NO162797B - Monoklonalt antistofff for anvendelse in vitro. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører monoklonale antistoffer som reagerer spesifikt mot merozoitter og sporozoitter av parasitten Eimeria tenella. Slike antistoffer fås ved hjelp av hybridoma-teknikk. Det beskrives hybridomakulturer som produserer antistoffer mot E. tenella. Merozoite antigener identifiseres og karakteriseres.

Coccidiose er, som bakgrunnsopplysning, en sykdom hos dyr forårsaket av forskjellige protozo-parasitter. Fugle-coccidiose er en ødeleggende sykdom hos fjærfe forårsaket av flere forskjellige arter av slekten Eimeria. Denne sykdom har en komplisert livscyklus bestående av både aseksuelle og seksuelle trinn. Kyllinger infiseres opprinnelig av sykdommen etter inntak av frittlevende oocyster som vanligvis er forbundet med avf©ringsmateriale. Oocyster utvikles til inntrengende, aseksuelle sporozoitter i kyllingenes fordøyelseskanal. Sporo-zoittene infiserer epitelceller og utvikler seg til multinukleære strukturer kjent som schizonter. Hver enkelt schizont modnes og frigjør eventuelt flere inntrengende, aseksuelle strukturer kjent som merozoitter. Disse merozoittene forlater den infiserte cellen og reinvaderer andre epitelceller. De flerfoldige aseksuelle inntrengningstrinn som omfatter sporozoitter og merozoitter, svarer for meget av coccidiosens patologi. Coccidiosens seksuelle cyklus startes opp når merozoitter differensierer til gametocytter. Forplantning skjer og for-plantningsproduktene kjent som oocyster frigjøres fra avfør-ingen. Derved er parasittens livscyklus fullført. Hos kyllinger fullføres livscyklusen til Eimeria tenella, en representativ art, i løpet av ca. 7 til 9 dager.

På grunn av de svære økonomiske tap som påføres fjærfe-industrien ved Eimeria-arter, er en vaksine mot parasitten svært ønskelig. Det er imidlertid, på grunn av kompleksiteten i livscyklusen til parasitten og foranderligheten i mengden antigener som er til stede i hvert trinn, i den senere tid blitt iaktatt at deaktiverte eller drepte parasitter ikke har tilveiebrakt homogen immunitet. En løsning på dette problemet er å isolere og karakterisere bestemte antigener fra parasitten og administrere dem i en tilstrekkelig mengde til å tjene som et immuniserende middel. Fortrinnsvis gir slike antigener beskyttelse mot infeksjon fra alle viktige arter. Det er kjent at forskjellige arter av Eimeria, såvel som forskjellige trinn i livscyklusen til de samme artene, både har felles og spesifikke antigener [Z. Cerna; Folia Parasitologica (Praque) 17: 135-140

(1970); Davis et al., Immunol. 34-* 879-888 (1978); M.E. Rose, Immunol. 2: 112-122 (1959); Rose et al., Immunol. 5: 79-92 ;(1962) og Tanielian et al., Acta Parasitol. Jugosl. 7: 79-84 ;(1976)]. Det er også kjent at utvikling av immunitet mot Eimeria er artsspesifikk og hos noen arter av husdyrfugler foreligger det betydelig stamme-spesifikk immunitet [T.K. Jeffers.; i P.L. Long et al. (eds.), Avian Coccidiosis, sidene 57-125, Proe. 13th Poultry Sei. Symp. (1978); L.P. Joyner, Parasitol, 59: 725-732; (1969); P.L. Long, Parasitol, 69: 337-347 (1974) og Long et al., Parasitol. 79: 451-457 (1979)]. Aktuelle immunogener fra Eimeria-arter som er i stand til å stimulere beskyttende immunitet i fugle- eller pattedyrverter er ennå ikke blitt isolert eller identifisert. Slik Eimeria-immunogener vil trolig gi vellykket immunisering mot coccidiose. ;Utviklingen av teknikken med lymfocytt-hybridoma gir et redskap for å fremstille forholdsvis store mengder spesifikke antistoffer mot forskjellige antigener fra Eimeria. Ved å smelte sammen spesifikke antistoff-produserende celler (miltceller) med celler fra en myelomatumor er det mulig å fremstille hybridomaceller som utskiller monoklonale antistoffer rettet spesifikt mot det opprinnelige sensibliserende antigen [Kohler & Milstein, Nature (London) 256: 495-497 (1975)]. ;Når det først er oppnådd slike hybridomakulturer som produserer monoklonale antistoffer, er det mulig ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter å utnytte slike antistoffer for å isolere og identifisere bestemte antigener som igjen kan utnyttes som en vaksine for å tilføre vertsorganismene et system av aktiv immunitet. Forskjellige patenter som vedrører hybridomakulturer og monoklonale antistoffer er kjent (dvs. US-patenter nr. ;I lys av diskusjonen ovenfor vedrørende de økonomiske virkningene av coccidiose i husdyrbruket er det svært ønskelig med kontroll av protozo-parasitten. Et formål ved foreliggende oppfinnelse er følgelig å tilveiebringe nye og anvendelige monoklonale antistoffer erholdt mot merozoitter av parasitten E. tenella. Det henvises således til det medfølgende krav. ;Eimeria tenella, arten som infiserer blindtarmen hos kyllinger, er en spesielt ødeleggende parasitt som forårsaker alvorlig blødende skader i infiserte dyr. E. tenella har to merozoitt-trinn i sin livscyklus som betegnes henholdsvis første og andre generasjons-merozoitter. Immunitet mot E. tenella er kjent for å utvikles under de aseksuelle merozoitt-trinnene i dens livscyklus [P. Long, (ed.), The Biology of the Coccidia, University Park Press, Baltimore, Md. (1982)]. ;Et preparat av E. tenella-merozoitter brukes til å immunisere mus for eventuelt å frembringe monoklonale antistoffer ved å følge fremgangsmåten beskrevet nedenunder. De monoklonale antistoffene brukes til å identifisere antigener hos parasitten. Antigener som utløser monoklonale antistoffer som reagerer med minst én art av Eimera eller med enten merozoitter eller sporozoitter, og nøytraliserer parasittvekst, anses som beskyttende antigener. Beskyttende antigener betraktes som potensielle kandidater for utviklingen av en vaksine mot fugle-coccidiose. ;De følgende eksempler tjener ytterligere til å illustrere oppfinnelsen. ;EKSEMPEL 1 ;Kvantitative radioimmun- analvser ;For å undersøke antistoffers kvalitet ble det utviklet en kvantitativ radioimmunanalyse. Glutaraldehyd-fikserte sporozoitter eller merozoitter (vanligvis 2-5xl0<5>/brønn) sentrifugeres ut på plater av polyvinylklorid eller Removawell® med 96 ;brønner ved 1400x g i 10 minutter for å feste organismen til bunnen av brønnene. Sporozoitter eller merozoitter som fester ;seg til platens bunn omsettes med serumprøver fra mus immunisert med parasitten eller det monoklonale antistoffet i et dyrkings-supernatant fra hybridoma-celler. Inkubering med antistoffet skjedde i 16 til 18 timer ved 4°C eller i 2 timer ved rom-temperatur. Antistoffet som ble bundet, ble påvist med et radioaktivt-merket andre antistoff 187.1, som er et monoklonalt antistoff fra rotte som er spesifikt for den lette k-kjeden fra mus. Anti-mus k lettkjede-antistoffet merkes biosyntetisk med <35>S-methionin [D.E. Yelton et al., Hybridoma, 1: 5-11 (1982)]. Radioaktiviteten overvåkes ved hjelp av scintillasjonstelling i væske. Radioimmunanalysefremgangsmåten anvendes deretter på . overflatetnembranene erholdt fra E. tenella sporozoitter for å sikre antistoffers reaktivitet i immun-mus-sera med membran-proteiner. ;EKSEMPEL 2 ;Konstruksjon av hybridoma- kulturer ;Primære kulturer av nyreceller fra kyllinger infiseres ;med sporozoitter som nylig er frisatt, etterfulgt av fremgangsmåter kjent innen teknikken. Merozoitter frigjort i mediet 5 dager etter infeksjon høstes ved hjelp av sentrifugering ved ;3 50x g i lo minutter. 18 uker gamle BALB/c-mus av hunkjønn immuniseres intra-peritonealt (i.p.) med 1x10 7 hele eller opp-delte E. tenella-merozoitter i fullstendig Freunds hjelpestoff. Dyrene gis en innsprøytning med 2 i.p. injeksjoner merozoitter ;i medium 199 (Gibco) ved to 5-ukers intervaller etter innleden-de immunisering. Serumet erholdt 3 dager etter hver innsprøyt-ing ble kontrollert for nærvær av antistoffer mot E. tenella-'merozoitter ved indirekte immunfluorescens-analyse (IFA) eller radioimmunanalyse (RIA). Begge disse analysene utføres på glutaraldehyd-fikserte parasitter. ;Hybridoma-celler avledes ved å følge fastlagt metodikk [Kwan et al. (1980), Genetic Engineering ed. av J. K. Setlow & A. Hollander, Plenum Publishing Corp., New York, s.31-96]. Miltceller fra 2 mus immunisert med E. tenella-merozoitter fusjoneres med en ikke-utskillende klon av P3-myeloma, P3-x63.Ag8.653 i nærvær av 30 % polyetylenglykol (PEG 1000) ;i 8 minutter. Sammensmeltede celler fordeles i 96-brønners vevkulturskåler (Linbro) og holdes i HAT-seleksjonsmedium ;[ J. W. Littlefield, Science, 145;709-710 (1964)]. HAT-mediet fremstilles i Dulbeccos modifiserte Eagles medium som inneholdt 20 % serum fra kalvefoster (Gibco) og 10 % NCTC 109 (Micro-biological Associates). Hybrider dyrkes i en inkubator ved 37°C og 10 % C02. ;Kulturer analyseres med jevne mellomrom for nærværet av antistoff som er reaktivt med E. tenella-merozoitter ved IFA-og RIA-fremgangsmåter. Positive kulturer flyttes over på vevkulturskåler med 24 brønner i et medium fritt for hypoxanthin, aminopterin og thymidin. Hybridoma-celler klones i bløt agaro-se over et fødesjikt med fibroblaster fra rotte-embryo ICoffins et al., J. Cell. Phyisol., 7j):429"440 (1972)]. Positive hybridoma-kloner betegnes med et underklon-nummer (dvs. en klon 15.84.4 er en underklon nr. 4 av en hybridoma betegnet som 15.84). Klassen og underklassen til immunglobulin utskilt av godt karakteriserte underkloner bestemmes ved hjelp av en dob-bel- dif fus jonsmetode i agar. Detergent (NP-40)-oppløselig eks-trakter av hybridomaceller brukes med reagenser som inneholder anti-mus-antistoff fra kanin (Meloy). ;EKSEMPEL 3 ;Karakterisering av anti- merozoitt- monoklonale antistoffer ;Kjennetegnene til 8 anti-merozoitt-monoklonale antistoffer er vist i tabell I. Flertallet av de monoklonale antistoffene reagerte med merozoitter såvel som sporozoitter ved IFA såvel som RIA. Monoklonale antistoffer 1.90 og 4.76 reagerte ikke med sporozoitter i IFA og leilighetsvis i RIA (se <*> i tabell I). Monoklonalt antistoff 15.84 reagerte ikke med merozoitter i IFA, men reagerte like godt med sporozoitter såvel som merozoitter i RIA. Dataene oppsummert i tabell I indikerer at alle de monoklonale antistoffene avledet fra anti-merozoitt-fusjonen er kryss-reaktive med sporozoitter såvel som merozoitter av E. tenella.

EKSEMPEL 4

Reaktivitet for anti- merozoitt- monoklonale antistoffer

mot sporozoitter av forskjellige arter

De monoklonale antistoffene analyseres ved hjelp av IFA mot sporozoitter avledet fra 5 parasitt-coccidia-arter fra fug-ler av kommersiell betydning. Data fra disse eksperimentene er vist i tabell II. 6 monoklonale antistoffer som reagerte i IFA med sporozoitter avledet fra E. tenella, brukes for å undersøke artenes kryss-reaktivitet. Resultatene viser at 5 monoklonale antistoffer kryss-reagerte med sporozoitter avledet fra E. necatrix og E. maxima, og et monoklonalt antistoff (15.84) reagerte med alle 5 undersøkte artene av Eimeria.

EKSEMPEL _ 5

Antigen- karakterisering

E. tenella-antigener som er gjenkjent ved hjelp av monoklonale antistoffer, identifiseres ved hjelp av SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) etterfulgt av en fremgangsmåte med oppsuging på nitrocellulose [Towbin et al., Proced. Nati. Acad. Sei. (USA) 76:4350-4354 (1979)].

E. tenella-sporozoitter og merozoitter lyseres og ekstra-heres med 1% "Nonidet P-40" i 10 mM tris-buffer (pH 7,5) som inneholder 155 mM NH^Cl, 1,5 mM MgAc2 med protease-inhibitorer leupeptin og antipain ved 30 pg/ml, 4 mM fenylmetylsulfonyl-fluorid og aprotinin (2 trypsininhiberende enheter/ml). Lyseringsfremgangsmåten omfatter en inkubasjon i 30 minutter ved 0°C etterfulgt av en sentrifugering ved 2500x g i 30 min. Pelleten kasseres og det oppløste materiale brukes så til gel-elektroforese. SDS-polyakrylamidgel-elektroforese av prøver redusert med 2-merkaptoetanol utføres i et diskontinuerlig tris-glycinsystem på gradientgeler med 7-15 % polyakrylamid.

De ved SDS-PAGE separerte proteiner overføres elektro-foretisk til et nitrocellulosefilter i løpet av 45 minutter. Nitrocellulosefilteret omsettes så med enten ascites-væsken (fortynning 1 til 100) eller brukt dyrkingsvæske fra hybridomas i 16-18 timer ved 4°C. Det ble tatt med normalt kaninserum ved en konsentrasjon på 10 % i alle inkubasjonene med antistoffet. Det bundne monoklonale antistoffet påvises ved å omsette med

12 5

et I-merket antimus IgG-antistoff fra kanin. Reaksjonen med det andre antistoffet varer vanligvis i 3-5 timer ved romtempe-ratur. Det ubundne andre antistoff fjernes ved vasking. Nitro-cellulosef iltrene eksponeres deretter mot Kodak røntgenfilm

XAR-5 eller SB-5.

Eventuelt fremkalles flekkene ved hjelp av en ELISA-fremgangsmåte hvor det brukes pepperrot-peroksidasekoblet antirwus-IgG fra kanin og klornaftol og ^02 som substrater. Molekylvekter for proteinantigenene bestemmes i forhold til molekyl-vektstandarder.

Antigenene som gjenkjennes ved monoklonal-antistoffet 15.84 er typisk. Monoklonal-antistoff 15.84 reagerer med en dublett med en omtrentlig molekylvekt på 130 _+ 20 kd. Beregningen av molekylvekter for proteiner i størrelsesorden 100 kd er imidlertid gjenstand for variasjon avhengig av molekylvektstandard-ene som anvendes. I tillegg til artene med 130 _+ 20 kd, reagerer 15.84 også med et bånd som har en tilsynelatende molekylvekt på 300 _+ 50 kd. Det største molekylvekt-båndet utgjør ca. 15 til 20 % av antigenet og er muligens enten et aggregat eller en polymer form av artene med 130 + 20 kd. Et kontroll-eksperiment med et monoklonalt antistoff som er kjent for ikke å reagere med proteinantigener, brukes til å bevise spesifisi-teten til anti-merozoitt-antistoffene. I tillegg viser andre kontroller at de monoklonale antistoffene er parasitt-spesifikke og ikke reagerer med det vert-spesifikke protein.

En oppsummering av molekylvektdata for antigener gjenkjent ved hjelp av forskjellige antistoffer er vist i tabell III. Det vesentlige trekket er tilstedeværelsen i E. tenella-merozoitter av immunogene antigener som enten ligger i molekylvektområdet

< 20 kd eller > 100 kd.

Monoklonalt antistoff 15.84 anses som et nøytraliserende antistoff, og antigenet som gjenkjennes anses som et beskyttende antigen. Dertil er 15.84-antistoffet kryss-reaktivt med merozoitter og sporozoitter fra E. tenella såvel som sporozoitter isolert fra E. maxima, E. necatrix, E. acervulina og E. brunetti.

De nye monoklonale antistoffer 1.90, 15.84, 13.90, 10.84, 8.03 og 2.03, som er isolert slik som beskrevet ovenfor, er blitt deponert ved American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland og er tilført dennes permanente samling. Nummer 1.90 har fått tildelt nummeret HB8336. Nr. 15.84 har nummeret HB8335. Nr. 13.90 er blitt tildelt HB8337. Nr. 10.84 har nummeret HB8387. Nr. 8.03 har fått tildelt nummeret HB8388 og nr. 2.03 har nummeret HB8389. Adgang til antistoffene er tilgjengelige mens foreliggende søknad er under behandling for d.; som gis rett til dette av Commissioner of Patents and Trademarks under 37 CF.R. 1.14 og 35 U.S.C. 122, og alle restriksjoner vedrørende tilgjengeligheten for almenheten til HB8335 , HB8336 , HB8337 , HB8387, HB8388 og HB8389 vil bli ugjen-kallelig fjernet etter meddelelsen av et patent basert på foreliggende søknad.

Numrene 1.90, HB8336, 15.84, HB8335 og 13.90, HB8337 ble alle deponert ved ATCC 16. august 1983. Numrene 10.84, HB8387, 8.03, HB8388 og 2.03, HB8389 ble deponert ved ATCC 20. oktober 1983.

Claims (1)

1. Monoklonale antistoffer for anvendelse in vitro, fremstilt av hybridomer dannet ved sammensmelting av celler fra en mus-myelomalinje og miltceller fra mus som tidligere er blitt immunisert med Eimeria tenella merozoitter, karakterisert ved at antistoffet: a) reagerer spesifikt med antigener fra Eimeria spp.

   sporozoitter eller merozoitter; b) reagerer spesifikt med antigener fra Eimeria tenella som har en molekylvekt i området fra ca. 15 til 350 kDa; c) de er fremstilt av hybridomer dannet ved sammensmelting av P3x63.Ag8.653-myelomaceller og miltceller fra BALB/c-mus som tidligere er blitt immunisert med E. tenella merozoitter, nemlig av:

   det hybridom som er betegnet klon-nummer 1.90 og er deponert som ATCC nr. HB833 6;

   det hybridom som er betegnet klon-nummer 2.03 og deponert som ATCC nr. HB8389;

   det hybridom som er betegnet klon-nummer 13.90 og deponert som ATCC nr. HB8337;

   det hybridom som er betegnet klon-nummer 10.84 og deponert som ATCC nr. HB8387;

   det hybridom som er betegnet klon nr. 8.03 og deponert som ATCC nr. HB8388; eller

   det hybridom som er betegnet klon-nummer 15.84 og deponert som ATCCC nr. HB8335.