CN106687584B - 用于t细胞或nk细胞活化和扩增的可溶性抗体复合物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于使用可溶性单特异性抗体复合物来活化和扩增人T细胞或NK细胞的组合物和方法。

Description

用于T细胞或NK细胞活化和扩增的可溶性抗体复合物
相关申请案
本申请要求于2014年9月4日提交的第62/045,591号美国临时专利申请的优先权，该专利的内容通过引用整体并入本文。
领域
本公开涉及用于人T细胞或NK细胞活化和扩增的可溶性单特异性抗体复合物的方法和组合物。
背景
宿主耐受性和适应性免疫是人类健康的复杂和关键组成部分。T淋巴细胞包含各种亚群，包括：调节性T细胞，其在维持宿主耐受性方面起重要作用；效应子亚群，诸如根据环境刺激进行免疫应答的CD4+ T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。
用于T细胞体外生长和繁殖的方法基于许多不同的途径。在一些情况下，通过使用辅助细胞和外源性生长因子(诸如抗原递呈细胞和IL-2)来活化和扩增T细胞。这需要在T细胞活化和/或扩增过程中存在和补充辅助细胞和生长因子。
或者，用于T细胞的活化和扩增的试剂由在固相表面(例如板或磁珠)上直接或间接固定抗CD3抗体的组合组成。除了由固定的抗CD3抗体提供的原代T细胞活化信号之外，还需要由抗CD28抗体提供的次级共刺激信号。还可以加入外源性生长因子或细胞因子(诸如IL-2)来增强T细胞增殖。
抗CD3抗体是许多多克隆T细胞刺激方案中的关键组分。首先Dixon等人证实，固定的抗CD3可在不存在由T细胞受体进行的同源抗原识别的情况下介导人T细胞活化和扩增。抗CD3通过交联T细胞表面上的T细胞受体复合物的组分来启动活化和增殖信号级联放大；因此它们需要固定。随后Baroja等人表明，来自固定或可溶性抗CD28刺激物的第二信号以及固定抗CD3是完全T细胞活化所需的。通过附着配体(诸如CD2、LFA-1)以及其它TNF家族成员(诸如CD137(4-1BB))提供的附加共刺激信号可以向T细胞提供附加的增殖或存活信号(Smith-Garvin等人)。
用于使用涂覆有固定抗CD3抗体的组织培养板进行T细胞活化的商品可购自Corning公司(BioCoatTM T细胞活化板，产品目录号354725)，并且由研究者使用本领域的技术人员已知的标准方法广泛制备。可以外源添加可溶性抗CD28抗体来提供启动T细胞活化和增殖所需的共刺激信号(Kruisbeek等人)。
美国专利6,352,694描述了一种使用固定在4.5um直径磁性颗粒上的抗CD3和抗CD28抗体进行T细胞活化和扩增的方法。
美国专利8,012,750B2描述了一种用于活化T细胞的可生物降解设备。类似于先前的公开，该方法使用间接包被有能够结合和活化T细胞的抗体的可生物降解微球体。
美国专利申请14/035,089描述使用具有固定抗CD3和/或抗CD28的柔性纳米基质来向T细胞提供活化信号。它们公开了大小在1-500nm之间的葡聚糖基质，所述葡聚糖基质用作可模塑到具有固定的T细胞活化抗体的T细胞的表面上的柔性支架。
与固定抗体不同，可溶性抗体复合物可以向T细胞提供更温和的活化信号。美国专利公布no.US 2007/0036783描述了可溶性双特异性四聚抗体复合物(TAC)的使用，所述TAC由一种抗CD3抗体与第二抗CD28抗体复合而成，所述第二抗CD28抗体能够启动T细胞活化和扩增。它们声称，与固定抗体方法相比，这种方法提供了更温和的刺激，从而产生更少的活化诱导的细胞死亡。此申请的发明人并未充分证实四聚抗体复合物确实是可溶的并且在刺激过程中不吸附到培养塑料上。此外，其发明人特别指出双特异性四聚抗体复合物的使用参与经刺激的T细胞的活化和扩增。
发明概要
本发明人已经开发了一种用于使用可溶性单特异性四聚抗体复合物来体外活化和扩增原代人T细胞或NK细胞的方法。具体地，本发明人已经确定，与使用双特异性四聚抗体复合物相比，使用可溶性单特异性四聚抗体复合物导致更大的T细胞活化。本发明人还已经确定，与在不存在可溶性单特异性四聚抗体复合物的情况下培养的NK细胞相比，使用可溶性单特异性四聚抗体复合物导致NK细胞活化的改善。
可溶性单特异性TAC具有优于固定抗体方法的优点，因为在扩增后不需要去除大的磁性颗粒，并且可以洗涤细胞以去除任何未结合的可溶性TAC复合物；也不需要专门的涂覆有抗体的板或基质。
因此，本公开涉及一种用于活化T细胞或NK细胞的方法，该方法包括用包含至少一种可溶性单特异性复合物的组合物培养含有T细胞或NK细胞的样品，其中每种可溶性单特异性复合物包含两个结合蛋白，这两个结合蛋白连接并结合至T细胞或NK细胞上的相同抗原。
在一个实施方案中，所述组合物包含至少两种不同的单特异性抗体复合物，其中一种单特异性抗体复合物结合至T细胞或NK细胞上的第一抗原，而另一种单特异性抗体复合物结合至T细胞或NK细胞上的第二抗原。任选地，所述组合物包含至少三种不同的单特异性抗体复合物，其中第一单特异性抗体复合物结合至T细胞或NK细胞上的第一抗原，第二单特异性抗体复合物结合至T细胞或NK细胞上的第二抗原，而第三单特异性抗体复合物结合至T细胞或NK细胞上的第三抗原。
在一个实施方案中，本文所述结合至T细胞或NK细胞上的抗原的结合蛋白是抗体或其片段。在一个实施方案中，可溶性单特异性复合物是四聚抗体复合物(TAC)。在一个实施方案中，TAC由来自一个物种的两个抗体与来自第二物种的两个抗体分子结合构成，所述第二物种的两个抗体分子结合至所述第一动物物种的抗体的FC部分。
在一个实施方案中，本文所述的方法用于活化T细胞。在一个实施方案中，该方法包括用组合物培养含有T细胞的样品，该组合物包含一种结合至T细胞上的第一抗原的单特异性抗体复合物和另一种结合至T细胞上的第二抗原的单特异性抗体复合物。在一个实施方案中，第一抗原选自CD3、CD28、CD2、CD7、CD11a、CD26、CD27、CD30L、CD40L、OX-40、ICOS、GITR、CD137、以及HLA-DR，而第二抗原为选自CD3、CD28、CD2、CD7、CD11a、CD26、CD27、CD30L、CD40L、OX-40、ICOS、GITR、CD137、以及HLA-DR的不同抗原。在一个实施方案中，第一抗原是CD3。在一个实施方案中，第二抗原是CD28。在一个实施方案中，第三抗原是CD2。
在一个实施方案中，T细胞活化是增强的T细胞增殖、增强的细胞因子产生和/或增强的T细胞表达。
在一个实施方案中，本公开描述了使用靶向人CD3、CD28和CD2的可溶性单特异性四聚抗体复合物，来诱导人T细胞的最佳体外多克隆活化和扩增。在此类实施方案中，组合物包含靶向CD3、CD28和CD2的三种不同的可溶性单特异性复合物。
在另一个实施方案中，本文所述的方法用于活化NK细胞。在一个实施方案中，该方法包括用组合物培养含有NK细胞的样品，该组合物包含一种结合至NK细胞上的第一抗原的单特异性抗体复合物和另一种结合至NK细胞上的第二抗原的单特异性抗体复合物。在一个实施方案中，第一抗原选自CD335、CD2、NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1、以及CD27，而第二抗原为选自CD335、CD2、NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1、以及CD27的不同抗原。在一个实施方案中，第一抗原是CD335。在一个实施方案中，第二抗原是CD2。
在一个实施方案中，NK细胞活化是增强的NK细胞增殖、增强的细胞因子产生和/或增强的NK细胞表达。
在一个实施方案中，本公开描述了使用靶向人CD335和CD2的可溶性单特异性四聚抗体复合物，来诱导人NK细胞的体外活化和扩增。在此类实施方案中，组合物包含靶向CD335和CD2的两种不同的可溶性单特异性复合物。
根据以下详细描述，本公开的其它特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，虽然指示了本公开的优选实施方案，但是详细描述和具体实例仅以说明的方式给出，因为通过此详细描述，在本公开的精神和范围内的各种变化和修改将变得对本领域技术人员显而易见。
附图简述
图1示出了在培养7天后，使用特异于CD3或CD28的单特异性TAC的混合物或使用抗CD3和CD28的双特异性TAC的混合物，通过CFSE染料稀释法评估的人T细胞增殖的结果。
图2示出了使用可溶性单特异性TAC组合物和
Figure BDA0001252993150000051
人T活化剂CD3/CD28珠粒、使用未处理或封闭的组织培养板进行的T细胞活化和增殖的结果。
图3示出了在用可溶性单特异性TAC组合物或
Figure BDA0001252993150000052
人T活化剂CD3/CD28珠粒刺激后进行的短期细胞内细胞因子产生测定的结果。
图4示出在21天时期内使用可溶性单特异性CD3、CD28和CD2 TAC或
Figure BDA0001252993150000061
人T活化剂CD3/CD28珠粒扩增的T细胞的代表性图像。
图5示出了使用可溶性单特异性CD3、CD28和CD2 TAC或
Figure BDA0001252993150000062
人T活化剂CD3/CD28珠粒的21天T细胞扩增的结果。
图6A示出在用或不用单特异性CD335/CD2 TAC刺激的情况下，在补充有IL-2的ImmunoCult-XF培养基中维持的NK细胞的纯度。图6B示出了在用或不用单特异性CD335/CD2TAC刺激的情况下，所维持的细胞总数的变化。与在500IU/mL的IL-2存在下单独培养NK细胞相比，在500IU/mL的IL-2存在下用NKp46(CD335)和CD2 TAC混合物刺激后观察到了增强的NK细胞活化。
具体实施方式
本公开提供了一种使用单特异性复合物(诸如四聚抗体复合物)来体外活化和扩增人T细胞或自然杀伤(NK)细胞的方法。
因此，在一个实施方案中，本公开提供了一种活化T细胞的方法，该方法包括用包含至少一种可溶性单特异性复合物的组合物培养含有T细胞的样品，其中每种可溶性单特异性复合物包含两个结合蛋白，这两个结合蛋白连接并结合至T细胞上的相同抗原。在一个实施方案中，本公开还提供了一种活化NK细胞的方法，该方法包括用包含至少一种可溶性单特异性复合物的组合物培养含有NK细胞的样品，其中每种可溶性单特异性复合物包含两个结合蛋白，这两个结合蛋白连接并结合至NK细胞上的相同抗原。在一个实施方案中，在IL-2和/或一种或多种其它细胞因子(诸如IL-7或IL-15)的存在下培养NK细胞。在一个实施方案中，T细胞或NK细胞是人细胞。
如本文所用的术语“可溶性单特异性复合物”是指包含两个结合蛋白的复合物，该两个结合蛋白彼此直接或间接连接并结合至相同的抗原。这两个结合蛋白是可溶的并且不固定在表面、颗粒或珠粒上。在一个实施方案中，所述结合蛋白结合至T细胞上的相同抗原。在另一个实施方案中，所述结合蛋白结合至NK细胞上的相同抗原。
在一个实施方案中，这两个结合蛋白是相同的结合蛋白并且结合至抗原上的相同表位。
如本文所用的术语“双特异性复合物”是指包含两种不同结合蛋白的复合物，该两种不同结合蛋白彼此直接或间接连接，其中每种结合蛋白结合至T细胞或NK细胞上的不同抗原。
术语“活化T细胞”包括但不限于诱导T细胞的增殖，诱导从T细胞产生细胞因子，以及诱导T细胞扩增。
“T细胞上的抗原”可以是活化T细胞的任何抗原，包括但不限于CD3、CD28、CD2、CD7、CD11a、CD26、CD27、CD30L、CD40L、OX-40、ICOS、GITR、CD137、以及HLA-DR。
术语“活化NK细胞”包括但不限于诱导NK细胞的增殖，诱导从NK细胞产生细胞因子，以及诱导NK细胞的扩增。
“NK细胞上的抗原”可以是活化NK细胞的任何抗原，包括但不限于CD335、CD2、NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1以及CD27。
在一个具体实施方案中，结合蛋白是抗体或其片段。可以使用的抗体片段包括来自重组来源和/或在转基因动物中产生的Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv和dsFv片段。抗体或抗体片段可以来自任何物种，包括小鼠、大鼠、兔子、仓鼠和人。嵌合抗体衍生物，即组合非人动物可变区和人恒定区的抗体分子，也被认为在本发明的范围内。嵌合抗体分子可包括例如人源化抗体，该人源化抗体包含来自小鼠、大鼠或其它物种的抗体的抗原结合结构域，以及人恒定区。常规方法可用于制备嵌合抗体。(参见例如Morrison等人；Takeda等人，Cabilly等人，美国专利No.4,816,567；Boss等人，美国专利No.4,816,397；Tanaguchi等人，欧洲专利公布EP171496；欧洲专利公布0173494，英国专利GB 2177096B)。人源化抗体的制备描述于EP-B 10 239400中。人源化抗体也可以商业化生产(Scotgen公司，英国米德尔塞克斯郡，特威克南冬青路2号(Scotgen Limited，2 Holly Road，Twickenham，Middlesex，GreatBritain))。预期在人受试者中嵌合抗体比相应的非嵌合抗体具有更低的免疫原性。人源化抗体可以例如如WO 00/61635中所述进一步稳定化。
结合至T细胞抗原或NK细胞抗原的抗体或其片段可商购或可由本领域的技术人员制备。
在一个实施方案中，结合至相同抗原的两个抗体或其片段直接连接。抗体的直接连接可以通过将一个抗体与另一个抗体化学偶联来制备，例如通过使用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)。
在另一个实施方案中，两个抗体在可溶性单特异性复合物中间接连接。“间接连接”是指两种抗体彼此不直接共价连接，而是通过连接部分如免疫复合物附接。在一个优选的实施方案中，通过制备四聚抗体复合物间接连接两种抗体。可以通过将结合至相同抗原并且是相同动物物种的单克隆抗体与大约等摩尔量的第二动物物种的单克隆抗体混合来制备四聚抗体复合物，所述第二动物物种的单克隆抗体针对所述第一动物物种的抗体的Fc-片段。第一和第二抗体还可以与约等摩尔量的第二动物物种的单克隆抗体的F(ab′)2片段反应，该第二动物物种的单克隆抗体的F(ab′)2片段针对第一动物物种的抗体的Fc-片段。(参见Lansdorp的美国专利No.4,868,109，其通过引用并入本文，以用于描述四聚抗体复合物及其制备方法)。
在一个实施方案中，所述组合物包含至少两种不同的单特异性复合物，每种单特异性复合物结合至T细胞上的不同抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含至少两种不同的可溶性单特异性复合物，并且所述至少两种不同的可溶性单特异性复合物中的各者结合至选自CD3、CD28、CD2、CD7、CD11a、CD26、CD27、CD30L、CD40L、OX-40、ICOS、GITR、CD137、以及HLA-DR的不同抗原。
在一个具体实施方案中，一种单特异性复合物将结合CD3，而第二种单特异性复合物将结合CD28。
在另一个实施方案中，所述组合物包含至少三种不同的可溶性单特异性复合物，每种可溶性单特异性复合物结合至T细胞上的三种不同抗原之一。在此类实施方案中，没有两种单特异性复合物会结合至相同的抗原。
在一个具体的实施方案中，所述组合物包含三种不同的可溶性单特异性复合物，一种特异于CD3，第二种特异于CD28，以及第三种特异于CD2。
在一个具体实施方案中，在可溶性单特异性复合物存在下的T细胞活化大于使用包含两种不同结合蛋白或抗体(每种结合蛋白或抗体结合至T细胞上的不同抗原)的双特异性复合物的T细胞活化。
含有T细胞的样品可以是希望活化其中的T细胞的任何样品，包括但不限于全血、含有T细胞的单采血液成分样品或外周血单核细胞，纯化的原代人T细胞或永生化的人T细胞系。
在一个实施方案中，所述组合物包含至少两种不同的单特异性复合物，每种单特异性复合物结合至NK细胞上的不同抗原。
在一个具体的实施方案中，一种单特异性复合物将结合CD335，而第二种单特异性复合物将结合CD2。
在另一个实施方案中，所述组合物包含至少两种不同的可溶性单特异性复合物，每种可溶性单特异性复合物结合至NK细胞上的两种不同抗原之一。在此类实施方案中，没有两种单特异性复合物会结合至相同的抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含至少两种不同的可溶性单特异性复合物，并且所述至少两种不同的可溶性单特异性复合物的各者结合至选自CD335、CD2、NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1以及CD27的不同抗原。
在一个具体的实施方案中，所述组合物包含两种不同的可溶性单特异性复合物，一种特异于CD335，第二种特异于CD2。在一个实施方案中，所述组合物包含特异于选自NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1和CD27的抗原的至少一种附加可溶性单特异性复合物。
在一个具体实施方案中，在可溶性单特异性复合物存在下的NK细胞活化大于在不存在可溶性单特异性复合物的情况下的NK细胞活化。
含有NK细胞的样品可以是希望活化其中的NK细胞的任何样品，包括但不限于全血，含有NK细胞的单采血液成分样品或外周血单核细胞，纯化的原代人NK细胞或永生化的人NK细胞系。
组合物
本公开还包括包含至少一种可溶性单特异性复合物的组合物，其中所述可溶性单特异性复合物包含两个结合蛋白，这两个结合蛋白连接并结合至T细胞或NK细胞上的相同抗原。
在另一个实施方案中，所述组合物包含两个可溶性单特异性复合物，其中一个可溶性单特异性复合物结合至T细胞或NK细胞上的一个抗原，而第二可溶性单特异性复合物结合至T细胞或NK细胞上的不同抗原。
在另一个实施方案中，所述组合物包含三个可溶性单特异性复合物，其中每个复合物结合至T细胞上的不同抗原。在一个具体实施方案中，抗原是CD3、CD28和CD2。
在另一个实施方案中，所述组合物包含两个可溶性单特异性复合物，其中每个复合物结合至NK细胞上的不同抗原。在一个具体实施方案中，抗原是CD335和CD2。
用途
本公开包括活化的T细胞或NK细胞的所有用途，包括但不限于它们在治疗中的用途。
本公开的方法和组合物可用于体外扩增T细胞或NK细胞以用于体内治疗需要T细胞或NK细胞的任何疾病或病症，包括但不限于过继性免疫治疗癌症、急性或持续性病原体感染(病毒、真菌、细菌、寄生虫)，调节疫苗效力，或免疫抑制自身免疫疾病或移植物抗宿主病。
以下非限制性实施例说明了本公开：
实施例1
与双特异性CD3/CD28 TAC的混合物相比，单特异性CD3 TAC和CD28 TAC在人T细胞中诱导更大的增殖(图1)。通过首先混合等体积的抗CD3抗体和抗CD28抗体来制备CD3/CD28双特异性TAC。在加入等体积的大鼠抗小鼠IgG1后形成双特异性TAC。所得TAC混合物含有25％的单特异性抗CD3 TAC，25％的单特异性抗CD28 TAC和50％的双特异性抗CD3/抗CD28TAC(参见Lansdorp的美国专利No.4,868,109，其通过引用并入本文，以用于描述四聚抗体复合物及其制备方法、)。
通过将等体积的抗CD3抗体或抗CD28抗体与等体积的大鼠抗小鼠IgG1混合来制备CD3 TAC和CD28 TAC单特异性混合物。将所得单特异性TAC以1∶1的比率混合以制备由50％抗CD3 TAC和50％抗CD28 TAC组成的CD3和CD28单特异性TAC混合物。
使用RosetteSepTM(STEMCELL技术公司，加拿大温哥华(STEMCELL TechnologiesInc.，Vancouver，Canada))，通过阴性富集从新鲜人全血中富集人T细胞。富集的CD4+ T细胞用1uM CFDA-SE的最终浓度标记。标记后将CFSE标记的T细胞重悬浮于XVIVO-15培养基(龙沙公司，瑞士巴塞尔(Lonza，Basel，Switzerland))中。
将96孔平底组织培养板用含1％人血清白蛋白(HSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)在4℃下封闭过夜。向1％HSA封闭的孔中，在0.5ug/mL最终的单特异性CD3和CD28 TAC或CD3/CD28双特异性TAC的存在下培养CFSE标记的细胞。不向培养物中添加外源IL-2。将样品在具有5％CO2的潮湿的37℃培养箱中培养7天。培养7天后，用流式细胞术来评价样品的CFSE染料稀释(细胞增殖的指标)以及CD4和CD8的表达。
结果表明，与双特异性CD3/CD28 TAC相比，单特异性CD3和CD28 TAC诱导更大的CD4+和CD8+ T细胞增殖。未受刺激的CD4+和CD8+ T细胞分别经历最小增殖，1.2％和1.5％。与双特异性TAC的27.4％增殖相比，用单特异性TAC刺激的CD4+ T细胞增殖54.7％。与双特异性TAC的15.9％增殖相比，用单特异性TAC刺激的CD8+ T细胞增殖33.0％。结果表明，单独的单特异性TAC能够诱导T细胞增殖，并且含有25％单特异性CD3和CD28TAC和50％双特异性TAC的混合物在诱导T细胞增殖方面效率较低，如在培养7天后用CFSE染料稀释法所评估的。
实施例2
溶性单特异性CD2TAC与CD3和CD28TAC组合诱导人T细胞的最佳活化(图2)。如实施例1所述制备单特异性TAC。使用抗人CD3制备抗CD3特异性的单特异性TAC。使用抗人CD28制备单特异性抗CD28 TAC。使用抗人CD2制备单特异性抗CD2 TAC。将CFSE标记的经纯化的人T细胞与单特异性TAC的各种组合或与
Figure BDA0001252993150000134
人T活化剂CD3/CD28珠粒一起在未处理或用1％HSA封闭的96孔板中培养。在XVIVO-15培养基中培养3天后，通过流式细胞术评估以下项对T细胞增殖的组合效应(CFSE染料稀释)：i)单独的抗CD3 TAC，ii)抗CD3 TAC和抗CD28 TAC，或iii)抗CD3 TAC、抗CD28 TAC和抗CD2 TAC。在培养的第6天使用GuavaViaCount测定进行活细胞计数。
在培养细胞之前，96孔组织培养板的各孔未经处理或用含1％HSA的PBS在4℃下封闭过夜。在培养细胞之前用PBS洗涤各孔。HSA将防止抗体复合物固定到组织培养塑料上，从而确保刺激由悬浮液中的可溶性TAC介导。
Figure BDA0001252993150000131
人活化剂CD3/CD28珠粒(样品5号和10号)不受孔预处理的影响并且诱导高水平的CD4+ T细胞增殖和CD8+ T细胞增殖。当
Figure BDA0001252993150000132
用于T细胞扩增时，各板处理样之间的第6天总存活细胞类似。单独的CD3TAC不足以诱导T细胞扩增(样品2号和6号)；而当不处理孔时(样品3号)，CD3和CD28单特异性TAC的组合可以诱导高水平的T细胞增殖。与具有相同刺激的未处理孔相比较时，当在1％HSA封闭的孔(样品8号)中使用CD3和CD28TAC时，T细胞的增殖显著下降，并且第6天的总活细胞从1.09E6降低至2.46E5个细胞。相比之下，类似于
Figure BDA0001252993150000135
人T活化剂CD3/CD28珠粒，CD3、CD28和CD2单特异性TAC的组合受到用HSA封闭孔的影响最小(样品4号和9号)。总的来说，这些数据表明，CD3和CD28单特异性TAC的板固定影响其在活化T细胞方面的有效性。然而，如果使用CD3、CD28和CD2单特异性TAC的组合来刺激T细胞，则此以可溶性方式与板固定和单特异性TAC功能无关地发生。
Figure BDA0001252993150000133
人T活化剂CD3/CD28珠粒也不受板预处理的影响，因为抗CD3抗体和抗CD28抗体固定在珠粒表面上。
实施例3
可溶性单特异性CD3、CD28和CD2 TAC能够诱导T细胞产生细胞因子(图3)。将RosetteSepTM富集的人T细胞在可溶性单特异性TAC构建体的各种组合或
Figure BDA0001252993150000141
人T活化剂CD3/CD28珠粒的存在下培养4小时(图3)。将布雷菲德菌素A(Brefeldin A)加入到培养物中以允许细胞内细胞因子积累，并在培养后用流式细胞术进行评估。收获培养物，并在固定和透化后对细胞表面标记物和细胞内细胞因子染色。
结果表明，在刺激4小时后，单独的CD3 TAC不诱导T细胞中的IL-2或IFNγ细胞因子产生(样品1号)。CD3和CD28 TAC的组合分别诱导2.4％的CD4+ T细胞和2.45％的CD8+ T细胞产生IL-2(样品2号)。CD3和CD28 TAC还诱导0.5％的CD4+ T细胞和1.0％的CD8+ T细胞产生IFNγ。与单独的CD3和CD28 TAC相比，CD3、CD28和CD2单特异性TAC的组合诱导T细胞产生更高水平的IL-2和IFNγ(样品3号)。
Figure BDA0001252993150000142
人T活化剂CD3/CD28珠粒诱导与CD3、CD28和CD2的组合相似的IL-2水平，但诱导更高水平的IFNγ(样品4号)。总的来说，这些结果表明，与单独的CD3和CD28 TAC相比，CD3、CD28和CD2单特异性TAC的组合能够诱导CD4+ T细胞和CD8+ T细胞产生更高水平的细胞因子；而
Figure BDA0001252993150000143
人T活化剂CD3/CD28珠粒诱导更高水平的IFNγ。IL-2有助于诱导T细胞增殖和分化，而IFNγ是参与诱导抗病毒免疫应答的效应细胞因子。
实施例4
在21天的时期中，CD3、CD28和CD2单特异性TAC刺激的T细胞与
Figure BDA0001252993150000144
人T活化剂CD3/CD28珠粒刺激的T细胞相比的代表性图像(10倍和20倍放大)(图4)。将EasySepTM富集的人T细胞与
Figure BDA0001252993150000145
人T活化剂CD3/CD28珠粒以1∶1的珠粒比细胞比率，或与0.5ug/mL最终的CD3、CD28和CD2单特异性TAC在30U/mL重组人IL-2的存在下培养。监测培养物中的细胞生长，并将细胞浓度维持在0.5-2×10E6个细胞/mL。在培养的第7天和第17天用
Figure BDA0001252993150000151
人T活化剂CD3/CD28珠粒或单特异性CD3、CD28和CD2 TAC再刺激T细胞。
Figure BDA0001252993150000152
人T活化剂CD3/CD28珠粒和单特异性CD3、CD28和CD2 TAC刺激的培养物诱导相似的T细胞增殖和扩增特征。可以在培养物中清楚地看到
Figure BDA0001252993150000153
人T活化剂CD3/CD28珠粒中所使用的4.5um珠粒。与
Figure BDA0001252993150000154
人T活化剂CD3/CD28珠粒相比，TAC刺激的培养物不需要因为细胞大小的珠粒可干扰下游分析(诸如流式细胞术)而在任何下游功能测定之前去除珠粒。
实施例5
与CD3、CD28和CD2单特异性TAC相比，使用
Figure BDA0001252993150000155
人T活化剂CD3/CD28珠粒长期培养和扩增人T细胞(图5)。将1×10E6个EasySepTM富集的人T细胞与
Figure BDA0001252993150000156
人T活化剂CD3/CD28珠粒以1∶1的珠粒比细胞比率，或与0.5ug/mL最终的CD3、CD28和CD2单特异性TAC在30U/mL重组人IL-2的存在下培养。监测培养物中的细胞生长，并将细胞浓度维持在0.5-2×10E6个细胞/mL。在培养的第7天和第17天用
Figure BDA0001252993150000157
人T活化剂CD3/CD28珠粒或单特异性CD3、CD28和CD2 TAC刺激T细胞，并按固定间隔时间用新鲜培养基替换培养基。
在第0天，将1×10E6个EasySepTM富集的T细胞接种到24孔组织培养板中并用
Figure BDA0001252993150000158
人T活化剂CD3/CD28珠粒或单特异性CD3、CD28和CD2 TAC刺激。在指定的时间点使用台盼蓝、用血细胞计数器计数总细胞和活细胞。结果表明，TAC刺激的培养物导致培养21天后的总T细胞扩增和存活的T细胞增加。
实施例6
使用EasySep人NK细胞分离试剂盒(STEMCELL技术公司，产品目录号17955)、通过阴性富集来分离人NK细胞。将分离的NK细胞(CD45+ CD3- CD56+)在补充有500IU/mL重组人IL-2的无血清和无异源ImmunoCult-XF培养基(STEMCELL技术公司，产品目录号10981)中以1x106个细胞/mL的细胞密度培养。NK细胞不接受附加刺激(无刺激)或用每种抗体的最终浓度为0.5ug/mL的CD335/CD2单特异性TAC复合物刺激。在第3天、第6天、第8天、第10天和第13天，使用体细胞计数器(Nucelocounter)计数总存活细胞，并用流式细胞术评估NK细胞纯度。通过加入补充有500IU/mL IL-2的新鲜ImmunoCult-XF培养基将培养物维持在约1×10^6个细胞/毫升。
如图6A所示，使用EasySep分离并在补充有IL-2的ImmunoCult-XF培养基中维持的NK细胞从第0天至第6天的纯度从84.5％增加到94％，而与它们是否接受任何附加刺激无关。将NK细胞的纯度维持在相似水平，直到培养的第13天。
如图6B所示，用单特异性CD335/CD2 TAC复合物刺激的NK细胞在第8天和第10天之间细胞数目增加，并持续到第13天，在第13天的时间点在CD335/CD2刺激的培养物中的NK细胞的数目增加了1.72倍。
虽然已经参照目前被认为是优选实施例的内容描述了本公开，但是应当理解本公开不限于所公开的实施例。相反，本公开旨在覆盖包括在所附权利要求书的精神和范围内的各种修改和等效布置。
所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被特定地和单独地指示为通过引用整体并入。
在说明书中提及的参考文献的完整引文
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Claims (16)

1.一种活化T细胞或NK细胞的方法，所述方法包括用包含至少一种可溶性单特异性复合物的组合物培养含有T细胞或NK细胞的样品，其中每种可溶性单特异性复合物包含两个结合蛋白，所述两个结合蛋白连接并结合至所述T细胞或所述NK细胞上的相同抗原，以及其中第一可溶性单特异性复合物的每个结合蛋白结合至所述T细胞或NK细胞上的第一抗原并且所述T细胞上的第一抗原是CD3以及所述NK细胞上的第一抗原是CD335。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含至少两种不同的单特异性抗体复合物，其中第二单特异性抗体复合物的每个结合蛋白结合至所述T细胞或NK细胞上的第二抗原。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物包含至少三种不同的单特异性抗体复合物，其中第三单特异性抗体复合物的每个结合蛋白结合至所述T细胞或NK细胞上的第三抗原。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述结合蛋白是抗体或其片段。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述可溶性单特异性复合物是四聚抗体复合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述四聚抗体复合物(TAC)由来自第一物种的两个抗体与来自第二物种的两个抗体分子结合构成，所述第二物种的所述两个抗体分子结合至所述第一动物物种的所述抗体的Fc部分。
7.根据权利要求2所述的方法，其中用于活化所述T细胞，所述第二抗原是CD28。
8.根据权利要求3所述的方法，其中用于活化所述T细胞，所述第三抗原是CD2。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述T细胞活化是增强的T细胞增殖。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述T细胞活化是增强的细胞因子产生。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述T细胞活化是增强的T细胞扩增。
12.根据权利要求2所述的方法，其中用于活化所述NK细胞，所述第二抗原是CD2。
13.根据权利要求1至3或12中任一项所述的方法，其中所述NK细胞活化是增强的NK细胞增殖。
14.根据权利要求1至3或12中任一项所述的方法，其中所述NK细胞活化是增强的细胞因子产生。
15.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述NK细胞活化是增强的NK细胞扩增。
16.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述T细胞或NK细胞是人的。
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