MEDICIÓN DEL GRADO DE POLIMERIZACIÓN PARA SACARIDOS CAPSULARES MENINGOCOCICOS QUE CONTIENEN ACIDO SIÁLICO
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se encuentra en el campo del análisis y control de calidad de vacunas que incluyen sacáridos capsulares bacterianos, y en particular aquellos en donde los sacáridos son conjugados a un portador. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los inmunógenos que comprenden antígenos sacáridos capsulares bacterianos conjugados a proteínas portadoras, son bien conocidos en la técnica. La conjugación convierte los antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, con lo cual se mejoran las respuestas de memoria y se permite que se desarrolle una inmunidad protectora, y la vacuna conjugada prototipo fue para Haemophilus influenzae TIPO B
(Hib) [por ejemplo, ver capítulo 14 de la ref. 1] . Desde la vacuna de Hib, han sido desarrolladas las vacunas de sacárido conjugado para proteger contra Neisseria meningi tidis (meningococos) y contra Streptococcus pneumoniae
(pneumococos) . Otros organismos donde las vacunas conjugadas son de interés, son Streptococcus agalactiae (estreptococos del grupo B) [2], Pseudomonas aeruginosa [3] y Staphylococcus aureus [4] . En vez del uso de sacáridos capsulares de longitud REF:177907 completa, es posible seleccionar fragmentos de oligosacáridos del tamaño deseado, después de un paso de hidrólisos [por ejemplo, referencia 5], y se ha reportado que los conjugados elaborados con los oligosacáridos de longitud de cadena intermedia ofrecen inmunogenicidad mejorada [por ejemplo, referencias 6 y 7]. De las tres vacunas conjugadas de N-meningi tidis serogrupo C que han sido aprobadas para el uso humano, Menjugate^ [8] y meningitec1* están basadas en oligosacáridos, mientras que ?eisVac-C1^ utiliza el polisacárido de longitud completa. La medición de la longitud del oligosacárido (por ejemplo mediante la medición del grado de polimerización, o "DP" por ejemplo el número de unidades repetidas, en la cadena) puede por lo tanto ser utilizado para evaluación indirecta de la inmunogenicidad. Donde son incluidos fragmentos de oligosacáridos en una vacuna, el control de calidad para la fabricación y liberación requiere que los oligosacáridos tengan una longitud definida, y que está longitud sea consistente entre los lotes. De este modo, DP es también útil en el control de calidad, y el directorio Europeo para la calidad de las medicinas (EDQM, por sus siglas en inglés) tiene una liberación de lote por la Autoridad de Control Oficial (OCABR, por sus siglas en inglés) para las vacunas de Hib conjugadas que requieren específicamente el envío de datos relacionados a DP, y la distribución del tamaño molecular de los sacáridos utilizados durante la fabricación. DP puede ser también utilizado para monitorizar la estabilidad de la vacuna. Los antígenos sacáridos pueden despolimerizarse fácilmente a temperaturas ambientales [9, 10] provocando una disminución de la inmunogenicidad y un incremento en la heterogeneidad de la vacuna. Tales cambios pueden ser monitorizados siguiendo el DP sobre el tiempo durante el almacenamiento. El DP promedio en un combinado oligosacárido puede ser medido utilizando un número de metodologías, y en algunos casos la .elección del método dependerá del sacárido bajo análisis. Las técnicas tales como análisis colorimétrico y/o enzimático han sido descritos para oligosacáridos a partir de Hib y de los serogrupos A y C de los meningococos [5, 11, 12], pero los inventores han encontrado que los enlaces glucosídicos en los sacáridos de los meningococos serogrupos W135 e Y ("MenWl35" y "MenY") significan que estas técnicas no pueden ser utilizadas. Aunque los métodos para medir DP de los sacáridos
MenA y MenC para vacunas conjugadas han sido previamente descritos [por ejemplo, referencias 5 y 13], sigue existiendo una necesidad para métodos que puedan ser aplicados a los sacáridos de los serogrupos W135 e Y. De este modo, un objetivo de la invención es proporcionar los mejoramientos o los métodos para la evaluación de DP de los sacáridos, y en particular para proporcionar métodos que puedan ser utilizados para medir DP para los sacáridos de los meningococos serogrupos W135 e Y. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los inventores han descubierto un método que puede ser utilizado para medir DP para los sacáridos capsulares de los serogrupos meningócicos W135 e Y. De este modo, la invención proporciona un proceso para medir el grado de polimerización de un sacárido capsular, caracterizado porque el sacárido es proveniente del serogrupo W135 o serogrupo Y de meningococos . El método es convenientemente realizado mediante la inclusión de un paso de separación cromatográfica. En una composición que comprende una población de sacáridos capsulares de diferente tamaño, la invención proporciona un proceso para medir el DP promedio. El proceso involucra típicamente la hidrólisis de los sacáridos para liberar los monosacáridos constituyentes, con el análisis que está basado en los monosacáridos. De este modo, la invención proporciona un proceso para medir el grado de polimerización de un sacárido capsular a partir de un serogrupo W135 o serogrupo Y de meningococos, en donde el proceso comprende los pasos de: (i) hidrolizar el sacárido para dar un hidrolizado de sacárido que contiene subunidades monosacáridos; (ii) cuantificar las subunidades monosacáridos en el hidrolizado, en donde los resultados cuantitativos del paso (ii) son utilizados para calcular el grado de polimerización. Antes de la hidrólisis, el proceso involucra típicamente la modificación química de un residuo terminal (ya sea en el extremo reductor o en el extremo no reductor) del sacárido tal que, después de la hidrólisis a monosacáridos, el residuo terminal puede ser distinguido de los residuos no terminales. De este modo, la invención proporciona un proceso para medir el grado de polimerización de un sacárido capsular proveniente del serogrupo 135 o el serogrupo Y de meningococos, en donde el proceso comprende los pasos de: (i) modificar una subunidad monosacárida terminal del sacárido, para dar un monosacárido terminal modificado; (ii) hidrolizar el sacárido para dar un hidrolizado de sacárido que contiene subunidades monosacáridos, incluyendo el monosacárido terminal modificado; (iii) cuantificar las unidades monosacáridas a partir del hidrolizado; (iv) cuantificar el monosacárido terminal modificado a partir del hidrolizado; y (v) utilizar los resultados cuantitativos de los pasos (iii) y (iv) para calcular el grado de polimerización. El método es aplicado más en general a cualquier sacárido que contenga más de un tipo diferente de subunidad monosácarida e incluye un residuo terminal de ácido siálico. Ventajosamente, el método proporciona la información de DP con base únicamente en la cuantificación de los residuos de ácido siálico en un sacárido sin requerir análisis de cualquier tipo de monosacárido. De este modo, la invención proporciona un proceso para medir el grado de polimerización de un sacárido capsular, en donde: (a) el sacárido comprende subunidades monosacáridas de ácido siálico y subunidades monosacáridas de ácido no siálico; (b) el sacárido tiene una subunidad monosacárida de ácido siálico terminal; y (c) el proceso comprende los pasos de: (i) modificar una subunidad de ácido siálico terminal del sacárido, en una subunidad de ácido siálico terminal modificado; (ii) hidrolizar el sacárido para dar un hidrolizado de sacárido que contiene subunidades de ácido siálico, incluyendo subunidades terminales de ácido siálico, modificadas; (iii) cuantificar las subunidades de ácido siálico a partir del hidrolizado, incluyendo las subunidades de ácido siálico terminales, modificadas; y (iv) utilizar los resultados cuantitativos del paso (iii) para calcular el grado de polimerización. Un método preferido de la invención está basado en la reducción de los residuos de ácido siálico terminales sobre los sacáridos, con DP que es luego calculado por comparación de la proporción molar del ácido siálico total al ácido siálico reducido. La invención proporciona de este modo un proceso para medir el grado de polimerización de un sacárido capsular, en donde: (a) el sacárido comprende subundiades monosacáridas de ácido siálico y subunidades monosacáridas de ácido no siálico; (b) el sacárido tiene una subunidad monosacárida de ácido siálico terminal; y (c) el proceso comprende los pasos de: (i) reducir la subunidad de monosacárida de ácido siálico terminal para dar una subunidad monosacárida de ácido siálico reducido; (ii) hidrolizar el sacárido para dar un hidrolizado que contiene subunidades monosacáridas; (iii) determinar la proporción del ácido siálico total (por ejemplo, reducido y no reducido) a ácido siálico reducido en el hidrolizado. En términos de una composición que comprende una población de sacáridos capsulares de diferente tamaño, la invención proporciona un proceso para medir el grado promedio de polimerización de los sacáridos, en donde: (a) los sacáridos comprenden subunidades monosacáridas de ácido siálico y subunidades monosacáridas de ácido no siálico; (b) los sacáridos tienen subunidades monosacáridas de ácido siálico terminales; y (c) el proceso comprende los pasos de: (i) reducir las subunidades monosacáridas de ácido siálico terminal para dar las subunidades monosacáridas de ácido siálico reducido; (ii) hidrolizar los sacáridos para dar un hidrolizado de sacárido que contiene subunidades monosacáridas; (iii) determinar la proporción de ácido siálico total (por ejemplo, reducido y no reducido) al ácido siálico reducido en el hidrolizado. La composición puede incluir sacáridos que no tienen subunidades monosacáridas de ácido siálico terminal. Ha sido descrito [14] un método para analizar la longitud y composición de los sacáridos de ácido poli-siálico en el cual los residuos terminales son oxidados y/o reducidos, después de lo cual el sacárido es digerido con la enzima neuraminidasa para liberar sus subunidades monosacáridas de ácido siálico. No obstante, el proceso de la técnica anterior fue descrito únicamente para los sacáridos compuestos únicamente de ácidos siálicos (incluyendo N-acetil-neuramínico, ácido N-glicolil-neuramínico y ácido siálico desaminado) y estuvo técnicamente limitado a los sacáridos que pueden ser enzimáticamente escindidos en monosacáridos . En contraste, el método de la invención puede tratar a los sacáridos que incluyen monosacáridos de ácido no siálico, y no requiere (pero no excluye) el uso de hidrólisis enzimática. Los inventores han descubierto también un método que puede ser utilizado para medir DP para los sacáridos capsulares del serogrupo C de meningococos . El método está nuevamente basado en la reducción de los residuos de ácido siálico terminal, con el DP que es calculado de la misma manera. El método es aplicado además en general a cualquier sacárido que contenga residuos de ácido siálico que estén enlazados a2—>9. Preferentemente, el método no involucra la despolimerización enzimática. La invención proporciona de este modo un proceso para medir el grado de polimerización de un sacárido capsular, en donde: (a) el sacárido comprende subunidades monosacáridas de ácido siálico que están enlazadas a2—9 ; (b) el sacárido tiene una subunidad monosacárida de ácido siálico terminal; y (c) el proceso comprende los pasos de: (i) reducir la unidad monosacárida de ácido siálico terminal, para dar una subunidad monosacárida de ácido siálico reducido; (ii) hidrolizar el sacárido para dar un hidrolizado que contiene subunidades monosacáridas; (iii) determinar la proporción del ácido siálico total (por ejemplo, reducido y no reducido) a ácido siálico reducido en el hidrolizado. En términos de una composición que comprende una población de sacáridos capsulares de diferente tamaño, la invención proporciona un proceso para medir el grado promedio de polimerización de los sacáridos, en donde: (a) el sacárido comprende subunidades monosacáridas de ácido siálico que están enlazadas a2—>9; (b) los sacáridos tienen subunidades monosacáridas de ácido siálico terminal; y (c) el proceso comprende los pasos de: (i) reducir las subunidades monosacáridas de ácido siálico terminal, para dar subunidades monosacáridas de ácido siálico reducido; (ii) hidrolizar los sacáridos para dar un hidrolizado que contiene subunidades monosacáridas; (iii) determinar la proporción del ácido siálico total (por ejemplo, reducido y no reducido) al ácido siálico reducido en el hidrolizado.
Ha sido descrito [14] un método para analizar la longitud y composición de los sacáridos de ácido poli-siálico en el cual los residuos terminales son oxidados y/o reducidos, después de lo cual el sacárido es digerido con la enzima neuraminidasa para liberar sus subunidades monosacáridas de ácido siálico. No obstante, el proceso de la técnica anterior fue descrito únicamente para los sacáridos compuestos de ácidos siálicos enlazados a a2->8, y estuvo técnicamente limitado a los sacáridos que pueden ser enzimáticamente escindidos en monosacáridos. En contraste, el método de la invención está relacionado con ácidos siálicos enlazados a2—»9 , y preferentemente utiliza la hidrólisis no enzimática, típicamente la hidrólisis química (por ejemplo, acida) . Un método para determinar la longitud de un sacárido del serotipo C es conocido [5] donde DP fue determinado por comparación de la proporción entre el ácido siálico total y el formaldehído generado por el tratamiento con peryodato del sacárido MenC. Este método de la técnica anterior involucra la modificación en el extremo no reductor del polímero, y no involucra la generación del sialitol. Sacáridos capsulares que contienen residuos de ácido siálico y residuos de ácido no siálico En algunas modalidades, la invención proporciona los métodos para analizar los sacáridos que comprenden subunidades monosacáridas de ácido siálico y subunidades monosacáridas de ácido no siálico. Más en particular, los sacáridos están preferentemente constituidos de unidades repetidas, y las unidades repetidas consisten de subunidades monosacáridas de ácido siálico y subunidades monosacáridas de ácido no siálico. Dos sacáridos particulares de interés son los sacáridos capsulares de Neisseria miningi tidis serogrupos W135 e Y. Los sacáridos tienen naturalmente un residuo de ácido siálico en su extremo reductor; y tienen ya sea glucosa o galactosa en el extremo no reductor. El ácido siálico en los sacáridos nativos de estos serogrupos es el ácido N-acetil-neuramínico o "NeuNAc" . El sacárido del serogrupo W135 es un polímero que consiste de unidades disacáridas de ácido siálico-galactosa. Este tiene una O-acilación variable en las posiciones 7 y 9 del ácido siálico [15]. La estructura es mostrada en la figura 1 y es escrita como: ?4) -D-Neup5Ac (7/90Ac) -a(2?6) -D-Gal-a- (l? El sacárido del serogrupo Y es similar al sacárido del serogrupo W135, excepto que las unidades repetidas del disacárido incluyen glucosa en vez de galactosa (ver figura 3) . Éste tiene una O-acetilación variable en las posiciones 7 y 9 del ácido siálico [15]. La estructura del serogrupo Y es mostrada en la figura 2 y es escrita como: ?4)-D-Neup5Ac (7/90Ac) -a(2-6 ) -D-Glc-a- ( l? En otras modalidades, la invención proporciona los métodos para analizar los sacáridos que comprenden ácidos siálicos (a2—>9) -enlazados . El sacárido capsular del serogrupo C es un homopolímero de ácido siálico (a2—>9) -enlazado con 0-acetilación variable en las posiciones 7 y/o 8. Las cápsulas de los serogrupos C, W135 e Y difieren del serogrupo A, que tiene un homopolímero de N-acetil-D-manosamina-1-fosfato (al—6) -enlazado, y el serogrupo B, el cual tiene un homopolímero de ácido siálico (a2—>8) -enlazado. Grado de polimerización El grado de polimerización de un sacárido es definido como el número de unidades repetidas en ese sacárido. Para un homopolímero, el grado de polimerización es de este modo el mismo que el número de unidades monosacáridas. Para un heteropolímero, no obstante, el grado de polimerización es el número de unidades monosacáridas en la cadena completa, dividido entre el número de unidades monosacáridas en la unidad repetida mínima, por ejemplo el DP de (Glc-Gal)?o es 10 en vez de 20, y el DP de (Glc-Gal-Neu) 10 es 10 en vez de 30. Dentro de una mezcla de sacáridos que tienen la misma estructura repetida básica, pero diferentes longitudes
(por ejemplo, en un hidrolizado parcial de un oligosacárido largo) , entonces es normal medir el DP promedio de una población, en vez de medir el DP de moléculas individuales. Si el intervalo de tamaño es demasiado grande, tal que un valor promedio no será significativo, entonces es posible medir el DP para las fracciones individuales de una mezcla después de la separación (por ejemplo, después de la separación por tamaño). En general, la invención será utilizada para medir el DP promedio de las composiciones que contienen sacáridos de longitud mixta. Reducción de la subunidad monosacárido de ácido siálico terminal La invención es utilizada para analizar los sacáridos que tienen residuos de ácido siálico terminal. En particular, ésta es utilizada para analizar los sacáridos que tienen residuos de ácido siálico en el extremo reductor. Cualquier química adecuada puede ser utilizada para la reducción del residuo de ácido siálico terminal, que involucra en general la incubación del sacárido con un agente reductor. Las condiciones adecuadas para cualquier agente reductor dado y cualquier sacárido dado pueden ser determinadas mediante análisis rutinario. Un agente reductor preferido es el borohidruro de sodio (NaBH4) , que reduce los residuos de ácido siálico terminales [14] bajo condiciones alcalinas. El producto de esta reducción es algunas veces denominado como sialitol [16]. La incubación con NaBH por 2 horas a 372C es en general adecuada. Después de la reducción en condiciones alcalinas es entonces preferentemente neutralizada una composición, por ejemplo, mediante la adición de acetato de amonio levemente ácido. Hidrólisis del sacárido para dar un hidrolizado de sacárido Después de la reducción del residuo de ácido siálico terminal, el sacárido es desintegrado en sus unidades monosacáridas constituyentes. En términos generales, la despolimerización de los sacáridos para producir monosacáridos puede ser realizada química o enzimáticamente. Si no existe enzima para realizar una reacción de escisión dada, no obstante, entonces debe ser utilizada la ruta química. La hidrólisis química de los sacáridos involucra en general el tratamiento ya sea con ácido o con base, bajo condiciones que son estándares en la técnica. Las condiciones para la despolimerización de los sacáridos capsulares a sus monosacáridos constituyentes, son conocidas en la técnica. Para los sacáridos del serogrupo W135 e Y, es preferida la hidrólisis acida. La hidrólisis acida utilizando ácido trifluoroacético (TFA, por sus siglas en inglés) puede ser utilizada para la hidrólisis de todos los serogrupos C, W135 e Y, con una temperatura de incubación relativamente menor que es preferida para el serogrupo C, para evitar la degradación de sus ácidos siálicos (90SC en vez de 100SC) . Un tratamiento con TFA típico involucra la adición de TFA a una concentración final de 2 M, seguido por el calentamiento a 90-1009C por 90 minutos. El sacárido del serogrupo C puede ser hidrolizado para el análisis del contenido total de sacárido, mediante tratamiento con HCl 100 mM a 802C por 2 horas [17]. Otras condiciones de hidrólisis típicas involucran las concentraciones milimolares de un ácido débil (por ejemplo, ácido acético) a temperaturas elevadas (por ejemplo, 70-80sC) . Son disponibles las enzimas para escindir los enlaces a2—»9 encontrados en el serogrupo C, y éstos pueden ser utilizadas con la invención. No obstante, las enzimas requieren en general que los sacáridos sean O-acetilados antes de la hidrólisis, de modo que si se desea mantener la 0-acetilación [15] entonces se prefiere hidrolizar el sacárido químicamente. La hidrólisis química puede ser también preferida donde la hidrólisis enzimática procede lentamente. Las enzimas para escindir los serogrupos W135 e Y no son en general disponibles. Aunque la invención ha sido definida anteriormente en términos de preparación en análisis de un hidrolizado que contiene subunidades monosacáridas, la invención puede ser también aplicada a los hidrolizados que contienen fragmentos di-sacáridos, tri-sacáridos, tetra-sacáridos, etc., del sacárido capsular, pero es más fácil preparar un hidrolizado de monosacáridos. Las condiciones de hidrólisis que proporcionan una población homogénea de di-, tri-, tetra-, etc. -sacáridos, tal que existe únicamente un compuesto simple que va a ser cuantificado, son mucho más difíciles de controlar que permitir simplemente que proceda la despolimerización hasta la terminación, por ejemplo, para dar los monosacáridos . Después de la despolimerización, los hidrolizados de sacáridos pueden ser secados, por ejemplo, utilizando un secador a vacío. Determinación de la proporción de ácido siálico total al ácido siálico reducido La hidrólisis da un hidrolizado sacárido que contiene las subunidades monosacáridas del sacárido original . En las modalidades en donde los sacáridos comprenden subunidades de ácido siálico y subunidades de ácido no siálico, el hidrolizado contendrá monosacáridos de ácido siálico y ácido no siálico. En las modalidades donde los sacáridos son homopolímeros de ácido siálico, entonces el hidrolizado contendrá únicamente ácidos siálicos; en ambos casos, una fracción de los monosacáridos de ácido siálico estarán en una forma modificada (por ejemplo, una forma reducida) . Esta fracción puede ser utilizada para determinar el DP del sacárido original. Por ejemplo, si uno de diez de los residuos de ácido siálico en la mezcla es un residuo modificado en la unidad repetida mínima del sacárido, contiene un residuo de ácido siálico simple, entonces el sacárido original tiene un DP de 10. Pueden ser determinadas las cantidades de los monosacáridos individuales en los términos de los números (por ejemplo, moles) de las moléculas, masas, proporciones o concentraciones. Es típico trabajar en moles, con el fin de simplificar el cálculo de las proporciones, particularmente donde los monosacáridos constituyentes tienen diferentes masas moleculares, pero cualquiera de estas medidas puede ser utilizada e intercambiada para determinar el contenido de monosacárido de las mezclas. Para la medición cuantitativa, los resultados analíticos pueden ser comparados a un estándar con un contenido conocido de sacárido particular. La mezcla despolimerizada es preferentemente hidrolizada completamente hasta monosacáridos. Los inventores han encontrado que la hidrólisis incompleta ocurre algunas veces, dando mezclas en las cuales están presentes fragmentos de disacáridos (por ejemplo, Gal-NeNAc para Men l35, y Glc-NeuNAc para MenY) . Por ejemplo, el tratamiento de los sacáridos MenWl35 o MenY con TFA 2M a 902C, se ha observado que da una mezcla de monosacáridos y disacáridos, mientras que el incremento de la temperatura de hidrólisis hasta 100SC da sustancialmente sólo monosacáridos. La hidrólisis incompleta incluso a 90SC no fue esperada, pero se ha observado ahora que la persona experta en la técnica puede, si es necesario, modificar cualquier método de hidrólisis particular para asegurar la hidrólisis total, por ejemplo, mediante el incremento de la temperatura, etc. • Los métodos para cuantificar los monosacáridos de ácido siálico son bien conocidos en la técnica. Los métodos pueden ser directos o indirectos (por ejemplo, éstos pueden involucrar derivatización de los monosacáridos, seguido por un análisis que correlaciona con el contenido original de monosacáridos) . Los métodos preferidos pueden analizar el ácido siálico en presencia de otros monosacáridos, tal que éstos no necesitan ser separados uno del otro antes del análisis. Además, pueden ser utilizados los métodos para sacáridos conjugados en los cuales, después de la desconjugación, el portador y el sacárido no necesitan ser separados. Un método tal es la cromatografía aniónica, y en particular la cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC, por sus siglas en inglés) , usualmente con detección anperométrica pulsada (PAD, por sus siglas en inglés) [18, 19]. Los sistemas HPAEC-PAD son proporcionados por la Corporación Dionex" (Sunnyvale, CA) , por ejemplo sistema el BioLC*1, utilizando una columna tal como PAl [sustrato de poliestireno de 10 µm de diámetro, 2% reticulado con divinilbenceno, aglomerado con látex funcionarizado con amonio cuaternario MicroBead de 500 nm (5% reticulado)] o PDA10 [sustrato de etilvinilbenceno de 10 µm de diámetro, 55% reticulado con divinilbenceno, aglomerado con ion de amonio cuaternario difuncional MicroBead 460 nm (5% reticulado)]. Estos sistemas pueden analizar cuantitativamente sacáridos individuales dentro de las mezclas, sin la necesidad para la derivatización o la separación pre-análisis . Para el análisis de sacáridos puede ser deseado el filtrar otros compuestos antes de la entrada a la columna, y Dionex1" produce trampas y protecciones pre-columna para este propósito, por ejemplo, una trampa de amino para eliminar aminoácidos, una trampa de borato, etc. • Un método alternativo para cuantificar los monosacáridos de ácido siálico dentro de una mezcla despolimerizada es la resonancia magnética nuclear (RMN) . Para facilidad de uso y para alta sensibilidad, no obstante, son preferidos los métodos cromatográficos de la invención. Cualquiera que sea el método elegido, no obstante, en algunas modalidades de la invención es importante que el ácido siálico reducido pueda ser distinguido del ácido siálico no reducido. Esto puede involucrar señales únicas provenientes de cada uno, o puede involucrar una señal única y una señal combinada, con la diferencia entre las dos señales que proporcionan la información necesaria. Otro método más para cuantificar los monosacáridos de ácido siálico es mediante ensayo colorimétrico [80]. Este método es particularmente útil para cuantificar el ácido siálico no reducido después de la hidrólisis acida en TFA. Una vez que han sido determinadas las cantidades relativas del ácido siálico modificado y no modificado (por ejemplo, reducido y no reducido) entonces es simple establecer el DP del sacárido original . Además de cuantificar los ácidos siálicos en el hidrolizado, los métodos de la invención pueden involucrar la cuantificación de otros monosacáridos (por ejemplo, de glucosa o galactosa) que pueden ser derivados del mismo sacárido como los ácidos siálicos, o de otros sacáridos. Estas mediciones pueden ser utilizadas para determinar parámetros diferentes de DP, o pueden ser utilizados como parte de la determinación de DP, por ejemplo, como la confirmación o en lugar de la medición de ácido siálico total, particularmente donde las cantidades molares del ácido siálico y otros monosacáridos son las mismas, como en los sacáridos W135 e Y. El proceso de la invención es típicamente destructivo. En vez de realizar el proceso sobre una composición completa, por lo tanto, es más típico tomar una muestra de una composición de interés y luego realizar el análisis sobre la muestra. Conjugados La invención es útil para analizar el contenido de sacárido de las vacunas, y en particular para vacunas que comprenden un sacárido conjugado. La conjugación covalente es utilizada para aumentar la inmunogenicidad de los sacáridos al convertirlos de antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, permitiendo de este modo el aprestamiento para la memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida [por ejemplo, revisada en las referencias 20 a 29]. Los sacáridos pueden ser enlazados a portadores directamente [30, 31], pero es en general utilizado un ligador o espaciador, por ejemplo, el ácido adípico, ß-propionamida [32], nitrofenil-etilamina [33], haluros de haloacilo [34], enlaces glucosídicos [35], ácido 6-aminocaproico [36], ADH [37], porciones de 4 a 12 átomos de carbono [38], etc. Las proteínas portadoras típicas en los conjugados son toxinas o toxoides bacterianos, tales como el toxoide de la difteria o el toxoide del tétanos. El derivado de la toxina de difteria CRM?97 [39-41] es la proteína portadora en Menjugate^ y Menigitec10*, mientras que el toxoide tetánico es utilizado en NeisVac1 . El toxoide de la difteria es utilizado como el portador en Menactra"1. Otras proteínas portadoras conocidas incluyen la proteína de membrana externa de N. meningi tidis [42], péptidos sintéticos [43, 44], proteínas de choque por calor [45, 46], proteínas de pertussis [47, 48], citocinas [49], linfocinas [49], hormonas [49], factores de crecimiento [49], proteínas artificiales que comprenden epitopos múltiples de células T CD4+ humanas, provenientes de diversos antígenos derivados de patógenos [50], proteína D proveniente de H. influenza [51, 52], proteína PspA de la superficie de pneuomococos [53], proteínas de captación de hierro [54], toxina A o B de C. difficile [55], etc. Las composiciones pueden utilizar más de una proteína portadora, por ejemplo, para reducir el riesgo de supresión del portador, y una proteína portadora simple puede llevar más de un antígeno sacárido [56]. Los conjugados tienen en general una proporción de sacáridos :proteína (p/p) de entre 1:5 (por ejemplo, exceso de proteína) y 5:1 (por ejemplo, exceso de sacárido) . Las composiciones pueden incluir la proteína portadora libre a partir de los conjugados [57]. La invención es particularmente útil antes de la conjugación en una etapa en donde es necesario asegurar que las cadenas sacáridas de tamaño correcto sean seleccionadas para la producción del conjugado. La invención permite el progreso de la fragmentación de un polisacárido de longitud completa antes de que sea verificada o monitorizada la conjugación. Donde los oligosacáridos de una longitud particular (o intervalo de longitudes) son deseados,' entonces es importante que la fragmentación del polisacárido no deba ser tan extensa como para tomar la despolimerización más allá del punto deseado (por ejemplo, en el extremo, para dar monosacáridos) . La invención permite que el progreso de esta despolimerización parcial sea monitorizado, mediante la medición de la longitud promedio de la cadena, sobre el tiempo. De este modo, la invención proporciona un proceso para medir el grado de polimerización del o de los sacáridos en una composición, que comprende los pasos de: (a) iniciar la despolimerización del o de los sacáridos en una composición; y, en uno o más puntos de tiempo, después de esto, (b) medir el DP del o de los sacáridos como se describió anteriormente. En una corrida inicial de experimentos, entonces será usual medir el DP a varios puntos de tiempo, con el fin de determinar el progreso sobre el tiempo, pero después de que han sido establecidas las condiciones estándares es entonces usual medir el DP a un punto de tiempo de ajuste para fines confirmatorios. Una vez que el DP está a un nivel deseado, entonces el proceso puede comprender el paso adicional de: (c) detener la despolimerización, por ejemplo, mediante lavado, separación, enfriamiento, etc. El proceso puede también comprender el paso adicional de conjugación del sacárido despolimerizado a una proteína portadora, después de la activación química opcional. La invención también permite la selección de cadenas oligosacáridas de una longitud deseada después de la fragmentación. De este modo, la invención proporciona un proceso para seleccionar sacáridos para el uso en la preparación de un glucoconjugado, que comprende los pasos de: (a) obtener una composición que comprende una mezcla de diferentes fragmentos de polisacáridos que tienen diferentes grados de polimerización; (b) separar la mezcla en submezclas; (c) determinar el DP de una o más submezclas utilizando un proceso como se describe anteriormente; y (d) utilizar los resultados del paso (c) para seleccionar una o más submezclas para el uso en la conjugación. El proceso puede involucrar la fragmentación del polisacárido antes del paso (a) o puede iniciar con una mezcla ya preparada. Los fragmentos pueden ser fragmentos del mismo polisacárido, por ejemplo, del mismo serogrupo. Después del paso (d) , el proceso puede comprender el paso de conjugación a una proteína portadora, después de la activación química opcional . Antes de la conjugación, es usual que un sacárido sea químicamente activado con el fin de introducir un grupo funcional que pueda reaccionar con el portador. Las condiciones para la activación del sacárido pueden provocar hidrólisis, y así pues es útil verificar el DP después de la activación. El término "sacárido" donde sea apropiado, debe ser considerado para incluir estos sacáridos activados. Además, la invención proporciona un proceso para preparar un sacárido activado para el uso en la preparación de un glucoconjugado, que comprende los pasos de: (a) obtener un sacárido; (b) activar químicamente el sacárido para introducir un grupo funcional que pueda reaccionar con una proteína portadora; y (c) medir el DP del producto del paso (b) como se describió anteriormente. El proceso puede incluir el paso adicional de: (d) hacer reaccionar el sacárido activado con la proteína portadora (que puede por sí misma ser activada) para dar el glucoconjugado. El proceso puede involucrar la fragmentación de un polisacárido antes del paso (a) o puede iniciar con una mezcla ya preparada. La invención puede ser también utilizada después de la conjugación. Después de la conjugación, las composiciones pueden ser analizadas utilizando la invención de tres maneras: primeramente, el DP de los sacáridos totales en una composición puede ser medido por ejemplo, antes de la mezcla de diferentes conjugados, o antes de la liberación de una vacuna (para fines de control de calidad y fines regulatorios) ; en segundo lugar, el DP del sacárido no conjugado libre en una composición puede ser medido, por ejemplo, para verificar la conjugación incompleta, o para seguir la hidrólisis del conjugado, mediante el monitoreo del incremento del sacárido libre sobre el tiempo; en tercer lugar, el DP del sacárido conjugado en una composición puede ser medido, por las mismas razones. La primera y tercera formas requieren que el sacárido sea liberado del conjugado antes del análisis. En situaciones donde la conjugación del sacárido involucró la reacción o modificación del residido de ácido siálico en su extremo reductor, no obstante, tal que el residuo ya no está disponible para la reducción, entonces la invención puede ser utilizada solamente para sacáridos donde el ácido siálico terminal pueda ser regenerado (o donde un ácido siálico terminal reducido pueda ser generado directamente) . Para evaluar separadamente los sacáridos conjugados y no conjugados, éstos deben ser separados. El sacárido libre, por ejemplo, no conjugado, en una composición acuosa puede ser separado del sacárido conjugado de diversas formas. La reacción de conjugación cambia varios parámetros químicos y físicos para el sacárido, y las diferencias pueden ser explotadas para la separación. Por ejemplo, la separación por tamaños puede ser utilizada para separar el sacárido libre y conjugado, ya que el material conjugado tiene una masa mayor debido a la proteína portadora. La ultrafiltración es un método preferido de separación por tamaño. Como una alternativa adicional, si los conjugados han sido adsorbidos a un adyuvante, entonces la centrifugación separará el conjugado adsorbido (pella) del sacárido libre (sobrenadante) que se resorbe después de la hidrólisis. La invención proporciona un método para analizar un glucoconjugado que comprende los pasos de: (a) tratar el glucoconjugado para liberar el sacárido del portador, y (b) medir el DP del sacárido liberado como se describe anteriormente. La invención proporciona un método para analizar una composición de glugoconjugado, que comprende los pasos de: (a) separar el sacárido no conjugado dentro de la composición del sacárido conjugado; y (b) medir el DP del sacárido no conjugado y/o conjugado, como se describió anteriormente . La invención también proporciona un método para liberar una vacuna para el uso por los médicos, que comprende los pasos de: (a) fabricar una vacuna que comprende un conjugado de un sacárido capsular, en donde el sacárido comprende subunidades monosacáridas del ácido siálico y subunidades monosacáridas de ácido no siálico; (b) analizar el DP del sacárido en la vacuna como se describió anteriormente; y, si los resultados del paso (b) indican un DP aceptable para el uso químico, (c) se libera la vacuna para el uso por médicos. El paso (b) puede ser realizado sobre una vacuna envasada o sobre una vacuna a granel antes del envasado . Sacáridos mixtos La invención permite el análisis de DP en composiciones que comprenden sacáridos capsulares meningocócicos que incluyen ácido siálico. Las composiciones pueden también comprender polisacáridos capsulares adicionales
(por ejemplo, un sacárido capsular del serogrupo A de N. meningi tidis, un sacárido capsular de H. influenzae b, etc.), con la condición de que estos sacáridos no contengan ácidos siálicos,' los cuales podrían interferir con el análisis completo. Donde más de un sacárido en una composición incluye residuos de ácido siálico, entonces los principios descritos en la referencia 58 pueden ser utilizados para distinguir los diferentes sacáridos. El sacárido capsular de meningococos del serogrupo A es un homopolímero de N-acetil-D-manosamina-1-fosfato, (al?6) -enlazado, con la O-acetilación parcial en las posiciones de los carbonos 3 y 4. Los grupos acetilo pueden ser reemplazados con grupos bloqueadores para prevenir la hidrólisis [10], y tales sacáridos modificados son todavía sacáridos del serogrupo A dentro del significado de la presente invención. El sacárido capsular de Hib es un polímero de ribosa, ribitol y fosfato. El sacárido es conocido como "PRP" (poli-3-ß-ribosa- (1, 1) -D-ribitol-5-fosfato) . Componentes sacáridos diferentes de los sacáridos capsulares Se prefiere que las composiciones para el análisis por la invención no incluya ácido siálico en forma libre (diferentes de cualesquiera monosacáridos antecedentes derivados de la hidrólisis del sacárido capsular) . Si está presente el ácido siálico libre, no obstante, entonces existen dos maneras generales en las cuales los problemas de interferencia pueden ser reducidos al mínimo, o evitados. Primeramente, los niveles iniciales del ácido siálico libre pueden ser medidos, y luego sustraídos de los niveles medidos en la mezcla despolimerizada. En segundo lugar, el ácido siálico libre puede ser eliminado de la composición antes del análisis, por ejemplo, mediante filtración o diálisis. Las membranas de ultrafiltración pueden ser utilizadas para remover los componentes de bajo peso molecular. Componentes no sacáridos Así como el análisis de los sacáridos en una composición, el proceso puede incluir el análisis de otros componentes o propiedades por ejemplo, la osmolaridad, el pH, el grado de polimerización para los sacáridos individuales o los conjugados, el contenido de proteína (particularmente para proteínas portadoras) el contenido de aluminio, el contenido detergente, el contenido conservador, etc. La invención proporciona un método para preparar una composición de vacuna, que comprende un paso del análisis de DP de un sacárido de acuerdo a la invención, y un paso de medición del pH de la composición, seguido opcionalmente por un paso de ajustar el pH de la composición a un valor deseado, por ejemplo, de 6 y 8 o aproximadamente 7. La invención también proporciona un método para preparar una composición de vacuna, que comprende los pasos de: (a) proporcionar el sacárido capsular analizado por DP como se describió anteriormente; (b) conjugar el sacárido analizado por DP a una o más proteínas portadoras; (c) opcionalmente analizar la vacuna a granel para el pH y/o otras propiedades; y si los resultados del paso (c) indican que la vacuna a granel es aceptable para el uso clínico; (d) la preparación y el envasado de la vacuna para el uso humano a partir del granel. El paso (c) puede involucrar la evaluación de la concentración mínima del sacárido, la evaluación de la proporción de sacárido no conjugado: conjugado, etc. El paso (d) puede involucrar el envasado en una forma de dosis unitaria o en forma de dosis múltiples, por ejemplo, dentro de frascos o dentro de jeringas. Una dosis humana típicamente para la inyección tiene un volumen de 0.5 ml . La invención también proporciona un método para preparar una composición de vacuna, que comprende los pasos de: (a) proporcionar el sacárido capsular analizado en DP, a partir del serogrupo W135 y/o Y, como se describió anteriormente; (b) conjugar el sacárido analizado en DP, a una o más proteínas portadoras, para dar el sacárido conjugado; y (c) mezclar el sacárido conjugado con uno o más antígenos adicionales, por ejemplo con: - un antígeno sacárido capsular del serogrupo C de N. meningi tidis . un antígeno sacárido capsular del serogrupo A de N. meningi tidis . un antígeno proteico del serogrupo B de N. meningi tidis . - preparaciones de microvesículas del serogrupo B de N.
meningi tidis [59], "OMVs nativos" [60], vejigas o vesículas de la membrana externa [por ejemplo, referencias 61 a 66, etc.]. un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae tipo b. un antígeno de Streptococcus pneumoniae, tales como los antígenos sacáridos conjugados polivalentes [por ejemplo, referencias 67 a 69]. un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como el virus inactivado [por ejemplo, 70, 71]. un antígeno del virus de la hepatitis B, tales como los antígenos de superficie y/o de núcleo [por ejemplo, 71, 72]. un antígeno de Bordetella pertussis , tal como la holotoxina de pertussis (PT) , y la hemaglutinina filamentosa
(FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o los aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, referencias 73 y 74]. Pueden ser utilizados antígenos celulares de pertusis. un antígeno de difteria, tal como toxoide de la difteria [por ejemplo, capítulo 3 de la referencia 75], por ejemplo, el mutante CRM?97 [por ejemplo, 76]. - un antígeno tetánico, tal como un toxoide del tétanos [por ejemplo, capítulo 4 de la referencia 75]. antígeno (s) de polio [por ejemplo, 77, 78] tal como IPV. Tales antígenos pueden ser adsorbidos a un adyuvante de sal de aluminio (por ejemplo, un hidróxido o un fosfato) . Cualesquiera antígenos sacáridos adicionales son preferentemente incluidos como conjugados. Consistencia lote a lote Para la fabricación de vacunas humanas, los sacáridos conjugados deben ser sometidos a control de calidad antes de la conjugación (por ejemplo, el sacárido y la proteína portadora) , después de la conjugación, después de la formulación y después del mezclado. Los métodos de la técnica anterior para la mención del DP no se refieren a los sacáridos provenientes de los serogrupos 135 e Y. Con la invención, no obstante, es ahora posible la medición de DP para estos dos serogrupos , y pueden ser combinados con los métodos para la medición de DP de los serogrupos A y C [5]. Además, los procesos de la invención son confiables y consistentes y de este modo permiten comparaciones válidas de diferentes lotes de conjugados mixtos A/C/ 135/Y, donde esto no era posible con los métodos de la técnica anterior. Los diferentes lotes de vacunas conjugadas mixtas pueden ser de este modo preparados, evaluados, y los lotes consistentes pueden ser seleccionados para la liberación y uso, mientras que los lotes aberrantes pueden ser rechazados. La invención proporciona dos lotes de una vacuna, en donde: (a) los dos lotes de la vacuna comprenden: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo A de Neisseria meningi tidis; (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningi tidis; (iii) un conjugado del sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningi tidis; (iv) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningi tidis; (b) el DP del sacárido del serogrupo A en el primer lote es Ai y el DP del sacárido del serogrupo A en el segundo lote es A2; (c) el DP del sacárido del serogrupo C en el primer lote es Ci; y el DP del sacárido del serogrupo C en el segundo lote es C2; (d) el DP del sacárido del serogrupo W135 en el primer lote es Wi; y el DP del sacárido del serogrupo W135 en el segundo lote es 2; (e) el DP del sacárido del serogrupo Y en el primer lote es Yi; y el DP del sacárido del serogrupo Y en el segundo lote es Y2; (f) las proporciones A?/A2/ C?/C2, W?/W2 e Y?/Y2, están cada entre 0.90 y 1.10, y preferentemente están cada una entre 0.95 y 1.05. Las proporciones especificadas en (f) pueden estar basadas en una muestra simple de cada lote que es comparado, pero típicamente estarán basadas en valores promedio (por ejemplo, las medias) a partir de muestras múltiples de cada lote. De este modo, los dos lotes pueden ser sometidos a muestreo múltiple, y cada muestra puede ser sometida a múltiples mediciones de A?/A2, C?/C2, x/ 2 e Y?/Y2, con los promedios que son luego calculados para cada lote, y con los promedios que son utilizados para calcular las proporciones necesarias . Cada lote de vacuna habrá sido preparado separadamente. Por ejemplo, dos diferentes lotes pueden ser elaborados por mezclados separados de los mismos conjugados simples a granel, o mediante el mezclado de conjugados simples a granel que fueron separadamente preparados. Diferentes muestras de la mezcla a granel no son lotes diferentes, ya que éstas muestras no son sometidas a variaciones de lote a lote que resultan de diferencias que surgen cuando se preparan mezclas de diferentes conjugados. Además de las características (a) a (f) como se especifican anteriormente, los dos lotes pueden además ser caracterizados por: (g) la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo A en el primer lote es A3; (h) la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo A en el segundo lote es j; (i) la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo C en el primer lote es C3; (j) la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo C en el segundo lote es C4; (k) la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo 135 en el primer lote es 3; si es aplicable, (1) la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo 135 en el segundo lote es W; (m) la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo Y en el primer lote es Y3; la concentración del sacárido no conjugado del serogrupo Y en el segundo lote es Y ; (o) las proporciones A3/A, C3/C , 3/ 4 e Y3/Y4, están cada una entre 0.90 y 1.10, y preferentemente están cada una entre 0.95 y 1.05. General El término "que comprende" abarca "que incluye", así como "que consiste" por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y. La palabra "sustancialmente" no excluye
"completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Donde sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención. El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x, significa, por ejemplo, x ± 10%. Se apreciará que los anillos de azúcar pueden existir en forma abierta y cerrada, y que, mientras que las formas" cerradas son mostradas en fórmula estructural en la presente, las formas abiertas son también abarcadas por la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1 y 2 muestran las fórmulas estructurales para los sacáridos capsulares de los serogrupos meningocócicos W135 e Y. La figura 3 muestra la diferencia entre los serogrupos 135 e Y. Las figuras 4 y 5 muestran los cromatogramas de los sacáridos MenY antes (4) y después (5) de la separación por tamaños . Las figuras 6 y 7 muestran los espectros ESI para los sacáridos MenWl35 (6) y MenY (7) . La figura 8 muestra la estructura del sacárido DP3 de MenWl35 por arriba de su espectro de 1H-RMN. La figura 9 muestra el mismo sacárido DP4 de MenY. Las figuras 10 a la 12 muestran perfiles de elución isocráticos de soluciones estándares de ácido siálico. La figura 13 muestra un perfil de elución en gradiente del oligosacárido MenY. La figura 14 muestra una curva estándar para el sialitol . La figura 15 muestra la disminución en DP de MenWl35 (D) y MenY (0) durante la despolimerización como se mide por HPAEC-PAD. Las figuras 16A-16B y 17A-17B muestran el incremento en los oligos de longitud corta durante el mismo proceso, para
MenWl35 (FIG. 16A-16B) y MenY (FIG. 17A-17B) , comparando el tiempo cero (FIG. 16A-17A) con las mezclas finales (FIG. 16B- 17B) . La figura 18 muestra un espectro ESI de DP5 de MenC, y la figura 19 muestra el análisis de HPAEC del mismo. La figura 20 es un perfil de elución en gradiente del oligosacárido MenWl35. El eje izquierdo muestra la detección amperométrica en nC; el eje derecho muestra el % de eluyente (acetato de sodio 100 mM + hidróxido de sodio 20 mM) . Las figuras 21A-21B son perfiles de elución en gradiente adicional del oligosacárido MenWl35. La figura 21A muestra una muestra estándar; y la figura 2IB muestra el material de MenWl35. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Preparación de las soluciones estándares de oligosacárido Los polisacáridos capsulares purificados del serogrupo W135 e Y (CPS) fueron preparados utilizando los métodos descritos en la referencia 79. Estos fueron suministrados como una solución a 10 mg/ml en ácido acético 0.01 M. Para hidrolizar los CPS, éstos fueron calentados a 70-802C por un periodo prolongado. Durante la hidrólisis, las muestras fueron obtenidas de las soluciones para el análisis, y fueron enfriadas y neutralizadas después de ser extraídas. Los fragmentos resultantes de esta hidrólisis tienen residuos terminales de ácido siálico, en vez de residuos terminales de glucosa o galactosa. Los oligosacáridos fueron luego purificados mediante cromatografía de intercambio iónico sobre una columna de Q-Sepharose, que se separa con base en el tamaño y la carga. Para la normalización inicial, el contenido de ácido siálico fue medido por un método modificado de Sevennerholm [80], mediante el cual fue leída la absorbancia a 564 nm. Las funciones específicas fueron aisladas y analizadas mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN) , mediante espectrometría de masa de electrorrocío y mediante HPAEC. El análisis HPAEC de los oligosacáridos utilizó ya sea una columna CarpoPac PA100 o una columna IonPac AS11 (ambas de 4 x 250 mm) sobre un sistema de cromatografía Dionex DX-500 equipado con una bomba GP40, detector ED40 y automuestrador AS3500. Las separaciones fueron realizadas a temperatura ambiente utilizando una velocidad de flujo de 1.0 ml/minuto . La columna PA100 utilizó los siguientes eluyentes:
A) acetato de sodio 500 nM + hidróxido de sodio 100 nM y B) hidróxido de sodio 100 nM. Una elución isocrática inicial con 10% de A (15 minutos) fue seguida por una elución en gradiente lineal desde 10% hasta 100% de A en 50 minutos. La columna ASll utilizó los siguientes eluyentes: A) hidróxido de sodio 100 M y B) agua, con una elución en gradiente lineal de 5% a 100% de A en 50 minutos. Los eluidos fueron monitorizados utilizando un detector electroquímico pulsado (ED40) en el modo amperométrico pulsado con un electrodo de trabajo de oro y un electrodo de referencia de Ag/AgCl . Una forma de onda de triple potencial fue aplicada utilizando los siguientes ajustes: El = 0.05 V, ti = 400 ms; E2 = 0.75 V, t2 = 200 ms ; E3 = 0.15 V, t3 = 400 ms . La integración ocurre de 200 ms a 400 ms durante la aplicación El. Los datos cromatográficos resultantes fueron integrados y procesados utilizando el software de reducción de datos Peak Net (Dionex) . El HPAEC de CarboPac PAlOO dio un perfil de los oligosacáridos MenWl35 y MenY. La calibración de los espectros fue realizada mediante comparación de los cromatogramas de oligosacáridos purificados y combinados, con caracterización paralela de los oligosacáridos purificados mediante ESI-MS, para permitir la correlación entre el número máximo o pico en el cromatograma y el DP de los oligosacáridos que eluyen. La espectrometría de masa ESI fue realizada sobre un analizador de masa Micromass ZQ-4000 equipado con una fuente de ionización de electrorrocío. El instrumento fue calibrado utilizando yoduro de sodio (2 g/l) y yoduro de cesio (50 mg/l) , diluido con alcohol isopropílico/agua 50/50 (v/v) . El voltaje capilar fue de 3 kV, el voltaje de cono fue 60 V. Las muestras fueron disueltas en acetonitrilo acuoso al 50% (v/v) + 0.1% de ácido fórmico, e inyectadas con velocidad de flujo de 10 µl/minuto. Los espectros fueron registrados en el modo de ion positivo con intervalo de exploración de 200 a 2000 m/z. Las figuras 4 y 5 muestran los cromatogramas de HPAEC (columna PAlOO) para la mezcla de oligosacárido MenY antes (Figura 4) y después (Figura 5) de la separación por Q-Sepharose. El análisis ESI del pico a aproximadamente 38 minutos confirmó que éste era un oligosacárido MenY con un DP de 4 (Figura 7) . Experimentos similares fueron realizados para MenWl35, con la Figura 6 que muestra un espectro ESI de un oligosacárido DP3. En el análisis ESI, una especie molecular simple puede mostrar iones moleculares múltiples en el espectro, correspondiente a la molécula progenitora con números variantes de la sustitución de O-acetilo y aducto de iones sodio. Los iones sodio aductos pueden surgir de la presencia de algunas cantidades de sodio durante el análisis de la muestra, y son comúnmente observados con los espectros de masa de los oligosacáridos. Además, la molécula progenitora puede asumir diferentes números de cargas positivas, y así pues una molécula oligosacárida puede producir muchos diferentes iones positivos, dependiendo de la sustitución del O-acetilo, los aductos de sodio y el número de carga positiva. Existen de este modo grandes números de iones positivos en las Figuras 6 y 7. En la Figura 6, los picos entre 700-800 y 1400-1526 m/z corresponden a iones doblemente cargados y simplemente cargados, respectivamente, resultantes de la adición de los cationes sodio y grupos O-acetilo. Estos fueron asignados a las siguientes masas monoisotópicas, las cuales corresponden a aquellas de un oligosacárido trímero (Men l35 DP3 ) :
Iones Iones O-acetilo NaL Carga observados esperados9 1400.6 1401.4 0 1 ? 1442.8 1443.4 1 1 1
1484.8 1485.4 2 1 1
1526.5 1527.4 3 1 1 712.0 712.7 0 2 2 723.0 1 2 733.1 733.7 1 2 744.2 2 754.0 754.7 2 2 764.1 3 2 775.6 775.7 3 2
iones teóricos calculados a partir de las masas monoisotópicas por calculador de peso molecular (software
MassLynx) b número de sustituyentes O-acetilo c número de sodio como iones contrarios En la Figura 7, los picos entre 900-1100 y 1800-2000 m/z, corresponden a iones doblemente cargados y cargados de manera simple, respectivamente, resultantes de la adición de los cationes sodio de los grupos O-acetilo. Estos fueron asignados a las siguientes masas monoisotópicas mostradas en la Tabla 2, que corresponde a aquellas de un oligosacárido tetra érico (MenY DP4) :
Iones Iones O-acetilo NaL Carga observados esperados9 1896.0 1896.6 1 1 1 916.8 0 o 2 927.7 927.8 0 1 2 938.7 937.8 1 o 2 949.6 949.3 1 1 2 959.7 958.8 2 o 2 971.4 970.3 2 1 2 980.8 979.8 3 o 2 991.7 991.3 3 1 2 1003.3 1002.8 3 2 2
Las muestras de RMN fueron preparadas mediante la disolución de oligosacáridos liofilizados en 750 µl de D20 al 99.9% (Aldrich"11) para dar soluciones concentradas a 10-15 mM. Tubos de RMN Wilmad1*11 de 5 mm fueron utilizados para cada experimento. Los espectros de RMN fueron registrados a 298 K sobre un espectrómetro de RMN Bruker11 con avance DRX 600 MHz, equipado con una sonda heteronuclear de triple resonancia TBI de 5 mm y una unidad BGU. Se utilizó software Bruker XWINNRM 3.0 para la adquisición y procesamiento de datos . Las condiciones de adquisición espectral estándares de 1H fueron para recolectar puntos de datos de 32 k sobre una ventana espectral de 6000 Hz con 4 exploraciones y 10 segundos de lapso dé relajación. Los espectros de 1H-RMN fueron transformados por Fourier después de la aplicación de una función de ensanchamiento lineal de 0.1 Hz y referidos con relación al agua monodeuterada a 4.79 ppm. Los experimentos de 13C y 2D.RMN (COSY y HSQC filtrado por cuanto doble) fueron llevados a cabo para asignar los espectros de XH de oligosacáridos . Los espectros de RMN de protones de los oligosacáridos meningocócicos W135 e Y fueron asignados por comparación con los datos publicados [81] y por espectros de correlación COSY de protón-protón y HSQC de protón-carbono, bidimensionales. Además de los desplazamientos químicos de protones, las constancias de acoplamiento homonucleares y heteronucleares ofrecieron una gran cantidad de información estructural. Los espectros de RMN de alta resolución de los oligosacáridos Menl35 (Figura 8) y MenY (Figura 9) muestran señales relativamente agudas que permiten una asignación pico particularmente definida del protón anomérico de las porciones Gal/Glc y las porciones H3eq/axNeuNAc de NeuNAc . Estos picos están situados en las regiones espectrales donde no existe superposición con otras señales que puedan complicar la resolución lineal. Por expansión del espectro, podrían ser determinados los desplazamientos químicos de protones de las señales :
Y ppm H?UicURl 5 090 H?ülcUR2 5 049 H?UicUR3 5 049 H?ül UR4 5 025 H3eqNeuNAcUR4 2 918 H3eqNeuItócUR3 2 907 H3eqNeuNAcUR2 2 897 H3eqNeuNAcURl 2 . 400 H3a?NeuNAcURl 1 782 H3a?NeuNAcUR2 1 . 726 H3axNeu cUR3 1 . 705 H3a?NeuNAcUR4 1 . 705
Los espectros de 1H-RMN confirmaron la estructura molecular, la identidad y la integridad de las cadenas sacáridas y muestran los valores de DP de las muestras : DPMenW135 = 3; DPMen? = 4. De este modo, la columna Q-sepharose fue capaz de resolver los oligosacáridos mediante DP, y los análisis de ESI y RMN confirman que los estándares de oligosacáridos son: MenWl35 DP3 ; MenY DP4. Estos estándares fueron analizados mediante los procesos de la invención. Análisis cromatográfico de DP Muestras de oligosácaridos fueron agotadas para contener 0.5 mg/ml de ácido siálico en 100 µl . Estas muestras fueron tratadas con 100 µl de solución de NaBH 40 mM en hidróxido de sodio 10 mM. Las muestras fueron calentadas a 372C por 12 horas en un tubo de ensayo de tapa roscada, cerrado. Para detener la reacción, las muestras fueron tratadas luego con 10 µl de acetato de amonio 5M pH 6.0 y mantenidas a temperatura ambiente por 30 minutos. Se agregaron 200 ml de metanol y las muestras fueron luego secadas sobre un concentrador Speed Vac equipado con una trampa de condensación refrigerada (Savant SC110) a vacío por 1 hora. Las muestras fueron reconstituidas con 100 µl de agua Milli-Q y 100 µl de TFA 4M (concentración final: 2M) y calentadas a 1002C por 90 minutos. Los hidrolizados fueron luego sacados sobre un concentrador Seed vac equipado con dos trampas de concentración refrigeradas (Savant SCI00) . Para el análisis de HPAEC-PAD, las muestras fueron disueltas en 1.0 ml de agua desgasificada Milli-Q y luego filtradas (0.22 µm) . El análisis de los productos hidrolizados fue realizado sobre el sistema Sionex, mediante el uso de una columna .Carbopac PAl (4 x 250 mm) con una columna de protección Borate Trap. Esta columna y la protección son mejor adecuadas para el análisis del monosacárido que las columnas PAlOO y AS11. La elución isocrática con acetato de sodio 50 mM + hidróxido de sodio 20 mM, fue utilizada en algunos experimentos, y otros experimentos utilizaron elución en gradiente, y fueron utilizados con los siguientes eluyentes: A) acetato de sodio 100 nM + hidróxido de sodio 20 mM y B) hidróxido de sodio 20 mM y con un gradiente de 10% hasta 70% de A (curva 7) . Los eluidos fueron analizados como se describe anteriormente . Este aparato puede distinguir el ácido siálico del sialitol, y puede dar resultados cuantitativos para cada uno. La proporción del ácido siálico total (por ejemplo, reducido y no reducido) , al ácido siálico reducido se utilizó para calcular el DP de los oligosacáridos iniciales. Para la prueba inicial, se preparó una solución estándar de ácido siálico puro (Sigma, Steinheim, Alemania) a 2.0 µg/ml y se sometió a reducción con NaBH como se describe anteriormente. Las muestras fueron analizadas a diversos puntos de tiempo mediante HPAEC con elución isocrática. El tratamiento con NaBH4 0.04M por 2 horas a 372C se encontró que da reducción completa del ácido siálico en el estándar. La Figura 10 presenta una muestra del tiempo cero, y la Figura 11 presenta la muestra a las dos horas, con el tiempo de retención que disminuye de 8.5 a 4.7-5.0. El doble pico en la Figura 11 es debido a los diastereoisómeros no resueltos del sialitol [14]. El tratamiento del estándar del ácido siálico con TFA 2M por 90 minutos a 100SC fue capaz de remover el doble pico (Figura 12) dando de este modo un pico simple para la cuantificación del sialitol. Se sabe que la hidrólisis con TFA es adecuada para la escisión de los sacáridos, en términos de eficiencia y facilidad de eliminación [82-84], y ha sido utilizado para el análisis de varias vacunas sacáridas [82]. De este modo, el uso de TFA para la hidrólisis acida de los sacáridos tiene un triple propósito - hidrólisis eficiente, eliminación deficiente y eliminación de la división pico para el salitol. Una muestra de oligosacárido de MenY, con un DP esperado en el intervalo de entre 3 y 5, fue tratada como se describe, pero las condiciones isocráticas para la elución cromatográfica no dieron buena separación del pico de sialitol. Una elución en gradiente fue por lo tanto utilizada en vez de esto, la cual dio el cromatograma mostrado en la Figura 13. El sialitol y el ácido siálico tuvieron tiempo de retención de 19.3 y 29.8 minutos, respectivamente. Una muestra del oligosacárido MenWl35 con un DP esperado en el intervalo de 3 y 5, fue analizada con el mismo método (Figura 20) . El sialitol es observado a los 19.33 minutos y el ácido siálico a los 29.77 minutos. Para facilitar el análisis cuantitativo de los cromatogramas de la Figura 13 y de la Figura 20, se realizaron curvas estándares basadas en las concentraciones conocidas de ácido siálico o sialitol. La curva estándar utilizó 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 y 6.0 µg/ml de ácido siálico o sialitol. La respuesta lineal del detector es mostrada en la Figura 14. Por comparación a estas curvas estándares, las cantidades de sialitol y ácido siálico podrían ser cuantificadas en las muestras de MenWl35 y MenY. Por ejemplo, el área bajo el pico de 19.33 minutos en la elución de MenWl35 (Figura 20) fue calculada como de 44914068. Por referencia a la curva estándar, la concentración del sialitol fue calculada como de 7.96 µg/ml. En un experimento duplicado se observó una concentración de 8.05 µg/ml. Los dos análisis dan un valor medio de 8.005 µg/ml. Conforme las muestras fueron diluidas lOx antes del análisis, entonces la concentración media original del sialitol fue de 80.05 µg/ml. La detección colorimétrica del ácido siálico total dio una concentración de 241.09 µg/ml. Tomando en cuenta la ligera diferencia en masa entre el ácido siálico y el sialitol, estas concentraciones fueron convertidas a concentraciones molares (de hecho, la diferencia en masa es tan ligera que es lograda una aproximación excelente sin convertir a moles) y la proporción molar fue calculada como 3 (por ejemplo, DP = 3). Las proporciones calculadas a partir de los resultados de dos diferentes análisis por duplicado, fueron como sigue:
Muestra Sialitol Acido siálico DP (µg/ml) (µg/ml) Oligo-MenW 80.5 241.09 3.0
Oligo-MenW 79.6 241.09 3.0
Oligo-MenY 62.7 303.64 4.8
Oligo-MenY 68.9 303.64 4.4
La repetibilidad del método de medición del sialitol fue evaluada mediante el análisis de una muestra simple de MenWl35 para cuatro replicas, utilizando tres trampas de borato de columnas diferentes. Los resultados fueron como sigue:
* Medido separadamente, análisis por duplicado Los resultados muestran de este modo una buena repetibilidad (CV% < 2%) .
Una solución de 10 mg/ml de CPS de longitud completa de MenY ó MenWl35 en ácido acético 0.01 M se calentó a 70-802C. Durante la hidrólisis fueron tomadas muestras para la determinación de DP promedio para rastrear el progreso de la reacción por 6 horas. Las muestras fueron rápidamente congeladas y mantenidas a -20 eC antes del análisis por duplicado utilizando una columna IonPac ASll. Los resultados fueron como sigue:
De este modo, las mediciones de DP muestran una disminución gradual en DP sobre el tiempo (Figura 15) . La confirmación de la despolimerización fue obtenida con el análisis cromatográfico IonPac AS11 que muestra cómo el contenido de oligosacárido de alto peso molecular se incrementa con el tiempo durante la hidrólisis acida, como es mostrado en las Figuras 16 (MenW315) y 17 (MenY) , donde 16A/17A es el tiempo cero y 16B/17B es después de 6 horas. Muestra del serogrupo W135 El sacárido capsular del serogrupo W135 fue preparado. Durante la preparación, su DP fue medido utilizando los métodos descritos en la presente. Un cromatograma para una dilución a 100 veces de este material es mostrado en la Figura 21B, con un estándar de 6 µg/ml que es mostrado en la Figura 21A. La elución en ambos casos utilizó acetato de sodio 100 mM más hidróxido de sodio 20 M y se muestra que se eleva linealmente el amortiguador de elución al 10% hasta amortiguador de elución al 30% en 30 minutos, con un salto final hasta un amortiguador de elución de 100% por 10 minutos. Se mostró que el sialitol en el estándar eluye a 16.383 minutos; en la muestra existió un pico a 16.350 minutos . Las características del análisis a partir de dos análisis separados de la misma muestra, y cinco muestras estándares, se muestran en seguida, junto con la concentración calculada del sialitol, que fueron como sigue:
Con base en la media de los análisis (a) y (b) , existió 3.339 µg/ml de sialitol en la muestra. Ajustando para la dilución inicial, la concentración original de sialitol fue de 133.9 µg/ml. El ácido siálico total fue medido como 5732.6 µg/ml, dando un valor de DP del 17.2 Análisis del serogrupo C Se obtuvo el oligosacárido MenC DP5 purificado como se describió previamente [5]. El análisis de ESI MS fue realizado en el modo de ion positivo. El espectro de masa se muestra en la Figura 18, donde son evidentes tres grupos principales de iones. La inspección detallada de los picos con la más alta intensidad (856-91 m/z) indicó que éstos corresponden a los pentasacáridos doblemente cargados, mientras que los picos en el intervalo de 1733-1826 m/z corresponden a los pentasacáridos cargados de manera simple, ambos difiriendo por el número de sustituyentes O-acetilo y del sodio como iones contrarios. El DP de los oligosacáridos DP5 de MenC fue determinado con los métodos cromatográficos de la invención, y un cromatograma de la invención es mostrado en la Figura 19. Se prepararon cuatro análisis separados de los oligosacáridos, y los resultados fueron como sigue:
Conclusiones El tamaño molecular de los sacáridos ha sido un problema importante en el diseño de las vacunas conjugadas previas [6, 7], con los oligosacáridos de longitud de cadena intermedia que muestran mejor inmunogenicidad. La preparación, aislamiento, y caracterización de los oligosacáridos intermediarios de MenW135 y MenY han sido mostrados, con la hidrólisis acida que impulsa la despolimerización inicial del polisacárido capsular [7, 9]. La invención ofrece un nuevo método cromatográfico para determinar el grado de polimerización de estos oligosacáridos, y el método muestra una buena precisión y exactitud, confirmada por los análisis de RMN y ESI-MS. Además, el método puede ser utilizado también para determinar DP de los oligosacáridos del serogrupo C. Pueden ser encontrados detalles experimentales adicionales en la referencia 85. Se entenderá que la invención ha sido descrita a manera de ejemplo únicamente y pueden ser realizadas modificaciones al tiempo que permanezcan dentro del alcance y espíritu de la invención. REFERENCIAS (los contenidos de los cuales son incorporados por referencia en la presente) [I] Vaccines (eds. Plotkin et al . ) 4 a edición, ISBN: 0721696880. [2] Baker et al . (2003) Infect Dis 188:66-73. [3] Theilacker et al . (2003) Infecí I mun 71:3875-84. [4] Anónimo (2003) Drugs R D 4:383-5. [5] Ravenscroft et al. (1999) Vaccine 17:2802-2816. [6] Paoletti et al . (1992) J Clin Invest 89:203-9. [7] Anderson et al . (1986) J Immunol 137:1181-6. [8] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49. [9] Corbel (1996) Dev Biol Stand 87:113-124. [10] WO03/080678. [II] Costantino et al . (1999) Vaccine 17:1251-63. [12] D'Ambra et al . (1997) Anal Biochem 250:228-36. [13] Ravenscroft et al . (2000) Dev Biol (Basel ) 103:35-47. [14] Ashwell et al . (1994) Anal Biochem 222:495-502.
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