NL8620225A

NL8620225A - Therapeutisch geneesmiddel voor leverstoornis.

Info

Publication number: NL8620225A
Application number: NL8620225A
Authority: NL
Original assignee: Tsumura Juntendo Kk
Priority date: 1985-06-07
Filing date: 1986-06-05
Publication date: 1987-05-04
Also published as: DE3690310T1; EP0224596A4; JPH0144167B2; GB2186572A; GB2186572B; JPS61282315A; HU203469B; WO1986007256A1; GB8702245D0; ATA901886A; AT396588B; EP0224596A1; HUT43785A; EP0224596B1; CH668183A5

Description

J 862 0225 * i VO 9018

Titel: Therapeutisch geneesmiddel voor leverstoornis.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een therapeutisch geneesmiddel voor leverstoornis en, meer in het bijzonder op een dergelijk geneesmiddel dat bestaat uit dibenzocyclooctadieen lignans geëxtraheerd uit Schisandrae Fructus.

5 Leverstoornis veroorzaakt door wijdverspreide necrose van lever- cellen is een ziekte die symptomen geeft zoals leveratrofie, progressieve geelzucht, esophago hemorrhage, spijsverteringshemorrhage, etc.

In de stand van de techniek hebben patiënten met leverstoornis in het algemeen alleen hulpbehandelingen ondergaan zoals experimentele hand-10 having en compensatie van leverfunctie. Deze conventionele behandelingen zijn echter niet meer dan een symptomatische behandeling, en tot op heden zijn geen therapeutische geneesmiddelen bekend die effectief zijn voor het genezen van leverstoornis. Bijgevolg is het een reeds lang bestaande wens een geneesmiddel te ontwikkelen dat effectief is voor 15 het genezen van leverstoornis.

Om deze reden is een van de doelen van de onderhavige uitvinding een therapeutisch geneesmiddel te verschaffen voor leverstoornis.

Een ander doel van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een therapeutisch geneesmiddel voor leverstoornis, omvattende 20 dibenzocyclooctadieen lignans geëxtraheerd uit Schisandrae Fructus.

Deze en andere doelen, samen met de voordelen daarvan ten opzichte van de stand van de techniek, zullen duidelijk worden uit de navolgende beschrijving en de conclusies.

Een therapeutisch geneesmiddel voor leverstoornis volgens de 25 onderhavige uitvinding wordt gerepresenteerd door de algemene structurele formule van het formuleblad, waarin zowel als -OCH^ zijn, of R^ samen met R£ -OCI^O- voorstellen, zowel R^ en R^ -OCH^ zijn of R^ samen met R^ -OCE^O" zijn; R,. ^ H is, ... CH^ of 4 OH, onder toepassing van de conventie waarin een gestippelde lijn en binding 30 onder het vlak van het papier voorstelt, en de driehoekjes bindingen boven het vlak voorstellen, terwijl golflijntjes beide voorstellen; en

Rr, R, en R„ *·! H of ... CH., zijn.

b 7 8 J

Pi: (ffh Λν SK? 0 8 tL U 2 2 3 ft £ - 2 -

Beste wijze voor het uitvoeren van de uitvinding Deoxyschizandrine

Korean Gomisi (Schizandra chinensis Baill.) toegepast voor het verkrijgen van een therapeutisch geneesmiddel voor leverstoornis 5 volgens de onderhavige uitvinding is een loofboom die behoort tot de

Magnoliaceae-familie welke op grote schaal voorkomt in Japan, Korea en China. Gedroogde rijpe vruchten van Schizandra Chinensis Baill. vormen een geneesmiddel dat Gomisi genoemd wordt (Schisandrae Fructus) of Kita-Gomisi. De Gomisi of Kita-Gomisi is in de handel verkrijgbaar.

10 Een verbinding waarin , R^ en R^ -OCH^ zijn, R^ Μ H is, R ... CH is, R_ 4 H is en Rn ... CH. is in de algemene formule· van het formuleblad wordt deoxyschizandrine genoemd. Deoxyschizandrine kan verkregen worden onder toepassing van de navolgende werkwijzen.

Schisandrae Fructus wordt geëxtraheerd met een organisch oplos-15 middel, zoals petroleumoether, ether, ethanol, methanol en dergelijke.

Dit extract wordt als zodanig of het concentraat daarvan verkregen door het verwijderen van het organische oplosmiddel door verdamping, onderworpen aan een silicagelkolomchromatografie en geëlueerd met een of meer oplosmiddelen, gekozen uit de groep bestaande uit benzeen, n-hexaan, 20 aceton, ethylacetaat, methanol en ethanol teneinde een eluaat te verkrijgen. Het oplosmiddel wordt verwijderd uit het eluaat waarbij men een ruwe fractie die deoxyschizandrine bevat verkrijgt. De ruwe fractie wordt onderworpen aan een preparatieve dunnelaagchromatografie (PTLC), en ontwikkeld met een of meer oplosmiddelen gekozen uit de groep bestaande 25 uit benzeen,ether, n-hexaan, aceton, ethylacetaat, methanol en ethanol. De zone die deoxyschizandrine bevat, waarvan de aanwezigheid geïdentificeerd kan worden door UV-bestraling, wordt verzameld en geëxtraheerd met een enkel oplosmiddel of een mengsel van oplosmiddelen met hoge polariteit, zoals chloroform, methanol en dergelijke. Het extract 30 levert deoxyschizandrine door verwijdering van de oplosmiddelen. Herhaalde PTLC van deoxyschizandrine verkregen middels de bovenbeschreven procedure geeft zuivere deoxyschizandrine. Zuiver deoxyschizandrine kan verkregen worden door omkristallisatie uit een of meer oplosmiddelen gekozen uit de groep bestaande uit ether, chloroform, n-hexaan, aceton, 35 methanol, ethanol. Een meer gedetailleerde verklaring met betrekking ίϊ Λ Γ) I% ίΓ-'j) if η Ρι f' ί / ƒ i! V L:jj \.f άν;? 'h.·- - 3 - tot de bereiding van deoxyschizandrine wordt gegeven in het navolgende bereidingsvoorbeeld 1. De percentages en verhoudingen hebben betrekking op volurne/volume, tenzij uitdrukkelijk anders aangegeven.

Produktievoorbeeld I

5 De gedroogde poeders (9,34 kg) van Schizandrae chinensis Baill.

werd geëxtraheerd met 24 liter petroleumether onder reflux (36°C, 6 uur). Het extract werd gefilterd teneinde een residu te verwijderen.

Het residu werd verder tweemaal op dezelfde wijze geëxtraheerd. De drie extracten werden gecombineerd en geconcentreerd door het verwijderen 10 van petroleumether onder verminderde druk, waarbij men 1,15 kg gedroogd extract verkreeg.

Het gedroogde extract (1,15 kg) werd onderworpen aan silicagel kolomchromatografie (Kieselgel 60, 70 - 230 mesh Merck), en ontwikkeld met benzeen die toenemende hoeveelheden aceton bevat. De fractie 15 (5 liter) die geëlueerd werd met benzeen-aceton (92:8) werd geconcen treerd door verwijdering van het oplosmiddel waarbij men een ruwe fractie deoxyschizandrine verkreeg (129,8 g).

De hierbovenvermelde ruwe fractie gedroogd extract (25,4 g) werd onderworpen aan PTLC (dunnelaag -plaat: Kieselgel PF^,-^ Merc^)> ont-20 wikkeloplosmiddel:benzeenether (5:1). Na het ontwikkelen werd de zone met RF 0,71 welke een UV 254 nm absorptie vertoonde, geëxtraheerd met chloroform-methanol (4:1). Het extract werd geconcentreerd door verwijdering van het oplosmiddel waarbij men een residu verkreeg. Dit residu werd verder gezuiverd middels PTLC (dunnelaag-plaat:Kieselgel 25 PF254 (Merck;) ' ontwikkeloplosmiddel:hexaan-ethylacetaat (4:1). Na ontwikkelen met de zone met Rf 0,44 welke UV (254 nm) absorptie vertoonde, werd geëxtraheerd met chloroform-methanol (4:1). Het extract werd geconcentreerd door verwijdering van het oplosmiddel onder verkrijging van een residu. Het residu werd omgekristalliseerd uit een 30 mengsel van n-hexaan en ether onder vorming van kleurloae kristallen.

De fysische en chemische eigenschappen van dit kristal waren identiek met die van deoxyschizandrine beschreven in de literatuur (Chem. Pharm. Buil., 27(11)2695-2709 (1979)).

pi ff: ^ A O Q j£ y y L· y L £, %3 k - 4 -

Gomisine N

Een verbinding waarin R, samen met R„ -0CHo0-, R_ en R. -OCH.

^ 1 2 2 3 4 3 zijn, R,- ... CH^ is, Rg 4 H is, R^ ... CH^ is en Rg in de algemene formule van het formuleblad 4 H is, wordt gomisine N genoemd.

5 Gomisine N kan verkregen worden door het extraheren van Schisandrae Fructus met lagere koolwaterstoffen, onder vorming van een extract, verwijdering van oplosmiddelen en vluchtige componenten uit het extract teneinde een residu te leveren, en het onderwerpen van het residu aan chromatografie.

10 Verpoederd Schisandrae Fructus wordt geëxtraheerd in lagere koolwaterstof zoals petroleumether, n-hexaan, benzeen en dergelijke bij een temperatuur van 30°C tot het kookpunt, bij voorkeur onder terug-vloeikoeling. De extracten verkregen door een aantal malen te extraheren worden gecombineerd en geconcentreerd door het verwijderen van de lagere 15 koolwaterstof onder levering van een droog extract. Dit extract wordt gestoomdestilleerd teneinde vluchtige componenten zoals essentiële oliën te verwijderen.

Het residu (essentieel olievrij gedeelte oplosbaar in lagere koolwaterstof) wordt onderworpen aan kolomchromatografie onder toepas-20 sing van een absorbent zoals silicagel, alumina, florisil, polyamide, celiet en dergelijke. De fracties geëlueerd met een organisch oplosmiddel zoals n-hexaan, benzeen, chloroform, aceton, ether, ethylacetaat, ethanol, methanol en dergelijke of mengsels van deze oplosmiddelen, worden geconcentreerd door het verwijderen van oplosmiddelen waarbij 25 men gomisine N verkrijgt.

Gomisine N kan ook verkregen worden door het extraheren uit Schisandrae Fructus met lagere alcohol zoals methanol, ethanol en dergelijke. In dit geval wordt het extract met het lagere alcohol geconcentreerd. Dit extract wordt opgelost in water, geabsorbeerd op het 30 absorbent zoals celiet, cellulosepoeder en dergelijke, en geëlueerd met n-hexaan, petroleumether, benzeen, chloroform, ether en dergelijke.

Het eluent wordt geconcentreerd en onderworpen aan de bovengenoemde chromatografie teneinde gomosine N te leveren. Een meer gedetailleerde uitleg met betrekking tot de bereiding van gomosine N wordt verschaft 35 door het navolgende produktievoorbeeld II.

//,'· 'f$> ü')· V ts ώ u £ & Si - 5 -

Produktievoorbeeld II

Verpoederd Schisandrae Fructus (4,67 kg) werd gemengd in petro-leumether (12 liter, kookpunt: 37-39°C), en geëxtraheerd onder terug-vloeikoeling gedurende 8 uur. Dit extractieproces werd driemaal her-5 haald. Deze drie extracten werden gecombineerd en geconcentreerd door het verwijderen van ether onder verminderde druk waarbij men 546 gextract verkreeg. Dit extract werd gesuspendeerd in 1200 ml water, en de essentiële oliën werden verwijderd door stoomdestillatie gedurende 3 uur waarbij men een residu verkreeg. Het niet gedestilleerde gedeelte 10 werd zes maal geëxtraheerd uit het residu met ether, en de ethirische extracten werden gecombineerd, en geconcentreerd door het verwijderen van ether waarbij men een essentiële olievrij gedeelte (491 g) verkreeg welke oplosbaar is in petroleumether.

De bovenbeschreven essentiële olievrije portie (491 g) werd 15 opgelost in 1 liter n-hexaan, geïnjecteerd in een kolom waarin 5 kg silicagel, gezwollen met n-hexaan eerder gepakt was in een glazen buis met diameter 12 cm en lengte 110 cm, en eerst ontwikkeld met n-hexaan, vervolgens met benzeen en uiteindelijk met benzeen-acetonmengsel. De twee delen die geëlueerd werden respectievelijk met benzeenaceton (47:3) 20 en benzeenaceton (46:4) werden gecombineerd, en geconcentreerd door verwijdering van het oplosmiddel onder gereduceerde druk onder levering van een residu. Het residu werd opgelost in een n-hexaan-ether mengsel bij verhoogde temperatuur, waarna men het op kamertemperatuur liet uitkristalliseren, en na affiltreren verkreeg men kristallen van 25 gomisine N (14 g, 0,3%) .

Schizandrine . Gomisine A

Van de verbindingen die weergegeven worden door de algemene formule van het formuleblad, wordt een verbinding waarin R3 en "0CH3 zijn, R5 ^ H is, R^ ...CH^ is, R^ ◄ H en Rg ___ CH^ is, 30 schizandrine genoemd, terwijl een verbinding waarin R^ samen met R£ -OCH^O- is, R^ en R^ -OCH^ zijn, R,.-41 OH is, R^ ...CH^ is, R^ 4 H is en R» ...CH, is gomisine A genoemd wordt.

o 3

Schizandrine kan verkregen worden onder toepassing van de werkwijze beschreven in de literatuur (N.K. Kochetkov, etc.: Zh. Obshch.Khim.,

1¾ |j 4 L· 4 J

- 6 - volume 31, pag. 3454, 1961). Meer specifiek kan schizandrine verkregen worden door de navolgende werkwijzen.

Een extract verkregen door het extraheren van Schisandrae Fructus met ligroine wordt behandeld met methanol. Nadat het methanoloplosbare 5 deel gehydrolyseerd is met NaOH (IN, 85% methanoloplossing), wordt het neutrale gedeelte onderworpen aan chromatografie met alumina, ontwikkeld met ligroine, benzeen en chloroform, en het eluaat met chloroform levert Schizandrine (0,14%).

Gomisine A kan worden verkregen door de werkwijze beschreven in 10 de literatuur (Taguchi, et al.: Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), volume 23, pag.3296, 1975; Taguchi, et al.: Chem. Pham. Bull. (Tokyo), volume 25, pag. 364, 1977) . Meer in het bijzonder kan gomisine A worden verkregen door de volgende methoden. Het extract van Schisandrae Fructus met hete lagere koolwaterstoffen (zoals petroleumether, n-hexaan, benzeen en 15 dergelijke) wordt geconcentreerd door het verwijderen van het oplosmiddel teneinde een residu te leveren, het residu wordt opgelost in water, en de essentiële oliën worden verwijderd door stoomdestillatie. Het niet-gedestilleerde gedeelte wordt onderworpen aan chromatografie met silicagel, en ontwikkeld met n-hexaan, benzeen of aceton of mengsels 20 daarvan teneinde gomisine A af te scheiden. Deze werkwijze kan ook schizandrine leveren. Een meer gedetailleerde toelichting ten aanzien van de bereiding van schizandrine en gomisine A wordt verschaft met het navolgende produktievoorbeeld III.

Produktievoorbeeld III

25 1,38 kg verpoederd Schisandrae Fructus werd geëxtraheerd met 3 liter petroleumether onder reflux, viermaal (8 uur elk) . De verkregen extracten werden gecombineerd en onder verminderde druk geconcentreerd teneinde het petroleumetherische extract te verkrijgen (188 g). Dit extract werd gesuspendeerd in 450 ml water en gedurende 3 uur gestoom-30 destilleerd teneinde de essentiële oliën te verwijderen. Het niet-gedestilleerde gedeelte werd viermaal geëxtraheerd met ether en de etherische extracten werden gecombineerd en geconcentreerd door het verwijderen van de ether onder levering van 179 g essentieel olievrij gedeelte (fractie A), welke oplosbaar is in petroleumether.

ë <Π> Λ Kf o li £> y & £ 5 » - 7 -

Na extractie met petroleumether van de Schisandrae Fructus werd dit driemaal verder geëxtraheerd met hete methanol (8 uur elk), vervolgens werden de methanolische extracten gecombineerd en geconcentreerd teneinde een gedroogd methanolisch extract te geven (383 g).

5 Het methanolische extract werd opgelost in 580 ml water en driemaal geëxtraheerd met 850 ml ethylacetaat. De drie eluaten met ethylacetaat werden gecombineerd en onder verminderde druk geconcentreerd waarbij men 78 g extract verkreeg. Dit extract werd opgelost in methanol en gemengd met celiet (No. 535, Johns-Manville, 300 g). Het mengsel werd 10 gechromatografeerd, ontwikkeld met 2 liter n-hexaan en het eluaat werd onder verminderde druk geconcentreerd waarbij men 20,8 g extract verkreeg (fractie B) .

Fractie A (179 g) en fractie B (20,8 g) werden gecombineerd, gechromatografeerd met 1200 g silicagel, eerst ontwikkelend met n-hexaan, 15 en vervolgens met benzeen en tenslotte met benzeenacetonoplosmiddel- systemen. Het eluaat met benzeenacetcn (4:1) en het eluaat met benzeen-aceton (3:1) werden gecombineerd en geconcentreerd waarbij men een residu verkreeg. Dit residu werd opnieuw gechromatografeerd op 480 g silicagel, en ontwikkeld met benzeenether oplosmiddelsystemen. Het eluaat 20 met benzeenether (4:1) werd gekristalliseerd uit methanol waarbij men 3,04 g gomisine A verkreeg (0,22%).

Het eluaat verkregen met benzeenaceton (7:3) onder toepassing van de bovenbeschreven chromatografie en het eluaat verkregen met benzeenacetcn (3:2) werden gecombineerd en geconcentreerd waarbij men 8,3 g. 25 residu verkreeg. Dit residu werd opnieuw gechromatografeerd op silicagel (180 g) en ontwikkeld met n-hexaan-aceton oplosmiddelsystemen. Het eluaat met n-hexaan-aceton (22:3) werd gekristalliseerd uit n-hexaan-ether waarbij men 3,5 g schizandrine verkreeg (0,25%).

γ-Schizandrine 30 Van de verbindingen weergegeven door de bovenbeschreven algemene formule wordt een verbinding waarin samen met -OCH^O- is, R^ en R^ -OCH2 zijn, R,. ► H is, Rg .. . CHg is, R^ ► H is en Rg ...CHg is, γ-schizandrine genoemd. De γ-schizandrine kan verkregen worden onder toepassing van de navolgende werkwijze. Schisandrae Fructus, dat wil β 9 fl 9 9 ^ 'i·? Q ;;i> II L· L· φ - 8 - zeggen de gedroogde vruchten van Schizandra chinensis Baill ,, wordt geëxtraheerd met een organisch oplosmiddel, zoals petroleumether,ether, n-hexaan, ethanol, methanol en dergelijke. Het extract wordt als zodanig of het concentraat ervan verkregen door verwijdering van het organisch 5 oplosmiddel of wordt aan kolomchromatografie met silicagel, geëlueerd met een of meer oplosmiddelen gekozen uit de groep bestaande uit petroleumether, n-hexaan, benzeen, aceton, ethylacetaat, methanol en ethanol onder vorming van een eluaat. Het eluaat wordt geconcentreerd door verwijdering van oplosmiddelen waarbij men de ruwe fractie van 10 γ-schizandrine verkrijgt. Deze ruwe fractie wordt omgekristalliseerd uit het mengsel van n-hexaan en ether, en verder herhaaldelijk omgekristalliseerd uit het mengsel van n-hexaan en ether, of methanol, teneinde γ-schizandrine te verkrijgen. Een meer gedetailleerde verklaring met betrekking tot de bereiding van γ-schizandrine wordt verschaft door het 15 navolgende produktievoorbeeld IV.

Produktievoorbeeld IV

9,34 kg gedroogd poeder van Schizandra chinensis Baill. werd geëxtraheerd met 24 liter petroleumether onder terugvloeikoeling (36°C, 6 uur). Na afkoeling werd het extract gefiltreerd waarbij men een 20 residu verkreeg. Het residu werd verder tweemaal opnieuw geëxtraheerd op dezelfde wijze. De drie extracten werden gecombineerd en geconcentreerd door het verwijderen van petroleumether onder verminderde druk, waarbij 1,15 kg gedroogd extract verkreeg.

Dit gedroogde extract (1,15 kg) werd onderworpen aan silicagel 25 kolomchromatografie (Kieselgel 60, 70-230 mesh, Merck, 10 kg), en ge- elueerd met benzeen welke toenemende hoeveelheden aceton bevat. Het eluaat met benzeenaceton (92:8, 5 liter) werd geconcentreerd door het verwijderen van het oplosmiddel waarbij men 129,8 g gedroogd extract verkreeg. Dit gedroogde extract (129,8 g) werd opnieuw gekristalliseerd 30 uit een mengsel van n-hexaan en ether, waarbij men. 15,44 g kleurloze kristallen verkreeg. Deze 15,44 g kleurloze kristallen werden driemaal omgekristalliseerd uit methanol, waarbij men uiteindelijk een kleurloos prismakristal (1,102 g, 0,012%) verkreeg. De fysische en chemische eigenschappen van het kristal waren identiek met die van γ-schizandrine 35 beschreven in de literatuur (Chem.Pharm. Buil., 30(1), 132-139 (1982)).

'M y l y l » - 9 -

Wuweizisu C

Van de verbindingen die gegeven worden door de algemene formule . van het formuleblad wordt een verbinding waarin samen met -QC^O-is, R^ samen met R^ -OCH^O- is, R^ ...CH^ is, R^ ► H is, 5 R-, . ..CH-. is en R„ ► H is, Wuweizisu C genoemd. Wuweizisu C kan ver-

/ J O

kregen worden onder toepassing van de navolgende werkwijzen. Schisandrae Fructus, dat wil zeggen gedroogde vruchten van Schizandra chinensis Baill, wordt geëxtraheerd met een organisch oplosmiddel zoals petroleum-ether, ether, n-hexaan, ethanol, methanol en dergelijke. Het eluaat 10 wordt als zodanig of het concentraat ervan dat verkregen wordt door het verwijderen van het organische oplosmiddel, onderworpen aan silicagel kolomchromatografie, en geëlueerd met een of meer oplosmiddelen gekozen uit de groep bestaande uit petroleumether, n-hexaan, benzeen, aceton, ethylaceton, methanol en ethanol teneinde een eluaat te geven. Het 15 eluaat wordt geconcentreerd door verwijdering van het oplosmiddel waarbij men een ruwe fractie van wuweizisu C verkrijgt. Deze ruwe fractie wordt onderworpen aan silicagel kolomchromatografie, geëlueerd met een of meer oplosmiddelen gekozen uit de groep bestaande uit n-hexaan, petroleumether, benzeen, ether, aceton,ethylacetaat, methanol en 20 ethanol en geconcentreerd door verwijdering van het oplosmiddel waarbij men een uiteindelijke ruwe fractie verkrijgt van wuweizisu C. De uiteindelijke ruwe fractie wordt omgekristalliseerd uit het mengsel van n-hexaan en ether, of methanol waarbij men wuweizisu C verkrijgt. Een meer gedetailleerde uitleg met betrekking tot de bereiding van 25 wuweizisu C wordt gegeven met het navolgende produktievoorbeeld V.

Produktievoorbeeld V

4,67 kg gedroogd poeder van Schizandra chinensis Baill. werd geëxtraheerd met petroleumether onder terugvloeikoeling (36°C, 6 uur). Het extract werd na afkoeling gefiltreerd waarbij men een residu ver-30 kreeg. Het residu werd tweemaal verder geëxtraheerd op dezelfde wijze.

De drie extracten werden gecombineerd en geconcentreerd door het verwijderen van petroleumether onder verminderde druk waarbij men 546 g gedroogd extract verkreeg.

Dit gedroogde extract (546 g) werd onderworpen aan silicagel 35 kolomchromatografie (Kieselgel 60, 70-230 mesh, Merck, 10 kg), en l'i; /?> O, 0¾ ,*% ga* t) - t - 10 - geëlueerd eerst met n-hexaan-benzeen (1:1, 4 liter), vervolgens met n-hexaan-benzeen (9:1, 3 liter), vervolgens benzeen (6,5 liter) en tenslotte met benzeen welke toenemende hoeveelheden aceton bevat. Het eluaat met benzeen (6,5 liter), het eluaat met benzeenaceton (98:2, 5 5 liter), en het eluaat met benzeenaceton (96:4, 5 liter) werden gecom bineerd en geconcentreerd door verwijdering van het oplosmiddel waarbij men 114,0 g gedroogd extract verkreeg. Dit extract werd onderworpen aan silicagelchromatografie (Kieselgel 60, 70-230 mesh, Merck, 2 kg) en geëlueerd met n-hexaan dat toenemende hoeveelheden ethylacetaat bevat.

10 Het eluaat (2 liter) met n-hexaan ethylacetaat (92:8) werd geconcentreerd door het verwijderen van het oplosmiddel waarbij men 6,73 g residu verkreeg. Dit residu werd omgekristalliseerd uit methanol waarbij men 3,346 g kleurloze kristallen verkreeg (0,072%). De fysische en chemische eigenschappen van deze kristallen waren identiek met die van 15 wuweizisu C zoals beschreven in de literatuur (Chem. Pharm. Buil., 30(9) , 3207-3211 (1982)) .

Farmacologische evaluatie

De effectiviteit van deze therapeutische geneesmiddelen voor leverstoornis wordt aan de hand van de navolgende experimenten gedemon-20 streerd.

Experiment 1

Effect op overlevingsverhouding van muizen met acute leverstoornis.

Zeven groepen mannelijke balb/c stam muizen (zes weken oud) werden toegepast. Iedere groep omvatte 40 muizen. Acute leverstoornis 25 werd geïnduceerd door de injectie van 1 ^ig/per muis van LPS (lipopoly-saccharide, Difco Laboratories) aan muizen die geïnjecteerd waren met 1 mg/muis van hitte-gedode P. acnes (propionibacteriumacnes, First Department of Biochemistry in Osaka City Univ. Medical School) zeven dagen eerder. De bovenverkregen verbindingen (deoxyschizandrine, 30 gomisine N, schizandrine, gomisine A, γ-schizandrine en wuweizisu C) welke gesuspendeerd waren in 0,5% CMC (carboxymethylcellulose, Wako Junyaku Kogyo, Co. Ltd.), werd p.o. toegediend aan elke groep acht uur na de injectie met LPS. Aan een overblijvende groep werd alleen de drager (CMC) p.o. toegediend als controlegroep.

II£ ? ê\ 9 9 ^ %? L %f £, c, %l - 11 -

De overlevingsratio van muizen werd periodiek bepaald 24 uur na de inductie van acute leverstoornis. Iedere dosering van de bovenbeschreven verbindingen en overeenkomstige overlevingsratio 24 uur na de injectie met LPS zijn opgenomen in Tabel A.

TABEL A

5 Effect op acute leverstoornis

Verbinding Dosis (mg/kg) Overlevingsratio (%)

Controle --- 7,5

Deoxyschizandrine 50 55

Gomisine N 20 80 10 Schizandrine 50 50

Gomisine A 10 80 γ-Schizandrine 50 60

Wuweizisu C 20 70

Experiment 2 15 Effect op serum GOT (glutamineoxaloazijnzuurtransaminase) van muizen met acute leverstoornis.

Drie groepen mannelijke Wistar ratten werden toegepast. Iedere groep omvatte 45 ratten. Iedere rat in alle groepen werd geïnjecteerd met 10 mg/per rat van P.acnes. Vier dagen later werd gomisine A 20 (100 mg/kg, 50 mg/kg) verkregen in produktievoorbeeld III gesuspendeerd in 2% Tween 80/zout en i.p. toegediend aan respectievelijk twee van de drie groepen. Aan de overblijvende groep werd alleen drager (2% Tween 80/ zout) i.p. toegediend als controlegroep. Alle ratten werden geïnjecteerd met 50 ^ig/rat aan LPS, zeven dagen na de injectie met P. acnes.

25 Vierentwintig uur na de injectie met LPS werden bloedmonsters verzameld van de overlevende ratten door een hartpunctie en serum GOT activiteiten werden gemeten. GOT is een van de aminozuurtransferases die aanwezig zijn in levercellen. Hoge serum GOT-activiteiten reflecteren een groot aantal vernielde levercellen.

8820225 - 12 -

Het resultaat was dat terwijl de overlevingsratio van de controlegroep 8,8% was, de overlevingsratio van de twee groepen waaraan gomisine A toegediend was (100 mg/kg, 50 mg/kg) respectievelijk 100% en 83,3% waren.

5 Terwijl gemiddelde serum GOT-activiteiten van de overlevende ratten in de controlegroep 7000 IU was, was de gemiddelde serum GOT-activiteit van gomisine A (100 mg/kg) gereduceerd tot 140 IU.

Deze resultaten geven een duidelijk beeld van de effectiviteit van deze therapeutische geneesmiddelen voor leverstoornis.

10 LD50 Van verkihdingen verkregen in de produktievoorbeelden I - V in ddY/muis zijn opgenomen in Tabel B. En geschatte clinische dagelijkse dosering van de onderhavige therapeutische geneesmiddelen voor patiënten met leverstoornis is ook opgenomen,in tabel B.

TABEL B

LD van de onderhavige verbindingen p.o. toegediend in muizen en 50 15 de geschatte clinische dosering in patiënten.

Verbinding LD Clinische dagelijkse dosis p.o. (mg/kg) i .v.

Deoxyschizandrine 2000 45 - 100 7,5 - 10

Gomisine N 2000 30-60 3-6 20 Schizandrine 1448 45 - 100 15 - 30

Gomisine A 777 15-30 5-10 γ-Schizandrine 2000 45 - 100 2,5 - 5

Wuweizisu C 2000 30-60 2,5-5

Hoewel slechts zeven voorbeelden van dibenzocyclooctadieenlignans 25 weergegeven door de algemene formule van het formuleblad uitgelegd zijn met voorbeelden wordt aangenomen dat alle verbindingen die onder de algemene formule beschreven in de conclusies omvat zijn, vergelijkbare effecten hebben, mits aan de condities ten aanzien van de substituenten voldaan is.

@ £ £ fj O 9 i£ !l il)) £ y £ il

Preparaten - 13 -

Medicamenten in een groot aantal vormen zoals vloeistof, poeder, gegranuleerd poeder, pillen, tabletten, beklede tabletten en capsules kunnen geproduceerd worden op conventionele wijze onder toepassing van 5 de geneesmiddelverbinding volgens de onderhavige uitvinding samen met geschikte oplosmiddelen, dragers, toevoegingen en dergelijke. De bovenbeschreven medicamenten kunnen gecompendeerd worden met andere medisch aktieve ingrediënten ingeval van recepten. Voor orale toediening kunnen medicamenten in de vorm van vloeistof, poeder, gegranuleerd poeder, 10 pillen, tabletten, beklede tabletten en capsules zoals beschreven worden door toepassing van tenminste één drager, zoals zetmeel, lactose, sucrose, mannitol en carboxymethylcellulose.

De bovenbeschreven medicamenten kunnen ook geproduceerd worden onder toepassing van heldermakende stoffen zoals magnesiumstearaat, 15 natriumlaurinezuur, en talk; bindmiddelen zoals dextrine, kristallijn-cellulose, polyvinylpyrrolidon, arabische gom, maïszetmeel en gelatine; evenals barstmiddelen zoals aardappelzetmeel en carboxymethylcellulose. De geneesmiddelverbindingen volgens de onderhavige uitvinding kunnen toe-gedien worden als suspensie, emulsie, siroop en elixer, welke een of 20 meer smaak- en geurcorrigerende middelen, evenals kleurstoffen kan bevatten .

In het geval van produktie van medicamenten voor injecties kunnen verdunners zoals gedestilleerd water voor injecties, fysiologische zoutoplossingen, dextroseoplossingen, en plantaardige olie voor 25 injecties, propyleenglycol en polyethyleenglycol toegepast worden.

Verder kunnen isotone middelen, stabiliseermiddelen, antiseptische middelen en pijnstillers toegevoegd worden' indien noodzakelijk of gewenst. Het heeft de voorkeur medicamenten voor injecties op te lossen in een gesteriliseerd injectiemedium.

30 Meer gedetailleerde verklaringen ten aanzien van de bereiding van medicamenten onder toepassing van de verbindingen volgens de onderhavige uitvinding worden geleverd door de navolgende preparaat-voorbeelden, welke niet bedoeld zijn als beperking van de onderhavige uitvinding.

8 6 9 0 9 9 B

ty» 'kJ

- 14 -

Preparaatvoorbeeld I

0,5 g deoxyschizandrine verkregen onder toepassing produktie-voorbeeld I werd fijnverdeeld en gemengd met 90,5 g lactose en 9 g mag-nesiumstearaat. Het mengsel werd getabletteerd op een tabletteermachine, 5 teneinde tabletten te verkrijgen met een diameter van 20 mm en een gewicht van 2,3 g. De tabletten werden verpoederd door een oscillator, gegradeerd en gezeefd teneinde gegranuleerd poedermedicijn te verkrijgen (20-50 mesh).

Het gegranuleerde poedermedicament (1 g) bevat 5 mg deoxyschi-10 zandrine. Drie doses dienen dagelijks toegediend te worden, waarbij elke dosis 3-6 g van het bovenbeschreven medicament bevat in overeenstemming met de conditie.

Preparaatvoorbeeld II

1 g gomisine N verkregen onder toepassing van produktievoor-15 beeld II werd fijnverpoederd en gemengd met 90 g lactose en 9 g magne-siumstearaat. Het mengsel werd getabletteerd op een tabletteermachine teneinde tabletten met een diameter van 20 mm en een gewicht van 2,3 g te verkrijgen. De tabletten werden verpoederd door een oscillator, gegradeerd en gezeefd teneinde een gegranuleerd poedermedicament 20 (20-50 mesh) te verkrijgen.

Dit gegranuleerdè poedermedicament (1 g) bevat 10 mg gomisine N. Drie doses dienen dagelijks toegediend te worden (elke dosis bevat 1-2 g van het bovenbeschreven medicament in overeenstemming met de conditie).

25 Preparaatvoorbeeld III

0,5 g gomisine A verkregen onder toepassing van produktievoor-beeld III werd fijnverpoederd en gemengd met 90,5 g lactose en 9 g magnesiumstearaat. Het mengsel werd getabletteerd op een tabletteermachine waarbij men tabletten met een diameter van 20 mm en een gewicht 30 van 2,3 g verkreeg. De tabletten werden verpoederd door een oscillator, gegradeerd en gezeefd waarbij men gegranuleerd poedermedicijn verkreeg. (20-50 mesh).

Dit gegranuleerd*poedermedicijn (1 g) bevat 5 mg gomisine A.

Ki) t'f ƒ' c*’ • ··' V M./ tivij iV.,; ©·.;·· - 15 - met 1 - 2 g van het bovenbeschreven medicijn in overeenstemming met de conditie 1 ·

Preparaatvoorbeeld IV

2.5 g schizandrine verkregen onder toepassing van produktievoor-5 beeld III werd gemengd met 90 g microkristallijne cellulose en 7,5 g magnesiumstearaat. Het mengsel werd getabletteerd op een tabletteer-machine waarbij men tabletten verkreeg, (diameter 9 mm; gewicht 200 mg).

Dit tablet bevat 5 mg schizandrine. Drie doseringen (3 - 6 tabletten elk) dienen dagelijks toegediend te worden.

10 Preparaatvoorbeeld V

2.5 g γ-schizandrine verkregen onder toepassing van produktie-voorbeeld IV werd gemengd met 90 g microkristallijne cellulose en 7,5 g magnesiumstearaat. Het mengsel werd getabletteerd op een enkele stempel-machine waarbij men tabletten verkreeg met een diameter van 9 mm en een 15 gewicht van 200 mg.

Dit tablet bevat 5 mg γ-schizandrine. Drie doseringen (3-6 tabletten elk) dienen per dag toegediend te worden.

Preparaatvoorbeeld VI

Wuweizisu C (2,5 g) verkregen onder toepassing van produktievoor-20 beeld V werd gemengd met 90 g microkristallijne cellulose en 7,5 g magnesiumstearaat. Het mengsel werd getabletteerd op een enkele sterapelma-chine waarbij men tabletten verkreeg met een diameter van 9 mm en een gewicht van 200 mg.

Dit tablet bevat 5 mg wuweisizu C. Drie doses (3-6 tabletten 25 elk) dienen per dag toegediend te worden.

Preparaatvoorbeeld VII

10 g gomisine N verkregen onder toepassing van produktievoorbeeld II werd fijnverpoederd en gemengd met 90 g lactose. Elke 100 g van het mengsel werd verpakt in een harde capsule waarbij men een 30 capsulemedicament verkreeg.

Deze capsule bevat 5 mg gomisine N. Drie doseringen (1-2 capsules elk) dienen dagelijks toegediend te worden.

f| 1¾ 9 9 9 E

Preparaatvoorbeeld VIII

- 16 -

Schizandrine 5 g, verkregen onder toepassing van produktievoor-beeld III werd fijnverpoederd en gemengd met 95 g lactose. Elke 100 mg van het mengsel werd verpakt in een harde capsule waarbij men een 5 capsulemedicament verkreeg.

Deze capsule bevat 5 mg schizandrine. Drie doseringen (3-6 capsules elk) dienen per dag toegediend te worden.

Preparaatvoorbeeld IX

5 g γ-schizandrine verkregen onder toepassing van produktie-10 voorbeeld IV werd fijnverpoederd en gemengd met 90 g lactose. Elke 100 mg van het mengsel werd verpakt in een harde capsule waarbij men een capsulemedicament verkreeg.

Deze capsule bevat 5 mg γ-schizandrine. Drie doseringen (3-6 capsules elk) dienen per dag toegediend te worden.

15 Preparaatvoorbeeld X

10 mg deoxyschizandrine verkregen onder toepassing van produktie-voorbeeld I werd verpakt en verzegeld in een steriliseerbaar flesje.

Voor praktische toepassing wordt dit verzegelde geneesmiddel opgelost in 5% glucoseoplossing of fysiologische zoutoplossing, en geïnjecteerd 20 met een intraveneus infuus. (500 ml/2-4 uur).

Preparaatvoorbeeld XI

10 mg gomisine A, verkregen onder toepassing van produktievoor-beeld III werd verpakt en verzegeld in een steriliseerbaar flesje voor praktische toepassing werd dit verzegelde geneesmiddel opgelost in 25 5% glucoseoplossing of fysiologische zoutoplossing en geïnjecteerd onder toepassing van een infuus (500 ml/2-4 uur).

Preparaatvoorbeeld XII

Wuweizisu C (5 mg) verkregen onder toepassing van produktievoor-beeld V werd verpakt en verzegeld in een steriliseerbaar flesje voor 30 praktische toepassing wordt het verzegelde geneesmiddel opgelost in 5% glucoseoplossing of fysiologische zoutoplossing en geïnjecteerd onder toepassing van een infuus (500 ml/2-4 uur).

6820225

Claims

1. Therapeutisch geneesmiddel voor leverstoornis omvattende verbindingen weergegeven door de algemene formule van het formuleblad, waarin zowel als -OCH^ voorstellen, of R^ samen met R^ -OCi^O-is; 5 zowel R^ en R^ -OCH3 voorstellen, of R3 samen met R^ -OCH^O- is; R^4 H is, ... CH3 is of 4 OH is; en Rr, R en R ·4ΐ H of ... CH, zijn. O/O J

2. Geneesmiddel volgens conclusie 1, waarin R^, R3 en R^ -OCH- , Rc 4 H, R . . .CH , R„ 4 H en R„ ... CH, voorstellen. 3 o 6 3/ 8 3

3. Geneesmiddel volgens conclusie 1, waarin R samen met R -0CH„0-, 1 ώ R, en R -OCH , R- ... CH , R^ 4) H, R ... CH, en R0 4 H voorstellen. J 4 .3 3 b / 3 o

4. Geneesmiddel volgens conclusie 1, waarin R^, R^, R3 en R^ -OCH3, R_ 41 OH, Rr ...CH , R, 4 H en R0 ... CH, voorstellen. 5 6 3 / 8 3

5. Geneesmiddel volgens conclusie 1, waarin R^ samen met R^ 15 -0CH,0-, R, en R„ -OCH,, R- ^ OH, R. ... CH., R_ Μ H, R„ ... CH, 23435 6 37 8 3 voorstellen.

6. Geneesmiddel volgens conclusie 1, waarin R^ samen met R^ -OC^O-, R, en R. -OCH,, R. 4 H, R. ... CH,, R H en R„ ... CH, voorstellen. 3 4 3 5 '6 3 7 8 3

7. Geneesmiddel volgens conclusie 1, waarin R^ samen met R^ -OCH^O-,

20 R, samen met R. -0CH,0-, R- ... CH,, R^ *4 H, R, ... CH en Rn 4 H 3 4 2 5 3 6 7 8 voorstellen. & 0 L U 1 £ b