JP5090366B2 - 多価イムノグロブリン系生物活性アセンブリー - Google Patents
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Description
本出願は、2006年3月24日に提出した国際出願第PCT/US2006/010762号;2006年3月29日に提出した国際出願第PCT/US2006/012084号;2006年6月29日に提出した国際出願第PCT/US2006/025499号;2006年3月24日に提出した米国特許出願第11/389,358号;2006年3月28日に提出した同第11/391,584号 及び2006年6月29日に提出した同第11/478,021号の一部継続出願であり、2006年3月14日に提出した米国特許仮出願第60/782,332号;2005年10月19日に提出した同第60/728,292号 及び2005年12月16日に提出した同第60/751,196号に基づく優先権を主張する。本出願は、2005年12月16日に提出した米国特許仮出願第60/751,196号及び2006年11月6日に提出した同第60/864,530号に基づき合衆国法典第35巻119条(e)に規定する利益を主張する。上記に引用する各出願の文章は、その全文が参照により本明細書に取り込まれる。
特許、特許出願、論文、書籍及び論説を含むが、これらに限定されない、本出願に引用される全ての文献、又は文献の一部は、参照により、その全文が明示的に本明細書に組み込まれる。
本明細書で用いる「1つ(a)」又は「1つ(an)」は、1又は2個以上の事項を意味する。
開示される方法及び組成物により、モジュール式サブユニットから成る安定係留アセンブリーを作成するための足場となる技術が提供される。1の態様は、好ましくは個別に作製される2種類の特定の成分AとBから形成される安定係留二成分複合体に関する。しかしながら、別の態様では、例えば、AとBの両方をコードするベクター又はAとBを別々にコードする2種類の異なるベクターで単一のセルラインをトランスフェクトする等により、AとBを両方一緒に作製してもよい。AとBが両方ともFab断片である場合には、AとBを同時作製した場合には、軽鎖の混ざり合いにより不均一な産物が生じることになるので、個別に作製することが好ましい。
特定のエピトープを認識する抗体断片をコードする核酸配列は、当該技術分野でよく知られる技法によって得ることができる。例えば、所望の特異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマを用いて、例えば、PCR又は従来のcDNAクローニング技術等の既知の技法を用いて調製可能な抗体をコードするDNAを得ることができる。これに代わり、Fab'発現ライブラリー又は抗体ファージディスプレーライブラリーを構築して、所望の特異性を有する抗体断片をスクリーニングすることもできる。
上述の安定係留構造体にさらなる部分を複合体形成させることができる。例えば、薬物、トキシン、放射性化合物、酵素、ホルモン、細胞毒性タンパク質、キレート、サイトカイン、及びその他の機能剤を、安定係留構造体の1又は2個以上のサブユニットに複合体形成させることができる。複合体形成は、例えば、側鎖にアミノ基、カルボキシル基、チオール基、又はヒドロキシル基を有するアミノ酸残基への共有結合により可能である。例えば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス(ヒドロキシスクシンイミド)エステル、カルボジイミド、マレイミド‐ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒドなど、種々の従来のリンカーをこの目的のために使用することができる。安定係留構造体への剤の複合体形成は、未修飾構造に含まれる各サブユニットの活性に著しい影響を与えないことが好ましい。モジュールのサブユニットに対して別々に複合体形成を行って、その後にサブユニットを集合させて安定係留構築物を構築することができ、又は、別の選択肢として、完成した安定係留構築物若しくは安定係留構築物を形成する中間体を用いて複合体形成を行うこともできる。さらに、細胞毒性剤又はその他の剤をまずポリマー担体へ結合させ、続いてそれを安定係留構造体へ複合体形成させることもできる。この方法については、本明細書に参照することで組み入れられる、Ryser et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 75:3867‐3870,1978;米国特許第4,699,784号、及び米国特許第4,046,722号を参照のこと。
医薬組成物
ある態様では、安定係留構造体及び/又は1若しくは2種類以上のその他の治療薬を、癌を有する対象などの対象へ投与することができる。そのような薬剤は、医薬組成物の形で投与することができる。一般に、これには、ヒト又は動物に有害となり得る不純物を実質的に含有しない組成物の調製が必要となる。当業者であれば、例えば経口投与、又は静脈内投与などの非経口投与を含む様々な経路で医薬組成物を対象に投与することができることが分かるであろう。
特定の態様では、化学療法薬を投与することができる。抗癌用に使用できる化学療法薬としては、5‐フルオロウラシル、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン(CDDP)、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エストロゲン受容体結合剤(estrogen receptor binding agent)、エトポシド(VP16)、ファルネシル‐タンパク質転移酵素阻害剤、ゲムシタビン、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テモゾロミド(DTICの水性溶液)、トランス白金化合物、ビンブラスチン及びメトトレキサート、ビンクリスチン、又は上記の類似体若しくは誘導体化された変形体などが挙げられるが、これらに限定されない。感染性の生物に対して使用できる化学療法薬としては、アシクロビル、アルベンダゾール、アマンタジン、アミカシン、アモキシシリン、アンホテリシンB、アンピシリン、アズトレオナム、アジスロマイシン、バシトラシン、バクトリム、バトラフェン(登録商標)、ビホナゾール、カルベニシリン、カスポファンギン、セファクロル、セファゾリン、セファロスポリン、セフェピム、セフトリアキソン、セファトキシム、クロラムフェニコール、シドホビル、シプロ(登録商標)、クラリスロマイシン、クラブラン酸、クロトリマゾール、クロキサシリン、ドキシサイクリン、エコナゾール、エリスロサイクリン、エリスロマイシン、フラジール、フルコナゾール、フルシトシン、ホスカルネット、フラゾリドン、ガンシクロビル、ゲンタマイシン、イミペネム、イソニアジド、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、リンコマイシン、リネゾリド、メロペネム、ミコナゾール、ミノサイクリン、ナフチフィン、ナリジクス酸、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラントイン、ニスタチン、オセルタミビル、オキサシリン、パロモマイシン、ペニシリン、ペンタミジン、ピペラシリン‐タゾバクタム、リファブチン、リファンピン、リマンタジン、ストレプトマイシン、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、テトラサイクリン、チオコナゾール、トブラマイシン、トルシクラート、トルナフタート、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、バラシクロビル、バンコマイシン、ザナミビル、及びジスロマイシン、が挙げられるが、これらに限定されない。
副腎皮質ステロイドホルモンは、他の化学療法薬の効果を高めることができ、従って、組み合わせて治療に使用されることが多い。副腎皮質ステロイドホルモンの例としては、プレドニゾン及びデキサメタゾンが挙げられる。カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、及び酢酸メゲストロールなどのプロゲスチンは、子宮内膜の癌や乳癌に用いられる。ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオールなどのエストロゲンは、前立腺癌などの癌に用いられる。タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤は、乳癌などの癌に用いられる。プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロンなどのアンドロゲンも、乳癌の治療に用いられる。
特定の態様では、アンジオスタチン、バクロスタチン(baculostatin)、カンスタチン(canstatin)、マスピン、抗VEGF抗体、抗PIGFペプチド及び抗体、抗血管増殖因子抗体、抗Flk‐1抗体、抗Flt‐1抗体及びペプチド、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性因子阻害剤、組織メタロプロテアーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン12、IP‐10、Gro‐β、トロンボスポンジン、2‐メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、CM101、マリマスタット、ペントサンポリサルフェート、アンジオポエチン‐2、インターフェロン‐α、ハービマイシンA、PNU145156E、16Kプロラクチン断片、リノマイド(Linomide)、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、TNP‐470、エンドスタチン、パクリタキセル、アクチン、アンジオスタチン、シドホビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、AGM‐1470、血小板第4因子、又はミノサイクリンなどの抗血管新生剤を用いることができる。
本明細書で用いる、「免疫調節剤」という用語には、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロン(例:インターフェロン‐α、‐β、及び‐γ)、及び「S1因子」と称する幹細胞増殖因子などの、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、及び、造血因子が含まれる。適切な免疫調節剤部分の例としては、IL‐2、IL‐6、IL‐10、IL‐12、IL‐18、IL‐21、インターフェロン‐ガンマ、TNF‐αなどが挙げられる。
ある態様では、ペプチド及び/又はタンパク質を放射性核種治療法又は放射免疫療法に使用することができる(例えば、各々が参照することで本明細書に組み入れられる、Govindan et al.,2005,Technology in Cancer Research & Treatment,4:375‐91;Sharkey and Goldenberg,2005,J.Nucl.Med.46:115S‐127S;Goldenberg et al. ( J.Clin.Oncol.2006;24:823‐834),”Antibody Pre‐targeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radioimmunotherapy”、を参照)。特別の態様では、有用な放射性同位元素で安定係留構造体を直接標識し、対象へ投与することができる。別の選択肢としての態様では、疾患組織内の発現が増加した部位に局在化する二重特異性の安定係留構造体を投与した後に、放射標識したハプテンペプチド又はリガンドを注入するという、上述のプレ標的法(pre−targeting method)によって放射性同位元素を投与することができる。
種々の態様が、患者の疾患組織の治療又は診断に適した構成物を含むキットに関するであろう。典型的なキットには、少なくとも1種類の安定係留構造体を含むことができる。投与成分を含む組成物が、経口送達などの消化管を通じての送達用に製剤されていない場合は、キットの構成物をその他の何らかの経路を通じて送達することが可能な装置を含めることができる。非経口送達などの用途のための装置の一つの種類としては、組成物を対象の体内へ注入するのに使用するシリンジがある。吸入装置を使用することもできる。
その複合体を含む安定係留構造体は、さらに製剤され、1若しくは2種類以上の薬理学的に許容される賦形剤、1若しくは2種類以上の追加成分、又はこれらのある組み合わせを含む組成物を得ることができる。これらは、薬理学的に有用な製剤を作製する公知の方法で達成することができ、それにより、活性成分(すなわち、安定係留構造体又は複合体)が1若しくは2種類以上の薬理学的に許容される賦形剤と混ぜ合わされ、混合物となる。薬理学的に許容される賦形剤の一つの例は、無菌リン酸緩衝食塩水である。その他の適切な賦形剤は当業者に公知である。例えば、Ansel et al.,PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,5th Edition(Lea & Febiger 1990)、Gennaro(ed.),REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th Edition(Mack Publishing Company 1990)、及びその改訂版を参照のこと。
その複合体を含む安定係留構造体は、抗体又は免疫複合体を用い、プレ標的を必要としない、広範囲にわたる種々の治療及び診断用途への使用に適している。例えば、三価の構造体は、「単体の(naked)」構築物として、すなわち、そのような構造体が追加的な機能剤と複合体形成をしない態様において、抗体単体を用いる治療と同じ方法によって、治療に用いることができる。又は、別の選択肢として、安定係留構造体を1若しくは2種類以上の機能剤で誘導体化することにより、診断又は治療への応用を可能とすることができる。追加する剤は、上述のように、安定係留構造体と共有結合することができる。
プレ標的とは、もともとは、特に骨髄などの正常組織への望ましくない毒性をもたらす、直接標的化した抗体の遅い血中クリアランスを解決するために開発された多段階プロセスである。プレ標的により、放射性核種又はその他の治療薬が、血中から数分以内に除去される低分子化合物に結合される。標的抗原に加えて放射標識した低分子化合物を認識することができるプレ標的剤をまず投与し、その後、プレ標的剤が十分に血中から除去されてから、放射標識した化合物を投与する。
一般的に、安定係留構造体は、癌、又は癌以外の疾患の治療に効力を示す抗体主体の薬剤の代わりとすることができる。放射性同位元素、薬物、及びトキシンが、癌細胞によって産生された若しくは癌細胞と関連するマーカーと特異的に結合する抗体、又は抗体断片と複合体形成することができることは公知であり、また、そのような抗体の複合体を用いて、放射性同位元素、薬物、又はトキシンを腫瘍部位に対して標的化してその治療効力を高め、副作用を最小限に抑えることができることも公知である。このような薬剤及び方法の例は、Wawrzynczak and Thorpe (Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer,L.M.Franks and N.M.Teich,eds, Chapter 18,pp.378‐410,Oxford University Press,Oxford,1986)、Immunoconjugates.Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer (C.W.Vogel,ed., 3‐300,Oxford University Press,N.Y.,1987), 及びDillman,R.O.(CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 1 :357,CRC Press,Inc.,1984)、にレビューされている。Pastan et al.,Cell (1986),47:641;Vitetta et al.,Science (1987),238:1098‐1104;及びBrady et al.,Int.J.Rad.Oncol.Biol.Phys.(1987),13:1535‐1544、も参照のこと。
安定係留構造体の標的に関するさらなる開示としては、Goldenberg et al.による2004年12月9日出願の、米国特許仮出願第60/634,076号、”Methods and Compositions for Immunotherapy and Detection of Inflammatory and Immune‐dysregulatory Disease, Infectious Disease, Pathologic Angiogenesis and Cancer"、に開示されており、この全文は参照することで本明細書に組み入れられる。
別の選択肢としてのある態様では、DDD及び/又はADドメインを構築する結合ペプチドは、本技術分野で公知のファージディスプレイ法によって同定することができる。例えば、DDDドメインに結合し、従って天然のAD配列に置き換わることができるペプチドは、DDD二量体に対するファージディスプレイパニングを行い、高い結合親和性を有するファージを選別することにより、識別することができる。特定の標的分子に選択的又は特異的な他の種類の結合ペプチドは、選択された標的に対してファージディスプレイパニングを行うことによって検出することができる。
特定の態様では、構築物形成の前駆体は、アプタマーを含むことができる。構築方法、及びアプタマーの結合特性の測定方法は、本技術分野で公知である。例えば、そのような技術は米国特許第5,582,981号、第5,595,877号、及び第5,637,459号に記載されており、これらは各々参照することで本明細書に組み入れられる。
特定の態様では、本明細書で述べる前駆体、成分、及び/又は複合体は、1若しくは2個以上のアビマー配列を含むことができる。アビマーは、種々の標的分子に対する親和性及び特異性という点である程度抗体に類似している結合タンパク質の一種である。これは、ヒトの細胞外ドメインからインビトロでのエクソンシャッフリング及びファージディスプレイによって開発された(Silverman et al.,2005,Nat.Biotechnol. 23:1493‐94;Silverman et al.,2006,Nat.Biotechnol. 24:220)。得られたマルチドメインタンパク質は、複数の独立した結合ドメインを有することができ、それによって、エピトープが一つである結合タンパク質と比べて、向上した親和性(場合によってはサブナノモル)及び特異性を示すことができる(上記と同じ文献)。種々の態様において、アビマーは、請求された方法及び組成物に使用するために、例えばAD及び/又はDDD配列と結合することができる。アビマーの構築及方法及び使用方法に関するさらなる詳細は、例えば、米国特許出願公開第20040175756号、第20050048512号、第20050053973号、第20050089932号、及び第20050221384号に開示されており、これらの文献の各々の実施例のセクションは、参照することで本明細書に組み入れられる。
請求された方法及び組成物の範囲内において、種々のポリペプチド又はタンパク質を使用することができる。特定の態様では、タンパク質は、抗体又は抗原結合性部位を有する抗体断片を含むことができる。他の態様では、タンパク質又はペプチドは、酵素、ホルモン、サイトカイン、結合性タンパク質、又はトキシンなどのエフェクターモジュールでもよい。
ポリペプチドの作製に関する別の態様は、ペプチドミメティックの使用である。ミメティックは、タンパク質の二次構造の要素を擬態するペプチド含有分子である。例えば、参照することで本明細書に組み入れられる、Johnson et al.,”Peptide Turn Mimetics”in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY,Pezzuto et al.,Eds.,Chapman and Hall,New York(1993)、を参照のこと。ペプチドミメティック用いることの裏づけとなる論理的根拠は、タンパク質のペプチドバックボーンが、抗体と抗原などの分子間の相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を配向するために主に存在するということである。ペプチドミメティックは天然分子に類似の分子相互作用を行うことができると考えられる。これらの原理を用いて、本明細書で開示する結合ペプチドの自然の性質の多くを有するが、胃や腸での吸収率の向上、及び/又はインビボでの安定性若しくは活性の改善など、特性が変化又は改善された第二世代の分子を設計することができる。
種々の態様は、融合タンパク質に関連するであろう。このような分子は、一般に、ペプチドの全部分又は大部分を有し、N末端若しくはC末端において、第二のポリペプチド若しくはタンパク質の全部分又は一部分と結合している。例えば、融合は、他の種のリーダー配列を利用することができ、異種ホスト内でのタンパク質の組換え発現を可能とする。別の有用な融合としては、抗体エピトープなどの免疫活性ドメインの付加がある。さらに別の有用な融合の形としては、FLAGエピトープなど、精製に用いる部分の結合を挙げることができる(Prickett et al.,1989,Biotechniques 7:580‐589;Castrucci et al.,1992,J Virol 66:4647‐4653)。融合タンパク質の別の使用は、例えば、第一のモノマーに結合したDDD配列及び第二のモノマーに結合したAD配列を提供するなど、本発明で請求される係留複合体の成分の構築に関連するであろう。
タンパク質又はペプチドは、その全体又は一部を、従来の技術に従って溶液中又は固体支持体上で合成することができる。種々の自動合成機が市販されており、公知のプロトコルに従って使用することができる。例えば、Stewart and Young, (1984,Solid Phase Peptide Synthesis,2d. ed.Pierce Chemical Co.);Tam et al.,(1983,J.Am.Chem.Soc.,105:6442);Merrifield,(1986,Science,232:341‐347);及びBarany and Merrifield (1979,The Peptides,Gross and Meienhofer,eds.,Academic Press,New York,pp.1‐284)、を参照のこと。普通は約6から約35乃至50アミノ酸までである短いペプチド配列を、このような方法で容易に合成することができる。別の選択肢として、組換えDNA技術を用いることができ、この場合、対象のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターへ挿入し、適切なホスト細胞中へトランスフォーム又はトランスフェクトし、発現に適した条件下で培養する。
請求された方法及び/又は組成物の種々の態様は、対象へ投与される1又は2種類以上のペプチドを主体とする安定係留構造体に関連するであろう。投与は、経口、経鼻、頬側、吸入、直腸内、腟内、局所、同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、くも膜下腔内、又は静脈内注射を含むがこれらに限定されない、本技術分野で公知のいかなる経路によっても行うことができる。
ある態様では、タンパク質、ペプチド、又はその他の高分子は、ホモ二官能性架橋剤、ヘテロ二官能性架橋剤、及び/又は光活性化が可能な架橋剤などの本技術分野で公知の種々の架橋剤を用いて、共有結合によって架橋することができる。そのような架橋剤の限定されない例としては、1,5‐ジフルオロ‐2,4‐(ジニトロベンゼン);N‐ヒドロキシスクシンイミドのスベリン酸エステル;酒石酸ジスクシンイミジル、ジメチル‐3,3’‐ジチオビスプロピオンイミデート;N‐スクシンイミジル‐3‐(2‐ピリジルチオ)プロピオネート;4‐(ブロモアミノエチル)‐2‐ニトロフェニルアジド;及び4‐アジドグリオキサールが挙げられる。典型的な態様では、DCCD又はEDCなどのカルボジイミド架橋剤を用いて酸性残基をアミノ基又はその他の基と架橋させることができる。そのような架橋剤は修飾して、蛍光標識剤などの種々の標識剤と結合させることができる。
種々の態様は、標的に対する抗体に関連するであろう。本明細書で用いる「抗体」という用語は、抗原結合領域を有するいかなる抗体様分子も意味し、Fab’、Fab、F(ab’)2、単一ドメイン抗体(DAB)、Fv、scFv(単鎖Fv)、などの抗体断片が含まれる。種々の抗体を主体とする構築物及び断片を調製し、使用する技術は、本技術分野で公知である。抗体の調製及びキャラクタリゼーションの方法も本技術分野で公知である(例えば、Harlowe and Lane,1988,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory、を参照)。有用な抗体は、広範囲にわたる公知の様々な供給者から購入することもできる。例えば、ハイブリドーマ細胞系を分泌する種々の抗体が、American Type Culture Collection (ATCC、バージニア州、マナサス)より入手可能である。
請求項に記載した方法及び/又は組成物のある態様は、抗体断片に関連するであろう。そのような抗体断片は、従来の方法により、全抗体のペプシン又はパパインによる分解によって得ることができる。例えば、抗体断片は、ペプチンによる抗体の酵素切断によって作製することができ、F(ab’)2断片が得られる。この断片はチオール還元剤を用いてさらに切断し、続いて任意に、ジスルフィド結合の開裂によって生成したスルフヒドリル基のブロックを行い、一価のFab’断片を作製することができる。別の選択肢として、パパインを用いた酵素切断により、一価のFab断片が2個とFc断片が1個作製される。抗体断片を作製する典型的な方法は、米国特許第4,036,945号;米国特許第4,331,647号;Nisonoff et al.,1960,Arch. Biochem.Biophys.,89:230;Porter,1959,Biochem.J.,73:119;Edelman et al.,1967,METHODS IN ENZYMOLOGY,page 422(Academic Press)、及びColigan et al.(eds.),1991,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,(John Wiley & Sons)、に開示されている。
キメラ抗体は、ヒト抗体の種々の領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域(CDR)を含むマウス抗体の種々の領域などに置換された、組換えタンパク質である。対象に投与されると、キメラ抗体は、低下した免疫原性と向上した安定性を示す。キメラ抗体を構築する方法は、本技術分野で公知である(例:Leung et al.,1994,Hybridoma 13:469)。
コンビナトリアル法、又はヒト免疫グロブリンの遺伝子座でトランスフォームされたトランスジェニック動物を用いて完全ヒト抗体を作製する方法は、本技術分野で公知である(例えば、Mancini et al.,2004,New Microbiol.27:315‐28;Conrad and Scheller,2005,Comb.Chem.High Throughput Screen.8:117‐26;Brekke and Loset,2003,Curr.Opin.Phamacol.3:544‐50;これらの文献の各々は参照することで本明細書に組み入れられる)。このような完全ヒト抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体よりもさらに副作用が少ないこと、及びインビボで実質的に内在性ヒト抗体として機能することが期待される。特定の態様では、請求された方法及び手順は、このような技術で作製したヒト抗体を利用することができる。
タンパク質に基づいたインビトロ診断
本発明は、安定係留構造体を用いて、インビトロ及び/又はインビボで疾患関連抗原の存在に関する生物サンプルのスクリーニングを行うことを意図している。典型的な免疫測定法では、以下で述べるように、抗体、融合タンパク質、又はこれらの断片を含む安定係留構造体を、液相で又は固相担体に結合させて用いることができる。好ましい態様、特にインビボでの投与を含む態様では、抗体又はその断片はヒト化される。抗体又はその断片が完全ヒト型であることも好ましい。さらに好ましくは、融合タンパク質はヒト化抗体又は完全ヒト抗体を含む。当業者であれば、特定の遺伝子の発現レベルを同定する広範囲にわたる種々の技術が知られており、免疫測定法、RT‐PCR法、mRNA精製及び/又はcDNA調製に続いて行う遺伝子発現アッセイ用のチップへのハイブリダイゼーションなど、このようないずれの公知の方法を用いても、個々の対象及び/又は組織内での発現レベルを同定できることを認識するであろう。有用な典型的インビトロアッセイとしては、RIA、ELISA、サンドイッチELISA、ウエスタンブロット、スロットブロット、ドットブロット、などが挙げられる。このような技術はインタクトな抗体を用いて開発されたものではあるが、抗体、抗体断片、又はその他の結合部分が取り込まれた安定係留構造体を使用することができる。
安定係留構造体は、ある態様において、核酸部分を取り込むことができる。特別な態様では、特に核酸増幅法を用いて核酸を分析することにより、結合のレベルを同定することができる。種々の増幅の形式が本技術分野で公知であり、そのような公知のいかなる方法も使用することができる。一般に、増幅は、増幅されるべき標的核酸配列に選択的に又は特異的にハイブリダイズする1又は2種類以上のプライマーの使用を含む。
標識化ペプチド又はMAbを用いた画像診断の方法はよく知られている。例えば、免疫シンチグラフィの技術では、リガンド又は抗体がγ線を放出する放射性同位元素で標識化され、患者へ導入される。γカメラを用いて、γ線を放出する放射性同位元素の位置と分布を検出する。例えば、Srivastava(ed.),RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY(Plenum Press 1988)、Chase,”Medical Applications of Radioisotopes,”in REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th Edition,Gennaro et al.(eds.),pp. 624‐652(Mack Publishing Co.,1990)、及びBrown,”Clinical Use of Monoclonal Antibodies,”in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227‐49,Pezzuto et al.(eds.)(Chapman & Hall 1993)、を参照のこと。18F、68Ga、64Cu、及び124Iなどのエネルギーが511keVであるものなど、ポジトロンを放出する放射性核種(PET同位元素)を使用することも好ましい。そのようなイメージングは、安定係留構造体の直接の標識化、又は、Goldenberg et al.,”Antibody Pre‐targeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radioimmunotherapy,”(J Clin Oncol 2006;24:823‐834)に記載のプレ標的画像法によって行うことができる。米国特許公開公報第20050002945号、第20040018557号、第20030148409号、及び第20050014207号も参照のこと。これらの各文献は参照することで本明細書に組み入れられている。
多くの適切なイメージング剤が本技術分野で知られており、それらをタンパク質又はペプチドへ結合する方法も同様である(例えば、共に参照することで本明細書に組み入れられる、米国特許第5,021,236号及び第4,472,509号を参照)。特定の結合方法は、例えばDTPAなどの有機キレート化剤を用いてタンパク質又はペプチドに結合した金属キレート錯体の使用を含む(米国特許第4,472,509号)。タンパク質又はペプチドは、グルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸などのカップリング剤の存在下で酵素と反応することもできる。蛍光マーカーとの複合体は、これらのカップリング剤の存在下で、又はイソチオシアネートとの反応によって調製される。
実施例1.モジュール式Fabサブユニットの一般的な製造ストラテジー
DDD配列又はAD配列のいずれかを含む融合タンパク質としてFabモジュールを製造してもよい。各Fab融合タンパク質について、独立したトランスジェニックセルラインを開発した。モジュールは、製造されたならば、所望の場合には精製するか又は細胞培養上清液中のまま保存できる。製造の後、あらゆる(Fab-DDD)2モジュールをあらゆるFab-ADモジュールと組み合わせて、二重特異性を示す3価のFab(bsTF)を作り出すことができる。
pdHL2プラスミドベクターを鋳型として用いたPCRによりCH1ドメインを増幅させた。左側のPCRプライマーは、CH1ドメインの上流部分(5')とSacII制限エンドヌクレアーゼ部位から成り、CH1コーディング配列の5'末端になる。右側のプライマーは、ヒンジ部(PKSC)の最初の4残基をコードする配列と、これに続くGGGGS(最後の2つのコドン(GS)にはBam HI制限酵素部位が含まれる)から成る。
5'側のCH1左側プライマー
5'GAACCTCGCGGACAGTTAAG-3' (配列番号5)
CH1+G4S-Bam 右側
5'GGATCCTCCGCCGCCGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGG-3' (配列番号6)
リンカーペプチドの11残基(最初の2つのコドンにはBamHI制限酵素部位が含まれる)の下流にDDD1のアミノ酸配列をコードする(G4S)2DDD1と定義する2重鎖ヌクレオチドの合成をSigma Genosys社(ヘイバーヒル、英国)に依頼した。3'末端に終止コドンとEagI制限酵素部位が付加されている。コードしたポリペプチド配列を以下に示す。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (配列番号7)
RIIA1-44トップ
5'GTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCAGGGCTACACGGTGGAGGTGCTGCGACAG-3' (配列番号8)
RIIA1-44ボトム
5'GCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTGAAGTACTCCACTGCGAATTCGACGAGGTCAGGCGGCTGCTGTCGCAGCACCTCCACCGTGTAGCCCTG-3' (配列番号9)
G4S Bam-左側
5'-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3' (配列番号10)
1-44 終止Eag右側
5'-CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG-3' (配列番号11)
リンカーペプチドの11残基(最初の2つのコドンにはBamHI制限酵素部位が含まれる)の下流にAD1のアミノ酸配列をコードする(G4S)2-AD1と定義する2重鎖ヌクレオチドを合成した(Sigma Genosys)。3'末端に終止コドンとEagI制限酵素部位が付加されている。コードされるポリペプチド配列を以下に示す。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA (配列番号12)
AKAP-ISトップ
5'GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCTGACGGCCG-3' (配列番号13)
AKAP-ISボトム
5'CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCTGCCACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCGGATCC-3' (配列番号14)
G4S Bam-左側
5'-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3' (配列番号15)
AKAP-IS終止Eag右側
5'-CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG-3' (配列番号16)
制限酵素BamHI及びNotIを用いてDDD1配列をコードする190bpの断片をpGemTから切り出し、次いで、CH1-pGemT内の同じ部位にライゲーションしてシャトルベクターCH1-DDD1-pGemTを作り出した。
制限酵素 BamHI及びNotIを用いてAD1配列を含む110bpの断片をpGemTから切り出し、次いで、CH1-pGemT内の同じ部位にライゲーションしてシャトルベクターCH1-AD1-pGemTを作り出した。
上記のモジュール式設計を用いることで、CH1-DDD1又はCH1-AD1は、pdHL2ベクター内にあるあらゆるIgG構築物中に組み込むことができる。pdHL2からSacII/EagI制限酵素断片(CH1-CH3)を取り除き、これを、各pGemTシャトルベクターから切り出したCH1-DDD1又はCH1-AD1のSacII/EagI断片と置き換えることにより、重鎖の定常ドメイン全体が上記構築物の1つと置き換えられる。
DDD又はADの位置は、CH1のカルボキシル末端に限定されない。DDD1配列がVHドメインのアミノ末端に付加された構築物を組換え技術により作製した。
h679-Fd-AD1-pdHL2の構築
h679-Fd-AD1-pdHL2は、14アミノ酸残基から構成されるフレキシブルなGly/Serペプチドスペーサーを介してFdのCH1ドメインのカルボキシル末端に結合したAD1を有するh679 Fabの製造に用いる発現ベクターである。SacII/EagI断片を、CH1-AD1-SV3シャトルベクターからSacIIとEagIで切り出したCH1-AD1断片と置き換えることにより、h679の可変ドメインを含むpdHL2系ベクターをh679-Fd-AD1-pdHL2へと変換した。
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2は、DDD1が、フレキシブルなペプチドスペーサーを介して、CH1のカルボキシル末端でhMN-14 Fabに結合した融合タンパク質C-DDD1-Fab-hMN-14を2コピー含む安定な2量体の製造に用いる発現ベクターである。SacIIとEagIの制限エンドヌクレアーゼを用いた制限酵素処理によりCH1-CH3ドメインを取り除いて、CH1-DDD1-SV3シャトルベクターからSacIIとEagIで切り出したCH1-DDD1断片を挿入することにより、hMN-14 IgGの製造に用いたプラスミドベクターhMN14(I)-pdHL2をC-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2へと変換した。
N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2は、DDD1が、フレキシブルなペプチドスペーサーを介して、VHのアミノ末端でhMN-14 Fabに結合した融合タンパク質N-DDD1-Fab-hMN-14を2コピー含む安定な2量体の製造に用いる発現ベクターである。
DDD1 Nco左側
5' CCATGGGCAGCCACATCCAGATCCCGCC-3' (配列番号17)
DDD1-G4S Bam右側
5'GGATCCGCCACCTCCAGATCCTCCGCCGCCAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTG-3' (配列番号18)
hMN-14VH左側 G4S Bam
5'-GGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGG-3' (配列番号19)
CH1-C終止 Eag
5'-CGGCCGTCAGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTC-3' (配列番号20)
SalI制限エンドヌクレアーゼを用いた制限酵素処理によりh679-Fab-AD1ベクターを直鎖状にして、エレクトロポレーションによりSp/EEE骨髄腫細胞にトランスフェクトした。このジシストロニック発現ベクターにより、h679κ軽鎖とh679 Fd-AD1の両方の合成と分泌が行われ、h679 Fab- AD1が形成される。エレクトロポレーション後に細胞を96ウェル組織培養プレート内に播種し、0.05 μMのメトトレキサート(MTX)を用いてトランスフェクトされたクローンのセレクションを行った。BSA-IMP-260(HSG)複合体でコーティングしたマイクロタイタープレートを用いたELISAと、HRP結合ヤギ由来抗ヒトFabを用いた検出により、クローンのタンパク質発現についてスクリーニングを行った。HSG(IMP-239)センサーチップを使用したBIAcore分析により、培地の希釈サンプルの注入から得られる初期勾配を測定することで生産能を決定した。最も生産能の高いクローンは、約30 mg/Lの初期生産能を示した。シングルステップIMP-291アフィニティークロマトグラフィーにより4.5リットルのローラーボトル培養から230 mgのh679-Fab-AD1が精製された。培養培地は、IMP-291アフィゲルカラムにローディングする前に、限外濾過により約10倍に濃縮した。PBSでカラムをベースラインまで洗浄し、1 Mのイミダゾール、1 mMのEDTA、0.1 MのNaAc(pH 4.5)でh679-Fab-AD1を溶離した。溶離液のSE-HPLC分析により、50 kDaのタンパク質と一致する保持時間(9.63分間)で単一のシャープなピークが示された(データは非表示)。還元的SDS-PAGE解析では、h679-AD1のポリペプチド成分を表す2本のバンドだけが明確に確認された(データは非表示)。
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2ベクターとN-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2ベクターをエレクトロポレーションによりSp2/0由来骨髄腫細胞にトランスフェクトした。C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2ベクターは、ジシストロニック発現ベクターであり、このベクターによってhMN-14κ軽鎖とhMN-14 Fd-DDD1の両方の合成と分泌が行われ、そして、hMN-14κ軽鎖とhMN-14 Fd-DDD1が組み合わさることでC-DDD1-hMN-14 Fabが形成される。N-DDD1-hMN-14-pdHL2ベクターは、ジシストロニック発現ベクターであり、このベクターによってhMN-14κ軽鎖とN-DDD1-Fd-hMN-14の両方の合成と分泌が行われ、そして、hMN-14κ軽鎖とN-DDD1-Fd-hMN-14が組み合わさることでN-DDD1-Fab-hMN-14が形成される。各融合タンパク質は、そのDDD1ドメインの相互作用を介して安定なホモ2量体を形成する。
DDD/AD相互作用を利用して、DDD1含有構築物のアフィニティー精製を行った。合成により作製されたAD1-Cは、AD1配列とカルボキシル末端のシステイン残基から成るペプチドであり(実施例6参照)、このシステイン残基を用いて当該ペプチドをスルフヒドリル基と無水クロロ酢酸の反応後にアフィゲルに結合する。DDD含有a2構造体は、中性のpHでAD1-C-アフィゲル樹脂に特異的に結合し、低pH(例えば、pH 2.5)で溶離可能である。
a2b複合体の形成の証拠は、最初にC-DDD1-Fab-hMN-14(a2として)及びh679-Fab-AD1(bとして)を等モル量で含む混合物のSE-HPLC分析により提示された。上記のサンプルを分析した際に、h679-Fab-AD1(9.55分間)又はC-DDD1 -Fab-hMN-14(8.73分間)のいずれか一方よりも大きい新たなタンパク質の形成に一致する、8.40分間の保持時間を有する単一のピークが観察された(データは非表示)。hMN-14 F(ab')2をh679-Fab-AD1と混合した場合、又はC-DDD1-Fab-hMN-14 を679-Fab-NEMを混合した場合には、高磁場へのシフトは観察されなかったことから、相互作用がDDD1ドメインとAD1ドメインにより特異的に媒介されることが示された。h679-Fab-AD1とN-DDD1-Fab-hMN-14を用いた場合にも、非常に近似した結果が得られた(データは非表示)。
実施例6.Di-AD1の作製
本実施例では、以下に示すアミノ酸配列を有する低分子ポリペプチド(AD1-C)を合成した。
NH2-KQIEYLAKQIVDNAIQQAKGC-COOH (配列番号37)
NH2-KQIEYLAKQIVDNAIQQAKGC=CGKAQQIANDVIQKALYEIQK-NH2 (配列番号21)
本発明の方法により、新規なプレターゲッティング方法が提供される。以下において、ハプテン結合性抗体を必要せず、親和性促進系(Le Doussal et al., J Nucl Med (1989), 30:1358-66)を用いたプレターゲッティング系の例を提供する。実施例4で記載するように作製したC-DDD1-Fab-hMN-14又はN-Fab-DDD2-hMN-14の2量体は、腫瘍のプレターゲッティングに用いることができる。最初に107 kDaのタンパク質を患者に静脈内投与し、そして、腫瘍上のCEAに結合させるが、一方で、血液と正常な組織からは排出されることになる。後の時点において、治療用放射性同位体(例えば、90Y)又は診断用放射性同位体(例えば111In)を担持するDi-AD1のDOTA複合体等の2価ペプチドを静脈内投与する。低分子ペプチド(〜5000 Da)は、血液と正常な組織からは迅速に排出されつつも、既に腫瘍に保持されているC-DDD1-Fab-hMN-14と特異的に相互作用することが予測される2つのAD配列を含んでいるため、この低分子ペプチドは、腫瘍に局在化することになる。
より低い親和力でのドッキングを示すDDDタンパク質又はADタンパク質を作製することで、万能のアフィニティー精製システムを開発できる。RIαの2量体により形成されるDDDは、RIIαの場合と比べて500倍弱い親和力(225 nM)でAKAP-IS (AD1)に結合する。従って、最初の44アミノ酸残基から形成されるRIαの2量体を作製して樹脂に結合させることで、あらゆるAD1含有融合タンパク質を精製するための誘引性のアフィニティーマトリックスを作り出すことができる。
実施例9.3つのFab断片から構成されるジスルフィド結合により安定化された構造体を作製するためのベクター
N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
N-DDD2-hMN-14-pdHL2は、Fdのアミノ末端に付加したDDD2の2量体化及びドッキング用ドメインの配列を有するN-DDD2-Fab-hMN-14の作製用の発現ベクターである(図4)。DDD2は、15アミノ酸残基のGly/Serペプチドリンカーを介してVHドメインに結合している。DDD2は、2量体化及びドッキング用ドメイン(DDD1と同じ2量体化及びドッキング用ドメイン)の上流にシステイン残基を有する。分泌された融合タンパク質は、DDD2ドメインの非共有結合的相互作用によって互いに保持された2個の同一のhMN-14 Fabのコピーから構成される(図3B)。
DDD2トップ
5'CATGTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3' (配列番号22)
DDD2 ボトム
5'GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCA-3' (配列番号23)
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2は、Fdのカルボキシル末端に14アミノ酸残基のGly/Serペプチドリンカーを介して付加したDDD2の2量体化及びドッキング用ドメインの配列を有するC-DDD2-Fab-hMN-14の作製用の発現ベクターである(図5A)。分泌される融合タンパク質は、DDD2ドメインの非共有結合的相互作用によって互いに保持された2個の同一のhMN-14 Fabのコピーから構成される(図5B)。
G4S-DDD2トップ
5'GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3' (配列番号24)
G4S-DDD2ボトム
5'GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCAACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3' (配列番号25)
N-DDD2-Fab-hMN-14又はC-DDD2-Fab-hMN-14にBとしてペア形成するようにh679-Fab-AD2を設計した。h679-Fd-AD2-pdHL2は、CH1ドメインのカルボキシル末端に14アミノ酸残基のGly/Serペプチドリンカーを介して付加したAD2のアンカードメインの配列を有するh679-Fab-AD2の作製用の発現ベクターである。AD2は、AD1のアンカードメイン配列の上流側に1つと下流側にも1つのシステイン残基を有する。
AD2トップ
5'GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGATGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCGGCTGCTGAA-3' (配列番号26)
AD2ボトム
5'TTCAGCAGCCGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCCACATCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3' (配列番号27)
h679-Fd-AD2-pdHL2ベクターを、エレクトロポレーションによりSp/EEE骨髄腫細胞にトランスフェクトした。このジシストロニック発現ベクターにより、h679κ軽鎖とh679 Fd-AD2の両方の合成と分泌が行われ、これによってh679 Fab-AD2が形成される。ADのいずれかの末端に存在するシステイン残基により2つの潜在的に反応性のあるスルフヒドリル基が提供される。エレクトロポレーション後に細胞を96ウェル組織培養プレート内に播種し、0.05 μMのメトトレキサート(MTX)を用いてトランスフェクトされたクローンのセレクションを行った。BSA-IMP-260(HSG)複合体でコーティングしたマイクロタイタープレートを用いたELISAとヤギ由来抗ヒトFab-HRP抗体を用いた検出により、クローンのタンパク質発現についてスクリーニングを行った。HSG(IMP-239)センサーチップを使用したBIAcore分析により、培地の希釈サンプルの注入から得られる初期勾配を測定することで生産能を決定した。最も生産能の高いクローンは、約50 mg/Lの初期生産能を示した。シングルステップIMP-291アフィニティークロマトグラフィーにより2.9リットルのローラーボトル培養から総量で160 mgのh679-Fab-AD2が精製された。培養培地は、IMP-291アフィゲルカラムにローディングする前に、限外濾過により約10倍に濃縮した。PBSでカラムをベースラインまで洗浄し、1 Mのイミダゾール、1 mMのEDTA、0.1 MのNaAc(pH 4.5)でh679- AD2を溶離した。溶離液のSE-HPLC分析により、50 kDaのタンパク質と一致する保持時間(〜10分間)で単一のシャープなピークが示された(データは非表示)。この物質をhMN14-Fab-DDD1と混合した際には、二成分複合体のものと考えられる新たなピークのSE-HPLCトレースの観察により証拠付けられるように、1/3だけが反応性を示した(データは非表示)。しかしながら、TCEPを用いたh679-Fab-AD2の還元により、100%の活性が生じた(データは非表示)。このことにより、(1)分子内ジスルフィド結合がAD2の2つのシステイン残基間に形成されることでDDDとの会合が妨げられるが、他の物質との反応からスルフヒドリル基を保護できること;及び(2)分子内ジスルフィド架橋は還元により切断可能であり、これによって2つの遊離スルフヒドリル基を有するDDD反応性アンカードメインが生じること、が示唆される。
N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2ベクターを、エレクトロポレーションによりSp/EEE骨髄腫細胞にトランスフェクトした。このジシストロニック発現ベクターにより、hMN-14κ軽鎖とN-DDD2-hMN-14 Fdの両方の合成と分泌が行われ、これによってN-DDD2-hMN14 Fabが形成される。A2構造体は、DDD2を介した2量体化により形成され、これによって各DDD2のシステイン残基から2つの潜在的に反応性のあるスルフヒドリル基が提供されると予想される。エレクトロポレーション後に細胞を96ウェル組織培養プレート内に播種し、0.05 μMのメトトレキサート(MTX)を用いてトランスフェクトされたクローンのセレクションを行った。
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2ベクターを、エレクトロポレーションによりSp/EEE骨髄腫細胞にトランスフェクトした。このジシストロニック発現ベクターにより、hMN-14κ軽鎖とC-DDD2-Fd-hMN-14の両方の合成と分泌が行われ、hMN-14κ軽鎖とC-DDD2-Fd-hMN-14が組み合わさることでC-DDD2-Fab-hMN14が形成される。N-DDD2-Fab-hMN-14の場合と同様に、a2構造体は、DDD2を介した2量体化により形成され、これによって各DDD2のシステイン残基から2つの潜在的に反応性のあるスルフヒドリル基が提供されると予想される。エレクトロポレーション後に細胞を96ウェル組織培養プレート内に播種し、0.05 μMのメトトレキサート(MTX)を用いてトランスフェクトされたクローンのセレクションを行った。
h679-Fab-AD2は、B成分としてN-DDD2-hMN-Fab-14又はC-DDD2-hMN-14等の a2成分とペアを形成するよう設計した。これらは、組み合せた場合に直ちに会合して a2b構造体(図7A)を形成するが、a2b構造体は、更にジスルフィド結合を介して共有結合するように誘導される場合がある(図7B)。N-DDD2構築物とAD2構築物のキャラクタリゼーションで、完全なDDD/AD交互作用を達成するためには、これら各構築物の還元が必要なことが示されたことから、本製造方法にも還元工程を含めた。最初に還元剤として固相化したTCEPを用いることで、還元剤の除去に要する時間を節約した。室温で1時間還元した後、遠心によりTCEP-アガロースを取り除き、DMSOを終濃度10%で反応溶液に添加した。これよりTF1と呼ぶ共有結合したa2b複合体の存在の第1の証拠は、BIAcore分析により示された。
TF1を守備良く作製し、次いでC-DDD2-Fab-hMN-14をh679-Fab-AD2と反応させることで、TF2と定める類似体(図8)も得られた。TF2は、TF1に対して2点の潜在的な利点を有する。第1に、C-DDD2-Fab-hMN-14は、N-DDD2-Fab-hMN-14より10倍高いレベルで作り出される。第2に、C末端にDDDドメインを有する融合タンパク質は、N末端にDDDドメインを有する融合タンパク質と比べて、顕著に強いCEA結合活性を示す。上記については、ドメインの配置に起因するものと考えられ、N-DDDの変異体の場合には、結合が立体障害により弱められる可能性がある。
TF1及びTF2は、血液と組織内において幾多もの希釈を受ける、インビボでの使用が可能な安定係留構造体となるように設計されている。BIACOREを用いてヒト血清内でのTF2の安定性を評価した。TF2を、4名のドナーからプールした新鮮なヒト血清で0.1 mg/mlに希釈し、5% CO2の下で37℃にて7日間インキュベートした。毎日採取したサンプルを1:25に希釈し、次いで、IMP-239 HSG センサーチップを用いたBIACOREによって分析した。WI2 IgGを注入することで、無傷で完全な活性を示すTF2の量を定量した。血清サンプルを、ストックから直接希釈したコントロールサンプルと比較した。TF2は、血清中で非常に安定しており、7日後において、その二重特異的結合活性の98%を保持していた(データは非表示)。同様の結果が、ヒト血清中又はマウス血清中のいずれのTF1について得られた(データは非表示)。
皮下にヒトの大腸腺癌の異種移植片(LS 174T)を保持するメスの胸腺欠損ヌードマウス内での生体内分布試験を行った。細胞は、マウス1匹当たり1x1O7個の細胞を50匹のマウスに皮下注射するのに十分な程度になるまで組織培養で増殖させた。1週間後に腫瘍を測定し、マウスを各時点に5匹のマウスから成るグループに振り分けた。試験開始時の平均の腫瘍サイズは0.141 ± 0.044 cm3であった。全てのマウスに、40 μgの125I-TF2(250 pmoles、2 μCi)を注射した。次いで、注射後0.5、2、4、16、24、48及び72時間でマウスを屠殺して検死した。本試験では全部で35匹のマウスを用いた。腫瘍並びに種々の組織を取り出し、γカウンター内に静置して、各時点での組織1グラム当たりの注射された用量のパーセント(ID/g%)を測定した。
皮下にヒトの大腸腺癌の異種移植片(LS 174T)を保持するメスの胸腺欠損ヌードマウス内でTF2を用いたプレターゲッティング試験を行った。細胞は、マウス1匹当たり1x1O7個の細胞を55匹のマウスに皮下注射するのに十分な程度になるまで組織培養で増殖させた。1週間後に腫瘍を測定し、マウスを各時点に5匹のマウスから成るグループに振り分けた。試験開始時の平均の腫瘍サイズは0.105 ± 0.068 cm3であった。20匹のマウスに、80 μgの125I-TF2(500 pmoles、2 μCi)を注射し、16時間後に99mTc-IMP-245(40 μCi、92 ng、50 pmoles)を投与した。注射後0.5、1、4及び24時間でマウスを屠殺して検死した。更に、24時間時点グループの3匹のマウスについては、注射後1、4及び24時間の時点においてγカメラで撮影した。コントロールとして更に3匹のマウスに99mTc-IMP-245(プレターゲッティング無し)を投与し、24時間での撮影後に検死する前にも、注射後1、4及び24時間の時点に撮影を行った。腫瘍並びに種々の組織を取り出し、γカウンター内に静置して、各時点での組織1グラム当たりの注射された用量のパーセント(ID/g%)を測定した。
上記の実施例13及び14に開示する方法に代わる態様として、安定係留構造体を一体として連結させる特異的なジスルフィド結合を形成するグルタチオンレドックスシステムを用いて、TF1又はTF2等の安定係留構造体を作製することもできる。
組換えヒトGM-CSF(14 kDa)は、種々の血液疾患の治療に臨床で用いられている。現在のGM-CSF製品の制限としては、循環系での半減期が短いことが挙げられ、従って、最適な効果を得るためには、患者に毎日注射してGM-CSFを投与しなければならない。タンパク質治療薬の循環系での半減期を伸ばすために既に採用された1つの方法として、そのタンパク質をポリエチレングリコール(PEG)で修飾してその有効サイズを増大させることが挙げられる。しかしながら、タンパク質にPEGを結合させる(PEG化)ための現時点での全ての既知の方法は、最適なものではなく、通常、目的タンパク質の修飾には部位特異的結合を達成させる必要がある(Doherty et al., Bioconjugate Chem. 2005, 16: 1291-1298)。このような修飾を用いた場合でも、複合体の収率は一定ではなく、得られる産物が均質なものになるとは限らない。
目的の細胞毒性薬物を結合可能なB成分としての融合タンパク質を作製し、これを用いてA成分として作製したターゲッティングタンパク質と結合させて、新規な種類の免疫薬物を得ることが可能であり、その概要を以下に示す。第1に、高レベルで発現されるヒトイムノグロブリンの軽鎖をスキャフォールド又は担体となるタンパク質として選択し、これをAD2配列にそのC末端側で融合させる。軽鎖の2量体の形成を防ぐため、末端部のシステイン(これは、Fd鎖とジスルフィド結合を形成する)をセリンで置換する。更に、この軽鎖に少なくとも1つのN-グリコシル化部位(トリペプチド配列N-X-T)を組換え技術によって導入することで、オリゴ糖の付加が可能になり、これらは、組換え技術によって高収量で作製して、均一に精製可能であり、そして適切な化学的手法、例えば、Shihらがアミノデキストランへのアントラサイクリンの結合について記載したような(Cancer Res. 1991; 51 : 4192-4198)、を介して薬物結合用の基質としても使用できる。このような薬物含有B成分は、ターゲッティング機能と内部移行機能を有する結合構造体と連結されたDDD2を含む種々のA成分と組み合わせることができる。これに代わる方法では、AD2で誘導体化した薬物含有アミノデキストランが適切なA成分と組み合されて特定の薬物治療のターゲッティングが可能となる。その他の高レベルで発現される組換え分子を薬物結合用のスキャフォールド又は担体となるタンパク質として選択することも可能である。
インフルエンザAウィルス、カンディダアルビカンス(Candida albicans)、及びE. coliを含む種々の病原体により引き起こされる疾患の治療に潜在的に有用な広範囲の感染症治療薬にとして、最近、組換えヒトサーファクタントタンパク質断片D(rfhSP-D)と抗CD89抗体のFabを含む化学複合体が報告されている(Tacken et al., J. Immunol. 2004, 172: 4934-4940)。以下のように、好中球に病原体をターゲッティングしてこれを死滅させる安定係留複合体を作製するためにDNL技術を用いることも可能である。αへリックスコイルドコイルネックドメインとC末端糖認識ドメイン(CRD)を含む切断型のhSP-D断片を、N末端でDDD2と融合させ、CDRを介して病原体と多価的に結合するA構造体を作り出す。好中球上のFcRへのターゲッティングを可能とするためには、A構造体を、抗CD89のFabとAD2の融合タンパク質から構成されるB成分に連結して、hSP-Dの2つのCRDと抗CD89の1つのFabから構成される安定な複合体を得る。ヒトサーファクタントタンパク質A(hSP-A)をhSP-Dと他の抗体(CD3及びCD64に対する抗体等)で置換することにより、同様の感染症治療薬を調製することができる。
2種類の基本となる方法が想定される。最初の方法は、DDDとADの役割の入れ替えに適しているであろう別の天然のタンパク質-タンパク質相互作用ドメインの探索と評価に依存する。例えば、HNF-1αのN末端の2量体化ドメインでDDDを置換し、HFN-1(DcoH)の2量体化補助因子でADを置換してもよい。第2の方法の概要を以下に示す。
スキームI
GEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQA (配列番号28)
実施例23.6量体構築物
a2b複合体形成のための上記のDNL技術を応用して、IgGを基礎とする6価のDNL構造体(HIDS)を作製した。組換え複合タンパク質として作製した2種類のモジュールを組み合わせて種々のHIDSを作製した。Fab-DDD2モジュールは、Tri-Fab構造体の作製へ用いるものについて記載する通りであった(Rossi et al. Proc Natl Acad Sci USA.2006; 103(18): 6841-6、上記実施例参照)。Fab-DDD2モジュールは、AD2含有モジュールに結合する安定なホモ2量体を形成する。HIDSを作製するため、2種類のIgG-AD2モジュールを作り出して、Fab-DDD2モジュールとペア形成させた:C-H-AD2-IgG及びN-L-AD2-IgG。
pdHL2哺乳動物発現ベクターは、多くの種類の組換えIgGの発現の媒介に用いられてきた。あらゆるIgG-pdHL2ベクターのC-H-AD2-IgG-pdHL2ベクターへの変換を容易化するために、プラスミドシャトルベクターを作製した。pdHL2 ベクターを鋳型として、オリゴヌクレオチドFc BgIII左側とFc Bam-EcoRI右側をプライマーとして用いて、Fc(CH2とCH3ドメイン)の遺伝子を増幅させた。
Fc BgIII左側
5'-AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG-3' (配列番号31)
Fc Bam-EcoRI右側
5'-GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3' (配列番号32)
エプラツズマブ又はhLL2 IgGは、ヒト化抗ヒトCD22MAbである。実施例24の記載と同様にhLL2 IgG-pdHL2からC-H-AD2-hLL2 IgGの発現ベクターを作製し、これを用いてエレクトロポレーションによりSp2/0骨髄腫細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後に細胞を96ウェルプレート内に播種し、メトトレキサートを含む培地中でトランスジェニッククローンのセレクションを行った。hLL2特異的な抗イディオタイプMAbでコーティングした96ウェルマイクロタイタープレートを用いたサンドイッチELISAとペロキシダーゼ結合抗ヒトIgGを用いた検出により、クローンのC-H-AD2-hLL2 IgG生産能についてスクリーニングを行った。タンパク質を生産させるため、ローラーボトル内でクローンを増殖させて、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによりシングルステップで増殖に使用済みの培養培地からC-H-AD2-hLL2 IgGを精製した。SE-HPLC分析により、2本のタンパク質ピークが解明された(図15)。より遅く溶離したピークの保持時間(8.63分間)は、hLL2 IgGと近似している。より速く溶離したピークの保持時間(7.75分間)は、300 kDaのタンパク質と一致する。後になって、このピークがジスルフィド結合したC-H-AD2-hLL2-IgGの2量体を表すと判断された。この2量体は、DNL反応中に単量体型へと還元される。SDS-PAGE解析により、精製されたC-H-AD2-hLL2-IgGが、モジュールの単量体型とジスルフィド結合した2量体型の両方で構成されていることが示された(図16)。非還元的条件下でのSDS-PAGEでは、これら2つの形態を表すタンパク質バンドが明確に認められるが、還元的条件下では、全ての形態が、構成ポリペプチド(重鎖-AD2とκ鎖)を表す2本のバンドに減少した。他のバンドの混入は検出されなかった。
hA20 IgGは、ヒト化抗ヒトCD20MAbである。実施例24の記載と同様にhA20 IgG-pDHL2からC-H-AD2-hA20 IgGの発現ベクターを作製し、これを用いてエレクトロポレーションによりSp2/0骨髄腫細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後に細胞を96ウェルプレート内に播種し、メトトレキサートを含む培地中でトランスジェニッククローンのセレクションを行った。hA20特異的な抗イディオタイプMAbでコーティングした96ウェルマイクロタイタープレートを用いたサンドイッチELISAとペロキシダーゼ結合抗ヒトIgGを用いた検出により、クローンのC-H-AD2-hA20 IgG生産能についてスクリーニングを行った。タンパク質を生産させるため、ローラーボトル内でクローンを増殖させて、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによりシングルステップで増殖に使用済みの培養培地からC-H-AD2-hA20 IgGを精製した。SE-HPLC分析とSDS-PAGE解析により、実施例25のC-H-AD2-hLL2 IgGで得られた結果と非常に近似する結果が得られた。
軽鎖リーダーペプチド、AD2、13残基のペプチドリンカー及びhA20 Vkの最初の4残基(全てコドンフレームが整合されている)のコーディング配列を含む197 bpのDNA2重鎖を以下のように作製した。Taqポリメラーゼを用いたプライマー伸長により、35塩基配列分重複する2種類の100-mer合成オリゴヌクレオチドから完全な2重鎖を作製した。
LP-AD2-L13トップ
CATCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGACGGCTGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATC (配列番号33)
LP-AD2-L13ボトム
CCGCCAGACCCGCCACCTCCGGACCCTCCGCCGCCGCAGCCGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCCACAGC (配列番号34)
LP-左側XbaI
TCTAGACACAGGACCTCATCATGGGATGGAGCTGTA (配列番号35)
L13-VK右側PvuII
CAGCTGGATGTCACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCC (配列番号36)
DNL法を用いて、C-H-AD2-hA20 IgG(実施例26参照)をhA20-Fab-DDD2と組み合わせることにより、単一特異性を示す抗CD20のHIDSであるHex-hA20を作製した。Hex-hA20構造体は、6本の抗CD20抗体のFab断片と1本のFc断片を含む(図10)。
Hex-hA20は4ステップで作製した。
工程1、組み合せ:210%モル当量の(hA20-Fab-DDD2)2をC-H-AD2-hA20 IgGと混合した。2つのFab-DDD2の2量体が各C-H-AD2-hA20 IgG分子に結合しており、更なる10%過剰量の前者により、この結合反応が確実に完了することから、上記のモル比を用いた。C-H-AD2-hA20 IgGと(hA20-Fab-DDD2)2の分子量は、それぞれ168 kDaと107 kDaである。例として、134 mgのhA20-Fab-DDD2を100 mgのC-H-AD2-hA20 IgGと混合することで、前者の210%モル当量が達成される。混合物は、典型的には1 mMのEDTAを含むpH 7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS)中で作製される。
工程2、穏やかな還元:還元型のグルタチオン(GSH)を1 mMの終濃度で添加し、この溶液を、室温(16 – 25℃)で1-24時間保持した。
工程3、穏やかな酸化:還元の後、酸化型グルタチオン(GSSH)を2 mMの終濃度で反応混合物に直接加え、この溶液を室温で1-24時間保持した。
工程4、DNL産物の単離:酸化の後、反応混合物を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラム上に直接ローディングした。カラムをPBSで洗浄し、Hex-hA20を0.1 Mのグリシン(pH 2.5)で溶離した。過剰量のhA20-Fab-DDD2を反応で用いたことから、非結合性のC-H-AD2-hA20 IgG又は(hA20-Fab-DDD2)2部分を1つだけ含んだ不完全なDNL構造体は存在していなかった。非結合性の過剰なhA20-Fab-DDD2は、アフィニティー樹脂に結合しない;従って、プロテインAで精製した物質には、所望の生成物のみが含まれる。
DNL法を用いて、C-H-AD2-hLL2 IgG(実施例25参照)をhLL2-Fab-DDD2と組み合わせることにより、単一特異性を示す抗CD22のHIDS(Hex-hLL2)を作製した。DNL反応は、実施例28でHex-hA20について記載する通りに行った。
DNL法を用いて、C-H-AD2-hLL2 IgG(実施例25参照)をhA20-Fab-DDD2と組み合わせて二重特異性のHIDSを作製することで、DNL1を得るか、又はhMN-14-DDD2と組み合わせて二重特異性のHIDSを作製することで、DNL1Cを得た。DNL1は、CD20に対する4本の結合アームとCD22に対する2本の結合アームを有する。hMN-14は、癌胎児抗原(CEA)に対するヒト化MAbであるから、DNL1Cは、CEAに対する4本の結合アームとCD22に対する2本の結合アームを有する。 DNL反応は、実施例28でHex-hA20について記載する通りに行った。
DNL法を用いて、C-H-AD2-hA20 IgG(実施例26参照)をhLL2-Fab-DDD2と組み合わせて二重特異性のHIDSを作製することで、DNL2を得るか、又はhMN-14-DDD2と組み合わせて二重特異性のHIDSを作製することで、DNL2Cを得た。DNL2は、CD22に対する4本の結合アームとCD20に対する2本の結合アームを有する。DNL2Cは、CEAに対する4本の結合アームとCD20に対する2本の結合アームを有する。 DNL反応は、実施例28でHex-hA20について記載する通りに行った。
DNL法を用いて、N-L-AD2-hA20 IgG(実施例27参照)をhA20-Fab-DDD2と組み合わせて単一特異性の抗CD20 HIDS(K-Hex- hA20)を作製した。DNL反応は、実施例28でHex-hA20について記載する通りに行った。
N-L-AD2-hA20 IgG(実施例27参照)をhLL2-Fab-DDD2と組み合わせて二重特異性のHIDSを作製した。DNL反応は、実施例28でHex-hA20について記載する通りに行った。
図26と図27に示すように、実施例28-33に記載するように作製したHIDSは、その親Fab/IgGの結合特性を保持している。競合的ELISAを用いることで、種々のHIDSの結合活性を調べる際には、hA20(WR2)と結合したラット由来抗イディオタイプMAbを用いてhA20成分の結合活性を評価するか、又はhLL2(WN)と結合したラット由来抗イディオタイプMAbを用いてhLL2成分の結合活性を評価した。hA20の結合性を評価するため、ELISAプレートをhA20 IgGでコーティングして、WR2の結合において、HIDSを固相化されたIgGと競合させた。hLL2の結合性を評価するため、ELISAプレートをhLL2 IgGでコーティングして、WNの結合において、HIDSを固相化されたIgGと競合させた。ペロキシダーゼ結合抗ラットIgGを用いて、固相化したIgGに結合している抗Idの相対量を検出した。
マウスのヒトBurkittリンパ腫モデルにより、HIDSが、インビボで治療効能を有することが示された(図30)。低投与量(12 μg)のDNL2及びHex-hA20により、腫瘍保持マウスの生存時間が2倍超まで延ばされた。より多くの投与量(60 μg)を用いた処置により、長期生存者が現れた。
MTS増殖アッセイにより、3種類の異なるリンパ腫セルラインに対する HIDS(DNL1、DNL2、Hex-hA20)対親IgG(hA20 IgG)の用量反応曲線の比較を行った(図31)。Daudiリンパ腫細胞(図31、上段のパネル)では、二重特異性構造体のDNL1(データは非表示)とDNL2が、親hA20 IgGと比べて、>100倍高い抗増殖活性を示し、Hex-hA20が>10,OOO倍高い活性を示した。本アッセイでは、Hex-hLL2とコントロール構造体(DNL1-C及びDNL2-C)は、殆ど抗増殖活性を示さなかった(データは非表示)。
抗CD20モノクローナル抗体の架橋形成は、そのインビトロでの効力を促進することが示されている。図32には、MTSアッセイによって評価した、親IgGに対するHIDSの相対効力に対する架橋形成による影響が示されている。図32に示すように、上記効果は、ヤギ由来抗ヒトIgG Fc特異的架橋と架橋形成したhA20 IgGで処理したDaudiリンパ腫細胞で、架橋形成されていないhA20 IgGとの比較において、再現性を以て示された。しかしながら、架橋が存在している場合であってもDNL2又はHex-hA20では抗増殖活性の促進は観察されなかった。以下でも議論するように、更に4つのFab基がHIDSのカルボキシル末端に繋ぎ止められた場合には、HIDSのFc部分への接近が不可能になることが考えられる。
図33には、二重特異性ELISAアッセイによって測定した、ヒト血清中でのDNL1とDNL2の安定性が示されている。新鮮なプールされたヒト血清中で10 μg/mlのタンパク質構造体を、5%のCO2下で37℃にて5日間インキュベートした。0日目のサンプルでは、アリコートを血清で希釈した直後に液体窒素で凍結させた。ELISAプレートは、hA20 IgGに対する抗Idでコーティングし、hLL2 IgGに対する抗Idを用いて二重特異性結合を検出した。DNL1とDNL2の両方とも血清内で非常に安定しており、完全な二重特異性結合活性を保持していた。
リツキシマブやhA20等の抗CD20モノクローナル抗体は、インビボで腫瘍細胞を死滅させるための補体依存性細胞傷害作用(CDC)、抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)及びシグナル伝達誘導性の増殖阻害/アポトーシスを利用することができる。Daudi細胞を用いたインビトロでのアッセイで、6価のDNL構造体(DNL1、DNL2、Hex-hA20)のCDC活性について試験を行った。驚くべきことに、CD20に結合するいずれの6価構造体もCDC活性を示さなかった(図34)。親hA20 IgGは、強力なCDC活性を示したが(図34)、CD22に対するhLL2抗体は、期待されたように何ら活性を示さなかった。DNL2とHex-hA20には、hA20 IgGと同程度のCDC活性を示したhA20-IgG-Ad2(図34)が含まれていることから、DNL2とHex-hA20が作用を示さないことは、興味深いものであった。
Claims (29)
- 2個のAD2(配列番号4)部分に結合したIgG抗体と、各断片がDDD2(配列番号2)部分に結合した同一の又は異なるIgGの4本のFab断片とを含み、前記AD2部分が前記DDD2部分に結合している、6量体の安定係留構造体。
- 前記AD2部分が、前記DDD2部分にジスルフィド結合により共有結合している、請求項1に記載の構造体。
- 前記構造体が、6本のFab断片と1本のFc断片を含む、請求項1に記載の構造体。
- 前記Fab断片のそれぞれが、同一の抗原エピトープに結合する、請求項1に記載の構造体。
- 前記Fab断片のうち2本の断片が第1の抗原エピトープに結合し、そして前記Fab断片のうち4本の断片が第2の抗原エピトープに結合する、請求項1に記載の構造体。
- 前記抗体又はFab断片が、ヒト抗体、ヒト化抗体若しくはキメラ抗体、又はこれらのFab断片である、請求項1に記載の構造体。
- 前記IgG抗体及び/又はFab断片が、炭酸脱水酵素IX、α-フェトプロテイン、A3、A33抗体の特異的抗原、Ba 733、BrE3抗原、CA125、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、大腸特異的抗原-p(colon-specific antigen-p)(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、葉酸レセプター、HLA-DR、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)及びそのサブユニット、HER2/neu、低酸素誘導因子(HIF-1)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、インシュリン成長因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体の特異的抗原、胎盤成長因子、p53、前立腺酸性フォスファターゼ、PSA、PSMA、RS5、S1OO、TAC、TAG-72、テネイシン、TRAILレセプター、Tn抗原、トムソン-フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、VEGF、ED-Bフィブロネクチン、17-1A抗原、脈管形成マーカー、癌遺伝子マーカー又は癌遺伝子産物から成る群から選択される抗原に結合する、請求項1に記載の構造体。
- 前記構造体に、共有結合若しくは非共有結合により結合した1又は2個以上のエフェクター又は担体を更に含む、請求項1に記載の構造体。
- 前記エフェクターが、診断剤、治療剤、化学療法剤、放射線同位体、造影剤(imaging agent)、抗血管新生剤、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、薬物、プロドラッグ、酵素、結合分子、細胞表面レセプターに対するリガンド、キレート剤、免疫調節剤、オリゴヌクレオチド、ホルモン、光検出性標識、色素、ペプチド、毒素、造影剤(contrast agent)、常磁性標識、超音波標識、アポトーシス促進剤、リポソーム、ナノ粒子又はこれらの組み合わせである、請求項8に記載の構造体。
- 前記IgG抗体及び前記Fab断片が、標的の分子、複合体、凝集体、細胞、抗原又は組織に対する結合親和力を有する、請求項1に記載の構造体。
- 前記IgG抗体が、標的の分子、複合体、凝集体、細胞、抗原又は組織に対する結合親和力を有し、そして少なくとも1つのFab断片が、ハプテンに対する結合部位を有する、請求項1に記載の構造体。
- 前記IgG抗体が、細胞表面レセプター、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュロキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、tpA、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、ウロキナーゼ、CA19-9、CEA、CEACAM6、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD74、ED-Bフィブロネクチン、EGFR、GD2、G250抗原、HER2/neu、hTR、HLAクラスII、HMW/MAA、HN/NDV、IGF1R、IL-2R/Tac、IL-17、MUC1、PSMA、M13コートタンパク質、GpIIb/IIIa、CD74、EGP-1、CD25/Tac、LeY、メソセリン(mesothelin)、Erb-B2、Erb-B3、EpCAM、GP240、GPIIb/IIIa、p97、CD3、IL-4R、IL-4、IL-13、VEGFR-2、CD14、CD111/ネクチン-1、葉酸レセプターα、gp120、IL-6、IL-5、IL-8、CD154、IgE、LFA-1、β-トリプターゼ、CD105/エンドグリン(endoglin)、TNFα、RSV Fタンパク質、CEAのA1B1、CEAのNドメイン、PfMSP-1、TAG-72、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、VEFGR1/Flt-1、VEGFR2/KDR又はVEGRF3/Flt-4、に対する結合親和力を有する、請求項11に記載の構造体。
- 少なくとも1つのFab断片が、IL-17、ヒスタミンスクシニルグリシン(HSG)、インジウム-DTPA、CD22、CD20、EGFR、IGF1R、VEFGR1/Flt-1、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt-4、CD3、CD16、CD64、CD89、CD2、アデノウィルスファイバーノブ、M13コートタンパク質、GpIIb/IIIa、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペロキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、tpA、ストレプトキナーゼ、ヒルジン又はウロキナーゼ、に対する結合親和力を有する、請求項12に記載の構造体。
- 前記IgG抗体が、CEA、ED-Bフィブロネクチン、CD20、CD22、CD19、EGFR、IGF1R、VEFGR1/Flt-1、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt-4、HER2/neu、CD30、CD33、PfMSP-1、HN/NDV、EpCAM/17-1A、hTR、IL-2R/Tac、CA19-9、MUC1、HLAクラスII、GD2、G250、TAG-72、PSMA、CEACAM6、HMWMAA、CD40、M13コートタンパク質及びGPIIb/IIIaから成る群から選択される細胞表面抗原に対する結合親和力を有し、そして少なくとも1つのFab断片が、ヒスタミンスクシニルグリシン(HSG)及びインジウム-DTPAから成る群から選択されるハプテン、又はCD22、CD20、EGFR、IGF1R、VEFGR1 /Flt-1、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt-4、CD3、CD16、CD64、CD89、CD2及びアデノウィルスファイバーノブから成る群から選択される細胞表面抗原のいずれかに対する結合親和力を有する、請求項11に記載の構造体。
- 前記IgG抗体が、M13コートタンパク質及びGpIIb/IIIaから成る群から選択される細胞表面抗原、又はアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペロキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、tpA、ストレプトキナーゼ、ヒルジン及びウロキナーゼから成る群から選択される生体分子のいずれかに対する結合親和力を有し、そして少なくとも1つのFab断片が、M13コートタンパク質及びGpIIb/IIIaから成る群から選択される細胞表面抗原、又はアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペロキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、tpA、ストレプトキナーゼ、ヒルジン及びウロキナーゼから成る群から選択される生体分子のいずれかに対する結合親和力を有する、請求項1に記載の構造体。
- 前記IgG抗体及び前記Fab断片が、同一の抗原に結合し、前記抗原が、CD14、CD111/ネクチン-1、葉酸レセプターα、gp120、IL-6、IL-5、IL-8、CD154、IgE、LFA-1、β-トリプターゼ、CD105/エンドグリン(endoglin)、GpIIb/IIIa、TNFα、RSV F-タンパク質、CEAのA1B1及びCEAのNドメインから成る群から選択される、請求項1に記載の構造体。
- 前記IgG抗体及び前記Fab断片が、CD20/CD22; CD20/CD74; CD20/HLA-DR; CD22/CD74; CD22/HLA-DR; CD74/HLA-DR; CD74/CEA又はHLA-DR/CEAの抗原の組合せに結合する、請求項4に記載の構造体。
- 疾病を伴う又は病的状態にある対象を治療する製剤の製造における請求項1ないし17のいずれか1項に記載の6量体の安定係留構造体の使用において、前記構造体が前記疾病又は病的状態に治療的効果を有する、使用。
- 前記疾病又は病的状態が癌または自己免疫疾患である、請求項18に記載の使用。
- 前記疾病又は病的状態が癌であり、前記IgG抗体及び/又はFab断片が、炭酸脱水酵素IX、α-フェトプロテイン、A3、A33抗体の特異的抗原、Ba 733、BrE3抗原、CA125、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、大腸特異的抗原-p(colon-specific antigen-p)(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、葉酸レセプター、G250抗原、HLA-DR、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)及びそのサブユニット、HER2/neu、低酸素誘導因子(HIF-1)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、インシュリン成長因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体の特異的抗原、胎盤成長因子、p53、前立腺酸性フォスファターゼ、PSA、PSMA、RS5、S1OO、TAC、TAG-72、テネイシン、TRAILレセプター、Tn抗原、トムソン-フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、VEGF、ED-Bフィブロネクチン、17-1A抗原、脈管形成マーカー、癌遺伝子マーカー又は癌遺伝子産物から成る群から選択される腫瘍関連抗原に対する結合親和力を有する、請求項19に記載の使用。
- 化学療法剤、サイトカイン、又は抗血管新生剤と組合わせた請求項20に記載の使用。
- 前記Fab断片の少なくとも1つが、ハプテンに対する結合親和力を有する、請求項20に記載の使用。
- 前記対象へ投与するための前記ハプテンの使用を更に含む、請求項22に記載の使用。
- 前記ハプテンが、抗血管新生剤、化学療法剤、サイトカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、オリゴヌクレオチド、放射線同位体、免疫刺激剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、ホルモン、結合分子、脂質、ポリマ、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、またはこれらの組み合わせからなる群から選択された薬剤に結合する、請求項23に記載の使用。
- 前記疾病又は病的状態が、真菌、ウイルス、バクテリア、又はパラサイトによって生じる、請求項18に記載の使用。
- 前記疾病又は病的状態が、自己免疫疾患である、請求項18に記載の使用。
- 前記構造体が、IgG抗体と、抗CD74抗体×抗CD20抗体、抗CD74抗体×抗CD22抗体、抗CD22抗体×抗CD20抗体、抗CD20抗体×抗HLA−DR抗体、抗CD19抗体×抗CD20抗体、抗CD20抗体×抗CD80抗体、抗CD2抗体×抗CD25抗体、抗CD8抗体×抗CD25抗体、抗CD2抗体×抗CD147抗体、抗CEACAM54抗体×抗CD3抗体、抗CEACAM6抗体×抗CD3抗体、抗EGFR抗体×抗CD3抗体、抗HER2/neu抗体×抗CD3抗体、抗CD20抗体×抗CD3抗体、抗CD74抗体×抗CD3抗体、及び抗CD22抗体×抗CD3抗体からなる群から選択されたFab断片の組み合わせを含む、請求項18に記載の使用。
- 前記疾病又は病的状態が、神経変性症、アルツハイマー病、代謝疾患、心疾患、アテローム性動脈硬化、又は、臓器移植拒否反応である、請求項18に記載の使用。
- 前記癌が、上皮癌、間葉性癌、血液癌、神経癌、上皮性悪性腫瘍、黒色腫、非上皮性悪性腫瘍、神経芽細胞腫、白血病、リンパ腫、神経膠腫及び骨髄腫からなる群から選択される、請求項20に記載の使用。
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