COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA VACUNACIÓN POR LA MUCOSA Antecedentes Las. rutas de vacunación por inyección clásicas -por ejemplo, subcutánea, intramuscular e intravenosa - están principalmente relacionadas con la inducción de la inmunidad sistémica (anticuerpos de suero sanguíneo y células T) . Mientras que este procedimiento puede ser apropiado contra enfermedades causadas por agentes infecciosos los cuales ganan acceso sistémico al cuerpo a través de la piel perforada y dañada (por ejemplo tétanos) , la mayoría de los patógenos' infectan naturalmente a los hospederos a través de las rutas de la mucosa tales como, por ejemplo, mucosa oral, nasal o urogenital. Las vacunas inyectables son generalmente inefectivas para, inducir la inmunidad en las superficies de la mucosa, lo cual es típicamente mediado a través de la producción y secreción de IgA e IgA secretado (s-IgA) , el cual es secretado en el lumen del tracto intestinal, respiratorio y urinario, frecuentemente con los productos de secreción de varios tejidos glandulares. En estas secreciones, el s-IgA es capaz de enlazar al patógeno, el cual permite a las células inmunes eliminar al patógeno antes de que el patógeno pueda comenzar a infectar las células del hospedero. Así, la vacunación por la mucosa puede reducir sustancialmente la probabilidad de que un patógeno infecte las células hospederas (es decir, infección celular) y, en algunos casos, aun prevenir a un patógeno de la infección de las células hospederas. En contraste, las vacunas inyectadas frecuentemente responden a antígenos liberados como un resultado de la infección de las células hospederas por el patógeno (por ejemplo, lisis de células infectadas) . Así, una distinción importante entre la vacunación por la mucosa y la vacunación inyectada es que la vacunación por la mucosa puede estimular una defensa del hospedero para limitar o aun prevenir la infección celular, mientras que la vacunación inyectada responde a una consecuencia de la infección celular, esperanzadamente antes de que la enfermedad infecciosa se desarrolle. Las vacunas por la mucosa probablemente van a ser más efectivas en prevenir o limitar las infecciones de la mucosa debido a su habilidad para inducir una respuesta s-IgA. Además, las vacunas por la mucosa ofrecen varias de otras ventajas sobre las vacunas inyectables. Estas ventajas incluyen la administración más fácil, efectos secundarios reducidos, la administración no es invasora (por ejemplo, no requiere agujas), y el potencial para la frecuencia casi ilimitada de refuerzo sin la necesidad de personal entrenado. Estas ventajas pueden reducir el costo e incrementar la seguridad de las vacunaciones y mejorar el acatamiento, problemas especialmente importantes en el ' mundo en desarrollo. Además, las mejoras en el diseño de los sistemas de vacunación por la mucosa novedosos pueden permitir el desarrollo de vacunas contra enfermedades que se controlan actualmente de manera deficiente. Adicionalmente, la inducción de una respuesta inmune de la mucosa en un sitio de la mucosa puede dar por resultado una respuesta inmune en un sitio de la mucosa distante. Por ejemplo, la vacunación por la mucosa nasal u oral puede generar secreción de s-IgA e IgG de la mucosa vaginal . A pesar de las ventajas importantes para inmunizar a través de las rutas de la mucosa, el éxito con las inmunizaciones por la mucosa ha sido limitado debido a muchos factores que incluyen, por ejemplo, degradación de antígenos, adsorción limitada e interacción con factores del hospedero no específicos en los sitios de la mucosa, una falta de adyuvantes seguros y efectivos, y el uso de sistemas de suministro inadecuados. Existe una necesidad actual sustancial para expandir la utilidad y eficacia de las vacunas por la mucosa. Breve Descripción Se ha encontrado que ciertos modificadores de respuesta inmune de molécula pequeña (IR s) pueden ser útiles como componentes de combinaciones farmacéuticas adecuados para el suministro por la mucosa.
Por consiguiente, la presente invención proporciona una combinación farmacéutica que incluye un compuesto IRM formulado para la administración por la mucosa, y un antígeno formulado para la administración por la mucosa. En algunas modalidades, el compuesto IRM y el antígeno se pueden proporcionar en una formulación sola, mientras que en otras modalidades el compuesto IRM y el antígeno se pueden proporcionar en formulaciones separadas . En otro aspecto, la presente invención también proporciona un método para inmunizar un sujeto. Generalmente, el método incluye administrar un antígeno a una superficie de la mucosa del sujeto en una cantidad efectiva, en combinación con un compuesto IRM, para generar una respuesta inmune contra el antígeno; y administrar un compuesto IRM a una superficie de la mucosa del sujeto en una cantidad efectiva, en combinación con el antígeno, para generar una respuesta inmune contra el antígeno. En algunas modalidades, el método puede incluir adicionalmente una o más dosis cebadoras de antígeno, una o más dosis de refuerzo de antígeno o compuesto IRM, o ambos. Varias de otras características y ventajas de la presente invención llegarán a ser más fácilmente evidentes con referencia a la siguiente descripción detallada, ejemplos, reivindicaciones y los dibujos adjuntos. En diversos lugares por toda la especificación, la guía se proporciona a través de las listas de ejemplos. En cada caso, la lista citada sirve únicamente como un grupo representativo y no se debe interpretar como una lista exclusiva. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es el dato de citometría de flujo que muestra la proliferación de células T específicas de antígeno en los tejidos linfáticos (NALT, Fig. ÍA; ILN, Fig. IB; CLN, Fig. 1C; bazo, Fig. ID) después de la vacunación. La Figura 2 es el dato que muestra el número total de células T específicas de antígeno en los tejidos linfoides
(Fig. 2A-2 C) y que muestra el porcentaje de las células T específicas de antígeno en la mucosa nasal (Fig. 2D) después de la vacunación. La Figura 3 es el dato de citometría de flujo que demuestra la expansión de las células T CD8+ específicas de antígeno (Fig. 3 A) y células T CD4+ (Fig. 3B) después de la vacunación. La Figura 4 es el dato que muestra el IgA de lavado de pulmón (Fig. 4A) , IgA del lavado nasal (Fig.4B) e IgG de suero (Fig. 4 C) las respuestas de anticuerpos para la inmunización por la vía de varias rutas con una combinación de IRM y antígeno. La Figura 5 es el dato que muestra el IgA de lavado de pulmón (Fig. 5?) e IgG2b de suero (Fig. 5B) las respuestas de anticuerpos para la administración intranasal del antígeno solo o con varios compuestos de IRM. La Figura 6 es el dato que muestra las células T especificas de antígeno en el DLN (Fig. 6?) y el bazo (Fig. 6B) después de la inmunización con el antígeno y uno de varios compuesto IRM. La Figura 7 es el dato que muestra las células T especificas de antígeno en el DLN (Fig. 1 A) y el NALT (Fig. IB) cuando se inmunizan dos veces cada cinco meses aparte a través de varias rutas con el antígeno y el compuesto IRM. Descripción Detallada de Modalidades Ilustrativas de la Invención Los modificadores de respuesta inmune (IRMs) son compuestos que pueden poseer actividad inmunomodulante potente. Los IRMs se presentan para actuar a través de los mecanismos del sistema inmune básico conocidos como receptores similar a Toll (TLRs) para modular selectivamente la biosíntesis de la citoquina. Por ejemplo, ciertos compuestos de IRM inducen la producción y secreción de ciertas citoquinas tales como, por ejemplo, interferones de Tipo I, TNF-a, IL-1, IL-ß, IL-8, IL-10, IL-12, MIP-1, y/o CP-1. Como otro ejemplo, ciertos compuestos de IRM pueden inhibir la producción y secreción de ciertas citoquinas TH2, tal como IL-4 e IL-5. Adicionalmente, algunos compuestos de IRM son para suprimir el IL-1 y TNF (patente norteamericana No. 6,518,265) . Ciertos IRMs pueden ser útiles para tratar una amplia variedad de enfermedades y condiciones tales como, por ejemplo, ciertas enfermedades virales (por ejemplo, virus de papiloma humano, hepatitis, herpes), ciertas neoplasias (por ejemplo, carcinoma de célula basal, carcinoma de célula escamosa, queratosis actínica, melanoma) , y ciertas enfermedades mediadas con TH2 (por ejemplo, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica) . La presente invención se relaciona a combinaciones farmacéuticas que pueden ser efectivas para el uso como vacunas de la mucosa y métodos que incluyen administración de tal combinación a la superficie de la mucosa. Generalmente, una composición farmacéutica de acuerdo a la invención incluye un compuesto IRM y un antígeno, cada uno formulado en una manera adecuada para el suministro por la mucosa y cada uno en una cantidad que, en combinación con el otro, pueden elevar una respuesta inmune contra el antígeno. Los beneficios de la vacunación por la mucosa son muchos; las composiciones y métodos de la invención pueden proporcionar uno o más de lo siguiente: 1) La composición se puede administrar fácilmente sin la necesidad de agu as; 2) La vacunación por la mucosa puede generar una respuesta inmune tanto mucosa como sistémica, mientras que las vacunas inyectadas generalmente inducen únicamente una respuesta sistémica. Debido a que la mayoría de los patógenos infectan a un hospedero en una superficie de la mucosa, la vacunación por la mucosa induce una respuesta inmune al sitio de entrada del patógeno; y 3) La vacunación por la mucosa puede inducir una respuesta inmune en un sitio de la mucosa diferente al sitio de vacunación. Los componentes de tal vacunación farmacéutica se pueden indicar para ser suministrado "en combinación" entre sí, si los componentes se proporcionan en una manera que permite al efecto biológico de poner en contacto un componente con las células para ser mantenido por lo menos hasta que otro componente se ponga en contacto con las células. Así, los componentes se pueden suministrar en combinación uno con otro aun si se proporcionan en formulaciones separadas, suministrados por la vía de diferentes rutas de administración y/o administrados en diferentes tiempos . Por ejemplo, un compuesto IRM y antígeno se pueden considerar una combinación farmacéutica sin considerar que si los componentes se proporcionan en una formulación sola o el antígeno se administra en una formulación y el componente de IRM se administra en una segunda formulación. Cuando se administran en diferentes formulaciones, los componentes se pueden administrar en diferentes tiempos, si se desea, pero se administran de modo que la respuesta inmune generada es mayor que la respuesta inmune generada si ya sea el antígeno o el compuesto IRM se administran solos. En algunas modalidades, la combinación farmacéutica puede incluir un conjugado de IRM/antígeno en el que por lo menos una porción de IRM se une covalentemente a un antígeno. Los métodos para preparar tales conjugados de IRM/antígeno se describen, por ejemplo, en la publicación de patente norteamericana No. 2004/0091491. Un método para medir una respuesta inmune inducida por una vacuna por la mucosa es medir la expansión de las células T CD8+ específicas de antígeno en respuesta a la estimulación con el antígeno. Esto se muestra en el Ejemplo 1. Las células T CD8+ específicas de antígeno se marcaron fluorescentemente y se trasfirieron adoptivamente en ratones singénicos . Los ratones se estimularon con un conjugado de IRM-antígeno . Cuatro días después, el tejido linfoide de varios sitios (tejido linfático asociado con nasa (NALT) , nodulo linfático cervical (CL) , y el bazo) se removió y se midió la expansión de las células T CD8+ específicas de antígeno. En un tejido de cada sitio, la expansión de las células T CD8+ fue mayor como resultado de la inmunización intranasal que como resultado de la inmunización intravenosa con el conjugado de IRM-antígeno, o la imnumización intranasal con ya sea el antígeno o IRM (Fig. 2A-2C) . Del mismo modo, un porcentaje más grande de células T CD8+ específicas de antígeno se observaron en la mucosa nasal siete días después de la inmunización intranasal con el conjugado de IRM-antígeno que se observó después de ya sea la inmunización intravenosa con el conjugado de IRM-antígeno, o la inmunización intranasal con ya sea el antígeno o IRM (Fig. 2D) . Se encontraron resultados similares utilizando el IRM no conjugado y el antígeno (Fig. 3A) . Otro método para medir una respuesta inmune inducida por la vacunación por la mucosa es medir la expansión de las células T CD4+ específicas de antígeno en el tejido linfoide tal como, por ejemplo, tejido linfoide asociado nasal. Las células T CD4+ específicas de antígeno activadas, a su vez, estimulan las células B para producir anticuerpos (por ejemplo, s-IgA) dirigidos contra el antígeno. En el Ejemplo 2, las células T específicas de antígeno se transfirieron adoptivamente en los ratones hospederos. Los ratones se estimularon con una combinación de compuestos de IRM y un péptido de antígeno inmunogénico. Tres días después, el tejido linfoide se removió de los ratones y se analizó la expansión de las células T CD4+ específicas de antígeno. Los resultados se muestran en la Figura 3B. La expansión de las células T CD4+ fue más grande en los ratones inmunizados con el IRM y el antígeno que en ratones inmunizados con el antígeno solo. Así, una ruta de vacunación por la mucosa (por ejemplo, intranasal) puede proporcionar un número más grande de células T CD8+ específicas de antígeno y/o células T CD4+ en sitios de tejido relevantes - el tejido linfoide asociado nasal (NALT) y la mucosa nasal - comparado a ya sea la ruta no de la mucosa de suministro (intravenoso) , o el suministro por la mucosa de ya sea el antígeno solo o el IRM solo. La expansión de la población de la célula T específica de antígeno en los sitios de la mucosa indica la activación de las células inmune en aquellas ubicaciones y la generación de una respuesta inmune que puede proteger contra la infección. Cuando tanto las células T CD8+ específicas de antígeno como las células T CD4+ específicas de antígeno se activan, tanto la respuesta inmune mediada con células específicas de antígeno como una respuesta inmune de anticuerpo específico de antígeno se pueden generar. El antígeno puede incluir cualquier material que eleve una respuesta inmune de la mucosa. Los materiales antigénicos adecuados incluyen pero no se limitan a proteínas; péptidos; polipéptidos; lípidos; glicolípidos; polisacáridos; carbohidratos; polinucleótidos; priones; bacterias vivas o inactivadas, virus u hongos; y bacterianos, virales, protozoarios, inmunógenos derivados de tumores o derivados de organismos, toxinas o toxoides . Adicionalmente, como se utiliza en la presente, el antígeno puede incluir una secuencia polinucléotida que no necesariamente eleva una respuesta inmune de la mucosa por sí mismo, pero se puede expresar en las células del hospedero para producir una proteína antigénica, péptido o polipéptido. Tales oligonucleótidos son útiles, por ejemplo, en vacunas de DNA. En algunas modalidades, el antígeno puede incluir una combinación de dos o más materiales antigénicos. Las condiciones por lo cual una composición que incluye un IRM y un antígeno, cada una formulada para la administración por la mucosa puede ser útil e incluyen, pero no se limitan a: (a) enfermedades virales tales como, por ejemplo, enfermedades que resultan de la infección por un adenovirus, un herpesvirus (por ejemplo, HSV-I, HSV-II, CMV, o VZV), un poxvirus (por ejemplo, un ortopoxvirus tal como viruela o vaccinia, o molluscum contagiosum) , un picornavirus (por ejemplo, rinovirus o enterovirus) , un ortomixovirus (por ejemplo, virus de influenza), un paramixovirus (por ejemplo, virus de parainfluenza, virus de paperas, virus de sarampión, y virus sincitial respiratorio (RSV) ) , un coronavirus (por ejemplo, SARS) , un papovavirus (por ejemplo, virus de papiloma, tal como aquellos que causan verrugas genitales, verrugas comunes o verrugas plantares) , un hepadnavirus (por ejemplo, virus de hepatitis B) , un flavivirus (por ejemplo, virus de hepatitis C o virus del Dengue) , o un retrovirus (por ejemplo, un lentivirus tal como HIV) ;
(b) enfermedades bacterianas tales como, por ejemplo, enfermedades que resultan de la infección por bacterias del, por ejemplo, género Escherichia, Enterobacter, Salmonela, Estafilococo, Shigella, Listeria, Aerobacter, Helicobacter, Klebsiela, Proteus, pseudomonas, Estreptococo, Clamidia, Micoplasma, Neumococo, Neisseria, Clostridium Bacillus, Corynebacterium, Micobacterium, Campilobacter, Vibrio, Serratia, Providencia, Cromobacterium, Brucella, Yersinia, Haemofilus, o Bordetella; (c) otras enfermedades infecciosas, tales como clamidia, enfermedades fúngales que incluyen pero no se limitan a candidiasis, aspergillosis, histoplasmosis, meningitis criptococal, o enfermedades parasíticas que incluyen pero no se limitan a malaria, neumonía pneumocystis carnii, leishmaniasis, cryptosporidiosis, toxoplasmosis, e infección tripanosoma; y (d) enfermedades atópicas, mediadas con TH2, tal como dermatitis atópica o eczema, eosinofilia, asma, alergia, rinitis alérgica, y síndrome de Ommen. Por ejemplo, una composición mucosalmente administrada se puede utilizar para detección profiláctica o terapéutica contra, por ejemplo, BCG, cólera, plaga, tifoidea, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, influenza A, influenza B, parainfluenza, polio, rabia, sarampión, paperas, rubéola, fiebre amarilla, tétanos, difteria, influenza hemofilia B, tuberculosis, vacunas meningococales y neumococales, adenovirus, HIV, varicela, citomegalovirus, dengue, leucemia felina, plaga de aves, HSC-1 y HSV-2, cólera de cerdos,' encefalitis Japonesa, virus sincitial respiratorio, rotavirus, virus de papiloma, y enfermedad de Alzheimer . En algunos casos, la vacunación por la mucosa puede ser útil para disminuir la probabilidad de, o aun prevenir, la infección a través de una superficie de la mucosa. En otros casos, una vacuna por la mucosa puede ser útil para estimular una respuesta del anticuerpo de suero. En algunos casos, una vacuna por la mucosa puede proporcionar tanto protección contra la infección de la mucosa como una respuesta de anticuerpo de suero. Así, la vacunación por la mucosa puede ser útil para la vacunación contra patógenos que no infectan típicamente a través de una superficie de la mucosa. En algunas modalidades, el antígeno se puede administrar en una o más dosis "cebadoras" separadas antes de la administración de la combinación de antígeno-IRM. La cebadura de esta manera puede proporcionar una respuesta inmune incrementada en la administración de la combinación de antígeno-IRM. En otras modalidades, el antígeno se puede administrar en una o más dosis "reforzadoras" separadas después de la administración de la combinación de antígeno-IRM. El refuerzo de esta manera puede revigorizar una respuesta inmune por lo menos parcialmente resuelta al activar las células T de memoria CD8+, células T de memoria CD4+, o ambas. En todavía otras modalidades, un compuesto IRM se puede administrar en una o más dosis reforzadoras separadas después de la administración de la combinación de antígeno-IRM. El compuesto IRM proporcionado en una dosis reforzadora puede ser el mismo o diferente que el compuesto IRM proporcionado en la combinación de antígeno-IRM,- y puede ser el mismo o diferente que el compuesto IRM proporcionado en cualquier otra dosis reforzadora. Por otra parte, cualquier combinación de compuestos de IRM se puede utilizar, ya sea como el componente IRM de una combinación de antígeno-IRM o como un reforzador. Muchos de los compuestos de IRM son derivados de imidazoquinolina amina de molécula orgánica pequeña (ver, por ejemplo, patente norteamericana No. 4,689,338), pero también un número de otras clases de compuestos son bien conocidos (ver por ejemplo, patentes norteamericanas Nos. 5,446,153: 6,194,425; y 6,110,929) y más que todavía están siendo descubiertos. Otros IRMs tienen pesos moleculares más altos, tal como los oligonucleótidos, que incluyen CPPS (ver, por ejemplo, patente norteamericana No. 6,194,388).
Ciertos IRMs son moléculas orgánicas pequeñas (por ejemplo, peso molecular abajo de aproximadamente 1000 Daltons, preferiblemente abajo de aproximadamente 500 Daltons, como son opuestas a las moléculas biológicas grandes tales como proteínas, péptidos, y los similares) tal como aquellas divulgadas en, por ejemplo, patentes norteamericanas Nos. 4,689,338; 4,929,624; 5,266,575; 5,268,376; 5,346,905;
,352,784; 5,389,640; 5,446,153; 5,482,936; 5,756,747; 6,110,929; 6,194,425; 6,331,539; 6,376,669; 6,451,810; 6,525,064; 6,541,485; . 6,545,016; 6,545,017; 6,573,273 6,656,938; 6,660,735; 6,660,747; 6,664,260; 6,664,264 6, 664,265; 6,667,312, 6,670,372; 6,677,347; 6,677,348; 6,677,349; 6,683,088; 6,756,382; 6,797,718; y 6,818,650; publicación de patentes norteamericanas Nos. 2004/0091491; 2004/0147543; y 2004/0176367; y Publicación Internacional Nos. WO 2005/18551, WO 2005/18556, y WO 2005/20999. Ejemplos adicionales de IRMs de moléculas pequeñas incluyen ciertos derivados de purina (tales como aquellos descritos en las patentes norteamericanas Nos. 6,376,501, y 6,028,076), ciertos derivados de imidazoquinolina amida (tales como aquellos descritos en la patente norteamericana No. 6,069,149), ciertos derivados de imidazopiridina (tales como aquellos descritos en la patente norteamericana No. 6,518,265), ciertos derivados de bencimidazol (tales como aquellos descritos en la patente norteamericana No.
6,387,938), ciertos derivados de una 4-aminopiridina fusionada a un anillo heterocíclico que contiene nitrógeno de cinco miembros (tales como derivados de adenina descritos en las patentes norteamericanas Nos. 6,376,501; 6,028,076 y 6,329,381; y en WO 01/08905), y ciertos derivados de 3-ß-D-ribofuranosiltiazol [4, 5-d] pirimidina (tal como aquellos descritos en la publicación norteamericana No. 2003/0199461). Otros IRMs incluyen moléculas biológicas grandes tales como secuencias de oligonucleótidos . Algunas secuencias de oligonucleótidos IRM contienen dinucleótidos de citosina-guanina (CpG) y se describen, por ejemplo, en las patentes norteamericanas Nos. 6,194,388; 6,207,646; 6,239,116: 6,339,068; y 6,406,705. Algunos oligonucleótidos que contienen CpG pueden incluir porciones estructurales inmunomodulatorias sintéticas tales como aquellas descritas, por ejemplo, en las patentes norteamericanas Nos. 6,426,334 y 6,476,000. Otras secuencias de nucleótidos IRM carecen de las secuencias CpG y se describen por ejemplo, en la publicación de patente internacional No. WO 00/75304. Otros IR s incluyen moléculas biológicas tales como fosfatos' de aminoalquil glucosaminida (AGPs) y se describen, por ejemplo, en las patentes norteamericanas Nos. 6,113,918: 6,303,347; 6,525,028; y 6,649,172. Los compuestos de IRM adecuados para el uso en la invención incluyen compuestos que tienen una 2-aminopiridina fusionada a un anillo heterocíclico que contiene nitrógeno de cinco miembros. Tales compuestos incluyen, por ejemplo, imidazoquinolina aminas que incluyen pero no se limitan a imidazoquinolina aminas sustituidas tales como, por ejemplo, imidazoquinolina aminas sustituidas con amida, imidazoquinolina aminas sustituidas con sulfonamida, imidazoquinolina aminas sustituidas con urea, imidazoquinolina amidas sustituidas con aril éter, imidazoquinolina aminas sustituidas con éter heterocíclico, imidazoquinolina aminas sustituidas con amido éter, imidazoquinolina aminas sustituidas con sulfonamido éter, imidazoquinolina éteres sustituidos con urea, imidazoquinolina aminas sustituidas con tioéter, imidazoquinolina aminas sustituidas con hidroxilamina, imidazoquinolina aminas sustituidas con oxima, imidazoquinolina aminas sustituidas con 6-, 7-, 8-, o 9-arilo, heteroarilo, ariloxi o arilalquilneoxi, e imidazoquinolina diaminas; tetrahidroimidazoquinolina aminas que incluyen pero no se limitan a tetrahidroimidazoquinolina aminas sustituidas con amida, tetrahidroimidazoquinolina aminas sustituidas con sulfonamida, tetrahidroimidazoquinolina aminas sustituidas con urea, tetrahidroimidazoquinolina aminas sustituidas con aril éter, tetrahidroimidazoquinolina aminas sustituidas con éter heterocíclico, tetrahidroimidazoquinolina aminas sustituidas con amido éter, tetrahidroimidazoquinolina aminas sustituidas con sulfonamido éter, tetrahidroimidazoquinolina éteres sustituidos con urea, tetrahidroimidazoquinolina aminas sustituidas con tioéter, tetrahidroimidazoquinolina aminas sustituidas con hidroxilamina, tetrahidroimidazoquinolina aminas sustituidas con oxi a, y tetrahidroimidazoquinolina diaminas; imidazopiridina aminas que incluyen pero no se limitan a imidazopiridina aminas sustituida con amida, imidazopiridina aminas sustituidas con sulfonamida, imidazopiridina aminas sustituidas con urea, imidazopiridina aminas sustituidas con aril éter, imidazopiridina aminas sustituidas con éter heterocíclico, imidazopiridina aminas sustituidas con amido éter, imidazopiridina aminas sustituidas con sulfonamido éter, imidazopiridina éteres sustituidos con urea, y imidazopiridina aminas sustituidas con tioéter; imidazoquinolina aminas con puente de 1,2; cicloalquilimidazopiridina aminas fusionadas con 6,7; imidazonaftiridina aminas; tetra idroimidazonaftiridina aminas; oxazoloquinolina aminas; tiazoloquinolina aminas; oxazolopiridina aminas; tiazolopiridina aminas; oxazolonaftiridina aminas; tiazolonaftiridina aminas; pirazolopiridina aminas; pirazoloquinolina aminas; tetrahidropirazoloquinolina aminas; pirazolonaftiridina aminas; tetrahidropirazolonaftiridina aminas; y dímeros de lfí-imidazo fusionados a piridina aminas, quinolina aminas, tetrahidroquinolina aminas, naftiridina aminas, o tetrahidronaftiridina aminas. En ciertas modalidades, el compuesto IRM puede ser una imidazonaftiridina amina, tetrahidroimidazonaftiridina amina, una oxazoloquinolina amina, una tiazoloquinolina, una oxazolopiridina amina, una tiazolopiridina amina, una oxazolonaftiridina amina, una tiazolonaftiridina amina, una pirazolopiridina amina, una pirazoloquinolina amina, una tetrahidropirazoloquinolina amina, una pirazolonaftiridina amina, o una tetrahidropirazolonaftiridina . En ciertas modalidades, el compuesto IRM puede ser una amina de imidazoquinolina sustituida, un tetrahidroimidazoquinolina amina, un imidazopiridina amina, una imidazoquinolina con puente de 1,2-amina, una cicloalquilimidazopiridina fusionada con 6,7-amina, una imidazonaftiridina amina, una tetrahidroimidazonaftiridina amina, una oxazoloquinolina amina, un tiazoloquinolina amina, una oxazolopiridina amina, una tiazolopiridina amina, una oxazolonaftíridina amina, una tiazolonaftiridina amina, una pirazolopiridina amina, una pirazoloquinolina amina, una tetrahidropirazoloquinolina amina, una pirazolonaftiridina amina, o tetrahidropirazolonaftiridina amina, . Como se utiliza en la presente, una imidazoquinolina amina sustituida se refiere a una imidazoquinolina amina sustituida con amida, una imidazoquinolina amina sustituida con sulfonamida, una imidazoquinolina amina sustituida con urea, una imidazoquinolina amina sustituida con aril éter, una imidazoquinolina amina sustituida con éter heterocíclico, una imidazoquinolina amina sustituida con amido éter, una imidazoquinolina amina sustituida con sulfonamido éter, una imidazoquinolina éter sustituida con urea, una imidazoquinolina amina sustituida con tioéter, una imidazoquinolina amina sustituida con hidroxilamina, una imidazoquinolina amina sustituida con oxima, una imidazoquinolina amina sustituida con 6-, 7-, 8-, o 9-arilo, heteroarilo, ariloxi o arilalquileneoxi, o una imidazoquinolina amina. Como se utiliza en la presente, imidazoquinolina aminas sustituidas específicamente y expresamente excluyen 1- (2-metilpropil) -IH-imidazo [4, 5-c] quinolin-4-amina y 4-amino-a, a-dimetil-2-etoximetil-li?-imidazo [4, 5-c] quinolin-1-etanol . Los compuestos IRM adecuados también pueden incluir los derivados de purina, derivados de imidazoquinolina amida, derivados de bencimidazol, derivados de adenina, fosfatos de aminoalquil glucosaminida y secuencias de oligonucleótidos descritas en lo anterior. En ciertas modalidades, el compuesto IRM puede ser una imidazoquinolina amina sustituida con amida tal como, por ejemplo, 1- (2-amino-2-metilpropil) -2- (etoximetil) -1H-imidazo [4, 5-c] quinolin-4-amina o N- [6- ( {2- [4-amino-2-(etoximetil) - 1H-imidazo [4, 5-c] quinolin-1-il] -1, 1-dimetiletil} amino) -6-oxohexil] -4-azido-2-hidroxibenzamida . En otras modalidades, el compuesto IRM puede ser una tiazoloquinolina amina tal como, por ejemplo, 2-butiltiazolo [4, 5-c] quinolin-4-amina. En otras modalidades, el compuesto IRM puede ser una imidazoquinolina amina tal como, por ejemplo, 4-amino-a, a-dimetil-2-etoximetil-líT-imidazo [4 , 5-c] quinolin-1-etanol . En otras modalidades, el compuesto IR puede ser una imidazoquinolina amina sustituida con amida tal como, por ejemplo, N-{3- [4-amino-l- (2-metilpropil) -1H-imidazo [4,5-c] quinolin-7-iloxi] propil }nicotinamida En otras modalidades, el compuesto IRM puede ser una imidazoquinolina amina sustituida con sulfonamida tal como, por ejemplo, 3- [4-amino-2- (etoximetil) -1H-imidazo [4, 5-c] quinolin-1-il] -N, 2, 2-trimetilpropano-l-sulfonamida. En otras modalidades, el compuesto IRM puede ser una imidazoquinolina amina sustituida con tioéter tal como, por ejemplo, 2-butil-l-{2-metil-2- [2- (metilsulfonil) -etoxi] propil } -lH-imidazo [4, 5-c] quinolin-4-amina. En otras modalidades, el compuesto IRM puede ser una pirazoloquinolina amina tal como, por ejemplo, 2-butil-l-[2- (propilsulfonil) etil] -2i?-pirazolo [3, 4-c] quinolin-4-amina. En otras modalidades, el compuesto IRM puede ser una imidazoquinolina amina sustituida con arilalquilneoxi tal como, por ejemplo, l-{ 4-amino-2-etoximetil-7- [3- (piridin-3-il) propoxi] -lE-imidazo [4, 5-c] quinolin-1-il }-2-metilpropan-2-ol. En otras modalidades, el compuesto IRM puede ser una imidazopiridina amina sustituida con urea tal como, por ejemplo, N- { 2- [4-amino-2- (etoximetil) -6, 7-dimetil-lií-imidazo [4, 5-c] piridin-1-il] 1, l-dimetiletil}-N' -ciclohexilurea . En otras modalidades, el compuesto IRM puede ser una imidazoquinolina amina sustituida con sulfonamida tal como, por ejemplo, N- [2- [4-amino-2-butil-lH-imidazo [4, 5-c] quinolin-1-il] 1, 1-dimetiletil] metañosulfonamida. En todavía otras modalidades, el compuesto puede ser una imidazoquinolina amina sustituida con amida tal como, por ejemplo, N- { 2- [4-amino-2- (etoximetil) -1H-imidazo [4, 5-c] quinolin-1-il] 1, 1-dimetiletil } ciclohexanocarboxamida . A menos que de otra manera se indique, la referencia a un compuesto puede incluir el compuesto en cualquier forma farmacéuticamente aceptable, incluyendo cualquier isómero (por ejemplo, diastereómero o enantiómero) , sal, solvato, polimorfo, y los similares. En particular, si un compuesto es óptimamente activo, la referencia al compuesto puede incluir cada uno de los enantiómeros del compuesto así como mezclas racémicas de los enantiómeros.
En algunas modalidades de la presente invención, el compuesto IR puede ser un agonista de por lo menos un TLR, preferiblemente un agonista de TLR6, TLR7, o TLR8. En ciertas modalidades, el compuesto IRM puede ser un agonista selectivo de TLR8. En otras modalidades, el compuesto IRM puede ser un agonista selectivo de TLR7. Como se utiliza en la presente, el término "agonista selectivo de TLR8" se refiere a cualquier compuesto que actúa como un agonista de TLR8, pero no actúa como un agonista de TLR7. Un "agonista selectivo de TLR7" se refiere a un compuesto que actúa como un agonista de TLR7, pero no actúa como un agonista de TLR8. Un "agonista de TLR7/8" se refiere a un compuesto que actúa como un agonista de ambos TLR7 y TLR8. Un agonista selectivo de TLR8 o un agonista selectivo de TLR7 puede actuar como un agonista para el TLR indicado y uno o más de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR9 o TLR10. Por consiguiente, mientras que "el agonista selectivo de TLR8" se puede referir a un compuesto que actúa como un agonista para el TLR8 y no para otro TLR, este puede alternativamente referirse a un compuesto que actúa como un agonista de TLR8 y, por ejemplo, TLR6. Similarmente, "el agonista selectivo de TLR7" puede referirse a un compuesto que actúa como un agonista para el TLR7 y no para otro TLR, pero este puede alternativamente referirse a un compuesto que actúa como un agonista de TLR7 y, por ejemplo, TLR6.
El agonismo de TLR para un compuesto particular se puede evaluar- de cualquier manera. Por ejemplo, los análisis para detectar el agonismo de TLR de los compuestos de prueba se describen, por ejemplo, en la publicación de patente norteamericana No. US2004/0132079, y las líneas de células recombinantes adecuadas para el uso en tales análisis se describe, por ejemplo, en la publicación de patente internacional No. WO 04/053057. Sin considerar el análisis particular empleado, un compuesto se puede identificar como un agonista de un TLR particular si se realiza el análisis como un compuesto que da por resultado por lo menos un incremento de umbral de una actividad biológica mediada por el TLR particular. A la inversa, un compuesto se puede identificar como que no actúa como un agonista de un TLR especificado si, cuando se utiliza para realizar un análisis diseñado para detectar la actividad biológica mediada por el TLR especificado, el compuesto no logra inducir un incremento de umbral en la actividad biológica. A menos que de otra manera se indique, un incremento en la actividad biológica se refiere a un incremento en la misma actividad biológica sobre aquel observado en un control apropiado. Un análisis puede o no se puede realizar en conjunción con el control apropiado. Con experiencia, uno experto en la técnica puede desarrollar familiaridad suficiente con un análisis particular (por ejemplo, el intervalo de valores observados en un control apropiado bajo condiciones de análisis específico) que realiza un control no puede siempre ser necesario determinar el agonismo de TLR de un compuesto en un análisis o ensayo particular. El incremento de umbral preciso de la actividad biológica mediada con TLR para determinar si un compuesto particular es o no es un agonista de un TLR particular en un análisis dado puede variar de acuerdo a los valores conocidos en al técnica incluyendo pero no se limita a la actividad biológica observada como el punto final del análisis, el método utilizado para medir o detectar el punto final del análisis, la relación señal-ruido del análisis, la precisión del análisis, y si el mismo análisis está siendo utilizado para determinar el agonismo de un compuesto para ambos TLRs. Por consiguiente más práctico exponer generalmente el incremento mínimo de la actividad biológica mediada con TLR requerida para identificar un compuesto como es un agonista o un no agonista de un TLR particular para todos los análisis posibles. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, sin embargo, pueden determinar fácilmente el mínimo apropiado con la debida consideración de tales factores. Los análisis que emplean células HEK293 transíectadas con un gen estructural de TLR expresable se puede utilizar como un umbral de, por ejemplo, por lo menos un incremento de tres veces en una actividad biológica mediada con TLR (por ejemplo, activación NFKB) cuando el compuesto se proporciona en una concentración de, por ejemplo, de aproximadamente 1 µM a aproximadamente 10 µM para identificar un compuesto como un agonista de TLR transfectado en las células. Sin embargo, los umbrales diferentes y/o intervalos de concentración diferentes pueden ser adecuados en ciertas circunstancias. También, los umbrales diferentes pueden ser apropiados para análisis diferentes. Un componente de una combinación de antígeno-IRM, así como un antígeno IRM proporcionado en una dosis cebadora o dosis de refuerzo, se puede proporcionar en cualquier combinación adecuada para la administración por la mucosa a un sujeto. Los tipos adecuados de formulaciones se describen, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,939,090; la patente norteamericana No. 6,365,166; la patente norteamericana No. 6,245,776; y la patente norteamericana No. 6,486,168. El compuesto - si es compuesto de antígeno o IRM -se pueden proporcionar en cualquier forma adecuada incluyendo pero no se limita a una solución, una suspensión, una emulsión, o cualquier forma de mezcla. El compuesto se puede administrar en la formulación con cualquier excipiente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Por otra parte, el componente1 de IRM y el componente de antígeno de una combinación de antígeno de una combinación de antígeno -1RM se puede proporcionar conjuntamente en una formulación sola o se puede proporcionar en formulaciones separadas. Una formulación se puede suministrar en cualquier forma de dosificación adecuada tal como, por ejemplo, una crema, un ungüento, una formulación de aerosol, un rocío no de aerosol, un gel, una loción y los similares. La formulación puede incluir adicionalmente uno o más aditivos que incluyen pero no se limitan a adyuvantes, mej oradores de penetración, colorantes, fragancias, saborizantes, humectantes, espesantes y los similares. Una formulación se puede administrar a cualquier superficie de la mucosa adecuada de un sujeto tal como, por ejemplo, mucosa oral, nasal, o urogenital. La composición de una formulación adecuada para la vacunación por la mucosa variará de acuerdo a los factores conocidos en la técnica incluyendo pero no se limita a la naturaleza física y química del (os) componente (s) (es decir, el compuesto IRM y/o antígeno) , la naturaleza del portador, el régimen de dosificación propuesta, el estado del sistema inmune del sujeto (por ejemplo, suprimido, comprimido, estimulado), el método para administrar el componente (s) , y las especies por lo cual la formulación está siendo administrada. Por consiguiente, no es práctico exponer generalmente la composición de una formulación efectiva para la vacunación por la mucosa por todas las aplicaciones posibles. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, sin embargo, pueden determinar fácilmente una formulación apropiada con la debida consideración de tales factores. En algunas modalidades, los métodos de la presente invención incluyen administrar IRM a un sujeto en una formulación de, por ejemplo, de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10% (a menos que de otra manera se indique, todos los porcentajes proporcionados en la presente son peso/peso con respecto a la formulación total) al sujeto, aunque en algunas modalidades el compuesto IRM se puede administrar utilizando una formulación que proporciona el compuesto IRM en una concentración fuera de este intervalo. En ciertas modalidades, el método incluye administrar a un sujeto una formulación que incluye por lo menos aproximadamente 0.01% del compuesto IRM, por lo menos aproximadamente 0.03% del compuesto IRM, o por lo menos aproximadamente 0.1% del compuesto IRM. En otras modalidades, el método incluye administrar a un sujeto una formulación que incluye hasta aproximadamente 5% del compuesto IRM, hasta aproximadamente 1% del compuesto IRM, o hasta aproximadamente 0.5% del compuesto 1RM. En una modalidad particular, el método incluye administrar el compuesto IRM en una formulación que incluye de por lo menos aproximadamente 0.1% del compuesto IRM, hasta aproximadamente 5% del compuesto IRM.
En algunas modalidades, una formulación se puede administrar a la superficie de la mucosa que es un sitio típico o esperado de infección por un patógeno particular. Una vacuna por la mucosa, o un componente de una vacuna por la mucosa se puede administrar a la mucosa nasal a fin de vacunarla con un patógeno respiratorio (por ejemplo, un virus de influenza) . Alternativamente, una formulación se puede administrar a una superficie de la mucosa a fin de inducir una respuesta inmune en un sitio de la mucosa distante. Por ejemplo, una formulación se puede administrar a la mucosa nasal o mucosa oral a fin de vacunarla contra un patógeno que puede infectar a través, por ejemplo, la mucosa vaginal (por ejemplo, un herpesvirus) . Una cantidad de un compuesto IRM efectivo para la vacunación por la mucosa es una cantidad suficiente para incrementar una respuesta inmune al antígeno en la combinación comparada a la respuesta inmune elevada al administrase el antígeno sin el compuesto IRM. La cantidad precisa del compuesto IRM administrada en una vacuna por la mucosa variará de acuerdo a los factores conocidos en la técnica incluyendo pero no se limitan a la naturaleza física y química del compuesto IRM, la naturaleza del portador, el régimen dé dosificación propuesto, el estado del sistema inmune del sujeto, por ejemplo, suprimido, comprimido, estimulado) el método para administrar el compuesto IRM, y las especies por lo cual la vacuna por la mucosa está siendo administrada. Por consiguiente, no es práctico exponer generalmente la cantidad que constituye una cantidad de compuesto IRM efectivo para la vacunación para la mucosa para todas las aplicaciones posibles. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, sin embargo, pueden determinar fácilmente la cantidad apropiada con la debida consideración de tales factores. - En algunas modalidades, los métodos de la presente invención incluyen administrar suficiente compuesto IRM para proporcionar una dosis de, por ejemplo, aproximadamente 100 mg/kg a aproximadamente 50 ng/kg al sujeto, aunque en algunas modalidades, los métodos se pueden realizar al administrar el compuesto IRM en una dosis fuera de este rango. En algunas de estas modalidades, el método incluye administrar suficiente compuesto IRM para proporcionar una dosis de aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 5 mg/kg al sujeto, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 3.75 mg/kg. El régimen de dosificación puede depender por lo menos en parte o muchos factores conocidos en la técnica incluyen pero no se limitan a la naturaleza física y química del compuesto IRM, la naturaleza del portador, la cantidad del IRM que se administra, el estado del sistema inmune del sujeto, (por ejemplo, suprimido, comprimido, estimulado), el método para administrar el compuesto IRM y las especies por lo cual la vacuna por la mucosa está siendo administrada. Por consiguiente no es práctico exponer generalmente el régimen de dosificación efectivo para la vacunación por la mucosa para todas las aplicaciones posibles. Aquellas de habilidad ordinaria en la técnica, sin embargo, puede determinar fácilmente un régimen de dosificación apropiado con la debida consideración de tales factores. En algunas modalidades, el compuesto IRM se puede administrar, por ejemplo, de una a múltiples dosis dentro de un período de tiempo determinado (por ejemplo, diario, por semana, etc.) . En ciertas modalidades, el compuesto IRM se puede administrar una sola vez. En otras modalidades, el IRM se puede administrar de aproximadamente una vez cada diez años a múltiples veces por día. Por ejemplo, el compuesto IRM se puede administrar por lo menos una vez cada diez años por lo menos una vez cada cinco años o por lo menos una vez cada dos años. En otras modalidades, el compuesto IRM se puede administrar, por ejemplo, por lo menos una vez por año, por lo menos una vez cada seis meses, por lo menos una vez por mes, por lo menos una vez por semana o por lo menos una vez por día. En una modalidad particular, el compuesto IRM se administra de aproximadamente una vez por mes a aproximadamente una vez por año. Los métodos de la presente invención se pueden realizar sobre cualquier sujeto adecuado. Los sujetos adecuados incluyen pero no se limitan a animales tales como pero no se limitan a humanos, primates no humanos, roedores, perros, gatos, caballos, cerdos, ovejas, cabras o vacas. Ejemplos Los siguientes ejemplos han sido seleccionados meramente para ilustrar adicionalmente las características, ventajas y otros detalles de la invención. Va a ser expresamente entendido, sin embargo, que mientras los ejemplos sirven para este propósito, los materiales y cantidades particulares utilizadas así como otras condiciones y detalles no van a ser considerados en una materia que indebidamente limitaría el alcance de esta invención. Los compuestos ' IRM utilizados en los ejemplos se muestran en la Tabla 1. Tabla 1
# Este compuesto no es específicamente ejemplificado pero se puede preparar fácilmente utilizando los métodos sintéticos divulgados en la referencia citada. Ejemplo 1 Se preparó un conjugado de Ovalbúmina-IRMl como sigue. El IRM1 se suspendió en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 10 mg/ml. La Ovalbúmina se suspendió en solución salina regulada de fosfato (PBS) a 10 mg/ml y el pH se ajustó a > 10.0 mediante la adición de .NaOH. Se prepararon 500 µL de la solución de albúmina (5 mg de ovalbúmina) con 100 µL de la solución de IRM1 (1 mg de IRM1) en una cavidad sola en una placa de cultivo de tejido de 12 cavidades. La placa se colocó sobre hielo y se colocó una fuente de luz UV de longitud de onda larga directamente sobre la placa tan cerca de la cavidad que contiene la mezcla de IRMl/ovalbúmina como sea posible. La mezcla se irradió durante 15 minutos. El conjugado resultante se removió de la cavidad y se resuspendió en PBS a una concentración final de 5 mg/mL de ovalbumina, 0.5 mg/mL de IRM1, y se dializó contra PBS para remover cualquier IRM no conjugado. Las células T CD8+ específicas de ovalbúmina de pollo (OT-I, The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) se marcaron con éster succinimidílico de carboxifluorescencia (CFSE, Molecular Probes, Inc, Eugene, OR) , un tinte fluorescente que mancha las células en una manera estable, y luego se transfirieron adoptivamente en los ratones C57BL/6 singénicos (Charles RIver Laboratorios, Wilmington, MA) . Los ratones recipientes luego se inmunizaron en el día 0 con 100 microgramos (µg) del conjugado de Ovalbúmina-IRMl, ya sea intranasalmente (IN) o intravenosamente (IV) . En el día 4, los ratones se sacrificaron y el tejido linfoide asociado nasal (NALT) , los nodulos linfáticos inguinal (ILN) , los nodulos linfáticos cervicales (CLN) , y los bazos (Spl) se removieron. Cada tejido recolectado de los ratones se corrió a través de una criba de nylon de 100 µm (BD Biosciences, Bedford, MA) , se centrifugaron, y se resuspendieron en solución reguladora de manchado de citometría de flujo
(Biosource International, Inc., Rockville, MD) . Las células luego se marcaron con CD8-cicroma (BD Pharmigen, San Diego,
CA) y los anticuerpos de tetramero-ficoeriterina SIINFEKL/Kb (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) . Las células luego se corrieron sobre un FACSCaliber (Betón, Dickinson, y Co., San José, CA) y las células T tetrameras+ SIINFEKL/Kb CD8+ se analizaron para la expresión CFSE. Los resultados se muestran en la Figura 1 como sigue: NALT en la Figura 1?; ILN en la Figura IB; CLN en la Figura 1C; y bazo en la Figura ID. El suministro intranasal de un antígeno con IRM da por resultado la activación efectiva de linfocitos T citotóxicos en todas las ubicaciones como se indica por una pérdida progresiva de CFSE. Separadamente, los números de la célula OT-I totales en el Día 7 se contaron en el tejido linfoide asociado con nasal (NALT) , los nodulos linfáticos cervicales (CLN) , y el bazo (Spl) . Los números de células OT-I se determinaron mediante el conteo de linfocitos totales (exclusión azul de Tripan) y al multiplicarlos por el porcentaje de OT-I+CD8+ (análisis de citometría de flujo. Adicionalmente, el porcentaje de las células OT-I en la mucosa nasal se determinó en el Día 7. Los resultados se muestran en la Figura 2 como sigue: NALT en la Figura 2?; CLN en la Figura 2B; el bazo en la Figura 2C; y la mucosa nasal en la Figura 2D; El suministro antinasal antígeno más el IRM1 generó números de célula OT-I totales más grandes en el Día 7 que el suministro intravenoso en todos los tejidos linfoides examinados. El suministro intranasal de IRM1 más al antígeno también generó números de célula OT-I totales más grandes en el Día 7 que el antígeno solo, que indica un efecto notable del IRM en el aumento de la activación de las célula T de antígeno específico por la vía de aquella ruta. Además, la ruta intranasal de vacunación da por resultado un número más grande de células OT-I en los sitios de tejido relevante-tejido linfoide asociado con nasal (LALT) y la mucosa nasal. Ejemplo 2 Las células T CD8+ de los ratones OT-I (The Jackson Laboratorios, Bar Harbor, ME) se transfirieron adoptivamente en los ratones C57B/6 (Charles River Laboratorios,
Wilmington, MA) las células CD4+ de los ratones DO. 11 TVR
(The Jackson Laboratorios, Bar Harbor, ME) se transfirieron adoptivamente en los ratones Balb/c (Charles River Laboratorios, Wilmington, MA) . Los ratones luego se inmunizaron intranasalmente en el Día 0 como sigue: ratones C57BL/6 transferidos con OT-I se inmunizaron con 100 µg de ovalbúmina de pollo completa por ratón, ya sea con (IRM12 + Ag, 75 µg de IRM2/ratón) o con (Ag solo) IRM2; los ratones Balb/c transferidos con DO.11 se inmunizaron con 100 µg péptido OVA (ISQAVHAAHAEINEAGR) por ratón, ya sea con (IRM2 + Ag, 75 µg de IRM2/ratón) o sin IRM2 (Ag solo) . En el Día 3, el tejido linfoide asociado nasal se removió y la expansión de veces de cada población de células sobre el PBS solo se determinó. Las células OT-I CD8+ se detectaron utilizando los tetrámeros SIINFEKL/Kb y las células DO.11 CD4+ se detectaron utilizando un anticuerpo clonotípico (Caltag Laboratorios, Burlingame, CA) y • se analizaron utilizando un FACS Caliber (Becton, Dickinson, San José, CA) . Los resultados se muestran en la Figura 3 como sigue: expansión OT.I CD8+ se muestra en la Figura 3A; la expansión DO.11 CD4+ se muestra en la Figura 3B. La inmunización intranasal de una combinación de IRM/antígeno induce la expansión de tanto las células T CD8+ a como las células T CD4+ a un grado más grande que la inmunización intranasal con el antígeno solo. Ejemplo 3 Ratones Balb(c (Charles River Laboratorios, Wilmington, MA) se trataron con 50 µg de proteína de ovalbúmina de pollo completa (OVA) (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO) con 50 µg de IRM4 de solución regulada de fosfato (PBS) mediante varias rutas. Se preparó proteína de ovalbúmina limpia al lavar la OVA con Bio-cuentas (Bio-Rad Laboratorios, Inc., Hércules, CA, Cat# 152-3920) para remover la endotoxina, luego se resuspendió en solución salina regulada con fosfato (PBS) . Los ratones se trataron con OVA e IRM4 mediante la inyección subcutánea (SC) , inyección intravenosa
(IV) , inyección intramuscular (IM) , inyección intradérmica (ID), instilación intranasal (IN) , inyección de OVA intradérmica con la administración tópica de 10 µL de crema de IRM4 directamente sobre el sitio de inyección de OVA (ID + Top) , o se dejaron sin tratar (nada) . En el Día 21 los ratones se sacrificaron, los lavados de' pulmón y nasales se realizaron mediante la administración por la traquea de 1 mL de PBS y el suero se obtuvo mediante la perforación cardiaca y la centrifugación para remover las células. El suero se recolectó para análisis. Las muestras de lavado se midieron para el IgA de OVA-específico por ELISA. Las muestras de suero se midieron para el IgG2a de OVA específico por ELISA. Los ELISAs de anticuerpos específicos de OVA se realizaron al recubrir las placas de 96 cavidades EIR/RIA (Cat#3590, Corning, Inc., Corning, NY) con 100 µL/cavidad una 20 µg/mL de solución de ovalbúmina en PBS y se incubaron durante 1 a 2 horas a 37 °C durante la noche a 4°C. Las placas luego se lavaron una vez con 0.5% de Tween-20 en solución PBS (solución reguladora de lavado) . Se colocaron 200 µL/cavidad de 1% de BSA en solución de PBS en las cavidades, y se incubaron durante una a dos horas a 37 °C durante la noche a 4°C. Las placas luego se lavaron dos veces con solución reguladora de lavado. Las diluciones en serie de tres veces que comienzan con las muestras de lavado no diluido, o las diluciones en serie de 20 veces que comienzan con una dilución de 1:10 de muestras de suero se hicieron a través de la placa en 0.2% de BSA, 0.05% Tween-20 en PBS (solución reguladora de dilución) y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas luego se lavaron cuatro veces con solución reguladora de lavado. 100 µL/cavidad de una dilución de 1:2000 de IgG2a de antiratón de cabra (Southern Biotechnology
Associates, Inc., Birmingham, AL) o IgA de antiratón de cabra
(Southern Biotechnology Associates, Inc. , ) en solución reguladora de solución se colocó en las cavidades y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas luego se lavaron cuatro veces con solución reguladoras de lavado, se rellenaron con 100 µL/cavidad de cromageno estabilizado (Cat#SB02, Biosource International, Camarillo, CA) , se incubaron por menos de cinco minutos, y 50 µL/cavidad de la solución de detección (Cat#SB02, Biosource International) luego se adicionaron. Las placas se leen sobre un espectrofotómetro en un OD de 490. Los resultados se muestran en la Figura 4. Únicamente la administración intranasal de la combinación de IRM/antígeno generó respuestas IgA fuertes en al mucosa del pulmón (Figura 4A) y nasal (Figura 4B) todas las rutas de administración, incluyendo la intranasal, generaron respuestas IgG2a fuertes en la sangre (Fig. 4C) . Ejemplo 4 En el Día 0 y el Día 7 los ratones Balb/c (Charles Rivers Laboratories) se inmunizaron intranasalmente con 35 µg de OVA sola o en combinación con 14 µg de IRM3, IRM4, IRM5, IRMß, IRM7, IRM8, IRM9, IRM10, IMRll, o IRM12 en PBS. En el Día 14, los ratones se sacrificaron y el lavado de pulmón y la recolección de suero se realizó como se describe en el ejemplo 3. El lavado de pulmón y las muestras de suero se analizaron para el IgA y el IgG2b de OVA específico (Southern Biotechnology Associates, Inc.), respectivamente, como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Figura 5. Las combinaciones de IRM/antígeno de todos los compuestos de IRM probados proporcionaron respuestas IgA (Figura 5A) e IgG2b (Figura 5B) más grandes que el antígeno solo. Ejemplo 5 Los linfocitos de los nodulos linfáticos de los ratones C57BL6 GFP+/OT-I+ se transfirieron adoptivamente en los ratones C57BL6. Un día después de la transferencia adoptiva, los ratones se inmunizaron nasalmente con 35 µg de ovalbúmina sola o en combinación con 14 µg de IRM3, IRM4, IRM5, IRM6, IRM7, IRM8, IRM9, IRM10, IRM11, o IRM12 en solución salina amortiguada con citrato (CBS) . Cuatro días después los ratones se sacrificaron y se drenaron los nodulos linfáticos (DLN) y los bazos se removieron. El número total de los linfocitos y esplenocitos de DLN se determinaron a utilizar un Guava PCA-96 (Guava Technologies, Inc., Hayward, CA) . Los linfocitos y los esplonocitos de DLN se mancharon con yodo de propidio (PI) y el anticuerpo anti-CD8 de ratón (BD Pharmingen, San Diego, CA) y el porcentaje de los linfocitos OT-I+/GFP+ se determinó ' mediante la activación de citometría de flujo sobre los linfocitos PI"CD8+/GFP+. El número total de linfocitos OT-I+/GFP+ se determinó al multiplicar el número total de esplenocitos por el por ciento de linfocitos PI"OT-I+/GFP+. Los resultados se muestran en la Fig. 6. La administración intranasal de. las combinaciones de IRM/antígeno que emplean muchos compuestos de IRM diferentes proporcionaron un número más grande de células T específicas de antígeno en el DLN (Figs. <óA) y el bazo (Figs. 6B) que la administración del antígeno solo. Ejemplo 6 Los linfocitos de los ratones OT-I (The Jackson
Laboratorios, Bar Harbor, ME) se transfirieron adoptivamente en los ratones C57BL/6 (Charles River Laboratorios, Wilmington, MA) . La ovalbúmina se lavó como se describe en el Ejemplo 3. Un día después de la transferencia adoptiva, los ratones se inmunizaron con PBS solo intranasalmente o 50 µg de ovalbúmina o 50 µg de IRM4 en PBS intranasalmente (IN) , intravenosamente (IV) , o subcutáneamente (SC) . Cinco meses después, los ratones ya sea se inmunizaron otra vez en la misma manera que habían sido inmunizados previamente, o no se reinmuinizaron. Los ratones se sacrificaron cuatro días después de los cinco meses de inmunización y se recolectaron los nodulos linfáticos de drenado (DLN) y el tejido linfoide asociado con nasal (NALT) . El número total de linfocitos de DLN y los linfocitos NALT se determinaron al utilizar un Guava PCA 96 (Guava Technologies, Inc., Hayward, CA) . Los linfocitos de DLN y los linfocitos de NALT se mancharon con yodo de propidio (PI) y el anticuerpo anti-CD8 de ratón (BD Pharmingen, San Diego, CA) y el por ciento de los linfocitos OT-I+/GFP+ se determinó mediante la activación de citometría de flujo sobre los linfocitos PI~CD8+/GFP+. El número total de linfocitos OT-I+/GFP+ se determinó al multiplicar el número total de linfocitos de DLN o linfocitos de NALT por el por ciento de DLN o NALT de linfocitos PI"OT-I+/GFP+. Los resultados se muestran en la Fig. 7 como sigue:
DLN en la Figura XA; NALT en la Figura 7B. Todas las rutas de inmunización, incluyendo intranasal, causaron un incremento en el número de células OT-I en el DLN en la re-inmunización. Además, la inmunización nasal causó un incremento en el número de células OT-I en el NALT en la re-inmunización. Las descripciones completas de las patentes, documentos de patente y publicaciones citadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad como si cada una fuera incorporada individualmente. En el caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo las definiciones, lo controlarán. Varias modificaciones y alteraciones a esta invención llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de esta invención. Las modalidades y ejemplos ilustrativos se proporcionan como ejemplos únicamente y no se proponen para limitar el alcance de la presente invención. El alcance de la invención está limitado únicamente por las reivindicaciones expuestas como siguen.