NL8204857A - Aminopropylaminobleomycinederivaten en werkwijze voor de bereiding daarvan. - Google Patents

Description

* '► - 1 - *Y r ----* : *

Aminopropylaminobleomycinederivaten en werkwijze voor de bereiding daarvan.

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe aminopropylaminobleomycinederi va ten.

Bleomycine is een familie van antibiotische stofr fen met antitumorwerking die in 1966 ontdekt is door Umezawa, 5 één van de huidige uitvinders, en medewerkers/J. of Antibiotics, 19A, blz.200 (1966]_7«Het wordt gevormd door Streptomyces verticillus , een Actinomyceet, en is een basisch, wateroplosbaar glycopeptide dat in staat is om één atoom tweewaardig koper gemakkelijk te cheleren.Bij gewone kweek worden 16 leden 10 van de bleomycine familie gevormd en worden ieder geïsoleerd /b.v. Umezawa c.s., J. of Antibiotics, 19A, blz.210 (1966j.7· Verschillende bleomycinen worden ook vermeld in Amerikaans Oc-trooischrift Nr.3.922.262 en Amerikaans Octrooischrift Nr.Re 30.451.Wegens hun uitgesproken antitumorwerking ondanks enkele 15 ongewenste nevenwerkingen zoals giftigheid voor de longen, zijn bleomycinen reeds op grote schaal gebruikt op klinische gebieden van kankertherapie; ze worden in het bijzonder met goed gevolg gebruikt bij de behandeling van geschubde cel carcinomen als hoofddoel, huidkanker, hoofd en nek kanker, long 20 kanker en kwaadaardige lymfomen.Het is echter nog wenselijk, dat bleomycinen verder verbeterd worden wat betreft antitumor werking en verminderde nevenwerkingen, in het bijzonder giftigheid voor de longen.

De onderhavige uitvinders hebben aandacht besteed 25 aan het feit dat aminopropyl-N-methylaminopropylaminobleomyci-ne (afgekort APMP) de groei van HeLa cellen sterk belemmert en hebben een uitvoerige studie gemaakt om de giftigheid voor de longen van APMP te verminderen.Deze uitvinding berust op de vinding, dat het mogelijk is om de giftigheid voor de longen 30 aanmerkelijk te verminderen door chemische modificatie van de eindstandige aminogroep van APMP met verschillende gesubstitueerde alkylgroepen.

De nieuwe aminopropylaminobleomycine derivaten volgens de uitvinding omvatten zowel de koperbevattende vorm als 35 de kopervrije vorm en worden weergegeven door de algemene formule /BX/rNH-(CH2)3-A-(CH2)3-B (1) 82Ü4857 j » i - 2 - waarin /BX/een groep is die gevormd is door de verwijdering van de hydroxygroep uit de carbonylgroep van bleomycinezuur en wordt weergegeven door de formule CONH, NH, I · I 2 ch, nh ch \V \/ \ f CH CH, CONH, 11 ,12 C- n^n ch, h o / I ij i 3 , « / L JL n HO .CH N. C N-jj

o \e ''o' CH NH

CH 1 11 i . » 1 i ΓΊ 3 /C\ /C\ 0 /CH\ °Ν; H CH N CH, HO CH, CH, ö a | I 3 32

CH H

/

Η 0 π-N

/\ /\ hoch2 O X h h

OH

H Cv 0 I I c.

OH H / ^0^ CH20H

H H

Η 1 OH

\ |\ / c I c J 0 1

HÓ | H

/\ O nh2 (koper is weggelaten in het geval van de koperbevattende vorm); 5 A stelt een groep voor met de formule R-, __ R, R.

i1 /—\ l1 tl -N- , -N N- , of -N-R-N- , waarin R.^ een korte keten alkyl (R2)n R2 R2 of benzylgroep is, R2 een korte keten alkyl of benzylgroep is, R een korte keten alkyleengroep is, en n gelijk is aan 0 of 1; en B een groep voorstelt met de formule R^ , waarin -n-R3 10 R^ en R^ ieder (1) een waterstofatoom, of (2) een alkylgroep 8204857 - 3 - •ί ' " die gesubstitueerd kan zijn door één of meer fenyl, naftyl, anthranyl, furyl, thiofeen, norbomeen, of cycloalkylgroepen ^deze suhstitutiegroepen kunnen verder gesubstitueerd zijn door één of meer halogeenatomen of korte keten alkyl, korte 5 keten alkoxy, cyaan, halogeenmethyl, of benzyloxygroepen (de benzyloxygroep kan gesubstitueerd zijn door één of meer halogeen atomen of korte keten alkoxy, benzyloxy of cycloalkyl-methyloxygroepen)^7 zijn, vooropgesteld, dat tenminste êên van de groepen R3 en R^ een andere groep is dan een waterstof-10 atoom.

Als voorbeelden voor de korte keten alkylgroepen kunnen worden genoemd methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl en isobutyl; voor de halogenen fluor, chloor en broom; voor de korte keten alkyleengroepen ethyleen, trimethyleen, 15 tetramethyleen, pentamethyleen en hexamethyleen; voor de cycloalkylgroepen cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, cyclodecanyl, cycloundecanyl, cyclododecanyl en cyclotrideca-nyl; voor de korte keten alkoxygroepen methoxy, ethoxy, pro-poxy en butoxy; en voor de halogeenmethylgroepen trifloorme-20 thyl en trichloormethyl.

Voorbeelden in de bovengenoemde A van ?1 ?H3 ?2H5 ?2H4C6H5 -Ijjf- zijn -N- , -N- , en -N- als n * 0, en <R2>n iH3 ?2H5 ?A «3 -N- , -N- , -N- en -N- als n = 0.Voorbeelden van i t i i ch3 c2h5 c4h9 ch2c6h5 R. R. CH, CH, 11 11 I 3 1 3 -N-R-N- omvatten -N- (CH~) -,-N- .

I i , 2 3 i r2 r2 ch3 ch3 25 Als voorbeelden van die verbindingen weergegeven door de algemene formule 1, die gewenst zijn vanuit het oogpunt van farmakologische werking, kunnen die verbindingen worden genoemd waarin A een groep CHo CH- R, /~\ I 3 I 3 I1 -N N-, -N-(CH0),-N- of -N- Is, waarin R. een korte keten \_/ | 2 J I | ^3 CH3 <R2>n 30 alkylgroep is, R2 een korte keten alkyl of benzylgroep is, en n gelijk is aan 0 of 1; R3 en R4 van B ieder (l) een water- 8204857 - 4 - f. ft stofatoom, (2) benzyl, die gesubstitueerd kan zijn door ëên of meer halogeenatomen of benzyloxy, cyaan, halogeenmethyl, halo-geenbenzyloxy, (korte keten)alkoxybenzyloxy, of cycloalkyl-methoxygroepen, (3) naftylmethyl, (4) een halogeenfenylethyl, 5 of (5) een korte keten alkyl, gesubstitueerd door een cyclo-alkyl met 8-13 koolstofatomen, zijn, vooropgesteld dat tenminste één van beide groepen R3 en een andere groep dan een waterstofatoom is.

Voorbeelden van representatieve verbindingen vol-10 gens deze uitvinding zijn weergegeven in Tabel A.

Tabel A

Verbinding Naam van verbinding Afkorting nr._ 1 3-{N-Methyl-N-/3'-(2"-p-chloorfenyl-

15 ethylamino)propyl?-amino}propylamino MCLPE

_BLM__ 2 3-{N-Methyl-N-/3'- (2''-fenylethylamino)

_propyl7amino}propylaminoBLM_MPE

3 3—(N-Methyl-N-/3'-(benzylamino) propyl? 20 _______amino) propy lamino BLM_MBZ_ 4 3-{N-Methyl-N-/3'-(p-chl00rbenzylamino) __propyl?aminoi propylaminoBLM_MCLBZ (p) 5 3- (N-Methyl-N-/3'-(m-chloorbenzylamino) __propy 1?amino}propylaminoBLM_MCLBZ (m) 25 6 3-{N-Methyl-N-/ 3'-(o-chloorbenzylamino) ____propyl?amino3propylaminoBLM_MCLBZ (o)

7 3-(N-Methyl-N-/3(m,p-dichloorbenzyl- MDCLBZ

(in p) _amino)propyl/amino^propylaminoBIil -_ '-

8 3-{N-Methyl-N-/3'-(o,p-dichloorbenzyl- MDCLBZ

_ (op) 30 ______amino) propyl? amino ) propy lamino BLM_' p 9 3-{N-Methyl-N-/3'-(p-fluorbenzylamino) MFBZ (p) _propyl?amino)propylaminoBLM_ 10 3-{N-Methyl-N-/3'-(p-broombenzylamino) MBRBZ(p) _propyl?amino}propylaminoBLM_

35 11 3-{N-Methyl-N-/3'-(pentafluorbenzyl- MPFBZ

_amino)propyl?amino3propylaminoBLM_

12 3-{N-Methyl-N-/3(p-methoxybenzylamino) MMOBZ

_propyl?amino}propylaminoBLM_^_

13 3-{N-Methyl-N-/3'-(o,p-dimethoxybenzyl- MDMOBZ

- (o, p) _amino) propy 1/amino jrpropylaminoBLM_ 8204857 - 5 - *' .....*

Tabel A (vervolg)

Verbinding ~ Naam van verbinding Afkorting nr. _ 14 3-{N-Methyl-N-/3'-(l"-p-chloorfenyl- MCLAPE (p) 5 _ethylamino)propyl7amlno}propylaminoBLM_

15 3-{N-Methyl-N-/3'- (m,p-dibenzyloxybenz;~ MDBZOBZ

_ylamino)propyl7amino3propylaminoBLM

16 3-(N-Methyl-N-/3'-(3"-fenylpropylamino) MPP

_propyl7amino>propylaminoBLM

10 17 3- {N-Methy1-N-/3'-(2",2'-di fenylethy1- MDPE

amlno) propyl7amino)propylaminoBLM_ ______

18 3-(N-Methy-l-N-/3'-(p-cyaanbenzylamino) MCNBZ

_propyl7amino3 propylaminoBLM_

19 3-{N-Methyl-N-/3'-(m-trifluormethylbenz- MTFBZ

15 _y lamlno) propy l7amlno 3 propy laminoBLM_^

20 3- f N-Methy 1-N- /3'-(sC-naftylmêthylamino) - KNAPH

__propyl? amino3rpropylaminoBLM_

21 3-{N-Methyl-N-/3'-(9-anthramethylamino) MANTRA

_ p ropy l7 amlno )p ropy laminoBLM__

20 22 3-{N-Methyl-N-/3'-(cyclooctylmethylamino) MCO

_propyl7amino?propylaminoBLM_

23 3-{N-Methyl-N-/3'-(dibenzylmethylamino) MDBZME

_propyl7amino fpropylaminoBLM_

24 3-^N-Methy 1-N-/3'-(l"-fenylethylaroino) MAPE

25 _propy l7amino) propy laminoBLM_

25 3-{N-Methy1-N-/3'-(2"-furylmethylamino) MFUR

__propy1/amino) propy laminoBLM_

26 3-{N-Methy1-N-/3'-(2"-thienylmethylamino) MTHIO

_ propy l7amino)propy laminoBLM__

30 27 3-{N-Methyl-N-/3'-(dibenzylamino) MDBZ

_propy1/aminolpropylaminoBLM_

28 3- (N-Methyl-N-/3'-(cyclopentylmethyl- MCP

_amino) propy 1/amino) propyl aminoBLM______

29 3-{N-Methyl-N-/3'-(cyclohexylmethyl- MCHM

35 _- amin?)prppy^amino3Eropy.laminoBLM__

30 S-iN-Methyl-N-Z^'-icyclohexylethylamino) MCHE

_propyl7amino3propylaminoBLM_

31 3-{N-Methyl-N-/3'-(cycloheptylmethyl- MCHEP

_amino)propyl7aminoypropylaminoBLM_ 8204857 I l - 6 -

Tabel A(vervolg)

Verbinding Naam van verbinding Afkorting nr. _

32 3-£N-Methyl-N-/3'-(cycloundecanylmethyl- MCU

5 _amino) propyl7aminolpropylaminoBLM_

33 3—£N-Methyl-N-/3'- (5"-norborneen-2-methyl- MNB

_amino)propyl?amino! propylaminoBLM_ 34 3—[N-Methyl-N-/3(di(mfp-dibenzyloxy- MDDBZOBZ' _benzyl)amino)propyl?aminolpropylaminoBLM_

10 35 3-iNfN-Dimethyl-N-/3l-(dibenzylamino) MMDBZ

_propyl?amino}propylaminoBLM_

36 S-iN/N-Dimethyl-N-/:!)(cyclooctylmethyl- MMCO

_amino)propyl?aminoipropylaminoBLM_

37 B-iN/N-Diethyl-N-/!'-(dibenzylamino) EEDBZ

15 _propyl/amincfr propylaminoBLM_

38 3-{N,N-Dibutyl-N-/3'-(dibenzylamino) BBDBZ

_propyl?amino}propylaminoBLM_

39 3-{N-Methyl-N-benzyl-N-/3'-(dibenzyl- MTBZ

_amino)propyl?amino3propylaminoBLM_

20 40 3-{N-Benzyl-N-/3'-(dibenzylamino) ATBZ

_propyl? amino )propylaminoBLM__

41 3—{N,N-Dimethyl-N-/31-(N,N-dimethyl- PPDBZ

-N-(3"-dibenzylaminopropyl)amino) _propyl?amino}propylaminoBLM__

25 42 3-^N,N-Dimethyl-N-/31 -(Ν,Ν-dimethyl- PPCO

-N-(3"-cyclooctylmethylaminopropyl) _amino)propyl?aminoypropylaminoBLM_

43 3-/4(3"-dibenzylaminopropyl)- PYDBZ

_üiperidyl?propylaminoBLM_

30 44 3-/4'-(3"-Chloorbenzylaminopropyl)- PYCLBZ

_piperidyl?propylaminoBLM ________

45 3-/4(3"-Cyclooctylmethylamino- PYCO

_propyl)piperidyl?propylaminoBLM_

46 3-{N,N-Diethyl-N-/3' - (2''-p-chloorfenyl- EECLPE

35 _ethylamino) propyl?amino)propylaminoBLM_

47 3-(N-Methyl-N-/3'-(cyclotridecanylmethyl- MCT

_amino)propyl?amino3propylaminoBLM_

48 3-(N-Methyl-N-/3'-(di(3",4"-di(p-chloor- MDDCL

benzyloxy) benzyl) amin(^propyl?amino3rpropyl- 40 _aminoBLM_ 8204857 - 7 -

Tabel A(vervolg)

Verbinding Naam van verbinding Afkorting nr._;_____

49 3^N-Methyl-N-/3,-(di(3",4"-di(m/p-di- MDDCL

5 chloorbenzyloxy)benzyl) amino)propyl? ___amino SpropylaminoBLM____

50 3-{N-Methyl-N-/3’-(di (3",4"-di(p- MDDMO

me thoxybenzyloxy) benzyl) amin<ipropyl7 _ amlnoirpropylamlnoBLM_______

10 51 3-(N-Methyl-N-/3'-(di(4”-(p-benzyloxy) MDBZOBZOBZ

benzyloxy)benzyl)amino)propyl? _aminojpropylaminoBLM________

52 3-^N-Methyl-N-/3'-(di(p-cyclooctyl- MDCDBZ

methyloxybenzyl)amino)propyl? 15 _amino) propylaminoBLM_______

53 3-(N-Methyl-N-/31 - (di (3", 4" , 5tri- MDTBZOBZ

benzyloxybenzyl) amino)propyl? _ amino jpropylamino BLM ______

Noot: "BLM" staat voor bleomycine.

20* Van deze verbindingen gaat de voorkeur uit naar de verbindingen nrs. 7, 15, -18, 19, 20, 22, 32, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 en 53, in het bijzonder 32, 34 en 43.

De verbindingen volgens deze uitvinding als weer-25 gegegeven door de algemene formule 1 worden op de hieronder aangegeven wijze bereid.

De onderhavige verbinding met formule 1 wordt verkregen door een aminopropylaminobleomycine met de formule /B3?-nh-(ch2)3-a-(ch2)3-nh2 (2) 30 waarin /BX? enA de bovenstaande betekenis hebben, reduktief te laten kondenseren met een carbonylverbinding met de formule R5-CO-R6 (3) waarin R^ en Rg ieder (1) een waterstofatoom, (2) een cyclo-alkylgroep, (3) een alkylgroep, die gesubstitueerd kan zijn 35 door êên of meer cycloalkyl of fenylgroepen(de fenylgroep kan gesubstitueerd zijn door een halogeenatoom), (4) een fenylgroep, die gesubstitueerd kan zijn door êén of meer halogeen-atomen of korte keten alkyl, cycloalkylmethyloxy, korte keten alkoxy, benzyloxy, cyaan, halogeenmethyl, halogeenbenzyloxy, 8204857 , i - 8 - (korte keten)alkoxybenzyloxy, of benzyloxybenzyloxygroepen, (5) naftyl, (6) thiofeen, (7) furyl, (8) anthranyl, of nor-borneen zijn; vooropgesteld dat tenminste één van beide en Rg een andere groep dan een waterstofatoom is.

5 De reduktiemiddelen die gebruikt worden bij de kondensatie zijn onder meer boorhydride verbindingen zoals natriumcyaanboorhydride.De kondensatie kan ook worden tot stand gebracht door de katalytische hydrogenering met gebruik van een katalysator zoals palladium-koolstof.De hoeveelheid 10 carbonylverbinding die gebruikt wordt varieert afhankelijk van de aard van het beoogde produkt en kan niet zonder meer algemeen worden gesteld, maar ligt in grote lijnen in het trajekt van 0,5 tot 25, gewoonlijk van 0,7 tot 20 mol per mol verbinding met formule 2.Een derivaat waarin R^ een waterstofatoom 15 is wordt voornamelijk verkregen door 1 tot 1,5 mol van de carbonylverbinding te gebruiken, terwijl een derivaat waarin R^ en R^ dezelfde groep zijn wordt verkregen als 10 mol ervan worden gebruikt.Als het de bedoeling is een derivaat te verkrijgen, waarin R , R^ en R4 dezelfde groep zijn (b.v. verbin-20 ding nr.40), worden 15 mol carbonylverbinding gebruikt.Als de verbinding met formule 3 moeilijk oplosbaar is in methanol, zoals het geval is voor b.v. m,p-dibenzyloxybenzaldehyde, kan de hoeveelheid daarvan worden verminderd door de reaktieduur te verlengen.De kondensatie wordt uitgevoerd in een oplosmid-25 del zoals methanol, water, dimethylformamide, acetonitril, of ·. een mengsel daarvan.De reaktietemperatuur, ofschoon afhankelijk van de aard van het beoogde produkt, is in het algemeen -5° tot 70°C, bij voorkeur 0° tot 50°C.Deze is 0° tot 25°C als R^ van het beoogde derivaat waterstof is, terwijl een hogere 30 temperatuur, zoals 35° tot 50°C de voorkeur geniet als gebruik wordt gemaakt van een keton of een aldehyde waarin R^ en R^ hetzelfde zijn en een hoge sterische hindering geven, of een aldehyde met geringe oplosbaarheid.De reaktieduur bedraagt 3 tot 70 uur.Een langere reaktieduur is gunstig voor de konden-35 satie als een aldehyde met hoge sterische hindering of met geringe oplosbaarheid wordt gebruikt.

Het isoleren van het op bovenbeschreven wijze verkregen onderhavige derivaat wordt op de onderstaande manier uitgevoerd.

40 Als een boorhydrideverbinding gebruikt wordt als 8204857 <r ( .-9- het reduktiemiddel, wordt het reaktiemengsel ingesteld op pH 1 met zoutzuur, 5 tot 10 min. geroerd bij kamertemperatuur om de overmaat reduktiemiddel te ontleden, dan geneutraliseerd, ontdaan van methanol door destillatie bij verlaagde druk, en 5 geëxtraheerd met ether of butanol om overmaat aldehyde of ke-ton te verwijderen.De waterige laag wordt ontzout door deze te voeren door een kolom die gepakt is met een adsorberende hars, zoals b.v. Amberlite® XAD-2 (Rohm en Haas Co.) in gedestilleerd water om adsorptie van het beoogde produkt op de 10 hars tot stand te brengen.Na wassen van de kolom met gedestilleerd water om het zout uit te wassen, wordt de geadsorbeerde fase geëlueerd met een zuur waterig methanol, zoals b.v. een 1/50 n waterig zoutzuur-methanol(1:4 op vol.basis) mengsel om de eluaatfrakties, die een blauw bleomycinederi-15 vaat bevatten, te verzamelen.De gekombineerde fraktie wordt zo nodig geneutraliseerd met Dowe^ 44 (een OH-type anion ultwisselingshars van Dow Chemical Co.), daarna onder verlaagde druk geconcentreerd, en gelyofiliseerd, waardoor een ruw blauw poeder van het beoogde derivaat wordt verkregen.

20 Teneinde de zuiverheid te verhogen wordt het ruwe poeder op de volgende wijze behandeld.

Een oplossing van het ruwe poeder in-gèdestilleerd water wordt door een kolom gevoerd, die gepakt is met CM-Sephade^ C-25 (Na+ type; Pharmacia Fine Chemicals Co.), die 25 in evenwicht is gebracht met een 1/20 molaire azijnzuur-natriumacetaat bufferoplossing met pH 4,5, om adsorptie van het beoogde produkt op de hars tot stand te brengen.De geadsorbeerde fase wordt dan geëlueerd met de lineaire concentratie gradiënt techniek, die wordt uitgevoerd door kontinu na-30 triumchloride aan bovengenoemde bufferoplossing toe te voegen om de natriumchlorideconcentratie geleidelijk te verhogen tot 1,0 molair.Als blijkt, dat de eluaatfrakties, die het beoogde produkt bevatten, nog door onzuiverheden verontreinigd zijn, wordt de bovenvermelde chromatografie gevolgd door een 35 andere chromatografie met gebruik van een adsorberende hars, (r) zoals b.v. Amberlite0^ XAD-2, die wordt uitgevoerd door een oplossing van ruwe stof in gedestilleerd water te voeren door een kolom die gepakt is met de hars in een bufferoplossing, zoals b.v. een 4%-ige waterige ammoniumacetaatoplossing, om 40 adsorptie van het beoogde produkt op de hars tot stand te 8204857 - 10 - brengen, en de geadsorbeerde fase wordt geëlueerd met de lineaire concentratiegradient methode, die wordt uitgevoerd door kontinu methanol aan de bufferoplossing toe te voegen om de methanolconcentratie geleidelijk te verhogen.In dit geval 5 is het eluaatkenmerk zodanig, dat de niet-gereageerde uitgangsmaterialen het eerst worden geëlueerd, daarna gevolgd door een derivaat, waarin waterstof is, en tenslotte door een derivaat waarin R^ en R^ dezelfde groep zijn.De scheiding van de frakties is mogelijk door een u.v. monitor te gebrui-10 ken.Als de beoogde fraktie toch nog de onzuiverheden zou bevatten, dient de bovenstaande chromatografie te worden herhaald om volledige verwijdering tot stand te brengen.

De gekombineerde fraktie, die het beoogde produkt bevat wordt door destillatie onder verlaagde druk ontdaan van 15 methanol, ontzout door gebruik van Amberlite^ XAD-2 en gely-ofiliseerd waardoor een blauw amorf poeder van een koperbevat-tend aminopropylaminobleomycine derivaat wordt verkregen.De kopervrije vorm wordt verkregen door het koper ui de koper-be-vattende vorm te verwijderen met een bekende methode, zoals 20 de methode met gebruik van EDTA(Japanse Octrooipublikatie Nr. 31.875/77; Amerikaans Octrooischrift Nr. 3.929.993).Een voorbeeld van de methode voor het verwijderen van koper wordt hieronder beschreven.

Het koperbevattende produkt wordt opgelost in ge-25 destilleerd water en de verkregen oplossing wordt door een kolom, die gepakt is met Amberlite^ XAD-2 in gedestilleerd water, gevoerd om adsorptie van het beoogde produkt tot stand te brengen.De harskolom wordt dan gewassen met een waterige oplossing, die natriumchloride en 5% dinatriumzout van ethyl-30 eendiaminetetraasijnzuur (kortweg EDTA.2Na) om het koper-ion met EDTA.2Na af te voeren, waardoor het kopervrije aminopropylaminobleomycine geadsorbeerd op de hars achterbiljft.De hars wordt gewassen met een natriumchlorideoplossing om EDTA.2Na te verwijderen, daarna met gedestilleerd water en 35 tenslotte geëlueerd met een zuur waterig methanol, zoals b.v. een 1/50 n waterig zoutzuur-methanol (1:4 op vol.basis) mengsel om de frakties te verzamelen die een absorptiemaximum hebben bij 290 urn.De gekombineerde fraktie wordt ingesteld op pH 6,0 met Dowex'0' 44 (OH-type;Dow Chemical Co.), onder ver-40 laagde druk geconcentreerd, en gelyofiliseerd waardoor een 8204857 - η - wit amorf poeder wordt verkregen van een aminopropylamino-bleomycine in de vorm van een kopervrij hydrochloride.Als een waterig zwavelzuur wordt gebruikt in plaats van het waterige zoutzuur, wordt een sulfaat verkregen.Het is zo mogelijk om 5 een gewenst zout te verkrijgen door keuze van het zuur dat gebruikt wordt in de elutietrap.

Bij hydrolyse met 6 n waterig zoutzuur bij 105°C gedurende 20 uur gaf het als boven beschreven bereide amino-propylaminobleomycinederivaat de ontledingsprodukten, die 10 gebruikelijk zijn voor bleomycinen, met inbegrip van L-threo-nine, ^-amino-3-(4-amino-6-carboxy-5-methylpyrimidin-2-yl)-propionzuur, 4-amino-3-hydroxy-2-methyl-n-pentaanzuur,$ -hy-droxy-L-histidine, /J-amino-L-alanine en 2'-(2-aminoethyl)- 2,4,-dithiazool-4-carbonzuur, naast amine verbindingen.Ander-15 zijds leverde bij de methanolyse met Amberlist 15 het amino-propylaminobleomycinederivaat, zoals in het geval van bleo-mycine, L-gulose en methylglucoside van 3-0-carbamoyl-D-man-nose, zoals vastgesteld met gaschromatografie.De bovenstaande feiten ondersteunen, dat de chemische struktuur van het 20 aminopropylaminobleomycinederivaat, bereid met de werkwijze volgens de uitvinding is als weergegeven in de bovengenoemde algemene formule 1.

Als de verbindingen met formule 2, die een uitgangsmateriaal zijn voor de synthese van de onderhavige bleo-25 mycinederivaten kunnen worden genoemd (1) 3-/N-(3-aminopro-pyl)amino7propylaminobleomycine (APP), (2) 3-/N-(3-aminopro-pyl)-N-methylamino7propylaminobleomycine (APMP), (3) 3-/N--(3-aminopropylj-N,N-dimethylamino7propylaminobleomycine (MMHH), (4) 3-/N-(3-aminopropyl)-N,N,diethylaming7propyl-30 aminobleomycine (EEHH), (5) 3-/N-(3-aminopropyl)-N,N-dibutyl-aming7propylaminobleomycine(BBHH), (6) 3-{N-/3(Ν'-(3-amino-propyU-N'fN'-dimethylaminoJpropylaminobleomycine (PP4M), (7) 3-/4-(3-aminopropyl)piperazin-l-yl7propylaminobleomycine (PY), en (8) 3-/N-(3-aminopropyl)-N-methyl-N-benzylamino7 35 propylaminobleomycine (MBZHH) (de letters tussen haakjes zijn afkortingen).Deze verbindingen worden gesynthetiseerd door (1) bleomycinezuur te kondenseren met een verbinding weergegeven door de algemene formule (4) NH2-(CH2)3-A-(CH2)3-NH2 (4) 40 waarin A de eerder gedefinieerde betekenis heeft, op een 8204857 3 - 12 - wijze die overeenkomt met die in een bekende methode/b.v. een methode beschreven in de ter inzage gelegde Japanse Octrooiaanvrage nr.63.089/79; Amerikaans Octrooischrift 4.195.0187 of door (2) een bleomycine leverende stam van Streptomyces 5 verticillus zoals b.v. Streptomyces verticillus NK-68-144 (ATCC 31307) zoals beschreven in Amerikaans Octrooischrift Nr. Re 30.451, te kweken in aanwezigheid van een amine met formule 4.Voorbeelden van verbindingen weergegeven door formule 4 zijn onder meer (1) di(3-aminopropyl)amine, (2) di(3-10 aminopropyDmethylamine, (3) di(3-aminopropyl)dimethylammo-niumzout, (4) di(3-aminopropyl)diethylammoniumzout, (5) di(3-aminopropyl)dibutylammoniumzout, (6) 1,3/di(3-amino-propyl)dimethylamino7propaan, (7) 1,4-/di(3-aminopropyll7~ piperazine, en (8) di(3-aminopropyl)(methyl)benzylammonium-15 zout.

Onder de verbindingen met formule 4 zijn die verbindingen als weergegeven door de volgende algemene 4a of 4b nieuwe verbindingen die voor het eerst door de uitvinders in deze zijn gesynthetiseerd: 20 R0 1 2 NH2-(CH2)3-N-(CH2)3-NH2 (4a) R2 h R1 NH--(CH,),-N-R-N-(CH_),-NH, (4b) R2 R2 waarin R·^, R2 en R kovenstaande betekenis hebben.Deze verbindingen worden b.v. met de volgende methoden bereid.

25 Een verbinding met formule 4a waarin R^^ en R2 de zelfde groep zijn, wordt bereid door een 3-aminopropyl-N,N-dialkylamine, weergegeven door de algemene formule NH2-(CH2)3-N-R2 (5) waarin R^ en R2 dezelfde groep zijn en zoals boven gedefini-30 eerd zijn) te laten reageren met 1,5 equivalenten benzoylchlo-ride, toevoegen van alkali aan het reaktiemengsel om het alkalisch te maken, extraktie van het mengsel met een organisch oplosmiddel om een 3-benzamidopropyl-N,N-dialkylamine, weergegeven door de algemene formule 8204857 - 13 -

CgHg-CO-NH-(CH2)3-N-R2 (6) (waarin R·^ en R2 dezelfde groep zijn en zoals boven gedefinieerd zijn), waarna dit amine tot reaktie wordt gebracht met N-(3-broompropyl)-ftaalimide om het amine om te zetten in een 5 quaternair axnmoniumzout met de algemene formule h - - /CgHg-CONH-(CH2)3-ψ -(CH2)3-N=Phth/Br (7) *2 (waarin Phth staat voor de ftalylgroep; R3 en R2 zijn dezelfde groep en zijn als boven gedefinieerd), gevolgd door hydrolyse van het quaternaire ammoniumzout door verhitten met 6 n 10 zoutzuur bij 110°C gedurende 8 uur, verwijderen van het als nevenprodukten gevormde ftaalzuur en benzoëzuur, concentreren van het hydrolysaatmengsel om het zoutzuur zoveel mogelijk te verwijderen, oplossen van het residu in gedestilleerd water, voeren van de oplossing door een kolom van een anionen uit 15 wisselingshars (Cl-type), en concentreren van de effluent waardoor het hydrochloride van de verbinding met formule 4a waarin Rj en R2 dezelfde groep zijn, wordt verkregen.Als voorbeelden van verbindingen die bereid zijn met de bovenstaande methode kunnen worden genoemd di-(3-aminopropyl)-20 dimethylammoniumzout, di-(3-aminopropyl)-diethylammoniumzout en di-(3-aminopropyl)-dibutylammoniumzout.

Een andere v: rbinding met formule 4 a waarin R^ en R2 verschillende groepen zijn, wordt b.v. bereid door N-meth-yylbenzylamine te laten reageren met 2 equivalenten 3-broom-25 ftaalimide in aanwezigheid van een base en hydrolyse van het gevormde quaternaire ammoniumzout zoals boven beschreven.Een voorbeeld van de met deze methode bereide verbinding is di-(3-aminopropyl)(methyl)-benzylammoniumzout.

Een verbinding met formule 4b wordt b.v. bereid 30 door 1,3-di-(dimethylamino)-propaan te laten reageren met 3-broompropylftaalimide om 1,3-/di-(3-ftaalimidopropyl)di-methylamino7propaan te vormen, hydrolyse van de als boven beschreven verbinding, verwijdering van ftaalzuur, een nevenprodukt, uit het hydrolysaatmengsel, onderwerpen van het 35 mengsel aan ionen uitwisseling, en concentrerenilen voorbeeld van een met deze methode bereide verbinding is l,3-/di-(3- 8204857 -14- aminopropyl)-dimethylamino7_propaan tetrahydrochloride.

De verbindingen met formule 3, die gebruikt worden als een ander uitgangsmateriaal zijn b.v. p-chloorfenylaceet-aldehyde, fenylaceetaldehyde, benzaldehyde, p-chloorbenzalde-5 hyde, m-chloorbenzaldehyde, o-chloorbenzaldehyde, m,p-di-chloorbenzaldehyde, ο,ρ-dichloorbenzaldehyde, p-fluorbenzaldehyde, p-broombenzaldehyde, pentafluorbenzaldehyde, p-meth-oxybenzaldehyde, o,p-dimethoxybenzaldehyde, p-chloorfenyl-methylketon, m,p-dibenzyloxybenzaldehyde, 3-fenylpropanol, 10 difenylaceetaldehyde, p-cyaanbenzaldehyde, m-trifluormethyl-benzaldehyde, 1,3-difenylaceton, acetofenon, furfural, thio-feen-2-carbaldehyde, cyclohexanon, 2-cyclohexylaceetaldehyde, 5-norborneen-2-aceetaldehyde, ci-naftylaldehyde, anthraceen--9-aldehyde, cyclooctaancarbaldehyde, 2-thiofeencarbonalde-15 hyde, cyclopentaancarbaldehyde, cyclohexaan carbaldehyde, cycloheptaancarbaldehyde, cyclooctaancarbaldehyde, cyclounde-caancarbaldehyde, m,p-dibenzyloxybenzaldehyde, cyclotridecaan-carbaldehyde, 3,4-di-(p-chloorbenzoxy)benzaldehyde, 3,4-di-(m,p-dichloorbenzoxy)benzaldehyde, 3,4-di-(p-methoxybenzoxy)-20 benzaldehyde, 4-(p-benzoxybenzoxy)benzaldehyde, p-cyclooctyl-methoxybenzaldehyde, en 3,4,5-tribenzoxybenzaldehyde.Van deze verbindingen zijn nieuwe verbindingen 3,4-di-(p-chloorbenzoxy) benzaldehyde, 3,4-di-(3',4'-dichloorbenzoxy)-benzaldehyde, 3,4-di-(p-methoxybenzoxy)benzaldehyde, 4-(4'-benzoxybenzoxy)-25 benzaldehyde en 4-cyclooctylmethoxybenzaldehyde.Deze worden op de volgende manier bereid.

R7-X + H0/^-CH0 — ·Η> CHO

(H°)n (R70)n (8) (9) (10) waarin Ry p-methoxybenzyl, 3,4-dichloorbenzyl, p-chloorbenzyl 30 p-benzoxybenzyl of cyclooctylmethyl is, X een halogeen is en n gelijk is aan 0 of l.Een verbinding met formule 8 en een verbinding met formule 9 laat men reageren in een oplosmiddel zoals aceton bij een temperatuur van kamertemperatuur tot het kookpunt van het oplosmiddel.Na voltooiing van de reaktie 35 wordt het reaktiemengsel ontdaan van het oplosmiddel door des tillatie en vermengd met water en een organisch oplosmiddel om het aldehyde over te brengen naar de organische fase.Zo 8204857 * - 15 - nodig wordt het uit de organische fase verkregen ruwe produkt door omkristalliseren of door kolomchromatografie met gebruik van siliciumdioxidegel of een adsorberende hars gezuiverd om een zuiver produkt te verkrijgen.

5 Het cyclotridecaanaldehyde dat boven is opgesomd is ook een nieuwe verbinding die op de volgende wijze wordt bereid: titaantetrachloride wordt toegevoegd aan een mengsel van zinkstof, watervrij tetrahydrofuran en dibroommethaan.Aan het gevormde mengsel wordt cyclotridecanon toegevoegd waar-10 door methyleencyclotridecaan wórdt verkregen, dat dan geëpoxi-deerd wordt met m-chloorperbenzoëzuur.Na zuiveren wordt het geëpoxideerde produkt tot reaktie gebracht met boortrifluori-de-ether complex in watervrij dichloormethaan waardoor cyclotridecaancarbaldehyde wordt verkregen.

15 De fysisch-chemische eigenschappen van de repre sentatieve aminopropylaminobleomycine derivaten van deze uitvinding zijn zoals weergegeven in Tabel B.

_________ Tabel B____ ' ±2 Verbinding Afkorting Ultraviolet TLC van Elektroforese 20 nr. absorptie Cu-bevat- van Cu-bevat- maximum van tende tende

Cu-vrije verbinding verbinding verbinding R- Rm mp (E 1%/lcm) ( van alanine 25 _________ = 1,0) .1 MCLPE 291 ( 87) 0,75 1,01 2 MPE 291(104) 0,81 1,08 3 MBZ 291(106) 0,82 1,09 4 MCLBZ (p) 291( 91) 0,77 1,09 30 5 MCLBZ (m) 291( 91) 0,78 1,09 6 MCLBZ (O) 291( 91) 0,81 1,09 7 MDCLBZ(m,p) 291( 89) 0,72 1,02 8 MDCLBZ(o,p) 291( 89) 0,75 0,99 9 MFBZ (p) 291( 89) 0,82 1,03 35 10 MBRBZ (p) 291( 86) 0,77 1,06 11 MPFBZ 291( 91) 0,79 1,10 12 MMOBZ (p) 291(104) 0,83 1,07 13 MDMOBZ(o,p) 283(100) 0,83 0,97 14 MCLAPE (p) 291( 88) 0,76 1,04 40 15 MDBZOBZ(m,p) 285( 65) 0,55 0,90 16 MPP 291(102) 0,79 1,05 17 MDPE 291( 89) 0,72 1,07 'ii 8204857 - 16 -

Tabel B (vervolg) 18 MCNBZ (p) 291( 95) 0,83 1,08 19 MTFBZ (m) 291( 87) 0,74 0,99 20 MNAPH . 283(117) 0,75 0,98 21 MANTRA 352( 24) 0,68 0,85 5 290( 73) 254 (571) 22 MCO 291( 86) 0,72 1,02 23 MDBZME 291( 88) 0,63 1,01 24 MAPE 291(104) 0,83 1,01 10 25 MFUR ' 291( 98) 0,84 1,06 26 MTHIO 291( 91) 0,81 1,02 27 MDBZ 291( 88) 0,65 1,00 28 MCP 291( 91) 0,81 1,13 29 MCHM 291( 91) 0,78 1,11 15 30 MCHE 291( 90) 0,72 1,04 31 MCHEP 291( 90) 0,74 1,01 32 MCU 291( 87) 0,54 0,99 33 MNB 291( 96) 0,78 1,04 34 MDDBZOBZ 285( 86) 0,12 0,75 20 35 MMDBZ 291( 87) 0,67 0,99 36 MMCO 291( 90) 0,71 0,98 37 EEDBZ 291( 90) 0,60 1,03 38 BBDBZ 291( 87) 0,45 0,99 39 MTBZ 291( 83) 0,55 0,97 25 40 ATBZ 291( 87) 0,50 0,96 41 PPDBZ 291( 84) 0,69 1,11 42 PPCO 291( 87) 0,52 1,12 43 PYDBZ 291( 93) 0,67 0,95 44 PYCLBZ 291( 99) 0,80 1,01 30 45 PYCO 291( 99) 0,74 0,98 46 EECLPE 291( 82) 0,72 1,11 47 MCT 292( 99) 0,43 1,06 48 MDDCL 286(101) 0,04 0,17 49 MDDDCL 284( 82) 0,01 0,02 35 50 MDDMO 280( 93) 0,15 0,87 51 MDBZOBZOBZ 282( 84) 0,08 0,21 52 MDCOBZ 287( 87) 0,02 0,51 53 MDTBZOBZ 294(61) 0,01 0,19

Noot: *1 Siliciumdioxidegel 60F 254 silanised (Merck Co.); 3204857 -17- methanol-6% ammoniumacetaat oplossing (60:40 op vol.basis) (p) *2 Avicel SF ^ (FMC Co.); mierezuur-azijnzuur-water (27:75:900 op vol.basis), 800 V, 15 min.

De biologische eigenschappen van karakteristieke 5 voorbeelden van de verbindingen volgens deze uitvinding worden hieronder beschreven.

(1) Antibacterieële werking tegen Mycobacterium smegmatics ATCC 697 en Bacillus subtilis

De werking werd getoetst tegen de bovengenoemde 10 test microorganismen met de methode van de agarplaat-cilinder, waarbij de sterkte vein bleomycine A2 (Cu-vrije vorm), die als standaard werd gebruikt, aangenomen werd 1.000 mcg/mg te bedragen.

(2) Groeibelemmerende werking tegen HeLa Sg cellen.

15 HeLa S-, cellen werden geënt in een medium (MEM

dat 10% kalverserum bevat) en in een kunststof Petrischaal geplaatst.Twee dagen na het enten werd het te testen bleomycine aan het medium toegevoegd en de incubatie werd nog 3 dagen voortgezet waarna het aantal cellen werd geteld.Het 20 percentage groeibelemmering werd berekend met behulp van de vergelijking:

Percentage groeibelemmering(in %) = 100 x (B-A) / (B-C) waarin A het uiteindelijke aantal cellen is op de derde dag na het toevoegen van een testmonster, B het uiteindelijke aan-25 tal cellen is in de controle (zonder toevoeging van testmonster) , en C het aantal cellen is op de dag van het toevoegen van het testmonster.ID^q (concentratie van 50% belemmering) werd geschat uit de kromme van monsterconcentratie tegen percentage belemmering.

30 De verkregen testresultaten in (1) en (2) waren zo als weergegeven in Tabel C.

________Tabel C_

Verbinding Antibacterieële sterkte 50% groeibelem- van Cu-vrije verbinding meringconcen- ___mcg sterkte per mg_ tratie(ID^q)

Nr. Afkorting Tegen Myco- tegen Bacil- verbindino^te 5JSSJÉ?! gen gekweikte" ATCCS607" HeLa cel'mc9/ml 1 MCLPE 16800 13266 0,54 2 MPE 7282 7660 0,60 3 MBZ 6384 7230 0,20 8204857 - 18 - _Tabel C (vervolg)_ 4 MCLBZ (p) 11536 7142 0,54 5 MCLBZ (m) 7615 5490 0,80 6 MCLBZ (o) 6548 4545 1,10 5 7 MDCLBZ (m,p) 10601 4263 0,82 8 MDCLBZ (0,p) ' 13013 2940 1,05 9 MFBZ (p) 8116 8145 0,75 10 MBRBZ (p) 15446 6001 0,57 11 MPFBZ 7950 1509 1,60 10 12 MMOBZ (p) 5491 6607 0,75 13 MDMOBZ (o,p) 5351 5312 1,30 14 MCLAPE (p) 16959 5459 0,52 15 MDBZOBZ (m,p) 4516 1772 0,36 16 MPP 8453 10295 0,46 15 17 MDPE 21084 3554 1,00 18 MCNBZ 3163 4347 1,10 19 MTFBZ (m) 8504 6063 0,75 20 MNAPH 6581 4785 0,78 21 MANTRA 13250 4504 0,80 20 22 MCO 22860 12300 0,45 23 MDBZME 14920 2593 1,45 24 MAPE 7901 14089 1,00 25 MFUR 4790 9548 0,30 26 MTHIO 5595 10626 0,39 25 27 MDBZ 14194 1138 0,89 28 MCP 13595 16180 1,00 29 MCHM 15414 12148 0,63 30 MCHE 35030 14440 0,56 31 MCHEP 25924 20143 0,48 30 32 MCU 28308 8146 0,58 33 MNB 16219 13332 0,68 34 MDDBZOBZ 164 49 0,38 35 MMDBZ 13784 1742 0,87 36 MMCO 21840 20000 0,29 35 37 EEDBZ 10680 1047 0,70 38 BBDBZ 17910 530 2,00 39 MTBZ 7746 580 2,30 40 ATBZ 4450 479 1,90 41 PPDBZ 16000 7100 0,66 40 42 PPCO 26000 14600 0,51 8204857 ^ ' «* - 19 - _____________________Tabel C (vervolg)_ 43 PYDBZ 14420 1230 0,50 44 PYCLBZ 11350 6080 0,31 45 PYCO 43000 15100 0,81 5 46 EECLPE 17480 13310 0,52 47 MCT 3915 1760 0,18 48 MDDCL 14 8 0,058 49 MDDDCL 23 8 0,063 50 MDDMO 145 35 0,90 10 51 MDBZOBZOBZ 163 46 0,12 52 MDCOÜZ 268 49 0,13 53 MDTBZOBZ 11 26 0,62

Uit Tabel C blijkt dat de verbinding volgens de uitvinding een sterke groeibelemmerende werking heeft tegen 15 gekweekte HeLa cellen alsmede een sterke anti-bacterieële werking.

(3) Giftigheid voor de longen (long fibrose) bij muizen.

ICR stam muizen (manlijk; 15 weken oud; 9 muizen per groep) werden gebruikt.Iedere muis kreeg een dagelijkse 20 dosis toegediend van 5mg/kg van het testmonster door intra-peritonale injektie, eenmaal daags, gedurende 10 opeenvolgende dagen.Na voltooiing van de vooraf vastgestelde toediening werden de muizen gedurende 5 weken onder observatie gehouden vervolgens afgemaakt en aan autopsie onderworpen om te onder-25 zoeken of en in welke graad longfibrose voorkwam.De beoordeling geschiedde door vergelijking van het aantal toegediende muizen dat aan longfibrose leed en de mate van de ziekte.De resultaten van het onderzoek waren als weergegeven in Tabel D.

In Tabel D werd de mate numeriek als volgt vastge- 30 legd: 0 punten: Geen fibrose 1 punt : Opeenhoping van exu aat in long alveoli en fibrose-achtige verandering in alveolaire septum.

2 punten: Fibrose in verschillende gebieden.

35 4 punten: Verspreide fibrose 6 punten: Fibrose in meer dan twee-derde van het totale gebied.

De "verhouding" werd berekend door vergelijking met "bleomy-cine complex'.' 40 Uit Tabel D blijkt, dat enkele van de onderhavige 8204857 - 20- verb indingen in het geheel geen voorkomen van longfibrose vertonen en dat zelfs in gevallen waarin de fibrose wordt waargenomen dat de mate van giftigheid voor de longen aanzienlijk verminderd is, en het voorkomen minder bedraagt dan ongeveer 5 de helft en de mate minder bedraagt dan ongeveer een zevende van die getoond door APMP-BLM.Aangezien het voorheen heel moeilijk was om de nevenwerkingen van bleomycinen te vermijden in het bijzonder longfibrose, is het een verrassend effekt, dat deze uitvinding een verbinding verschaft die geen neven-10 werking verschaft die voert tot longfibrose, zij het in een dierproef.

_Tabel D_ _Voorkomen_Mate_

Aantal muizen dat Ver- Totaal aantal Ver- 15 Verbinding lijdt aan longfibrose hoü- longfibrose/ hou- ding totaal aantal ding nr~__ proefdieren (%) 1 2/9 (22) 0,35 3/27 (11) 0,13 2 3/9 (33) 0,53 7/27 (26) 0,31 20 3 2/8 (25) 0,40 2/24 ( 8) 0,10 4 1/7 (14) 0,22 1/21 ( 5) 0,19 5 4/9 (44) 0,70 7/27 (26) 0,31 6 5/9 (56) 0,90 6/27 (22) 0,26 7 1/9 (11) 0,18 1/27 ( 4) 0,05 25 8 1/9 (11) 0,18 2/27 ( 7) 0,08 9 2/9 (22) 0,35 3/27 (11) 0,13 10 2/9 (22) 0/35 4/27 (i5) 0,18 11 2/9 (22) 0,35 2/27 ( 7) 0,08 12 2/7 (29) 0,46 3/21 (14) 0,17 30 13 2/6 (33) 0,53 2/18 (11) 0,13 14 2/9 (22) 0,35 3/27 (11) 0,13 15 1/9 (11) 0,18 1/27 ( 4) 0,05 17 1/5 (20) 0,32 1/15 ( 7) 0,08 18 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 35 19 1/9 (11) 0,18 1/27 ( 4) 0,05 20 1/9 (11) 0,18 1/27 ( 4) 0,05 22 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 27 1/5 (20) 0,32 1/15 ( 7) 0,08 32 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 40 34 0/9 ( 0) 0,00 0/27 (0) 0,00 35 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 38 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 8204857 - 21 - __'__Tabel D (vervolg)___ 39 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 41 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 42 0/9 ( 0) 0,00 0/27 { 0) 0,00 5 43 0/9 ( 0) 0,00 0/27 (0) 0,00 44 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 45 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 46 0/9 { 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 47 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 10 48 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 49 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 50 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 51 0/9 (0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 52 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 15 53 0/9 ( 0) 0,00 0/27 ( 0) 0,00 AP MP 9/9 (100) 1,6 48/27 (178) 2,15 (4) Acute toxiciteit.

LD^q werd getoetst door verschillende representatieve verbindingen volgens de uitvinding gedurende 10 opeen-* 20 volgende dagen toe te dienen.

1. Methode van de proef.

CDF^/SLC stam manlijke muizen (ieder 6 weken oud, 7 muizen per groep) kregen subcutaan verschillende verbindingen volgens de uitvinding toegediend, waarbij de dosis 25 voor iedere verbinding anders was.LD^q(dagelijkse dosis) werd geschat uit de mortaliteit tijdens de toedieningsperiode volgens de methode van Behrens-Karber.

2. Resultaten van de proef.

De resultaten waren zoals weergegeven in Tabel E.

30 _;_Tabel E_ _Verbinding_ LD^q

Nr. Afkorting (mg/kg/dag) 32 MCU 17,5 34 MDDBZOBZ 60,0 35 37 EEDBZ 50,0.

43_PYDBZ _ 12,5

Bleomycine complex 20__

Zoals uit hun hierboven beschreven biologische eigenschappen blijkt, hebben de verbindingen volgens de uitvinding een anti-tumor werking en hebben sterk verminderde 8204857 - 22- nevenwerkingen zoals giftigheid voor de longen.Derhalve valt te verwachten dat de onderhavige verbindingen bruikbaar zijn als carcinostatica met verminderde nevenwerkingen.Bij gebruik als een carcinostaticum kan de verbinding in verschillende 5 doseringsvormen worden toegediend, zoals b.v. vast preparaat, zalf, en oplossingen maar in het algemeen in de vorm van in-jekties.De toediening geschiedt 1-5 maal per week en de dosis bedraagt 5-200 mg/week.

De uitvinding wordt hieronder nader toegelicht aan 10 de hand van de Voorbeelden, maar is daartoe niet beperkt.

Voorbeeld I

Trap 1:

Aan een oplossing van 1,0 g 3-,/N-methyl-N- (3-amino propyl)amino7propylaminobleomycinetrihydrochloride (Cu-bevat-15 tende vorm) in 30 ml methanol werden 227 mg cycloundecaancarb-aldehyde, gevolgd door 26 mg natriumcyaanboorhydride toegevoegd. Het mengsel liet men 16 uur bij kamertemperatuur reageren.Het reaktiemengsel werd ingesteld op pH 1,0 met 6n zoutzuur en men liet het 10 min. staan om de reaktie te laten 20 eindigen.Het reaktiemengsel werd daarna geneutraliseerd met ln natriumhydroxideoplossing en door destillatie bij verlaagde druk ontdaan van methanol.Het residu werd met gedestilleerd water aangevuld tot 50 ml en geëxtraheerd met ether om de overmaat aldehyde te verwijderen.De waterige laag werd 25door een kolom met een volume van 100 ml, gepakt met Amber-lite^ XAD-2 (Rohm en Haas Co,) in 4%-ige waterige ammonium-acetaatoplossing - 2%-ige waterige azijnzuuroplossing (1:1 op vol.basis) gevoerd om het beoogde produkt te adsorberen.

De geadsorbeerde fase werd geëlueerd met de lineaire concen-30 tratiegradient techniek met gebruik van 500 ml van de genoemde bufferoplossing waarin kontinu 500 ml methanol werden toegevoegd. De frakties, in totaal 200 ml, die geëlueerd waren bij methanolconcentraties van ongeveer 65% en absorbtiemaxima vertoonden bij golflengten van ongeveer 290 mp, werden verza-35 meld.De waterige oplossing, die werd verkregen uit deze frakties na verwijdering van de methanol door destillatie bij verlaagde druk, werd door een kolom met een volume van 100 ml gepakt met Amberlite^XAD-2 (Rohm en Haas Co.) in gestil-leerd water gevoerd om het beoogde produkt te adsorberen.De 40 kolom werd gewassen met 150 ml gedestilleerd water en het be- 8204857 - 23 - oogde produkt werd geëlueerd met 1/50 molair waterig zoutzuur- methanol (1:4 op vol.basis).Blauwe frakties van het bleomycine

R

derivaat werden verzameld, geneutraliseerd met Dowex 44 (een anionen uitwisselingshars, OH-type, van Dow Chemical Co.), en 5 daarna geconcentreerd bij verlaagde druk en gelyofiliseerd.

Het hierboven verkregen gelyofiliseerde poeder werd opgelost in 10 ml gedestilleerd water en door een kolom R + met een volume van 100 ml, gepakt met CM-Sephadez C-25 (Na - type, Pharmacia Fine Chemicals Co.) gevoerd, die in evenwicht 10 was gebracht met 1/20 molair azijnzuur-natriumacetaat buffer met pH 4,5 om adsorptie op de kolom te bewerkstelligen.Het beoogde produkt werd geëlueerd met de lineaire concentratie- gradient techniek, die werd uitgevoerd door kontinu natrium- chloride aan de bufferoplossing toe te voegen om de concentra- 15 tie aan natriumchloride geleidelijk op te voeren tot 1,0 mol.

Een totaal van 550 ml eluent liet men door de kolom vloeien en in totaal 120 ml blauwe frakties, geëlueerd bij natriumchlo- rideconcentraties van ongeveer 0,65 molair werden verzameld.

R

De verzamelde frakties werden ontzout met Amberlite XAD-2, 20 dat hieboven gebruikt werd, en gelyofiliseerd waardoor 872 mg (79% opbrengt) werden verkregen aan koper-bevattend 3-^N-méth-yl-N-/3'-(cycloundecanylmethylamino)propyl7amino}propylamino-bleomycine in de vorm van een blauw amorf poeder.

Trap 2: 25 Het koper-bevattende produkt, 872 mg, verkregen in trap 1, werd opgelost in 18 ml gedestilleerd water.Om het koper te verwijderen werd de verkregen oplossing door een kolom met een volume van 100 ml, gepakt met Amberlite XAD-2 in gedestilleerd water, gevoerd om adsorptie tot stand te brengen, 30 en de hars werd gewassen met 300 ml van een waterige oplossing die natriumchloride en 5% EDTA.2Na bevat, daarna achtereenvolgens met 100 ml 2%-ige natriumchlorideoplossing en 150 ml gedestilleerd water, en tenslotte werd de geadsorbeerde fase geëlueerd met 1/50 n waterig zoutzuur-methanol (1:4 op vol.

35 basis) om de eluaatfrakties te verzamelen die absorptiemaxima vertoonden bij golflengten van ongeveer 290 mp.De verzamelde frakties werden ingesteld op pH 6,0 met Dowex 44 (OH-type, Dow Chemical Co.), onder verlaagde druk geconcentreerd en daarna gelyofiliseerd waardoor 758 mg(90% opbrengst) werden verkregen 40 van een wit amorf poeder van 3-<N -methyl-N-/3'-(cycloundeca- 8204857 -24- nylmethylamino)propyl/aminoypropylaminobleomycine (verbinding nr.32) in de vorm van koper-vrij trihydrochloride.Deze verbinding vertoonde UV absorptiemaximum bij- 291 mp en E(l%/lcra) = 87, gemeten in gedestilleerd Water.-De IR-absorptiemaxima 5(in golfgetal, cm gemeten in KBr-tablet waren: 3425, 2950, 1650, 1550, 1520, 1440, 1400, 1260, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 980, 800.Andere fysisch-chemische eigenschappen zijn vermeld in Tabel B.

In de bovenstaande reaktie werden 988 mg m,p-di-10 benzoxybenzaldehyde gebruikt als het aldehyde bestanddeel en de reaktie werd 70 uur bij 27°C uitgevoerd.Het reaktiemeng-sel werd gezuiverd en van koper ontdaan op een overeenkomstige wijze als hierboven beschreven waardoor 762 mg (57% opbrengst) werden verkregen van een kleurloos amorf poeder 15 van 3-{N-methyl-N-/3'-(di-(m,p-dibenzoxybenzyl)amino)propyl/ aminojfpropylaminobleomycine (verbinding nr.34) in de vorm van koper-vrij trihydrochloride.Deze verbinding vertoonde UV absorptiemaximum bij 285 mp en E(l%/lcm) = 86, gemeten in gedestilleerd water.De IR absorptiemaxima (in golfgetal, cm 1), 20 gemeten in KBr-tablet, waren: 3425, 2950, 1650, 1550, 1510, 1460, 1430, 1380, 1320, 1270, 1190, 1140, 1060, 1020, 960, 800, 730, 690, 650.

Op overeenkomstige wijze werden 174 mg cyclooc-taancarbaldehyde als aldehyde gebruikt en liet men dat 24 uur 25 bij kamertemperatuur reageren, waarna het werd gezuiverd en ontdaan van koper, waardoor 605 mg (58% opbrengst) werden verkregen van een kleurloos amorf poeder van 3-£N-methyl-N-/31-(cyclooctylmethylamino)propyl/amino}propylaminobleomycine (verbinding nr.22) in koper-vrije trihydrochloride vorm.Deze 30 verbinding vertoonde UV absorptiemaximum bij 291 mp en E(l%/lcm) = 86, gemeten in gedestilleerd water.De IR absorptiemaxima ( in golfgetal, cm *) gemeten in KBr-tablet) waren: 3425, 2925, 1650, 1550, 1520, 1440, 1400, 1330, 1260, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 980, 800.

35 Op een overeenkomstige wijze werden de in Tabel F

vermelde verbindingen bereid.

8204857 - 25- - _;_Tabel F_

Beoogde Uitgangsverbinding Aantal Reaktie Op- verbinding (formule 3) equiv. duur temp. breng nr. van (uur) (°C) st 5 _verb.3_(%) 1 p-Chloorfenylaceetaldehyde 1,2 16 22 66 2 Fenylaceetaldehyde 1,2 16 22 71 3 Benzaldehyde 1,2 16 22 85 4 Benzaldehyde 1,2 48 0 45 10 4 p-chloorbenzaldehyde 1,2 16 22 66 5 m-chloorbenzaldehyde 1,2 16 22 83 6 o-chloorbenzaldehyde 1,2 16 22 69 * 7 m,p-dichloorbenzaldehyde 1,2 16 22 77 8 o,p-dichloorbenzaldehyde 1,2 16 22 71 15 9 p-fluorbenzaldehyde 1,2 16 22 80 10 p-broombenzaldehyde 1,2 16 22 75 11 pentafluorbenzaldehyde 1,2 16 22 56 12 p-methoxybenzaldehyde 1,2 16 22 80 13 ο,ρ-dimethoxybenzaldehyde 1,2 16 22 58 20 14 p-chlooracetofenon 2,0 24 37 57 15 m,p-dibenzoxybenzaldehyde 1,2 18 22 63 16 3-fenylpropanal 1,2 16 22 74 17 difenylaceetaldehyde 1,2 16 22 67 18 p-cyaanbenzaldehyde 1,2 16 22 83 25 19 m-trifluormethylbenzaldehyde 1,2 18 22 87 20 4-naftylaldehyde 1,2 18 22 60 21 anthraceen-9-aldehyde 1,2 18 22 61 22 cyclooctaancarbaldehyde 2,0 24 37 58 23 1,3-difenylaceton 5,0 30 37 71 30 24 acetofenon 5,0 30 22 59 25 furfural 1,2 16 22 71 26 2-thiofeencarbaldehyde 1,2 16 22 59 27 benzaldehyde 10,0 16 22 67 28 cyclopentaancarbaldehyde 1,2 16 22 61 35 29 cyclohexaancarbaldehyde 1,2 16 22 60 30 2-cyclohexylaceetaldehyde 1,2 16 22 54 31 cycloheptylcarbaldehyde 1,2 16 22 74 32 cycloundecaancarbaldehyde 2,0 16 22 71 33 5-norborneen-2~carbaldehyde 1,2 16 22 52 40 34 m,p-dibenzoxybenzaldehyde 5,0 70 27 57 47 cyclotridecaancarbaldehyde 2,0 16 22 66 8204857 - 26 - _Tabel F (vervolg)_ 48 3,4-di-(p-chloorbenzoxy)- 4,0 96 27 54 benzaldehyde 49 3,4-di-(m,p-dichloorbenzoxy) 4,0 120 40 44 5 benzaldehyde 50 3,4-di-)p-methoxybenzoxy)- 4,0 24 40 49 benzaldehyde 51 4-(p-benzoxybenzoxy)- 4,0 24 40 41 benzaldehyde 10 52 p-cyclooctylmethoxybenz- 4,0 48 40 33 aldehyde 53_3,4,5-tribenzoxybenzaldehyde 4,0 24_40 44

Voorbeeld II

Trap 1: 15 Aan een oplossing van 1,0 g 3-/N,N-diethyl-N-(3- aminopropyl)aming7propylaminobleomycinetrichloride (Cu-bevat-tende vorm) in 30 ml methanol werden 642 mg benzaldehyde, ge volgd door 51 mg natriumcyaanboorhydride toegevoegd.Men liet het mengsel 16 uur bij kamertemperatuur reageren.Op overeen-20 komstige wijze als in Voorbeeld I werd het reaktiemengsel behandeld met zoutzuur, geëxtraheerd met ether, onderworpen aan de Amberlite®XAD-2 kolomchromatografie, daarna ontzout door gebruik van Amberlite XAD-2zoals eerder beschreven, en gelyo-filiseerd waardoor 832 mg(75% opbrengst) werden verkregen van 25 een koper-bevattend 3-/N,N-diethyl-N-(3'-dibenzylamino)pro-pyl7amino7propylaminobleomycine in de vorm van een blauw amorf poeder.

Trap 2:

Het koper-bevattende produkt, 832 mg, verkregen 30 in trap 1, werd opgelost in 17 ml gedestilleerd water, daarna werd het koper verwijderd zoals in trap 2 van Voorbeeld I, onder verlaagde druk geconcentreerd en gelyofiliseerd waardoor 739 mg (92% opbrengst) werden verkregen van een koper-vrij wit amorf poeder van 3-/N,N-diethyl-N-(3'-dibenzylamino) 35 propyl7amino7propylaminobleomycine (verbinding nr.37) trihy-drochloride-Het vertoonde een UV absorptiemaximum bi j 291 mp en E(l%,lcm) = 90, gemeten in gedestilleerd water.De IR ab-sorptiemaxima (in golfgetal, cm *), gemeten in KBr-tablet, waren: 3425, 2975, 2925,1640, 1550, 1520, 1490, 1450, 1400, 8204857 -27- 1* 1320, 1260, 1190, 1140, 1100, 1060, 1020, 980, 910, 800, 740, 690.

Op overeenkomstige wijze ais hierboven beschreven liet men 1,0 g 3-{N,N-dimethyl-N-/3(N,N-dimethyl-N-(3"-ami-5 . nopropyl)amino)propyl7amino}propylaminobleomycine tetrahydro-chloride (Cu-bevattende vorm), dat als uitgangsmateriaal werd gebruikt, reageren met 607 mg benzaldehyde en het reaktie-mengsel werd gezuiverd en het koper verwijderd waardoor 587 mg (55% opbrengst) werden verkregen van een kopervrij kleur-10 loos amorf poeder van 3-{N,N-dimethyl-N-/3'-(N,N-dimethyl-N- (3,'-*dibenzylarainopropyl)amino)propyl7amino3,propylaminobleo-mycine (verbinding nr.41) tetrahydrochloride.Het vertoont een UV absorptiemaximum bij 291 mp en E(l%/lcm) = 84, gemeten in gedestilleerd water.De IR absorptiemaxima (in golfgetal, cm h 15 gemeten in KBr-tablet, waren: 3425, 2950, 1650, 1560, 1490, 1460, 1400, 1330, 1260, 1190, 1160, 1100, 1060, 1020, 980, 800, 740, 600.

Op dezelfde wijze als hierboven werd een reaktie uitgevoerd door gebruik van 161 mg cyclooctaancarbaldehyde in 20 plaats van het benzaldehyde en het reaktiemengsel werd op overeenkomstige wijze gezuiverd en van koper ontdaan waardoor 539 mg (52% opbrengst) werden verkregen van een kopervrij kleurloos amorf poeder van 3{N,N-dimethyl-N-/3(N,N-dimethyl -N-(3"-cyclooctylmethylaminopropyl)amino)propyl7amino}propyl-25 aminobleomycine (verbinding nr.42) tetrahydrochloride.Het vertoonde UV absorptiemaximum bij 291 mp en E(l%/lcm) = 87, gemeten in gedestilleerd water.De IR absorptiemaxima (in golf-getal, cm-1), gemeten in KBr-tablet, waren: 3425, 2950, 1720, 1660, 1550, 1520,1490, 1450, 1400, 1360, 1260, 1190, 1140, 30 1100, 1060, 1020, 980, 880, 800.

Op overeenkomstige wijze liet men 1,0 g 3-/4'- (3"- l< ' e aminopropyl)piperidyl/propylaminobleomycine tetrahydrochloride (Cu-bevattende vorm) dat als uitgansmateriaal werd gebruikt, reageren met 623 mg benzal ehyde en het reaktiemeng-35 sel werd gezuiverd en ontdaan van koper waardoor 695 mg (65% opbrengst) werden verkregen van een kopervrij, kleurloos amorf poeder van 3-/4'-(3"-dibenzylaminopropyl)piperidyl7“ propylaminobleomycine (verbinding nr.43) tetrahydrochloride.

Het vertoonde een UV absorptiemaximum bij 291 πιμ en E(l%/lcm) 40 = 93.De IR absorptiemaxima (in golfgetal, cm 1) gemeten in

8204 857 I

- 28 - KBr-tablet, weren: 3425, 2950, 1660, 1560, 1520, 1500, 1460, 1260, 1190, 1140, 1100, 1060, 1030, 980, 880, 810, 740, 700.

Op overeenkomstige wijze werden de verbindingen als vermeld in Tabel G bereid.

5 _Tabel G_

Beoogde Afkorting Verbinding met Aantal Reak- Op- verbinding_ voor ver- formule 3 equiv. tie breng binding met van duur st

Nr. Afkorting formule 2 verbin-(uur) (%) 10 _ding 3__ 35 MMDBZ MMHH Benzaldehyde 10,0 16 72 36 MMCO MMHH Cyclooctaan- 2,0 24 57 carbaldehyde 37 EEDBZ EEHH Benzaldehyde 10,0 16 69 15 38 BBDBZ BBHH Benzaldehyde 10,0 16 68 39 MTBZ MBZHH Benzaldehyde 15,0 16 68 40 ATBZ APP Benzaldehyde 15,0 20 65 41 PPDBZ PP4M Benzaldehyde 10,0 16 55 42 PPCO PP4M Cyclooctaan- 2,0 24 52 20 carbaldehyde 43 PYDBZ PY Benzaldehyde 10,0 16 65 44 PYCLBZ PY p-Chloorbenz- 1,2 16 48 aldehyde 45 PYCO PY Cyclooctaan- 2,0 24 43 25 carbaldehyde 46 EECLPE EEHH p-Chloorfenyl- 1,3 16 41 _aceetaldehyde_

Voorbeeld III

50 g 3-aminopropyldimethylamine en 62 g natrium- 30 waterstofcarbonaat werden gesuspendeerd in 300 ml gedestil leerd water.Onder koelen in ijs en onder krachtig roeren werden aan de suspensie druppelsgewijze 105 g (1,5 equivalenten) benzoylchloride toegevoegd.Na 6 uur reageren bij kamertemperatuur werd het reaktiemengsel aangezuurd tot pH 4 met geconcen-35 treerd zoutzuur en geëxtraheerd met ethylether om overmaat benzoylchloride te verwijderen.De waterige laag werd ingesteld op pH 12 met 5n waterige natriumhydroxideoplossing en geëxtraheerd met chloroform.Het chloroformextrakt werd gedroogd boven natriumsulfaat en van oplosmiddel ontdaan door destillatie on-40 verlaagde druk waardoor 91 g 3-benzamidopropyldimethylamine werden verkregen.Aan dit residu werd een oplossing van 118 g (1 equivalent) N-3-broompropylftaalimide in 300 ml tetrahy-drofuran toegevoegd.Na 18 uur roeren bij kamertemperatuur wer- 8204857 ¢.

- 29 - den de neergeslagen kleurloze kristallen door filtreren verzameld, gewassen met tetrahydrofuran en gedroogd, waardoor 188 g (90% opbrengst) kleurloze kristallen vein het quaternaire ammoniumzout werden verkregen.Dit zout werd opgelost in 1.000 5 ml 6n zoutzuur en 8 uur op 110°C verhit om hydrolyse tot stand te brengen.Na afkoelen werden het neergeslagen ftaalzuur en benzoëzuur door filtreren verwijderd en het filtraat werd tot droog ingedampt onder verlaagde druk om overmaat zoutzuur te verwijderen.Het residu werd opgelost in gedestilleerd water en p 10 door een kolom gevoerd van een ionen uitwisselingshars Dowex -1 (Cl-type, volume van 600 ml).De effluent werd tot droog ingedampt onder verlaagde druk waardoor 96 g (90% opbrengst) werden verkregen aan di-(3-aminopropyl)-dimethylammonium tri-hydrochloride.Deze verbinding was te hygroscopisch om zijn 15 smeltpunt te bepalen.Het k.m.r. spektrum, gemeten in zwaar water, vertoonde de volgende /-waarden: 2,1 - 2,8 ppm, 4H (m), 2,4 ppm, 6H (s), 3,1 - 3,9 ppm, 8H (m) (waarin de letters tussen haakjes de signaaltypen aangeven: m = multiplet; s « sin-gulet).Deze waarden waren in overeenstemming met de toegekende 20 struktuur.De IR absorptiemaxima (in golfgetal, cm *), gemeten in KBr-tablet, waren: 3425, 2975, 2625, 2000, 1600, 1480, 1470 1350, 1320, 1300, 1230, 1200, 1160, 1140, 1Q60, 1040, 1000, 930, 840, 760.

Op overeenkomstige wijze als hierboven beschreven 25 werden met gebruikmaking van 3-aminopropyldiethylamine en 3-aminopropyldibutylamine respektievelijk verkregen di-(3-amino-propyl)diethylammonium- trihydrochloride en di-(3-aminopropyl)-dibutylammonium trihydrochloride.De fysisch-chemische eigenschappen van deze verbindingen zijn als vermeld in Tabel H.

30 _.____ Tabel H _

Gesynthetiseerd IR (cm”1),KBr-tablet PMR*1(ppm) R *2 Rf*3 amine _ '_60 MHz ,D20_ di-(3-Aminopropyl)- 3425, 2975, 2625, 2,1-2,8 dimethylammonium 2000, 1600, 1480, 4H (m) 35 trihydrochloride 1470, 1350, 1320, 3,1-3,9 1300, 1230, 1200, 8h (m) 1160, 1140, 1060, 2,4 1040, 1000, 930, 840 6H (s) 2,63 0,08 _____760 ___ 40 di-(3-aminopropyl)- 3425, 2975, 2650 1,6 diethylammonium 2000, 1600, 1470, 6h (t) trihydrochloride 1400, 1390, 1350, 2,0-2,7 1280, 1260, 1180, 4H (m) 1070, 1030, 990,950, 3,1-4,0 2,430,14 8204857 - 30 - _Tabel H (vervolg)____ _900/ 880, 800, 750_12H (m)_ di-(3-aminopropyl)- 3425, 2975, 2650, 1,15 dibutylammonium- 2000, 1600, 1470, 3H (t) 5 trihydrochloride 1400, 1390, 1350, 1,3-2,2 1280, 1260, 1180, 4H (m) 1070, 1030, 990, 2,0-2,7 1,89 0,44 950, 900, 840, 800, 4H (m) 750 3,1-4,0 10_12H (m)_

Noot: *1 Letters tussen haakjes: s staat voor singulet, t voor triplet en m voor multiplet.

*2 Snelheid van e'lektroforese ten opzichte van alanine — 13

15 (1^=1,0) in dunne-laag elektroforese/Avicel SF

(FMC Co.); mierezuur-azijnzuur-water (25:75:900 op vol.basis);800 V; 6 min.?· *3 Mobiliteit in dunne-laag chromatografie /silïciumdi-oxidegel 60 F 254 (merck Co.); methanol-10% waterig 20 ammoniumacetaat-10% waterige ammoniak (1:1:1 op vol.

basis].?; ninhydrine kleurreaktie.

Voorbeeld IV

Aan een oplossing van 53,6 g (2 equivalenten) N-(broompropyl)ftaalimide in 300 ml acetonitril werden 13 g 25 N,N,N',N'-tetramethyl-l,3-diaminopropaan toegevoegd.Het mengsel werd 18 uur bij kamertemperatuur geroerd waardoor 1,3-/13-ftaalimidopropyl)dimethylaming/propaandibromide werd gevormd als een wit neerslag.Het neerslag werd door filtreren verzameld, gewassen met acetonitril en gedroogd.De opbrengst 30 bedroeg 90%.Dit quaternaire ammoniumzout werd opgelost in 200 ml 6n zoutzuur en 8 uur op 110°C verhit om hydrolyse tot stand te brengen.Na afkoelen werd het neergeslagen ftaalzuur door filtreren verwijderd.Het filtraat werd door een kolom

R

van een ionen uitwisselingshars Dowex -1 (Cl-type; volume 35 1200 ml) gevoerd.De effluent werd onder verlaagde druk tot droog ingedampt waardoor 28,7 g l,3-di-/T3-aminopropyl)di-methylamino7propaan trihydrochloride werden verkregen.

Deze verbinding was te hygroscopisch om het smeltpunt te bepalen.Het k.m.r. spektrum, gemeten in zwaar 40 water, vertoonde de volgende i (ppm) waarden: 2,0-2,9, 6H (m) ; 3,0-4,0, 12H (m); 3,45, 12H (s).De letters tussen haakjes hebben dezelfde betekenis als eerder vermeld.De ί waarden dui 8204857 - 31 - den op de struktuur van de bovenvermelde verbinding.De waarden van Rf en Rm, gemeten onder de omstandigheden als vermeld in de noot bij Tabel G, waren respektievelijk 0,02 en 2,56.De IR absorptiemaxima (in golfgetal, cm *) : 3425, 2975, 2600, 5 2000, 1720, 1600, 1480, 1470, 1400, 1300, 1230, 1200, 1150, 1060, 1000, 960, 920, 900, 850, 760.

Voorbeeld V

Aan een oplossing van 20 g N-methylbenzylamine in 300 ml tetrahydrofuran werden 17 g triethylamine en 89 g N-10 (3-broompropyl)-ftaalimide toegevoegd.Het mengsel werd 17 uur bij kamertemperatuur geroerd.Het kleurloze neerslag dat zich afscheidde, werd door filtreren verzameld en omgekristalliseerd uit waterige ethanol waardoor 76 g (80% opbrengst) aan kleurloze kristallen werden verkregen.De kristallen werden 15 opgelost in 380 ml 6n zoutzuur en 8 uur op 110°C verhit en daarna afgekoeld, door filtreren ontdaan van het neergeslagen ftaalzuur, onder verlaagde druk geconcentreerd om de overmaat zoutzuur te verwijderen, opgelost in gedestilleerd water, en

door een kolom gevoerd van een ionen uitwisselingshars, Dowex R

20 -1 (Cl-type, volume van 200 ml).De effluent werd onder ver laagde druk tot droog ingedampt, waardoor 41 g(90% opbrengst) di-(3-aminopropyl)methylbenzylammonium trihydrochloride werden verkregen.Deze verbinding was te hygroscopisch om zijn smeltpunt te bepalen.Het k.m.r. spektrum, gemeten in zwaar 25 water, gaf de volgende i(ppmV waarden: 1,9-2,8, 4H (m); 2,9- 4,0, 8H (m); 3,2, 3H <s)? 4,70-4,75, 2H (m); 7,7, 5H (s); de letters tussen haakjes hebben de bovenstaande betekenis.Deze waarden duiden op de struktuur van de bovenvermelde verbinding.De waarden van Rf en Rm, bepaald onder de omstandigheden 30 als vermeld in de noot van Tabel G, waren respektievelijk 0,29 en 2,14.De IR absorptiemaxima (in golfgetal, cm *), gemeten in KBr-tablet, waren als volgt: 3425, 2975, 2650, 2000, 1600, 1470, 1400, 1310, 1220, 1200, 1180, 1140, 1070, 1030, 1000, 960, 890, 780, 750, 730, 700.

35 Vergelijkingsvoorbeeld 1

In 10 ml' dimethylformamide werden. 1,000 mg bleomycineziiur (Cu-chelaat) en 2,948 mg 1-hydroxybenztriazool (afgekort HOBT) opgelost.Aan de oplossing werden, terwijl deze bij 0°C werd gekoeld en geroerd, 1,500 mg (10 equiva-40 lenten op bleomycinezuur) dicyclohexylcarbodiimide(afgekort 8204857 - 32 - DCC) toegevoegd.Tien min. daarna werd een oplossing van 1,93 mg (10 equivalenten op bleomycine) aan N- (3-aminopropyl)-N,Ν'-dime thylaminopropylamine trihydrochloride, dat afzonderlijk was bereid, en 2,206 mg (30 equivalenten op bleomycine) aan 5 N-methylmorfoline in 5 ml dimethylformamide aan het mengsel toegevoegd.Met liet het mengsel onder roeren 4 uur reageren bij kamertemperatuur.Aan het reaktiemengsel werd aceton toegevoegd ( 10 maal het volume van het reaktiemengsel) om het beoogde produkt neer te slaan.Het neerslag werd grondig ge- 10 wassen met aceton, opgelost in gedestilleerd water en door een kolom gevoerd met een volume van 100 ml, gepakt met CM-Sephadex C-25 (Na+ type, Pharmacia Fine Chemicals Co.), die in evenwicht was gebracht met 1/20 molaire azijnzuur-natrium-acetaat bufferoplossing (pH 4,5) , om adsorptie te bewerk- 15 stelligen.De geadsorbeerde fase werd geëlueerd met de lineaire concentratiegradient techniek die tot stand kwam door kon-tinu toevoegen van natriumchloride aan de bovenstaande buffer oplossing om de natriumchlorideconcentratie geleidelijk te verhogen tot 1,0 molair.De blauwe frakties die bij ongeveer 20 0,45 molair werden geëlueerd, werden verzameld, ontzout met

R

gebruik van Amberlite XAD-2, zoals eerder beschreven, en gelyofiliseerd waardoor 624 mg Cu-bevattend 3-/N-(3-amino-propyl)-N,N-dimethylamino7propylaminobleomycine werden verkregen in de vorm van een blauw amorf poeder.De ÜV absorptie- 25 maxima, gemeten in gedestilleerd water, lagen respektievelijk bij 292 ιημ en 243 ηιμ en E(l%/lcm) = 124 en 155.De IR absorp-tiemaxima (in golfgetal, cm *), gemeten in KBr-tablet, w ren 3425, 2975, 2925, 1720, 1640, 1560, 1460, 1400, 1370, 1330, 1300, 1250, 1200, 1140, 1100, 1060, 1010, 990, 930, 880, 760.

30 Andere fysisch-chemische eigenschappen waren als vermeld in Tabel J.

De in Tabel J vermelde verbindingen werden op een overeenkomstige wijze als boven beschreven gesynthetiseerd. _Tabel J___ 35 Gesynthetiseerde UV absorp- TLC Elektro verbinding met Als uitgangsmateriaal tie max. Cu- forese formule 2 gebruikt amine, ver- van Cu-be- bevat· Cu-bev.

Afkorting) binding met formule 4 vattend tend pood.

produkt,mu prod. *2 40 t 1%/lcm) _ XI m ___ff__ MMHH di-(3-aminopropyl)- 292(124) 0,81 1,10 _dimethylammoniumzout 243(155)_ 8.204 857 - 33 - _ Tabel J (vervolg)_ EEHH di-(3-aminopropyl)- 292(116) 0,82 1,06 __dl ethyl ammonlumzout 243(145)_ BBHH di-(3-aminopropyl)- 292(112) 0,73 1,04 5 __ dibutylammoniumzout 243(139)_ PP4M di-(3-aminopropyl)- 292(111) 0,42 1,15 methylbenzylammonium- 243(138) _zout ___ MBZHH 1,3-/di-(3-aminopro- 292(123) 0,70 1,03 10 pyl)-dimethylamino7" 244(152) _propaan______

Noot: s *1 Siliciumdioxidegel 60F 254 silanised (Merck Co.); methanol-6% ammoniumacetaat (45:55 op vol.basis).

15 *2 Avicel SF r (FMC Co.); mierezuur-azijnzuur-water (25:75:900); 800 V; 15 min.

Vergelijkingsvoorbeeld 2

Synthese van 3,4-di-(3’,4'-dichloorbenzoxy) benzaldehyde.

20 Aan een oplossing van 2 g 3,4-dihydroxybenzalde- hyde in 40 ml aceton werden 4,40 g watervrij-kaliumcarbonaat en 6,24 g 3,4-dichloorbenzylbromide toegevoegd.Het mengsel werd 24 uur onder terugvloeiing verhit.Het reaktiemengsel werd daarna door destillatie bij verlaagde druk ontdaan van 2 aceton, bermengd met 200 ml water, en het beoogde produkt werd geëxtraheerd met 200 ml chloroform.De chloroformlaag werd gedroogd boven watervrij natriumsulfaat en van chloroform ontdaan door destillatie bij verlaagde druk, waardoor witte kristallen neersloegen.De ruwe kristallen werden omge-30 kristalliseerd uit ethanol waardoor 4,99 g kleurloze kristallen werden verkregen met smpt. 18l-l83°C.Het IR absorptie-spektrum, gemeten in KBr-tablet, vertoonde de volgende ab-sorptiemaxima (in golfgetal, cm A) : 658, 693, 710, 760, 795, 805, 830, 875, 1030, 1135, 1168, 1200, 1245, 1280, 1370, 35 1403, 1437, 1460, 1470, 1510, 1585, 1600, 1690, 2730, 2830, 2870, 2910, 3070.

Het k.m.r.spektrum, gemeten in deutero-chloroform, vertoonde de volgende signalen: 5,20 (s) 2H; 6,93-7,67(m) 9H; 5,23 (s) 2H; 9,87 (s) 1H.

40 De verbindingen als vermeld in Tabel K

werden op een overeenkomstige wijze als hierboven beschreven verkregen.

8204857 - 34 - __Tabel K_ üitgangs- Beoogd produkt verbinding Smelt-

Formule 9 Naam punt IR KMR

5 Formule 8_29_ 3.4- Dihydroxybenz- 3,4-di-p- 108-110 660,680,755, 5,16(s) aldehyde Chloorbenz- 800,835,848, 2H, _ oxy)-benz- 870,1013,1033 5,20(s)

p-Chloorbenzyl- alaehyde 1090,1135,1168 2H

10 bromiae 1208,1236,1270 6,9- 1350,1380,1407 7,6

1437,1456,1493 (m) 11H 1510,1575,1585 9,82(s) 1600,1685,1900 1H

15 2740,2870,2910 _3070_ 3.4- Dihydroxybenz- 3,4-di-(p- Olie- 750,764,790, 3,88(s)

aldehyde Methoxybenz- achtig 820,860,875, 6H

_ oxy)benzal" 935,960,985, 5,18 (s)

20 ?-*eth?YbenZYl dehyde 1000,1028,1118, 2H

cnioriae il70, 1187,1235, 5,22(s)

1255,1270,1310, 2H

1340,1390,1430, 6,83- 1465,1520,1590,1620 7,6

25 1700,2740,2850,2880, (m) 11H

_2950,3030_ 4-Hydroxybenzal- 4— (,4-Benzozy- 102-104 690,725,795 5,07(s)

dehyde benzoxy)- 810,845,875, 4H

. _ , . benzaldehyde 995,1030,1035 6,85- 30 4-Benzoxybenzyl- 1115,1165,1180 7,93

chloride .1215,12.45,1260 (m) 13H

1305,1315,1385, 9,83(s)

1425,1453,1515, 1H

1575,1603,1695,1895 35 2750,2810,2830,2875, _2910,2950,3050,3075_ 4-Hydroxybenzal- 4-(Cyclooct- Olie- 830,860,1010 1,6(br.

dehyde ylmethoxy)- achtig 1033,1110, s)

benzaldehyde 1160,1215,1255 15H

Cyclooctylmethyl- 1313,1360,1393, 3,78 40 bromide 1425,1445,1465 0 J = 1710,1787,1600, 1,1 Hz) 1692,2740,2855, 2H, 2920. 6,96; 7,80 45 (A2B2,J= 1/4 Hz), 9,86(s)

_1H

Vergelijkingsvoorbeeld 3 50 Bereiding van cyclotridecaancarbaldehyde.

Aan een geroerd mengsel van 3 g zinkstof, 50 ml watervrij tetrahydrofuran en 2,66 g dibroommethaan werd druppelsgewijs een oplossing van 2,13 g watervrij titaante- 3204857 - 35 - trachloride in 5 ml dichloomethaan toegevoegd.Na 15 min. werd aan de verkregen oplossing druppelsgewijs een oplossing van 2 g cyclotridecanon in 8 ml watervrij tetrahydrofuran toegevoegd.Men liet het mengsel 12 uur bij kamertemperatuur 5 reageren.Het reaktiemengsel werd verdund met 50 ml pentaan, vermengd met 100 ml 1 molair zoutzuur en door schudden door eengemengd.De organische laag werd achtereenvolgens gewassen met water, verdunde waterige natriumwaterstofcarbonaatoplos-sing, en verzadigde waterige natriumchlorideoplossing, daar-10 na gedroogd en geconcentreerd waardoor methyleencyclotride-caan werd verkregen.Aan een oplossing van deze stof in 40 ml watervrij dichloomethaan werd, nadat deze op -15°C was gekoeld, een oplossing van 2,64 g m-chloorperbenzoëzuur in 40 ml watervrij dichloomethaan toegevoegd.Na 3 uur reageren 15 werd de organische laag achtereenvolgens gewassen met 10% natriumsulfietoplossing, 7% natriumwaterstofcarbonaatoplos-sing, en verzadigde natriumchlorideoplossing, daarna gedroogd en onder verlaagde druk geconcentreerd.Het residu werd gezuiverd door siliciumdioxidegel chromatografie /ontwikkeld met 20 een petroleumether-ethylacetaat (20:1) mengsel? waardoor 2,04 g (95% opbrengst, betrokken op de ketonverbinding) werden verkregen van een epoxyverbinding.Aan een oplossing van de epoxyverbinding in watervrij dichloomethaan werd, nadat deze was afgekoeld tot -18°C, druppelsgewijs een boortriflu-25 oride-ether complex toegevoegd.Na voltooiing van het toevoegen werd aan het reaktiemengsel water toegevoegd.De organische laag werd afgescheiden, daarna geconcentreerd en gezuiverd door siliciumdioxidegel chromatografie, waardoor een olieachtig cyclotridecaancarbaldehyde werd verkregen in een 30 opbrengst van 60-70%.Het IR absorptiespektrum van de verbinding, gemeten in KBr-tablet, vertoonde de volgende absorptie-maxima: 723, 735, 825, 970, 1070, 1110, 1128, 1196, 1220, 1225, 1285, 1350, 1420, 1450, 1465, 1590, 1710, 1735, 2700, 2870, 2920.

35 Het KMR spektrum, gemeten in deutero-chlo- roform, vertoonde de volgende signalen: 1,39 (br.s) 24H; (-CH2- x 12), 2,1-2,5 (m) 1H; (-CH) 9,58 (d, 3 = 1,8 Hz) 1H (-CHO).

8204857

Claims (12)

1. Een aminopropylaminobleomycine met de onderstaande algemene formule of een zout daarvan: /BX7-NH-(CH2)3-A-(CH2)3-B waarin /Bx7 een groep van bleomycinezuur voorstelt, die ge-5 vormd is door verwijdering van de hydroxygroep van de carbox-ylgroep van dat zuur; A een groep voorstelt met de formule rt v RT R! 11 / \ il il -N- , -NOf -N - R - N- , 'V. *2 «2 waarin een korte keten alkyl of benzylgroep is, R2 een 10 korte keten alkyl of benzylgroep is, R een korte keten alk- yleengroep is, en n gelijk is aan 0 of 1; en B een groep voorstelt met de formule R. |4 -N - R3, waarin R3 en R^ ieder (1) een waterstofatoom, of (2) een 15 alkylgroep, die desgewenst gesubstitueerd is door één of meer fenyl, naftyl, anthranyl, furyl, thiofeen, norborneen of cy-cloalkylgroepen ^deze substitutiegroepen kunnen verder gesubstitueerd zijn door één of meer halogeenatomen of korte keten alkyl, korte keten alkoxy, cyaan, halogeenmethyl, of 20 benzoxygroepen (de benzoxygroep kan gesubstitueerd zijn door één of meer halogeenatomen of korte keten alkoxy, benzoxy of cycloalkylmethoxygroepen)>7 / vooropgesteld dat tenminste één van beide groepen R3 en R^ een andere groep dan een waterstofatoom is. 25

2. Een aminopropylaminobleomycine of een zout daarvan volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat A een groep CH-, CH-, R. / \ I ^ I J | 1 -N^_^N-, -N· - (CH2) 3 - N - , of -N- CH3 CH3 ^R2^n is (waarin R^ een korte keten alkylgroep is, R2 een korte ke-30 ten alkyl of benzylgroep is, en n gelijk is aan 0 of 1); en R3 en R^ in B ieder (1) waterstof,(2) benzyl, die gesubstitueerd kan zijn door één of meer halogeenatomen of benzoxy, cyaan, halogeenmethyl, halogeenbenzoxy, of cycloalkylmethoxy-groepen, (3) naftylmethyl, (4) halogeenfenylethyl of (5) een 8204857 .- 37 - korte keten alkyl, gesubstitueerd door een cycloalkyl met 8-13 koolstofatomen is.

3. Een aminopropylaminobleomycine of zout daar van volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat 5. een groep CH^ ^^ - N - of -N^_- is; in B een benzylgroep, een benzylgroep gesubstitueerd door één of meer benzoxygroe-pen, een methylgroep gesubstitueerd door een cycloalkyl met 11-13 koolstofatomen, is en R4 in B een waterstofatoom, een 10 benzylgroep of een benzylgroep gesubstitueerd door één of meer benzoxygroepen is. 4. 3- N-Methyl-N-/3(cycloundecanylmethylami-no)propyl7amino propylaminobleomycine. 15 5. 3- N-Methyl-N-/31-(di-(m,p-dibenzoxybenzyl) amino propyl7amino propylaminobleomycine. 6. 3-^4'-(3"-dibenzylaminopropyl)piperidyl7 20 propylaminobleomycine.

7. Werkwijze voor de bereiding van een amino-propylaminobleomycinederivaat, m et het kenmerk, dat men een verbinding met de onderstaande formule of een 25 zout daarvan: /bx7-nh-(ch2)3-a-(ch2)3-b bereidt, waarin /Bx7een groep van bleomycinezuur is, gevormd door de verwijdering van de hydroxygroep uit de carboxylgroep van dat zuur; A een groep voorstelt met de formule 30 R, /__Λ R, R, t 1 y—^ (1 ,1 - N - , - N N - , of - N - R - N - , ' \_/ I * R2 n r2 R2 waarin R^^ een korte keten alkyl of benzylgroep is, R2 een korte keten alkyl of benzylgroep is, R een korte keten alk-35 yleengroep is, en n gelijk is aan 0 of 1; en B een groep is met de formule R4 - N - R3 waarin R^ en R4 ieder (1) een waterstofatoom of (2) een alkyl 8204857 V - 38 - groep, gesubstitueerd door één of meer fenyl, naftyl, anthra-nyl, furyl, thiofeen, norboraeen, of cycloalkylgroepen zijn /deze substitutiegroepen kunnen verder gesubstitueerd zijn door één of meer halogeenatomen of korte keten alkyl, korte 5 keten alkoxy, cyaan, halogeenmethyl, of benzoxygroepen(de benzoxygroep kan gesubstitueerd zijn door één of meer halo-geenatömen of korte keten alkoxy, benzoxy of cycloalkylmeth-oxygroepen/7; vooropgesteld dat tenminste één van de groepen en een andere groep dan waterstof atoom is, doordat men 10 een aminopropylaminobleomycine met formule /bx7-nh-(ch2)3-a-(CH2)3“NH2 waarin /Bx7 en A de bovenstaande betekenis hebben reductief kondenseert met een carbonylverbinding met formule Rc - CO - Rc 5 6 15 waarin R^ en Rg ieder (1) een waterstofatoom, (2) een cyclo-alkyl, (3) een alkyl, die gesubstitueerd kan zijn door één of meer cycloalkyl of fenylgroepen (de fenylgroep kan verder gesubstitueerd zijn door een halogeenatoom), (4) een fenyl, die gesubstitueerd kan zijn door één of meer halogeenatomen 20 of korte keten alkyl, cycloalkylmethoxy, korte keten alkoxy, benzoxy, korte keten alkoxybenzoxy, of benzoxybenzoxygroepen, (5) naftyl, (6) thiofeen, (7) furyl, (8) anthranyl, of (9) norborneen, zijn; vooropgesteld dat tenminste één van de groepen R^ en Rg een andere groep is dan een waterstofatoom. 25

8. Werkwijze volgens conclusie 7, m e t het kenmerk, dat A _ CH_ CH0 R. /-\ I 3 ,3 11 -N N- , -N - (CH-), -N-, Of -N - \_/ * Δ Λ \ J CH3 ch3 <ty„ waarin R^ een korte keten alkylgroep is, R2 een korte keten 30 alkyl of benzylgroep is, en n gelijk is aan 0 of 1; en R^ en Rg van de carbonylverbinding ieder (1) een waterstofatoom, (2) een cycloalkyl, (3) een alkyl, gesubstitueerd door een halogeenfenyl, (4) fenyl, die gesunstitueerd kan zijn door één of meer halogeenatomen of benzoxy, cyaan, halogeenmethyl, 35 halogeenbenzoxy, korte keten alkoxybenzoxy, benzoxybenzoxy, of cycloalkylmethoxygroepen, cf (4) een naftylgroep zijn.

9. Werkwijze volgens conclusie 7, m e t het 8204857 - 39 - kenmerk , A een groep qj I 3 ,-s - N - of - _ja - is, R5 een waterstofatoom is, en Rg een fenylgroep is, die gesubstitueerd kan zijn door één of meer benzoxy of cyclo-5 alkylgroepen.

10. Werkwijze volgens conclusie 7, m e t het kenmerk , dat A een groep CH^ y___ - N - of - \ - is, 10 en Rg-CO-Rg cycloundecaancarbaldehyde of benzaldehyde is, welke laatste gesubstitueerd kan zijn door één of meer benzoxygroepen.

11. Werkwijze volgens êên of meer van de con-15 clusies 7-10, met hetkenmerk, dat men de kondensa tie uitvoert in een oplosmiddel en in aanwezigheid van een reduktiemiddel bij -5°C tot 70°C gedurende 3 tot 70 uur.

12. Werkwijze volgens één of meer van de con-20 clusies 7-11, met het kenmerk, dat men een mol. verhouding van het aminopropylaminobleomycine tot de carbon-ylverbinding gebruikt van 1: 0,5-25.

13 Werkwijze volgens conclusie 11, m e t 25 het kenmerk, dat men als oplosmiddel methanol, water, dimethylformamide, acetonitril of een mengsel daarvan gebruikt.

14. Werkwijze volgens conclusie 11, m e t 30. e t kenmerk, dat men als reduktiemiddel een boor-hydrideverbinding of palladium-koolstof gebruikt.

15. Een amine met de formule H2N-(CH2)3-A'-(CH2)3-NH2 35 waarin A’ een groep voorstelt met de formule R. R. R. .1 11 11 -N- , of-N-R-N- , waarin Rv en R0 ieder een korte I i » 12 R2 R2 R2 keten. alkyL- of *benzyIqroep zi-jn, en- R. een. korte keten alkyl-40 eengroep is. I 8204857 I