DK166966B1 - Analogifremgangsmaade til fremstilling af immunoenzymatiske konjugater - Google Patents

Description

i DK 166966 B1

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte immunoenzymatiske konjugater med den i kravets indledning angivne formel.

Disse konjugater fremstilles ved sammenbinding ved hjælp 5 af en disulfidbinding eller en thioetherbinding af et enzym og et antistof.

Analogifremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af kravet angivne.

10

De ved anal ogi fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse opnåede hidtil ukendte forbindelser er således konjugater, som er konstrueret ved en disulfidbinding eller en thioetherbinding mellem et specifikt enzym og et 15 antistof eller fragment af et antistof, der er rettet mod et antigen, som er båret af visse mål-celler.

Sådanne forbindelser vil i det følgende blive betegnet med udtrykket immunoenzymatiske konjugater.

20

Immunoenzymatiske konjugater er kunstige blandingsmolekyler, hvori enzymet med en disulfidbinding eller en thioetherbinding er bundet til et antistof rettet mod et antigen, som bæres af visse måle-celler.

25

De anvendte enzymer er velkendte forbindelser. Det anvendte antistof vil enten være af polyclonal karakter, dersom det stammer fra en konventionel immunisation gennemført hos et dyr, eller af monoclonal karakter, dersom 30 det er opstået ved kloning af hybridceller opnået ved fusion mellem lymfocytter og myelomceller. Dette antistof vil kunne anvendes enten i form af hele immunoglobulin-molekyler, som er bærere af evnen til at genkende det valgte antigen, eller i form af et hvilket som helst 35 fragment af disse immunoglobulinmolekyler, som har bevaret evnen til at genkende det valgte antigen, især sådanne fragmenter, som er kendt under betegnelsen F(ab')2,

Man kan gennemføre den kemiske kobling mellem antistoffet (eller antistoffragmentet) og enzymet ved flere metoder, * 5 dog betinget af at den valgte metode: 2 DK 166966 B1

Fab og Fab1.

bevarer de respektive biologiske aktiviteter af de to bestanddele i konjugatet: antistoffet og enzymet; 10 sikrer fremgangsmåden en tilfredsstillende reproducerbar hed og et godt koblingsudbytte; tillader styring af værdien af forholdet mellem enzym og antistof i det således opnåede konjugat; 15 fører til et stabilt og vandopløseligt produkt.

Ifølge opfindelsen forløber reaktionen i vandigt miljø ved pH på mellem 5 og 9 og ved en temperatur der ikke 20 overskrider 30 °C.

En særlig egnet metode indebærer anvendelsen af en eller flere thiolgrupper til frembringelsen af bindingen mellem de to proteiner. Disse thiolgrupper kan vilkårligt til-25 høre det ene eller det andet af de proteiner, der skal sammenkobles, eller de kan kunstigt være indført på det ene eller det andet af disse proteiner, som ikke naturligt er i besiddelse af thiolgrupper.

30 Dersom det ene eller begge thiolgrupperne således skal kunstigt indføres på det ene af proteinerne, kan dette gennemføres ved indvirkning på dette protein af S-acetyl-mercaptoravsyreanhydrid, som er i stand til at acylere aminogrupper i proteinet. Man vil derpå kunne frigøre 35 thiolgrupperne med fjernelse af acetylbeskyttelsesgruppen med indvirkning af hydroxylamin, således som det er omtalt i [Archives of Biochemistry and Biophysics 119, 41- DK 166966 B1 3 49, (1967)]. En dialyse tillader fjernelse af overskud af reaktionskomponenter, såvel som reaktionsprodukter med lav molekylvægt. Andre i litteraturen beskrevne metoder kan ligeledes anvendes til indføring af thiolgrupper i et 5 af de proteiner, som skal bringes til sammenkobling.

Det af de to proteiner, som alene besidder en eller flere thiolgrupper, bringes ifølge opfindelsen til omsætning med det andet protein, hvori der forinden er blevet ind-10 ført en eller flere grupper, som er i stand til at reagere med thiolgrupperne i vandig væske ved pH på mellem 5 og 9 og ved en temperatur, som ikke overskrider 30 °C til dannelse af en stabil og veldefineret kovalent binding i form af en disulfidbinding eller en thioesterbinding. I 15 det efterfølgende vil man ved udtrykket betegne det af de to proteiner, som er bærer af den eller de anvendte thiolgrupper, og med udtrykket P2 det andet protein, der skal sammenkobles.

20 1) I tilfælde af disulfidbinding;

Fremstilling af konjugatet kan i dette tilfælde beskrives ved reaktionsskemaet:

25 P^-SH + P2-S-S-X -> P1-S-S-P2 + XSH

hvori: P^ og P2 har den i kravets indledning angivne betydning.

30 -S-S-X betegner en aktiveret blandingsdisulfidgruppe, hvori X betegner den aktiverende gruppe.

Proteinet P2, der er substitueret med et aktiveret svovl-35 atom, opnås ud fra selve proteinet P2 ved substitution ved hjælp af et reagens, som selv bærer et aktiveret svovlatom. Denne reaktion er omtalt i FR patentansøgning 4 DK 166966 B1 nr. 7 827 838 og i SE fremlæggelsesskrift nr. 446 303 og forløber i overensstemmelse med reaktionsskemaet: P2SH + X-S-S-X - P2-S-S~X + XSH 5 hvori: X og P2 har den i kravets indledning angivne betydning.

10 P2 betegner det protein, der skal substitueres, og X betegner en aktiverende gruppe såsom en 2-pyridylgruppe eller en 4-pyridylgruppe, eventuelt substitueret med en eller flere halogenatomer alkylgrupper eller carboxylgrup-15 per, eller en phenylgruppe, eventuelt substitueret med en eller flere nitrogrupper eller carboxylgrupper.

Når man anvender sådanne forbindelser X-S-S-P2, gennemfører man koblingen med proteinet P1 i vandig opløsning 20 af de to proteiner ved en temperatur, som ikke overskrider 30 °C, og i en tid, som varierer fra nogle timer til en dag. Den således opnåede vandige opløsning dialyseres til fjernelse af produkter med lav molekylvægt, hvorpå konjugatet kan oprenses ved forskellige velkendte 25 metoder.

2) Når det drejer sig om thioetherbinding:

Fremstillingen af konjugatet består her i at omsætte P^-30 SH med proteinet P2, på hvilket man forinden har indført maleimid-gruppen.

Reaktionen kan så beskrives ved følgende skema: 35 DK 166966 B1 5 • y-, P, -SH + p_ -NH-CO-Z-N !

_^S" V

5 --> P9 -NH-CO-Z-N

\ ' hvori 10 P.^ og P2 har den i kravets indledning anførte betydning.

Z betegner en alifatisk eller aromatisk afstandsgivende struktur, som indeholder 1 til 10 carbonatomer.

15 Det med maleimid substituerede protein P2 opnås ud fra selve proteinet P2 ved substitution af aminogrupperne i proteinet ved hjælp af en reaktionskomponent, der i sig selv er bærer af en maleimidgruppe, i overensstemmelse med reaktionsskemaet: 20 °v 0>

Λ-? }~T

?2 NH2 + Yj-Z-N j -> P2-KH-C0-Z-N

\^ 0^- 25 0 hvori P2 og Z har den i kravets indledning anførte betydning og betegner: 30 enten en carboxylsyregruppe, idet reaktionen derpå gennemføres efter aktivering af carboxylsyregruppen i nærvær af et koblingsmiddel, såsom et carbodiimid, især et vandopløseligt derivat såsom l-ethyl-3-(3-diethylaminopro-35 pyl)-carbodiimid, 6 DK 166966 Bl eller en ester, der betegnes som "aktiveret", såsom en ortho- eller para-, nitro- eller dinitrophenylester eller også en ester af N-hydroxysuccinimid, der omsættes direkte med aminogruppen for at acylere disse. Fremstilling af 5 sådanne reaktionskomponenter er især beskrevet i Helvetica Chimica Acta 58, 531-541, (1975). Andre reaktionskomponenter tilhørende samme klasse er kommercielt tilgængelige.

Vi

10 Reaktionen mellem forbindelsen Y^-Z-N

— hvori Y og Z har den ovenfor anførte betydning, og 15 proteinet P2 gennemføres i homogen flydende fase, hyppigst i vand eller en pufferopløsning. Det er muligt, når reaktionskomponenternes opløseligheder kræver det, at sætte til reaktionsmediet op til 20 volumen-% af et organisk opløsningsmiddel, der er blandet op med vand, såsom 20 en alkohol, især tert.-butanol.

Reaktionen gennemføres ved omgivelsernes temperatur igennem en tid, der kan variere fra nogle timer til 24 timer.

Derpå tillader en dialyse at fjerne reaktionsprodukter 25 med lav molekylvægt, især overskud af reaktionskomponenterne. Ved denne metode kan man indføre et antal grupper substituenter pr. mol protein, som sædvanligvis er på mellem 1 og 15.

30 Under anvendelse af sådanne forbindelser med formlen —jl

Po-NH-C0-Z-N

hvori P2 og Z har den i kravets indledning anførte betydning gennemfører man koblingen med proteinet P^ i nærvær 35 DK 166966 B1 7 af en vandig opløsning af de to proteiner ved en temperatur, som ikke overskrider 30 °C, og igennem en tid, som varierer fra nogle timer til 1 dag. Den således opnåede opløsning dialyseres til fjernelse af produktet med lav 5 molekylvægt, hvorpå man kan rense konjugatet ved forskellige velkendte metoder.

De enzymer, der anvendes ved analogifremgangsmåden ifølge opfindelsen vil med henblik på deres terapeutiske anven-10 delser, således som det skal omtales senere, være sådanne, der er i stand til at frigøre ammoniumioner ud fra naturlige substrater, som tolereres godt af højere dyrs organismer.

15 De enzymer, som er terapeutisk anvendelige befinder sig fortrinsvis i følgende grupperinger, idet der henvises til den internationale klassificering, således som den f.eks. er omtalt i "Comprehensive Biochemistry" Bind 13, 3. udgave (1973), M. Florkin og E. H. Stortz Editors 20 (Elsevier): inden for gruppe 1 (oxydoreduktaser), især i undergruppen 1-4 indeholdende aminosyre-dehydrogenaser og amino-oxy-daser; 25 inden for gruppe 3 (hydrolaser) især i undergruppen 3-5, som indeholder enzymer, der hydrolyserer amider, amidiner og andre C-N-bindinger (med undtagelse af peptidbindinger ); 30 inden for gruppe 4 (lyaser) især i undergrupperne 4-2 og 4-3, som indeholder de enzymer, som katalyserer nedbrydningsreaktioner med dannelse af umættede forbindelser.

35 I det efterfølgende er anført en liste over foretrukne enzymer til fremstilling af de omhandlede immunoenzyma-tiske konjugater. Den har i hvert enkelt tilfælde lige- DK 166966 Bl 8 ledes indikeret den kodning, som anvendes for at betegne disse enzymer inden for den internationale nomenclatur.

1-4-1-1 : alanindehydrogenase 5 1-4-1-3 : glutamatdehydrogenase NAD (P)+ 1-4-1-5 : L-aminosyredehydrogenase 1-4-3-2 : L-aminosyreoxydase 3-5-1-1 : asparaginase 3-5-1-2 : glutaminase .

10 3-5-1-4 : amidase 3-5-1-5 : urease 3-5-3-6 : arginin-deiminase 3-5-4-4 : adenosin-deaminase 3- 5-4-6 : adenosin-monophosphat-deaminase 15 3-5-4-21: creatinin-deaminase 4- 2-1-13: L-serin-dehydratase 4-2-1-16: L-theonin-dehydratase 4-3-1-1 : aspartat-ammoniak-lyase (eller aspartase) 4-3-1-3 : histidin-ammoniak-lyase (eller histidase) 20 4-3-1-5 : phenylalanin-ammoniak-lyase.

Man har tidligere blandt andet i fransk patentansøgning nr. 78 27 838, nr. 79 24 655, nr. 81 07 596 og nr.

81 21 836 omtalt fremstillingen af produkter med anti-25 cancervirkning dvs. konjugater opnået ved kobling gennem kovalent binding mellem kæden A i ricin og antistoffer eller antistoffragmentet rettet mod et antigen, som er båret af en celle, der skal ødelægges. Produkter af denne type er i den foreliggende sammenhæng betegnet med den 30 generiske benævnelse immunotoxiner.

I fransk patentansøgning nr. 81 21 836 omtales yderligere en egenskab ved ammoniumioner (i form af et hvilket som helst af saltene deraf, især chloridet), til på effektiv 35 måde at potentialisere den cytotoxiske virkning af disse immunotoxiner.

DK 166966 B1 9

Ammoniumsaltenes evne til at potentialisere immunotoxin-ernes selektive cytotoxiske virkning frembyder talrige fordele i to typer af situationer: 5 a) Hver gang man anvender et immunotoxin som selektivt cytotoxisk middel in vitro til ødelæggelse af visse målceller

Ved den terapeutiske anvendelse opstår denne situation 10 især, når man anvender immunotoxinet som cytotoxisk middel ved behandlingen af benmarven hos leukæmijpatienter, til hvem den således behandlede benmarv skal transplanteres, således som det er blevet omtalt i fransk patentansøgning nr. 81 21 826.

15 b) Når immunotoxinet anvendes in vivo som terapeutisk middel brugt på mennesker, hver gang det er muligt at indgive til patienten forinden, samtidigt eller efter immunotoxinet et ammoniumsalt, som sikrer potentialise-20 ringen af immunotoxinets virkning, således som det er omtalt i ovenfor nævnte patentansøgningsskrift.

I det sidstnævnte anvendelsestilfælde, hvor immunotoxinet anvendes in vivo sammen med et ammoniumsalt med det for-25 mål at forbedre den potentialiserende virkning, finder man dog visse begrænsninger, som er knyttet til ammoniumionernes egen toxicitet samt til den kendsgerning, at det er relativt besværligt på varig måde at opretholde en tilstrækkelig høj koncentration af ammoniumioner i pati-30 entens biologiske væsker.

Man har nu gennemført forskning, som gør det muligt på særdeles betydelig måde at reducere de begrænsninger, som er knyttet til anvendelsen af ammoniumioner, samtidigt 35 med at man bevarer fordelene ved potentialiseringen af den cytotoxiske aktivitet og en fremskyndelse af kinetikken i virkningen af disse immunotoxiner gennem disse DK 166966 B1 10 ioner. Disse undersøgelser har vist, at den potentialise-rende og accelererende virkning, der opnås ved tilsætning til immunotoxineme af et ammoniumsalt i passende koncentration, lige såvel kunne opnås, dersom ammoniumioneme 5 blev produceret i målcellernes umiddelbare omgivelser gennem en enzymatisk reaktion ud fra et ikke-toxisk substrat, som naturligt var til stede eller som kunstigt var blevet tilført til de pågældende cellers nærmeste omgivelser.

10

De pågældende undersøgelser har yderligere vist, at dette resultat på særlig effektiv måde lader sig opnå, når det enzym, som katalyserer den reaktion, der danner ammoniumionerne, er koblet sammen med et antistof (eller et anti-15 stoffragment), som har den egenskab, at det kan genkende et antigen, der befinder sig på overfladen af målcellerne.

Denne form for fremgangsmåde medfører adskillige fordele 20 af stor betydning, især de følgende: a) Det anvendte enzym er således koncentreret på målcellernes membran på grund af affiniteten af antistoffet (eller antistoffragmentet) for et antigen, der befinder 25 sig på denne membran. Af denne grund finder frigivelsen af NH^+-ioner, som enzymatisk reaktionsprodukt, kun sted i den umiddelbare nærhed af målcellernes membran, hvilket reducerer de risici, der er knyttet til ammoniumioners almene toxicitet, samtidigt med at det letter den gensi-30 dige virkning af disse ioner og målcellen, således som det er nødvendigt for at potentialiseringen kan opstå.

b) Eftersom den enzymatiske reaktion, der frembringer NH^+-ionerne, arbejder på kontinuert måde, lige så længe 35 som substratet er til stede, og eftersom dette substrat er valgt som værende ikke-toxisk, har man en meget stor smidighed i udnyttelsen af potentialiserings-mekanismen.

XI

DK 166966 B1

Dersom det pågældende substrat er endogent og har tilstrækkelig høj koncentration, kan man faktisk gennemføre indgiften af immunoenzymatisk konjugat med potentialise-rende virkning før, samtidig med eller efter indgiften af 5 immunotoxinet rettende sig efter de mest optimale betingelser, som kan fastlægges for hver enkelt patient.

Og dersom yderligere enzymet er valgt på en sådan måde, at dets substrat ikke eksisterer i blodet eller i de eks-10 tracellulære væsker i tilstrækkelig høj koncentration, og eftersom dette substrat således skal kunne indgives til patienten, konstaterer man den maksimale smidighed i anvendelsen af medikamentet, eftersom man frit og uafhængigt kan regulere tidspunktet for indgift, indgiftens va-15 righed og doseringen for hver af de tre tilførte komponenter, nemlig immunotoxinet, det immunoenzymatiske konjugat og substrat, igen i afhængighed af de optimale betingelser ved behandlingen af hver enkelt patient.

20 c) Under de ovenfor angivne betingelser vil man på selektiv måde kunne føre imod målcellerne mindst to effektive substanser, som er uundværlige for opnåelsen af det ønskede resultat: 25 på den ene side kæden A fra ricin, som er den cytotoxiske effektive substans indgående i det konjugat, der betegnes som immunotoxinet; på den anden side det enzym, som er en essentiel bestand-30 del i potentialiserings-systemet, og som er indbefattet i det immunoenzymatiske konjugat.

Disse effektivt virkende substanser er i samtlige tilfælde koblet med henblik på deres transport til og deres se-35 lektive fiksering på de pågældende målceller til antistoffer (eller antistoffragmentet), som er i stand til at genkende antigener, der befinder sig på overfladen af DK 166966 B1 12 målcellerne. Dersom man har et antistof til rådighed, som kan genkende et antigen, der er strengt specifikt over for den cellepopulation, der skal ødelægges, kan man så anvende det samme antistof til kobling med forskellige 5 effektive midler. Man har dog i de mest almindelige tilfælde interesse i at vælge forskellige antistoffer, som kan genkende forskellige antigener, som dog bæres tilsammen af de pågældende målceller. Selv om hvert af disse antigener ikke er strengt specifikt over for målcellerne, 10 vil sandsynligheden for, at de to valgte antigener samtidigt er til stede på ikke-målcellerne, være særdeles lille, og man har således et meget kraftigt middel til rådighed til endnu at forøge den specifikke karakter af immunotoxinernes cytotoxicitet.

15

De efterfølgende eksempler belyser opfindelsen.

EKSEMPEL 1 20 Immunoenzymatisk konjugat opnået ved reaktion mellem et anti-dinitrophenyl-antistof substitueret med en aktiveret disulfidgruppe og en urease af vegetabilsk oprindelse.

a) Anti-dinitrophenyl-antistof ( anti-DNP) 25

Dette antistof er et monoklonalt antistof, som er blevet oprenset ved konventionel teknik ud fra ascitesvæsken fra mus af stammen Balb/C, til hvilke man har transplanteret hybridomet Fg.

30

Dette hybridom er i sig selv blevet opnået ved fusion mellem miltceller fra mus af stammen Balb/C, der er immuniseret ved hjælp af bovint r-globulin, hvortil man forinden har fastgjort 20 grupper DNP pr. mol med celler af 35 slægten morint myelom NS 1, og isolerer ved kloning ifølge klassisk teknik. Det opnåede antistof er et immunoglobulin af klassen G og af isotypen 2b, hvis affinitetskon- 13 DK 166966 B1 stant (målt over for liganden e-DNP-lysin) er på 1,8 x 108 M-1.

b) Aktiveret anti-DNP-antistof 5

Dette produkt er opnået ud fra ovennævnte antistof ved hjælp af en teknik, der er analog med den, som er omtalt i de tidligere omtalte franske patentansøgninger nr.

78 27 838 og tillægsansøgning nr. 79 24 655, nr.

10 81 07 596 og nr. 81 21 836. Man har på denne måde opnået 20 mg anti-DNP-antistof, som indeholder 1,2-aktiverings-grupper pr. mol.

c) Urease 15

Det anvendte enzym er urease stammende fra firmaet "SIGMA" (type VII, reference nr. U 0376), som har et indhold på 170 enheder pr. mg. En enhed er den mængde enzym, som fører til frigivelsen af 1 mikromol NH^+ pr. minut 20 ved 20 “C og ved pH 7,0 ud fra urinstof.

Dette enzym indeholder naturligt 27 thiolgrupper pr. molekyle med molekylvægten 480 000. Disse thiolgrupper, som kan titreres ved metoden angivet af "ELLMAN", er ikke 25 alle nødvendige for den enzymatiske aktivitet. Visse af dem kan således tjene til sikring af koblingen med det aktiverede antistof.

d) Kobling mellem antistof og enzym 30

Man opløser 5 mg urease i 0,625 ml af den aktiverede antistofopløsning indeholdende 7,2 mg/ml i en phosphat-buffer 0,125 M, pH 7,0, dvs. 4,5 mg aktiveret antistof, og man inkuberer ved 25 °C 14 timer.

Reaktionsblandingen chromatograferes over en gelkolonne af "Sepharose 6 B (Pharmacia)", der er bragt i ligevægt 35 DK 166966 B1 14 med en PBS-puffer (phosphat 10 mM, natriumchlorid 140 mM, pH 7,4). Eluerlngen efterfølges af måling af den optiske tæthed af 280 nm samt på måling af ureaseaktiviteten ved den af SUMMER angivne metode [Methods in Enzymology Bind 5 II, p. 378, S. B. Colowick og N. 0. Kaplan Ed., Academic Press, 1955].

De fraktioner, som indeholder de kraftigste ureaseaktivi-teter, samles, og man opnår på denne måde 8 ml kon jugat-10 opløsning indeholdende 6,5 enheder/ml. Dersom man absorberer en aliquot-fraktion af denne opløsning på en kolonne af bovint serumalbumin, som er substitueret med 6 DNP-grupper pr. mol, og som er insolbiliseret på en matrix af "Sepharose 4 B", som forinden er blevet aktiveret med 15 cyanbromid, konstaterer man, at ureaseaktiviteten bliver fuldstændig absorberet på kolonnen. Dette viser på samme tid, at det i konjugatet tilstedeværende antistof har bevaret sin evne til at genkende haptenet DNP, og at ureasen er klart sammenkoblet med dette antistof.

20 EKSEMPEL 2

Potentialisering af immunotoxinet anti T65 25 Konjugatet, der er opnået som ovenfor vist, er blevet undersøgt med henblik på dets biologiske egenskaber, især med henblik på dets evne til at potentialisere aktiviteten af immunotoxin anti T65 i en passende cellemodel.

30 Denne model består af celler af slægten humant lympho-blastoid CEM, som er naturlig bærer af antigenet T65. Dette antigen, mod hvilket man dirigerer det anvendte immunotoxin, udgør det første målantigen i modellen. Man kan yderligere markere disse celler ved hjælp af haptenet 35 trinitrophenyl (TNP) ved den teknik, som er omtalt i det tidligere omtalte patentansøgningsskrift nr. 78 27 838. Dette hapten genkendes godt af antistoffet anti-DNP, som 15 DK 166966 B1 er indeholdt i det undersøgte immunoenzymatiske konjugat, og udgør således det andet målantigen i modellen. Man har vist, at markeringen af cellerne med haptenet TNP ikke modificerer cellernes levedygtighed og ikke forstyrrer 5 fikseringen på cellerne af immunotoxinet anti-T65.

Eftersom den fundamentale egenskab for immunotoxiner er at inhibere proteinsyntesen i målcellerne, består den anvendte afprøvning i, at man måler virkningen af de under- 14 10 søgte stoffer på inkorporeringen af C-leucin i cancercellerne under kultur.

Denne måling gennemføres ved hjælp af en teknik, som er tillempet fra den teknik, der er beskrevet i Journal of 15 Biological Chemistry, 1974, 249 (11), 3557-3562, idet man 14 anvender sporstoffet C-leucin til bestemmelse af udstrækningen af proteinsyntesen. Bestemmelsen af den inkorporerede radioaktivitet gennemføres her på hele celler, som er isoleret ved filtrering.

20

Man kan ud fra disse bestemmelser optegne kurverne for effekt/dosis, der som abscisse har en molær koncentration af kæde A i de undersøgte forbindelser og som ordonnant 14 inkorporeringen af C-leucin udtrykt som procentdel af 25 inkorporeringen i kontrolceller i fravær af ethvert stof, som indvirker på proteinsyntesen.

Man kan på denne måde fastlægge for hver undersøgt forbindelse den koncentration, som inhiberer 50% af inkorpo-14 30 reringen af C-leucxn eller "inhibitionskoncentrationen 50" (Cl 50).

Man har gennemført de forskellige forsøg i dette eksperi ment på følgende måde. De tilsvarende eksperiment-resul- 35 tater er vist på fig. 1.

DK 166966 B1 16 a) CEM-celler inkuberer 18 timer ved 37 °C i nærvær af kendte koncentrationer af ricin eller af isoleret kæde A, anvendt som referencesubstans, hvorpå disse celler underkastet et trin til inkorporering af radioaktivt sporstof.

-12

5 De opnåede værdier for Cl 50 er henholdsvis 4 x 10 M

—8 og 4,5 x 10 M for ricin og kæde A. Man har i øvrigt vist, at disse værdier ikke lader sig skelne fra sådanne, som man opnår med CEM-celler, der er markeret med haptenet TNP (kurve 1, ricin på CEM og kurve 2 kæde A ricin på 10 CEM).

b) CEM-celler, der er markeret med TNP, inkuberes 18 timer ved 37 °C i nærvær af et immunotoxin med specificitet anti-DNP, som er opnået som beskrevet i fransk patentan- 15 søgningsskrift nr. 78 27 838 og tillægsansøgningen nr.

79 24 655, hvorpå de underkastes et trin til inkorporering af radioaktivt sporstof. Formen på kurven for opnået _g cytotoxicitet samt værdien for Cl 50 (1,5 x 10 M) viser, at cellerne er normalt følsomme over for den cyto- 20 toxiske virkning af immunotoxinet anti-DNP, hvilket såle des viser, at markering med TNP på disse celler er blevet korrekt gennemført (kurve 3).

c) CEM-celler, der er markeret med TNP, inkuberes først 25 il time ved 4 °C i nærvær af ikke-kon jugeret urease med et indhold på fire enheder/ml, hvorpå de vaskes, inkuberes 18 timer ved 37 °C i nærvær af immunotoxinet anti-'65 og af urinstof 5 mM, hvorpå de underkastes en inkorporeringsfase med radioaktivt sporstof. Den opnåede værdi for _g 30 CX 50 er 5 x 10 M. Denne værdi er identisk med den, som man opnår under anvendelse af de samme betingelser på CEM-celler, som ikke er markeret med TNP, i fravær af behandlingen af urease og i fravær af urinstof i inkube-ringsmediet efter vask af ureasen. Dette forsøg viser, at 35 inkubering i nærvær af ikke-konjugeret urease ikke medfører nogen binding mellem ureasen og cellerne og af denne grund ikke nogen potentialisering af virkningen af im- DK 166966 B1 17 munotoxinet anti T65 (kurve 4).

d) CEM-celler, som er markeret med TNP, inkuberes først i en time ved 4 "C i nærvær af det ovenfor beskrevne im-5 munoenzymatiske konjugat, som anvendes i en koncentration på 6,5 enheder/ml. Man har i øvrigt kontrolleret, at dette konjugat, anvendt under disse betingelser, ikke har nogen cytotoxicitet i sig selv over for de anvendte celler. Disse celler vaskes derpå for at fjerne ethvert kon-10 jugat, som ikke er blevet fikseret, hvorpå de inkuberes 18 timer ved 37 "C i nærvær af immunotoxinet anti T65 og af urinstof 5 mM. Derpå underkastes de et inkorporeringstrin for radioaktivt sporstof. Den opnåede værdi for Cl 50 er 3,5 x 10 ^ M (kurve 5).

15

Dette resultat viser, at den potentialiserende virkning af det immunoenzymatiske konjugat forøger ca. 14 000 gange den cytotoxiske aktivitet af immunotoxinet over for målcellerne. Dette forsøg viser ligeledes, at denne po-20 tentialiserende virkning rummer fikseringen af det immunoenzymatiske konjugat på det antigen, der svarer det dets immunologiske specificitet. Denne fiksering modstår vaskning af cellerne og efterlader på overfladen af disse det enzymatiske aktive urease, som fremstiller NH^+-25 ionerne ud fra det urinstof, som er til stede i inkube-ringsmediet med immunotoxinet, hvilket medfører NH^+-ionernes velkendte potentialiserende virkning. Den opnåede potentialiserende virkning er fuldstændig analog med den, som tidligere er blevet påvist ved tilsætning af am-30 moniumchlorid 10 mM til inkuberingsmediet.

Som det er tilfældet ved en kunstig tilsætning af ammo-niumchlorid, er denne potentialiserende virkning hverken blevet opnået med ricin, heller ikke med kæden A fra ri-35 cin og heller ikke med et immuno toxin, der ikke er specifikt over for de undersøgte celler.

DK 166966 B1 18

Under reaktionsbetingelserne i dette eksempel er den cy-totoxiske aktivitet af immunotoxinet anti T65 i nærvær af det anvendte immunoenzymatiske konj ugat ca. 130 000 gange så stort som aktiviteten for kæde A af ricin, og det 5 overgår også virkningen af ricin med en faktor på ca. 11 gange.

EKSEMPEL 3 10 Immunoenzymatisk konjugat opnået ved reaktion mellem et anti-dinitrophenyl-antistof, der er substitueret med en maleimidgruppe, og et urease af vegetabilsk oprindelse a) Anti-dinitrophenyl-antistof (anti-DNP) 15

Dette antistof er et monoklonalt antistof, som er blevet oprenset ved konventionelle fremgangsmåder ud fra asci-tis-væsken hos mus af stammen Balb/C, til hvilke man havde transplanteret hybridomet Fg.

20

Dette hybridom er i sig selv blevet opnået ved fusion mellem miltceller fra mus af stammen Balb/C, der er immuniseret ved hjælp af bovint r-globulin, på hvilke man forinden har fikseret 20 DNP-grupper pr. mol, med celler 25 af slægten murint myelom NS 1, samt isoleret ved kloning i overensstemmelse med klassiske fremgangsmåder. Det således opnåede antistof er et immunoglobulin af klasse G

og af isotypen 2b, hvis affinitetskonstant (målt over for 8 -1 liganden e-DNP-lysin) er 1,8 x 10 M 30 b) Aktiveret anti-DNP-antistof

Man sætter til 2,5 ml anti-DNP-antistof med koncentrationen 9,7 mg/ml i phosphatpuffer 125 mM pH 7,0 10 ul di-35 methylformamid indeholdende 0,4 mg N-hydroxysuccinimid- esteren af m-maleimidobenzoesyre. Blandingen inkuberes en halv time ved 25 °C. Opløsningen placeres derpå på en ko DK 166966 B1 19 lonne af "Sephadex G 25" rummende 10 ml og bragt i ligevægt med phosphatpuffer 125 mM pH 7,0. Elueringen efterfølges ved måling af den optiske tæthed ved 280 nm. Man opsamler 2,5 ml begyndende med kolonnen udelukkelsesvolu- 5 men. Målingen af substitutionsgraden gennemføres på en 14 aliguot-del ved omsætning med et overskud af C-cystein.

På denne måde opnås en opløsning indeholdende 8 mg antistof pr. ml og med en substitutionsgrad på 3,5 maleimid-10 grupper pr. mol antistof.

c) Urease

Det anvendte enzym er urease fra firmaet "SIGMA" (type 15 VII, reference nr. U 0376), som indeholder 170 enheder pr. mg. En enhed er den mængde enzym, som fører til frigivelsen ud fra urinstof af 1 mikromol NH4+ pr. minut ved 20 °C og ved pH 7,0.

20 Dette enzym indeholder naturligt 27 thiolgrupper pr.

molekyle med en molekylvægt 480 000. Disse thiolgrupper, der lader sig titrere ved den såkaldte ELLMAN-metode, er ikke alle nødvendige for den enzymatiske aktivitet. Visse af dem kan således tjene til at sikre koblingen med det 25' aktiverede antistof.

d) Kobling mellem antistof og enzym

Umiddelbart efter afsaltning over G 25, blandes 2,4 ml af . 30 opløsningen af det aktiverede antistof med 2,0 ml af ure-aseopløsningen indeholdende 24 mg/ml phosphatpuffer 125 mM pH 7,0. Blandingen inkuberes 1 time ved 25 °C, og placeres efter centrifugering på en kolonne indeholdende 450 ml "Sephadex G 200" gel, der er bragt i ligevægt med PBS 35 puffer. Elueringen efterfølges af måling af den optiske tæthed ved 280 nm, samt ved måling af ureaseaktiviteten i overensstemmelse med SUMMER-teknikken.

DK 166966 B1 20

De fraktioner, som indeholder de kraftigste ureaseaktivi-teter, samles, og man opnår på denne måde 14 ml konjugat-: opløsning indeholdende 102 enheder pr. ml.

5 Når man chromatograferer en aliquot fraktion af denne opløsning over en gelkolonne af protein A-Sepharose, konstaterer man, at 30% af ureaseaktiviteten ikke tilbageholdes af kolonnen. Resten af ureaseaktiviteten elueres samtidigt med antistoffet med en puffer med pH 3,5. Et 10 kontroleksperiment viser, at den urease, der ikke er koblet til antistoffet, slet ikke er fikseret af kolonnen.

Dette viser, at 70% af ureaseaktiviteten af de samlede fraktioner klart tilhører et konjugat antistof-urease.

Ved de efterfølgende forsøg er opløsningen ikke blevet 15 befriet for forurenende urease i fri tilstand, som er uden indvirkning under de anvendte forsøgsbetingelser, således som det er beskrevet i det følgende.

EKSEMPEL 4 20

Potentialisering af immunotoxinet anti T65 ved hjælp af immunoenzymatisk konjugat ifølge eksempel 3_

Konjugatet, som er blevet opnået som ovenfor beskrevet 25 (eksempel 3), er blevet undersøgt med henblik på sine biologiske egenskaber, især sin kapacitet til at poten-tialisere aktiviteten af immunotoxinet anti T65 i en passende cellemodel.

30 Denne model består af celler af slægten human lympho-blastoid CEM, som er naturlig bærer af antigenet T65.

Dette antigen, mod hvilket man dirigerer det anvendte im-munotoxin, udgør det første mål-antigen i modellen. Man kan derudover markere disse celler ved hjælp af haptenet 35 trinitrophenyl (TNP) i overensstemmelse med den teknik, som er anført i det tidligere omtalte franske patentansøgningsskrift nr. 78 27 838.

21 DK 166966 B1

Dette hapten genkendes særdeles vel af det anti-DNP-antistof, som er indeholdt i det undersøgte immunoenzymatiske konjugat, og det udgør således det andet målantigen i modellen. Man har påvist, at markeringen af cellerne af 5 haptenet TNP ikke modificerer cellernes levedygtighed og ikke forstyrrer fikseringen på cellerne af immunotoxinet anti T65.

Eftersom immunotoxinernes fundamentale egenskab er at in-10 hibere proteinsyntesen i mål-cellerne, består den anvendte afprøvning i, at man måler virkningen af de undersøgte stoffer på inkorporeringen af ^C-leucin i cancercellerne under kultur.

15 Denne måling gennemføres ifølge en teknik, som er tillempet fra den teknik, der er beskrevet i Journal of

Biological Chemistry, 1974, 249 (11), 3557-62, idet man 14 anvender sporstoffet C-leucin til bestemmelsen af graden af proteinsyntese. Bestemmelsen af den inkorporerede 20 radioaktivitet gennemføres her på hele celler, der er isoleret ved filtrering.

Man kan ud fra disse bestemmelser optegne kurverne for effekt/dosis, idet man som abscisse anvender den molære 25 koncentration af kæde A i de undersøgte forbindelser og 14 som ordinat inkorporeringen af C-leucin udtrykt som procentandel af inkorporeringen i kontrolcellerne i fravær af enhver forbindelse, som har indflydelse på proteinsyntesen .

30 På denne måde kan man for hver undersøgt forbindelse bestemme den koncentration, som inhiberer 50% af inkorporeringen af 14C-leucin eller den såkaldte "inhiberende koncentration 50" (Cl 50).

De forskellige forsøg i dette eksperiment er blevet gennemført på følgende måde. De tilsvarende eksperimentelle 35 DK 166966 B1 22 resultater er vist på fig. 2.

a) De kontrolforsøg, der er gennemført i eksempel 2a) er ikke blevet gentaget, eftersom de ikke kan betragtes som 5 værende gyldige i det foreliggende eksempel.

b) CEM-celler, som er markeret med TNP, inkuberes 18 timer ved 37 °C i nærvær af immunotoxin med specificitet anti T65, der er opnået som beskrevet i fransk patent- 10 ansøgningsskrift nr. 81 21 836, hvorpå de underkastes et trin til inkorporering af radioaktivt sporstof. Formen på kurven for cytotoxiciteten er identisk med den, som man opnår med de samme celler, som ikke er markeret med TNP, under de samme inkuber ings-betingelser, hvorved det 15 vises, at markering med TNP af disse celler er korrekt gennemført (kurve 6).

c) CEM-celler, der er markeret med TNP, inkuberes først i en time ved 4 °C i nærvær af ikke-konjugeret urease i 20 en mængde på 1 U/ml, hvorpå de vaskes, inkuberes i 18 timer ved 37 °C i nærvær af immunotoxinet anti T65 med den -9 enkelte koncentration på 10 M samt med urinstof 5 mM, hvorpå de endelig underkastes et trin til inkorporering af radioaktivt sporstof.

25 Værdien for inkorporeringen af ^C-leucin, der opnås ved dette forsøg (65%), er overhovedet ikke forskelligt fra den, der opnås med den samme koncentration af immunotoxinet anti T65 i forsøget b). Dette resultat viser, at 30 inkuber ingen i nærvær af ikke-konjugeret urease ikke med fører nogen som helst binding af urease til cellerne, og på grund heraf ingen potential iser ing af virkningen af immunotoxinet anti T65.

35 d) CEM-celler, som er markeret med TNP, inkuberes først i en time ved 4 °C i nærvær af det ovenfor beskrevne im-munoenzymatiske konjugat, som er anvendt i en koncentra- DK 166966 B1 23 tion på 1,02 U/ml. det er i øvrigt blevet bekræftet, at dette konjugat anvendt under disse betingelser ikke udviser nogen cytotoxicitet i sig selv over for de anvendte celler. Disse celler vaskes derpå for at fjerne ethvert 5 konjugat, der ikke er blevet fikseret, hvorpå de inkube res i 18 timer ved 37 °C i nærvær af immunotoxinet anti T65 og urinstof 5 mM. Derpå underkastes de et trin til inkorporering af radioaktivt sporstof. Den opnåede værdi for Cl 50 er 2,4 x 10-1¾ (kurve 7).

10

Denne værdi, der er fuldstændig sammenlignelig med den der opnås under anvendelse af konjugatet fra eksempel 1, repræsenterer en bemærkelsesværdig potentialiserende virkning udøvet af det immunoenzymatiske konjugat i for-15 hold til immunotoxinet.

Dette forsøg viser, at denne potentialiserende virkning omfatter fikseringen af det immunoenzymatiske konjugat på det antigen, der svarer til dets immunologiske specifici-20 tet. Denne fiksering er modstandsdygtig over for vask af cellerne og efterlader på overfladen af disse celler enzymatisk aktiv urease, som danner NH4+-ioner ud fra det urinstof, som er til stede i inkuberingsmediet med immunotoxinet, hvilket medfører NH4+-ionernes potentialise-25 rende effekt.

Den opnåede potentialiseringseffekt er hel analog med den, som er blevet påvist, når inkuberingen finder sted i nærvær af ammoniumchlorid lOmM tilsat inkuberingsmediet i 30 stedet for systemet bestående af immunoenzymatisk konju gat og substrat.

Når det drejer sig om tilsætning af ammoniumchlorid, er -13 det opnåede værdi for Cl 50 3,8 x 10 M, således som det 35 fremgår af tilsvarende kurve på fig. 2 (kurve 8).

24 DK 166966 B1

De ovenfor anførte eksempler viser, at konjugaterne fremstillet ifølge opfindelsen, lader sig anvende ved human terapi.

5 De pågældende lægemidler tilberedes således, at de lader sig anvende ved injektion, fortrinsvis intravenøst. De kan anvendes ved behandlingen af lidelser, som kan være af cancerkarakter eller ej, der er følsomme over for det antistof, som er anvendt ved fremstillingen af immuno-10 toxinet. De vil kunne anvendes i doseringer under sådanne betingelser, som det vil være nødvendigt at fastlægge i hvert enkelt tilfælde afhængig af det pågældende individ og af arten af den lidelse, som skal behandles.

15 20 25 30 35

Claims (1)

1. DK 166966 B1 Patentkrav : Analogifremgangsmåde til fremstilling af immunoenzyma-5 tiske konjugater omfattende to proteiner og P2 og som har formlen Pl-S-S-P2 10 eller formlen c y _/ 1 Po-NH-C0-Z-N ' · 15. hvori et af proteinerne P^ og P2 er et antistof eller et antistoffragment, som har bevaret sin evne til at genkende det valgte antigen og det andet protein er et enzym, som 20 er i stand til at frigøre ammoniumioner ud fra naturlige substrater, der tolereres godt af højere dyrs organismer, og hvor Z betegner en alifatisk eller aromatisk gruppe, som indeholder 1 til 10 carbonatomer, kendetegnet ved, at di sulfidbindingen eller thioetherbindingen 25 mellem proteinerne P^ og p2 etableres i vandigt miljø, Ved pH på mellem 5 og 9 og ved temperaturer, der ikke overskrider 30 °C, idet man gennemfører en reaktion mellem et protein P^, der indeholder en thiolgruppe, P^H, og et andet protein P2, hvori man har indført en gruppe, 30 der er bærer af en disulfidbro og en med thiolen omsættelig gruppe, P2~S-S-X, hvor X betegner en aktiverende gruppe eller at man omsætter et thiolgruppeholdigt protein, P^SH, med et andet protein P2, hvori man har indført en maleimidgruppe, Vi p7-nh-co-z-n DK 166966 B1 hvori Z har den tidligere anførte betydning. 5 10 15 20 25 30 35