FI84186B - Foerfarande foer framstaellning av monoklonala antikroppar mot eimeria spp.-sporozoiter och merozoiter och foerfarande foer framstaellning av en antigen komposition. - Google Patents

Description

Menetelmä Eimeria spp.-itiöiden ja merotsoiittien vastais ten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ja me netelmä antigeenikoostumuksen valmistamiseksi 1 84186 5 Keksintö koskee menetelmää monoklonaalisten vasta- aineiden valmistamiseksi, jotka reagoivat Eimeria spp.-itiöiden tai merotsoiittien antigeenien kanssa.

Nämä monoklonaaliset vasta-aineet reagoivat spesifisesti Eimeria tenella'n itiöitä ja merotsoiittejä vas-10 taan. Kyseisiä vasta-aineita saadaan hybridoomatekniikal-la. Esitetään hybridooma-viljelmiä, jotka tuottavat vasta-aineita E. tenella'a vastaan. Merosoiitti-antigeenit identifioidaan ja karakterisoidaan.

Keksintö koskee myös menetelmää antigeenisen, immu-15 nogeenisen ja proteiinipitoisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on liukoinen detergenttiä sisältävään puskuri-liuokseen, ja joka on Eimeria tenella'n merotsoiittien antigeeninä, ja joka on spesifisesti reaktiivinen merotso-iittivastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa.

20 Kyseiset antigeenit ja tietyt monoklonaaliset vas ta-aineet ovat tehokkaita kokkidioosin ennaltaehkäisyssä ja hoidossa. Antigeenit ovat hyödyllisiä rokotteina kokki-dioosia vastaan.

Taustatietona mainittakoon, että kokkidioosi on 25 alkueläimissä esiintyvä sairaus, jonka aiheuttaa joukko alkueläinparasiitteja. Linnuissa esiintyvä kokkidioosi on tuhoisa siipikarjan tauti, jonka aiheuttaa joukko Eimeria-lajeja. Kyseisellä taudilla on monimutkainen elinkierto, joka koostuu sekä suvuttomista että suvullisista vaiheis-30 ta. Kanat saavat alunperin tartunnan tautiin nieltyään vapaana eläviä munarakkuloita, joita yleensä esiintyy ulosteissa. Munarakkulat kehittyvät tauteja levittäviksi suvuttomiksi itiöiksi kanan ruoansulatuskanavassa. Itiöt tartuttavat epiteelisoluja ja kehittyvät monitumaisiksi 35 rakenteiksi, jotka tunnetaan halkioina. Jokainen halkio 2 g*tf,6 kehittyy ja lopulta vapauttaa useita tauteja levittäviä suvuttomia rakenteita, jotka tunnetaan merotsoiitteinä. Kyseiset merotsoiitit poistuvat tartunnan saaneista soluista ja tartuttavat muita epiteelisoluja. Itiöihin ja 5 merotsoiitteihin liittyvät useat tauteja levittävät suvut-tomat vaiheet muodostavat suurelta osin kokkidioosin patologian. Kokkidioosin suvullinen kierto alkaa, kun merotsoiitit erottuvat gametosyyteiksi. Hedelmöittyminen tapahtuu ja hedelmöittymistuotteet, jotka tunnetaan munarakkuloina, 10 vapautuvat ulosteisiin. Tällöin parasiitin elinkierto päättyy. Tyypillisen Eimeria tenella'n elinkierto kanoissa päättyy noin 7:ssä - 9:ssä päivässä.

Eimeria-lajien takia koituvien valtavien taloudellisten tappioiden johdosta siipikarjateollisuudelle, roko-15 te parasiittiä vastaan on erittäin toivottava. Kuitenkin parasiitin elinkierron monimutkaisuudesta ja jokaisessa elinvaiheessa olevien useiden antigeenien lukumäärän vaihtelevuudesta johtuen, on huomattu, että heikennetyt tai tapetut parasiitit eivät ole saaneet aikaan pysyvää immu-20 niteettiä. Eräs ratkaisu kyseiseen ongelmaan on eristää ja tunnistaa tietyt antigeenit parasiitistä ja antaa niitä riittävässä määrin, jotta ne voivat toimia immunisoivina aineina. Edullisesti kyseiset antigeenit suojaavat kaikkien tärkeiden lajien tartunnoilta.

25 On tunnettua, että useilla Eimeria-lajeilla sekä saman lajin elinkierron eri vaiheilla on sekä yhteisiä että spesifisiä antigeenejä [Z. Cerna: Folia Parasitologi-ca (Praha), 17 (1970), ss. 135 - 140; Davis et ai.: Immunol. 34 (1978), ss. 879 - 888; M. E. Rose: Immunol. 2 30 (1959), ss. 112 - 122; Rose et ai.: Immunol. 5 (1962), ss.

79 - 92; ja Tanelian et ai.: Acta parasitol. Yogosl. 7 (1976), ss. 79 - 84].

On myös tunnettua, että immuniteetin kehittyminen Eimeria'a vastaan on lajikohtaista; joillakin siipikarjan 35 lajeilla esiintyy huomattavaa kantakohtaista immuniteettiä 3 84186 [Τ. Κ. Jeffers, julkaisussa P. L. Long et al. (toim.): Avian Coccidiosis, ss. 57 - 125; Proc. 13th Poultry Sci. Symp. (1978); L. P. Joyner: Parasitol. 59 (1969), ss.

725 - 732; P. L. Long: Parasitol. 69 (1974), ss. 337 -5 347; ja Long et al.: Parasitol. 79 (1979), ss. 451 - 457] .

Tällä hetkellä Eimeria-lajin immunogeenejä, jotka voisivat synnyttää suojaavaa immuniteettiä linnuissa tai nisäkkäissä, ei vielä ole eristetty tai identifioitu. Ky-10 seisillä Eimeria-immunogeeneillä saadaan todennäköisesti aikaan onnistunut immunisointi kokkidioosia vastaan.

Lymfosyyttihybridoomatekniikan kehittyminen tarjoaa keinon, jolla voidaan tuottaa suhteellisen suuria määriä spesifisiä vasta-aineita lukuisia Eimeria-antigee-15 nejä vastaan. Fuusioimalla spesifiset vasta-ainetta tuottavat solut (pernasolut) myeloomakasvaimesta saatuihin soluihin, on mahdollista valmistaa hybridoomasoluja, jotka erittävät monoklonaalisia vasta-aineita, jotka spesifisesti kohdistuvat alkuperäistä herkistävää antigeeniä vas-20 taan [Köhler & Milstein: Nature (Lontoo) 256 (1975), ss. 495 - 497].

Jos saadaan parasiitin vastaisia vasta-aineita, voi olla mahdollista siirtää kyseiset vasta-aineet tartunnan saaneeseen tai altistuneeseen siipikarjaan ja täten ai-25 kaansaada isäntäorganismille määrätty passiivinen immuniteetti. Kun monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia hybri-doomaviljelmiä on saatu, on mahdollista eri menetelmillä käyttää kyseisiä vasta-aineita spesifisten antigeenien eristämiseksi ja identifioimiseksi, joita antigeenejä puo-30 lestaan voitaisiin käyttää rokotteena, jotta isäntäorganismille saataisiin aktiivinen immuniteetti.

Tunnetaan lukuisia hybridoomaviljelmiin ja monoklo-naalisiin vasta-aineisiin liittyviä patenttijulkaisuja (ts. US-patenttijulkaisut 4 172 124; 4 196 265; 4 271 145; 35 4 361 549; 4 631 550; 4 364 932; 4 364 933; 4 364 934; 4 364 935; 4 364 936; 4 831 292 ja 4 381 295).

4 84186

Edellä esitetyn valossa kokkidioosin taloudellisista vaikutuksista karjanhoitoon ja erityisesti siipikarja-teollisuuteen, alkueläinparasiitin hallinta on hyvin toivottavaa .

5 Niinpä keksinnön tarkoituksena on saada aikaan uu sia ja käyttökelpoisia monoklonaalisia vasta-aineita E. tenella-parasiitin merotsoiittejä vastaan. Lisätarkoituk-sena on eristää ja identifioida spesifiset E. tenella-an-tigeenit, jotka ovat käyttökelpoisia rokotteina linnuissa 10 esiintyvän kokkidioosin hallitsemiseksi.

Keksinnön mukaisille menetelmille vasta-aineiden ja antigeenikoostumuksen valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään.

Eimeria tenella-laji, joka infektoi kananpoikien 15 umpisuolet, on erityisen tuhoisa parasiitti, joka aiheuttaa erityisen pahoja verisiä haavaumia tartunnan saaneissa eläimissä. E. tenella'lla on kaksi merotsoiitti-vaihetta elinkierrossaan, jotka vaiheet on nimetty ensimmäisen ja vastaavasti toisen sukupolven merotsoiiteiksi. Immunitee-20 tin E. tenella'a vastaan tiedetään kehittyvän sen elin-kierron suvuttomien merotsoiitti-vaiheiden aikana [P. L. Long (toim.): The Biology of the Coccidia, University Park Press, Baltimore, Md. (1982)].

E. tenella'n merotsoiitti-valmistetta käytetään 25 immunisoimaan hiiriä, jotta lopulta saataisiin monoklonaa lisia vasta-aineita jäljempänä esitetyllä menetelmällä. Monoklonaalisia vasta-aineita tutkitaan edelleen, jotta voitaisiin määrittää niiden kyky hillitä parasiitin kasvua in vivo. Antigeenit, jotka aikaansaavat monoklonaalisia 30 vasta-aineita, jotka reagoivat ainakin yhden Eimeria-lajin kanssa tai joko merotsoiittien tai itiöiden kanssa, ja jotka hillitsevät parasiitin kasvua, pidetään suojäävinä antigeeneinä. Suojaavia antigeenejä pidetään mahdollisina ehdokkaina linnuissa esiintyvää kokkidioosia vastaan käy-35 tettävän rokotteen kehittämiseksi.

5 84186

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1

Kvantitatiivinen radioimmunomääritys

Jotta voitaisiin arvioida vasta-aineiden laatua, 5 suoritettiin kvantitatiivinen radioimmunomääritys.

Glutaraldehydillä sidottuja itiöitä tai merotso-iittejä (yleensä 2 - 5 x 105/kuoppa) sentrifugoidaan 96-kuoppaisille polyvinyylikloridi- tai Removawell·®'-levyille (Dynatech) 1 400 x g 10 minuutin ajan, jotta organismi 10 kiinnittyisi kuoppien pohjiin.

Levyn pohjaan kiinnittyneet itiöt tai merotsoiitit saatetaan reagoimaan seeruminäytteiden kanssa, jotka on saatu parasiitillä immunisoiduista hiiristä, tai hybridoo-mien viljelyliuoksesta saadun monoklonaalisen vasta-aineen 15 kanssa.

Inkubointi vasta-aineen kanssa kesti 16 - 18 tuntia 4 °C:ssa tai 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Sitoutunut vasta-aine todettiin radioaktiivisesti leimatulla toisella vasta-aineella 187,1, joka on hiiren k-kevytketjulle spe-20 sifinen rotan monoklonaalinen vasta-aine. Anti-hiiri k-kevytketjuinen vasta-aine leimataan biosynteettisesti 35S-metioniinilla [D. E. Yelton et ai.: Hybridoma 1 (1982), ss. 5 - 11]. Radioaktiivisuus mitataan neste-tuikelasken-nalla. Radioimmunomääritysmenetelmää sovelletaan tämän 25 jälkeen E. tenella'n itiöistä saatuihin pintamembraanei- hin, jotta varmistetaan vasta-aineiden reaktiivisuus immuuneissa hiiriseerumeissa membraaniproteiinien kanssa.

Esimerkki 2

Hybridoomaviljelmien valmistus 30 Kanan munuaissolujen primääriset viljelmät infek- toidaan juuri munarakkuloista puhjenneilla itiöillä noudattaen menetelmiä, jotka ovat tunnettuja alalla.

5 päivää tartunnan jälkeen alustaan vapautuneet merotsoiitit kerätään sentrifugoimalla 350 x g 10 minuutin 35 ajan.

6 84116 18-viikkoiset BALB/c-naarashiiret immunisoidaan vatsaontelon sisäisesti (i.p.) 1 x 107:llä joko kokonaisilla tai E. tenella-merotsoiittien osilla Freund'in täydellisessä adjuvantissa. Eläimille annetaan i.p. 2 merotso-5 iitti-tehosteruisketta väliaineessa 199 (Gibco) 5 viikon välein alkuperäisen immunisoinnin jälkeen. 3 päivää jokaisen tehosteruiskeen jälkeen saatu seerumi tutkittiin E. tenella'n itiöitä vastaan muodostuneiden vasta-aineiden toteamiseksi epäsuoralla immunofluoresenssimäärityksellä 10 (IFA) ja radioimmunomäärityksellä (RIA). Kummatkin määri tykset suoritetaan glutaraldehydillä sidotuille parasiiteille.

Hybridoomat saadaan noudattaen tunnettuja menetelmiä [Kwan et ai.: (1980) Genetic Engineering; J. K. Setlow 15 ja A. Hollander (toim.), Plenum Publishing Corp., New

York, ss. 31 - 96]. E. tenella'n merotsoiiteillä immunisoidut kahden hiiren pernasolut yhdistetään P3-myelooman P3-x 83. Ag 8.653, erittämättömään klooniin, 30-%risen polyetyleeniglykolin (PEG 1 000, Baker Chemical) läsnäol-20 lessa 8 minuutin ajan. Fuusioidut solut levitetään 96- kuoppaisiin kudosviljelyastioihin (LINBRO) ja ylläpidetään HAT-selektio-alustassa [J. W. Littlefield: Science 145 (1964), ss. 709 - 710]. HAT-alusta valmistetaan Dulbecco'n modifioituun Eagle'n alustaan, jossa on 20 % sikiövasikan 25 seerumia (Gibco) ja 10 % NCTC 109:ää (Microbiological Associates). Hybridejä viljellään inkubaattorissa 37 °C:ssa ja 10-%:isessa C02:ssa.

Viljelmiä analysoidaan ajoittain IFA- ja RIA-mene-telmillä E. tenella'n itiöiden kanssa reagoivien vasta-30 aineiden toteamiseksi. Positiiviset viljelmät siirretään 24-kuoppaisiin kudosviljelmä-astioihin alustassa, jossa ei ole hypoksantiinia, aminopteriiniä eikä tymidiiniä. Hybridoomat kloonataan pehmeässä agaroosissa rotan alkion fib-roblastisyöttökerroksen päällä [Coffins et ai.: J. Cell 35 Physiol. 79 (1972), ss. 429 - 440]. Positiiviset hybridoo- 7 84186 makloonit nimetään alaklooninumeroilla (ts. klooni 15,84,4 on hybrodooma 15,84 alaklooni 4). Hyvin karakterisoitujen alakloonien erittämien immunoglobuliinien luokka ja alaluokka määritetään agar-kaksoisdiffuusiomenetelmällä. De-5 tergenttiin (NP-40) liukoisia hybridoomauutteita käytetään kanin anti-hiiri-vasta-ainereagenssien kanssa (Meloy). Esimerkki 3

Anti-merotsoiitti-monoklonaalisten vasta-aineiden karakteri sointi 10 8:n anti-merotsoiitti-monoklonaalisen vasta-aineen ominaisuudet on esitetty taulukossa I. Suurin osa monoklo-naalisista vasta-aineista reagoi merotsoiittien ja itiöiden kanssa sekä IFArlla että RlA:11a analysoituna. Monoklonaaliset vasta-aineet 1,90 ja 4,76 eivät reagoineet 15 itiöiden kanssa ja sattumalta RIA:ssa [katso (* taulukossa I], Monoklonaalinen vasta-aine 15,84 ei reagoinut merotsoiittien kanssa IFArssa, mutta reagoi yhtä hyvin sekä itiöiden että merotsoiittien kanssa RIA:ssa. Taulukkoon I kerätyt tiedot osoittavat, että kaikki anti-merotsoiitti-20 fuusiosta johdetut monoklonaaliset vasta-aineet ovat ris- ti-reaktiivisia sekä E. tenella'n itiöiden että merotsoiittien kanssa.

Taulukko I

25 Anti-merotsoiitti-monoklonaalisten vasta-aineiden identi fiointi

Monoklonaalinen IFA RIA

vasta-aine_Mero Itiö_Mero Itiö 30 Ml (1,90 + - + (* M2 (4,76) + - + (* M3 (2,03) + + + + M4 (13,90) + + + + M5 (10,08) + + + + 35 M6 (10,84) + + + + M7 (8,03) + + + + M8 (15,84)____+ + + 8 84186

Esimerkki 4

Anti-merotsoiitti-monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus eri lajien itiöitä vastaan

Monoklonaaliset vasta-aineet analysoidaan IFArlla 5 5:stä taloudellisesti tärkeästä lintu-parasiitti kokkidi-oosilajista johdettuja itiöitä vastaan. Tiedot kokeista on esitetty taulukossa II. 6:tta monoklonaalista vasta-ainetta, jotka reagoivat IFA:ssa E. tenella'sta johdettujen itiöiden kanssa käytetään tutkittaessa lajien ristireak-10 tiivisuutta. Tulokset osoittavat, että 5 monoklonaalista vasta-ainetta reagoi ristiin E. necatrix'sta ja E. maxima ' sta johdettujen itiöiden kanssa ja 1 monoklonaalinen vasta-aine (15,84) reagoi kaikkien viiden kokeessa olleen Eimeria-lajin kanssa.

15

Taulukko II

Anti-merotsoiitti-monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus eri lajien itiöitä vastaan 20 Mono- E. te- E.neca- E. acer- E. maxi- E. bru- klonaali- neliä trix vulina ma netti nen vasta- aine_ M 3 (2,03) + + - + 25 M 4 (13,90) + + + M 5 (10,08) + + + M 6 (10,84) + + +/- M 7 (8,03) + + - + M 8 (15,84) + + + + + 30 _

Esimerkki 5

In vivo-neutralointianalyysi

In vivo-menetelmää monoklonaalisten vasta-aineiden 35 analysoimiseksi käytetään arvioimaan monoklonaalisia vas- 9 84186 ta-aineita. 3 monoklonaalista vasta-ainetta, jotka reagoivat E. tenella'n itiöiden kanssa, analysoidaan tällä tavalla. Juuri eristettyjä itiöitä inkuboidaan steriileissä olosuhteissa lämpö-inaktivoidulla askiites-nesteellä, joka 5 on johdettu kolmesta eri hybridoomasta. Inkubointiaika on 1 tunti huoneen lämpötilassa. Itiöt istutetaan 3 viikon ikäisten kananpoikien umpisuoliin kirurgisesti. Parasiitin kehityksen annetaan tapahtua 5 päivää istutuksen jälkeen. Tämän ajan lopussa haavaumat lasketaan, jotta voitaisiin 10 arvioida tartunnan laajuus. Kokeiden tulokset on esitetty taulukossa III monoklonaalisten vasta-aineiden tarjoamana suojausprosenttina. Tiedot osoittavat, että jokainen vasta-aine on ainakin osittain suojaava joissakin koejärjestelmän olosuhteissa.

15

Taulukko III

In vivo-neutralointianalyysi E. tenella'n itiöillä ja an-ti-merotsoiitti-monoklonaalisilla vasta-aineilla 20 Eläinten _Suojaus-%_ Käsittely luku- Ei Osittain Täysin _määrä_yhtään_ I. Kevyt tartunta (200 itiötä/eläin) 25 Kontrolli 14 65 35 M 6 (10,84) 13 15 85 M 8 (15,84) 18 5 17 78 II. Vakava tartunta 30 (1000 itiötä/eläin)

Kontrolli 7 100 M 4 (13,90) 9 89 11 M 6 (10,84) 8 75 25 M 8 (15,84) 9 33 44 23 35 (jatkuu...) 10 841 86

Taulukko III (jatkoa)

Eläinten _Suojaus-%_ Käsittely luku- Ei Osittain Täysin 5__määrä_yhtään_ III. Vakava tartunta (3000 itiötä/eläin)

Kontrolli 7 100 M 6 (10,84) 7 86 14 10 M 8 (15,84) 4 100

Esimerkki 6

Antigeenien karakterisointi 15 Monoklonaalisilla vasta-aineilla karakterisoidut E. tenella-antigeenit identifioitiin SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesilla (PAGE), jota seurasi nitroselluloo-sa-blottins-menetelmä [Towbin et ai.: Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76, ss. 4 350 - 4 354 (1979)].

20 E. tenella'n itiöitä ja merotsoiitteja hajotetaan ja uutetaan l-%:isella Nonidet P-40:llä (Betsheda Research Laboratory) 10 mM:ssä Tris-puskurissa (pH 7,5), jossa on 155 mM NH4Cl:a, 1,5 mM MgAc2:a proteaasi-inhibiittoreiden, leupeptiinin ja antipainin 30 pg/ml kanssa, 4 mM fenyyli-25 metyyli-sulfonyylifluoridia ja aprotiinia (2 trypsiini- inhiboivaa yksikköä/ml). Hajotusmenetelmään kuuluu inku-bointi 30 minuutin ajan 0 °C:ssa, jota seuraa sentrifugoin-ti 2 000 x g:ssä 30 minuutin ajan. Pelletti heitetään pois ja liuennut materiaali käytetään geelieletroforeesiin.

30 Suoritetaan SDS-polyakryyliamidigeelielektroforee- si näytteille, jotka on pelkistetty 2-merkaptoetanolilla epäjatkuvassa Tris-glysiinisysteemissä käyttäen 7 -15-%:isiä polyakryyliamidigradienttigeelejä.

SDS-PAGE:lla erotetut proteiinit siirretään nitro-35 selluloosasuodattimeen elektroforeettisesti 45 minuutin 1X 84186 ajan. Nitroselluloosasuodatin saatetaan sitten reagoimaan joko askiites-nesteen (laimennettu 1:100) tai hybridoomil-le käytetyn elätusnesteen kanssa 1-18 tunnin ajan 4 °C:ssa. Tavallista kanin seerumia lisättiin 10 %:n konsent-5 raatiossa kaikkiin vasta-aineiden kanssa tapahtuviin inku-baatioihin. Sidottu monoklonaalinen vasta-aine havaitaan saattamalla se reagoimaan 125I-leimatulla kanin anti-hiiri-IgG-vasta-aineella (New England Nuclear). Reaktio toisen vasta-aineen kanssa kestää yleensä 3-5 tuntia huoneen 10 lämpötilassa. Sitoutumaton toinen vapaa vasta-aine poistetaan pesemällä. Nitroselluloosasuodattimet kuvataan Kodak-röntgenfilmillä XAR-5 tai SB-5.

Vaihtoehtoisesti täplät kehitetään ELISA-menetel-mällä käyttäen piparjuuriperoksidaasiin sidottua kanin 15 anti-hiiri-IgG:tä (Miles) ja kloorinaftolia (Aldrich) ja H202:a (Baker) substraatteina. Proteiiniantigeenien mole-kyylipainot määritetään suhteessa molekyylipainostandar-deihin.

Monoklonaalisella vasta-aineella 15,84 karakteri-20 soidut antigeenit ovat kuvaavia. Monoklonaalinen vasta-aine 15,84 reagoi kaksoismuodon kanssa, jonka molekyyli-paino on noin 130 ± 20 kd. Kuitenkin 100 kd:n suuruusluokan proteiinien molekyylipainojen arviointi vaihtelee riippuen käytettävistä molekyylipainostandardeista. 130 ± 25 20 kd-lajien lisäksi 15,84 reagoi myös vyöhykkeen kanssa, jonka näennäinen molekyylipaino on 300 ± 50 kd. Suuremman molekyylipainon omaavaan vyöhykkeeseen kuuluu 15 - 20 % antigeenistä ja se on ehkä joko aggregaatti tai 130 ± 20 kd-lajin polymeerinen muoto.

30 Kontrollikoetta monoklonaalisella vasta-aineella, josta tiedetään, ettei se reagoi proteiiniantigeenien kanssa, käytetään todistamaan antimerotsoiitti-vasta-ai-neiden spesifisyyttä. Lisäksi muut kontrollit osoittavat, että monoklonaaliset vasta-aineet ovat parasiittispesifi-35 siä, eivät reagoi isäntäspesifisen parasiitin kanssa.

12 841 86

Yhteenveto eri vasta-aineilla karakterisoitujen geenien molekyylipainotiedoista on esitetty taulukossa IV. Merkittävä piirre on immunogeenisten antigeenien, joiden molekyylipaino on alueella joko < 20 kd tai > 100 kd, 5 esiintyminen E. tenella'n merotsoiiteissä.

Taulukko IV

Molekyylipainotietojen yhteenveto 10 Anti-merotsoiitti- Antigeenin likimääräinen monoklonaalinen vasta-aine molekyylipaino_ M 1 (1,90) M 2 (4,76) 300 ± 50 kd M 6 (10,84) 15 M 8 (15,84) 130 ± 20 kd M 3 (2,03) M 4 (13,90) 18 ± 3 kd M 5 (10,08) M 7 (8,03) 20 _

Monoklonaalista vasta-ainetta 15,84 pidetään neutraloivana vasta-aineena ja karakterisoitua antigeeniä pidetään suojaavana antigeeninä. Lisäksi 15,84 vasta-aine on 25 risti-reaktiivinen E. tenella'n merotsoiittien ja itiöiden kanssa, samoin kuin itiöiden kanssa, jotka on eristetty E. maxima'sta, E. necatrix'sta, E. acervulina'sta ja E. bru-netti'sta.

Uudet monoklonaaliset vasta-aineet 1,90, 15,84, 30 13,90, 10,84, 8,03 ja 2,03, jotka on eristetty kuten edel lä on esitetty, ovat talletettuina American Culture Type Collection'iin (ATCC) (Rockville, Maryland, USA), ja ne on lisätty sen pysyviin kokoelmiin. Numerolle 1,90 on annettu n:o HB8336; numerolle 15,84 on annettu n:o HB8335; nume-35 rolle 13,90 on annettu n:o HB8337; numerolle 10,84 on an- i3 841 86 nettu n:o HB8387; numerolle 8,03 on annettu n:o HB8388; ja numerolle 2,03 on annettu n:o HB8389. Vasta-aineisiin pääsee tutustumaan patenttihakemuksen ollessa käsittelyn alaisena henkilö, josta päättää patentti- ja tavaramerk-5 kien tarkastaja, ja joka on siihen oikeutettu 37 C.F.R. l,14:n ja 35 U.S.C. 122:n nojalla; ja kaikki rajoitukset HB8335:n, HB8336:n, HB8337:n, HB8387:n, HB8388:n ja HB8389:n saatavuuden suhteen yleisölle tullaan peruuttamattomasti poistamaan, kun patenttihakemukselle on myön-10 netty patentti.

Numerot 1,90, HB8336; 15,87, HB8335; ja 13,90, HB8337 talletettiin ATCCriin 16. elokuuta 1983.

Numerot 10,84, HB8387; 8,03, HB8388; ja 2,03, HB8389 talletettiin ATCCiiin 20. lokakuuta 1983.

Claims (2)

14 84186

1. Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka reagoivat Eimeria spp.-itiöiden tai 5 merotsoiittien antigeenien kanssa, tunnettu siitä, että viljellään klooni-n:o 1,90 (ATCC n:o HB8336) 2,03 (ATCC n:o HB8389), 13,90 (ATCC n:o HB8337), 10,84 (ATCC n:o HB8387), 8,03 (ATCC n:o HB8388) tai 15,84 (ATCC n:o 10 HB8335) sopivassa ravintoalustassa ja vasta-aine otetaan talteen yllä mainitun hybridoomaviljelmän supernatantista; tai että hiireen injektoidaan hybridoomaviljelmä, jolle on annettu klooni-n:o 1,90 (ATCC n:o HB8336), 2,03 (ATCC n:o HB8389), 13,90 (ATCC n:o HB8337), 10,84 (ATCC 15 n: o HB8387), 8,03 (ATCC n:o HB8388) tai 15,84 (ATCC n:o HB8335) ja vasta-aine otetaan talteen hiiren vesivatsasta tai seerumista.

2. Menetelmä antigeenisen, immunogeenisen ja pro-teiinipitoisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on liu- 20 koinen detergenttiä sisältävään puskuriliuokseen, ja joka on Eimeria tenella'n merotsoiittien antigeeninä, ja joka on spesifisesti reaktiivinen hybridoomakloonin 1,90 (ATCC n:o HB8336) erittämien merotsoiittivastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, antigeenin keskimääräisen 25 molekyylipainon ollessa 300 ± 50 kd; on spesifisesti reaktiivinen hybridoomakloonien 10,84 (ATCC n:o HB8387) ja 15,84 (ATCC n:o HB8335) erittämien merotsoiittivastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, antigeenin keskimääräisen molekyylipainon ollessa 130 ± 20 kd; tai on eri-30 tyisen reaktiivinen hybridoomakloonien 8,03 (ATCC n:o HB8388), 2,03 (ATCC n:o HB8389) ja 13,90 (ATCC nro HB8337) erittämien merotsoiittivastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, antigeenin keskimääräisen molekyylipainon ollessa 18 ± 3 kd; tunnettu siitä, että 15 841 86 a) E. tenella'n itiöitä ja/tai merotsoiittejä hajotetaan ja tehdään liukoisiksi uuttamalla ne detergentillä sisältävällä puskurilla tavanomaiseen tapaan; b) liuennut aine erotetaan puhdistetun antigeenin 5 saamiseksi. 16 841 86