NO154584B

NO154584B - Fremgangsmaate for fremstilling av 3-0-(beta-d-glucuronpyransyl) soyaogenol b.

Info

Publication number: NO154584B
Application number: NO790994A
Authority: NO
Inventors: Masanao Shinohara; Yoshimasa Nakano; Hirotsugu Kaise; Taketoshi Izawa; Wasei Miyazaki
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1978-03-31
Filing date: 1979-03-26
Publication date: 1986-07-28
Also published as: FI67559C; ZA791061B; DE2911353A1; AU527201B2; IT1126812B; MX6305E; NO154584C; GB2020290A; FI67559B; NL7902449A; SE434269B; ES478874A1; FI791011A; CA1128498A; DE2911353C2; JPS5822120B2; AU4499579A; ATA236079A; SU1190989A3; AR227624A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktiv 3-0- (£>-D-glucuronpyranosy 1) - soyasapogenol B med formel (I):

eller farmasøytisk tålbare salter derav, og det karakterist-

iske ved oppfinnelsen er som angitt i patentkravet.

Forbindelsen og dens farmasøytiske tålbare salter derav har antikomplementær aktivitet og er anvendelig som terapeutisk middel for autoimmune sykdommer, collagensykdommer og reumatisk sykdommer.

Forskjellige beslektede forbindelser er kjent fra tidligere,

f.eks. glycyrrhizin (Yasuhiro Ariga, Hiroyuki Sumi, Yumiko Takada, og Akikazu Takada, "Abridgements of lecture Programs on Seminar of the Plasmin Research Assiociation", side 65

(1977),; Koretsugu Arimoto, Kaneyuki Mineta, Hiroyuki Sumi,

Yumika Takada og Akikazu Takada, "Proceedings of the 14th

Symposium on Complements", side 79-82 (1977)); og 3-0-(6-0-metyl-[i-D-glukuronpyranosyl)-soyasapogenol B (Isao Kitagawa, Masayuki Yoshikawa og Ichiro Yoshioka, Chem.Parm. Bull, 22,

side 1339 (1974); Ibid., 24, side 121 (1976)), etc. Den førstnevnte forbindelse har en steroidlignende struktur og fremviser en aktivitet tilsvarende aktiviteten av steroider.

Den viser f.eks. en inhiberende aktivitet mot plasmin, uro-kinase, kallikrein, thrombin og komplementer. På den annen side har de fysiologiske virkninger av den sistnevnte forbindelse ennå ikke blitt rapportert. I motsetning hertil har den forbindelse som kan fremstilles ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen og dens farmasøytiske tålbare salter en antikomplementær aktivitet som uventet er overlegen aktiviteten av glycyrrhizin og som også er helt uventet sett på bakgrunn av 3-0-(6-0-mety1- ^b-D-glucoronpyranosy1)-soyasapogenol B som vil fremgå av resultatene av de farmakologiske tester beskrevet senere.

Forbindelsen og dens farmasøytiske tålbare salter kan anvendes for å fjerne eller forhindre patologiske reaksjoner som krever funksjon av et komplement og ved terapeutisk behandling av im-munologiske sykdommer som f.eks. reumatoid arthritis, systemisk lupus erythematosus, glomerulonephritis, autoallergisk hemolytisk anemi, blodplateforstyrrelser, vasculitis, etc. Forbindelsen og dens farmasøytiske tålbare salter kan også anvendes ved terapeutisk behandling av ikke-immunoligiske sykdommer som f .eks. paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, arvelig angioneurotisk ødem og inflammatoriske tilstander indusert ved innvirkning av bakterielle eller lysosomale enzymer på angjeldende komplementkomponenter som f.eks. inflammasjon som følger coronar okklusjon. Forbindelsen og dens farmasøytisk tålbare salter kan også være nyttig ved behandling av trans-plantatavstøtninger og som medium for blodkultur og transport.

I de senere år har det vært forsket intenst på den teoretiske analyse av komplementsystemet og dets innvirkning på mennesker og dyr og det er i dag generelt erkjent at når visse forbindelser har en antikomplementær aktivitet kan de fremvise terapeutiske virkninger på forskjellige symptomer beskrevet ovenfor. F.eks. US patentskrift nr. 4.021.544 lærer følgende: "Betegnelsen "komplement" refererer til en kompleks gruppe av proteiner i kroppsvæskene som ved at de arbeider sammen med antistoffer eller andre faktorer, spiller en viktig rolle som formidlere av immune, allergiske, immunokjemiske og/eller immunopatologiske reaksjoner. De reaksjoner hvori et komplement deltar, foregår i blodserum eller i andre kroppsvæsker og betraktes følgelig å være humorale reaksjoner."

"Med hensyn til menneskeblod er det tilstede mer enn 11 proteiner i komplementsystemet. Disse komplementproteiner betegnes med bokstaven C og med nr.: Cl, C2, C3 osv. opp til C9. tKompiernent-proteinet Cl er i virkeligheten en sammensetning av underenheter betegnet Clq, Clr og Cls. De nummere som er gitt kompiement-proteinene reflekterer den rekkefolge hvori de blir aktive, med unntagelse av komplementprotein C4, som reagerer etter Cl og for C2. De numeriske betegnelser for proteinene i komplementsystemet ble gjort for reaksjonssekvensen var fullt forstått.

En mer detaljert droftelse av komplementsystemet og dets rolle i kroppsprosessene kan f.eks. finnes i Bull. World Health Org. 39, 935-938 (1968), Scientific American, 229, (Nr. 5), 54-66 (1973), Medical Worl News, 11. oktober 1974, sidene 53-58, 64-66,

Harvey Lectures, 66, 75-104 (1972), The New England Journal of Medicine, 287, 489 - 495, 545-549, 592-596, 642-646 (1972),

The John Hopkins Med. J., 128, 57-74 (1971) og Federation Proceeding, 32, 134-137 (1973)."

"Komplementsystemet kan betraktes som bestående av tre sub-systemer: (1) en gjenkjennelsesenhet (Clq) som gjor det mulig for den å kombinere med anti-stoff-molekyler som har oppdaget en fremmed inntrenger; (2) en aktiveringsenhet (Clr, Cls, C2, C4, C3) som preparerer et "sted" på nabomembranen; og, (3) en angrepsenhet (C5, C6, C7, C8 og C9) som skaper et hull i membranen. Membran-angrepsenheten er ikke-spesifikk; den odelegger inntrengere bare på grunn av at den er utviklet i deres naboskap. For å nedsette skaden på vertens egne celler til et minimum må dens aktivitet være tidsbegrenset. Denne begrensning oppnås delvis ved den spontane nedbrytning av

aktivert komplement og delvis ved interferens med inhibitorer og destruktive enzymer. Styringen av komplement er imidlertid ikke perfekt og det forekommer at skader gjores på vertens celler. Immunitet er derfor et dobbeltegget sverd."

"Aktivering av komplementsystemet aksellererer også blodlevring. Denne virkning skyldes en komplement-formidlet frigivelse av en levringsfaktor fra blodplatene. Det biologiske aktive komplemenfe-fragment og kompleksene kan bli involvert i reaksjoner som skader vertens celler og disse patogene reaksjoner kan resultere i utvikling av immun-komplekse sykdommer. F.eks. ved noen former av nephritis skader komplementet basalmembranen i nyren og resulterer i unnslipping av protein fra blodet inn i urinen. Sykdommen utspredt lupus erythematosus horer til denne kategori og dens symptomer omfatter nephritis, viscerale lesjoner og huderupsjoner. Behandling av difteri eller tetanus med injeksjon av store mengder antitoksin resulterer enkelte canger i serumsyke, en immun-kompieks sykdom. Reumatoid arthritis involverer også immun-komplekser. Tilsvarende utspredt "tupus erythematosus er dette en autoimmun sykdom hvor sykdoms - symptomene bevirkes av patologiske virkninger på immunsystemet i vertens vev. Oppsummert har komplementsystemet blitt vist å være involvert med inflammasjon, koagulering, fibrinolyse, antistoff-antigenreaksjoner og andre stoffskifteprosesser."

"I nærvær av antistoff-antigenkomplekser er komplementproteinene involvert i en rekke reaksjoner som kan fore til irreversibel membranskade hvis de foregår i nærheten av biologiske membraner. Mens således komplementet utgjor en del av kroppens forsvars-mekanisme mot infeksjon resulterer det også i inflammasjon og vevskade ved den immunopatologiske prosess. Naturen av enkelte av komplementproteinene, forslag vedrorende måten som komplementet binder seg til biologiske membraner og måten hvorpå komplementet påvirker membranskade er droftet i, Annual Review in Biochemistry, _J8i__3^_(_]Ji69Lj: "Det har vært tilkjennegitt at de kjente komplementinhibitorer, epsilon-arainocapronsyre, natrium-suramin og traneksamsyre, har vært anvendt med hell ved behandling av arvelig angioneurotisk ødem en sykdomstilstand som skriver seg fra en arvelig dårlig eller manglende funksjon av serum-inhibitor av den aktiverte

forste komponent i komplementet (Cl inhibitor), The New England Journal of Medicine, 286, 808-812 (1972); Allergol: Et. Immuni-path; II, 163-168 (1974); J. Allergy Clin. Immunol, 53, nr. 5, 298-302 (1974); og Annals of Internal Medicine, 84, 580-593

(1976);

3-0- ((3-D-glucuron pyranosyl )-soyasapogenol B oppnådd ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen viser kraftig antikomplementær virkning. Forbindelsen er derfor forventet å inhibere for sterk aktivering av komplement ved slike sykdommer som betegnes "Immun komplekse sykdommer" eller "Autoimmune sykdommer", f.eks. nephritis, reumatiske sykdommer, systemisk lupus erythematosus, etc. og å være effektiv for profylakse og terapi av slike sykdommer.

Forbindelsen kan fremstilles på følgende måter.

Forbindelsen representert med formeld) kan isoleres og renses med letthet ved å underkaste kjent saponinholdig plantemater-ial som f.eks. soyabønner som inneholder forbindelser med en 3-0-(P-D-glucuronpyranosy1)-soyasapogenol-del som en delstruk-tur for kjemiske behandlinger eventuelt sammen med fysikalske behandlinger. Forbindelsen med formel (I) kan således fremstilles ved først og separere soyasaponin B fra soyabønner og deretter behandle denne forbindelse i samsvar med reaksjons-skjema 1 beskrevet i det følgende.

Separeringen av soyasaponin B kan gjennomføres ved anvendelse av kjente separasjonsprosesser og innretninger. Eksempler på egnede kjemiske behandlinger omfatter hydrolyse, alkoholyse, foretring, acylering, etc. og eksempler på passende fysikalske —behandlinger omfatter løsningsmiddelekstråksjon, løsningsmid-delfortynning, væskekromatografering, gasskromatografering, omkrystallisering, etc.

Mer spesifikt kan forbindelsen representert ved formel (I) fremstilles ved å underkaste soyasaponing B oppnådd i samsvar med prosessen til Kitagawa et al (Isao Kitagawa, Masayuki Yoshikawa og Ichiro Yoshioka, Chem. Pharm. Bull, 22, side 1339

(1974), Ibid., 24, side 121 (1976)) for alkoholyse med en

lavere alkohol som f.eks. metanol, etanol, propanol, isopropa-nol, butanol, pentanol, heksanol, etc. i nærvær av en syre til å danne 3-0-( 6-0-alkyl- JJ -D-glucuronpyranosyl)-soyasapogenol B og deretter å hydrolysere denne (Reaksjonsskjerna 1). Betegnelsen "soyasaponin B" som anvendt héri refererer til en blanding av soyasaponiner 1,^11 og III som inneholder soyasapogenol B som et aglycon som beskrevet i de ovennevnte litteratur-henvisninger .

I den etterfølgende formel (III) representerer R en lavere alkylgruppe med 1 til 6 karbonatomer.

Forskjellige syrer som konvensjonelt anvendes ved alkoholyse kan anvendes ved alkoholysen av soyasaponin B. Passende eksempler på slike syrer omfatter hydrogenhalogenider som f.eks. hydrogenklorid, hydrogenbr omid, etc, sterke organiske syrer som trikloreddiksyre, trifluoreddiksyre, etc., lewis-syrer som f.eks. aluminiumklorid, bortrifluorid, titantetraklorid,

titantetrabromid, etc.

Alkoholysen kan foretrukket gjennomføres ved romtemperatur til 150°C og mer foretrukket fra 50 til 100°C, i en periode på

1 til 6 timer.

Fremgangsmåten for å isolere forbindelsen med formel (III) fra reaksjonsblandingen er ikke spesielt begrenset, og forskjellige kjente metoder som anvender de fysikals kjemiske egen-skaper av de fremstilte substanser inklusive de metoder som

anvendes ved å separere soyasaponin B kan anvendes. Passende eksempler på" slike metoder omfatter en metode som utnytter forskjellen i oppløselighet mellom produktene og forurensning-ene, en metode som utnytter forskjellen i adsorbsjonsevne og

affinitet for vanlige adsorbsjonsmidler som f.eks. aktivert karbon, XAD-2, silikagel, ionevekslerharpikser, "Sephadex", etc., en metode som utnytter forskjellen i fordelingskoeffisi-enten mellom to væskefaser, og en kombinasjon av disse metoder, F.eks. blandes alkoholysatet med vann til danne bunn-fall som utsettes for silikagel-kromatografering og elueres trinnvis med et elueringsmiddel, f.eks. en blanding av kloroform og etanol for å isolere forbindelsen med formel (I).

Hydrolysen av forbindelsen representert med formel (III) kan venligvis gjennomføres i et inert løsningsmiddel i nærvær av en katalysator under betingelser som anvendes konvensjonelt ved hydrolyse av estere. Konvensjonelle katalysatorer kan anvendes ved denne reaksjon. Passende eksempler på katalysatorer som kan anvendes omfatter mineralsyrer som f.eks. saltsyre, svovelsyre, salpetersyre, etc, uorganiske basiske forbindelser som f.eks. natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, natrium-karbonat, natriumhydrogenkarbonat, kaliumkarbonat, kalium-hydrogenkarbonat, etc. Uorganiske basiske forbindelser fore-trekkes som katalysator.

Hvilke som helst konvensjonelle inerte løsningsmidler kan anvendes ved den ovennevnte reaksjon. Passende eksempler på inerte løsningsmidler omfatter vann, lavere alkoholer som metanol, etanol, propanol, etc, etere som f.eks. dioksan, tetra-hydrofuran, etc., dimetylsulf oksyd , dimetylf ormamid , etc, eller en blanding derav. Hydrolysereaksjonen kan foretrukket gjennomføres ved romtemperatur til omtrent 150°C, mer foretrukket 50 til 110°C, i et tidsrom av 1 til 6 timer.

Forbindelsen med formel (I) kan isoleres fra produkter ved delvis hydrolyse av soyasaponin B, hvor hydrolysen gjennom-føres i vann eller en blanding av vann og en eller flere av de ovenfor beskrevne løsningsmidler i nærvær av hydrogenhalogenider som f . eks . hydrogenklor id, hydrogenbromid, etc, sterke uorganiske syrer som svovelsyre, salpetersyre, etc, eller sterke organiske syrer som trikloreddiksyre, trifluoreddiksyre, etc. Betegnelsen "delvis hydrolyse" anvendt heri betyr hydrolyse hvor ingen spalting av aglyconet i utgangs-saponin B-materialet foregår.

Isoleringen av forbindelsen fra det delvise hydrolysatet kan gjennomføres ved å anvende de ovenfor beskrevne metoder for isolering, f.eks. etter ekstraksjon med n-butanol for å fjerne vannløselige komponenter, underkaste det delvise hydrolysatet for en silikagel-kolonnekromatografering for å separere hydrolysatet i de respektive komponenter og den fraksjon som til-svarer 3-0-(p-D-glucuronpyranosyl)-soyasapogenol B under-kastes krystallisering fra et passende løsningsmiddel, f.eks. en blanding av kloroform og aceton (1:1 volumdeler). Den delvise hydrolysen kan vanligvis gjennomføres ved romtemperatur til 150°C, foretrukket 50 til 110°C, i et tidsrom av 1 til 6 timer.

Den ønskede forbindelsen kan etter at den er isolert danne salter med forskjellige farmasøytisk tålbare basiske forbindelser .

Eksempler på egnede basiske forbindelser som kan anvendes for å danne de ovennevnte salter omfatter uorganiske basiske forbindelser, f.eks. natriumhydroksyd, kaliumkarbonat, natriumhydrogenkarbonat, etc., og organiske basiske forbindelser, f.eks. piperazin, morfolin, piperidin, etylamin, dimetylamin, trietylamin, etc.

Forbindelsene kan anvendes som et middel for behandling av nephritis og når de anvendes for dette formål sammensettes de i farmasøytiske preparater sammen med vanlige farmasøytiske tålbare bærere. Passende bærere som kan anvendes er f.eks. fortynningsmidler eller strekkmidler som f.eks. fyllstoffer, strekkmidler, bindemidler, fuktemidler, desintegrasjonsmidler, overflateaktive midler og smøremidler som vanlig anvendes for fremstilling av slike preparater avhengig av den ønskede doseringsform.

Forskjellige doseringsformer av de terapeutiske midler som et middel for behandling av nephritis kan velges alt etter tera-piformålet, og typiske doseringsformer som kan anvendes er tabletter, piller, pulvere, flytende preparater, suspensjoner, emulsjoner, granuler, kapsler, suppositorier, og injiserbare preparater (oppløsninger, emulsjoner, suspensjoner etc).

Ved tildannelse av et farmasøytisk preparat inneholdende den nevnte forbindelse som en aktiv bestanddel til tablettform kan en lang rekke kjente bærere anvendes og eksempler på passende bærere omfatter tilsetningsmidler som f.eks. laktose, melis, natriumklorid, glukose, urea, .-stivelse, kalsiumkarbonat, kaolin, krystallinsk cellulose og silisiumdioksyd. Binde-~"midler som vann, etanol, propanol, enkel sirup, glukose, stivelsesløsning, gelatinløsning, karboksymetylcellulose, shellakk, metylcellulose, kaliumfosfat og polyvinyl-pyrrolidon kan anvendes og likeledes desintegrasjonsmidler som f.eks. tørket stivelse, natriumalginat, agarpulver, laminariapulver, natriumhydrogenkarbonat, kalsiumkarbonat, "Tween", natrium-laurylsulfat, stearinsyremonoglyserid, stivelse og laktose, og videre desintegrasjonsinhibitorer som f.eks. melis, stearin-syre-glycerylester, kakaosmør og hydrogenerte oljer. Absorb-sjons-promotorer som f.eks. kvaternære ammoniumbaser og natri-umlaurylsulfat kan anvendes, og fuktemidler som glyserol og stivelse, adsorbsjonsmidler som stivelse, laktose, kaolin, bentonit og kolloidal kiselsyre, og smøremidler som f.eks. renset talkum, stearinsyresalter, borsyrepulver, makrogol og fast polyetylenglykol.

Ved tildannelse av det farmasøytiske preparat til pilleform kan en lang rekke konvensjonelle bærere anvendes og eksempler på passende bærere er tilsetningsmidler som f.eks. glukose, laktose, stivelse, kakaosmør, herdede vegetabilske oljer, kaolin og talkum, bindemidler som f.eks. gummiarabikumpulver, tragantpulver, gelatin og etanol, og desintegrasjonsmidler som f.eks. laminaria og agar. Om ønsket kan tablettene over-trekkes og det kan fremstilles sukkerovertrukne tabletter, gelantinovertrukne tabletter, filmovertrukne tabletter, eller

tabletter overtrukket met to eller flere lag.

Ved tildannelse av det farmasøytiske preparat til supposi-torieform kan en lang rekke bærere anvendes og eksempler på passende bærere omfatter polyetylenglykol, kakaosmør, høyere alkoholer, estere av høyere alkoholer, gelatin, og halvsyntet-iske glyserider.

Når det farmasøytiske preparat sammensettes til et injiserbart preparat blir den resulterende oppløsning og suspensjon foretrukket sterilisert, og er isotonisk i forhold til blodet.

Ved sammensetning av det farmasoytiske preparat i form av en opplosning eller suspensjon kan alle vanlige fortynningsmidler anvendes og eksempler på passende fortynningsmidler er vann, etylalkohol, propylenglykol, etoksylert isostearylalkohol, polyoksyetylensorbitol og sorbitanestere. Natriumklorid,

glukose eller glyserol kan innlemmes i et terapeutisk middel, f.eks. et middel for behandling av nephritis i en mengde tilstrekkelig til å fremstille isotoniske losninger. Det terapeutiske middel kan ytterligere inneholde vanlige opplosnings-hjelpestoffer, buffere, smertestillende midler, og konserverings-midler, og eventuelt farvestoffer, parfymer, aromastoffer, sotningsmidler samt andre medikamenter.

Mengden av den aktive forbindelse som skal innlemmes i et farmasoytisk preparat nyttig som et middel for behandling av nephritis er ikke spesielt begrenset og kan variere innen vide grenser. En passende terapeutisk effektiv mengde av angjeldende forbindelse er vanligvis 1 til 70 vekt%, foretrukket 5 til 50vekt%, basert på hele preparatet.

Der er ingen spesiell begrensning med hensyn til anvendelses-måten for det terapeutiske middel som et antikomplementært middel som f.eks. et middel for behandling av nephritis, og det terapeutiske middel kan tilfores på passende måter for de spesielle former av det terapeutiske middel. F.eks. tilfores tablettene, pillene, flytende preparater, suspensjoner, emulsjoner, granuler og kapsler oralt. De injiserbare preparater tilfores intravenost enten alene eller sammen med vanlige tilsetningsmidler som f.eks. glukose og aminosyrer. Videre kan etter behov det terapeutiske middel tilfores intra-muskulært, intra-kutant, subkutant eller intraperitonealt. Suppositorieformene tilfores intrarektalt.

Doseringen av midlet for behandling av nephritis velges passende alt etter bruksformålet, symptomene, etc. og en passende dose av forbindelsen er omtrent 0,5 til 20 mg/kg kroppsvekt pr. dogn.

Forbindelsen har antikomplementære virkninger og er nyttig

også som terapeutisk middel for autoimmune sykdommer, kollagen sykdommer, og reumatiske sykdommer.

Resultatene av testene på farmakologiske virkninger av forbindelsen er vist i det følgende.

FARMAKOLOGISK TESTING

1. Forbindelser som testes

A. 3-0-(Ji-D-glukuronpyranosyl)-soyasapogenol B (oppfinnelsen).

B. Glycyrrhizin (Sammenlikning)

2. Antikomplementær aktivitet

Den antikomplementære aktivitet av testforbindelsene ovenfor ble målt og bekreftet ved hjelp av testemetoden beskrevet i Meneki Kagaku (Immuno-Chemistry), Yuichi Yamamura et al, ut-gitt av Asakura Shoten, Tokyo, Japan (1973) sidene 830-834. Spesifikt ble et prøverør tilført 0,5 ml av en vandig desper-sjon av hver av testforbindelsene, 0,5 ml sensitiverte erytrocytter (EA) inneholdende 1 x 10 Q celler/ml, 1 ml av 5-ganger fortynnet oppløsning av en veronal bufferløsning inneholdende isotonisk gelatin (denne 5-ganger fortynnede oppløsning betegnes GVB<++> for korthets skyld), og 0,5 ml komplementserum (marsvinkomplement) fortynnet 150 ganger med GVB<++>. Blandingen ble holdt ved 37°C i 60 min. Deretter ble 5 ml av en iskold fysiologisk saltløsning tilsatt dertil og blandingen ble sentrifugert. Absorbsjon av separert overliggende løsning ble målt ved OD.,-, °^ ^en utstrekning som testf orbindelsene inhiberte hemolysen av de sensitiverte erytrocytter ble bestemt. 50% inhiberende aktivitetsverdi overfor hemolyse ("f/ml) målt ved hjelp av den ovennevnte metode er vist i tabell 1 i det følgende for hver testforbindelse.

3. Akutt giftighet

Akutt giftighet (LD^^mg/kg) av testforbindelsene ble bestemt med mus ved intraperitoneal tilførsel i tilfellet med forbindelse A og intravenøs tilførsel i tilfellet med forbindelse B.

De oppnådde resultater er vist i den etterfølgende tabell 1.

Det er fra resultatene vist i tabell 1 klart, at den akutte giftighetsverdi (LD^q) for forbindelsen fremstilt i henhold til oppfinnelsen er av en storrelsesorden som gjor det mulig å anvende forbindelsen som et terapeutisk middel.

4. Terapeutisk virkning på nephrotoxin- type nephritis

Rottenephrotoxin ("NT" for korthets skyld) ble oppnådd som beskrevet i det følgende.

Rottenyre-cortex ble homogenisert med en like stor mengde fysiologisk saltlake. Den homogeniserte blanding ble blandet med Freud1s komplette tilsetningsmiddel (et produkt fra Difco Company) i volumforholdet 1:1. 2 ml av den resulterende blanding ble intramuskulært injisert i en kanin (kroppsvekt 3.100 g) for immunisering av kaninen. Halvannen måned senere ble blod tatt fra hjertet av kaninen og serum oppnådd. Det resulterende serum ble inaktivert ved 56°C i 30 min., deretter utsaltet med en 40% mettet vandig løsning av ammonium-sulfat og fraksjonert. Y-globulinfraksjonen (IgG) ble samlet for oppnåelse av NT.

Den terapuetiske evaluering ble gjennomført under anvendelse av Wistar-hanrotter med en kroppsvekt på 150 - 160 g med tre grupper for hver testforbindelse. Testforbindelsen ble intraperitonealt tilført en gang hver 24. timer i 7 døgn. En time etter tilførselen av testforbindelsen den 3. dag ble NT til-ført. NT ble intravenøst injisert i en mengde på 1 ml ved en halevenei hver rotte. Fysiologisk saltløsning ble anvendt som kontroll.

Proteinuria-nivået (total mengde protein utskilt i urinen i løpet av en 24 timers periode) ble målt under anvendelse av turbidometri med bovin-serumalbumin som en kontroll ved hjelp av sulfosalisylsyre.

De oppnådde resultater er vist i den etterfølgende tabell 2.

Dag nr. angitt ovenfor telles fra tidspunktet for tilførsel av testforbindelsen som var 1 time før tilførsel av NT.

Proteinuria-nivået i en frisk rotte er 0,5 til 5 mg/døgn. Når proteinuria-nivået overstiger dette område, spesielt når proteinuria-nivået er mer enn 10 mg/døgn, kan det sikkert sies at nephritis er inntruffet. Som det kan sees fra resultatene i tabell 2 forekom nephritis i kontrollgruppen, og i tilfellet med forbindelsen fremstillbar i henhold til oppfinnelsen er mengden av proteinuria fra tidspunktet for tilførsel av NT til 10 døgn etter tilførsel hovedsakelig det samme som for en frisk rotte. Tilførsel av forbindelsen som kan fremstilles i henhold til oppfinnelsen kan således sees og inhibere primære og sekundære immunreaksjoner.

5. Terapeutiske virkninger på Heymann- type nephritis

Wistar-hannrotter med en kroppsvekt på 180-200 g ble anvendt ved denne test. Rotte-nyrecortex ble ekstrahert og homogenisert med en like stor volummengde av en fysiologisk saltløs-ning. Homogenatet ble sentrifugert ved 1500 gil time.

Den overliggende væske ble renset i samsvar med metoden til T.S. Edgington et al, Journal of Experimental Medicine, 127, 555 (1968) og blandet med Freud<1>s fullstendige tilsetningsmiddel 37 Ra (et produkt fra Difco Company) i volumforhold 0,4:1. Den resulterende blanding ble injisert intraperitonealt i isologe rotter i en mengde på 0,5 ml pr. rotte, og deretter ble den samme mengde av blandingen tilført hver 2 uker inntil proteinuria-nivået oversteg 100 mg/døgn (denne periode var omtrent 6-8 uker).

Hver av testforbindelsene ble tilført intraperitoenalt til rottene som led av Heymann-type nephritis (med en kroppsvekt på 300-350 g) en gang hver dag i 7 døgn, og-deretter ble graden av proteinuria (mg/døgn) målt på samme måte som beskrevet ovenfor. Fysiologisk saltoppløsning ble anvendt som en kontroll. De oppnådde resultater er vist i den etterfølg-ende tabell 3.

To til tre uker etter begynnelsen av testingen økte kropps-vekten av rottene til 400 til 500 g og normale proteinuria-nivåer antas å være 5 til 15 mg/døgn. Som det kan sees fra resultatene i tabell 3 kan forbindelsen fremstilt i henhold til oppfinnelsen helbrede Heymann-type nephritis.

For å illustrere oppfinnelsen mer detljert er fremgangsmåten for fremstilling av angjeldende forbindelser med dne generelle formel (I) og de farmasøytiske tålbare saltene derav beskrevet i de følgende éksemper.

To til tre uker etter begynnelsen av testingen okte kropps-vekten av rottene til 400 til 500 g og normale proteinuria-nivåer antas å være 5 til 15 mg/dogn. Som det kan sees fra resultatene i tabell 3 kan forbindelsen fremstilt i henhold til oppfinnelsen helbrede Heymann-type nephritis.

For å illustrere oppfinnelsen mer detaljert er fremgangsmåten for fremstilling av angjeldende forbindelser med den generelle formel (I) og saltene derav beskrevet i de folgende eksempler.

EKSEMPEL 1

(a) Soyasaponin B (500 mg) ble opplost i 30 ml metanol. Etter tilsetning av 1,5 ml av en 15N svovelsyre ble opplosningen kokt under tilbakelop i 3,5 timer. Koldt vann ble tilsatt til reaksjonsblandingen for å danne utfellinger som ble'samlet og vasket tilstrekkelig med vann. Bunnfallene ble adsorbert på

en silikagelkolonne og fremkalt med en blanding av kloroform-etanol i rekkefolge (volumforhold 20:1 200 ml; volumforhold 10:1 150 ml; volumforhold 5:1 200 ml; og volumforhold 2:1

200 ml) til å gi 71 mg 3-0-(6-0-metyl- P-D-glucuronpyranosy1)-soyasapogenol B.

Den således oppnådde forbindelse ble opplest i 2 ml metanol og

2 ml av en IN vandig NaOH-losning ble tilsatt til opplosningen, etterfulgt av koking under tilbakelop i 2 timer. Etter at reaksjonsblandingen var blandet med koldt vann og pH-verdien innstilt til 1 med en IN vandig HCl-losning ble den ekstrahert med n-butanol. n-butanol-fraksjonen ble konsentrert til torrhet under redusert trykk. Krystallisering av resten fra en blanding av kloroform-aceton (volumforhold 1:1) ga 50 mg 3-0-((3-D-glucoron pyranosyl) -soyasapogenol B.

Smp. : 231 - 232°C (spalting).

Elementæranalyse for C35<H>58°<g:>

Silikagel-tynnskiktkromatografering under anvendelse av "Kiesel Gel F254" ^en ^andelsbetegnelse for et produkt fra Merck Co. ) 1. Kloroform-metanol-vann (volumforhold 65:35:8) Rf= 0,38 2. Isopropanol-2N vandig ammoniakk-losning (volumforhold 100:15) Rf= 0,21 Opploselighet: Meget opploselig metanol, etanol, n-propanol, n-butanol, vandig alkali-losning, pyridin, dimetylsulfoksyd og dimetylformamid, opploselig i aceton, etylacetat og metyletylketon, og dårlig opploselig i benzen, kloroform, dietyleter, n-heksan og petroleter. (b) Soyasaponin B (500 mg) ble opplost i 30 ml etanol mettet med hydrogenklorid og opplosningen ble kokt under tilbakelop i 3 timer. Koldt vann ble tilsatt til reaksjonsblandingen til å gi utfellinger som ble samlet og vasket med vann. Bunnfallene ble så renset ved silikagel-kolonnekromatografering (elueringsmiddel: kloroformetanol (volumforhold 20:1, 10:1, 5:1 og 2:1)) til å gi 75 mg 3-0-(6-0-±yl-(3-D-glucuronpyranosyl )-soyasapogenol B.

Den således oppnådde forbindelse ble blandet med 2 ml etanol og

2 ml av en IN vandig K0H-16sning og blandingen ble kokt under tilbakelop i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble blandet med koldt vann og pH innstilt til omtrent 1 med en IN vandig HCl-lbsning etterfulgt av ekstraksjon med n-butanol.

n-butanol-fraksjonen ble inndampet til torrhet under redusert trykk og krystallisering av resten fra en blanding av kloroform - aceton (volumforhold 1:1) ga 45 mg 3-0-(p-D-glucoronpyranosyl )-soyasapogenol B.

Smp.:231 - 232°C (spalting).

EKSEMPEL 2

Soyasaponin B (lg) ble opplost i 70 ml destillert vann og opplosningen blandet med 5 ml av en 15N vandig svovelsyrelosning etterfulgt av koking under tilbakelop i 2,5 timer. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med n-butanol. n-butanol-fraksjonen ble inndampet til torrhet under redusert trykk. Resten ble adsorbert på en silikagel-kolonne og fremkalt med en blanding av kloroform-etanol (volumforhold 20:1, 10:1, 5:1 og 2:1) til å gi 350 mg 3-0-((3-D-glucuron pyranosyl )-soyasapogenol B.

Smp.: 231 - 232°C (spalting).

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt 3_0-( fi -D-glucuronpyranosyl)-soyasapogenol B med formel (I):

eller farmasøytisk tålbare salter derav, karakterisert ved at man enten a) foretrukket i et inert løsningsmiddel i nærvær av katalysator ved en tempratur på fra romtemperatur til omtrent 150°C, foretrukket 50 til 110°C, hydrolyserer en 3-0-(6-0-alkyl- p-D-glucuronpyranosyl)-soyasapogenol B med formel (III): hvori R_representex©X_en_ alkylgruppe—med—1 til 6— k-a-rbonatomer ,—etler b) at man delvis hydrolyserer soyasaponin B, som består av en blanding av soyasaponin B I, II og III, og som har formlene: i vann eller et vandig oppløsningsmiddel ved temperatur fra romtemperatur til omtrent 150°C, foretrukket 50-110°C, i nærvær av et hydrogenhalogenid, en sterk uorganisk syre eller en sterk organisk syre, og isolerer forbindelsen med formel (I) fra det partielle hydrolysat., idet man, om ønsket, omdanner en erholdt fri syre til salter med farmasøytisk tålbare baser.