CN101068922B - 里氏木霉葡糖淀粉酶及其同源物 - Google Patents

里氏木霉葡糖淀粉酶及其同源物 Download PDF

Info

Publication number
CN101068922B
CN101068922B CN200580040938.5A CN200580040938A CN101068922B CN 101068922 B CN101068922 B CN 101068922B CN 200580040938 A CN200580040938 A CN 200580040938A CN 101068922 B CN101068922 B CN 101068922B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
enzyme
glucoamylase
dna
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200580040938.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101068922A (zh
Inventor
N·顿－科尔曼
P·聂夫－克鲁索夫
C·E·皮尔格林
D·E·沃德
P·范索灵根
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Danisco US Inc
Original Assignee
Genencor International Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2004/040040 external-priority patent/WO2005118800A1/en
Priority claimed from PCT/US2005/018214 external-priority patent/WO2005117756A2/en
Application filed by Genencor International Inc filed Critical Genencor International Inc
Publication of CN101068922A publication Critical patent/CN101068922A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101068922B publication Critical patent/CN101068922B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C12N9/242—Fungal source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及与具有SEQ ID NO：4的序列的木霉葡糖淀粉酶具有至少80％序列同一性的葡糖淀粉酶及其生物学功能性片段。本发明还涉及编码葡糖淀粉酶的DNA序列、包含所述DNA序列的载体和宿主细胞、酶组合物，以及在各种用途中使用所述葡糖淀粉酶的方法。

Description

里氏木霉葡糖淀粉酶及其同源物
相关申请
本申请要求2005年5月24日提交的国际专利申请PCT/US05/18214的优先权权益，该国际专利申请要求2005年1月28日提交的临时专利申请系列号60/647,925、2004年12月9日提交的国际专利申请PCT/US04/041276、2004年11月30日提交的国际申请PCT/US04/040040、现已放弃的2004年8月30日提交的临时申请系列号60/605,437和现已放弃的2004年5月27日提交的临时申请系列号60/575,175的优先权权益，并且本申请要求2005年5月24日提交的国际专利申请PCT/US05/0018212的优先权权益，该国际专利申请要求2005年1月28日提交的临时申请系列号60/647,925、现已放弃的2004年8月30日提交的系列号60/605,437和现已放弃的2004年5月27日提交的系列号60/575,175的优先权权益；以及2004年10月30日提交的国际申请PCT/US04/040040的优先权权益。
发明领域
本发明涉及新的葡糖淀粉酶，其对于从淀粉生产葡萄糖和其它终产物是有用的。所述葡糖淀粉酶适合应用于多种过程，尤其适合在传统的高温淀粉加工条件下和非蒸煮或低温淀粉加工条件下使用。
发明背景
葡糖淀粉酶(α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶，E.C.3.2.1.3.)是水解淀粉的外切作用的糖酶。葡糖淀粉酶催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原性末端移去连续的葡萄糖单位，并可以水解淀粉的直链和支链糖苷键(直链淀粉酶和支链淀粉酶)。
葡糖淀粉是由为数众多的细菌、真菌、酵母和植物株系产生。尤其令人感兴趣的葡糖淀粉酶是胞外生产的真菌酶类，例如来自曲霉属(Aspergillus)(Boel等，(1984)EMBO J.3：1097-1102；Hayashida等，(1989)Agric.Biol Chem.53：923-929；美国专利5,024,941；美国专利4,794,175和WO 88/09795)、篮状菌属(Talaromyces)(美国专利4,247,637；美国专利6,255,084和美国专利6,620,924)、根霉属(Rhizopus)(Ashikari等，(1986)Agric.Biol.Chem.50：957-964；Ashikari等，(1989)App.Microbiol.and Biotech.32：129-133和美国专利4,863,864)、腐质霉属(Humicola)(WO05/052148和美国专利4,618,579)以及毛霉属(Mucor)(Houghton-Larsen等，(2003)Appl.Microbiol.Biotechnol.，62：210-217)的菌株。编码这些酶的基因中的许多已被克隆并在酵母和真菌细胞中表达。
在商业上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶，其已被广泛用于需要水解淀粉的多种用途。葡糖淀粉酶被用于水解淀粉以生产高果糖玉米增甜剂，玉米增甜剂占据了超过50％的美国增甜剂市场。一般而言，淀粉的水解过程涉及使用α淀粉酶将淀粉水解为糊精以及使用葡糖淀粉酶将糊***解为葡萄糖。然后由其它酶诸如葡萄糖异构酶将葡萄糖转变为果糖。由葡糖淀粉酶生产的葡萄糖也可以被结晶或者用于发酵以生产其它终产物，诸如柠檬酸、抗坏血酸、谷氨酸、1，3丙二醇以及其它终产物。葡糖淀粉酶被用于醇类生产，诸如啤酒生产和清酒生产。葡糖淀粉酶还用于生产燃料乙醇和消费用乙醇。最近，葡糖淀粉酶已被用于低温法水解颗粒(非熟化)淀粉。葡糖淀粉酶也被用于制备动物饲料例如饲料添加剂或者例如家畜的液体饲料组分。
尽管葡糖淀粉酶已被成功地使用了许多年，但仍然存在对于新的有用的葡糖淀粉酶的需求。本发明是基于新型葡糖淀粉酶的发现，其适用于多种用途，尤其是淀粉转化过程。
发明概述
本发明涉及分离的DNA序列，其编码与SEQ ID NO：4具有至少80％同一性的葡糖淀粉酶。
在另一实施方式中，本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性的酶，包括SEQ IDNO：4的氨基酸序列或者与其基本上同源的序列以及其等位基因变体和生物学功能性片段。
在另一实施方式中，本发明涉及分离的DNA序列，其编码里氏木霉葡糖淀粉酶，包括天然基因序列及其生物学功能性片段。
在另一实施方式中，本发明涉及包含编码本发明所包括的葡糖淀粉酶的DNA序列的载体。
在另一实施方式中，本发明涉及稳定转化的真菌宿主细胞，尤其是木霉和曲霉宿主细胞，以及由其表达葡糖淀粉酶的方法。
在另一实施方式中，本发明涉及培养基，其包含本发明所包括的葡糖淀粉酶，以及从转化宿主的生长物或培养物获得的酶制剂，并涉及这些酶制剂的使用。
在另一实施方式中，本发明涉及使用本发明的酶制剂的淀粉转化方法。在一些实施方式中，葡糖淀粉酶将被用于将淀粉转化或者部分水解为含葡萄糖的糖浆的过程。在其它实施方式中，葡糖淀粉酶将被用于生产特制糖浆(specialtysyrups)的过程。在进一步的实施方式中，葡糖淀粉酶将被用于发酵生产终产物诸如醇类，尤其是乙醇。
附图说明
图1A-B显示了编码图3的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶的基因组DNA序列(SEQ ID NO：1)。
图2A-B显示了编码图3的里氏木霉葡糖淀粉酶的无内含子的DNA序列(SEQ ID NO：2)。
图3A显示了具有632个氨基酸的里氏木霉葡糖淀粉酶的推导氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，其中：
信号序列(SEQ ID NO：38)为黑体，表示为残基位置1-20；
原序列(prosequence)(SEQ ID NO：39)为黑体加下划线，表示为残基位置21-33；
催化结构域(SEQ ID NO：40)表示为残基位置34-486；
接头区域(SEQ ID NO：41)为斜体，表示为残基位置487-523；
淀粉结合结构域(SEQ ID NO：42)为斜体加下划线，表示为残基位置524-632。
残基位置34表示的成熟蛋白N-末端氨基酸残基是丝氨酸。
图3B显示了图3A的里氏木霉葡糖淀粉酶的推导成熟蛋白序列(SEQ IDNO：4)。该成熟蛋白序列包括下划线表示的催化结构域(SEQ ID NO：40)、接头区域(SEQ ID NO：41)以及淀粉结合结构域(SEQ ID NO：42)。
图4显示了具有2154bp的基因组DNA序列(SEQ ID NO：5)，其编码柠檬黄肉座菌美国变种(Hypocrea citrina var.Americana)的葡糖淀粉酶(GA102)(SEQID NO：6)。
图5显示了具有2152bp的基因组DNA序列(SEQ ID NO：7)，其编码葡酒红肉座菌(Hypocrea vinosa)的葡糖淀粉酶(GA104)(SEQ ID NO：8)。
图6显示了具有2158bp的基因组DNA序列(SEQ ID NO：9)，其编码木霉属某种(Trichoderma sp.)的葡糖淀粉酶(GA105)(SEQ ID NO：10)。
图7显示了具有2144bp的基因组DNA序列(SEQ ID NO：11)，其编码胶质样肉座菌(Hypocrea gelatinosa)的葡糖淀粉酶(GA107)(SEQ ID NO：12)。
图8显示了具有2127bp的基因组DNA序列(SEQ ID NO：13)，其编码东方肉座菌(Hypocrea orientalis)的葡糖淀粉酶(GA108)(SEQ ID NO：14)。
图9显示了具有2139bp的基因组DNA序列(SEQ ID NO：15)，其编码Trichoderma konilangbra的葡糖淀粉酶(GA109)(SEQ ID NO：16)。
图10显示了具有2088bp的基因组DNA序列(SEQ ID NO：28)，其编码木霉属某种(Trichoderma sp.)的葡糖淀粉酶(GA113)(SEQ ID NO：29)。
图11显示了具有2141bp的基因组DNA序列(SEQ ID NO：30)，其编码哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的葡糖淀粉酶(GA103)(SEQ ID NO：31)。
图12显示了具有2131bp的基因组DNA序列(SEQ ID NO：32)，其编码长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)的葡糖淀粉酶(GA124)(SEQ ID NO：33)。
图13显示了具有2151bp的基因组DNA序列(SEQ ID NO：34)，其编码Trichoderma asperellum的葡糖淀粉酶(GA127)(SEQ ID NO：35)。
图14显示了具有2142bp的基因组DNA序列(SEQ ID NO：36)，其编码Trichoderma strictipilis的葡糖淀粉酶(GA128)(SEQ ID NO：37)。
图15A-I显示了由SEQ ID NOs：5、7、9、11、13、15、28、30、32、34和36的DNA序列编码的葡糖淀粉酶推定氨基酸序列，其分别与SEQ ID NOs：6、8、10、12、14、16、29、31、33、35和37的氨基酸序列相对应，其中每种蛋白的前导肽(leader peptide)为黑体，原序列(prosequence)为下划线加黑体。每种蛋白的不含前导肽和原序列的成熟蛋白序列也被表示为(1)GA102的SEQ ID NO：17；(2)GA104的SEQ ID NO：18；(3)GA105的SEQ ID NO：19；(4)GA107的SEQ ID NO：20；(5)GA108的SEQ ID NO：21；(6)GA109的SEQ ID NO：22；(7)GA113的SEQID NO：43；(8)GA103的SEQ ID NO：44；(9)GA124的SEQ ID NO：45；(10)GA127的SEQ ID NO：46以及(11)GA128的SEQ ID NO：47。
图16图示了SDS-PAGE凝胶，其被用于测定纯化的TrGA的分子量(MW)，其中泳道1表示TrGA，泳道2表示分子量标记，SeeBlue Plus 2(Invitrogen)。
图17A是里氏木霉表达载体pTrex3g的质粒图。
图17B是包含里氏木霉表达载体pNSP23的质粒图，其中TrGA基因被克隆入pTrex3g中。
图18显示了(A)TrGA在37℃在pH 3-8的相对GA活性百分数和(B)TrGA在pH 4.0在25℃至78℃的相对GA活性百分数，参考实施例4。
图19图示了SDS-PAGE凝胶，其被用于测定木霉宿主菌株(1A52)分泌基本上同源的葡糖淀粉酶的情况，其中在大约62kDa处的条带代表葡糖淀粉酶，泳道1代表GA104，泳道2代表GA105；泳道3代表GA107；泳道4代表GA109；泳道5代表TrGA；泳道6代表里氏木霉对照宿主菌株(1A52)；泳道7代表标准分子量标记。
图20(A)显示了黑曲霉葡糖淀粉酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)，其包括前导序列。成熟蛋白的N-末端氨基酸残基由残基位置25的A(丙氨酸)表示；接头区域加下划线，淀粉结合结构域为斜体。(B)显示了河内曲霉α淀粉酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)，其包括前导序列，其中前导序列为黑体加下划线，表示为氨基酸残基1-21；接头区域加下划线，淀粉结合结构域为斜体。成熟蛋白包括催化结构域、接头和淀粉结合结构域。
发明详述
在一些方面，本发明依赖于遗传工程和分子生物学领域所使用的常规技术和方法。下列资源包括在本发明中有用的一般方法学的描述：Sambrook等Eds.，MOLECULE CLONING：A LABORATORY MANUAL(3rd Ed.2000)；Kriegler M.Ed.，GENE TRANSFER AND EXPRESSION：A LABORATORY MANUAL(1990)；和Ausubel等Eds.，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (5th Ed.2002)。尽管与本文描述的方法和材料相似的或等价的任何方法和材料都可以被用于本发明的实践或测试，但优选的方法和材料被描述如下。
除非在本文中另作限定，本文所用的所有科技术语都具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2nd Ed，John Wiley and Sons，NY(1994)以及Hale和Margham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY(1991)Addison Wesley Pub.Co.为技术人员提供了描述本发明时所使用的许多术语的释义。
现在本发明将用下列定义和实施例仅以参考方式详加描述。所有专利和出版物，包括本文中所提及的此类专利和出版物中公开的所有序列，被明确并入本文作为参考。
单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”，除非内容另作清楚的描述，包括复数指代。因此，例如，提及含“一种化合物(a compound)”的组合物时，包括了两种或更多种化合物的混合物。应当注意的是，术语“或(or)”，除非内容另作清楚的描述，一般在使用时包含了“和/或(and/or)”的含义。
数字范围包括定义该范围的数。
除非另作说明，核酸按从左至右5′至3′的方向书写；氨基酸序列按从左至右氨基至羧基的方向书写。
本文所提供的标题并非是对于本发明的各方面或实施方式的限定，其可以作为整体被并入本说明书作为参考。
定义
术语“葡糖淀粉酶”指淀粉葡萄糖苷酶类的酶(E.C.3.2.1.3，葡糖淀粉酶，1，4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶)。这些酶从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原性末端释放出葡糖基残基。
短语“具有颗粒淀粉水解活性”表示能够水解颗粒形式淀粉的酶。
短语“木霉/肉座菌科簇”表示肉座菌科的成员，包括子囊菌门(PhylumAscomycota)肉座目(Hypocreales)的若干无性型例如木霉属(Trichoderma)和粘帚霉属(Gliocladium)，参考第12章，Alexopoulos，C.J.等，INTRODUCTORY MYCOLOGY4th Edition，John Wiley & Sons，NY 1996。
术语“核酸序列”和“多核苷酸”在本文可以互换使用。该术语包括基因组DNA、无内含子DNA、合成来源的DNA或者它们的组合。
术语“内含子”表示间插DNA序列，其被转录，但通过将成熟蛋白的编码序列剪接到一起而从转录物中除去。
术语“分离的核酸序列”表示核酸序列，其中基本上无其它核酸序列。
术语“序列的生物学功能性片段”(例如，SEQ ID NO：4的生物学功能性片段)表示具有葡糖淀粉酶水解活性的多肽，并且一个或多个氨基酸残基从该氨基酸序列的氨基和/或羧基端删去。
术语“载体”表示多核苷酸序列，其被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型。
术语“表达载体”表示包含核酸序列的DNA构建物，所述核酸序列被可操纵地连接于能够影响该核酸序列在适当宿主中的表达的合适的控制序列。合适的控制序列包括影响转录的启动子、操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子和/或终止序列。
术语“启动子”表示调控序列，其参与结合RNA聚合酶以启动基因的转录。
术语“可操纵地连接”指并列关系，其中元件按能够使其在功能上相互关联的方式排布。例如，如果启动子控制序列的转录，则该启动子可操纵地连接于编码序列。
术语“分离的多肽”表示多肽，其中基本上无其它非葡糖淀粉酶的多肽。分离的多肽可以是至少20％纯度、至少40％纯度、至少60％纯度、至少70％纯度、至少80％纯度、至少90％纯度、至少95％纯度，如SDS-PAGE所测定的。
术语“信号序列”表示结合于蛋白质N-末端部分的氨基酸序列，其有利于将成熟形式的蛋白质分泌至细胞外。信号序列的定义是一种功能性定义。成熟形式的胞外蛋白缺少信号序列，其在分泌过程中被切除。术语“信号序列”、“信号肽”和“前导肽”在本文中可以互换使用。一般而言，信号序列指核苷酸序列，术语前导肽指氨基酸序列。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母编码。
术语“催化结构域”指多肽的结构区域，其含有用于底物水解的活性位点。
术语“接头”指短的氨基酸序列，一般具有3至40个氨基酸残基，其将包含淀粉结合结构域的氨基酸序列共价地连接于包含催化结构域的氨基酸序列。
术语“淀粉结合结构域”指优先地结合于淀粉底物的氨基酸序列。
术语“等位基因变体(allelic variants)”表示占据相同的染色体座位的任何两种或更多种可选形式的基因。等位基因变异通过突变天然地产生，并可以导致种群间的多态性。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
术语“宿主细胞”或“宿主菌株”表示对于表达载体或DNA构建物合适的宿主，所述表达载体或DNA构建物包含编码本发明所包括的葡糖淀粉酶的多核苷酸。有利地，将合适的宿主细胞用于本发明所包括的葡糖淀粉酶的重组生产中。
如本文所用，涉及多核苷酸或多肽时使用的术语“来源于(derived from)”表示该多肽或多核苷酸对于微生物而言是天然的。
关于多核苷酸或蛋白的术语“异源的”指在宿主细胞中并非天然存在的多核苷酸或蛋白。
关于多核苷酸或蛋白的术语“内源的”指在宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白。
术语“表达”表示基于基因的核酸序列产生多肽的过程。
术语“过量表达”表示在宿主细胞中表达多肽的过程，其中多核苷酸已被导入该宿主细胞。
术语“导入的(introduced)”在将核酸序列***细胞的上下文中，表示转染、转化或转导，包括指代将核酸序列整合入宿主细胞的过程。
术语“颗粒淀粉”指生的未熟化的淀粉(例如，尚未经过糊化作用的颗粒淀粉)。
术语“淀粉”指由植物的复杂多糖碳水化合物组成的任何物质，包括具有式(C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任何数字。
术语“糊化作用”表示通过熟化(蒸煮)将淀粉分子溶解形成粘性悬浮液。短语“低于糊化温度”指低于开始发生糊化作用的温度的温度。
术语“培养”指使一群微生物细胞在适当条件下在液体或固体培养基中生长。在一种实施方式中，培养指将淀粉底物发酵生物转化为终产物(一般在容器或反应器中)。发酵是通过微生物将有机物质酶促厌氧降解以生产更简单的有机化合物。当发酵过程在厌氧条件下进行时，并不意味着将该术语单独地限定在严格的厌氧条件，因为发酵也在存在氧的条件下进行。
术语“终产物”指来源于任何碳源的分子产物，其由淀粉底物酶促转化而来。
术语“酶促转化”指通过酶作用对底物进行修饰。
术语“比活”表示酶单位，定义为由酶制剂在每单位时间内在特定条件下转化为产物的底物摩尔数。比活表示为单位(U)/mg蛋白。
术语“单糖”表示聚合物诸如淀粉的单体单元，其中聚合度(DP)是1(例如葡萄糖、甘露糖、果糖和半乳糖)。
术语“二糖”表示包含两个共价连接的单糖单元的化合物(DP2)。该术语包括，但不限于诸如蔗糖、乳糖和麦芽糖的化合物。
术语“DP＞3”表示聚合度大于3的聚合物。
术语“寡糖”表示具有2-10个以糖苷键相连的单糖单元的化合物。
术语“多糖”表示具有多个以直链或支链相连的单糖单元的化合物。在一些实施方式中，该术语指具有数百或数千单糖单元的长链。多糖的典型实例是淀粉、纤维素和糖原。
如本文所用，术语“干固体含量(dry solids content，DS或ds)”指在基于干重计算，浆体中的总固体，以％表示。
术语“磨(milling)”指将谷物颗粒粉碎成更小的颗粒。在一些实施方式中，该术语与碾(grinding)可互换使用。
术语“干磨(dry milling)”指碾磨完整的干谷粒，其中谷粒的诸如胚芽和糠的部分未被特意除去。
如本文所用，术语“蒸馏器干糟(distillers dried grain，DDG)”和“带可溶物的蒸馏器干糟(distillers dried grain with solubles，DDGS)”指谷物发酵过程中有用的联产物。
术语“DE“或”葡萄糖当量”是用于量度总还原糖的浓度的行业标准，其按基于干重的D-葡萄糖来计算。未水解的颗粒淀粉具有基本为0的DE，D-葡萄糖具有100的DE。
术语“糖浆(sugar syrup)”指含有可溶性碳水化合物的含水组合物。在一种实施方式中，糖浆是含葡萄糖的糖浆。
               里氏木霉葡糖淀粉酶氨基酸序列
来源于里氏木霉QM6a(ATCC，登记号13631)的葡糖淀粉酶已被克隆，如实施例1中进一步详加描述的。根据本发明，来源于里氏木霉的全长葡糖淀粉酶在图3中示出，并具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。里氏木霉葡糖淀粉酶的成熟蛋白序列(SEQ ID NO：4)表示为图3中的氨基酸残基34-632。
本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性的分离的酶，其包括SEQ ID NO：4中所示的序列，或者涉及与其基本上同源的具有葡糖淀粉酶活性的酶。
在一些实施方式中，本发明涉及包括SEQ ID NO：3中所示序列的葡糖淀粉酶或者与其基本上同源的具有葡糖淀粉酶活性的酶。SEQ ID NO：3的葡糖淀粉酶包括从里氏木霉获得的葡糖淀粉酶的信号序列。
在一些实施方式中，本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性的多肽，其包含SEQID NO：4的葡糖淀粉酶催化结构域，它也表示为SEQ ID NO：40。
在其它实施方式中，本发明涉及淀粉结合结构域，其与SEQ ID NO：4中示出的葡糖淀粉酶淀粉结合结构域具有至少90％、至少95％、至少97％和至少98％的序列同一性。在一些实施方式中，淀粉结合结构域包括SEQ ID NO：4的残基位置524至残基位置632的序列，它被表示为SEQ ID NO：42。
在其它实施方式中，淀粉结合结构域是SEQ ID NO：4的淀粉结合结构域的片段。优选地，片段将包括SEQ ID NO：4的淀粉结合结构域的至少90、至少80或者至少70个氨基酸残基。
                   蛋白质序列的同源性
两种葡糖淀粉酶之间的同源性可以通过两个蛋白序列的氨基酸序列之间的同一性程度来确定。多肽或多核苷酸与另一序列具有某一百分比的同一性(即80％、90％和95％)意味着，当进行比对时，该百分比的碱基或氨基酸残基在这两个序列被比较时是相同的。这种比对以及百分比同源性或同一性可以通过使用本领域已知的任何合适的软件程序来确定。例如，合适的程序在CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel等eds 1995，第19章)中被描述。优选的程序包括GCG Pileup程序(Wisconsin Package，Version 8.1和10.0)、FASTA、BLAST和TFASTA。另一种优选的比对程序是ALIGN或ALIGN Plus(Dayhoff(1978)，ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE 5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation))。进一步，可以使用BLASTP、BLASTN和BLASTX算法(Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。其它有用的方法包括ClustralW(Thompson等，(1997)Nucleic Acid Research 25：4876-4882)，其使用由DNASTAR(Madison WI)提供的软件。也参考Needleman等，(1970)J.Mol.Biol.48：443、Smith等，(1981)Adv.Appl.Math.2：482、Smith等，(1997)Meth.Mol.Biol.70：173-187以及Pearson等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：24444。
根据本发明，“基本同源的”氨基酸序列显示出葡糖淀粉酶活性，且与SEQID NO：4示出的序列或者SEQ ID NO：3示出的序列具有至少80％同一性、至少83％、至少85％、至少87％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％以及至少99％的同一性。尤其优选的基本上同源的葡糖淀粉酶序列是如图15中所示的成熟蛋白序列，其对应于SEQ ID NOs：17、18、19、20、21、22、43、44、45、46和47。此外，优选的基本上同源的葡糖淀粉酶序列是图15所示的序列，其对应于SEQ ID NOs：6、8、10、12、14、16、29、31、33、35和37，并且包含前导序列。进一步，基本上同源的多肽包括具有葡糖淀粉酶活性的等位基因变异和天然突变体。
本发明的葡糖淀粉酶包括基本上同源的多肽和生物学功能性片段，其具有来源于里氏木霉的具有图3中示出的序列(SEQ ID NO：4)的成熟蛋白的至少20％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％以及至少100％的葡糖淀粉酶活性。在本发明的一些优选的实施方式中，在基本相同的条件下检测到的葡糖淀粉酶比活将是来源于里氏木霉的具有图3中示出的序列(SEQ ID NO：4)的成熟蛋白比活的至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％以及至少200％。在一些实施方式中，比活可以在可溶性淀粉底物上进行测量，在其它实施方式中，比活可以在颗粒淀粉底物上进行测量。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列将包括用L-氨基酸进行的保守氨基酸置换，其中一种氨基酸由另一种生物学上相似的氨基酸置换。保守氨基酸置换是那些保留了被置换氨基酸的总电荷、疏水性/亲水性和/或空间体积的置换。保守置换的非限制性实例包括下列组之间的那些置换：Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Lys/Arg、Asn/Gln、Glu/Asp、Ser/Cys/Thr以及Phe/Trp/Tyr。其它保守置换可以选自下表。
                            表1-保守氨基酸置换
  氨基酸   符号   用其中任何一个置换
  丙氨酸   A   D-Ala、Gly、β-Ala、L-Cys、D-Cys
精氨酸 R   D-Arg、Lys、D-Lys、高Arg、D-高Arg、Met、Ile、D-Met、D-Ile、Orn、D-Orn
  天冬酰胺   N   D-Asn、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、Gln、D-Gln
  天冬氨酸   D   D-Asp、D-Asn、Asn、Glu、D-Glu、Gln、D-Gln
  半胱氨酸   C   D-Cys、S-Me-Cys、Met、D-Met、Thr、D-Thr
  谷氨酰胺   Q   D-Gln、Asn、D-Asn、Glu、D-Glu、Asp、D-Asp
  谷氨酸   E   D-Glu、D-Asp、Asp、Asn、D-Asn、Gln、D-Gln
  甘氨酸   G   Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、b-Ala、Acp
  异亮氨酸   I   D-Ile、Val、D-Val、Leu、D-Leu、Met、D-Met
  亮氨酸   L   D-Leu、Val、D-Val、Leu、D-Leu、Met、D-Met
赖氨酸 K   D-Lys、Arg、D-Arg、高Arg、D-高Arg、Met、D-Met、Ile、D-Ile、Orn、D-Orn
  甲硫氨酸   M   D-Met、S-Me-Cys、Ile、D-Ile、Leu、D-Leu、Val、D-Val
苯丙氨酸 F   D-Phe、Tyr、D-Thr、L-Dopa、His、D-His、Trp、D-Trp、反-3，4或5-苯基脯氨酸、顺-3，4或5-苯基脯氨酸
  脯氨酸   P   D-Pro、L-I-噻唑烷-4-羧酸、D-或L-1-噁唑烷-4-羧酸
丝氨酸 S   D-Ser、Thr、D-Thr、异Thr、Met、D-Met、Met(O)、D-Met(O)、L-Cys、D-Cys
苏氨酸 T   D-Thr、Ser、D-Ser、异Thr、Met、D-Met、Met(O)、D-Met(O)、Val、D-Val
  酪氨酸   Y   D-Tyr、Phe、D-Phe、L-Dopa、His、D-His
  缬氨酸   V   D-Val、Leu、D-Leu、Ile、D-Ile、Met、D-Met
在其它实施方式中，氨基酸置换将不是保守置换。
在一些实施方式中，应当考虑，本发明的葡糖淀粉酶将来源于丝状真菌菌株，特别地，基本上同源的序列将从曲霉属某些种(Aspergillus spp.)、根霉属某些种(Rhizopus spp.)、腐质霉属某些种(Humicola spp.)、镰刀霉属某些种(Fusariumspp.)、毛霉属某些种(Mucor spp.)、木霉属某些种(Trichoderma spp.)以及类似属种的菌株获得。在优选的实施方式中，具有葡糖淀粉酶活性的基本上同源的序列将来源于木霉/肉座菌科簇的菌株。这些种中的一些包括T.stromaticum、柠檬黄腐质霉美国变种(H.citrina var.americana)、柠檬黄腐质霉(H.citrina)、乳白腐质霉(H.lactea)、H.hunua、顶孢木霉(T.fertile)、T.tomentosum、葡酒红腐质霉(H.vinosa)、哈茨木霉(T.harzianum)、T.inhamatum、T.oblongisporum、T.cf.aureoviride、T.cf.harzianum、T.fasciculatum、H.tawa、T.crassum、黄绿木霉(T.flavovirens)、粘绿木霉(T.virens)、长孢木霉(T.longipilis)、卷曲木霉(T.spirale)、T.strictipilis、T.pilulifera、多孢木霉(T.polysporum)、T.croceum、T.minutisporum、钩状木霉(T.hamatum)、棘孢木霉(T.asperellum)、深绿木霉(T.atroviride)、康宁木霉(T.koningii)、绿色木霉(T.viride)、胶样腐质霉(H.gelatinosa)、粗壮木霉(T.strigosum)、T.pubescens、H.novazelandiae、T.saturnisporum、长枝木霉(T.longibrachiatum)、东方腐质霉(H.orientalis)、黄绿木霉(T.citrinoviride)、里氏木霉(T.reesei)、T.ghanense、拟康宁木霉(T.pseudokonimgii)、H.andinensis和H.aureoviride。尤其优选的木霉属种以及有亲缘关系的肉座菌某些种的菌株包括柠檬黄腐质霉美国变种、柠檬黄腐质霉、乳白腐质霉、葡酒红腐质霉、哈茨木霉、深绿木霉(T.atroviride)、康宁木霉、绿色木霉、胶样腐质霉、T.saturnisporum、长枝木霉、东方腐质霉、黄绿木霉(T.citrinoviride)、里氏木霉和T.konilangbra。
上述种的一些菌株是可以从培养物保藏中心诸如American Type CultureCollection(ATCC)P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108；Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)；Agricultural Research Service PlantCulture Collection，Northern Regional Research Center(NRRL)；the Centraalbureauvoor Schimmelcultures(CBS)，P.O.Box 85167，3508 AD Utrecht，The Netherlands；Plant Research Institute，Department of Agriculture，Mycology，Ottawa，(DAOM)Canada和International Mycological Institute(IMI)，Genetic Resources Collection，Egham，United Kingdom公开获得。
                  生物学功能性葡糖淀粉酶片段
在一些实施方式中，本发明涉及在SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或与其基本上同源的序列中所公开的葡糖淀粉酶的生物学功能性片段。在一些实施方式中，生物学功能性片段将包括本发明所包括的葡糖淀粉酶的催化结构域。在其它实施方式中，生物学功能性片段将包括至少400个氨基酸残基、至少425个氨基酸残基、至少450个氨基酸残基以及至少460个氨基酸残基。
在一些优选的实施方式中，片段将包括由SEQ ID NO：4的残基位置1至453表示的氨基酸序列的至少一部分，在其它实施方式中，片段将包括SEQ ID NO：4的位置1至453。在进一步的优选实施方式中，片段将包括由SEQ ID NO：17的残基位置1至453、SEQ ID NO：18的残基位置1至452、SEQ ID NO：19的残基位置1至454、SEQ ID NO：20的残基位置1至452、SEQ ID NO：21的残基位置1至453、SEQ ID NO：22的残基位置1至453、SEQ ID NO：43的残基位置1至452、SEQ ID NO：44的残基位置1至452、SEQ ID NO：45的残基位置1至453、SEQ IDNO：46的残基位置1至452或者SEQ ID NO：47的残基位置1至453所表示的氨基酸序列。
本发明所包括的生物学功能性葡糖淀粉酶片段可以通过本领域已知的方法生成。
与由SEQ ID NO：4的氨基酸残基1至453组成的片段具有至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％以及至少99％序列同一性的葡糖淀粉酶同样被本发明所考虑。
在其它实施方式中，生物学功能性片段将包括SEQ ID NO：4中所公开的葡糖淀粉酶的催化结构域和接头序列。
生物学功能性片段还可以包括融合多肽或者可剪切的融合多肽，其中另一种多肽被融合于所述多肽的N-末端和/或C-末端。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的。
            克隆的里氏木霉与基本同源DNA序列
本发明还涉及克隆的DNA序列，其编码表现出本发明的葡糖淀粉酶活性的多肽，所述DNA序列包括：
a)SEQ ID NO：1中示出的DNA序列；
b)SEQ ID NO：2中示出的DNA序列；
c)编码葡糖淀粉酶的DNA序列，所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％、至少83％、至少85％、至少87％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％的同一性；
d)编码葡糖淀粉酶的DNA序列，所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％、至少83％、至少85％、至少87％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％的同一性；
e)编码具有葡糖淀粉酶活性的酶的DNA序列，其中所述的酶与SEQ ID NOs：17、18、19、20、21、22、43、44、45、46和47中所示序列的任何一个具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性；
f)编码序列的生物学功能性片段的DNA序列，所述序列与SEQ ID NO：4中所示序列的氨基酸残基位置1至453具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％和至少98％的同一性；
g)编码具有葡糖淀粉酶活性的酶的DNA序列，所述的酶包含与下列序列中的任何一个具有至少90％、至少95％、至少97％和至少98％序列同一性的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO：17的氨基酸残基位置1至453；
b.SEQ ID NO：18的氨基酸残基位置1至452；
c.SEQ ID NO：19的氨基酸残基位置1至454；
d.SEQ ID NO：20的氨基酸残基位置1至452；
e.SEQ ID NO：21的氨基酸残基位置1至453；
f.SEQ ID NO：22的氨基酸残基位置1至453；
g.SEQ ID NO：43的氨基酸残基位置1至452；
h.SEQ ID NO：44的氨基酸残基位置1至452；
i.SEQ ID NO：45的氨基酸残基位置1至453；
j.SEQ ID NO：46的氨基酸残基位置1至452；和
k.SEQ ID NO：47的氨基酸残基位置1至453。
h)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所示序列至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％和至少99％相同的DNA，其中所述DNA序列编码具有葡糖淀粉酶活性的酶；或者
i)DNA序列，其在高度严紧条件下与对应于SEQ ID NO：2的DNA序列或者其具有至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少100、至少150个连续核苷酸的片段的核酸探针杂交。
此外，本发明包括编码酶的克隆DNA序列，该酶具有葡糖淀粉酶活性并与SEQ ID NOs：6、8、10、12、14、16、29、31、33、35和37中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性。
由于遗传密码的简并性，一种以上的密码子可以被用于编码一种特定的氨基酸。因此，不同的DNA序列可以编码一种多肽，其具有与例如SEQ ID NO：4的多肽完全相同的氨基酸序列。本发明包括编码相同的多肽的多核苷酸。编码本发明所包括的葡糖淀粉酶的DNA序列可以包括或者可以不包括内含子。
DNA序列的同源性是通过两种DNA序列之间的同一性程度来确定。同源性可以使用如上所述用于测定蛋白序列同源性的计算机程序来确定。
当单链形式的核酸能够与其它核酸在合适的温度和溶液离子强度条件下退火时，该核酸则可杂交于另一核酸。对于在低、中、中/高、高以及非常高的严紧条件下的杂交，杂交和清洗条件是本领域熟知的(参见，例如，Sambrook等，supra，具体地第9章和第11章)。一般而言，杂交涉及核苷酸探针和同源DNA序列，其通过互补多核苷酸的大量碱基配对形成稳定的双链杂合体(参见，第8章，GeneCloning，An Introduction，T.A.Brown，(1995)Chapman and Hall，London)。
带有探针和同源序列的滤膜在2×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％SDS中在大约60℃(中度严紧性)；65℃(中/高度严紧性)；70℃(高度严紧性)以及大约75℃(非常高度严紧性)下清洗。
                            载体
根据本发明的一种实施方式，DNA构建物被组装以转入宿主细胞，所述DNA构建物包含编码本发明所包括的葡糖淀粉酶的核酸序列，该核酸序列被可操纵地连接于启动子序列。DNA构建物可以使用载体导入宿主细胞。载体可以是在被导入宿主细胞时整合入宿主细胞基因组并且被复制的任何载体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒及类似物。在一些优选的实施方式中，载体是表达载体，其包括可操纵地连接于葡糖淀粉酶编码序列的调控序列。
合适的表达和/或整合载体的实例在Sambrook等，(1989)supra和Ausubel(1987)supra以及van den Hondel等，(1991)Bennett and Lasure(Eds.)MORE GENEMANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press pp.396-428和美国专利号5,874,276中提供。也参考真菌遗传学保藏中心菌种目录(the Fungal Genetics Stock CenterCatalogue of Strains)(FGSC，<www.fgsc.net>)的载体列表。特别有用的载体包括从例如Invitrogen和Promega获得的载体。适用于真菌宿主细胞的特定载体包括多种载体诸如pFB6、pBR322、pUC18、pUC100、pDONTM201、pDONRTM221、pENTRTM、pGEM3Z和pGEM4Z。
在一些优选的实施方式中，在真菌宿主细胞中表现出转录活性的启动子可以来源于编码与宿主细胞同源或者异源的蛋白的基因。启动子可以是突变的、截短的和杂合的启动子。优选地，启动子在木霉或曲霉宿主中是有用的。示例性的启动子包括里氏木霉启动子cbh1、cbh2、egl1、egl2、eg5、xln1和xln2。其它有用的启动子的实例包括来自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因(glaA)的启动子(参见Nunberg等，(1984)Mol.Cell Biol.4：2306-2315和Boel等，(1984)EMBO J.3：1581-1585)、构巢曲霉乙酰胺酶基因和米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂酶基因的启动子。
在一种实施方式中，启动子对于宿主细胞而言是天然的启动子。例如，当里氏木霉是宿主时，启动子是天然的里氏木霉启动子。
在另一实施方式中，启动子对真菌宿主细胞而言是异源的启动子。
在优选的实施方式中，启动子是里氏木霉cbh1，其为诱导型启动子并已被记载于GenBank，登记号为D86235。
“诱导型启动子”是在环境或发育调控下具有活性的启动子。在一些实施方式中，DNA构建物包括编码信号序列的核酸，信号序列是连接于多肽氨基末端的氨基酸序列，其引导被编码的多肽进入细胞的分泌途径。核酸序列的编码序列的5′端可以天然地包括信号肽编码区，其天然地与葡糖淀粉酶编码序列的片段一起被连接进翻译阅读框，所述葡糖淀粉酶编码序列编码分泌的葡糖淀粉酶，或者核酸序列的编码序列的5′端可以包括对于编码序列而言是外源的信号肽。在一些优选实施方式中，DNA构建物包括与将被表达的葡糖淀粉酶基因天然相关的信号序列。有效的信号序列可以包括从其它丝状真菌细胞诸如腐质霉、曲霉和根霉的葡糖淀粉酶获得的信号序列。
在优选的实施方式中，DNA构建物的核酸编码信号序列，其与图3中所述的信号序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性。
在其它实施方式中，包含信号序列和启动子序列的将要被导入真菌宿主细胞的DNA构建物或载体来自于相同来源。例如，在一些实施方式中，信号序列是cbh1信号序列，其被可操纵地连接于cbh1启动子。在其它优选实施方式中，将使用木霉/肉座菌科簇成员的天然葡糖淀粉酶信号序列。
在一些实施方式中，表达载体还包括终止序列。在宿主细胞中有功能的任何终止子序列都可以被用于本发明。在一种实施方式中，终止序列和启动子序列来自于相同来源。在另一种实施方式中，终止序列对宿主细胞而言是同源的。特别合适的终止子序列是来源于木霉属菌种，尤其是里氏木霉的cbh1。其它有用的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因(Nunberg等，(1984)supra和Boel等，(1984)supra)、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、米曲霉TAKA淀粉酶基因或者构巢曲霉trpC的终止子(Punt等，(1987)Gene 56：117-124)。
在一些实施方式中，表达载体包括选择标记。优选的选择标记的实例包括赋予抗微生物剂抗性的标记(例如潮霉素和腐草霉素)。营养选择标记也可用于本发明，包括本领域已知的标记如amdS、argB和pyr4。在载体***中对于木霉转化有用的标记是本领域已知的(参见，例如，Finkelstein，第六章，BIOTECHNOLOGYOF FILAMENTOUS FUNGI、Finkelstein等Eds.Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992)，第六章；和Kinghorn等，(1992)APPLIED MOLECULAR GENETICS OFFILAMENTOUS FUNGI，Blackie Academic and Professional，Chapman and Hall，London)。在一种优选的实施方式中，选择标记是amdS基因，其编码乙酰胺酶，该酶使得转化细胞能够以乙酰胺为氮源进行生长。使用构巢曲霉amdS基因作为选择标记在Kelley等，(1985)EMBO J.4：475-479和Penttila等，(1987)Gene 61：155-164中被描述。
用于连接DNA构建物以及将其***适当载体的方法是本领域熟知的，所述DNA构建物包括编码葡糖淀粉酶的核酸序列、启动子、终止子和其它序列。连接一般是通过在方便的限制性位点进行连接反应来完成。如果不存在此类位点，则按照常规实践使用合成的寡核苷酸接头(参见Sambrook(1989)supra以及Bennett和Lasure，MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press，San Diego(1991)pp 70-76.)。此外，可以使用已知的重组技术(例如Invitrogen Life Technologies，Gateway Technology)构建载体。
                           宿主细胞
本发明还涉及包含编码本发明葡糖淀粉酶的核酸序列的宿主细胞，其被用于生产本发明的葡糖淀粉酶。根据本发明的优选的宿主细胞是丝状真菌细胞，术语宿主细胞包括细胞，细胞子代和由丝状真菌菌株的细胞产生的原生质体。
术语“丝状真菌”指真菌亚门的所有丝状形式(参见Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORY MYCOLOGY，Wiley，New York)。这些真菌的特征是具有细胞壁的营养菌丝体，所述细胞壁由几丁质、纤维素和其它复杂多糖构成。本发明的丝状真菌在形态学、生理学和遗传学上都不同于酵母。丝状真菌通过菌丝的延长进行营养生长，碳代谢是专性好氧的。在本发明中，丝状真菌亲代细胞可以是但不限于下列的种的细胞：木霉(Trichoderma)(例如里氏木霉(Trichoderma reesei)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性态、长枝木霉(T.longibrachiatum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum))；青霉属某种(Penicillium sp.)、腐质霉属某种(Humicola sp.)(例如特异腐质霉(H.insolens)、H.lanuginosa和灰腐质酶(H.grisea))；金孢子菌属某种(Chrysosporium sp.)(例如C.lucknowense)、粘帚霉属某种(Gliocladium sp.)、曲霉属某种(Aspergillus sp.)(例如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans)和泡盛曲霉(A.awamori))、镰刀霉属某种(Fusarium sp.)(例如禾谷镰刀菌(F.graminum)和F.venenatum)、脉孢菌属某种(Neurospora sp.)、肉座菌属某种(Hypocreasp.)、毛霉(Mucor)和裸孢壳属某种(Emericella sp.)(也参见Innis等，(1985)Sci.228：21-26)。术语“木霉”或“木霉属某种”指以前或目前被分类为木霉的任何真菌属。在一些实施方式中，宿主细胞将是经遗传改造的宿主细胞，其中天然的基因已失活，例如通过缺失。在期望获得一种或多种基因失活的真菌宿主细胞的情况下，可以使用已知的方法(例如美国专利5,246,853、美国专利5,475,101和WO92/06209中公开的方法)。基因失活可以通过完全或部分缺失、通过***失活或者为了意欲达到的目标而使基因丧失功能(由此防止基因表达功能性蛋白)的任何其它手段来完成。已被克隆的来自木霉属某种或者其它丝状真菌宿主的任何基因都可以被剔除。在一些优选实施方式中，当宿主细胞是木霉细胞，尤其是里氏木霉宿主细胞时，cbh1、cbh2、egl1和egl2基因将被失活且优选地被剔除。特别优选的四种蛋白缺失(quad-deleted proteins)的里氏木霉宿主细胞在美国专利5,847,276和WO 05/001036中被阐明和描述。
                        宿主细胞的转化
将DNA构建物或载体导入宿主细胞，包括多种技术，诸如转化；电穿孔；细胞核微注射；转导；转染(例如用脂转染法介导的转染和DEAE-Dextrin介导的转染)；与磷酸钙温育沉淀DNA；用DNA包被的微射弹进行的高速轰击；和原生质体融合。一般的转化技术是本领域已知的(参见例如Ausubel等，(1987)，supra，第9章；和Sambrook(1989)supra以及Campbell等，(1989)Curr.Genet.16：53-56)。木霉中异源蛋白的表达在美国专利6,022,725；美国专利6,268,328；Harkki等，(1991)；Enzyme Microb.Technol.13：227-233；Harkki等，(1989)Bio Technol.7：596-603；EP 244,234；EP 215,594；和Nevalainen等，“The Molecular Biology ofTrichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous andHeterologous Genes”，MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY，Eds.Leong andBerka，Marcel Dekker Inc.，NY(1992)pp.129-148)中被描述。对于曲霉属菌株的转化，也参考Cao等，(2000)Sci.9：991-1001和EP 238 023，对于镰刀霉菌株的转化，也参考WO96/00787。
优选地，遗传稳定的转化子用载体***构建，由此编码葡糖淀粉酶的核酸被稳定地整合入宿主菌株染色体中。然后通过已知技术将转化子纯化。在一个非限制性实例中，包含amdS标记的稳定转化子通过其在含乙酰胺的固体培养基上较快的生长速度并形成具有光滑而非粗糙轮廓的圆形克隆而区别于不稳定转化子。此外，在一些情况下，进行进一步的稳定性测试，这是通过下述进行的：在非选择性固体培养基(即，NH4(SO4)2(5mg/mL)作为氮源)上生长转化子、从这一培养基收获孢子，并确定随后在含10mM乙酰胺作为唯一氮源的选择性培养基上发芽并生长的这些孢子的百分比。可选地，本领域已知的其它方法可以被用于选择转化子。
在一种具体实施方式中，用于转化的木霉属某种的制备涉及制备真菌菌丝体的原生质体(参见，Campbell等，(1989)Curr.Genet.16：53-56)。而且，丝状真菌的根癌农杆菌介导的转化法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)是已知的(参见de Groot等，(1998)Nat.Biotechnol.16：839-842)。
在一些实施方式中，菌丝体从萌发的营养孢子获得。将菌丝体用酶处理，该酶消化细胞壁而形成原生质体。然后通过在悬浮培养基中加入渗透压稳定剂保护原生质体。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁以及类似物。通常这些稳定剂的浓度在0.8M至1.2M之间变化。优选地，在悬浮培养基中使用大约1.2M的山梨醇溶液。木霉属某种菌株宿主对DNA的摄入决定于钙离子的浓度。一般而言，大约10mM CaCl2至50mM CaCl2被用在摄入溶液中。对于丝状真菌宿主的转化方法，也参考美国专利6,022,725和美国专利6,268,328。
本发明涉及重组生产葡糖淀粉酶的方法，包括在丝状真菌宿主细胞中表达编码本发明葡糖淀粉酶的多核苷酸，并在适于生产葡糖淀粉酶的条件下培养宿主细胞，以及可选地，回收葡糖淀粉酶。
在本发明的表达和生产方法中，真菌细胞在适当条件下以摇瓶培养方式、在实验室发酵罐或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵方式(包括连续发酵、分批发酵和补料分批发酵)进行培养，其中使用含有生理盐和营养剂的合适培养基(参见例如Pourquie，J.等，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSEDEGRADATION，eds.Aubert，J.P.等，Academic Press，pp.71-86，1988和Ilmen，M.等，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306)。普通的商业制备的培养基(例如酵母麦芽提取物(YM)肉汤、Luria Bertani(LB)肉汤和Sabouraud葡萄糖(SD)肉汤)可用于本发明。对于给定丝状真菌，优选的培养条件是本领域已知的，并可以在科技文献中和/或该真菌的来源诸如美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)和真菌遗传学储存中心(Fungal Genetics Stock Center)找到。在葡糖淀粉酶编码序列处在诱导型启动子的控制下的情形中，向培养基中加入能够有效诱导葡糖淀粉酶表达的浓度的诱导剂(例如糖类、金属盐或抗微生物剂)。
在一些实施方式中，为了评价已被用编码本发明所包括的葡糖淀粉酶的多核苷酸转化的细胞系表达葡糖淀粉酶的情况，在蛋白水平、RNA水平和/或通过利用功能性生物试验尤其是针对葡糖淀粉酶的活性和/或产生的试验来进行分析。这些试验中的一些包括Northern印迹、斑点印迹(DNA或RNA分析)、RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应)或使用适当标记的探针(基于核酸编码序列)的原位杂交，以及常规的Southern印迹和放射自显影。
此外，葡糖淀粉酶的生产和/或表达可以在样品中直接测定，例如，通过直接测定培养基中的还原糖诸如葡萄糖的试验以及通过测定葡糖淀粉酶活性、表达和/或产生的试验。特别地，葡糖淀粉酶活性可以通过3，5-二硝基水杨酸(DNS)法进行检测(参见Goto等，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.58：49-54)。在其它实施方式中，蛋白表达是通过免疫学方法诸如细胞、组织切片的免疫组化染色或组织培养基的免疫试验(例如通过Western杂交或ELISA)来评价。此类免疫试验可以被用于定性和定量地评价葡糖淀粉酶的表达。此类方法的细节是本领域技术人员已知的，执行此类方法的许多试剂是可商业获得的。
本发明的葡糖淀粉酶可以通过本领域已知的各种方法从培养基中回收或纯化，包括离心、过滤、萃取、沉淀以及类似方法。
                       用途与组合物
本发明还涉及包含本发明葡糖淀粉酶的组合物以及将该葡糖淀粉酶应用于工业和商业用途的方法。非限制性的实例，包括本发明所包含的葡糖淀粉酶在工业和商业用途中的应用，被简要地描述如下。
葡糖淀粉酶可以被用在水解和糖化淀粉的组合物中、清洁和去污剂组合物(例如洗衣去污剂、洗碟去污剂和硬表面清洁组合物)和动物饲料组合物中。进一步，葡糖淀粉酶可以被用于烘焙用途诸如面包和蛋糕的生产、酿造、保健、纺织、环境废物转化过程、生物制浆加工和生物材料(biomass)转化用途中。
特别地，葡糖淀粉酶可以被用于淀粉转化过程，尤其用于生产果糖糖浆的葡萄糖，特制糖(specialty sugars)以及用于由含淀粉底物发酵生产醇和其它终产物(例如有机酸、抗坏血酸和氨基酸)(G.M.A van Beynum等Eds.(1985)STARCHCONVERSION TECHNOLOGY，Marcel Dekker Inc.NY)。用本发明的葡糖淀粉酶组合物生产的糊精可以产生至少80％、至少85％、至少90％和至少95％的葡萄糖产率。使用本发明所包括的葡糖淀粉酶由淀粉底物的发酵进行的醇类生产，可以包括燃料醇类或便携醇类的生产。
在一种优选的实施方式中，本发明的葡糖淀粉酶将被用于水解来自各种基于植物的底物的淀粉，其被用于醇类生产。在一些优选实施方式中，基于植物的底物将包括玉米、小麦、燕麦、黑麦、蜀黍、稻米、甘蔗以及它们的组合。在一些实施方式中，基于植物的底物将是分离的(fractionated)植物材料，例如谷物谷粒诸如玉米，其被分离为多种组分诸如纤维、胚芽、蛋白和淀粉(胚乳)(美国专利6,254,914和美国专利6,899,910)。醇类发酵的方法在THE ALCOHOL TEXTBOOK，A REFERENCE FOR THE BEVERAGE，FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOLINDUSTRIES，3rd Ed.，Eds K.A.Jacques等，1999，Nottingham University Press，UK.中被描述。在某些优选实施方式中，醇类将是乙醇。特别地，醇类的发酵生产过程被表征为湿磨或干磨过程。在一些实施方式中，葡糖淀粉酶将被用于湿磨发酵过程，在其它实施方式中，葡糖淀粉酶将被用于干磨过程。
干法谷粒碾磨包括大量基本步骤，其一般包括：碾磨、熟化(cooking)、液化、糖化、发酵和固液分离，从而生产醇类及其它副产物(co-prodcuts)。植物材料，尤其是完整的谷物颗粒诸如玉米、小麦或黑麦被压碎(ground)。在一些情况下，谷粒可以首先被分离为各组成部分。压碎的植物材料可以被碾磨以获得粗制或精制颗粒。压碎的植物材料与液体在浆体槽中混合。该浆体在喷射熟化器(jet cooker)中与液化酶(例如α淀粉酶)一起经受高温成为可溶物并将谷物中的淀粉水解为糊精。将混合物冷却并进一步用糖化酶诸如本发明所包括的葡糖淀粉酶处理以产生葡萄糖。然后将含葡萄糖的醪在存在发酵微生物诸如产乙醇微生物——尤其是酵母(酵母属某些种(Saccharomyces spp))——的情况下发酵大约24至120小时。将醪中的固体从液相中分离出来，获得醇诸如乙醇和有用的副产物诸如蒸馏器酒糟。
在一些实施方式中，糖化步骤和发酵步骤被合并，该方法被称为同步糖化发酵法(simultaneous saccharification and fermentation)或同步糖化酵母增殖发酵(simultaneous saccharification，yeast propagation and fermentation)。
在其它实施方式中，熟化步骤或将含淀粉底物暴露于高于底物中淀粉的糊化温度的温度可以被排除。这些发酵方法，在一些实施方式中，包括碾磨谷物谷粒或分级的(fractionated)谷粒以及将磨碎的谷物谷粒与液体混合以形成浆体，然后将此浆液与本发明的葡糖淀粉酶以及可选地其它酶以及酵母在单个容器中混合以生产乙醇和其它联产物，所述其它酶诸如但不限于α淀粉酶、其它葡糖淀粉酶和具有颗粒淀粉水解活性的酶(美国专利4,514,496、WO 04/081193和WO04/080923)。
在一些实施方式中，本发明涉及糖化液体淀粉溶液的方法，其包括使用本发明葡糖淀粉酶的酶促糖化步骤。
在一些实施方式中，包含本发明所包括的且从培养基中获得或者从培养基中回收并纯化的葡糖淀粉酶的酶组合物将任选地与下列酶的任何一种或它们的组合组合使用，所述酶为α淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶(pullulanases)、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂酶、肌醇六磷酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、木聚糖酶、颗粒淀粉水解酶以及其它葡糖淀粉酶。
在一些特别优选的组合物中，本发明的葡糖淀粉酶将与α淀粉酶诸如真菌α淀粉酶(例如曲霉属某种)或细菌α淀粉酶(例如芽孢杆菌属某种诸如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))以及它们的变体组合。在一些实施方式中，α淀粉酶将是与SEQ ID NO：27的成熟蛋白序列具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的α淀粉酶。被考虑用于本发明组合物的可商业获得的α淀粉酶是已知的，包括GZYME G997、SPEZYME FRED、SPEZYME EHTYL(GenencorInternational Inc.)和TERMAMYL 120-L以及SUPRA(Novozymes，Biotech.)。
在其它特别优选的实施方式中，本发明的葡糖淀粉酶将与其它葡糖淀粉酶组合。在一些实施方式中，本发明的葡糖淀粉酶将与一种或多种葡糖淀粉酶组合，后者来源于曲霉属菌株或其变种，诸如米曲霉、黑曲霉(例如图20(A)的成熟蛋白序列、河内曲霉和泡盛曲霉；来源于腐质霉属菌株或其变种，尤其灰腐质霉，诸如与WO 05/052148中公开的SEQ ID NO：3具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的葡糖淀粉酶；来源于篮状菌属菌株或其变体，尤其T.emersonii，以及其来源于阿太菌属(Athelia)菌株，尤其罗氏阿太菌(A.rolfsii)。
                 材料与方法
在以下的公开内容和实验部分，使用了下列缩略语：
TrGA(里氏木霉葡糖淀粉酶组合物，成熟蛋白具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列)；AkAA(河内曲霉α淀粉酶组合物，成熟蛋白具有SEQ ID NO：27的序列)；AnGA(DISTILLASE，包含黑曲霉GA(Genencor International Inc.))；GA(葡糖淀粉酶)；GAU(葡糖淀粉酶单位)；AAU(α淀粉酶单位)；wt％(重量百分比)；℃(摄氏度)；rpm(每分钟转数)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；dIH2O(去离子水，Milli-Q过滤)；aa或AA(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD或kDa(千道尔顿)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔浓度)；mM(毫摩尔浓度)；μM(微摩尔浓度)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；DO(溶解氧)；和EtOH(乙醇)。
下列试验和方法被用于下面提供的实施例中：
1)GA试验—葡糖淀粉酶试验：葡糖淀粉酶活性是利用已熟知的分析的测量方法，其基于葡糖淀粉酶催化水解对硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷(pNPG)为葡萄糖和对硝基苯酚的能力。在碱性pH条件下，硝基苯酚形成黄色，其与葡糖淀粉酶活性成比例，在400nm进行监测，并与酶标准品进行比较，测量结果表示为GAU(Elder，M.T.和Montgomery R.S.，Glucoamylase activity in industrial enzyme preparations usingcolorimetric enzymatic method，Journal of AOAC International，vol.78(2)，1995)。1GAU被定义为在pH 4.2和60℃从可溶性淀粉底物(4％ds)每小时产生1gm以葡萄糖计算的还原糖的酶量。
2)用于扩增来自木霉/肉座菌菌株的基因的引物与PCR方案：
  组分   μl
  正向引物(10μM)   1
  反向引物(10μM)   1
  模板基因组DNA   5
  dNTP(10mM)   1
  HiFi缓冲液   5
  MgSO4(50mM)   2
  DNA聚合酶—高保真Platinum Taq聚合酶(Invitrogen，目录号11304-029)   0.5
  Milli-Q水，无菌   34.5
关于PCR程序，初始变性为94℃2分钟，1个循环；94℃变性30秒、55℃退火30秒以及68℃延伸2分钟，30个循环，最后的延伸步骤为68℃7分钟。
3)乙醇和碳水化合物的测定
样品的乙醇和碳水化合物组成使用此处所述的HPLC法来确定：
a)将1.5mL Eppendorf离心管装满发酵罐啤酒并将其在冰上冷却10分钟；
b)在Eppendorf桌面离心机上将样品管离心1分钟；
c)将0.5mL上清液样品转入装有0.05mL Kill溶液(1.1N H2SO4)的试管中并将其静置5分钟；
d)向试管样品中加入5.0mL水，然后经0.45μm Nylon Syringe Filter将其滤入HPLC管；和
e)运行HPLC。
HPLC条件：
a)乙醇***：柱：Phenomenex Rezex有机酸柱(RHM-单糖)#00H 0132-KO(等效于Bio-Rad 87H)；柱温：60℃；流动相：0.01N H2SO4；流速：0.6mL/分钟；检测器：RI；上样体积：20μL。
b)碳水化合物***：柱：Phenomenex Rezex碳水化合物(RCM-单糖)#00H-0130-KO(等效于Bio-Rad 87H)；柱温：70℃；流动相：纳米纯DIH2O；流速：0.8mL/分钟；检测器：RI；上样体积：10μL(3％DS物质)。
该柱根据糖类的分子量进行分离，所述糖被命名为DP-1(单糖)；DP-2(二糖)；DP-3(三糖)和DP＞3(寡糖，具有大于3的聚合度)。
4)残留淀粉的碘测试：将啤酒样品(发酵肉汤)在2ml塑料离心管中离心。倒空上清液并将含有沉淀的离心管放入冰浴中。向沉淀中加入若干滴0.025N碘溶液(0.1N碘，来自VWR Cat.No.VW3207-14X稀释)并混合。阳性(+)淀粉显示出从蓝至紫的颜色范围，颜色的强度与淀粉浓度成正比。阴性结果(-)保持浅黄色。
5)总淀粉含量的测定：酶-酶淀粉液化糖化法(双酶法)被用于测定总淀粉含量。在典型的分析中，取2g干样品到100ml Kohlraucsh烧瓶中并加入45ml pH 7.0的MOPS缓冲液。将此浆液充分搅拌30分钟。加入1.0ml SPEZYME FRED(1∶50稀释于水中)并加热至沸腾3-5分钟。将烧瓶放入高压灭菌锅中121℃保持15分钟。高压灭菌后，将烧瓶放入95℃水浴中并加入1ml 1∶50 SPEZYME FRED稀释液，温育45分钟。将pH调至pH 4.2并将温度降至60℃。随后加入20ml pH 4.2的乙酸盐缓冲液。通过加入1.0ml 1∶100稀释的OPTIDEX L-400(葡糖淀粉酶，来自Genencor International Inc.)进行糖化，并继续在60℃温育18小时。通过在95℃加热10分钟终止酶反应。用葡萄糖作为标准，通过HPLC分析测定总糖组成。室温下未经酶促处理的样品水提取物中的可溶性淀粉水解产物从总糖中扣除。
6)总蛋白分析：样品制备物中的总氮(N)使用Kjeldhal法(American Assoc.CerealChemists(AACC)，(1983)，Methods 22B60 8th Ed.St Paul，MN)来测定。蛋白含量通过6.25×总N来计算。
                           实施例
提供下列实施例是为了证明并进一步说明本发明某些优选的实施方式和方面，而非解释为对本发明范围的限定。
                   实施例1-TrGA的分离与克隆
按照供应商(Qbiogene)所述的方法，用BIO101 Fast PrepSystem从马铃薯葡萄糖肉汤(Potato Dextrose Broth)(DifcoTM目录号254920)中的菌丝体液体培养物中分离里氏木霉QM6a的染色体DNA。用Quick Spin柱(Qiagen art No.28106)纯化该DNA。用具有GA特异性序列的引物NSP232R(SEQ ID NO：24)和NSP233F(SEQ ID NO：25)分离葡糖淀粉酶基因，所述引物是根据Department of Energy(DOE)Joint Genome Institute的里氏木霉基因组数据库中的预测核苷酸序列设计的。该引物的5′端的侧翼具有GatewayattB序列(Invitrogen)。将里氏木霉QM6a染色体DNA作为模板使用。
PCR混合物含有下列组分：正向引物(10μM)4μL；反向引物(10μM)4μL；模板DNA(500ng/μL)1μL；dNTP混合物(10mM)2μL；10×Cx缓冲液10μL和PfuTurboCx Hotstart DNA聚合酶0.5μL(Stratagen目录号600410)。加入去离子水至总体积100μL。
PCR方案如下：初始变性为98℃30秒，变性、退火和延伸分别为98℃10秒；68℃30秒；72℃45秒，30个循环，最后的延伸步骤为72℃10分钟。
通过在1％琼脂糖中电泳对PCR片段进行分析。用凝胶抽提纯化试剂盒(Gel-Extraction Purification Kit)(Qiagene目录号28706)分离期望大小的片段。将PCR片段克隆入GatewayEntry载体pDONR201并转化进大肠杆菌DH5αMaxEfficiency细胞(Invitrogen目录号18258012)。测定***DNA的核苷酸序列，由其推导出TrGA基因的基因组DNA序列(图1(SEQ ID NO：1))。
             实施例2-里氏木霉的转化与TrGA的发酵/表达
包含正确GA基因序列的载体DNA被重组进里氏木霉表达载体pTrex3g中(图17)。
载体pTrex3g基于大肠杆菌载体pSL1180(Pharmacia Inc.，Piscataway，NJ)，其为基于pUC118噬粒(phagemid)的载体(Brosius，J.(1989)，DNA 8：759)，带有含有64个六聚体限制性酶识别序列的延伸的多克隆位点。载体pTrex3g被设计为Gateway目标载体(Hartley等，(2000)Genome Research 10：1788-1795)，可以允许利用Gateway技术(Invitrogen)在里氏木霉cbh1基因的启动子和终止子区之间任何期望的开放阅读框内***片段。该载体还含有构巢曲霉amdS基因以用作里氏木霉转化中的选择标记。pTrex3g载体的细节如下(图17A)。该载体大小为10.3kb。以下DNA片段被***到pSL1180的多接头区(polylinker region)：a)来自里氏木霉cbh1基因的启动子区的2.2bp DNA片段；b)由Invitrogen获得的1.7kb Gateway阅读框A序列盒，其在两端包括位于氯霉素抗性基因(CmR)和ccdB基因侧翼的attR1和attR2重组位点；c)336bp的来自里氏木霉cbh1基因的终止子区的DNA片段；和d)含带有其天然启动子和终止子区的构巢曲霉amdS基因的2.7kb DNA片段。
通过PDS-1000/Helium System(BioRad目录号165-02257)，用微粒轰击法，将含里氏木霉GA基因的表达载体pNSP23(图17)转化进衍生于RL-P37(IA52)并具有多种基因缺失(Δcbh1、Δcbh2、Δeg1、Δeg2)的里氏木霉宿主菌株。实验方案概述如下，也参考WO 05/001036的实施例6和11。
制备来自里氏木霉四缺失菌株(quad deleted strain)的孢子悬浮液(大约5×108个孢子/ml)。将100ul-200ul孢子悬浮液涂布于装有基本培养基(MM)乙酰胺培养基的平板中心。(MM乙酰胺培养基具有下列组成：0.6g/L乙酰胺；1.68g/LCsCl；20g/L葡萄糖；20g/L KH2PO4；0.6g/L CaCl2 2H2O；1ml/L 1000X痕量元素溶液；20g/L Noble琼脂和pH 5.5。1000X痕量元素溶液含5.0g/L FeSO47H2O；1.6g/L MnSO4；1.4g/L ZnSO4 7H2O和1.0g/L CoCl2 6H2O。使孢子悬浮液在MM乙酰胺培养基表面上干燥。
按制造商说明书进行转化。简言之，将60mg M10钨微粒放入微量离心管中。加入1mL乙醇并使其静置15秒。将微粒在15,000rpm离心15秒。除去乙醇，将微粒用无菌dH2O清洗三次，然后加入250uL 50％(v/v)无菌甘油。将25ul钨微粒悬浮液放入微量离心管中。在连续涡旋振荡的同时，加入下列物质：5ul(100-200ng/ul)质粒DNA、25ul 2.5M CaCl2和10ul 0.1M亚精胺。将微粒离心3秒。弃去上清液，微粒用200ul 100％乙醇清洗并离心3秒。弃去上清液，加入24uL 100％乙醇并吹打混匀，然后取出8ul等份试样的微粒并将其放在盛于干燥器中的macrocarrier disks的中心。一旦钨/DNA溶液干燥，将该macrocarrier disk与带有孢子的MM乙酰胺平板一起放入轰击室，并按制造商说明书执行轰击过程。在用钨/DNA微粒对铺板的孢子进行轰击后，将板在30℃温育。将转化的菌落转移到MM乙酰胺培养基的新培养板并在30℃温育。
            实施例3-转化细胞所表达的TrGA的GA活性验证
在MM乙酰胺板上生长5天后，将表现出稳定形态的转化子接种到装有30ml Proflo培养基的250ml摇瓶中。(Proflo培养基含有：30g/L α-乳糖；6.5g/L(NH4)2SO4；2g/L KH2PO4；0.3g/L MgSO4 7H2O；0.2g/L CaCl2；1ml/L 1000X痕量元素盐溶液；2ml/L 10％ Tween 80；22.5g/L ProFlo棉籽粉(Traders protein，Memphis，TN)；0.72g/L CaCO3。在28℃和140rpm生长两天后，将10％的Proflo培养物转入装有30ml乳糖确定培养基(Lactose Defined Media)的250ml摇瓶中。乳酸确定培养基的组成如下5g/L(NH4)2SO4；33g/L PIPPS缓冲液；9g/L酪蛋白氨基酸；4.5g/L KH2PO4；1.0g/L MgSO4 7H2O；5ml/L Mazu DF60-P消泡剂(MazurChemicals，IL)；1000X痕量元素溶液；pH 5.5；灭菌后向培养基中加入40ml/L40％(w/v)乳糖溶液。将乳糖确定培养基摇瓶在28℃、140rpm温育4-5天。
通过离心除去菌丝体，对上清液进行总蛋白分析(BCA Protein Assay Kit，Pierce目录号23225)并用pNPG作为底物进行GA活性分析。
将培养物上清样品与适当体积的含还原剂的2×上样缓冲液混合，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定蛋白表达情况，其中使用NuPAGENovex 10％Bis-Tris胶和MES SDS电泳缓冲液。将凝胶用SimplyBlueTMSafeStain(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)染色。
根据SDS-PAGE分析，在来自四缺失菌株的上清中未观察到的蛋白条带在一些转化子的上清中被观察到，这些转化子带有含葡糖淀粉酶开放阅读框的pTrex3g载体(图16)。这一新的蛋白条带具有大约64kDa的表观分子量。此结果证实了TrGA被分泌进入培养基。
           实施例4-GA基因产物的生物化学表征
以4-L规模培养产GA转化子。用标称分子量界限值为10,000Da的超滤设备(Pall Omega Centramate OS010c10)浓缩培养物滤液。应用explorer 100FPLC***(Amersham Biosciences)通过2步法对粗制酶制剂进行纯化。将HiPrep16/10 FF Q-Sepharose柱(Amersham BioSciences目录号17-5190-01)用25mM TrispH 8.0平衡，用含100mM NaCl的25mM Tris pH 8.0从该柱中洗脱蛋白。使用Cbind200树脂(Novagen目录号701212-3)并用含500mM NaCl的50mM Tris pH 7.0作为洗脱缓冲液进行第二亲合层析步骤(图16)。通过Edman降解法(Edman，P.(1956)Acta Chem Scand 10：761-768)测定该基因产物的N-末端(Ser-Val-Asp-Asp-Phe-Ile)(SEQ ID NO：38)。
用4-硝基苯基-α-D-葡糖吡喃糖苷作为底物测定该基因产物的葡糖淀粉酶活性的pH及温度谱图(Elder，M.T.和Montgomery R.S.，Glucoamylase activity inindustrial enzyme preparations using colorimetric enzymatic method；Collaborativestudy Journal of AOAC International，vol.78(2)，1995)(图18)。
     实施例5-从木霉/肉座菌科簇的菌株中分离/克隆葡糖淀粉酶同源物
按照实施例1所述，分离以下菌株的染色体DNA制备物：(GA102)-柠檬黄肉座菌美国变种(Hypocrea citrina var. Americana)(CBS976.69)；(GA104)-葡酒红肉座菌(Hypocrea vinosa)(CBS960.68)；(GA105)-木霉属某种(Trichoderma sp)；(GA107)-胶样肉座菌(Hypocrea gelatinosa)(CBS254.62)；GA108-东方肉座菌(Hypocrea orientalis)(ATCC 90550)；(GA109)-Trichoderma konilangbra；(GA103)-哈茨木霉(Trichoderma harzianum)(CBS433.95)；(GA113)-木霉属某种(Trichodermasp.)；(GA 124)-长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)；(GA127)-Trichodermaasperellum(ATCC 28020)；和(GA128)-Trichoderma strictipilis(CBS 347.93)。如实施例1所述，使用TrGA基因特异性引物NSP231F(SEQ ID NO：23)和NSP232R(SEQID NO：24)，克隆全长GA基因。这些菌株的核苷酸序列在附图中公开，图4是GA102(SEQ ID NO：5)；图5是GA104(SEQ ID NO：7)；图6是GA105(SEQ ID NO：9)；图7是GA107(SEQ ID NO：11)；图8是GA108(SEQ ID NO：13)；图9是GA109(SEQ ID NO：15)；图10是GA113(SEQ ID NO：28)；图11是GA103(SEQ ID NO：30)；图12是GA124(SEQ ID NO：32)；图13是GA127(SEQ ID NO：34)；图14是GA128(SEQ ID NO：36)。图15中示出了相应的氨基酸序列。表2阐明了里氏木霉葡糖淀粉酶的成熟蛋白的氨基酸序列(图3B，SEQ ID NO：4)与来自肉座菌/木霉簇的葡糖淀粉酶同源物的同一性百分比。
表2-来自肉座菌/木霉簇(Hypocrea/Trichodrma cluster)的GA同源物的％同一性
  GA102   GA103   GA104   GA105   GA107   GA108   GA109   GA113   GA124   GA127   GA128 TrGA
  GA102 100 86 86 84 87 84 84 83 84 87 85 84
  GA103 100 98 90 96 90 91 86 90 98 90 90
  GA104 100 91 97 91 90 86 91 99 90 91
  GA105 100 90 95 93 83 94 91 94 95
  GA107   100   90   90   86   90   98   90   90
  GA108 100 94 84 98 91 94 97
  GA109 100 83 94 91 94 94
  GA113 100 84 86 83 84
  GA124 100 91 94 98
  GA127 100 91 91
  GA128 100 94
  TrGA   100
如实施例2所述获得过量表达GA的里氏木霉菌株。如实施例3所述获得粗制酶制剂，图19示出了针对某些同源物获得的凝胶。表3阐明了一些同源物的葡糖淀粉酶活性。
                              表3
  菌株   基因来源   总蛋白mg/mL   U GA/mL   比活
  GA104   葡酒红肉座菌   2.76   37   13
  GA105   木霉属某种   2.77   26   9
  GA107   胶样肉座菌   3.61   178   49
  GA109   T.konilangbra   2.22   10   5
  TrGA   里氏木霉   3.89   91   23
  宿主对照   里氏木霉   0.7   3   4
              实施例6-使用TrGA进行葡萄糖生产
用反向渗透水制备Cargill袋装淀粉32％DS浆液。将浆液的pH调至pH5.8。经100目网筛过滤浆液并按4.0AAU/g ds使用SPEZYMEETHYL(GenencorInternational，Inc.)。然后在107.3℃将浆液喷射5分钟(初步液化)。通过淀粉水解速率测定酶活性，反映为碘染色能力的下降速率。一个AAU单位的细菌α淀粉酶活性是在特定条件下每分钟水解10mg淀粉所需的酶量。初步液化后，收集液化物并放入95℃水浴中120分钟(二级液化)。在30、60、90和120分钟时取样，通过使用来自the Corn Refiners Association的标准Schoorls还原糖法检测DE。将液化物按100g的量分装入螺口罐中，将pH调至pH4.5并平衡至60℃ 15分钟，然后再给予制剂。将TrGA酶稀释，向罐中按0.22GAU/g ds加入0.2ml稀释的酶。给予制剂之后，将液化物分装入7个螺口管中，每一管装有大约10ml物质，并将管放回指定温度。在选定的时间间隔(18、24、30、42、50和55小时)取出管并通过HPLC碳水化合物***进行分析以确定糖组成：柱：Phenomenex Rezex碳水化合物(RCM-单糖)#00H-0130-KO(等效于Bio-Rad 87H)；柱温：70℃；流动相：纳米纯DI H2O；流速：0.8mL/分钟；检测器：RI；上样体积：10uL(3％DS物质)。
             表4-使用TrGA由玉米淀粉生产葡萄糖
  处理(小时)   ％DP1   ％DP2   ％DP3   ％DP＞3
  18   80.66   2.60   0.66   16.08
  24   84.25   2.31   0.46   12.98
  30   86.26   2.66   0.47   10.61
  42   88.85   3.05   0.40   7.69
  50   89.93   3.26   0.42   6.39
  55   90.64   3.36   0.37   5.62
       实施例7-在同步糖化发酵(SSF)法中使用TrGA进行乙醇生产
从本地乙醇制造商获得玉米醪液化物(corn mash liquefact)样品并用稀酒糟稀释至29％DS。将此浆液的pH用6N硫酸调至pH 4.3。将300g等份试样的醪放入31℃水浴中并使其恒温。将TrGA加入到样品中(0.4GAU/g ds，等同于1.08kg/MT ds)。加入酶以后，向每个样品中加入1ml Red Star Red酵母水溶液(Lesaffreyeast Corp.Milwaukee，WI)，所述水溶液为45ml DI水溶液含有15g酵母。在18、26、41和53小时取样并通过HPLC进行分析，柱：Phenomenex Rezex有机酸柱(RHM-单糖)#00H-0132-KO(等效于Bio-Rad 87H)；柱温：60℃；流动相：0.01NH2SO4；流速：0.6mL/分钟；检测器：RI；上样体积：20uL。
表5-在SSF方法中用TrGA(0.4GAU/g)生产乙醇
  样品(小时)   ％w/vDP＞3   ％w/vDP-3   ％w/vDP-2   ％w/vDP-1   ％w/v乳酸   ％w/v甘油   ％v/vEtOH
  18   6.38   0.61   3.42   2.69   0.31   0.97   7.44
  26   4.39   0.76   1.02   1.81   0.30   1.12   10.68
  41   1.62   0.47   0.35   0.77   0.31   1.27   13.65
  53   1.03   0.37   0.36   0.16   0.32   1.32   14.46
      实施例8-使用TrGA生产乙醇的非蒸煮(Non-cook)法
一般而言，用DI H2O制备33％的玉米粉浆液(Azure Standard Farms)，向其中加入400ppm脲。将pH调至4.5。发酵在装有100g醪的125ml烧瓶中进行，其中用各种GAU/g TrGA进行处理。用水制备20％的Fali干酵母浆，并将其在32℃水浴中混合1小时，然后通过加入0.2ml酵母浆接种发酵罐。将烧瓶放置于32℃水浴中并温和混合醪。在发酵过程中取样进行HPLC分析。72小时后终止发酵。包括糖类、乳酸、甘油和乙醇在内的化合物在各采样时段的产量表示在下面各表中。将醪在60℃干燥以获得DDGS，DDGS的淀粉含量通过双酶法(dual enzymemethod)来测定。
A.所有条件如上所述：处理包括1.2GAU/g TrGA。
表6-乙醇生产
                  ％w/v    ％w/v   ％w/v   ％w/v   ％w/v   ％w/v   ％v/v
处理    小时      DP＞3    DP-3    DP-2    DP-1    乳酸    甘油    EtOH
                                                 
TrGA    17        0.68     0.05    0.04    0.00    0.04    0.41    4.70
TrGA    24        0.67     0.06    0.05    0.02    0.04    0.42    5.44
TrGA    41        0.65     0.07    0.00    0.00    0.05    0.44    6.78
TrGA    48        0.59     0.08    0.08    0.00    0.07    0.43    7.77
TrGA    64        0.61     0.08    0.00    0.00    0.15    0.43    8.42
TrGA    72        0.60     0.08    0.07    0.01    0.17    0.43    8.59
B.所有条件如上所述：处理包括0.75GAU/g GA107和0.75GAU/g GA104
表7-乙醇生产
GA 小时   ％w/vDP＞3   ％w/vDP-3   ％w/vDP-2   ％w/vDP-1   ％w/v乳酸   ％w/v甘油   ％v/vEtOH
  1.11   0.10   0.29   1.06   0.00   0.15   0.00
  104   13   0.84   0.00   0.01   0.01   0.00   0.43   5.03
  107   13   0.77   0.00   0.00   0.00   0.00   0.42   4.16
  104   21   0.94   0.14   0.03   0.00   0.00   0.46   6.90
  107   21   0.88   0.10   0.03   0.01   0.00   0.43   5.24
  104   35   0.94   0.18   0.13   0.02   0.02   0.49   9.02
  107   35   0.87   0.11   0.02   0.01   0.04   0.44   6.53
  104   54   0.91   0.14   0.00   0.00   0.00   0.51   10.93
  107   54   0.89   0.13   0.00   0.00   0.30   0.45   7.58
  104   62   0.87   0.12   0.00   0.00   0.00   0.53   11.49
  107   62   0.88   0.14   0.00   0.00   0.39   0.46   7.74
  104   72   0.94   0.14   0.16   0.00   0.00   0.53   12.22
  107   72   0.88   0.14   0.05   0.01   0.42   0.47   7.82
C.所有条件如上所述：处理包括a)黑曲霉GA 0.75GAU/g+2.25SSU AkAA和b)TrGA 0.75 GAU/g+2.25 SSU AkAA。对于AnGA+AkAA处理，残留淀粉被测定为5.26％，对于TrGA+AkAA处理，残留淀粉被测定为8.71％。
对AkAA的α淀粉酶活性的测定是基于酶等份样品在pH 4.5、50℃水解可溶性马铃薯淀粉底物(4％ds)的程度。还原糖含量使用如在Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31：426-428中所述的DNS法来测量。一个单位的酶活(SSU，可溶性淀粉单位)等价于在特定温育条件下每分钟释放1mg葡萄糖的还原力。
表8-乙醇生产
                    ％w/v    ％w/v   ％w/v   ％w/v   ％w/v   ％w/v   ％v/v
处理         小时
                    DP＞3    DP-3    DP-2    DP-1    乳酸    甘油    EtOH
AnGA+AkAA    15     0.81     0.00    0.04    0.13    0.04    0.63    8.22
TrGA+AkAA    15     0.94     0.00    0.04    0.03    0.04    0.68    8.35
AnGA+AkAA    26.5   0.94     0.06    0.04    0.08    0.06    0.89    12.59
TrGA+AkAA    26.5   1.00     0.08    0.08    0.00    0.06    0.83    11.81
AnGA+AkAA    40     0.65     0.10    0.08    0.05    0.06    0.94    14.37
TrGA+AkAA    40     0.73     0.10    0.14    0.00    0.05    0.91    13.80
AnGA+AkAA    49     0.93     0.07    0.06    0.05    0.05    1.08    17.05
TrGA+AkAA    49     0.98     0.08    0.14    0.00    0.04    0.97    15.52
AnGA+AkAA    70     0.82     0.04    0.04    0.27    0.00    1.07    17.59
TrGA+AkAA    70     0.95     0.08    0.04    0.00    0.00    1.01    17.17
D.所有条件如上所述：处理包括a)TrGA 0.695GAU/g+2.25SSU AkAA和b)TrGA 0.695GAU/g+2.25SSU AKAA+2 ASPU/普鲁兰酶(Pullulanase)。一个酸稳定性支链淀粉酶单位(ASPU)被定义为在pH 4.5和60℃的温度从普鲁兰多糖(pullulan)每分钟释放一个当量还原能力(one equivalent reducing potential)例如葡萄糖所需的酶量。
表9-乙醇生产
               ％w/v  ％w/v  ％w/v  ％w/v  ％w/v  ％w/v  ％v/v   DDGS
处理     小时
               DP＞3  DP-3   DP-2   DP-1   乳酸   甘油   EtOH    ％淀粉
TrGA     15    0.92   0.05   0.05   0.04   0.03   0.60   7.69
TrGA+
普鲁兰   15    0.91   0.05   0.04   0.04   0.03   0.60   8.00
酶
TrGA     24    0.94   0.08   0.09   0.05   0.04   0.72   10.46
TrGA+
普鲁兰   24    0.91   0.12   0.10   0.05   0.04   0.73   10.93
酶
TrGA     41    0.91   0.10   0.17   0.05   0.04   0.86   13.89
TrGA+
普鲁兰   41    0.92   0.13   0.16   0.04   0.05   0.87   14.33
酶
TrGA     47    0.87   0.10   0.20   0.05   0.04   0.90   14.51
TrGA+
普鲁兰   47    0.94   0.13   0.19   0.04   0.03   0.91   15.32
酶
TrGA     70    0.92   0.11   0.06   0.03   0.00   0.98   17.27   18.5
TrGA+
普鲁兰   70    0.95   0.11   0.05   0.02   0.00   0.98   17.77   16.4
酶
E.所有条件如上所述：处理包括TrGA 0.695GAU/g和下列AkAA处理：
a)3SSU AkAA；b)10SSU AkAA和c)30SSU AkAA。
表10
处理          ％w/v   ％w/v  ％w/v  ％w/v  ％w/v  ％w/v  ％v/v   ％淀粉
        小时
(AkAA)        DP＞3   DP-3   DP-2   DP-1   乳酸   甘油   EtOH    DDGS
3SSU    17    0.77    0.05   0.00   0.00   0.04   0.59   8.31
10SSU   17    0.76    0.04   0.03   0.00   0.03   0.62   8.85
30SSU   17    0.78    0.04   0.05   0.00   0.03   0.06   9.54
3SSU    30    0.74    0.07   0.05   0.00   0.05   0.73   11.35
10SSU   30    0.78    0.06   0.05   0.00   0.05   0.81   12.62
30SSU   30    0.85    0.71   0.05   0.03   0.05   0.84   13.91
3SSU    41    0.70    0.08   0.02   0.02   0.05   0.90   13.96
10SSU   41    0.69    0.08   0.02   0.03   0.05   0.91   15.02
30SSU   41    0.68    0.07   0.03   0.07   0.05   0.92   15.83
3SSU    51    0.73    0.09   0.09   0.04   0.05   0.98   15.38
10SSU   51    0.74    0.09   0.05   0.05   0.04   0.99   16.57
30SSU   51    0.73    0.08   0.04   0.03   0.04   0.96   16.53
3SSU    70    0.70    0.09   0.02   0.02   0.02   1.04   17.09   15.8
10SSU   70    0.72    0.08   0.02   0.03   0.04   1.04   17.35   10.7
30SSU   70    0.71    0.08   0.02   0.07   0.03   1.01   17.42   9.6

Claims (29)

1.分离的DNA，其编码具有葡糖淀粉酶活性的酶，其中所述DNA的序列选自：
a)SEQ ID NO：1中示出的DNA序列；
b)SEQ ID NO：2中示出的DNA序列；
c)编码SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的DNA序列；
d)编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的DNA序列；
e)编码下述氨基酸序列的DNA序列，所述氨基酸序列由SEQ ID NO：4的氨基酸残基位置1至453和信号肽组成，或者由SEQ ID NO：3的氨基酸残基位置34至486和信号肽组成；或者
f)编码下述氨基酸序列的DNA序列，所述氨基酸序列由SEQ IDNO：4的氨基酸残基位置1至453组成，或者由SEQ ID NO：3的氨基酸残基位置34至486组成。
2.权利要求1所述的分离的DNA，其中所述酶来自里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株。
3.载体，包含权利要求1或2所述的DNA。
4.宿主细胞，由权利要3所述的载体转化。
5.权利要求4所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是从丝状真菌菌株获得。
6.权利要求5所述的宿主细胞，其中所述丝状真菌菌株是木霉。
7.权利要求6所述的宿主细胞，其中所述木霉是里氏木霉。
8.培养基，其来自于丝状真菌宿主细胞的发酵过程，所述丝状真菌宿主细胞用如权利要求1所述的DNA转化，其中所述培养基包含如权利要求1所述的分离的DNA所编码的具有葡糖淀粉酶活性的酶。
9.权利要求8所述的培养基，其中所述丝状真菌宿主细胞是木霉细胞。
10.分离的酶，其具有葡糖淀粉酶活性，且其中所述酶的氨基酸序列选自：
a)SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；
b)SEQ ID NO：4所示氨基酸序列；
c)由SEQ ID NO：4的氨基酸残基位置1至453组成的氨基酸序列；
d)由SEQ ID NO：3的氨基酸残基位置34至486组成的氨基酸序列；
e)由SEQ ID NO：4的氨基酸残基位置1至453和信号肽组成的氨基酸序列；或
f)由SEQ ID NO：3的氨基酸残基位置34至486和信号肽组成的氨基酸序列。
11.重组生产葡糖淀粉酶的方法，包括在丝状真菌宿主细胞中表达编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽的多核苷酸的步骤，其中所述多肽由权利要求10所述的氨基酸序列组成。
12.权利要求11所述的方法，其中所述多肽还包含信号肽。
13.权利要求12所述的方法，其中所述信号肽由SEQ ID NO：3的位置1至20所示的氨基酸序列组成。
14.权利要求11所述的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞是木霉细胞。
15.权利要求14所述的方法，其中所述的木霉宿主是里氏木霉。
16.权利要求11所述的方法，进一步包括回收所生产的葡糖淀粉酶。
17.酶组合物，其包含葡糖淀粉酶以及α淀粉酶，其中所述葡糖淀粉酶为权利要求10所述的酶。
18.权利要求17所述的酶组合物，其中所述组合物被用在烘焙用途中。
19.权利要求17所述的酶组合物，其中所述组合物是动物饲料组合物。
20.权利要求17所述的酶组合物，其中所述组合物被用在水解颗粒淀粉的过程中。
21.权利要求17所述的酶组合物，其中所述组合物是去污剂组合物。
22.权利要求17所述的酶组合物，进一步包括一种或多种其它的酶。
23.权利要求22所述的酶组合物，其中所述的一种或多种其它的酶选自葡糖淀粉酶、颗粒淀粉水解酶、蛋白酶、纤维素酶、支链淀粉酶以及它们的组合。
24.权利要求23所述的酶组合物，其中所述的其它的酶是颗粒淀粉水解酶。
25.权利要求23所述的酶组合物，其中所述的其它的酶是蛋白酶。
26.水解淀粉的方法，包括用权利要求10所述的酶处理含淀粉底物。
27.由含颗粒淀粉的底物生产发酵产物的方法，包括
a)将含颗粒淀粉的底物与葡糖淀粉酶在低于糊化温度的温度、在大约4至7.0的pH接触一段时间，以产生包含葡萄糖的组合物，其中所述葡糖淀粉酶为如权利要求10所述的酶，
b)将所述葡萄糖与发酵生物在合适的发酵条件下接触，以生产发酵产物。
28.权利要求27所述的方法，其中所述的发酵产物是乙醇。
29.糖化液化的淀粉的方法，包括用具有葡糖淀粉酶活性的多肽处理液化的淀粉，其中所述多肽的氨基酸序列由如权利要求10中所述的氨基酸序列组成，并获得包含至少80％葡萄糖的组合物。
CN200580040938.5A 2004-11-30 2005-10-07 里氏木霉葡糖淀粉酶及其同源物 Active CN101068922B (zh)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2004/040040 WO2005118800A1 (en) 2004-05-27 2004-11-30 Heterologous expression of an aspergillus kawachi acid-stable alpha amylase and applications in granular starch hydrolysis
USPCT/US2004/040040 2004-11-30
USPCT/US2004/041276 2004-12-09
PCT/US2004/041276 WO2005117953A1 (en) 2004-05-27 2004-12-09 Heterologous expression of an aspergillus kawachi acid-stable alpha amylase
US64792505P 2005-01-28 2005-01-28
US60/647,925 2005-01-28
USPCT/US2005/018212 2005-05-24
PCT/US2005/018214 WO2005117756A2 (en) 2004-05-27 2005-05-24 Acid-stable alpha amylases having granular starch hydrolyzing activity and enzyme compositions
PCT/US2005/018212 WO2005118795A2 (en) 2004-05-27 2005-05-24 Aspergillus kawachi acid-stable alpha amylase and applications in granular starch hydrolysis
USPCT/US2005/018214 2005-05-24
PCT/US2005/036307 WO2006060062A2 (en) 2004-11-30 2005-10-07 Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101068922A CN101068922A (zh) 2007-11-07
CN101068922B true CN101068922B (zh) 2015-06-03

Family

ID=36147080

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200580040938.5A Active CN101068922B (zh) 2004-11-30 2005-10-07 里氏木霉葡糖淀粉酶及其同源物
CN2005800406599A Expired - Fee Related CN101084308B (zh) 2004-11-30 2005-11-08 异源α淀粉酶在曲霉中的表达

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800406599A Expired - Fee Related CN101084308B (zh) 2004-11-30 2005-11-08 异源α淀粉酶在曲霉中的表达

Country Status (10)

Country Link
EP (2) EP1824970B1 (zh)
CN (2) CN101068922B (zh)
AT (1) ATE519842T1 (zh)
AU (1) AU2005310284B2 (zh)
CA (1) CA2589725C (zh)
DK (1) DK1824970T3 (zh)
ES (1) ES2370768T3 (zh)
PL (1) PL1824970T3 (zh)
RU (1) RU2394101C2 (zh)
WO (2) WO2006060062A2 (zh)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7498158B2 (en) 2001-05-15 2009-03-03 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
CN101268195A (zh) 2005-09-20 2008-09-17 诺维信北美公司 产生发酵产物的方法
WO2009048488A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-16 Danisco Us, Inc., Genencor Division Glucoamylase variants with altered properties
CN101522893B (zh) 2006-10-10 2014-07-09 丹尼斯科美国公司 具有改变性质的葡糖淀粉酶变体
EP2479267B1 (en) * 2006-12-21 2016-12-21 BASF Enzymes LLC Amylases and glucoamylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN101657537B (zh) 2007-03-14 2013-06-19 丹尼斯科美国公司 里氏木霉α-淀粉酶增强玉米淀粉的糖化
WO2009035500A1 (en) 2007-09-12 2009-03-19 Danisco Us Inc., Genencor Division Trichoderma promoter
US8592194B2 (en) * 2007-10-09 2013-11-26 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
EP2201108B1 (en) 2007-10-18 2014-10-08 Danisco US Inc. Enzyme blends for fermentation
ES2795989T3 (es) 2007-11-20 2020-11-25 Danisco Us Inc Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas
DK2268806T3 (da) 2008-02-11 2013-07-15 Danisco Us Inc Enzym med mikrobiel lyseaktivitet fra Trichoderma reesei
WO2009114403A1 (en) * 2008-03-11 2009-09-17 Danisco Us Inc., Genencor Division Use of rhizopus amylases in granular starch hydrolysis
CA2726630A1 (en) 2008-06-06 2009-12-10 Danisco Us Inc. Production of glucose from starch using alpha-amylases from bacillus subtilis
US9090887B2 (en) 2008-06-06 2015-07-28 Danisco Us Inc. Variant alpha-amylases from Bacillus subtilis and methods of use, thereof
CN102112618A (zh) 2008-06-06 2011-06-29 丹尼斯科美国公司 糖化酶组合物及其糖化方法
ES2527645T3 (es) 2008-06-06 2015-01-27 Danisco Us Inc. Variantes de alfa-amilasa de Geobacillus stearothermophilus (AMYS) con propiedades mejoradas
AU2010284963C1 (en) 2009-08-19 2014-11-27 Danisco Us Inc. Variants of glucoamylase
WO2011022465A1 (en) 2009-08-19 2011-02-24 Danisco Us Inc. Combinatorial variants of glucoamylase with improved specific activity and/or thermostability
WO2011039324A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Novozymes A/S Steamed bread preparation methods and steamed bread improving compositions
CN103038340A (zh) * 2010-04-12 2013-04-10 斯泰伦博什大学 生物燃料生产
AU2011263706B2 (en) 2010-06-11 2014-07-24 Novozymes A/S Enzymatic flour correction
EP2397491A1 (en) 2010-06-21 2011-12-21 Technische Universität Wien LeaA from Trichoderma reesei
WO2012019159A1 (en) * 2010-08-06 2012-02-09 Danisco Us Inc. Neutral ph saccharification and fermentation
EP3798303A1 (en) 2011-06-30 2021-03-31 Novozymes A/S Alpha-amylase-variants
MX2015002099A (es) 2012-08-22 2015-05-11 Dupont Nutrition Biosci Aps Variantes que tienen actividad glucoamilasa.
EP3712240B1 (en) 2014-02-07 2023-09-27 Novozymes A/S Compositions for producing glucose syrups
CN106591261A (zh) * 2015-10-14 2017-04-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种α淀粉酶及高产α淀粉酶的诱变菌株
WO2017112631A1 (en) * 2015-12-21 2017-06-29 Danisco Us Inc. Improved granular starch conversion enzymes and methods
CA3006992A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Novozymes A/S Processes for improving fermentation product yield using phospholipase c
CN110088287A (zh) 2016-10-17 2019-08-02 诺维信公司 在乙醇发酵过程中减少泡沫的方法
WO2019067287A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Dupont Nutrition Biosciences Aps BREWERY MASS PRODUCTION HAVING ENHANCED FERMENTESCIBLE SUGARS
CN112368393A (zh) 2018-07-11 2021-02-12 诺维信公司 用于生产发酵产物的方法
CN114032177B (zh) * 2021-03-04 2024-03-08 上海万力华生物科技有限公司 一种矩孢木霉及其土壤修复菌剂
WO2023225510A1 (en) * 2022-05-17 2023-11-23 Dupont Nutrition Biosciences Aps Feed additive comprising enzyme combinations

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5665585A (en) * 1992-09-03 1997-09-09 Alko-Yhiot Oy Recombinant production of glucoamylase P in trichoderma
WO2002046429A2 (en) * 2000-11-01 2002-06-13 Novozymes Biotech, Inc. Polypeptides having glucoamylase activity and nucleic acids encoding same
WO2003068976A2 (en) * 2002-02-14 2003-08-21 Novozymes A/S Process for producing starch hydrolysate

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5534046A (en) 1978-09-01 1980-03-10 Cpc International Inc Novel glucoamyrase having excellent heat resistance and production
US4794175A (en) 1983-12-20 1988-12-27 Cetus Corporation Glucoamylase CDNA
US4618579A (en) 1984-09-28 1986-10-21 Genencor, Inc. Raw starch saccharification
JPH0630586B2 (ja) 1984-12-15 1994-04-27 サントリー株式会社 グルコアミラ−ゼ遺伝子
US5024941A (en) 1985-12-18 1991-06-18 Biotechnica International, Inc. Expression and secretion vector for yeast containing a glucoamylase signal sequence
DE3854256T2 (de) 1987-06-06 1996-02-01 Omnigene Inc Expressionsvektor für hefe.
WO1992010581A1 (en) 1990-12-10 1992-06-25 Genencor International, Inc. IMPROVED SACCHARIFICATION OF CELLULOSE BY CLONING AND AMPLIFICATION OF THE β-GLUCOSIDASE GENE OF TRICHODERMA REESEI
US6255084B1 (en) 1997-11-26 2001-07-03 Novozymes A/S Thermostable glucoamylase
US6268328B1 (en) 1998-12-18 2001-07-31 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
US20040219649A1 (en) * 2003-03-10 2004-11-04 Novozymes A/S Alcohol product processes
MXPA06000212A (es) * 2003-06-25 2006-03-21 Novozymes As Enzimas para procesar almidon.
EP1641932B1 (en) * 2003-06-25 2011-05-25 Novozymes A/S Process for the hydrolysis of starch
ES2382333T3 (es) 2003-11-21 2012-06-07 Danisco Us Inc. Expresión de enzimas hidrolizantes de almidón granular en trichoderma y procedimiento para producir glucosa a partir de sustratos de almidón granular
US20080113418A1 (en) * 2004-01-16 2008-05-15 Novozymes A/S Processes for Producing a Fermantation Product
EP1749092A2 (en) * 2004-05-27 2007-02-07 Genencor International, Inc. Acid-stable alpha amylases having granular starch hydrolyzing activity and enzyme compositions
MXPA06013599A (es) * 2004-05-27 2007-03-15 Genencor Int Expresion heterologa de una alfa amilasa estable en condiciones acidas de aspergillus kawachi y aplicaciones en la hidrolisis del almidon granular.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5665585A (en) * 1992-09-03 1997-09-09 Alko-Yhiot Oy Recombinant production of glucoamylase P in trichoderma
WO2002046429A2 (en) * 2000-11-01 2002-06-13 Novozymes Biotech, Inc. Polypeptides having glucoamylase activity and nucleic acids encoding same
WO2003068976A2 (en) * 2002-02-14 2003-08-21 Novozymes A/S Process for producing starch hydrolysate

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Felipe S.et al.Elucidation of the Metabolic Fate of Glucose in theFilamentous Fungus Trichoderma reesei Using ExpressedSequence Tag (EST) Analysis and cDNA Microarrays.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY277 16.2002,277(16),13983-13988. *
Richard Fagerstrom.Purification and specificity of recombinant Hormoconis resinaeglucoamylase P and endogenous glucoamylase fromTrichoderma reesei.Enzyme Microb. Technol.16 1.1994,16(1),36-42. *

Also Published As

Publication number Publication date
ATE519842T1 (de) 2011-08-15
ES2370768T3 (es) 2011-12-22
WO2006060062A2 (en) 2006-06-08
PL1824970T3 (pl) 2012-01-31
AU2005310284A1 (en) 2006-06-08
CN101084308B (zh) 2013-06-19
EP1817412A2 (en) 2007-08-15
AU2005310284B2 (en) 2011-05-19
WO2006060126A2 (en) 2006-06-08
WO2006060062A3 (en) 2006-09-14
EP1824970A2 (en) 2007-08-29
CA2589725A1 (en) 2006-06-08
WO2006060126A3 (en) 2006-08-10
RU2007124552A (ru) 2009-01-10
DK1824970T3 (da) 2011-10-31
CN101068922A (zh) 2007-11-07
RU2394101C2 (ru) 2010-07-10
EP1824970B1 (en) 2011-08-10
CA2589725C (en) 2014-11-25
CN101084308A (zh) 2007-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101068922B (zh) 里氏木霉葡糖淀粉酶及其同源物
US7919299B2 (en) Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof
US8349601B2 (en) Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof
CN1875099B (zh) 颗粒淀粉水解酶在木霉菌中的表达和从颗粒淀粉底物产生葡萄糖的方法
CN1981037B (zh) 白曲霉酸稳定性α淀粉酶的异源表达和在颗粒淀粉水解中的应用
EP1848735B1 (en) Polypeptides having alpha-amylase and granular starch hydrolyzing activity
US7332319B2 (en) Heterologous alpha amylase expression in Aspergillus
CN102712915B (zh) 具有改良比活和/或热稳定性的葡糖淀粉酶的组合变体
AU2011205074B2 (en) Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof
CN1981038A (zh) 具有颗粒淀粉水解活性的酸稳定性α淀粉酶和酶组合物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant