JP5546870B2 - 1,2−プロパンジオールおよびアセトールの製造のための微生物および方法 - Google Patents
1,2−プロパンジオールおよびアセトールの製造のための微生物および方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、改変された微生物ならびに1,2−プロパンジオールおよび/またはアセトールの製造のためのその使用に関する。
大腸菌は天然に1,2−プロパンジオールとアセトールを産生する遺伝的能力を有する。1,2−プロパンジオールへの生合成経路は、解糖中間体ジヒドロキシアセトンリン酸から出発する。この代謝中間体は、mgsA遺伝子によりコードされているメチルグリオキサールシンターゼによってメチルグリオキサールへと変換され得る(Cooper, 1984, Totemeyer et al, 1998)。メチルグリオキサールは、DNA、RNAおよびタンパク質などの高分子の求核中心と反応し得る極めて有毒な求電子物質である。これは細菌の増殖を阻害し、極めて低濃度で細胞死をもたらし得る(0.3〜0.7mM)。このため、メチルグリオキサールの解毒のための既存の経路が検討されてきた(Ferguson et al, 1998)。3つの経路が細菌、特に大腸菌で同定されている。
・1つ目は、メチルグリオキサールをD−乳酸へ変換するグルタチオン依存性グリオキサラーゼI−II系(gloAおよびgloB遺伝子によりコードされている)
・2つ目は、メチルグリオキサールの、D−乳酸への変換を触媒するグルタチオン非依存性グリオキサラーゼIII酵素系
・3つ目は、メチルグリオキサールレダクターゼによるメチルグリオキサールの分解を含む。
より強レベルの発現は、遺伝子の天然プロモーターを、選択された微生物で強い遺伝子発現を誘導することが知られているプロモーターで置換することによって得ることができる。このようなプロモーターとしては、大腸菌では、例えば、プロモーターPtrc、Ptac、Plac、λプロモーターcIまたは当業者に知られているその他のプロモーターがある。他の微生物については、当業者がならば、使用可能なプロモーターを決定することができる。
・目的遺伝子を担持および発現する発現ベクターを導入すること
・遺伝子の付加的コピーをその微生物の染色体へ導入すること
による、メチルグリオキサール還元に関与する目的遺伝子の複数のコピーの、微生物への導入。
・その遺伝子への、この遺伝子の発現レベルまたはコードされているタンパク質の活性のレベルを低下させる突然変異の導入、
・その遺伝子の天然プロモーターの、より低い発現をもたらす強度の低いプロモーターでの置換、
・対応するメッセンジャーRNAまたはタンパク質を脱安定化するエレメントの使用、
・発現が全く必要でないならば、その遺伝子の欠失。
・メチルグリオキサールからのラクトイルグルタチオンの合成を触媒するグリオキサラーゼIをコードするgloA遺伝子、
・ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ((S)ラクトアルデヒドからの(S)乳酸の合成を触媒する)をコードするaldAおよびaldB遺伝子。
・グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を増強すること。好ましくは、gldA遺伝子の発現が増強される。
・好ましくはfucO遺伝子の発現を増強することにより、1,2−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を増強すること。
a)メチルグリオキサールの還元に関与するNADH依存性またはNADPH依存性酵素の精製方法:
メチルの還元に関与するNADH依存性またはNADPH依存性酵素を精製するために設計された全精製工程は5つの段階からなる。各段階で、標的酵素を酵素活性アッセイにより検出した。2つの酵素活性を測定した:1)NADPH依存性メチルグリオキサール還元、2)NADH依存性メチルグリオキサール還元。
1)厳密な嫌気性条件下または微好気性条件下のいずれかで行った大腸菌MG 1655 lpd*,ΔtpiA,ΔpflAB,ΔadhE,ldhA::km,ΔgloA,ΔaldA,ΔaldB,Δedd(株の構築については、WO2005/073364を参照)のケモスタット培養から微生物バイオマスを回収した。
2)これらの細胞を遠心分離により採取し、5mM DTTを含む50mM HEPESバッファーpH7.5で2回洗浄し、同じバッファーに再懸濁させた後、−20℃で保存した。
3)これらの細胞を音波処理により破砕した(0℃、嫌気性条件下、各サイクルの間にプロテアーゼ阻害剤の存在下での2分を挟んで、30秒4サイクル)。細胞残渣を遠心分離により除去し、細胞ホモジネート中に存在する核酸を硫酸ストレプトマイシン処理により沈殿させるか、酵素処理(ベンゾナーゼ)により加水分解した(表I)。
陰イオン交換クロマトグラフィー(pH7)と、その後の疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いた精製工程の結果、メチルグリオキサールを還元する2つのNADPH依存性酵素:yqhD遺伝子によりコードされているYQHD(42KDa)およびydhF遺伝子によりコードされているYDHF(33KDa)が同定された(図2)。第三の酵素も、NADH依存性およびNADPH依存性のメチルグリオキサール還元において活性があることが判明した(gldA遺伝子によりコードされているグリセロールデヒドロゲナーゼ)。
陰イオン交換クロマトグラフィー(pH7.5)を用いて設計された精製工程の結果、NADPH依存性のメチルグリオキサール還元を触媒するycdW遺伝子によりコードされているYCDWと呼ばれる36KDaタンパク質が同定された。
a)改変大腸菌株MG1655 lpd * ,ΔtpiA,ΔpflAB,ΔadhE,ldhA::km,ΔgloA,ΔaldA,ΔaldB,Δeddの構築
プロトコール1に従い、大腸菌株MG1655 lpd*,ΔtpiA,ΔpflAB,ΔadhE,ldhA::km,ΔgloA,ΔaldA,ΔaldB,Δedd::cmにおいてクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。
プロトコール1:耐性カセットの除去
クロラムフェニコールおよび/またはカナマイシン耐性カセットを以下の技術に従って除去した。クロラムフェニコールおよび/またはカナマイシン耐性カセットのFRT部位にFLPレコンビナーゼ作用を有するプラスミドpCP20をエレクトロポレーションによりこの株へ導入した。42℃で連続培養した後、これらの抗生物質耐性カセットの欠損を、表2に示されたオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析により確認した。
カナマイシン耐性カセットを除去するため、およびldhA遺伝子を不活性化するために、プロトコール2に従い、関連遺伝子の大部分を欠失したldhA遺伝子にクロラムフェニコール耐性カセットを挿入した。
プロトコール2:組換えのためのPCR産物の導入および組換え体の選択
遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択され、表3に示されたオリゴヌクレオチドを用い、プラスミドpKD3由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドpKD4由来のカナマイシン耐性カセットを増幅した(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000))。次に、得られたPCR産物を、そこで発現したλ Red(γβ,exo)系が相同組換えに極めて有利である、プラスミドpKD46を担持するレシピエント株にエレクトロポレーションにより導入した。その後、抗生物質耐性形質転換体を選択し、その耐性カセットの挿入を、表2に示された適切なオリゴヌクレオチドを用いた分析により確認した。
大腸菌株MG1655 lpd*,ΔtpiA,ΔpflAB,ΔadhE,ΔldhA::cm,ΔgloA,ΔaldA,ΔaldB,Δeddにおいて、プロトコール2に記載の技術を表3に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、yqhD遺伝子を不活性化した。
大腸菌株MG1655において、プロトコール2に記載の技術を表3に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることによりyafB遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌MG1655 ΔyafB::kmと命名した。
プロトコール3:遺伝子欠失のためのファージP1を用いた形質導入
レシピエント大腸菌における、その遺伝子を耐性カセット(カナマイシンまたはクロラムフェニコール)で置換することによる選択された遺伝子の欠失は、ファージP1を用いた形質導入技術によって行った。プロトコールは、(i)単一の遺伝子が欠失したMG1655株でのファージ溶解液の作製、および(ii)このファージ溶解液によるレシピエント株の形質導入の二段階であった。
・10mlのLB+Cm 30μg/ml+グルコース0.2%+CaCl2 5mMでの、単一の遺伝子が欠失したMG1655株の一晩培養物100μlを播種する。
・振盪しながら37℃で30分インキュベーション。
・野生株MG1655で作製したファージP1溶解液100μl(およそ1×109ファージ/ml)を加える。
・37℃で3時間、全ての細胞が溶解するまで振盪する。
・200μlのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける・
・4500gで10分の遠心分離を行い、細胞残渣を除去する。
・上清を無菌試験管に移し、200μlのクロロホルムを加える。
・この溶解液を4℃で保存する。
・LB培地中、大腸菌レシピエント株の一晩培養物5mlを1500gで10分遠心分離する。
・この細胞ペレットを2.5mlのMgSO4 10mM、CaCl2 5mM中に懸濁させる。
・対照試験管:細胞100μl
単一の遺伝子が欠失したMG1655株のファージP1 100μl
・試験管試験:細胞100μl+単一の遺伝子が欠失したMG1655株のファージP1 100 μl
・振盪せずに30℃で30分インキュベーション。
・各試験管に1Mクエン酸ナトリウム100μlを加え、ボルテックスにかける。
・1mlのLBを加える。
・振盪しながら37℃で1時間インキュベーション。
・試験管を7000rpmで3分遠心分離した後、ディッシュ上、LB+Cm30μg/mlでプレーティング。
・37℃で一晩インキュベーション。
大腸菌株MG1655 lpd*,ΔtpiA,ΔpflAB,ΔadhE,ΔldhA::cm,ΔgloA,ΔaldA,ΔaldB,Δeddにおいて、プロトコール2に記載の技術を表3に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ydhF遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌MG1655 lpd*,ΔtpiA,ΔpflAB,ΔadhE,ΔldhA::cm,ΔgloA,ΔaldA,ΔaldB,Δedd,ΔydhF::kmと命名した。
大腸菌株MG1655において、プロトコール2に記載の技術を表3に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ycdW遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌MG1655 ΔycdW::kmと命名した。
欠失ΔyqhD,ΔyafB,ΔydhFおよびΔycdWを有する4つの株をエルレンマイヤーフラスコ内、微好気性条件下、pH6.7のMPG培地中、37℃で培養した。
1,2−プロパンジオールの生産を高めるために、trcプロモーターを用い、遺伝子の種々の組合せをプラスミドpME101VB01から発現させた。
プラスミドpME101VB01はプラスミドpME101に由来し、希少な制限エンドヌクレアーゼNheI、SnaBI、PacI、BglII、AvrII、SacIIおよびAgeIに特異的な認識部位配列とその後にクロストリジウム・アセトブチリカムATCC824のadc転写ターミネーターを含む多重クローニング部位を担持している。
ccgacagtaagacgggtaagcctg
PME101R(配列番号56):
agcttagtaaagccctcgctag
catgggctagctacgtattaattaaagatctcctaggagctcaccggtTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAggcgcgcca
からなり、
pME101VB01 2は、100塩基(配列番号58):
agcttggcgcgccTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAaccggtgagctccctagagatctttaattaatacgtagctagcc
からなり、
・多重クローニング部位に対応する領域(下線の小文字)
・クロストリジウム・アセトブチリカムATCC 824pSOL1(NC_001988)のadc転写ターミネーター(配列179847〜179814)に相当する領域(大文字)を含む。
大腸菌MG1655株における天然gapAプロモーターの、合成ショートPtrc16プロモーター(配列番号69:gagctgttgacgattaatcatccggctcgaataatgtgtgg)での置換は、プロトコール2に記載の技術を表3に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、225pbの上流gapA配列をFRT−CmR−FRTおよび操作プロモーターで置換することにより行う。
ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC
からなり、
・ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の参照配列であるppsA遺伝子(1785136〜1782758)の配列(1785106〜1785136)と相同な領域(大文字)
・gapAプロモーター(1860794〜1860761)と相同な領域(小文字)
を含む。
2.ppsARは、43塩基(配列番号71):
aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC
からなり、
・ppsA遺伝子の領域(1785136〜1782758)の配列(1782758〜1782780)と相同な領域(小文字)
・制限部位HindIII(下線の文字)
を含む。
同時に、大腸菌gapA遺伝子のgapAプロモーター領域を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
1.gapA−ppsARは、65塩基(配列番号72):
GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg
からなり、
・ppsA遺伝子(1785136〜1782758)の配列(1785106〜1785136)と相同な領域(大文字)および
・gapAプロモーター(1860794〜1860761)と相同な領域(小文字)
を含む。
2.gapAFは、33塩基(配列番号73):
ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc
からなり、
・gapAプロモーター(1860639〜1860661)と相同な領域(小文字)
・制限部位SmaI(下線の文字)
を含む。
実施例4で記載したように得られた株(株1、2および3)および対照株(対照1:MG1655 pME101VB01−yqhD−mgsA−gldA、対照2:MG1655 pME101VB01−yafB−mgsA−gldA、対照3:MG1655 pME101YB01−yqhE−mgsA−gldAおよび対照4:MG1655 Ptrc16−gapA,Δedd−eda,ΔgloA,ΔpykA,ΔpykF)を、エルレンマイヤーフラスコ内、好気性条件下、炭素源としてグルコースを含む最小培地中で培養した。培養は34℃または37℃で行い、培養培地をMOPSで緩衝させることによりpHを維持した。培養の終了時に、発酵培養液中の1,2−プロパンジオール、アセトールおよび残留グルコースをHPLCにより分析し、グルコースに対する1,2−プロパンジオールおよびグルコースに対する1,2−プロパンジオール+アセトールを算出した。
Claims (14)
- 1,2−プロパンジオールを製造するための方法であって、
−大腸菌由来のyqhD遺伝子を過剰発現させることによるメチルグリオキサールレダクターゼ活性の増強、および
−Entner-Doudoroff経路に関与するedd遺伝子およびeda遺伝子の少なくとも1つの欠失
によって特徴づけられる、炭素源からの1,2−プロパンジオールの製造に有用な改変大腸菌が、炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、生成した1,2−プロパンジオールが回収される、方法。 - 前記改変大腸菌において、前記過剰発現が、メチルグリオキサール還元に関与するyqhD遺伝子の天然プロモーターを該遺伝子の強レベルの発現を誘導するプロモーターに置換することによって、またはメチルグリオキサール還元に関与するyqhD遺伝子の複数のコピーを大腸菌に導入することによって得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記改変大腸菌において、mgsA遺伝子の発現の増強によって、またはmgsA遺伝子に導入された特異的な突然変異によって、メチルグリオキサールシンターゼ活性が増強されている、請求項1または2に記載の方法。
- 前記改変大腸菌において、メチルグリオキサールから乳酸への変換に関与する次の遺伝子:gloA、aldA、aldBの少なくとも1つの発現が減弱されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変大腸菌において、乳酸、ギ酸またはエタノールの合成に関与する次の遺伝子:ldhA、pflA、pflB、adhEの少なくとも1つの発現が減弱されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変大腸菌において、酢酸の合成に関与する次の遺伝子:ackA、pta、poxBの少なくとも1つの発現が減弱されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変大腸菌において、gapA遺伝子の発現の減弱によって、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ活性が減弱されている、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変大腸菌において、ホスホエノールピルビン酸とは独立の糖移入系に関与し、かつ、galPおよびglkから選択される少なくとも1つの遺伝子の発現の増強によって、糖移入の効率が高められている、請求項7に記載の方法。
- 前記改変大腸菌において、糖ホスホトランスフェラーゼ系の効率が、代謝産物ホスホエノールピルビン酸のアベラビリティーを高めることによって増強されており、ここで、
−ピルビン酸キナーゼをコードするpykAおよびpykFから選択される少なくとも1つの遺伝子の発現が減弱されており、および/または
−ホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードするppsA遺伝子の発現が増強されている、請求項8に記載の方法。 - 前記改変大腸菌において、
−gldA遺伝子の発現の増強によってグリセロールデヒドロゲナーゼ活性が増強されており、および/または
−fucO遺伝子の発現の増強によって1,2−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性が増強されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記改変大腸菌において、遺伝子lpdが、アラニン55がバリンで置換される置換をもたらす点突然変異を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変大腸菌において、
−tpiA遺伝子の発現の減弱によってトリオースリン酸イソメラーゼ活性が減弱されており、および/または
−arcAおよびndhから選択される少なくとも1つの遺伝子の発現が減弱されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。 - 回収された1,2−プロパンジオールがさらに精製される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 炭素源からの1,2−プロパンジオールおよび/またはアセトールの製造に有用な改変大腸菌であって、
−大腸菌由来のyqhD遺伝子を過剰発現させることによるメチルグリオキサールレダクターゼ活性の増強、
−mgsA遺伝子の発現の増強によるメチルグリオキサールシンターゼ活性の増強、および
−Entner-Doudoroff経路に関与するedd遺伝子およびeda遺伝子の少なくとも1つの欠失
によって特徴づけられる、改変大腸菌。
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