan érvényre juttatják ezeknek az ímmuno-toxinoknak a citotoxikus hatását.
Az ammónium-sóknak az a tulajdonsága, hogy az immuno-toxinok szelektív citotoxikus aktivitását érvényre juttatják, az esetek két típusánál jelent előnyöket:
a) Mindenkor, amikor egy immuno-toxint, mint szelektív citotoxikus ágenst in vitro alkalmazunk a sejt elroncsolásához.
A gyógyászatban ilyen eset lehet pl., amikor az immuno-toxint, mint citotoxikus ágenst a leukémiában szenvedők csontvelőjének kezeléséhez használjuk, akikbe azután az így kezelt csontvelőt beültetjük, amint ez a bejelentők 81 21 826 számú francia szabadalmi bejelentésében le van írva.
b) Ha az immuno-toxint in vivő alkalmazzuk az embergyógyászatban, olyan esetekben ha az immuno-toxin bevezetése előtt, vagy azzal párhuzamosan vagy az után lehetséges ammónium-sót beadni, ilyen módon biztosítva az immuno-toxin hatásának érvényre juttatását, ahogyan ez a korábban említett szabadalmi bejelentések leírják.
Az utóbbi esetben azonban, ahol az immunotoxint in vivő használjuk, az ammónium-só in vivő alkalmazásának az érvényre juttatás kifejtésére bizonyos korlátái vannak, amelyek az ammóniumionok aktuális toxicitásából erednek és abból a tényből, hogy viszonylag nehéz hosszabb időtartamon át a beteg biológiai folyadékjaiban a megfelelő ammónium-ion koncentrációt fenntartani.
A bejelentők által elvégzett munka lehetővé tette ezeknek az ammónium-ionokkal kapcsolatos korlátozásoknak jelentős mértékű csökkentését, e közben fenntartva az immunotoxinok reakciókinetikájának és citotoxikus aktivitásának ammónium-sók által előidézett előnyös érvényre juttatását. Ez a munka azt is megmutatja, hogy az immuno-toxinokhoz megfelelő koncentrációban adott ammönium-sóval nyert érvényre juttató és gyorsító hatás akkor is fellép, ha az ammónium iont a cél-sejt közvetlen környezetéből nyerjük, mégpedig ezeknek a sejteknek a környezetében természetesen jelen levő vagy oda mesterségesen bevezetett szubsztrátumokból enzimes reakció segítségével.
Ez a munka azt is megmutatja, hogy az eredmény különösen hatásosan jelenik meg, ha az ammónium-iont szolgáltató reakciót katalizáló enzim egy olyan antitesttel (vagy antitest-fragmenssel) van összekapcsolva, amely képes a cél-sejtek felületén levő antigén felismerésére.
Az eljárás szerinti módszer jelentős előnyökkel jár, ezek közül néhányat ismertetünk a következőkben:
a) Az alkalmazott enzim ilyen módon a cél-sejt membránján koncentrálódik az antitestnek (vagy az antitest-fragmensnek) az említett membránon jelen levő antigénhez való affinitása miatt. Ennek következtében az NH4 + ionoknak az enzimes reakció révén történő kibocsátása csak a cél-sejt membránjának közvetlen szomszédságában történik, ez csökkenti az ammónium-ionok általános loxicitásának kockázatát, míg elősegíti ezeknek az ionoknak a kölcsönhatását a cél-sejtekkel, amely kölcsönhatás szükséges ahhoz, hogy az ammóniumion a reakció érvényre juttatásában szerepet játszhasson.
b) Az NH4 + ionokat a szubsztrátum jelenlétében folyamatosan termelő reakció, valamint a nemtoxikus volta alapján kiválasztott szubsztrátum segítségével végbemenő folyamat az érvényre juttatási mechanizmus alkalmazásában nagy rugalmasságot enged meg:
- Ha a szubsztrátum endogén és megfelelő koncentrációban van jelen, az érvényre juttató immuno-enzim konjugátum az immuno-toxin beadása előtt, azzal együtt vagy az után adható be, a körülmények optimumától függően, amelyet a kezelt személyenként egyedileg kell meghatározni.
- Ha az enzimet úgy választottuk meg, hogy szubsztrátuma nincs elég nagy koncentrációban jelen a vérben és az extracelluláris folyadékban és az említett szubsztrátumot is be kell adni a paciensnek, a gyógyszer alkalmazkodási lehetőségét a maximumig ki lehet használni, mivel lehetségessé válik szabadon és függetlenül megszabni a beadagolandó három komponens: az immuno-toxin, az immunoenzim konjugátum és a szubsztrátum mindegyikének beadagolást idejét, időtartamát és mennyiségét.
189 246 az egyes paciensek kezeléséhez meghatározott optimális feltételekkel összhangban.
c) A fentebb jelzett körülmények között legalább két, a kívánt hatás eléréséhez szükséges, ható vegyület irányul szelektíven a cél-sejtekre:
- egyrészt a ricin A lánca, amely az ún. immunotoxin konjugátumban levő citotoxikus hatóanyag,
- másrészt az enzim, amely az érvényre juttató rendszer lényeges komponense, és amelyet az immuno-enzim konjugátum tartalmaz.
Ezek a ható vegyületek minden esetben össze vannak kapcsolva - abból a célból, hogy a cél-sejtre irányuljanak és azon szelektíven rögzítve legyenek antitestekkel (vagy antitestek fragmenseivel), amelyek felismerik a cél-sejtek felületén jelenlevő antigéneket. Ha az alkalmazott antitest képes felismerni egy olyan antigént, amely szigorúan fajlagos az elpusztítandó sejtpopulációra, akkor ugyanazt az antitestet lehet használni az összekapcsoláshoz különböző hatóanyagokkal. Legtöbb esetben azonban ajánlatos kiválasztani több különböző antitestet, amelyek különböző antigéneket ismernek fel, amelyeket mind hordoz a cél-sejt. Ez után, még ha mindegyikük nem is szigorúan fajlagos a célsejtekre, teljesen valószínűtlen, hogy a két kiválasztott antigén mindegyike jelen van a cél-sejteken kívül más sejteken; ilyen módon egy rendkívül erőteljes eszköz van a kezünkben az immuno-toxinok citotoxicitása fajlagos jellegének további növelésére.
A következő példák a találmány bemutatására szolgálnak és nem korlátozó jellegűek.
1. Példa
Az immuno-enzim konjugátum egy aktivált diszulfid-híddal szubsztituált anti-dinitrofenil-antitest és egy növényi eredetű ureáz reakciójával készül.
a) Anti-dinitrofenil-antitest (Anti-DNP)
Ez az antitest monoklonális antitest, amelyet a hagyományos technikával tisztítottunk Balb/C törzsbeli egerek - amelyekbe FQ hibridómát ültettünk be - hasi vízkóros folyadékjából.
Magát az említett hibridómát bovin γ-globulinnak - amelyen előzőleg 20 DNP gyököt rögzítettünk mólonként - immunizált Balb/C törzsbeli egerek lépsejtjeinek és egér NS 1 mielóma állomány sejtjeinek fúziójával nyerjük. A hibridómát klónozással izoláljuk, hagyományos technikát alkalmazva. Az így nyert antitest G osztályhoz tartozó immuno-globulin, amely a 2 b izotípushoz tartozik, és amelynek affinitási konstansa (ε-DNP-lizin ligandumhoz mérve) 1,8-108 (mól/1)-1.
b) Aktivált anti-DNP antitest ml, 7,8 mg/ml anti-DNP antitestet (= 0,0104 pmól antitest) tartalmazó oldathoz 1 mg, előzetesen terc-butanolban oldott 3-(pirid-2-il-diszulfanil)-propionsav és 0,6 mg l-etil-3-(dimetil-amino)karbodiimid vizes oldatát adjuk, majd az így kapott elegyet 30 °C-on 15 percen át keverjük és ezután TPE-vel szemben folyamatosan dializáljuk pH 7-nél 40 órán át 500 ml/óra sebességgel. A dialízist követően a proteikus oldatot centrifugáljuk, amikor 2 ml olyan oldatot kapunk, amely 7,2 mg mennyiségben módosított antitestet tartalmaz. 2merkapto-etanollal végrehajtott cserebomlásos reakcióban felszabaduló piridin-2-tion 343 nm-nél végzett spektrofotometriás meghatározásával megállapítható, hogy az antitest molekulánként 1,2 aktivátor-csoportot tartalmaz.
c) Ureáz
Az alkalmazott enzim a SIGMA-tól származik (VII. típus, U 0376 referencia-szám), aktivitását 170 egység/mg-nak mértük. Egy egység az enzimnek az a mennyisége, amely karbamidból 1 mikromól NH4 + iont szabadít fel percenként 20 ’C hőmérsékleten, pH 7-nél.
Az említett enzimnek természetes formájában 27 tiol-csoportja van molekulánként, 480 000 molekulasúlynál. Az említett tiolcsoportok, amelyek ELLM AN módszerével [Anderson, W. L. és Wetlaufer, D. B.: „A new method fór disulfide analysis of peptides, Analytical Biochemistry, 67. 493—502 (1975)] mérhetők, nem mind szükségesek az enzimaktivitáshoz. Ezek közül néhány tehát felhasználható az összekapcsoláshoz az aktivált antitesttel.
d) Az antitest összekapcsolása az enzimmel mg ureázt feloldunk 0,625 ml aktivált antitestoldatban (7,2 mg/ml 0,125 mól/l-es, 7,0 pH-jú foszfát-pufferben), amely 4,5 mg aktivált antitestnek felel meg. Az oldatot inkubáljuk 25 ’C hőmérsékleten 14 órán át.
A reakciókeveréket ez után Sepharose 6 (Pharmacia) géloszlopon, amelyet PBS pufferrel egyenlítettünk ki (PBS puffer foszfátra 10 mmól/1, nátrium-kloridra 14 mmól/1, pH 7,4), kromatografáljuk. A leoldást a 280 nm-nél mért optikai sűrűséggel és az ureáz aktivitásának mérésével ellenőrizzük, az ureáz-aktivitás méréséhez SUMMER módszerét használva (S. B. Colowick és Ν. O. Káplán: Methods in Enzymology, Π. kötet, 378. oldal, Academic Press kiadás, 1955).
A legerősebb ureáz aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítjük, 8 ml 6,5 egység/ml-es konjugátumot nyerünk.
Ha az említett oldat egy alikvot frakcióját egy, brómciánnal előzőleg aktivált Sepharose 4 B mátrixon oldhatatlanná tett és hat DNP-gyökkel szubsztituált bovin szérum albuminban abszorbeáljuk, úgy találjuk, hogy az ureáz-aktivitás teljesen abszorbeálódik az oszlopon. Ez is azt mutatja, hogy a konjugátumban jelen levő antitest megőrzi a DNP-haptén felismerő kapacitását, és hogy az ureáz valóban összekapcsolódott az említett antitesttel.
2. Példa
Anti-T65 immuno-toxin érvényre juttatása
A találmány szerinti, a korábbiak alapján nyert konjugátumot biológiai tulajdonságaira és még inkább az anti-T65 immuno-toxin aktivitást érvényre juttató kapacitására vizsgáljuk egy megfelelő sejtmodellen.
Az említett modellt humán limfoblasztoid CEM sejt-állományból (ATCC CCL 119) alakítjuk ki, amely természetes formájában T65 antigént hordoz. Az említett antigén, amely ellen irányul az alkalmazott immuno-toxin, alkotja a modell első
-5189 246 cél-antigénjét. Lehetséges ezeket a sejteket trinitrofenil-hapténnel (TNP) jelezni, a 78 27 838 számú korábbi bejelentésben leírtak szerint. Az említett haptént a vizsgált immuno-enzim konjugátumban levő anti-DNP antitest tökéletesen felismeri és ilyen módon megalkotja a modell második cél-antigénjét. Bebizonyosodott, hogy a sejtek jelzése TNP hapténnel nem váltóztatja meg a sejtek életképességét és nem zavarja meg az anti-T65 immuno-toxin rögzítését ezeken a sejteken.
Ezeknek az immuno-toxinoknak alapvető tulajdonságát, vagyis a cél-sejtekben a fehérje-szintézis gátlást olyan módon mérhetjük, hogy megvizsgáljuk a vizsgált anyagok hatását a 14C-leucin beépülésére rákos sejtekbe, megfelelő tenyészetben.
Ezt a mérést a Journal of Biological Chemistry 1974, 249, 3557-62 irodalmi helyen leírt technikából adaptált technika szerint hajtjuk végre, l4Cleucin jelzőanyagot használva a fehérje-szintézis sebességének meghatározására. A beépült radioaktivitás meghatározását a szűréssel kinyert teljes sejten végezzük.
Ezekből a meghatározásokból a dózis/hatás görbéit meg lehet rajzolni, az X tengely mutatja a tanulmányozott anyag A-láncának moláris koncentrációját, és az Y tengely a 14C-leucin beépülését, a fehérje-szintézisre ható bármely anyag távollétében vizsgált kontroli-sejteknél mért beépülés százalékában kifejezve.
Ilyen módon minden tanulmányozott anyagnál meghatározzuk azt a koncentrációt, amely 50%ban gátolja a I4C leucin beépülését, vagyis az „Inhibitor koncentráció 50”-et (IC 50).
Ennek a kísérletnek a különböző vizsgálatait a következőkben mutatjuk be. A megfelelő kísérleti eredményeket az 1. ábra ábrázolja.
a) CEM sejteket (ATCC CCL 119) inkubálunk 18 órán át 37 °C hőmérsékleten ismert koncentrációjú, referencia-anyagként szolgáló ricin vagy ennek izolált A lánca jelenlétében, majd a radioaktív jelzőanyagot beépítjük a sejtbe. A nyert IC 50 érték
4- 10 12 mól/1 ricinre és 4,5 10 s mól/1 A-láncra. Azt találtuk, hogy ezek az értékek megkülönböztethetetlenek azoktól az értékektől, amelyet TNPhapténnel jelzett CEM-sejtekkel nyerünk (1. görbe: ricin CEM sejten; 2. görbe: ricin A-lánc CEM sejten).
b) TNP-vel jelzett CEM-sejteket 18 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk anti-DNP-re fajlagos immuno-toxin jelenlétében (amelyet a korábbi 78 27 838 számú bejelentésben és annak 79 24 655 számú kiegészítésében leírtak szerint nyerünk); majd radioaktív jelzőanyag beépítésének tesszük ki. A nyert citotoxicitási görbe alakja és az IC 50 érték (1,5 · 10 9 mól/1), azt mutatja, hogy ezek a sejtek normálisan érzékenyek az anti-DNP immunotoxin hatására, ezáltal bebizonyosodik, hogy ezek a sejtek TNP-vel jól jelzettek. (3. görbe).
c) TNP-vel jelzcn CEM-sejteket először 1 óra hosszat inkubálur.', 4 ’C hőmérsékleten, 5 egység/ ml nem-konjugált ureáz jelenlétében, majd mossuk, 18 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk antiT65 immuno-toxin és 5 mól/l-es karbamid jelenlétében, végül a radioaktív jelzőanyag beépítésének tesszük ki. A nyert IC érték 5 · 10 υ mól/1. Ez az érték megegyező azzal, amelyet TNP-vel nem jelzett CEM-sejteket használva nyerünk azonos körülmények között, ureázos kezelés nélkül és az inkubáló közegben karbamid nélkül az ureáz mosása után. Ez a vizsgálat mutatja, hogy az inkubálás nem-konjugált ureáz jelenlétében azzal jár, hogy az ureáz nem kötődik a sejthez és ennek eredményeképpen az anti-T65 immuno-toxin hatása nem jut érvényre (4. görbe).
d) TNP-vel jelzett CEM-sejteket először 1 óra hosszat 4 ’C hőmérsékleten inkubálunk a fentebb leírt immuno-enzim konjugátum jelenlétében, amelyet 6,5 egység/ml koncentrációban alkalmazunk. Azt találjuk, hogy ennek a konjugátumnak, amikor ilyen körülmények közt használjuk, nincs eredendő citotoxicitása az alkalmazott sejtekre. Ezeket a sejteket azután mossuk, hogy eltávolítsunk minden konjugátumot, amely nincs rögzítve, majd 37 ’C hőmérsékleten 18 órán át inkubáljuk anti-T65 immuno-toxin és 5 mól/1 karbamid jelenlétében. Végül radioaktív jelzőanyag beépítésének tesszük ki, az így nyert IC 50 érték 3,5 · 10 ” mól/1 (5. görbe).
Ez az eredmény azt mutatja, hogy az immuno.enzim konjugátum érvényre juttató hatása mintegy 14 000-szeresére növeli az immuno-toxin citotoxikus hatását a cél-sejtekre. Ez a vizsgálat bizonyítja be, hogy ez az érvényre juttató hatás magába foglalja az immuno-enzim konjugátum rögzítését az immunológiai fajlagosságának megfelelő antigénen. Az említett rögzítés elviseli a sejtek mosását és átengedi a felületét bizonyos enzimatikusan aktív ureázoknak, amelyek az immuno-toxinokkal együtt jelenlevő inkubációs tápközegben található karbamidból NH4 + ionokat termelnek, ezáltal pedig előidézik az NH4 + ionok jól ismert érvényre juttató hatását. Az igy nyert érvényre juttató hatás egészen hasonló ahhoz, amelyet korábban figyeltek meg, amikor ammónium-kloridot adtak az inkubációs tápközeghez.
Az ammönium-klorid mesterséges adagolása esetében az említett érvényre juttatási hatás nem alakult ki sem ricinnek, sem a ricift A láncával, sem a tanulmányozott sejtekre nem fajlagos immunotoxinnal.
Ezeknek a kísérleteknek a körülményei között az anti-T65 immuno-toxin citotoxikus aktivitása az alkalmazott immuno-enzim konjugátum jelenlétében kb. 130 000-szerese a ricin A lánc aktivitásának és az még mintegy 11-szeresen erősebb, mint a ricin citotoxikus aktivitása.
3. példa
Maleimid-csoporttal szubsztituált anti-DNP antitest és növényi eredetű ureáz reakciójával nyert immuno-enzim konjugátum.
a) Anti-DNP antitest
Ez az antitest monoklonális antitest, amelyet hagyományos technikával tisztítottunk Balb/C törzsbeli egerek - amelyekbe F9 hibridómát ültettünk be - hasi vízkóros folyadékjából.
Magát az említett hibridómát bovin-gammaglobulinnal - amelyen előzőleg 20 DNP gyököt rögzítettünk mólonként -immunizált Balb/C törzs-61
189 246 beli egerek lépsejtjeinek és egér NS1 mielóma állomány sejtjeinek fúziójával nyerjük. A hibridómát klónozással izoláljuk, hagyományos technikát alkalmazva, Az így nyert antitest G osztályhoz tartozó immuno-globulin, amely a 2 b izotipushoz tartozik, és amelynek affinításí konstansa (ε-DNP-lizin ligandumhoz mérve) 1,8 · 108 (mól/1)1.
b) Aktivált anti-DNP antitest
2,5 ml anti-DNP antitest oldathoz (9,7 mg/ml 125 mmól/l-es, pH 7-es foszfát-pufferben) 10 1 dimetil-formamidot adunk, amely 0,4 mg m-maleimido-benzoesav-N-hidroxi-szukcinimid-észtert tartalmaz. A keveréket fél órán át 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az oldatot ez után 10 ml-es Sepha„ dex G 25 oszlopra helyezzük, amelyet előzőleg 125 mmól/l-es (pH 7,0) foszfát-pufferrel egyensúlyoztunk ki. A leoldást a 280 nm hullámhossznál mért optikai sűrűséggel ellenőrizzük. 2,5 ml-t nyerünk vissza az oszlop kiszorítási térfogatából. A szubsztitúciós hányadot egy alikvoton mérjük, feleslegben alkalmazott 14C ciszteinnel végzett reakcióval.
így olyan oldatot nyerünk, amely 8 mg antitestet tartalmaz milliliterenként, és egy antitest-molekula 3,5 maleimid-csoporttal van szubsztituálva.
c) Ureáz
Az alkalmazott enzim a SIGMA-tól származik (VII. típus, U 0376 referencia-szám), aktivitását 170 egység/mg-nak mértük. Egy egység az enzimnek az a mennyisége, amely karbamidból 1 mikromól NH4 + iont szabadít fel percenként 20 °C hőmérsékleten, pH 7-nél.
Ennek az enzimnek természetes formájában 27 tiol-csoportja van molekulánként, 480 000 molekulasúlynál. Az említett tiol-csoportok, amelyek ELLMAN módszere szerint mérhetők, nem mind szükségesek az enzim-aktivitáshoz. Ezek közül tehát néhány felhasználható az összekapcsoláshoz az aktivált antitesttel.
d) Az antitest összekapcsolása az enzimmel
Közvetlenül az után, hogy a sót a G 25 oszlopon eltávolítottuk, 2,4 ml aktivált antitest-oldatot öszszekeverünk 2,0 ml ureáz-oldattal (24 mg/ml koncentrációjú, 125 millimól/ml-es, pH 7-es pufferben). A keveréket 1 órán át inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten és centrifugálás után 450 ml-es, PBS pufferrel kiegyensúlyozott Sephadex G 200 géloszlop tetejére helyezzük. A leoldást a 280 nm hullámhossznál mért optikai sűrűséggel és az ureáz-aktivitás SUMMER-technikával történő mérésével ellenőrizzük.
c A legerősebb ureáz-aktivitást mutató frakciókat egyesítjük és így 14 ml, 102 egység/ml koncentrációjú konjugát-oldatot nyerünk.
•f Ha ennek az oldatnak egy alikvot részét A-fehérje-Sepharose oszlopon kromatografáljuk, azt találjuk, hogy az ureáz-aktivitás 30%-a nem marad az oszlopon. Az ureáz-aktivitás többi része az antitesttel együtt oldódik le pH 3,5-ös pufferrel. Egy kontroli-kísérlet azt mutatja, hogy az antitesttel nem kapcsolódott ureáz kétségtelenül nem rögződik az oszlopon. Ez azt bizonyítja, hogy az egyesített frakciók ureáz-aktivitásának 70%-a valóban az antitest-ureáz konjugátumhoz tartozik, Az ez után leírt vizsgálatokhoz a szennyező szabad ureázt nem távolítjuk el az oldatból, ez az ureáz ugyanis hatástalan az alkalmazott körülmények között, ahogyan ezt később leírjuk.
4. Példa
Az anti-T65 immuno-toxin hatásának érvényre juttatása a 3. példa immuno.enzim konjugátjával.
A találmány szerinti, a 3. példa alapján nyert konjugátumot biológiai tulajdonságaira és még inkább az anti-T65 immuno-toxin aktivitást érvényre juttató kapacitásra vizsgáljuk egy megfelelő sejtmodellen.
Az említett modellt humán limfoblasztoid CEM sejt-állományból alakítjuk ki, amely természetes formájában T65 antigént hordoz. Az említett antigén, amely ellen irányul az alkalmazott immunotoxin, alkotja a modell első cél-antigénjeit. Lehetséges ezeket a sejteket trinitrofenil-hapténnel (TNP) jelezni, a 78 27 838 számú korábbi bejelentésben leírtak szerint. Az említett haptént a vizsgált immuno-enzim konjugátumban levő anti-DNP antitest tökéletesen felismeri, és ilyen módon megalkotja a modell második cél-antigénjét. Bebizonyosodott, hogy a sejtek jelzése TNP hapténnel nem változtatja meg a sejtek életképességét és az anti-T65 immuno-toxin rögzítését ezeken a sejteken.
Ezeknek az immuno-toxinoknak az alapvető tulajdonságát, vagyis a cél-sejtekben a fehérje-szintézis gátlást, olyan módon mérhetjük, hogy megvizsgáljuk a vizsgált anyagok hatását a 14C-leucin beépülésére rákos sejtekbe, megfelelő tenyészetben.
Ezt a mérést a Journal of Biological Chemistry 1974, 249, 3557-62 irodalmi helyen leírt technikából adaptált technika szerint hajtjuk végre, 14C'eucin jelzőanyagot használva a fehérje-szintézis sebességének meghatározására. A beépült radioaktivitás meghatározását a szűréssel kinyert teljes sejten végezzük.
Ezekből á meghatározásokból a dózis/hatás görbét meg lehet rajzolni, az X tengely mutatja a tanulmányozott anyag’ A-láncának moláris koncentrációját és az Y tengely a 14C leucin beépülését, a fehérje-szintézisre ható bármely anyag távollétében vizsgált kontroll.sejteknél mért beépülés százalékában kifejezve.
Ilyen módon minden tanulmányozott anyagnál meghatározzuk azt a koncentrációt, amely 50%ban gátolja a 14C leucin beépülését, vagyis az „Inhibitor koncentráció 50”-et (IC 50).
Ennek a kísérletnek a különböző vizsgálatait a következőkben mutatjuk be. A megfelelő kísérleti eredményeket a 2. ábra ábrázolja.
a) Ezt áz ellenőrző vizsgálatot a 2. példa a) vizsgálatának megismétlésével végezhetjük el, ez a vizsgálat ugyanis itt is érvényesnek tekinthető.
b) TNP-vel jelzett CEM-sejteket inkubálunk 18 órán át 37 °C hőmérsékleten anti-T65 fajlagosságú immuno-toxin jelenlétében (ezt az immúno-toxint a bejelentőnek egy korábbi, 81 21 836 számú bejelentése szerint készítjük), majd a radioaktív jelzőanyag beépítésének tesszük ki. A nyert citotoxicitási görbe azonos azzal, amelyet ugyanolyan, de TNP-vel nem jelzett sejttel nyerünk azonos inkubálási körülmények közt; ezzel lehet bebizonyítani.
-7189 246 hogy ezeknek a sejteknek a jelzése TNP-vel megfelelően végbemegy (6. görbe).
c) TNP-vel jelzett CEM sejteket először 1 óra hosszat inkubálunk 4 ’C hőmérsékleten 1 egység/ ml nem-konjugált ureáz jelenlétében, majd mossuk, órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 10“3 mól/1 koncentrációjú anti-T65 immuno-toxin szól és 5 mmól/1 karbamid jelenlétében, majd a radioaktív jelzőanyag beépítésének tesszük ki.
Az ebben a vizsgálatban nyert l4C-leucin beépülés! érték (65%) megkülönböztethetetlen attól az értéktől, amelyet azonos koncentrációjú anti-T65 immuno-toxinnal nyerünk a b) vizsgálat szerint. Ez az eredmény azt bizonyítja, hogy az inkubálás nem- 1 konjugált ureáz jelenlétében azzal jár, hogy az ureáz nem kötődik a sejthez és ennek eredményeképpen az anti-T65 immuno-toxin hatása nem jut érvényre.
d) TNP-vel jelzett CEM-sejteket először 1 óra 2Q hosszat 4 ’C hőmérsékleten inkubálunk a fentebb leírt immuno-enzim konjugátum jelenlétében, amelyet 1,02 egység/ml koncentrációban alkalmazunk. Azt is ellenőrizzük, hogy ennek a konjugátumnak, amikor ilyen körülmények közt használjuk, nincs eredendő citotoxicitása az alkalmazott sejtekre. 5 A sejteket azután mossuk a nem rögzített konjugátum eltávolítása érdekében, majd inkubáljuk 18 órán át 37 ’C hőmérsékleten anti-T65 immunotoxin és 5 mmól/1 karbamid jelenlétében. A sejteket végül a radioaktív jelzőanyag beépülésének tesszük 30 ki. Az így nyert IC érték 2,4 · 10 11 mól, 1 (7. görbe).
Ez az érték nagyon jól összehasonlítható azzal az értékkel, amelyet akkor nyerünk, ha az 1. példa szerinti konjugátumot használjuk; ez az immunoenzim konjugátumnak az immuno-toxin hatásának 33 érvényre juttatásában kifejtett jelentős szerepét mutatja.
Ez a vizsgálat bebizonyítja, hogy ez az érvényre juttatási hatás magába foglalja az immuno-enzim konjugátum rögzítését az immunológiai fajlagos- 0 ságnak megfelelő antigénen. Az említett rögzítés elviseli a sejtek mosását és átengedi a felületét bizonyos enzimatikusan aktív ureázoknak, amelyek az immuno-toxinokkal együtt jelenlevő inkubációs tápközegben található karbamidból NH4+ ionokat 45 termelnek, ezáltal előidézik az NH4‘ ionok érvényre juttató hatását.
Az így nyert érvényre juttató hatás egészen hasonló ahhoz, amelyet korábban figyeltek meg, amikor az inkubálás 10 mmól/1 ammónium-klorid jelenlétében ment végbe, amely ammónium-kloridot az inkubáló tápközegbe adtuk az immuno-enzim konjugátum/szubszlrátum rendszer helyett.
Abban az esetben, amikor ammóiiium-kloridol adunk, a nyert IC 50 érték 3,8 10 |! möl, 1. amint ezt a 2. ábra megfelelő görbéje (8. görbe) mutatja.
Az előző példák bemutatták, hogy a találmány szerinti termékek alkalmazhatók a humán gyógyászatban.
A találmány szerinti új gyógyszerek injektálható formában szerelhetők ki, az előnyös beadás intravénás úton történik. Ezek bármilyen rákos vagy nem rákos rendellenességek kezelésére használhatók, attól függően, hogy milyen antitestet alkalmazunk az immuno-toxinhoz. Ezek olyan dózisokban és olyan körülmények közt alkalmazandók, amelyeket minden esetben egyedileg kell meghatározni a kezelendő személytől és a rendellenesség természetétől függően.
Claims (3)
- Szabadalmi igénypontok1. Eljárás immuno-enzim konjugátumok előállítására azzal jellemezve, hogy egy antitestet vagy egy antitestnek egy olyan fragmensél, amely megőrizte az antitestnek a kiválasztott antigént felismerő kapacitását, diszulfid-híd vagy tioéter-kötésekkel kötjük össze egy olyan enzimmel, amely természetes szubsztrátumokból ammónium-ionokat képes termelni.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy egy tiol-funkciót viselő. Ρ,-SH-nak nevezett fehérjét reagáltatunk egy másik, P,-nek nevezett fehérjének olyan származékával, amelybe előzőleg legalább egy olyan csoportot vezettünk be, amely diszulfid-hidat és egy tiol-csoporttal reagálni képes gyököt (X) tartalmaz (X jelentése 2-piridilvagy 4-piridilcsoport), és amelyet ilyen módon P2 — S — S — X-nek nevezünk, és az említett reakciót vizes közegben hajtjuk végre pH 5 és pH 9 értékek közt, 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten.
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve. hogy egy tiol-funkciót viselő, Ρ,-SH-nak nevezett fehérjét reagáltatunk egy másik, P,-nek nevezett fehérjének olyan származékával, amelybe előzőleg maleimid-gyököt vezettünk be, és amelyet az (I) általános képlettel jellemezhetünk, amely képletben Z jelentése térkitöltő csoportként fenil- vagy naftilcsoport, és az említett reakciót vizes közegben hajtjuk végre, 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8204547A FR2523445A1 (fr) | 1982-03-17 | 1982-03-17 | Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU189246B true HU189246B (en) | 1986-06-30 |
Family
ID=9272107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU83906A HU189246B (en) | 1982-03-17 | 1983-03-17 | Process for preparing conjugates of an enzyme and an antobody formed by covalents bonds |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4762707A (hu) |
| EP (1) | EP0089880B1 (hu) |
| JP (1) | JPH0653677B2 (hu) |
| KR (1) | KR910000029B1 (hu) |
| AT (1) | ATE27915T1 (hu) |
| AU (1) | AU563356B2 (hu) |
| CA (1) | CA1216791A (hu) |
| CS (1) | CS268656B2 (hu) |
| DD (1) | DD209578A5 (hu) |
| DE (1) | DE3372175D1 (hu) |
| DK (1) | DK166966B1 (hu) |
| EG (1) | EG15882A (hu) |
| ES (1) | ES520692A0 (hu) |
| FI (1) | FI830897L (hu) |
| FR (1) | FR2523445A1 (hu) |
| GR (1) | GR77119B (hu) |
| HU (1) | HU189246B (hu) |
| IE (1) | IE54624B1 (hu) |
| IL (1) | IL68106A0 (hu) |
| MA (1) | MA19742A1 (hu) |
| NO (1) | NO166618C (hu) |
| NZ (1) | NZ203586A (hu) |
| OA (1) | OA07388A (hu) |
| PH (1) | PH18890A (hu) |
| PL (1) | PL142316B1 (hu) |
| PT (1) | PT76394B (hu) |
| ZA (1) | ZA831833B (hu) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4664911A (en) * | 1983-06-21 | 1987-05-12 | Board Of Regents, University Of Texas System | Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties |
| US4542225A (en) * | 1984-08-29 | 1985-09-17 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Acid-cleavable compound |
| FR2573656B1 (fr) * | 1984-11-29 | 1987-02-27 | Sanofi Sa | Medicament comportant en tant qu'association au moins une immunotoxine et au moins un polymere contenant du mannose |
| AU595173B2 (en) * | 1985-01-08 | 1990-03-29 | General Hospital Corporation, The | Method and use for site-specific activation of substances |
| DE3612643A1 (de) * | 1985-12-05 | 1987-06-11 | Mueller Lierheim Kg Biolog Lab | Traegerkoerper, der durch kovalent an seine oberflaeche gebundene antikoerper bioaktiviert ist |
| EP0252951A4 (en) * | 1986-01-06 | 1988-09-07 | Univ Melbourne | TECHNETIUM-ANTIBODY CONJUGATES. |
| US5716990A (en) * | 1987-03-09 | 1998-02-10 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Drug delivery systems |
| US4975278A (en) * | 1988-02-26 | 1990-12-04 | Bristol-Myers Company | Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells |
| NZ225599A (en) | 1987-08-04 | 1991-09-25 | Bristol Myers Co | Antibody-enzyme conjugates and combinations with prodrugs for the treatment of tumour cells |
| US5773435A (en) * | 1987-08-04 | 1998-06-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Prodrugs for β-lactamase and uses thereof |
| FR2624010B1 (fr) * | 1987-12-07 | 1991-07-05 | Fabre Pierre Cosmetique | Compositions topiques heterogenes a base de microgranules de cafeine et/ou de ses derives, utiles comme amincissant et/ou dans le traitement de la cellulite, ainsi que leur preparation |
| DE3807904A1 (de) * | 1988-03-10 | 1989-09-21 | Behringwerke Ag | Magnetische protein-konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| US5851527A (en) * | 1988-04-18 | 1998-12-22 | Immunomedics, Inc. | Method for antibody targeting of therapeutic agents |
| US20030068322A1 (en) * | 1988-04-18 | 2003-04-10 | Immunomedics, Inc. | Methods of antibody-directed enzyme-prodrug therapy |
| GB8809616D0 (en) * | 1988-04-22 | 1988-05-25 | Cancer Res Campaign Tech | Further improvements relating to drug delivery systems |
| US5632990A (en) * | 1988-04-22 | 1997-05-27 | Cancer Research Campaign Tech. Ltd. | Treatment for tumors comprising conjugated antibody A5B7 and a prodrug |
| US5024834A (en) * | 1988-07-12 | 1991-06-18 | Cetus Corporation | Thioether linked immunotoxin conjugates |
| US5609869A (en) * | 1988-08-19 | 1997-03-11 | The General Hospital Corporation | Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use |
| US5811265A (en) * | 1988-08-19 | 1998-09-22 | The General Hospital Corporation | Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use |
| EP0449998A4 (en) * | 1989-06-30 | 1992-01-15 | Brunswick Corporation | Antibody-oxidase conjugates with non-systemic substrates |
| DE68928946T2 (de) * | 1989-12-11 | 1999-10-21 | Immunomedics, Inc. | Verfahren zum aufspüren von diagnostischen oder therapeutischen mitteln durch antikörper |
| AU595786B3 (en) * | 1990-01-10 | 1990-03-12 | Chung Ming Pan | Spray head assembly |
| AU663582B2 (en) * | 1992-03-04 | 1995-10-12 | Akzo N.V. | In vivo binding pair pretargeting |
| US5965106A (en) * | 1992-03-04 | 1999-10-12 | Perimmune Holdings, Inc. | In vivo binding pair pretargeting |
| AU4375293A (en) * | 1992-05-13 | 1993-12-13 | Beth Israel Hospital Association, The | Targeted activated species cytotoxicity |
| ES2287926T3 (es) | 1992-12-04 | 2007-12-16 | Me Medical Enzymes Ag | Glutaminasa manipulada geneticamente y su uso en terapia. |
| DK75593D0 (hu) * | 1993-06-25 | 1993-06-25 | Novo Nordisk As | |
| US6207805B1 (en) | 1997-07-18 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Prostate cell surface antigen-specific antibodies |
| US20100056762A1 (en) | 2001-05-11 | 2010-03-04 | Old Lloyd J | Specific binding proteins and uses thereof |
| PT1392359E (pt) | 2001-05-11 | 2010-01-27 | Ludwig Inst For Cancer Res Ltd | Proteínas de ligação específica e suas utilizações |
| CA2606259A1 (en) * | 2005-04-27 | 2006-11-02 | Avici Systems | An application specific reconfigurable network processor |
| EP2126127B1 (en) | 2007-01-25 | 2016-09-28 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Use of anti-egfr antibodies in treatment of egfr mutant mediated disease |
| AU2008227123B2 (en) | 2007-03-15 | 2014-03-27 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Treatment method using EGFR antibodies and src inhibitors and related formulations |
| CN101896503B (zh) | 2007-08-14 | 2018-05-22 | 路德维格癌症研究所有限公司 | 靶向egf受体的单克隆抗体175及其衍生物和用途 |
| PL238187B1 (pl) | 2015-01-23 | 2021-07-19 | Helix Biopharma Corp | Koniugaty przeciwciało-ureaza dla celów terapeutycznych |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5272284A (en) * | 1975-12-12 | 1977-06-16 | Dainippon Pharmaceutical Co | Enzymeeimmunoassay reagent |
| SE430062B (sv) * | 1977-03-04 | 1983-10-17 | Pharmacia Fine Chemicals Ab | Kopplings- eller tioleringsreagens |
| SE427505B (sv) * | 1977-03-04 | 1983-04-11 | Pharmacia Diagnostics Ab | Reagens till anvendning vid immunkemiska bestemningsmetoder |
| JPS53124682A (en) * | 1977-04-08 | 1978-10-31 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Preparation of complex of enzyme and bioactive substance and its use |
| US4218539A (en) * | 1978-03-24 | 1980-08-19 | Weltman Joel K | Enzyme conjugates and method of preparation and use |
| FR2437213A1 (fr) * | 1978-09-28 | 1980-04-25 | Cm Ind | Produits cytotoxiques formes par liaison covalente de la chaine a de la ricine avec un anticorps et leur procede de preparation |
| JPS5590858A (en) * | 1978-12-29 | 1980-07-09 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Method of measuring substance |
| JPS588395B2 (ja) * | 1979-08-08 | 1983-02-15 | 大日本製薬株式会社 | マレイミド安息香酸誘導体の製法 |
| FR2504010B1 (fr) * | 1981-04-15 | 1985-10-25 | Sanofi Sa | Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation |
| FR2516794B1 (fr) * | 1981-11-20 | 1985-10-25 | Sanofi Sa | Nouveaux medicaments anticancereux pour le traitement des leucemies t constitues de la chaine a de la ricine et d'un anticorps monoclonal specifique |
-
1982
- 1982-03-17 FR FR8204547A patent/FR2523445A1/fr active Granted
-
1983
- 1983-03-08 GR GR70721A patent/GR77119B/el unknown
- 1983-03-11 IL IL68106A patent/IL68106A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-03-11 IE IE531/83A patent/IE54624B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-03-14 CS CS831737A patent/CS268656B2/cs unknown
- 1983-03-14 EG EG170/83A patent/EG15882A/xx active
- 1983-03-14 MA MA19960A patent/MA19742A1/fr unknown
- 1983-03-15 DE DE8383400523T patent/DE3372175D1/de not_active Expired
- 1983-03-15 EP EP83400523A patent/EP0089880B1/fr not_active Expired
- 1983-03-15 AT AT83400523T patent/ATE27915T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-03-15 PT PT76394A patent/PT76394B/pt not_active IP Right Cessation
- 1983-03-16 PL PL1983241047A patent/PL142316B1/pl unknown
- 1983-03-16 NO NO830935A patent/NO166618C/no unknown
- 1983-03-16 CA CA000423762A patent/CA1216791A/en not_active Expired
- 1983-03-16 DD DD83248852A patent/DD209578A5/de not_active IP Right Cessation
- 1983-03-16 AU AU12504/83A patent/AU563356B2/en not_active Ceased
- 1983-03-16 ES ES520692A patent/ES520692A0/es active Granted
- 1983-03-16 NZ NZ203586A patent/NZ203586A/en unknown
- 1983-03-16 ZA ZA831833A patent/ZA831833B/xx unknown
- 1983-03-16 DK DK121683A patent/DK166966B1/da not_active IP Right Cessation
- 1983-03-17 JP JP58043276A patent/JPH0653677B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-17 KR KR1019830001078A patent/KR910000029B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1983-03-17 PH PH28663A patent/PH18890A/en unknown
- 1983-03-17 FI FI830897A patent/FI830897L/fi not_active Application Discontinuation
- 1983-03-17 OA OA57939A patent/OA07388A/xx unknown
- 1983-03-17 HU HU83906A patent/HU189246B/hu not_active IP Right Cessation
-
1985
- 1985-05-21 US US06/736,334 patent/US4762707A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU189246B (en) | Process for preparing conjugates of an enzyme and an antobody formed by covalents bonds | |
| AU2020200975B2 (en) | New stable antibody-drug conjugate, preparation method therefor, and use thereof | |
| EP0175617B1 (en) | Antibody-therapeutic agent conjugates | |
| US7462689B2 (en) | Hydrazine-based and carbonyl-based bifunctional crosslinking reagents | |
| JPS61227532A (ja) | 抗体ハイブリツド分子およびその製造方法 | |
| US4643895A (en) | Anti-cancer drugs for the treatment of leukaemias I, constituted by the chain A of ricin and a specific monoclanal antibody | |
| JPS6221000B2 (hu) | ||
| JPH0788310B2 (ja) | 抗体結合体 | |
| JPH0647557B2 (ja) | 放射性標識抗体フラグメント | |
| JPH064678B2 (ja) | 抗体複合体の製造方法 | |
| JP3273608B2 (ja) | 治療薬の部位特異的インビボ活性化 | |
| IE52239B1 (en) | Conjugates of vindesine with immunoglobulin or fragments thereof | |
| CA2107558A1 (en) | In vivo binding pair pretargeting | |
| KR930003333B1 (ko) | 탄수화물 단위가 변형된 리보솜을 비활성화시키는 당단백질 성분을 함유하는 지속-작용성 면역독소의 제조방법 | |
| KR950007215B1 (ko) | 오시딕 단위를 산화시키고 쉬프염기를 형성하여 리보솜을 비활성화시키는 당단백질을 변형시키는 방법 | |
| JPH04506454A (ja) | 生物活性材料のタンパクへの酵素的結合 | |
| JPS6112628A (ja) | 抗腫瘍作用を有する糖タンパクおよびその製造方法 | |
| US5144009A (en) | Conjugates in which a monovalent carboxylic ionophore is associated by means of a covalent bond with a macromolecule, their use as immunotoxin potentiators and the intermediate activated inophores | |
| JPS62175500A (ja) | 修飾糖タンパク質、当該修飾糖タンパク質の製造方法、当該修飾糖タンパク質を含む免疫毒素および当該免疫毒素を有効成分として含む抗ガン剤組成物 | |
| WO1987004171A1 (en) | Process for preparing antibody complex |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |