MXPA03002278A - Modulacion de respuestas de la celula t mediadas por il-2 e il-15. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se basa, en parte, en los estudios de expresion de subunidades receptoras de IL-2 e IL-15 al ciclar las celulas T in vivo. En una modalidad, la invencion generalmente muestra nuevas combinaciones de antagonistas de IL-2 e IL-15 y metodos para suprimir la respuesta inmune al administrar estos antagonistas. En cada caso, la supresion se logra por la administracion de un primer agente que tiene como objetivo una molecula de IL-15 o un receptor de IL-15 (IL-15R) y un segundo agente que tiene como objetivo una molecula de IL-2 o un receptor de IL-2 (IL-2R). Mas generalmente, la invencion muestra nuevas combinaciones de agentes que, cuando se administran a un paciente (o a un transplante ex vivo), reducen el numero de celulas T reactivas al antigeno. Por ejemplo, la invencion muestra composiciones (por ejemplo, composiciones farmaceuticamente aceptables) que incluyen dos o mas agentes, cada uno de los cuales promueve la muerte de la celula T. Alternativamente, la composicion puede contener al menos un agente que promueve la muerte de la celula T y al menos un agente que inhibe la proliferacion de la celula T. El agente que promueve la muerta de la celula T puede promover AlCD (muerte de la celula inducida por activacion), muerte de la celula pasiva, ADCC (citotoxicidad mediada por la celula dependiente del anticuerpo) o CDC (citotoxicidad dirigida complemento).

Description

MODULACIÓN DE RESPUESTAS DE LA CÉLULA T MEDIADAS POR IL-2 E IL-15 Esta solicitud reclama el beneficio de U .S.S. N 60/232,251 , presentada el 14 de Septiembre de 2000.

CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere a inmunología, rechazo de transplante, y enfermedades asociadas con el sistema inmune.

INVESTIGACIÓN FEDERALMENTE PATROCINADA El trabajo descrito en la presente se soporta en parte por una garantía de los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno de los Estados Unidos puede, por lo tanto, tener ciertos derechos en la invención.

ANTECEDENTES Dos de las interleucínas, IL-2 e IL-15, son funcionalmente redundantes para estimular la proliferación de la célula T in vitro. Sin embargo, su papel en la activación inmune primaria y homeostasis primaria in vivo es mucho menos clara. In vivo, I L-2 e I L-1 5 pueden tener distintas funciones y regular distintos aspectos de la activación de la célula T. Por ejemplo, I L-2 puede activar por carga de inicio las células T para apóptosis (Lenardo, Nature, 353:858-861 . 1991 ), mientras que I L-15 puede soportar la supervivencia celular (Dooms et al., J Immunol. 161 :2141 -2150. 1998; Bulfone et al., Nature Medicine 3: 1 124-1 128, 1997). IL-15 también parece conducir la proliferación de células T tipo CD8+ de memoria In vivo mientras que I L-2 limita su expansión continua (Ku et al., Science 288:675-678, 2000). Además, el fenotipo de ratones deficientes en IL-2 es linfoproliferativo y autoinmune (Horak et al., Immunol. Rev. 148:35-44, 1995), mientras que los ratones deficientes en IL- 5 son de alguna manera linfofénicos e incapaces de montar una respuesta primaria a cambio viral (Kennedy et al. a, J. Exp. Meó. 191 :771 -780. 2000; Lodolce et al., Immunlty 9:669-676, 1998). La base molecular para esta dicotomía llamativa permanece enigmática. Los receptores funcionales para I L-2 e I L-15 consisten de una cadena privada, que define la especificidad de unión para IL-2 e IL-15, y cadenas p y ? del receptor de IL-2 compartidas. La cadena ? también es un componente de señalización crítica de los receptores de IIL-4, I L-7 e IL-9 (Sugamura et al., Ann. Rev. Immunol. 14: 179-205, 1996). En el compartimento linfoide, estas unidades receptoras pueden expresarse individualmente o en diversas combinaciones que resultan en la formación de receptores con diferentes afinidades y/o con distintas capacidades de señalización (Sugumara et al., supra). Por ejemplo, la cadena ß puede asociarse con ya sea la cadena a o la cadena ? para formar estructuras dimóricas, o con ambas, las cadenas a y ? para formar estructuras quiméricas. De manera similar, la cadena ? puede interactuar con la cadena ß y, a través de la cadena ß, con la cadena a de ya sea el receptor de IL-2 o el receptor de IL-15. La cadena a del receptor de IL-15, en contraste con la cadena a del receptor de I L-2, puede unirse a IL- 15 con un afinidad remarcablemente elevada (Giri et al., EMBO J. 14:3654-3663. 1995). Sin embargo, similar a la cadena del receptor de IL-2, no se cree que esta interacción active los eventos de señalización. De esta manera, la trimerización de las subunidades de cadena a, (3 y ? es esencial para la integridad funcional de receptores de afinidad elevada tanto para I L-2 como IL-15. Los estudios in vitro han mostrado que las células T activadas pueden expresar tanto cadena a del receptor de I L-2 como cadena a del receptor de IL-15 (Chae et al., J Immunol. 157:2813-2819. 1996) y las cadenas ß y ? se expresan constitutivamente por las células T activadas (Ishii et al., Int Immunol. 6: 1273-1277, 1994). Además, tanto I L-2 como I L-15 se detectan fácilmente durante la activación inmune in vivo (Li et al., J Immunol. 161:890-896, 1998). De esta manera, no está claro como las células T activadas distinguen entre IL-2, IL-15 y otras citoquinas dependientes de la cadena ? in vivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, en parte, en estudios de expresión de subunidades receptoras de IL-2 e IL-15 al ciclar las células T in vivo. Sorprendentemente, estas subunidades dirigen respuestas de la célula T activada a IL-2 o IL-15 en una manera selectiva y, así, regulan la respuesta de la célula T in vivo. En otras palabras (y contrario al conocimiento convencional de que IL-2 e IL-15 son redundantes), IL-2 e IL-15 realizan diferentes papeles para controlar la proliferación de la célula T in vivo. En particular, IL-15 es crítica para iniciar la división de la célula T, mientras que IL-2 controla la expansión de la célula T a través de la sub-regulación de expresión ye. De acuerdo con lo anterior, en una modalidad, la invención generalmente muestra nuevas combinaciones de antagonistas de IL-2 e I L-1 5 y métodos para suprimir la respuesta inmune al administrar estas antagonistas. En cada caso, la supresión se logra por administración de un primer agente que antagoniza una molécula de I L-1 5 o un receptor de I L- 15 (I L- 15R) y un segundo agente que antagoniza una molécula de I L-2 o un receptor de I L-2 (IL-2R). En modalidades alternativas, las composiciones de la invención pueden incluir (en lugar de, o además de, los agentes arriba descritos) , agentes que inhiben la expresión de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN o ARN) que codifican una interleucina (por ejemplo, I L-2 o I L- 1 5) o un receptor de interleuclna (por ejemplo, un receptor de I L-2 o I L- 1 5) . Más generalmente, la invención muestra nuevas combinaciones de agentes que, cuando se administran a un paciente, reducen el número de células T reactivas al antígeno. Por ejemplo, la invención muestra composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticamente aceptables) que incluyen dos o más agentes, cada uno de los cuales promueve la muerte de la célula T. Alternativamente, la composición puede contener al menos un agente que promueve la muerte de la célula T y al menos un agente que inhibe la proliferación de la célula T. El agente que promueve la muerte de la célula T puede promover AICD (muerte de la célula inducida por activación) , muerte de la célula pasiva , ADCC (citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo) o CDC (citotoxicidad dirigida complemento) . Agentes que promueven AICD incluyen I L-2 y moléculas relacionadas (por ejemplo, I L-2/Fc u otras moléculas que funcionan como agonistas de IL-2 o el receptor de I L-2 (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente al receptor I L-2 e imita la unión del ligando natural del receptor)). Otro agente que promueve AICD es el Ligando Fas (FasL) . Los agentes que promueven la muerte de la célula pasiva incluye agentes que antagonizan IL- 15 (al tener como objetivo, por ejemplo, la unión a, y así inhibir la actividad de , I L- 1 5, un receptor de I L- 1 5, o un componente de la trayectoria de señalización intracelular que se activa una vez que un receptor se une) o cualquier otro factor requerido para supervivencia de la célula T (por ejemplo, I L-4, I L-7, ligando OX-4, I FN-ß, 4- 1 BB o IGF-I). En modalidades alternativas, las composiciones de la invención pueden incluir (en lugar de, o en adición a, uno o más de los agentes arriba descritos) , agentes que inhiben la expresión de los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN o ARN) que codifican una interieucina (por ejemplo, IL-2 o I L-15) o un receptor de interieucina (por ejemplo, un receptor de I L-2 o I L- 15) . Uno puede promover ADCC o CDC al exponer una célula T a un agente que se une a la superficie de la célula T y contiene una porción Fe que activa ADCC o CDC. Más específicamente, los agentes que promueven ADCC o CDC incluyen proteínas de fusión que contienen una interieucina (por ejemplo, IL-2 o una I L-1 5 mutante) y una región Fe (por ejemplo, I L-2/Fc) así como también anticuerpos u otras proteínas que contienen Fe que se unen a un receptor de interieucina (por ejemplo, un receptor de I L-2 o IL- 1 5). Como se establece arriba, las composiciones de la invención pueden incluir no solamente un agente que promueve la muerte de la célula T, sino que también un agente que inhibe la proliferación de la célula T. Los agentes que inhiben la proliferación de la célula T incluyen ramapicina, mofetil micofenolato (MMF), azatioprina, y cualquier otro agente conocido y utilizado en la técnica para prevenir la proliferación celular (incluyendo agentes quimioterapéuticos). El uso de un agente que inhibe la proliferación de la célula T es particularmente útil en combinación con agentes que promueven AlCD y también estimulan la proliferación de la célula T (tal como IL-2/Fc). Por ejemplo, la invención muestra una composición farmacéuticamente aceptable que incluye I L-2/Fc (que, por ejemplo, promueve AlCD y lisis celular a través de ADCC o CDC), un antagonista de IL-15, un factor requerido para la supervivencia de la célula T) y rapamicina (que inhibe la proliferación de la célula T). Las composiciones que contienen otras combinaciones de agentes, se describen abajo. Notablemente, cuando dos o más agentes se emplean, no necesitan separarse físicamente uno del otro. Aunque un agente puede ser una entidad única que tiene principalmente una actividad funcional (por ejemplo, un anticuerpo que tiene como objetivo IL-2 o IL-15 al unir específicamente IL-2 o IL-15), también pueden ser una entidad única que tiene al menos dos actividades funcionales (por ejemplo, IL-2/Fc, mlL-15/Fc, o un anticuerpo anti-IL-2 o anti-IL- 5; en estas moléculas, la interleucina media AlCD y la porción Fe de la molécula medida CDC y ADCC). De esta manera, una composición que incluye (1 ) un agente que induce AlCD, (2) un agente que induce CDC, y (3) un agente que Inhibe la proliferación celular puede incluir solamente dos ingredientes activos (por ejemplo, (1 ) una molécula de IL-2/Fc, que induce AICD y CDC), y (2) rapamicina, que inhibe la proliferación celular). Las composiciones descritas en la presente son útiles para tratar pacientes que se beneficiarían de la supresión inmune (por ejemplo, un paciente que ha recibido, o se programa para recibir, un transplante; un paciente que tiene una enfermedad inmune, particularmente una enfermedad autoinmune; un paciente que tiene cáncer (por ejemplo, un cáncer del sistema inmune), o un paciente que padece de la enfermedad de injerto contra huésped (GVH D)). GVHD se caracteriza por una respuesta de leucocitos del donador contra antígenos en el receptor. Esta respuesta es particularmente problemática en transplantes de médula ósea, pero también ocurre en transplantes del órgano completo; leucocitos del donador residentes en órganos transplantados siempre se co-transplantan. Aunque las composiciones de la invención pueden contener más de un agente, los métodos de la invención no se limitan a aquellos en los cuales los agentes se administran simultáneamente. Por ejemplo, un paciente podría recibir una composición que contiene un antagonista de IL- 5 o un antagonista de I L-15R antes de recibir una composición que contiene un antagonista de IL-2 o un antagonista de IL-2R. De manera similar, un paciente podría recibir una composición que contiene rapamicina antes de recibir una composición que contiene un agonista de IL-2. Además, las composiciones de la invención (aplicadas simultánea o secuencialmente) pueden utilizarse para tratar un órgano o injerto celular antes de que implante en un paciente. Los agentes de la invención, y métodos para su uso se describen más abajo. Muchos de los agentes utilizados en el contexto de la presente invención tienen características terapéuticas ventajosas. Por ejemplo, los agentes que tienen como objetivo un IL-15R pueden ser proteínas de fusión que incluye un polipóptido de I L-15R muíante (ml l_-1 5) . Estos agentes, probablemente no son inmunogénicos debido a que la porción de IL-15 muíante de la proteína de fusión puede diferir del I L-15 tipo silvestre por solamente unos pocos residuos. Además, ya que los polipóptidos de mlL-15 pueden unir IL-15Ra con afinidad elevada, pueden competir efectivamente con IL-15 tipo silvestre para el receptor. Además, los agentes de la invención pueden activar componentes del sistema inmune huésped, tal como complemento y fagocitos, que median por último la eliminación de (o borrado de) células que llevan el receptor (por ejemplo, un receptor de IL-2) al cual se une el agente. Por ejemplo, los agentes de la invención pueden mediar la lisis o fagocitosis de células objetivo. A medida que la subunidad alfa del receptor de IL-15 (IL-15Ra) se expresa por células inmunes malignas o activadas, pero no al reposar las células inmunes, los agentes de la invención pueden utilizarse para tener como objetivo, específicamente, aquellas células que se han activado (por ejemplo, células T activadas por antígeno) o que se han vuelto malignas. De esta manera, aunque las células T representan un objetivo preferido para los agentes de la invención , las composiciones de la invención también pueden utilizarse para tener como objetivo los agentes de la invención, las composiciones de la invención también pueden utilizarse para tener como objetivo otras células incluidas en la patogénesis de desordenes inmunológicos, tales como otras células del sistema inmune o células de hiperproliferación de tejidos. Al menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto ordinario en la materia al cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan para referencia en su totalidad. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de los dibujos, la descripción detallada y reivindicaciones. Aunque los materiales y métodos similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o prueba de la invención, los materiales preferidos y métodos se describen abajo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una representación de una secuencia de ácidos nucleicos de IL- 5 tipo silvestre (SEQ ID NO: 1 ) y la secuencia de aminoácidos predicha (SEQ I D NO:2). La figura 2 es una representación de una secuencia de ácidos nucleicos de IL-15 muíante (SEQ I D NO:3) y la secuencia de aminoácidos predicha (SEQ ID NO:4). El codón tipo silvestre que codifica glutamina en la posición 149, CAG, y el codón tipo silvestre que codifica glutamina en la posición 156, CAA, ambos han cambiado a GAC, que codifica aspartato. (Estas posiciones (149 y 156) corresponden a las posiciones 101 y 108, respectivamente, en el polipéptido de I L-15 maduro, que carece de una secuencia de señal de 48 aminoácidos). La figura 3A es una seria de diagramas que representan la expresión de las cadenas a, ß y ye del receptor de IL-2, al dividir las células T en un bazo huésped 3 días después de la inyección intravenosa (i.v.) de células marcadas CFSE. Los datos representativos de seis experimentos se muestran. La figura 3B es una seria de diagramas que representa la expresión de las cadenas a, p y y del receptor de IL-2, al dividir las células T in vitro. Los linfocitos de las células marcadas CFSE se estimulan con anti-CD3 (2 µ?/G??) in vitro para tres dias. La división celular y la expresión de las subunidades receptoras de I L-2 se analizan por clasificación de la célula activada por fluorescencia (FACS). La figura 3C es una diagrama que representa la expresión de selectina L al dividir las células T in vivo. Las células se recolectan de nodos linf de los ratones huéspedes tres días después de la inyección intravenosa de células marcadas CFSE y coloreadas con mAb PE-anti-CD26L. El cuadrante se establece en base a las células coloreadas con mAb de control de isotipo. La figura 3D es una serie de diagramas que representan la expresión diferencial de la cadena a del receptor de IL-2 entre las células T de división in vivo. Las células marcadas CFSE se estimulan in vivo por tres días y las células en las segunda división celular se clasifica. Las células clasificadas se re-estimulan in vitro con anti-CD3 y anti-CD28 por tres días. La división celular y expresión de la cadena a del receptor de IL-2 se analizan por FACS. La figura 4A es una serie de diagramas que representan la expresión de la cadena a del receptor de I L-1 5 al dividir las células T in vivo tres días después de la inyección intravenosa de células marcadas CFSE. Las células se colorean con una proteína de fusión IL-15-FLAG, seguida por la coloración con mAb anti-FLAG y PE-estreptavidina. La coloración de la célula en la ausencia de I L- 15-FLAG se incluye como un control . La figura 4B es una gráfica de barras que representa la respuesta diferente de células T de división in vivo a I L-2 e I L- 15 in vitro. Los línfocitos marcados CFSE se estimulan in vivo por tres dfas y la división celular se analiza al examinar el perfil CFSE. Las células T en la segunda división celular se clasifican y las células (1 x104) se cultivan in vitro con IL-2 o IL-1 5 por dos dias. La proliferación celular se determina por toma 3H-TdR. Los resultados se presentan como CPM ± SD promedio de análisis triplicados. La figura 4C es un par de gráficas que representan el efecto del tratamiento anti-CD25 en la división de la célula T in vivo. A los ratones huésped se les da mAb anti-CD25 intraperitonealmente (i. p.) a 1 mg/día por tres dfas inmediatamente antes de la inyección intravenosa de células marcadas CFSE. Los ratones tratados con mAb de control de Isotipo (IgG 1 de rata) se incluyen como un control. La figura 5A es una serie de diagramas de flujo que representan coloración de IL-2 intracelular de células T de división in vivo. Las células marcadas CFSE se estimulan in vivo por tres dfas. Las células recolectadas del bazo huésped se estimulan in vitro con PPMA e ionomicina por cuatro horas en la presencia de GolgiStop™. Las células se fijan entonces, permeabilizan, y colorean para producción de I L-2. Las células coloreadas con mAb de control de isotipo se incluyen como un control . La figura 5B es un par de gráficas que representan expresión de yc por células T CD4+ de ratones deficientes en IL-2. Las células de bazo de ratones deficientes en I L-2 y ratones de control de tipo silvestre se colorean con mAb CD4 PE-anti-ratón y mAb yc del receptor de IL-2 de FITC-anti-ratón. La expresión de yc por células T CD4+ se analiza por FACS. La figura 5C es una serie de diagramas que representan el efecto de tratamiento anti-CD25 en expresión de yc al dividir las células T in vivo. A los ratones huésped se les da mAb anti-CD25 a 1 mg/día (i. p.) por tres días inmediatamente antes de la inyección intravenosa de células marcadas CFSE. La expresión de las cadenas ß y y del receptor de IL-2 en las células T de división in vivo se determina el día 3 (es decir, tres días después de la inyección de células marcadas CFSE). Los ratones tratados con mAb de control de isotipo (IgG 1 de rata) se incluyen como un control. La figura 5D es una serie de diagramas que representan la muerte de la célula apoptótica de células T de división in vivo. Las células marcadas CFSE se estimulan in vivo por tres días. Las células se recolectan del bazo huésped y colorean con PE-anexina V. La división celular y la muerte de la célula apóptica se analizan por FACS.

La figura 5E es una serie de diagramas que representan expresión de Bcl-2 intracelular al dividir las células T in vivo. Las células marcadas CFSE se estimulan in vivo por tres días. Las células recolectadas del bazo huésped se colorean con mAb de Bel-2 PE-anti-ratón o un mAb de control de isotipo. La división celular y expresión de Bcl-2 se analizan por FACS. La figura 6 es una gráfica de barras que representa los resultados de un experimento en el cual la muerte de la célula (valorada por la liberación del isotipo 6 Cr de las células CTLL-2, ver los ejes x) se valora después del tratamiento con varios agentes. NP40 es un detergente; IL-2/Fc es una proteína de fusión que contiene IL-2 y la región Fe de una molécula de IgG (esta molécula es lítica); C es complemento de rata; IL-2/FC-/- es una proteína de fusión que contiene IL-2 no lítica; y mlg es una inmunoglobulina de murino. Este estudio reporta la conclusión de que IL-2/Fc citolítica lisa las células CTLL-2 que llevan IL-2R,a pero no IL-2/Fc no lítica no lo hace. La figura 7 es una serie de histográficas. La intensidad de fluorescencia de FcRI en células de CHO (ovario de hámster Chino) se mide después de que las células se exponen a salina regulada por fosfato (PBS; izquierda superior), una inmunoglobulina de murino (mlgG2a; derecha superior), una molécula de IL-2/Fc no lítica (IL-2/Fc-/-; izquierda inferior), y una proteína de fusión que contiene I L-2 lítica (I L-2/Fc; derecha inferior). En cada histográfica, el número de células se diagrama contra la intensidad de fluorescencia de FcRI/CHO. Este estudio soporta la conclusión de que IL-2/Fc citolítica se une a FcRI, pero IL-2/Fc no lítica no lo hace. La figura 8 es una serle de ocho diagramas que representan la respuesta prolíferativa de células T in vivo CD4+ (lado a mano derecha) y CD8+ (lado a mano izquierda) . Las células se marcan con CFSE y estimulan in vivo por tres días con una molécula lítica (I L-2/Fc), un agente de proliferación de la célula (rapamicina (Rap)), o dos agentes combinados. Como un control negativo, un grupo de animales no se trata. IL-2/Fc se analiza por su perfil CFSE. Este estudio soporta la conclusión de que rapamicina inhibe la señalización prolíferativa de I L-2. La figura 9 es una serie de cuatro diagramas obtenidos de un experimento en el cual los linfocitos marcados CFSE se estimulan in vivo por tres días. La expresión de una cadena a de I L-2R en las células T de división se valora por FACS en animales que no reciben tratamiento (izquierda superior) , rapamicina sola (Rap; derecha superior), IL-2/Fc sola (izquierda inferior), o una combinación de rapamicina e I L-2/Fc (Rap + I L-2/Fc; derecha inferior) . Este estudio soporta la conclusión de que el tratamiento con rapamacina e I L-2/Fc promueve la expresión de la subunidad a de I L-2R durante la proliferación temprana in vivo de la célula T. La figura 1 0 es un par de diagramas obtenidos cuando los linfocitos marcados CFSE se estimulan in vivo por tres días y analizan por FACS. La expresión de Anexina V en las células de división T (CD4+) se valora en animales que no reciben tratamiento (panel a mano izquierda) o rapamicina e IL-2/Fc (Rap + IL-2/Fc; panel a mano derecha). Este estudio soporta la conclusión de que la rapamicina y el tratamiento con IL-2/Fc promueve apóptosis de las células CD4+ durante la proliferación temprana in vivo de la célula T. La figura 1 1 es una Tabla que muestra los resultados de los experimentos que examinaron la supervivencia del aloinjerto de isleta examinados en ratones diabéticos no obesos (NOD) autoinmunes. Los injertos se valoran en términos de función de aloinjerto primaria (los porcentajes mostrados en esta columna representan el porcentaje de ratones en los cuales el aloinjerto funcionó (la función se valora al monitorear los niveles de glucosa en la sangre)) y el tiempo de supervivencia promedio (MST) de los injertos de funcionamiento, n = "Tratamiento" (ver también la leyenda que acompaña la Tabla y la descripción de abajo). Los resultados presentados aquí soportan la conclusión de que el tratamiento con una combinación de rapamicina. I L-2/Fc y mlL-15/Fc resulta en supervivencia a largo plazo de aloinjertos de isleta. La figura 12 es una Tabla que muestra los resultados de los experimentos que examinaron la supervivencia de aloinjertos de piel en ratones NOD. Los injertos se valoran en términos del tiempo de supervivencia promedió (MST) de injertos de funcionamiento, n = el número de animales probados. Los tratamientos se indican bajo el encabezado de "Tratamiento" (ver también la leyenda que acompaña la Tabla y la descripción de abajo). Los resultados presentados aquí soportan la conclusión que el tratamiento con una combinación de rapamicina, IL-2/Fc e mlL-15/Fc resulta en supervivencia a largo plazo de aloinjertos de piel.

Figura 13 es una gráfica de líneas que representa el % de animales que permanecen libre de diabetes durante un tiempo después del tratamiento con una molécula de IL-2/Fc lítica, una inmunoglobulina de murino (mlg) y una molécula de IL-2/Fc no lítica. IL-2/Fc citolftica bloqueó la autoinmunidad, pero IL-2/Fc lítica no.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Una respuesta inmune comienza cuando un antígeno o mitógeno activa la activación de las células T. En el proceso de la activación de la célula, ocurren numerosos cambios celulares, que incluyen la expresión de citoquinas y receptores de citoquina. Una de las citoquinas incluidas en la respuesta inmune es ¡nterleucina-15 (IL-15), que es un factor de crecimiento de la célula T que estimula la proliferación y diferenciación de las células B, células T, células asesinas naturales (NK), y células asesinas activadas por linfocito (LAK) in vitro. In vivo, la proliferación de estos tipos de células aumenta la respuesta inmune. Otra citoquina incluida en la respuesta inmune, y descrita en la presente, es IL-2. Las composiciones de la presente invención incluyen agentes que tienen como objetivo I L-15, o su receptor, y IL-2 o su receptor, y métodos en los cuales aquellas composiciones se utilizan para suprimir una respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta inmune celular o humoral). Los pacientes se benefician de supresión de la respuesta inmune en un número de circunstancias, por ejemplo, en el caso de transplante de órgano o enfermedad inmune, particularmente enfermedad autoinmune, o la Enfermedad de Injerto Contra Huésped . En otras circunstancias, por ejemplo, cuando células inmunes selectas se vuelven malignas o autoagresivas, es benéfico destruirlas de manera activa. La presente invención se basa en el descubrimiento de nuevas maneras para inhibir la respuesta inmune. La inhibición puede lograrse al administrar una combinación de agentes, uno de los cuales tiene como objetivo I L- 1 5 o un I L-1 5R y uno de los cuales tiene como objetivo I L-2 o un I L-2R (modos de administración, incluyendo tratamiento ex vivo de injertos, se conocen en la materia y describen más abajo) . De manera más general, uno puede reducir el número de células T reactiva al antígeno al activar las trayectorias de señalización que conducen a la muerte de las células T activadas (por ejemplo, AICD), privación de las células de factores que se requieren para su supervivencia (células que mueren después de tal privación se dice que mueren por muerte de la célula pasiva) ; o el tener como objetivo células activadas por lísis por componentes del sistema inmune (células que mueren en esta manera se dice que se mueren por A DCC o CDC) . De acuerdo con lo anterior, las composiciones de la invención incluyen agentes que logran uno o más de estos fines (es decir, que promueven la muerte de la célula T a través de una trayectoria de muerte de la célula reconocida (por ejemplo, AICD, muerte de la célula pasiva, ADCC o CDC)). Además de contener uno o más agentes que promueven la muerte de la célula T, las composiciones de la invención pueden incluir uno o más agentes que inhiben la proliferación de la célula T (como ocurre, por ejemplo, en respuesta a un antígeno). Por ejemplo, la invención muestra una composición (por ejemplo, una composición farmacéuticamente aceptable o una formulada para su aplicación a un órgano o cultivo celular) que incluye IL-2/Fc (que, por ejemplo, promueve AICD y lisis celular a través de ADCC o CDC), ml L-15/Fc (que antagoniza IL-15 (y promueve así la muerte de la célula pasiva) y promueve la lisis celular a través de ACDD o CDC), y rapamicina (que inhibe la proliferación de la célula T). El término "agente" se entiende que comprende esencialmente cualquier tipo de molécula que puede utilizarse como un agente terapéutico. Las proteínas, tales como anticuerpos, proteínas de fusión y ligandos solubles, cualquiera de los cuales puede ser ya sea idéntico a una proteína tipo silvestre o contienen una mutación (es decir, una eliminación, adición, o substitución de uno o más residuos de aminoácidos), y las moléculas de ácido nucleico que las codifican (o que son "antisensibles" a ellas; por ejemplo, un oligonucleótido que es antisensible a los ácidos nucleicos que codifican I L-2, IL-15 o un componente (por ejemplo, una subunidad) de sus receptores), son todos "agentes". Los agentes de la invención pueden administrarse, ya sea, sístémicamente, localmente o a manera de terapias a base de célula (es decir, un agente de la invención puede administrarse a un paciente al administrar una célula que expresa el agente al paciente). La célula puede ser una célula administrada al paciente solamente para el propósito de expresar el agente terapéutico. La célula también puede ser una célula de un transplante celular, de tejido u órgano. Por ejemplo, las células transplantadas (por ejemplo, células de isleta) o células dentro de tejidos u órganos (por ejemplo, células dentro de un parche de piel o un hígado, riñón, o corazón) pueden tratarse con un agente o transducirse con una molécula de ácido nucleico que codifica un agente ex vivo (por ejemplo, antes del transplante) . De esta manera, la célula transplantada produce sus propios agentes inmunosupresores. Por ejemplo, una célula con un fenotipo deseable (por ejemplo, una célula que produce insulina) puede modificarse para incluir un gen que produce uno o más de los factores inmunosupresores de la invención. La célula transplantada, tejido u órgano pueden tratarse ya sea antes de o subsecuente al transplante. Los métodos para administrar agentes a pacientes (o a células u órganos en cultivo) se conocen y utilizan rutinariamente por aquellos de experiencia ordinaria en la materia y se tratan como se establece abajo). Agentes que tienen como objetivo I L-5 o un IL- 15R Las composiciones de la invención pueden incluir uno o más agentes que tienen como objetivo IL-1 5 o un receptor I L-15. Como se observa arriba, un solo agente puede tener múltiples dominios. Los agentes que tienen como objetivo I L- 1 5 o un I L- 15R incluyen agentes que se unen a (o de otra manera interactúan con) I L-15, un I L- 15R , o los ácidos nucleicos que los codifican así como también agentes que se unen a y subsecuentemente destruyen las células que llevan I L- 15R , tales como células T activadas. De esta manera, los agentes útiles para lograr supresión inmune pueden contener dos porciones funcionales: una porción objetivo que tiene como objetivo el agente para una célula que lleva I L-1 5R y una célula objetivo que elimina (por ejemplo, lítica) la porción que conduce a la eliminación de la célula que lleva I L- 15R. En una modalidad, la porción objetivo se une a un I L- 5R sin transducir de manera eficaz una señal a través del receptor. Por ejemplo, la porción objetivo puede incluir un polipóptído de IL-15 muíante, y una porción que elimina la célula objetivo puede incluir la región Fe de una molécula de inmunoglobulina. La región Fe puede derivarse de una IgG, tal como lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 de humano o unas IgGs de mamífero análogas o de una IgM, tal como IgM de humano o IgMs de mamífero análogas. En una modalidad preferida, la región Fe incluye la articulación, dominios CH2 y CH3 de IgG 1 de humano o lgG2a de murino. Aunque la invención no se limita a agentes que funcionan por cualquier mecanismo particular, se cree que la región Fe media la eliminación conducida por fagocito y complemento de células que llevan IL-15R. Los polipéptidos de IL-15R que unen el receptor de IL-15 con una afinidad similar al IL-15 de tipo silvestre, pero fallan para activar completamente la transducción de señal, se han producido. Estos polipéptidos mutantes compiten eficazmente con polipéptidos de IL-15 tipo silvestre y pueden inhibir uno o más de los casos que ocurren normalmente en respuesta a señalización de IL-15, tal como proliferación celular. El "polipéptido de IL-15 tipo silvestre" referido en la presente es un polipéptido que es idéntico a un IL-15 que ocurre de manera natural (por ejemplo, un polipéptido de IL-15 tipo silvestre se muestra en la figura 1). En contraste, un "polipéptido de IL-15 mutante" es un polipéptido que tiene al menos una mutación relativa al IL-15 tipo silvestre y que inhibe al menos una de las actividades in vivo o in vitro que se promueven usualmente por IL-15 tipo silvestre. Un polipéptido de IL-15 mutante puede utilizarse de acuerdo con la presente invención generalmente bloqueará al menos 40% , más preferentemente al menos 70%, y más preferentemente al menos 90% de una o más de las actividades de la molécula de IL- 15 tipo silvestre. La habilidad de un polipéptido de I L- 1 5 muíante para bloquear la actividad de IL-1 5 tipo silvestre puede valorarse por numerosos análisis, incluyendo el análisis de proliferación de la célula BA F-B03 descrito en la presente (en el cual, las células se transfectan con una construcción que codifica I L-2Rp). Además, los polipéptidos mutantes de la invención pueden definirse de acuerdo con el por ciento de identidad particular que muestran con I L-15 tipo silvestre. Cuando se examina el por ciento de identidad entre dos polipéptidos, la longitud de las secuencias comparadas generalmente será a menos 16 aminoácidos, preferentemente al menos 20 aminoácidos, más preferentemente al menos 25 aminoácidos, y más preferentemente al menos 35 aminoácidos. El término "identidad", como se utiliza en referencia al polipéptido o secuencias de ADN , se refiere a la identidad entre subunidades (residuos de aminoácidos de proteínas o nucleótidos de moléculas de ADN) dentro de las dos secuencias de ADN o polipéptidos que se comparan. Cuando una posición de subunidad en ambas moléculas se ocupa por la misma subunidad monomórica (es decir, el mismo nucleótído o residuo de aminoácido), entonces las moléculas son idénticas en esa posición. La similitud entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos es una función directa del número de posiciones idénticas. De esta manera, un polipéptido que es 50% idéntico a un polipóptido de referencia que es de 100 aminoácidos de largo puede ser un polipéptido de 50 aminoácidos que es completamente idéntico a una porción de 50 aminoácidos de largo del polipéptido de referencia. También puede ser un polipéptido de 100 aminoácidos de largo que es 50% idéntico al polipéptido de referencia arriba de su longitud total. Por supuesto, otros polipóptidos satisfacen los mismos criterios. La identidades típica y más convenientemente medida utilizando software de análisis de secuencias, tal como el Paquete de Software de Análisis de Secuencia del Genetics Computer Group en el Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin (1710 University Avenue, Madison, Wl 53705) , con los parámetros de falla del mismo. Un polipéptido de IL- 15 mutante de la invención puede ser al menos 65%, preferentemente al menos 80% , más preferentemente al menos 90% y más preferentemente al menos 95% (por ejemplo, 96%, 97%, 98% o 99%) idéntico al I L-1 5 tipo silvestre. La mutación puede consistir de un cambio en el número o contenido de residuos de aminoácido. Por ejemplo, el I L- 1 5 mutante puede tener un número mayor o menor de residuos de aminoácido que I L-1 5 tipo silvestre. Alternativamente, o además, el polipéptido mutante puede contener una substitución de uno o más residuos de aminoácido que están presentes en el IL-15 tipo silvestre. El polipéptido de IL- 1 5 mutante puede diferir del I L- 1 5 tipo silvestre por la adición, eliminación o substitución de un residuo de aminoácido único, por ejemplo, una adición, eliminación o substitución del residuo en la posición 156. De manera similar, el polipéptido mutante puede diferir del tipo silvestre por una adición , eliminación o substitución de dos residuos de aminoácidos, por ejemplo, los residuos en las posiciones 156 y 149. Por ejemplo, el polipéptido de I L- 15 mutante puede diferir del IL- 15 tipo silvestre por la substitución de aspartato para glutamina en los residuos 1 56 y 149 (como se muestra en la figura 2). Los polipéptidos mutantes útiles para agentes objetivo, como I L- 15 tipo silvestre, reconocen y se unen a un componente del IL- 15R. En una modalidad, la mutación de IL-1 5 se encuentra en el dominio terminal de carboxi de la citoquina, que se cree que une I L-2Ry (la subunidad receptora de I L-2) . Alternativamente, o en adición, los polipéptidos de IL- 15 mutantes pueden incluir una o más mutaciones dentro del dominio de unión I L-2Rp (la subunidad ß receptora de IL-2) . En el caso de que un polipéptido de IL- 1 5 mutante contiene una substitución de un residuo de aminoácido por otro, la substitución puede ser, pero no necesariamente, una substitución conservadora, que incluye una substitución dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina , valina, isoleucfna, leucfna; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina , treonina ; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. En lugar de utilizar, o además de utilizar, un polipéptido objetivo de I L- 15 (por ejemplo, un polipéptido de I L-1 5 mutante), el agente terapéutico puede ser un anticuerpo. Por ejemplo, IL-15 puede ser objetivo (es decir, unirse específicamente) con un anticuerpo. De manera similar, el IL- 15R puede ser objetivo con anticuerpos que unen un componente de la I L- 1 5R (por ejemplo, la subunidad a de I L- 15R). Los métodos mediante los cuales los anticuerpos, incluyendo anticuerpos humanizados, pueden generarse contra un componente de I L- 15R se conocen bien en la materia. Los anticuerpos preferentemente deben ser capaces de activar complementos y fagocitosis, por ejemplo, subclases de lgG3 e lgG 1 de humano (preferentemente) , o subclase de lgG2 de murlno. Los métodos de la invención también pueden llevarse a cabo con composiciones que contienen : (a) dos o más agentes, cada uno de los cuales promueve la muerte de la célula T o (b) al menos un agente que promueve la muerte de la célula T y al menos un agente que inhibe la proliferación de la célula T. El agente que promueve la muerte de la célula puede hacerlo al promover la muerte de la célula pasiva, que ocurre cuando una célula Tse priva de un factor requerido para su supervivencia. I L-1 5 es uno de tales agentes (otros se describen abajo) . De esta manera, los agentes que interfieren con la habilidad de I L-1 5 para servir como un factor de supervivencia (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a I L-1 5 o el receptor de I L- 15) puede incluirse en las composiciones de la invención (por ejemplo, una composición puede incluir una gente que promueve AICD, un agente que promueve la muerte de la célula pasiva (por ejemplo, un anticuerpo anti-I L-1 5), y, opcionalmente, un agente que inhibe la proliferación de la célula T. Como se describe arriba , los agentes útiles para lograr la supresión inmune pueden contener dos porciones funcionales: una porción objetivo que tiene como objetivo el agente para una célula que lleva IL-15R (tal como la molécula de I L-1 5 muíante apenas descrita) y una porción que elimina la célula objetivo que, por ejemplo, lisa o de otra manera conduce a la eliminación de la célula que lleva IL- 15R. De esta manera, el agente puede ser un polipéptido quimérico que incluye un polipéptido de IL- 1 5 mutante y un polipéptido heterólogo tal como la región Fe de las subclases de anticuerpos IgG e IgM. La región Fe puede incluir una mutación que inhibe la fijación complemento y la unión del receptor Fe, o puede eliminar la célula objetivo (es decir, capaces de destruir las células al unirse por complemento u otro mecanismo, tal como lisis complemento dependiente del anticuerpo). La región Fe puede aislarse de una fuente que ocurre de manera natural, recombinantemente producida, o sintetizada Gusto como cualquier polipóptido mostrado en la presente invención puede ser) . Por ejemplo, una región Fe que es homóloga al dominio terminal C de IgG puede producirse por digestión de IgG con papaína. Fe de IgG tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa. Los polipéptidos de la invención pueden incluir la región Fe completa, o una porción más pequeña que retiene la capacidad de lisar células. Además, las regiones Fe de longitud fragmentada o longitud completa pueden ser variantes de la molécula de tipo silvestre. Es decir, pueden contener mutaciones que pueden o no afectar la función del polipóptido. Se hace referencia en la presente a los agentes que "tienen como objetivo" una ínterleucina o un receptor de ínterleucina. El objetivo ocurre cuando un agente se une directa o indirectamente a, o de otra manera ¡nteractúa con , una ínterleucina o un receptor de ínterleucina en una manera que afecta la actividad de la ínterleucina o el receptor de ínterleucina . La actividad puede valorarse por aquellos de experiencia ordinaria en la materia y con métodos de laboratorio de rutina. Por ejemplo, uno puede valorar la intensidad de la transducción de señal u otro evento biológico aguas abajo que ocurre, o normalmente ocurriría, después de la unión del receptor. La actividad generada por un agente que tiene como objetivo una interleucina o un receptor de interleucina puede ser, pero no necesariamente, diferente de la actividad generada cuando una interleucina que ocurren de manera natura une un receptor de interleucina que ocurre de manera natural. Por ejemplo, un agente que tiene como objetivo un receptor de I L-2 cae dentro del alcance de la invención aún cuando ese agente genera substancialmente la misma actividad que ocurriría tiene el receptor unido por la IL-2 que ocurre naturalmente. Cuando un agente genera actividad que es substancialmente la misma como, o mayor que, la actividad generada por un ligado que ocurre naturalmente, el agente puede describirse como un agonista receptor (el agente y el ligando natural examinándose bajo las mismas condiciones). Cuando un agente genera la actividad que es menor que la actividad generada por un ligando que ocurre de manera natural, el agente puede describirse como un antagonista del receptor (si la interacción primaria del agente es con el receptor, por ejemplo, ml L-1 5) o la interleucina (si la interacción primaria del agente es con la interleucina, por ejemplo, un anticuerpo anti-I L-15) . De nuevo, los niveles de actividad se valoran al probar el agente y el receptor que ocurre de manera natural (o ligando) bajo las mismas condiciones. La región Fe que puede ser parte de los agentes de la invención puede "eliminar la célula objetivo" o "eliminar la célula no objetivo". Una región de Fe que elimina la célula no objetivo típicamente carece de sitio de unión del receptor Fe de afinidad elevada y un sitio de unión C'1 q. El sitio de unión del receptor Fe de afinidad elevada de Fe de IgG de murino incluye el residuo Leu en la posición 235 de Fe de IgG. De esta manera, el sitio de unión del receptor Fe de murino puede destruirse al mutar o eliminar Leu 235. Por ejemplo, la substitución de Glu por Leu 235 inhibe la habilidad de la región Fe para unir el receptor Fe de afinidad elevada. El sitio de unión C' 1 q de murino puede destruirse funcionalmente al mutar o eliminar residuos de Glu 318, Lys 320 y Lys 322 de IgG . Por ejemplo, la substitución de residuos Ala para residuos Glu 318, Lys 320 y Lys 322 vuelve a Fe de lgG1 incapaz de dirige la lisis complemento dependiente del anticuerpo. En contraste, una región Fe de IgG que elimina la célula objetivo tiene un sitio de unión del receptor de Fe de afinidad elevada y un sitio de unión C' 1 q. El sitio de unión del receptor de Fe de afinidad elevada incluye residuo Leu en la posición 235 de Fe de IgG, y el sitio de unión C' 1 q incluye los residuos Glu 318, Lys 320 y Lys 322 de IgG 1 . Fe de IgG que elimina la célula objetivo tiene residuos tipo silvestre o substituciones de aminoácidos conservadoras en estos sitios. Fe de IgG que elimina la célula objetivo puede tener como objetivo las células para citotoxícidad celular dependiente del anticuerpo o citolisis dirigida complemento (CDC) . Las mutaciones apropiadas para IgG de humano también se conocen (ver, por ejemplo, Morrison et al., The ¡mmunologist 2 : 1 19- 124, 1 994; y Brekke et al., The Immunologíst 2_ 125. 1994). Los agentes que tienen como objetivo el I L-1 5R pueden mutar los polipéptidos de IL- 15, opcionalmente fusionados a una etiqueta antigónica (por ejemplo, una secuencia FLAG) . Las secuencias FLAG se reconocen por anticuerpos anti-FLAG biotinilados, altamente específicos, como se describe en la presente (ver también Blanar et al., Science 256: 1014, 1992; LeClair et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA §9:8145, 1992). Además, la cadena a de IL- 15R soluble puede utilizarse como antagonista. Aunque el complejo receptor de I L- 5 consiste de subunidades a ß ?, la cadena a sola despliega una afinidad elevada para IL- 1 5. De esta manera, la cadena a de I L- 1 5R soluble unirá I L- 1 5 y evitará que I L- 1 5 se una a un complejo de I L-1 5R unido a la superficie celular. De esta manera, una cadena a de IL-15R soluble puede actuar como un antagonista específico del receptor. La construcción de cadena a de IL- 5 soluble incluye clonar el fragmento extracelular de la cadena a de IL-1 5R de las células positivas del receptor, tales como células T activadas o estirpes que expresan el receptor, y, opcionalmente, fusionarlo a una secuencia de etiqueta molecular. La secuencia de etiqueta puede ser, por ejemplo, FLAG, GST o Histidina. Esta construcción genética en un vector de expresión puede transfretarse en estirpes de expresión. La cadena a de I L-15 soluble marcada producida por estirpes de expresión se purificará utilizando mAbs específicos para la secuencia Tag. Además, un dominio extracelular IL- 15R puede enlazarse (por ejemplo, fusionarse a manera de un enlace de péptido) a un dominio Fe de inmunoglobulina (por ejemplo, articulación, dominios CH2 y CH3 de I nmunoglobulina G) , preferentemente de un subtipo IgG o IgM. Tal proteína fusión podría expresarse en un tipo celular adecuado, muchos de los cuales se conocen por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. Agentes que tienen como objetivo \ a-2 o un receptor de I L-2 Para inhibir una respuesta inmune, los agentes que tienen como objetivo células que llevan IL-1 5R, descritas arriba, pueden administrarse con un agente que tiene como objetivo IL-2 o un I L-2R. Un agente que se administra "con" otro puede, pero no necesariamente, administrarse al mismo tiempo o de la misma manera (aunque este comentario se establece en el contexto de una discusión de agentes relacionados con IL-2, es aplicable para cualquiera de los agentes o moléculas combinadas en las composiciones de la invención) . Por ejemplo, un agente que tiene como objetivo un IL-1 5R puede administrarse antes o después de un agente que tiene como objetivo un I L-2R . De manera similar, un agente que tiene como objetivo IL-15 o un IL-15R puede administrarse ex vivo (para tratar, por ejemplo, una célula, tejido u órgano que se extirpa para transplante) mientras que un agente que tiene como objetivo I L-2 o un I L-2R puede administrarse sistémicamente (por ejemplo, intravenosamente) a un paciente (por ejemplo, un paciente que ha recibido un transplante que se trata ex vivo con un agente que tiene como objetivo IL-15). De manera similar, uno puede administrar un agente que promueve AICD en un tiempo diferente o en una manera diferente que un agente que inhibe proliferación celular. De esta manera, en los métodos de la invención, cualquiera de los agentes o tipos de moléculas que se combinan en las composiciones de la invención pueden administrarse por separado. Para inhibir un IL-2R, uno puede administrar un agente que se une a y antagoniza I L-2 o un I L-2R. Los agentes que tienen como objetivo IL-2 o un IL-2R incluye agentes que se unen a IL-2 o un I L-2R así como también agentes que se unen a y subsecuentemente destruyen células que llevan I L-2R, tal como células T activadas. Como se describe arriba en el contexto de objetivo de IL- 15, los agentes útiles para lograr supresión inmune pueden contener una porción que tiene como objetivo el agente para una célula que lleva I L-2R y una porción que elimina la célula objetivo (por ejemplo, lítica) que conduce a la eliminación de la célula que lleva I L-2R . Por ejemplo, la porción objetivo puede unir un IL-2R sin transducir eficazmente una señal a través de ese receptor. En el caso de que una región Fe se incluya, esa región puede derivarse de las mismas moléculas de inmunoglobulina descritas arriba. Los agentes objetivo, tal como un agente IL-2/Fc (por ejemplo, ver Zheng et al., J. Immunol. 163:4041 -4048, 1999) puede administrarse con un agente que evita la señalización de I L-2R mediada por IL-2, tal como rapamicina. Los agentes que inhiben la proliferación celular se conocen bien por aquellos de experiencia ordinaria en la materia (y se tratan abajo). En lugar de utilizar, o además de utilizar, un polipéptido objetivo de IL-2R (por ejemplo, un polipéptido de IL-2), el agente terapéutico utilizado en combinación con un antagonista I L-15 puede ser un anticuerpo anti-I L-2 o un anti-IL-2R (por ejemplo, un anticuerpo humanizado) que antagoniza I L-2 o IL-2R, respectivamente. Como se explica arriba, los métodos de la invención (por ejemplo, métodos para inhibir una respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta inmune celular), métodos para inhibir rechazo del transplante, y métodos para tratar cáncer), también pueden llevarse a cabo con composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticamente aceptables) que contienen: (a) dos o más agentes, cada uno de los cuales promueven la muerte de la célula T o (b) al menos un agente que promueve la muerte de la célula T y al menos un agente que inhibe la proliferación de la célula T. El agente que promueve la muerte de la célula T puede hacerlo al promover AlCD (muerte de la célula inducida por activación), y tales agentes incluyen I L-2 y moléculas que funcionan como agonistas de IL-2. Por ejemplo, IL-2/Fc, mutantes de IL-2 que mantiene la habilidad para unir y transducir una señal a través del receptor de I L-2 , y anticuerpos que une específicamente y agonizan el receptor de IL-2 (por ejemplo, un anticuerpo que une específicamente la subunidad a del receptor de I L-2) puede incluirse en las composiciones de la invención . Otros agentes que promueven AlCD incluyen Ligando Fas (FasL), que estimula la muerte de la célula T al activar la cascada de transducción de señal Fas en células T activadas, y mutantes biológicamente activos de la misma. Agentes que promueven la muerte de la célula pasiva La muerte de la célula T pasiva ocurre cuando una célula T se priva de un agente que se requiere para su supervivencia. Además de I L-1 5, los factores que incluyen I L-4, I L-7, ligando OX-4, IFN-ß, 4-1 BB o IGF-I son esenciales (es decir, las células T mueren en la ausencia de cada uno de estos factores, ver, por ejemplo, Tu et al., J Immunol. 165: 1331 - 1336, 2000; Tsuda et al., J. Immunol. Meth. 236:37-51 , 2000; Bertolino et al., Int. Immunol 11: 1225-1238, 1999; Takahashi et ai, J. Immunol. 162:5037-5040, 1999; Pilling et al. , Eur. J. Immunol. 29: 1 041 - 1050, 1999; Chu et al. , J. Immunol 162: 1896- 1 903, 1999; y Weinberg et al., Semin. Immunol. 10:471 -480, 1998). Uno puede privar a las células T de uno o más de estos factores (I L- 15, I L-4, IL-7, etc)a\, por ejemplo, exponer las células in vivo o en cultivo, a agentes que se une selectivamente a uno o más de los factores o de otra manera evitan que interactúen con las células T como lo harían normalmente (el resultado de la privación siendo la muerte de la célula pasiva) . Agentes oue promueven ADCC o CDC A DCC y CDC pueden provocarse por agentes que se unen a la superficie de la célula T y que contienen una porción de Fe de una molécula de inmunoglobulina que activa ADCC o CDC. Ejemplos de tales agentes incluyen anticuerpos que se unen a las estructuras de superficie celular que se expresan en células inmunes activadas (por ejemplo, receptores de superficie celular tales como CD154, el receptor de I L-2 y el receptor de I L- 15) . Además, uno puede usar una proteína fusión quimérica de ligando/Fc, que se une a proteínas receptoras en la superficie de las células activadas (por ejemplo, una IL-2/Fc o una ml L-15/fc). Dado estos ejemplos, otros agentes adecuados serán aparentes para aquellos de experiencia ordinaria en la materia. Agentes que inhiben la proliferación celular Los agentes que inhiben la proliferación celular incluyen rapamicina (Sírolimus), micofenolato mofetil (MMF), azatioprina, y cualquiera de otros agentes que se sabe que son útiles para el tratamiento de desordenes hiperproliferativos (tal como cáncer). Las quimioterapéuticas bien caracterizadas incluyen agentes que inhiben metabolismo de ácido nucleico (tales como inhibidores de biosintésis de purina y pirimidina, inhibidores de síntesis de ARN , y agentes de unión de - - ADN, de modificación de ADN , o intercalación). Estos agentes son especialmente útiles cuando la composición utilizada para, por ejemplo, inhibir una respuesta inmune, también contiene un agente tal como I L-2/Fc, que no solamente promueve AICD sino que también estimula la proliferación de la célula T. Los agentes que inhibe la proliferación celular también incluyen antimetabolitos de ácido fólico tal como metotrexato (MTX) y pirimetamina; antimetabolitos de purina (tal como ß-mercaptopurina (6-MP) y azotioprina), y antagonistas de pirimidina tal como citarabina (ara-C), 5-azacitidina, y 5-fluorouracil (estas categorías se mencionan arriba); agentes de alquilación y otros que enlazan ADN (por ejemplo, ciclofosfamfda (CPA), mitomicina C, y Doxorubicina (Adriamicina)), alcaloides vinca (por ejemplo, vincristina) ; e inhibidores de calcineurina (por ejemplo, Ciclosporina A, FK506 y Brequinar). Otros agentes que pueden utilizarse para inhibir la proliferación celular incluyen agentes que interfieren directamente con proteínas incluidas en la regulación del ciclo celular (tales como anti-CDKs (Quinase de División Celular) o anti-ciclinas) o proteínas que afectan los puntos de verificación de la proliferación celular (todas las células de proliferación tienen puntos de verificación en diferentes etapas del ciclo celular que evitan que entre a la siguiente etapa del ciclo de división celular (CDC) antes de que concluyan la etapa previa). Las trayectorias que se alimentan en los controles del punto de verificación incluyen inhibidores de síntesis de proteína ADN , ARN y proteína (por ejemplo, inhibidores de quinasa S6 y quinasa PI-3). Los inhibidores de citoquinesis también pueden utilizarse. Procedimientos para seleccionar agentes que inhiben la respuesta inmune. Además de la prueba de un agente candidato (por ejemplo, un polipéptido de IL-2 o I L- 1 5 mutante) en los análisis in vitro descritos en los ejemplos de abajo, uno puede utilizar cualquiera de los siguientes análisis in vivo para probar que combinaciones particulares de los agentes descritos en la presente producen de manera más eficaz supresión inmune. Por ejemplo, uno puede probar uno o más de los agentes que tienen como objetivo I L- 1 5R en combinación con uno o más de los agentes que antagonizan IL-2 o su receptor. Estos análisis in vivo representan solamente algunas de las vías de rutina en las cuales alguien experto en la materia podría probar más la eficacia de los agentes de la invención. Se seleccionan para inclusión en la presente debido a que su relevancia a la variedad de condiciones clínicas listas para el tratamiento con agentes que tienen como objetivo IL-2 , I L- 15 y sus receptores. Por ejemplo, los análisis son relevantes para transplante de órgano, enfermedad inmune, particularmente enfermedad autoinmune, enfermedad de injerto contra huésped y cánceres del sistema inmune (por ejemplo, cánceres que se originan cuando las células T se vuelven malignas) . Paradigmas de transplante Para determinar si una combinación de agentes de la invención logra supresión inmune, la combinación puede administrase (ya sea directa, por terapia a base de gen , o por terapia a base de célula) en el contexto de paradigmas de transplante bien establecidos. Los agentes de la invención, moléculas de ácido nucleico que los codifican (o que se hibridizan con o las inhiben así), pueden administrarse sistómica o localmente por medios estándar a cualquier animal de laboratorio convencional, tal como una rata, ratón, conejo, conejillo de Indias, o perro, antes de un injerto de piel alogénico o xenogénico, transplante de órgano, o implantación celular se realiza en el animal. Las cepas de ratones tales como C57B 1- 10, B10. BR y B 10.AKAAM (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) , que tienen el mismo antecedente genético pero que no se acoplan para el lugar de H-2, se adecúan bien para valorar varios injertos de órgano. Transplante del corazón Un método para realizar injertos cardiacos por anastomosis del corazón donador a los vasos grandes en el abdomen del huésped se publica primero por Ono et al., (J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57:225, 1969, ver también Corry et al., Transplantation 16:343, 1 T73). Por medio de este procedimiento quirúrgico, la aorta de un corazón donador se anestesia a la aorta abdominal del huésped, y la arteria pulmonar del corazón donador se anestesia a la cava de la vena adyacente utilizando técnicas microvasculares estándar. Una vez que el corazón se injerta en su lugar y calienta a 37°C con solución de lactato de inger, se resume el ritmo del seno normal. La función del corazón transplantado puede valorarse frecuentemente por palpitación de contracciones ventriculares a través de la pared abdominal. El rechazo se define como el cese de contracciones miocardiales. Los agentes de la invención (por ejemplo, una combinación de IL-15/Fc mutante y un anticuerpo que se une a e inhibe IL-2 o IL-2R, o una combinación de una IL- 15/FC, I L-2/Fc y rapamicina) se consideraría eficaz para reducir el rechazo del órgano si los huéspedes que reciben estos agentes experimentan un periodo más largo de injerto del corazón donador que lo que lo hacen los huéspedes sin tratar. Injerto de Piel La efectividad de varias combinaciones de los agentes de la invención también puede valorarse después de un injerto de piel . Para realiza los injertos de piel en un roedor, un animal donador se anestesia y la piel de espesor total se remueve de una parte de la cola. El animal receptor también se anestesia, y un lecho de injerto se prepara al remover un parche de piel del lado rasurado. Generalmente, el parche es aproximadamente 0.5 x 0.5 cm. La piel del donador se forma para ajustarse al lecho de injerto, colocarse, cubrirse con gasa, y vendarse. Los injertos pueden inspeccionarse diario comenzando el sexto día después de la operación , y se consideran rechazados cuando más de la mitad del epitelio transplantado parece no ser viable. Los agentes de la invención (por ejemplo, una combinación de I L- 15/Fc muíante y un anticuerpo que se une a e inhibe IL-2 o I L-2R, o una combinación de un IL- 5/FC, I L-2/Fc, y rapamicina) se considerarían eficaces para reducir el rechazo de injerto de piel si los huéspedes que reciben estos agentes experimentan un periodo más largo de injerto de la piel donadora que lo que lo hacen los huéspedes sin tratar. Un ejemplo típico de un experimento de injerto de piel, los resultados de los cuales demuestran la utilidad de una composición que contiene IL-2/Fc, mlL- 1 5/Fc y rapamicina, se describe en los Ejemplos (abajo) y resumen en la figura 12. Modelo de Aloinierto de Isleta Los aloinjertos de célula de isleta DBA/2J pueden transplantarse en roedores, tales como ratones ?T AF1 de 6-8 semanas de edad vueltos diabéticos por una inyección intraperitoneal única de estreptozotocina (225 mg/kg; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Como un control, los injertos de célula de isleta singénica pueden transplantarse en ratones diabéticos. El transplante de la célula de isleta puede realizarse al seguir los procedimientos publicados (por ejemplo, ver Gotoh at al., Transplantation 42.:387, 1986). Brevemente, los páncreas donadores se perforan in situ con colagenasa tipo IV (2 mg/ml ; Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) . Después de un periodo de digestión de 40 minutos a 37eC, las isletas se aislan en un gradiente Ficoll discontinuo. Subsecuentemente, 300-400 isletas se transplantan bajo la cápsula renal de cada receptor. La función de aloinjerto puede seguirse por mediciones seriales de glucosa en la sangre (Accu-Check III™; Boehringer, Mannheim, Alemania). La función del injerto principal se define como un nivel de glucosa en la sangre bajo 1 1 . 1 mmol/l el día 3 después del transplante, y el rechazo del injerto se define como un aumento de glucosa en la sangre que excede 16.5 mmol/l (en cada uno de los 2 días sucesivos) después de un periodo de función del injerto principal. Modelos de enfermedades autoinmunes Los modelos de enfermedad autoinmune proporciona otros medios para valorar las combinaciones de los agentes de la invención in vivo. Estos modelos se conocen bien por aquellos de experiencia ordinaria en la materia y pueden utilizarse para determinar si una combinación dada de agentes, que incluye, por ejemplo, un agente que tiene como objetivo un IL-15R, sería terapéuticamente útil para tratar una enfermedad autoinmune específica cuando se suministra ya sea directamente, a través de terapia genética o a través de terapias a base de célula. Las enfermedades autoinmunes que se han modelado en animales incluyen enfermedades reumáticas, tal como artritis reumatoide y lupus sistémico eritematoso (SLE), diabetes tipo I , y enfermedades autoinmunes de la tiroides, intestinos, y sistema nervioso central. Por ejemplo, los modelos animales de SLE incluyen ratones MRL, ratones BXSB, ratones NZB y sus h íbridos Estos animales pueden cruzarse con objeto de estudiar aspectos particulares del proceso de enfermedad reumática; progenie de la cepa NZB desarrollan lupus glomerulonefritis severo cuando se cruza con ratones NZQ (Bielschowsky, et al., Proc. Univ. Otago Meó. Sch. 37:9, 1959, ver también Fundamental Immunology, Paul , Ed. , Raven Press, New York, NY 1989). De manera similar, un cambio a nefritis letal se observa en la progenie de parejas NBZ Z SWR (Data et al. , Nature 263:412. 1976). La apariencia histológica de lesiones renales en ratones SN Fi se ha caracterizado bien (Eastcott, et al., J. Immunol 121:2232, 1983; ver también Fundamental Immunologu, supra). Por lo tanto, la salud general del animal así como también la apariencia histológica del tejido renal pueden utilizarse para determinar si la administración de agentes que tienen como objetivo un IL-15R , y por ejemplo, tienen como objetivo el I L-2R , pueden suprimir eficazmente la respuesta inmune en un modelo animal de SLE. Una de las cepas MRL de ratones que desarrolla SLE, MRL-Ipr/lpr, también desarrolla una forma de artritis que se parece a la artritis , reumatoide en humanos (Theofilopoulos et al. , Adv. Immunol, 37:269, 1985). Alternativamente, una artritis experimental puede inducirse en roedores al inyectar colágeno tipo II a la rata (2 mg/ml) mezclado 1 : 1 en adyuvante completo de Freund (100 µ? total) en la base de la cola. La artritis se desarrolla 2-3 semanas después de la Inmunización. La habilidad de las moléculas de ácido nucleico que codifican los agentes de la invención (por ejemplo, agentes que tienen como objetivo IL-15R y agentes que tienen como objetivo IL-2R o que se unen a e inactivan las células T activadas por antígeno) para suprimir una respuesta inmune, puede valorarse al tener como objetivo las moléculas de ácido nucleico para linfocitos T. Una manera de tener como objetivo linfocitos T es como sigue. Las suspensiones de la célula de bazo se preparan 2-3 días después del inicio de artritis e incuban con colágeno (100 µg/ml) por 48 horas para inducir la proliferación de células T activadas por colágeno. Durante este tiempo, las células se transducen con un vector que codifica el agente de polipóptido de interés. Como un control , los cultivos paralelos se desarrollan pero no se transducen o, se transducen con un vector "vacío". Las células se inyectan intraperítonealmente (5 x 107 células/animal). La efectividad del tratamiento se valora al seguir los síntomas de la enfermedad durante las 2 semanas subsecuentes, como se describe por Chernajovsky et al., (Gene Therapy 2:731 -735, 1995). Menos síntomas, en comparación con el control, indican que los agentes combinados de la invención, y las moléculas de ácido nucleico que los codifican , funcionan como inmunosupresores y por lo tanto son útiles para el tratamiento de enfermedad inmune, particularmente enfermedad autoinmune. La habilidad de varias combinaciones de agentes para suprimir la respuesta inmune en el caso de diabetes tipo I puede probarse en la cepa de rata BB, que se desarrolla de una colonia comercial de ratas Wistar en los Laboratorios Bio-Breeding en Ottawa. Estas ratas desarrollan espontáneamente autoanticuerpos contra células de isleta e insulina , justo como ocurre con diabetes tipo I de humano. Alternativamente, los ratones NOD (diabéticos no obesos) pueden utilizarse como un sistema modelo. Un ejemplo típico de un experimento en el cual los niveles de azúcar en la sangre se restauran en ratones NOD siguiente el transplante de isletas donadores alogénicas se describe abajo y resumen en la figura 1 1 . Los animales se tratan con una combinación de IL-2/Fc, IL- 1 5/Fc y rapamicina. El resultado fue injerto a largo plazo. Las enfermedades autoinmunes de la tiroides se han modelado en el pollo. Los pollos de cepa obesos (OS) consistentemente desarrollan tiroides autoinmune espontánea que se parece a la enfermedad de Hashimoto (Colé et al. , Science 160: 1357, 1968). Aproximadamente 1 5% de estos pájaros producen autoanticuerpos a células parietales del estómago, justo como en la contraparte humana de tiroidftis autoinmune. Las manifestaciones de la enfermedad en pollos OS, que podría monitorearse en el curso de cualquier régimen de tratamiento, incluyen tamaño del cuerpo, depósito de grasa, lípidos de suero, sensibilidad al frío e infertilidad. Los modelos de enfermedad autoinmune en el sistema nervioso central (CHS) también pueden inducirse experlmentalmente. Una inflamación del CNS, que conduce a parálisis, puede inducirse por una inyección única de cerebro o tejido de la médula espinal con adyuvante en muchos animales de laboratorio diferentes, incluyendo roedores y primates. Este modelo, referido como encefalomielitis alérgica experimental (EAE) se media por la célula T. De manera similar, la miastenia gravis experlmentalmente inducida puede producirse por una sola inyección de receptor de acetilcolina con adyuvantes (Lennon et al. , Ann. N. Y. Aca . Sci. 274:283, 1976). Las enfermedades autoinmunes de los intestinos pueden modelarse en ratones "noqueados" con IL-2 o IL-10 o en ratones que reciben enemas que contienen albúmina de suero de bovino. Moléculas de ácido nucleico que codifican los agentes de la invención Los agentes de polipéptido de la invención, incluyendo aquellos que son proteínas de fusión (por ejemplo, moléculas de IL-2/Fc e IL- 15/Fc mutantes) no pueden obtenerse solamente por expresión de una molécula de ácido nucleico en un sistema de expresión procariótica o eucariótica ín vítro y purificación subsecuente del agente polipéptido, pero también pueden administrarse a un paciente por medio de un vector de expresión terapéutico de gen adecuado que codifica una molécula de ácido nucleico. Además un ácido nucleico puede introducirse en una célula de un injerto antes del transplante del injerto. De esta manera, las moléculas de ácido nucleico que codifican los agentes descritos arriba se encuentran dentro del alcance de la invención. Justo como los polipéptidos de la invención pueden describirse en términos de su identidad con polipéptidos tipo silvestre, las moléculas de ácido nucleico que los codifican necesariamente tendrán una cierta identidad con aquellos que codifican los polipéptidos tipo silvestre correspondientes. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL- 1 5 mutante puede ser al menos 65%, preferentemente al menos 75%, más preferentemente al menos 85% y más preferentemente al menos 95% (por ejemplo, 96%, 97%, 98% o 99%) idéntico al IL-15 de tipo silvestre que codifica el ácido nucleico. Para ácidos nucleicos, la longitud de la secuencias comparadas generalmente será al menos de 50 nucleótidos, preferentemente al menos 60 nucleótidos, más preferentemente al menos 75 nucleótidos, y más preferentemente 1 10 nucleótidos. Las moléculas de ácido nucleico que codifican los agentes de la invención pueden contener secuencias que ocurren naturalmente, o secuencias que difieren de aquellas que ocurren naturalmente, pero, debido a la degeneración del código genético, codifican el mismo polipéptido. Estas moléculas de ácido nucleico pueden consistir de ARN o ADN (por ejemplo, ADN genómico, cADN, o ADN sintético, tal como los producidos por síntesis a base de fosforamidita) o combinaciones o modificaciones de los nucleótidos dentro de estos tipos de ácidos nucleicos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden ser de doble filamento o de un solo filamento (es decir, ya sea un filamento sensible o antí-sensíble).

Las moléculas de ácido nucleico de la invención se refieren como "aisladas" debido a que se separan de ya sea la secuencia de codificación 5' o 3' con la cual se encuentran inmediatamente contiguas en el genoma que ocurre de manera natural de un organismo. De esta manera, las moléculas dé ácido nucleico no se limitan a secuencia que codifican polipéptidos, algunas o todas las secuencias de no codificación que yacen aguas arriba o aguas debajo de una secuencia de codificación también pueden incluirse. Aquellos de experiencia ordinaria en la materia de biología molecular son familiares con procedimientos de rutina para aislar moléculas de ácido nucleico. Pueden, por ejemplo, generarse por el tratamiento de ADN genómico con endonucleasas de restricción, o por desempeño de la reacción de cadena de polimerasa (PCR). En el caso de que la molécula de ácido nucleico sea un ácido ribonucléico (ARN), moléculas pueden producirse por transcripción in vitro. Las moléculas de ácido nucleico asiladas de la invención pueden incluir fragmentos no encontrados como tales en el estado natural. De esta manera, la invención comprende moléculas recombinantes, tales como aquellas en las cuales una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia que codifica IL-15 mutante) se incorpora en un vector (por ejemplo, un plásmido o vector viral) o en el genoma de una célula heteróloga (o el genoma de una célula homóloga, en una posición diferente a la ubicación cromosomal natural) . Como se describe arriba, agentes de la invención pueden ser proteínas de fusión. Además de, o en lugar de, los polipéptidos heterólogos descritos arriba, una molécula de ácido nucleico que codifica un agente de la invención puede contener secuencias que codifican un "marcador" o un "reportador*. Ejemplos de genes marcadores o reportadores incluyen ß-lactamasas, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), adenonisa deaminasa (ADA), aminoglucósido fosfotransferasa (neor, G418'), dihidrofolato reductasa (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa (H PH) , timidina quinasa (TK), lacZ (ß-galactosidasa) , y xantina guanuina fosforibosiltransferasa (XGPRT). Como con muchos de los procedimientos estándar asociados con la práctica de la invención , alguien experto en la materia estará ai pendiente de los reactivos útiles adicionales, por ejemplo, de secuencias adicionales que pueden servir para la función de un marcador o un reportador. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden obtenerse al introducir una mutación en un agente de la invención (por ejemplo, una molécula de IL- 5 o una molécula de IL-2) obtenido de cualquier célula biológica, tal como la célula de un mamífero, o producido por métodos de clonación de rutina. De esta manera, los ácidos nucleicos de la invención pueden ser aquellos de un ratón, rata, conejillo de Indias, vaca, oveja, caballo, puerco, conejo, mono, mandril, perro, o gato. Preferentemente, las moléculas de ácido nucleico será aquellas de un humano. Las moléculas de ácido nucleico descritas arriba pueden contenerse dentro de un vector que es capaz de dirigir su expresión en , por ejemplo, una célula que se ha transducido con el vector. De acuerdo con lo anterior, además de los agentes de polipéptido, los vectores de expresión que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica aquellos agentes y células transfectadas con aquellos vectores se encuentran entre las modalidades preferidas. Los vectores adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen vectores a base de T7 para utilizarse en bacterias (ver, por ejemplo, Rosenberg, et al., Gene 56: 125, 1 T87), el vector de expresión pMSXND para utilizarse en células de mamífero (Lee and Nathans, J. Biol. Chem. 263: 352 , 1 988) , sistemas de expresión de levadura, tal como Pichia pastoris (por ejemplo, la familia PICZ de los vectores de expresión de Invitrogen, Caralsbad, CA) y vectores derivados de baculovirus (por ejemplo, el vector de expresión pBacPAK9 de Clontech, Palo Alto, CA) para utilizarse en células de insecto. Las inserciones de ácido nucleico, que codifican el polípéptido de interés en tales vectores, pueden operativamente enlazarse a un promotor, que se selecciona en base a, por ejemplo, el tipo de célula en el cual la expresión se espera. Por ejemplo, un promotor T7 puede utilizarse en bacterias, un promotor de polihidrina puede utilizarse en células de insecto, y un promotor de metalotioneina o citomegalovirus puede utilizarse en células de mamífero. También, en el caso de eucariotas elevadas, los promotores específicos del tipo celular y específicos del tejido se encuentran ampliamente disponibles. Estos promotores se llaman así por su habilidad para dirigir la expresión de una molécula de ácido nucleico en un tipo celular o tejido dado dentro del cuerpo. Alguien de experiencia ordinaria en la materia estará al tanto de numerosos promotores y otros elementos reguladores que pueden utilizarse para dirigir la expresión de ácidos nucleicos. Además de las secuencias que facilitan la transcripción de la molécula de ácido nucleico insertada, los vectores que contienen origines de replicación, y otros genes que codifican un marcador seleccíonable. Por ejemplo, el gen de resistencia a nemocina {neo') imparte resistencia a G418 a las células en las cuales se expresa, y permite así la selección fenotípica de las células transfectadas. Otros genes marcados seleccionabas , factibles que permite la selección fenotípica de células incluyen varias proteínas fluorescentes, por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP) y variantes de la misma. Aquellos de experiencia en la materia pueden determinar fácilmente si un elemento regulador dado o marcador seleccíonable es adecuado para utilizarse en un contexto experimental particular. Los vectores virales que pueden utilizarse en la invención incluyen, por ejemplo, vectores retrovirales, adenovirales, y adeno-asociados, virus del herpes, virus del simio 40 (SV40) y vectores del virus de papiloma de bovino (ver, por ejemplo, Gluzma (Ed.) Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). Las células procariótícas o eucarióticas que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica un agente de la invención y expresan la proteína codificada en esa molécula de ácido nucleico in vitro también son características de la invención . Una célula de la invención es una célula transfectada, es decir, una célula en la cual una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipóptido de IL-15 muíante, se ha introducido por medio de técnicas de ADN recombinante. La progenie de tal célula también se considera dentro del alcance de la invención. Los componentes precisos del sistema de expresión no son críticos. Por ejemplo, un polipéptido de I L-15 muíante puede producirse en un huésped procarioótico, tal como E. coli de bacteria, o un huésped ecuariótico, tal como una célula de insecto (por ejemplo, células Sf21 ) o células de mamífero (por ejemplo, células COS, células CHO, células 293, células N IH 3T3, o células HeLa). Estas células se encuentran disponibles de muchas fuentes, incluyendo la Colección de Cultivo Tipo Americana (Manassas, VA) . Para seleccionar un sistema de expresión, solamente importa que los componentes sean compatibles entre sí. Alguien de experiencia ordinaria en la materia es capaz de hacer tal determinación. Además, sí se requiere guía para seleccionar un sistema de expresión, uno puede consultar Ausubel et al,, (Current Protocols in Molecular Biolog, John Wiley and Sons, New York, Y, 1993) y Pouweis et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 Suppl. 1987). Las células eucarióticas que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica el agente de la invención y expresan la proteína codificada en tal molécula de ácido nucleico in vivo también son características de la invención. Además, las células eucarióticas de la invención pueden ser células que son parte de un transplante celular, un transplante de órgano o tejido. Tales transplantes pueden comprender ya sea células primarias tomadas de un organismo donador o células que se cultivan, modifican y/o seleccionan in vítro antes del transplante a un organismo receptor (por ejemplo, estirpes eucarióticas, incluyendo células germinales o células progenitores). Ya que, después del transplante en un organismo receptor, la proliferación celular puede ocurrir, la progenie de tal célula también se considera dentro del alcance de la invención. Una célula , siendo parte de un transplante celular, de tejido u órgano, puede transfretarse con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de I L- 15 mutante y subsecuentemente transplantarse en el organismo receptor, en donde la expresión del polipéptido de I L- 1 5 ocurre. Además, tal célula puede contener una o más construcciones de ácido nucleico adicionales que permiten la aplicación de procedimientos de selección, por ejemplo, de tipos celulares o estirpes específicas antes del transplante en un organismo receptor. Los polipéptidos esperados pueden purificarse del sistema de expresión utilizando procedimientos bioquímicos de rutina , y pueden utilizarse como herramientas de diagnóstico o como agentes terapéuticos, como se describe abajo. Agentes que tienen como objetivo un IL-15R son útiles para hacer diagnósticos Los agentes que tienen como objetivo un IL- 15R pueden utilizarse para determinar si un paciente tiene una enfermedad (por ejemplo, una enfermedad inmune, particularmente enfermedad autoinmune) que está lista para su tratamiento con una combinación de los agentes descritos en la presente. El método de diagnóstico puede llevarse a cabo, por ejemplo, al obtener una muestra de tejido de un paciente que se sospecha que tiene una enfermedad inmune, particularmente enfermedad autoinmune o un cáncer que se manifiesta como células inmunes malignas y que expone ese tejido a un polipéptido antigénicamente marcado que tiene como objetivo un I L- 1 5R. La muestra puede ser cualquier muestra biológica, tal como una muestra de sangre, orina, suero o plasma. Además, la muestra puede ser una muestra de tejido (por ejemplo, tejido de biopsia) o una efusión obtenida de una articulación (por ejemplo, fluido sinovial) de la cavidad abdominal (por ejemplo, fluido de ascitos) , del pecho (fluido pleural) o del sistema nervioso central (por ejemplo, fluido cerebro espinal). La muestra también puede consistir de células cultivadas que se obtienen originalmente de un paciente (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica). La muestra puede obtenerse de un mamífero, tal como un paciente humano. Si la muestra contiene las células que se unen por el agente al cual se exponen, es altamente probable que se unirán por ese agente (por ejemplo, un agente que tiene como objetivo un IL- 15R) in vivo y podrían así inhibirse de proliferarse o destruirse in vivo. Los presentes síntomas de pacientes candidatos para tal prueba y los tejidos relevantes para tomar muestras dando un conjunto particular de síntomas se conocen bien por alguien de experiencia ordinaria en la materia. Pacientes Adecuados para el Tratamiento Las composiciones de la invención son útiles para inhibir las células T que se incluyen, o podría incluirse, en una respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta inmune celular) a un antígeno; para inhibir otras células incluidas en la patogénesis de desordenes inmunológicos (por ejemplo, monocitos, macrófagos, y otras células que presentan antígeno tales como células dendríticas, células N K, y granulocitos); y para destruir las células de híperproliferación (como se observa, por ejemplo, en tejidos incluidos en los desordenes inmunológicos tales como fibroblastos sinoviales (que se afectan en artritis reumatoide) queratfnocitos (que se afectan en psoriasis) o fibroblasos dérmicos (que se afectan en eritematosis lupus sistémica) . Dado estos ejemplos, otros tipos celulares que pueden ser usualmente objetivo serán aparentes para aquellos de experiencia ordinaria en la materia. Las células hiperproliferativas también pueden ser células cancerosas (por ejemplo, células T malignas) . De esta manera, las composiciones de la invención pueden utilizarse para tratar pacientes que padecen de una enfermedad inmune, particularmente enfermedad autoinmune, incluyendo pero no limitándose a las siguientes: (1 ) una enfermedad reumática tal como artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, síndrome de Sjógren, escleroderma, enfermedad de tejido conectivo, dermatomiositis, polimiositis, síndrome de Reiter o enfermedad de Behcet (2) diabetes tipo I o tipo II (3) una enfermedad autoinmune de la tiroides, tal como tiroiditis de Hashimoto o Enfermedad de Grave (4) una enfermedad autoinmune del sistema nervioso central , tal como esclerosis múltiple, miastenia gravis, o encefalomielitis (5) una variedad de fenfígus, tal como fenfigus vulgaris, fenfigus vegetans, fenfigus foliaceus, síndrome Senear-Usher, o fenfigus Brasileño, (6) enfermedades de la piel tal como psoriasis o neurodermítis y (7) enfermedad del intestino inflamatoria (por ejemplo, colitis ulcerativa o Enfermedad de Crohn 's). Las combinaciones de los agentes de la invención también pueden utilizarse para tratar síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). De manera similar, los métodos mediante los cuales estos agentes se administran pueden utilizarse para tratar a un paciente que ha recibido un transplante de material biológico o sintético, o una combinación de ambos. Tales transplantes pueden ser transplantes de órgano, tejido o célula, o injertos sintéticos sembrados con células, por ejemplo, injertos vasculares sintéticos sembrados con células vasculares. Además, los pacientes que padecen de GVH D o pacientes que han recibido una lesión vascular se beneficiarían de este método. Debido a que la invención comprende la administración de una forma que elimina la célula objetivo de un agente que tiene como objetivo el I L- 1 5R (o un receptor I L-2, o una combinación de I L- 15 o el I L- 15R e I L-2 o el IL-2R), es posible matar selectivamente células inmunes "destructoras del transplante" o autoreactivas sin destrucción masiva de las células T normales. De acuerdo con lo anterior, la invención muestra un método para matar células que expresan en I L- 15R in vivo, que incluye células malignas o células inmunes "destructoras del transplante" o autoreactivas. Estos métodos pueden llevarse a cabo al administrar a un paciente una combinación de agentes que incluye un agente que tiene como objetivo el IL-1 5R y que activa el sistema complemento, lisa las células por el mecanismo ADCC, o de otra manera mata las células que expresan el complejo del receptor de I L- 15 tipo silvestre. Este método puede utilizarse para tratar pacientes que tienen leucemia de IL-15R\ linfoma, u otras enfermedades malignas de IL- 15R+, tal como cáncer de colón. Formulaciones para uso y vías de administración Los métodos de la presente invención y las composiciones terapéuticas utilizadas para llevarlos a cabo contienen agentes "substancíalmente puros". Por ejemplo, en el caso en donde el agente es un polipéptído, el polípóptido es al menos 60% en peso (peso seco) del polipóptido de interés, por ejemplo, un polípóptido que une y destruye las células que llevan IL-15R. Preferentemente, los agentes (por ejemplo, los polipéptidos) son al menos 75% , más preferentemente al menos 90% , y más preferentemente al menos 99% en peso, del agente de interés. La pureza puede medirse por cualquier método estándar apropiado, por ejemplo, cromatografía de columna, electroforesis de gel de poliacrilamida, o análisis H PLC. Aunque los agentes útiles en los métodos de la presente invención pueden obtenerse de fuentes que ocurren de manera natural , pueden también sintetizarse o de otra manera fabricarse (por ejemplo, agentes que unen y destruyen células que llevan IL- 15R pueden producirse por expresión de una molécula de ácido nucleico recombinante). Los polipéptidos que se derivan de organismos eucarióticos o sintetizan en E, coli, u otras procariotas, y polipéptidos que se sintetizan químicamente se encontrarán substancíalmente libres de sus componentes naturalmente asociados. En el caso de que el polipóptido sea una quimera, puede codificarse por una molécula de ácido nucleico híbrida que contiene una secuencia que codifica toda o parte del agente (por ejemplo, una secuencia que codifica un polipóptido de IL- 15 mutante y la secuencia que codifica una región Fe de IgG). Los agentes de la invención (por ejemplo, polipéptidos) pueden fusionarse a una etiqueta de hexa-histidína para facilitar la purificación de proteína bacterialmente expresada, o a una etiqueta de hemaglutinina para facilitar la purificación de proteína expresada en células eucarióticas. Las técnicas que se requieren para hacer los agentes de la invención son rutina en la materia , y pueden realizarse sin exponerse a experimentación indebida por alguien de experiencia ordinaria en la materia. Por ejemplo, una mutación que consiste de una substitución de uno o más de los residuos de aminoácido en I L- 1 5 puede crearse utilizando la técnica de mutagénesis de PCR asistida descrita en la presente para la creación del polipéptido de I L-15 mutante en el cual los residuos de glutamina en las posiciones 149 y 1 56 se cambian a residuos de ácido aspártico. Las mutaciones que consisten de eliminaciones o adiciones de residuos de aminoácidos (para un polipéptido de IL- 15 o para cualquiera de otros polipéptidos útiles descritos en la presente, por ejemplo, polipéptidos que inhiben la coestimulación o que unen células T activadas) también pueden hacerse con técnicas recombinantes estándar. En aplicaciones terapéuticas, los agentes de la invención pueden administrarse con un vehículo fisiológicamente aceptable, tal como salina fisiológica. Las composiciones terapéuticas de la invención también pueden contener un vehículo o excipiente, muchos de los cuales se conocen por alguien de experiencia ordinaria en la materia. Los excipientes que pueden utilizarse incluyen reguladores (por ejemplo, regulador de citrato, regulador de fosfato, regulador de acetato, y regulador de bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (por ejemplo, albúmina de suero) , EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol . Los agentes de la invención pueden formularse en varias maneras, de acuerdo a la vía de administración correspondiente. Por ejemplo, las soluciones líquidas pueden hacerse por Ingestión o Inyección; geles o polvos pueden hacerse para ingestión, inhalación o aplicación tópica. Los métodos para hacer tales formulaciones se conocen bien y pueden encontrarse en, por ejemplo, " emington's Pharmaceuticals Sciences". Las vías de administración también se conocen bien por los médicos y farmacólogos expertos e incluyen administración intraperitoneal, intramuscular, subcutánea o intravenosa. Las vías adicionales incluyen administración intracranial (por ejemplo, intracisternal o intraventricular) , intraorbital, oftálmica, intracapsular, intraespinal, intraperitoneal, transmucosal, tópica, subcutánea y administración oral. Se espera que las vías intravenosa o intra-arterial sean preferidas para la administración de agentes que tienen como objetivo un receptor de I L- 15. La vía subcutánea también puede utilizarse de manera frecuente a medida que el tejido subcutáneo proporciona un ambiente estable para polipéptidos, de los cuales pueden liberarse lentamente. En caso de las terapias a base de célula (terapias de gen), las células/tejidos/órganos podría ya sea transfectarse por incubación, infusión o perfusión antes del transplante con una composición de ácido nucleico, de manera que la proteína terapéutica se expresa y subsecuentemente se libera por las células/tejidos/órganos transplantados dentro del organismo receptor. También, las células/tejídos/órganos podría experimentar un pretratamiento por perfusión o incubación simple con la proteína terapéutica antes del transplante con objeto de eliminar las células inmunes asociadas con el transplante adherentes a las cólulas/tejidos/órganos donadores (aunque esto es solamente un aspecto secundario, que probablemente no seria de relevancia clínica). En el caso de transplantes de célula , las células pueden administrarse ya sea por un procedimiento de implante o con un procedimiento de inyección mediado por catéter mediante liberación en la vasculatura, de la cual se distribuyen subsecuentemente por la corriente sanguínea y/o migran en el tejido circundante (esto se hace en el transplante de las células de isleta, en donde las células de isleta se liberan en la vena portal y subsecuentemente migran hacia el tejido del hígado) . Se sabe bien en materias médicas que las dosis para cualquier paciente dependen de diversos factores, incluyendo la salud en general, sexo, peso, área de superficie de cuerpo, y edad del paciente, así como también el compuesto particular a administrarse, el tiempo y la vía de administración, y otros fármacos que se administran concurrentemente. Las dosis del polipéptido de la invención variarán, pero, cuando se administren intravenosamente, pueden darse en dosis en el orden de magnitud de 1 microgramo a 10 mg/kg de peso de cuerpo o en el orden de magnitud de 0.01 mg/l a 100 mg/l de volumen de sangre. Una dosis puede administrarse una o más veces por días, si es necesario, y el tratamiento puede continuarse por períodos prolongados de tiempo. La determinación de la dosis correcta para una aplicación dada se encuentra bien dentro de las habilidades de un experto en la materia.

EJ EMPLOS Reactivos Los siguientes reactivos se utilizaron en los estudios descritos en la presente: IL-2 humano recombinante se obtuvo de Hoffman-La Roche (Nutley, NJ); rapamicina se obtuvo de Wyeth-Ayerst (Princeton , NJ) ; ciclosporina-A (CsA) se obtuvo de Sandoz (East Hanover, NJ); RP I-1640 y suero de becerro fetal (FCS) se obtuvo de BioWittaker (Walkersville, MD); penicilina, streptomicina, G418, y streptoavidin-RED670 se obtuvieron de Gibco-BRL (Gaithersburg, MD) ; dexametasona, PHA, lisozima, Nonidet P-40, NaCI, HEPES, y PMSF se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO) ; Ficoll-Hypaque se obtuvo de Pharmacia Biotech (Uppsala , Suecia); IL-15 humano recombinante y Ab de IL-15 anti-recombinante se obtuvieron de PeproTech (Rocky Hill, NJ) ; Ab anti-FLAG y perlas de afinidad de anti-FLAG se obtuvieron de International Biotechnologies, Inc. (Kodak, New Haven, CT); pRcCMV se obtuvo de InVitrogen Corporation (San Diego, CA); genisteina se obtuvo de ICN Biomedicals (Irvlne, CA); suberato de disuccinimidilo (DSS) se obtuvo de Pierce (Rockford, IL) ; endonucleasas de restricción se obtuvieron de New England Biolabs (Beverly, MA); [3H]TdR se obtuvo de New England Nuclear (Boston, MA); y anticuerpos conjugados de tinte fluorescente CD25-PE3, CD14-PE, CD16-PE, C D122-PE, CD4-FITC, CD8-FITC, lgG 1 -PE o lgG 1 -FITC se obtuvieron de Beckton/Dickinson (San José, CA). El péptido FLAG se sintetizó en la Facilidad de Síntesis de Péptido en la Escuela Módica de Harvard. Producción de Protefna de Fusión FLAG-HMK-IL15 Para estudiar el modelo celular de expresión de receptor de IL-15 humano, se construyó un plásmido que podría utilizarse para expresar una proteína de fusión I L-15. El plásmido codifica un polipéptido I L- 15 que tiene una terminal N covalentemente unida a la secuencia FLAG-HMK de 18 aminoácidos (FLAG-HMK-IL-15). Las secuencias FLAG se reconocen por anticuerpos anti-FLAG altamente específicos, biotinilados , (Blanar et al. , Science 256: 1014. 1992); LeClair et al. , Proc, Nati. Acad. Sci. USA 89_:8145, 1992) mientras que las secuencias H K (sitio de reconocimiento de Quínasa de Músculo de Corazón) permiten la introducción de marca radioactiva [32P] en la molécula (Blanar et al, , supra, LeClair et al., supra). Para la construcción del plásmido FLAG-HMK-IL-15, un fragmento de cADN de 322 bp que codifica la proteína de I L-15 madura se amplificó por PCR que utiliza olígonucleótidos sintéticos [sentido 5'-GGAATTCAACTGGGTGAATGTAATA-3' (SEQ ID NO: 5; sitio EcoRI (subrayado) más las bases 145- 162); antisentido 5'-CGGGATCCTCAAGAAGTGTTGATGAA-3' (SEQ ID NO: 5; sitio BamHI [subrayado] más las bases 472-489)]. El ADN templado se obtuvo de PBMCs humanos activados por PHA. El producto de PCR se purificó, se ingirió con EcoRI y BamHI, y se clonó en el plásmido pAR(DRI)59/60 ingerido con EcoRI-BamHI según se describe (Blanar et al. , Science 256: 1014, 1992; LeClair et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:8145, 1992). El elemento principal del plásmido pAR(DRI)59/60 contiene en estructura secuencias que codifican las secuencias de péptido de reconocimiento de FLAG y HMK (Blanar et al. , Science 256: 1014. 1992; LeClair et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89_:8145, 1992). Expresión v Purificación de la Proteína de Fusión FLAG-HMK-I L-15 La construcción de fusión relacionada a IL-15, FLAG-HMK-IL- 1 5, se expresó en cepa E. coli BL-21 y afinidad purificada con perlas revestidas de anti-FLAG según se describe (Blanar et al. , Science 256: 1014, 1 992; LeClair et al. , Proc. Nati. Acad. Sel. USA 89:8145, 1992) . La proteína de fusión se eluyó de las columnas de afinidad después del lavado extensivo con 0. 1 M de glicina (pH 3.0). El eluato que contiene FLAG-HMK-IL-15 se dializó contra un regulador que contiene 50 mM de Tris (pH 7.4) y 0.1 M de NaCI por 18 horas a 4eC, se filtró a través de 0.2 µp? de membrana, y se almacenó a -20°C. FLAG-HMK-IL- 1 5 une la subunidad IL-1 5 a La proteína de fusión FLAG-HMK-IL-1 5 purificada se probó para determinar si interactúa con los receptores de I L- 15 de superficie de célula. Según se describe anteriormente, [32P]-FLAG-HMK-IL-15 se agregó a los cultivos de PBMCs que se activaron por un mitogen , PHA . A fin de unir permanentemente las proteínas interactivas a otras, se agregó suberato de disuccinimidilo de degradador químico (DSS). Las células se lavaron, se destruyeron por lisínas, se centrifugaron, y las proteínas solubles en detergente se separaron por SDS-PAG E. La autoradiograffa de proteínas separadas de SDS-PAGE revelaron una banda de 75-80 kDa correspondiente al peso molecular combinado de FLAG-HMK-IL-1 5 (15 kDa) y la subunidad de IL- 15Ra humano (60-65 kDa). La identidad de esta banda como la subunidad de IL-15R se confirmó al degradar los experimentos conducidos en la presencia de un exceso molar de h l L-1 5. Bajo estas condiciones, fallamos en detectar la banda de 15 kDa marcada por radio. De esta manera , la confirmación de las proteínas de fusión [32P]-FLAG-HMK-IL-15 permite la unión específica de sitio a la subunidad de IL- 15Ra de 60-65 kDa sobre la superficie de PBMCs activados por mitogen. FLAG-HMK-IL-15 es un Factor de Crecimiento Biológicamente Activo que Requiere la Expresión de I L-2RB. En la siguiente serie experimentos, la proteína de fusión FLAG-HMK-IL-15 se probó para determinar si podría funcionar como un factor de crecimiento biológicamente activo. Los PBMCs humanos activados de PHA proliferan en respuesta a ya sea FLAG-HMK-IL- 5 o IL-2 recombinante humano, según se detecta por medio de ensayo de incorporación de [3H]-Tdr. Un póptido FLAG que carece de la secuencia I L-15 no estimula la proliferación celular. Así como lo hace I L-2 , la proteína de fusión FLAG-HMK-IL-15 estimula la proliferación de transfectantes de célula IL-2Ry+BAF-B03 que expresan la subunídad IL-2Rp. Sin embargo, la proteína de fusión FLAG-HMK-I L-1 5 no estimula la proliferación de las células BAF-B03 párenteles que se transfectaron con un vector que carece de secuencias de cadena IL-2Rp. De esta manera, FLAG-HMK-IL-15 es un factor de crecimiento biológicamente activo que requiere la expresión de cadenas IL-2Rp en las células objetivo a fin de estimular la proliferación celular. PBMCs. activados por Mitogen. pero no en reposo. Expresan la Subunidad de I L-1 5Ra La proteína de fusión FLAG-HMK-IL-15, anticuerpo antl-FLAG biotinilado, y estreptavidina-R ED670 se emplearon para detectar la expresión de sitios de unión de IL-1 5 sobre PBMCs humanos mediante análisis citofluoromótrico. Los PBMCs probados se aislaron ya sea frescamente o se activaron por PHA. Estas células se lavaron y se incubaron con cualquier medio solo o FLAG-HMK-I L-15 seguido por Ab biotinilado de anti-FLAG y estreptavidina-R ED670. Las células coloreadas se analizaron medíante citometrfa de flujo. Los PBMCs que se activaron con PHA expresaron proteínas de IL-15 oc pero no PMBCs en reposo. Al mantenerse con el resultado de los experimentos de degradación descritos anteriormente, la unión de FLAG-HMK-IL-15 a PBMCs activados por PHA se bloquea por un exceso molar de rl L- 15, demostrando de tal modo la especificidad de la unión de FLAG-HMK-IL-15 para los sitios de unión de IL- 5. Tanto las células CD8+ como CD4+ expresan cadenas de IL- 15 . Las cadenas de IL-1 5Ra inducidas por activación también se detectaron sobre células CD14+ (monocito/macrófago) y células CD16+ (asesinas naturales). Las Subunidades de I L-2 Rp e I L-2 R No Se Requieren para la Unión de I L-15 El análisis FACS de PBMCs activados por PHA coloreados con proteínas FLAG-HMK-I L-15 y Mab antl-CD25, contra la subunldad de IL-2Ra, revela las poblaciones celulares que expresan tanto las subunidades de IL-2Ra como IL-15Ra, así como también las poblaciones celulares que expresan cualquier subunídad, pero no ambas. Existen células de IL-2Ra+ que no unen FLAG-HMK-IL- 1 5. Casi todos los PBMCs que se estimularon con PHA por solamente un día expresan ya sea cadenas IL-2Rp o IL- 15Ra, pero no ambas proteínas. En contraste, 3 días siguientes a la estimulación de PHA, una población casi más grande de células IL-15Ra+, IL-2Rp+ (positivas dobles) y una población casi más pequeña de células IL- 1 5R +, IL-2Rp" (positivas únicas) se notaron . De manera interesante, existen células IL-2Rp+ que fallaron en unir IL-15. Por lo tanto, la expresión de cadenas de IL-2RP no es suficiente para la unión de IL-15. Tomados juntos, estos datos indican que I L- 15 puede unir las células IL-15Ra*, I L-2Ra", e IL-2Rp". Una conclusión similar se alcanzó a través de la experimentación que probó la interacción de IL-15 con células IL-2Ra", ß" transfectadas con la subunidad de IL-15R (Anderson et al. , J. Biol. Chem. 270:29862, 1995; Girí et al., EMBO J. H: 3654, 1995). Además del requisito para la expresión de subunidad de I L-1 5Ra, las subunídades de I L-2Rp e I L-2Ry se requieren para volver a las células sensibles al crecimiento liberado de IL-15. En resumen, los experimentos anteriormente presentados han demostrado que: (i) las subunidades de IL-15Ra se expresan rápidamente por macrófagos activados, células T, y células K, y (ii) la inducción de la subunidad de I L-15Ra se bloquea por dexametaeona pero no por CsA o rapamicina. Además, los experimentos han confirmado que la subunidad de IL-1 5Ra es necesaria y suficiente para unir IL- 15 y que la proteína de fusión FLAG-H MK-I L- 1 5 es una herramienta extremadamente útil para estudiar los receptores de IL-15. Subunidad de I L-2R6 es Crítica tanto para la Transducción de Señal de I L-1 como IL-2 La reducción de la viabilidad de células T activadas y la supresión de tal modo de células T activadas proporciona una manera para reducir la producción de linfoquinas y mitogenes que contribuyen a la ateroesclerosis acelerada, rechazo de aloinjerto ciertas leucemias y otras patologías mediadas inmunes. Además , bloqueando la trayectoria de transducción de señal activada por IL-15 también se proporciona una manera para reducir la producción de linfoquinas y mitogenes que contribuyen a la ateroeeclerosis acelerada, rechazo de aloinjerto, ciertas leucemias y otras patologías mediadas inmunes. Cuando se activan, las células T prolíferan y expresan receptores sobre su superficie de célula para interleucinas. Además, las células T activadas liberan al menos 3 linfoquinas: fnterferona gamma, factor li de diferenciación de célula B, e I L-3. Estas linfoquinas pueden producir diversos casos indeseables, tal como rechazo de aloinjerto. En contraste, las células T en reposo y células T de memoria a largo plazo no expresan receptores de linfoquina. Esta diferencia en la expresión de receptor proporciona un medio para las células inmunes activadas objetivo sin Interferir con las células en reposo. Las moléculas diseñadas para reconocer alguna subunidad del IL-15R reconocerán los monocitos/macrófagos activados así como también las células T activadas y pueden utilizarse para inhibir selectivamente o destruir estas células. Los derivados de I L-15 que se unen a una subunidad IL-1 5R pero que carecen de actividad de IL-15, ya sea debido a que bloquean la unión y/o toma auténtica de buena fe I L-15, son útiles en el método de la invención . La molécula de IL-15 muíante descrita abajo proporciona un ejemplo de trabajo de tal derivado. Un Polipéptido de IL- 15 Mutante que Tiene como Objetivo una Construcción Genética de I L-1 5R de I L-15 muíante La proleína IL-15 humana que recubre una doble muíación (Q149D; Q 156D) se diseñó para tener como objetivo los sitios putativos críticos para unirse a la subunidad IL-2Ry. Los residuos de glutamina polares, pero no cargados, en las posiciones 14T y 156 se mutaron en residuos acídicos de ácido aspártico utilizando mutagénesis auxiliada por PCR . Un cADN que codifica el mutante doble de IL- 15 se amplificó por PCR utilizando un oligonucleótido de sentido sintético [5'-GGAATTCAACTGGGTGAATGTAATA-3' (SEQ ID NO:J; sitio EcoRI (hexámero subrayado) más las bases 145-162] y un oligonucleótido de antisentido sintético (5'- CGGGATCCTCAAGAAGTGTTGATGAACATGTCGACAAT-ATGTACAAAACTGTCCAAAAAT-3' (SEQ I D NO:_); sitio BamHl (hexámero subrayado) más las bases 438-489; las bases mutadas se subrayan de manera única] . El templado fue un plásmido que contiene cADN que codifica FLAG-HMK-IL- 5 humano. El fragmento amplificado se ingirió con EcoRI/BamHI y se clonó en el plásmido pAR(DRI)59/60 ingerido con EcoRI/BamHI según se describe (LeClair et al. , Proc. Nati. Acad. Sel. USA 89: 8145, 1989). La presencia de una mutación en el residuo 156 se confirmó por digestión con Salí; la mutación introduce un nuevo sitio de restricción Salí. Además, las mutaciones se verificaron por secuenciación de ADN , de acuerdo a las técnicas estándares. La proteína de mutante doble de FLAG-HMK-I L- 15 (Q149D; Q 156D) se produjo, purificó, y se verificó por secuenciación según se describe anteriormente para la proteina tipo silvestre de FLAG-H M K-IL- 1 5. Utilizando esta misma estrategia, los mutantes que contienen una sustitución de aminoácido único, ya sea en la posición 149 o en la posición 156 se prepararon Según se describe anteriormente, estas posiciones ( 149 y 156) corresponden a las posiciones 101 y 108, respectivamente, en el polipóptido I L-1 5 maduro, que carece de una secuencia de señal de 48 aminoácidos. De igual forma, esta estrategia puede utilizarse para incorporar cualquier otro aminoácido en lugar de los residuos de glutamina en las posiciones 14T o 1 56 o para introducir las sustituciones de aminoácido en las posiciones diferentes a 149 y/o 156. Proliferación de Células BAF-BQ3 en la Presencia de Proteínas Relacionadas de I L- 15 El polipéptido IL-15 mutante doble puede inhibir la proliferación de BAF-B03 en una manera dependiente por doeie: adición de 30 µ? (aproximadamente 50 µg ml) de la proliferación inhibida por IL-15 mutante doble de manera más completa que lo que fue la adición de 20 µ? de la misma concentración del IL-15 mutante doble. Proliferación de PBMCs Humanos Estimulados por PHA La habilidad del polipéptido mutante doble de FLAG-HMK-IL- 1 5 para unir PMBCs humanos activados por PHA se demostró como sigue.

Los PBMCs activados por PHA se lavaron y se incubaron con medio solo, o con el mutante doble de FLAG-HMK-IL- 5. Las células se incubaron así con un anticuerpo biotinilados de anti-FLAG y se colorearon con streptavidina conjugada a R ED670. Las células coloreadas se analizaron por citometría de flujo Análisis FACS de Estirpes de Célula Leucémica con FLAG-HMK-I L- 15 Tipo Silvestre En una serie de experimentos similares a aquellos anteriores, se muestra la habilidad del polipóptido FLAG-H M K-I L- 15 tipo silvestre para unirlas células de leucemia. Las células tratadas se obtuvieron de las estirpes de célula leucémicas MOLT- 14, YT, HuT-102 , y de las estirpes de células actualmente establecidas en el Hospital Beth Israel (Boston, MA), y denominadas 2A y 2 B. Las células cultivadas se lavaron y se incubaron ya sea con un medio solo o con un medio que contiene el polipéptido tipo silvestre FLAG-HMK-I L- 15. Las células se incubaron así con el anticuerpo de anti-FLAG biotinilado y se colorearon con estreptavjdina conjugada por ED670. Las células coloreadas se analizaron por citometría de flujo. Construcción Genérica de Polipéptidos Quiméricos de IL-15 Mutante Adicionales Además de la quimera FLAG-HMK-IL-15, que proporciona el IL- 15 mutante con una etiqueta antigénica , otros numerosos polipéptidos pueden unirse en cualquier mutante de 11-15 o IL-2. Por ejemplo, el IL-15 o I L-2 mutante puede unirse en el fragmento Fe de la subclase IgG de anticuerpos de acuerdo al siguiente método. Construcción Genética de IL-1 5/Fc Mutante El cADN de Fcy2a puede generarse de mARN extraído de un hibridoma que secreta lgG2a utilizando técnicas estándares con transcriptasa inversa (MMLV-RT; Gibco-BRL, Grand Island, NY) y un oligo-dT sintético (12-18) oligonucleótido (Gibco BRL). El cADN de IL- 15 mutante puede amplificarse de un templado de plásmido por PCR utilizando oligonucleótidos sintéticos específicos de I L-15. El oligonucleótido 5' se diseña para insertar un sitio de restricción de Notl único de 40 nucleótidos 5' en el codón de inicio translacional, mientras que el oligonucleótido 3' elimina el codón de terminación y modifica el uso de residuo Ser de terminal C de AGC a TCG para acomodar la creación de un sitio de BamHI único en la unión de I L-1 5/Fc muíante. Los oligonucleótidos sintéticos utilizados para la amplificación del cADN de dominio Fcy2a cambian el primer codón de la articulación de Glu a Asp a fin de crear un sitio de BamHI único atravesando el primer codón de la articulación e introducir un sitio de Xbal único 3' en el codón de terminación . El fragmento Fe puede modificarse de tal forma que es una supresión de célula no objetivo, es decir, no es capaz de activar el sistema complementario. Para hacer la construcción de IL-15 muíante de supresión de célula no objetivo (ml L- 15/Fc), se utilizó la mutagénesis dirigida por sitio de oligonucleótido para reemplazar el motivo de unión C'lq Glu318, Lys320, Lys322 con residuos Ala. De igual forma, Leu235 se reemplaza con Glu para inactivar el sitio de unión FcyR I. La ligación de componentes de Fe' y citoquina en la estructura de lectura correcta en el sitio de BamHI único produce una estrucíura de lecíura de 1 ,236 par base que codifica un polipéptido de 41 1 aminoácidos único (incluyendo el péptido de señal IL- 15 de 18 aminoácidos) con un íoíal de 13 residuos de cisteína. El I L- 1 5/Fc homodimórico secreiado maduro se pronosíica que tiene un tolal de hasta ocho enlaces de dísulfuro de cadena inter-pesada e intra-molecular y un peso molecular de aproximadamente 85 kDa , exclusivo de glicosllación. Expresión v Purificación de Proteínas de Fusión Fe de Recepíor de ml L-1 5 La construcción genética adecuada de mlL- 1 5/Fc puede - T7 -confirmarse por análisis de secuencia de ADN siguiente a la clonación del gen de fusión como un cásete Notl-Xbal en el plásmido de expresión eucariótica pRc/CMV (Invitrogen , San Diego, CA). Este plásmido lleva un promotor/reforzador de CMV, una señal de poliadenllación de hormona de crecimiento de bovino y un gen de resistencia de neomicina para la selección con G418. Los plásmidos que llevan el gen de fusión mlL-1 5/Fc se transfectan en células de ovario de hámster Chino (CHO-K1 , disponible de la Colección de Cultivo Tipo Americano) por electroporación (1 .5 kV/3 ? 0.4 cm/PBS) y se seleccionan en medio de Ultra-CHO libre de suero (BioWhittaker Inc. , Walkerville, M D) que contiene 1 .5 mg/ml de G418 (Geneticina, Gibco BRL) . Después de la subclonación, los clones que producen niveles altos de la proteína de fusión se seleccionan al seleccionar sobrenadantes de IL-15 mediante ELISA (PharMingen, San Diego, CA) . Las proteínas de fusión m l L- 1 5/Fc se purifican de sobrenadantes de cultivo por cromatografía de afinidad de sefarosa de proteína A seguida por diálisis contra PBS y 0.22 µ?t? de esterilización de filtro. Las proteínas de fusión pueden almacenarse a -20°C antes de utilizarse. El análisis de Western blot siguiente a SDS-PAGE bajo condiciones de reducción (con DTT) y no reducción (sin DTT) puede realizarse utilizando anticuerpos primarios de anti Fcy o anti-ml L-15 pollclonales o monoclonales para evaluar el tamaño y la especificidad de isotipo de las proteínas de fusión . La actividad funcional de I L-15/Fc mutante puede valorarse por un ensayo de proliferación de célula T estándar, según se describe anteriormente. Los siguientes mAbs se obtuvieron de PharMingen (San Diego, CA): PE-antí-ratón CD25 (cadena IL-2Ra, IgGI, PC61), anti-ratón de rata CD122 (cadena IL-2Rp, lgG2b, TM-b1), anti-ratón de rata CD132 (IL-2Ryc, lgG2b, TUGm2), anti-ratón de hámster CD3 (IgG, 145-2C11), anti-ratón de hámster CD28 (IgG, 37.51), PE-anti-ratón CD62L (lgG2a, MEL14), anti-ratón de hámster conjugado de PE Bcl-2 (IgG, 3F11), anti-ratón conjugado de PE IL-2 (lgG2, JES6-5H4), PE-anexlna V, anti-rata biotínllado lgG2b, PE-estreptoavidina, PE-CiCroma, y mAbs de control de isotipo conjugado de PE. Un mAb de anti-FLAG de ratón blotinllado y un mAb de control de lgG1 de rata se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Un mAb de anti-ratón de rata que secreta hibridoma de célula B CD25 (TIB 222, lgG1) se obtuvo de la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC; Manassas, VA). Las células crecieron en medio de UltraCultivo libre de suero (BioWhittaker, Walkerville, MD) y el mAb en el sobrenadante de cultivo se purificó con una columna de proteína G. Estudios de Expresión de IL-2 e IL-15 ¡n vivo El IL-2 e IL-15 humano recombinante se adquirieron de R & D System (Mineapolis, MN). Las proteínas de fusión IL-15 mutante/Fc e IL-15-FLAG se construyeron, expresaron, y se probaron según se reporta previamente (Chae et al. J. Immunol. 157:2813-2819, 1996; Kim et al., J. Immunol. 161:5742-5748. 19T8). Los mAbs ye de anti-ratón de rata (4G3/3E12, lgG2b) se utilizaron según se describe previamente (Li et al., J. Immunol. 164:1193-1199.2000). Los linfocitos se marcaron con éster de succinimidilo de diacetato 5-carboxifluoresceína de fluorocroma (CFSE; Molecular Probes, Inc., Pórtland, OR) como sigue. Los bazos y los nudos linfáticos periféricos se colectaron de ratones donadores y las suspensiones de célula única se prepararon en solución de sal balanceada de Hanks (HBSS). Las células de sangre roja se destruyeron por lisinas por choque hipotónico. Las células se volvieron a suspender en HBSS a 1x107/ml y se marcaron con CFSE según se describe por Wells et al. (J. Clin. Invest. 100:3173-3183, 1997). Para activar las células T marcadas de CFSE in vivo, los ratones DBA/2 irradiaron (1000 rad) con un Exactor Gammacell (Kanata, Ontario, Canadá). Cada ratón recibió así 4 a 6x107 de células marcadas por CFSE en 0.5 mi de HBSS por medio de la vena de cola. Tres días después, los ratones huésped se sacrificaron y los bazos y nudos linfáticos periféricos se colectaron por separado. Las suspensiones de célula única se prepararon para la coloración de superficie de célula y análisis FACS. En algunos experimentos, los ratones huésped irradiados se trataron con mAb de anti-CD25 o mAbs de anti-yc (i.p. en 1mg/día por 3 días comenzando en la inyección i.v. de células marcadas por CFSE). La división celular in vivo se determinó en el tercer día siguiente a la inyección de células marcadas por CFSE. El tratamiento con la proteína de fusión IL-15 mutante/Fc consistió de 1.5 µg i.p. diariamente, por tres días, comenzando en la inyección i.v. de células marcadas. Las células marcadas por CFSE activadas in vivo en huéspedes alogeneicos irradiados se colorearon para la expresión de subunidades de receptor de IL-15 e IL-2. Para detectar la expresión de cadena de receptor de I L-2, las células (2x10°) se colorearon con mAb de PE-anti-ratón CD25 en hielo por 30 minutos, se lavaron, y se volvieron a suspender en 1 mi de PBS que contiene 0.5% de BSA . Para detectar la expresión de ye y ß de IL-2R , las células se incubaron con una cadena p de anti-ratón de rata (lgG2b) o mAb de ye (lgG2b) en hielo por 30 minutos, seguidos por la incubación con un lgG2b de anti-rata biotinilado. Las células se lavaron y además se colorearon con PE-estreptoavidina por 20 minutos. Las células se lavaron y se volvieron a suspender en PBS-0.5% de BSA para análisis. Para detectar la expresión de cadena s de IL-15R, las células se incubaron con una proteína de fusión de I L-1 5-FLAG que se une a la cadena a (Chae er a/ , J Immunol 157:2813-2819. 19T6) y después se coloreó con mAb de anti-F LAG de ratón biotinilado. Las células se lavaron así y se colorearon con PE-streptoavidina . Los mAbs de control igualado de isotipo se incluyeron en cada experimento como un control. Todas las muestras se analizaron utilizando FACSort con software CelIQuest™ (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Los datos se colectaron y se analizaron al abrirse sobre las células CFSE+. Todas las células de CFSE+ de división fueron células T, según se define por la expresión de C D3. Al menos 100,000 casos se colectaron para cada muestra. La apoptosis de las células T de división ¡n vivo se analizaron como sigue. Los linfocítos marcados por CFSE se estimularon in vivo en huéspedes alogenelcos irradiados según se describe anteriormente. Las células se colectaron del bazo huésped o nudos linfáticos periféricos tres días después y se colorearon con anexina V conjugada de PE en hielo por 1 5 m inutos en regu lador de ma rcación . La división cel ula r se identificó en base a la configuración de CFSE de las células, y la muerte celular apoptótica en cada división celular distinta se analizó por la coloración de anexina V. Las células también se colorearon para la expresión de citoquina de Bcl-2 e I L-2 intracelular. Las células marcadas por CFSE que se había activado in vivo por tres días se colecta ron del bazo h uésped y nudos linfáticos . Las células se volvieron a estimular in vitro con PMA (50 ng/ml) e inonomicina (500 ng/ml) por cuatro horas y GolgiStop™ (PharMingen) se agregó por las últimas dos horas de cu ltivo. Las células se fijaron y se permeabilízaron con Cytofix/Cytoperm (PharMingen) a 4°C por 1 0 minutos, y después se colorearon con mAb de I L-2 de anti-ratón conjugado por PE, se incluyó mAb de control igualado de isotipo como un control . Para la coloración de Bcl-2 , las células se fijaron y se permeabilízaron con Cytofix/Cytoperm por 10 minutos y se colorearon con mAb de anti- Bcl-2 conjugado por PE o Ab de control de isotipo por 30 minutos . Las células se lavaron y se analizaron por FACS. La clasificación de célula y re-estimulación in vitro se llevó a cabo como sigue . Las células marcadas por CFSE se prepararon de huéspedes alogeneicos irradiados tres días después de la inyección i .v. de las células marcadas. La proliferación celular in vivo se identificó a través del análisis de sus configuraciones de CFSE. Las segundas divisiones celulares se seleccionaron, abrieron , y clasificaron con el clasificador FACS Vantage™ (Becton Dicklnson) en 2000 casos/segundo . Las células clasificadas se volvieron a suspender en medio R PM I 1640 complementado con 10% de FCS y 1 % de penicilina y streptomicina a 5x105/ml y se laminaron en láminas revestidas de anti-CD3 (2 µ?/?t??) junto con mAb de anti-CD28 (1 µ9/???) . Tres días después, las células se colectaron y se colorearon con CD25 de anti-ratón conjugado por PE y Ab de control de isotipo. La proliferación celular y la expresión de cadena a de receptor de I L-2 se analizaron por FACS. Los ensayos de clasificación de célula y de proliferación In vitro se llevaron a cabo como sigue. Las células marcadas por CFSE se prepararon de huéspedes alogeneicos tres días después de la inyección intravenosa de células marcadas, y la proliferación celular in vitro se identificó por análisis de la configuración de CFSE de las células. La segunda división celular se seleccionó, se abrió, y se clasificó con FACS Vantage™. Las células (1 x104/ml) se volvieron a suspender en medio RPM 1 1640 con 10% de FCS y 1 % de penicilina y estreptomicina, y se estimularon con II-2 (40 µ/ml a 500 µ/ml) o I L-1 5 (5 ng/ml) por 48 horas. Las células se pulsaron con 1 mCI de 3H-TdR (Amersham, Boston, MA) por 1 horas y la toma 3H-TdR se determinó por conteo de escintilación (Beckman Instrument, Columbia, MD). Los reactivos y las técnicas anteriormente descritas proporcionaron las bases para diversos encuentros. Primero, los linfocitos alogeneicos de B6AF1 (H-2b/d. k) marcados por CFSE, en contraste a los controles singeneicos (Li et al. , Natura Medicine 5: 1298-1302, 1999), se prolíferaron vigorosamente en huéspedes de DBA/2 (H-2d) irradiados. Aproximadamente 20% de las células T marcadas por CFSE recuperadas del bazo huésped entrar al ciclo celular dentro de los tres días de transferencia adoptiva , y se identificaron claramente de siete a ocho rondas discretas de división celular (Fig. 3A). Sorprendentemente, la cadena a de receptor IL-2, que se requiere para el señalamiento de receptor I L-2 de alta afinidad , no podía detectarse durante las primeras 5 divisiones, es decir, esta subunidad de receptor se expresa solamente después de cinco divisiones celulares. En contraste, las subunidades p del receptor I L-2 se expresaron constitutivamente al dividir todas las células T, y su nivel de expresión se aumentó progresivamente a medida que las células continuaron dividiéndose. El modelo de expresión de ye ¡n vitro difirió a manera de golpe de aquel de la cadena a y la cadena ß (Fig. 3A). Las células T no divididas (división 0) expresaron niveles muy bajos de cadena ? (< 10%). Siguiente a la entrada en el ciclo celular, la cadena ? se expresó altamente al dividir las células T, y los niveles de expresión continuaron aumentándose después de cada división celular consecutiva. Sin embargo, después de cinco divisiones celulares, la expresión de cadena ? se reguló drásticamente, alcanzando casi el nivel básico después de la sexta división celular (Fig. 3A) . La expresión diferencial de subunidades de receptor IL-2 no se debe a la acumulación selectiva de un subgrupo de células T activadas en el bazo huésped, a medida que las células marcadas por CFSE colectadas de los n udos linfáticos periféricos mostraron un modelo notablemente similar de expresión para las tres subunidades del receptor IL-2. Segundo, la estimulación de las células T marcadas por CFSE in vitro dieron como resultado la expresión uniforme de todas las tres subunídades del receptor I L-2 (Fig. 3B). Esto sugiere que la regulación de la expresión de receptor IL-2 in vivo es distinta de aquella in vitro. La cadena a de receptor IL-2 se sabe que es sensible para la división proteolítica in vivo en una manera que es similar a las selectinas (Hemar et al. , J. Cell Biol. 129:55-64, 1995). La coloración para la expresión de L-selectina al dividir las células T in vivo mostró que la L-selectina se expresó en niveles altos durante las primeras cinco divisiones celulares (Fig. 3C), sugiriendo que la falla para detectar la expresión de cadena a de receptor I L-2 durante las primeras cinco divisiones celulares no se debe a la rápida división proteolítica. Para determinar si las células T en las primeras cinco divisiones celulares son capaces de expresar la cadena a de receptor IL-2, las células T en la segunda división celular, que no expresa la cadena a de receptor IL-2, se clasificaron y se estimularon in vivo con antí-CD3 inmovilizado y anti-CD28 soluble por tres días. Estas células T clasificadas continuaron dividiéndose en la re-estimulación in vitro, y todas las células T de división expresaron la cadena de receptor IL-2. Claramente, la expresión de cadena de receptor IL-2 in vivo e in vitro se regula diferencialmente. A medida que el receptor para I L-15 también utiliza las cadenas ? y ß de receptor IL-2 como componentes de señalamiento críticos (Tagaya et al. , Immunity 4_i329-336, 1996), que se expresan altamente durante las primeras cinco divisiones celulares, nos preguntamos si las células expresan una cadena de receptor IL-15 que las vuelve responsivas a IL-1 5 durante las divisiones celulares iniciales. La aplicación de una proteína de fusión IL-15-FLAG como un reactivo de coloración primario (Chae et al., J. Immunol. 157:2613-2819, 1996) demostró que la cadena a de receptor IL-15 es claramente detectable, regla no escrita en niveles bajos, en las células T de división sin considerar el número de divisiones celulares (Fig. 4A). La cadena a para el receptor IL-2 no se detectó en todas las células T de división in vivo. De esta manera, la expresión selectiva de la cadena a para el receptor IL-15, pero no para el receptor IL-2, junto con la expresión de cadenas ? y ß compartidas durante las primeras cinco divisiones celulares, sugiere que la división celular inicial in vivo probablemente es IL-15 pero no IL-2-dependiente. Para probar esta hipótesis, la producción de IL-2 se valoró en las células T de división in vivo. La coloración de IL-2 intracelular reveló que IL-2 se expresó altamente solamente por las células que se han dividido más de cinco veces. El tratamiento de ratones huésped con dosis de saturación de mAb de antl-CD25 citolítica falló en inhibir las primeras cinco divisiones celulares (en relación a los ratones tratados por Ab de control), y las células de división en las divisiones, primera y quinta, fueron notablemente similares en los ratones tratados por anti-CD25 y en los ratones de control. Además, las células T en la segunda división celular in vivo se clasificaron y se cultivaron in vitro en la presencia de IL-2 o IL-15, y la proliferación celular se analizó por la toma de 3H-Td . IL-2, proporcionado en dosis tan altas como 500 u/ml en cultivo, fallón en soportar la proliferación de célula T. En contraste, IL-15 estimuló la proliferación celular vigorosa (Fig. 4B). El modelo de expresión de IL-2 in vivo se asocia exactamente con la regulación superior de las cadenas ß y a de receptor IL-2, y con la expresión notablemente reducida de la cadena ? común (Fig. 5A). Esto sugiere que IL-2 regula la expresión de cadena ? in vivo. Para probar esta posibilidad, la expresión de cadena ? se examinó en las células T de ratones deficientes de IL-2 y ratones de control tipo silvestre. Las células CD4+T de los ratones deficientes de IL-2 expresaron niveles muy altos de cadena ? sobre la superficie de célula según se compara a los controles de tipo silvestre (Fig. 5B). El tratamiento de ratones huésped con anti-CD25 inhibición la baja regulación de cadena y sobre las células T de división in vivo, pero este tratamiento no tuvo efecto en la expresión de cadena ß de receptor IL-2 (Fig. 5C). La cadena ? es un elemento de señalamiento crítico para todos los factores de crecimiento de célula T conocidos y las señales de cadena y son esenciales para la supervivencia de célula, lo cual se logra al menos en parte por medio de la expresión sostenida de las proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 (Nakajima et al., J. Exp. Med. 185:189-195, 1997). Para determinar si la expresión de cadena ? reducida después de cinco divisiones celulares in vivo regula la expansión clonal, las células marcadas de CFSE se colorearon con PE-anexina V después de la recuperación de los huéspedes y la muerte celular apoptótlca de las células T de división se analizó in vivo. La muerte celular precipitosa ocurrió después de las cuatro divisiones celulares. Las células no divididas (división 0) tuvieron <10% de células positivas de anexina V. Sin embargo, después de la sexta división celular, ~40% de las células fueron positivas de anexina V. Este tipo de muerte celular no es dependiente de Fas, a medida que las células T de los ratones MRL-1 Pr mutante de Fas tuvieron modelo similar de muerte celular apoptótlca In vivo (Ll et al. , J Immunol. 163:2500-2507, 1999) . La coloración para la expresión de Bcl-2 mostró que la intensidad de fluorescencia de canal promedio de la coloración Bcl-2 se redujo notablemente después de las cuatro divisiones celulares (Fig. 5E). De esta manera, los casos de señalamiento en la baja regulación de cadena ? pueden fallar en soportar la expresión de Bcl-2 sostenida y las células llegan a ser susceptibles de muerte celular apoptótica (Nakajima et al. . J. Exp. Meó. 185: 189- 195, 1997) . Estos resultados sugieren que el bloqueo del señalamiento de IL-15 o IL-2 tendrá diferentes efectos sobre la expansión de célula T in vivo. Para explorar más esta posibilidad, los linfocitos marcados por CFSE de ratones deficientes de IL-2 (H-2b) se inyectaron en huéspedes DBA/2 irradiados (H-2d) , se analizó la división celular in vivo tres días después y se comparó con aquella en los ratones de control tipo silvestre. Las células T de ratones deficientes de I L-2 continuaron dividiéndose y se expandieron in vivo. Aproximadamente 30% de células marcadas por CFSE entraron al ciclo celular, y la mayoría de las células se dividieron más de cinco veces, en comparación al control. El tratamiento de ratones huésped con un mutante/Fc I L-1 5, que actúa como un combatiente específico de receptor I L-1 5 (Kim et al. , J. Immunol. 161: 5742-5748, 1 998), redujo notablemente la frecuencia de proliferación de las células T marcadas por CFSE, y una mayoría aplastante de células marcadas por CFSE fallaron en entrar al ciclo celular en los ratones tratados. Además, el tratamiento de ratones huésped con mAbs de bloqueo contra la cadena ? común , un componente de señalamiento compartido de receptores I L- 1 5 e IL-2, también inhibieron notablemente la división de célula T in vivo. De esta manera, I L-2 e IL-15 regulan distintos aspectos de la expansión de célula T in vivo, y la administración de combatientes para estas interleucinas puede suprimir la respuesta inmune, según se discute anteriormente. Estos resultados también demuestran que la baja regulación de cadena ? requiere la activación de célula T y el avance de ciclo celular así como también el señalamiento de I L-2. Claramente, la baja regulación de cadena ? in vivo se asocia exactamente con la producción de I L-2 y la expresión de receptor IL-2 de alta afinidad. En la ausencia de IL-2, la cadena ? se expresa en niveles extremadamente altos y el bloqueo de receptor I L-2 inhibe la baja regulación de cadena ? in vivo en la células T de ciclo. De esta manera, estos estudios proporcionan nueva evidencia de que IL-2 e I L-15 regulan distintos aspectos de la activación de célula T primaria in vivo. Contrario a las creencias y conclusiones tradicionales en base a los estudios in vitro, I L- 15 es un factor de crecimiento crítico en el inicio de división de célula T in vivo y el papel único de I L-2 in vivo es controlar la magnitud de expansión clonal al regular la expresión de cadena ? sobre las células T de ciclo. Estos resultados soportan las aplicaciones clínicas anteriormente descritas. Los intentos para promover la respuesta de célula T con inmunidad de tumor I L-2 exógeno y SI DA pueden promover la muerte de célula T y las terapias para bloquear la inducción de tolerancia de I L-2 y autoinmunidad pueden inducir a la expansión de célula T no - -deseada. Además, el objetivo de I L- 5 e I L- 15 combinado y en etapas representan una manera importante para bloquear la activación de célula T en condiciones citopáticas dependientes de célula T. IL-2/Fc lítica destruye por Usinas las células que cubren 1 L-2R y se une a FcRI Las células de una estirpe de célula T (células CTLL-2; 10e) se marcaron con 100 mCi51Cr y se incubaron con una forma lítica de IL-2/Fc y complemento bajo en tóxico de rata (C), una forma no lítica de IL-2/Fc y C\ inmunoglobulina de murino y C (un control negativo) o C solo (un control negativo en 0.5 µ9/?p?). Otro grupo de las mismas células se probó con un detergente (1 % de N P40) (un control positivo). La lisis de célula se midió por liberación de 51Cr. El grado de lisis observado en la presencia del detergen representa 100% de lisis. La lisis específica siguiente al tratamiento según se describe anteriormente se calculó de acuerdo a la fórmula: % de lisis específica = [(cpm experimental - cpm de antecedente)/(cpm de liberación total - cpm de antecedente) x 100%]. Los resultados, que se muestran en la Fig. 6, apoyan la conclusión de que IL-2/Fc cftolítica destruye por lisis las células CTLL-2 que cubren IL-2R , pero I L-2/Fc no lítica no lo hace así. Para valorar la habilidad de IL-2/Fc no lítica y lítica para unirse a los receptores Fe en las células CHO transfectadas de FcRI (FcRI murino, FcRIl, e IL-2R-negativo), los transfectantes FcRI se pre-incubaron con PBS, mlgG2a, I L-2/Fc lítica, o IL-2/Fc no lítica. Después de lavarse, el Fe de anti-ratón de cabra conjugado fluorescente se utilizó para colorear las células para análisis FACS. Según se muestra en la Fig. 7, la I L-2/Fc citolítica puede unir FcR I , pero la I L-2/Fc l ítica no puede. I L-2/Fc Lítica es eficaz en la prevención de diabetes en un modelo de transferencia adoptivo Dos diferentes variantes de IL-2/Fc se crearon . La primera contuvo una terminal Fe derivada de lgG2a murino que mediará el CDC y CDCC (IL-2/Fc), y la segunda tuvo una parte de Fe mutada de punto que podría no activar C DC o CDCC (I L-2/Fc-/-) . Mientras que IL-2/Fc media CDC en las células que cubren I L-2 R (tales como aquellas de la estirpe de célula T de CTLL-2 murino) y se une a FcRI , I L-2/FC-/- no lo hace asi (Figs. 6 y 7). Además, la molécula de IL-2/Fc l ítica prevendrá al desarrollo de la diabetes en un modelo de transferencia adoptivo NOD, pero una forma no lítica de la molécula (I L-2/Fc-/-) es ineficaz (Fig. 13). En el modelo animal, las células de bazo monodispersadas se consume de eritrocitos por tratamiento con Regulador de Destrucción por Lisinas ACK (BioWhittaker Inc. , Walkersville, MD) . Los receptores de macho NOD irradiados de ocho a 12 semanas de edad (700-rad) , que no eran diabéticos, se inyectaron así con 2x107 de leucocitos esplénicos de ratones NOD hembra agudamente diabéticos (hiperglicemia <dos semanas) . Los niveles de glucosa de sangre (BGL) se probaron semanalmente, y la diabetes se diagnóstico cuando los BG L fueron mayores a 16.5 mmol/L en cualquier medida única o más de 1 3.8 mmol/L en los 3 días consecutivos. Según se muestra en la Fig. 1 3, la mayoría de los animales permanecieron libres de diabetes aún después de que el tratamiento se discontinuó. Según se señala anteriormente, los ensayos y los modelos animal presentados en la presente pueden utilizarse para probar diversas combinaciones de los agentes en la invención para eficacia terapéutica . Rapamicina inhibe la proliferación de célula T en un injerto in vivo contra el modelo huésped, pero no inhibe la apoptosis de células T activadas En un injerto in vivo contra el modelo huésped (según se describe anteriormente), se analizó la esperanza de células T de reactivo huésped en la presencia de I L-2/Fc y rapamicina. Según se muestra en la Fig . 8, la rapamicina inhibirá la proliferación de células T CD8+ y CD4+, aún en la presencia de IL-2/Fc, pero permitirá la expresión de un I L-2R funcional. Según se evidencia por la coloración de Anexina V, las células T de reactivo huésped activadas por antígeno superarán la apoptosis en la presencia de IL-2/Fc y rapamicina (Fig . 10). Las composiciones de la invención permiten la supervivencia a largo plazo de aloinjertos de piel e isleta Para prevenir el rechazo de cualquiera de las isletas alogeneicas transplantadas en receptores NOD agudamente diabéticos o rechazo de injertos de piel transplantados en ratones NOD, una combinación de agentes que promueven la muerte de célula T e inhiben la proliferación de célula T, se utilizó. Según se muestra en las Figs. 1 1 y 1 2 , una combinación de I L-2/Fc lítica , mutl L- 15/Fc y rapamicina se probaron eficaz en la prevención de rechazo de injerto (y más eficaz que otros regímenes de tratamiento probados). La supervivencia de injerto y función de injerto persistió a lo largo de todo el período de observación mostrado, y la mayoría de los injertos sobrevivió después de la discontinuación de la terapia. Este efecto dramático se cree que es debido a la combinación de agentes utilizados (agentes que promueven la muerte de célula T así como también inhiben la proliferación de célula T) . Se han descrito un número de modalidades de la Invención . Sin embargo, se entenderá que pueden hacerse diversas modificaciones sin alejarse del espíritu y alcance de la invención . De acuerdo con lo anterior, otras modalidades se encuentran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . U na composición terapéutica que comprende un primer agente que tiene como objetivo un receptor de interleucina I L-15 (I L-1 5R) y un segundo agente que tiene como objetivo un receptor de interleucina IL-2 (I L-2R) . 2. La composición terapéutica según la reivindicación 1 , caracterizada porque el primer agente comprende un polipéptido de I L-15 m utante substancialmente puro que une una subunidad de I L-1 5R. 3. La composición terapéutica según la reivindicación 2 , caracterizada porque la subunidad es una subunidad de I L- 1 5R<x. 4. La composición terapéutica según la reivindicación 3, caracterizada porque el polipéptido de I L- 1 5 mutante tiene una mutación en la posición 156 de SEQ ID NO:2. 5. La composición terapéutica según la reivindicación 4, caracterizada porque el polipéptido de I L- 15 mutante también tiene una mutación en la posición 1 49 de SEQ I D NO:2. 6. La composición terapéutica según la reivindicación 4, caracterizada porque la mutación en la posición 156 de SEQ I D NO:2 es una substitución de aspartato por glutamina. 7. La composición terapéutica según la reivindicación 5, caracterizada porque la mutación en la posición 149 de SEQ I D NO:2 es una substitución de aspartato por glutamina. 8. La composición terapéutica según la reivindicación 5, caracterizada porque el polipéptido de I L- 1 5 mutante tiene una substitución de aspartato por glutamina en las posiciones 149 y 1 56 de SEQ ID N0:2. 9. La composición terapéutica según la reivindicación 2, caracterizada porque el primer agente comprende una porción que conduce a la eliminación de células que llevan I L-15R. 10. La composición terapéutica según la reivindicación 9, caracterizada porque la porción que lisa células que llevan IL-15R es una región Fe de una molécula de IgG. 1 1 . La composición terapéutica según la reivindicación 1 , caracterizada porque el primer agente comprende un anticuerpo anti-IL15R substancialmente puro. 12. La composición terapéutica según la reivindicación 1 , caracterizada porque el segundo agente comprende un anticuerpo que une específicamente IL-2 o un IL-2R. 13. Un método para suprimir una respuesta inmune en un paciente, el método comprendiendo administrar al paciente una composición terapéutica que comprende un primer agente que tiene como objetivo un IL-15R y un segundo agente que tiene como objetivo un IL-2 R. 14. El método según la reivindicación 13, caracterizado porque el paciente tiene una enfermedad inmune, particularmente enfermedad autoinmune o se encuentra en riesgo de desarrollar una enfermedad inmune, particularmente enfermedad autoinmune. 15. El método según la reivindicación 14, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es una enfermedad reumática, seleccionada del grupo que consiste de lupus sistémico eritematoso, síndrome de Sjogren, escleroderma, enfermedad del tejido conectivo, dermatomiositis, polimiositis, síndrome de Reíter, y enfermedad de Behcet. 16. El método según la reivindicación 14, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide. 17. El método según la reivindicación 14, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es diabetes tipo I . 18. El método según la reivindicación 14, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune de la tiroides seleccionada del grupo que consiste de tiroiditis de Hashimoto y Enfermedad de Graves. 19. El método según la reivindicación 14, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune del sistema nervioso central seleccionada del grupo que consiste de esclerosis múltiple, miastenia gravis y encefalomielltis. 20. El método según la reivindicación 14, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es una variedad de fenfigus seleccionada del grupo que consiste de fenfigus vulgaris, fenfigus vegetans, fenfigus foliaceus, síndrome Senear-Usher y fenfigus Brasileño. 21 . El método según la reivindicación 14, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es psoriasis. 22. El método según la reivindicación 14, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es enfermedad del intestino inflamatoria. 23. El método según la reivindicación 13, caracterizado porque el paciente ha adquirido síndrome de ínmunodeficiencia adquirida (SIDA). 24. El método según la reivindicación 1 3, caracterizado porque el paciente ha recibido un transplante de un órgano biológico, tejido o célula. 25. El método según la reivindicación 1 3, caracterizado porque el paciente tiene una enfermedad de injerto contra huésped . 26. Un método para eliminar una célula que expresa un receptor para I L-1 5, el método comprendiendo exponer la célula a la composición terapéutica que comprende un primer agente que tiene como objetivo un I L- 1 5R y un segundo agente que tiene como objetivo un I L-2R. 27. El método según la reivindicación 26, caracterizado porque la célula es una célula del sistema inmune. 28. El método según la reivindicación 26, caracterizado porque la célula es una célula maligna. 29. Un método para diagnosticar a un paciente que tiene una enfermedad o condición que puede tratarse con la composición terapéutica de la reivindicación 1 , el método comprendiendo determinar si una muestra biológica obtenida del paciente contiene una célula que se une por un polipéptido que comprende I L- 1 5 y una etiqueta antigénica, la ocurrencia de unión indicado que la célula puede unirse por un agente que tiene como objetivo un I L-1 5R in vivo e inhibirse así de proliferarse en respuesta a I L- 15 tipo silvestre in vivo. 30. Una composición farmacéuticamente aceptable que comprende dos o más agentes, cada uno promueve la muerte de la célula T. 31 . La composición farmacéutica según la reivindicación 30, que comprende además un agente que inhibe la proliferación de la célula T. 32. El método según la reivindicación 31 , caracterizado porque la composición comprende una molécula de I L-2/Fc lítica, una molécula de I L- 15 mutante que se antagoniza y el receptor de I L-1 5, y rapamicina. 33. U na composición farmacéutica que comprende al menos un agente que promueve la muerte de la célula T y al menos un agente que inhibe la proliferación de la célula T. 34. La composición farmacéutica según la reivindicación 32, caracterizada porque la muerte de la célula T es AlCD (muerte de la célula inducida por activación), muerte de la célula pasiva, ADCC (citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo) o CDC (citotoxicidad dirigida complemento).