CN106591368A - 携带il‑15r/il‑15融合基因的b亚群腺病毒11载体及其构建和用途 - Google Patents

携带il‑15r/il‑15融合基因的b亚群腺病毒11载体及其构建和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及携带IL‑15R/IL‑15融合基因的B亚群腺病毒11载体及其构建和用途，该病毒其E1A的启动子区域由端粒酶基因启动子所替换，其E318.5K由治疗基因mIL‑15R/IL‑15所替换。本发明的Ad11‑Tel‑mIL‑15R/IL‑15载体具有肺癌特异性、安全性和高效性，能通过肿瘤特异性的端粒酶启动子靶向肿瘤，可用于肺癌的治疗。本发明的Ad11‑Tel‑mIL‑15R/IL‑15载体，采用高效的融合基因mIL‑15R/IL‑15作为治疗基因，具有肿瘤靶向性和抗肿瘤效果，为该重组的基因工程产品向临床转化奠定基础，有望为肺癌病人提供一种有效的治疗方法。

Description

携带IL-15R/IL-15融合基因的B亚群腺病毒11载体及其构建 和用途
技术领域
本发明涉及了一种携带IL-15R/IL-15融合基因的B亚群溶肿瘤腺病毒11载体及其构建和在靶向治疗肺癌中的用途。
技术背景
世界卫生组织(WHO)公布数据显示，2020年全球癌症发病率将比现在增加50％，全球新增癌症患者人数将达到1500万人/每年。肺癌(lung cancer)是目前全球肿瘤死亡的首要原因。据了解，从1985年以来，肺癌已成为全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。影响肺癌发病的首位危险因素是吸烟，90％以上的肺癌被认为是由于主动吸烟或被动吸“二手”烟所致，和吸烟者生活在一起，吸二手烟的人群患肺癌的风险上升20％～30％。此外，环境污染，如：大气污染、居室空气污染、烹调油烟等也是诱发肺癌的因素。另外，一些肺部慢性疾病患者，如：慢性支气管炎,肺结核、弥漫性肺间质纤维化等人群肺癌的发生率也高于其他人群。
鉴于肺癌已经属于全球性的高发恶性肿瘤性疾病，目前，已经发展出了针对肺癌的各种检测和治疗以及预后相关的方法和技术。
中国发明专利申请CN201110328294.7公开了一种有关肺癌诊断试剂盒用于肺癌的检测方法，通过基因重组技术纯化生产S100A2蛋白，纯化的S100A2蛋白，注射于动物体内以诱导产生特异性结合S100A2蛋白的多克隆抗体。同时，该申请也提供了一种肺癌的诊断试剂盒，该试剂盒含有容器，容器中含有S100A2蛋白；标签，所述标签说明所述试剂盒用于诊断肺癌；以及抗S100A2蛋白的特异性抗体。所述试剂盒中还含有免疫组化相关试剂：PBS缓冲液，或0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液，或3％H2O2溶液，或辣根酶检测试剂。该发明对肺癌进行诊断及为患者提供个体化辅助治疗方法。
韩国专利申请PCT/KR2009/000777涉及使用肺癌特异性生物标记物检测肺癌的方法，尤其是肺癌诊断的生物标记物，其可检测其5’UTR或者外显子1区域是在肺癌细胞中特异性甲基化的PCDHGA12基因的甲基化；和使用所述生物标记物检测肺癌和它的发展阶段的方法。该诊断试 剂盒使得相比于传统方法，在早期以准确和快速的方式诊断肺癌成为可能，可用于肺癌和它的发展阶段的预后和监测。
专利申请201610490191.3涉及一种治疗肺癌的中药组合物，所述中药组合物由下述重量配比的原料药组成：党参20-40克、生白术25-35克、茯苓10-20克、陈皮5-15克、法夏6-14克、广木香7-13克、砂仁2-10克、白芍15-25克、瓜萎壳10-20克、玄参9-18克、猫爪草10-18克。该药物组合物对肺癌的治疗起到减毒增效，改善病人临床症状，延长患者生存时间，提高患者生存质量。
尽管近年来肺癌的治疗有很大的进展，然而肺癌病人的预后仍很低，5年生存率不到15％，因此，开发新的有效的治疗方案具有十分重要的意义。生物治疗成为手术、化疗和放疗等传统治疗方法之后的第四大肿瘤治疗模式。
溶瘤病毒(oncolytic virus)，是一类具有复制能力的肿瘤杀伤性病毒，世界上最早出现溶瘤病毒的报道是缘于当时发现一名子***患者在感染狂犬病病毒后肿瘤随之消退。溶瘤病毒药以其独特的杀瘤功效日益受到行业人士关注。新城疫病毒(newcastledisease virus，NDV)、单纯疱疹病毒-1(herpes simplex virus-1，HSV-1)、呼肠孤病毒(reovirus)、腺病毒(adenovirus)等因具有天然的嗜肿瘤特性而被用来改造成溶瘤病毒，它们能感染癌细胞而最终摧毁癌细胞。
复制选择性溶肿瘤腺病毒(replication-selective oncolytic adenovirus，RSOA)是生物治疗中发展较快的、具有独特优势的一种新型肿瘤治疗方法。RSOAs不仅本身可以杀伤肿瘤细胞，而且可以通过多种不同的作用模式靶向肿瘤内信号途径发挥作用，并能破坏肿瘤免疫抑制的微环境诱导长期的肿瘤特异性免疫反应。此外，RSOAs而且还可以携带治疗基因，使治疗基因通过病毒选择性在肿瘤细胞中的复制达到高水平、长时间的表达，并且还能广泛感染大量邻近的肿瘤细胞，克服非复制型载体的不足。尽管我国首次在世界上批准了第一个溶肿瘤5型腺病毒(Adenovirus type 5，Ad5)的突变体(H101)用于头颈部肿瘤治疗。但是单独使用时，其抗肿瘤效果非常有限，不能高剂量静脉给药。目前，以Ad5为骨架的RSOA有如下缺点：(1)Ad5黏附的受体为柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsackievirusand adenovirus receptor，CAR)，但CAR在一些肿瘤细胞中表达缺失或低表达；(2)超过90％的人群中已存在高水平抗Ad5的中和抗体；(3)Ad5静脉注射常引起严重的肝脏毒性；(4) Ad5能引起长期的腹腔内炎症反应；这些因素严重限制了基于Ad5的溶肿瘤病毒基因工程药物的临床应用。
简而言之，尽管全世界范围内的对生物疗法投入了大量的精力，但是目前仍然缺少有效的治疗癌症，尤其是肺癌的生物疗法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15及其构建方法以及该载体在治疗肺癌中的用途。该载体通过IL-15R/IL-15介导的天然免疫和适应性免疫发挥抗肿瘤效果，具有靶向性、安全、高效和/或适于静脉注射的特点。
11型腺病毒(Adenovirus type 11，Ad11)，属于B亚群腺病毒，能克服Ad5所具有的上述缺点，具有明显的优势：(1)Ad11能通过补体调节受体CD46感染细胞，该受体在人类恶性肿瘤细胞中广泛高表达，Ad11也能利用受体X、免疫调节分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)以及Desmoglein 2作为受体黏附细胞；(2)人群中Ad11中和抗体的出现率较低；(3)当静脉注射人CD46转基因小鼠时，几乎完全缺乏肝转导和肝毒性，因此，Ad11对于***性给药具有更大的优越性；(4)Ad11比Ad5具有更少的炎症反应。因此，通过基因工程改造而制备的肿瘤靶向性溶肿瘤病毒Ad11突变体将成为下一代肿瘤生物治疗的新型溶肿瘤病毒。我们课题组前期结果证实，野生型Ad11比Ad5有更高的感染性，尽管野生型Ad11能完全进入肿瘤细胞内，并非对所有肿瘤细胞都有强的杀伤能力，其杀伤性取决于早期基因E1A的转录水平，进一步发现采用Ad5启动子驱动Ad11E1A表达的突变体Ad11-Ad5-P或采用Ad5增强子与启动子联合驱动Ad11E1A表达的突变体Ad11-Ad5-EP病毒具有广泛的肿瘤杀伤性，但缺乏肿瘤选择性。因此，为了提高其对肿瘤细胞的选择性，我们选择了一种端粒酶启动子，该启动子因其无可争辩的高肿瘤特异性、较强的活性以及广泛的分布性，而成为肿瘤靶向治疗极其理想的启动子，将端粒酶启动子替换Ad11-Ad5-P E1A的启动子或Ad11-Ad5-EP E1A的启动子产生新的复制选择性溶肿瘤病毒Ad11-Tel-GFP，从而大大提高其对肿瘤的选择性。
白细胞介素15(interleukin 15，IL-15)一方面能刺激NK细胞的发育、增殖和活化，另一方面能刺激CD8+T细胞的增殖和活化，也是NKT细胞、γδT细胞和B细胞的主要活化因子，并增加B细胞分泌抗体的能 力。由于它的多效性作用，IL-15成为先天免疫***和适应性免疫***之间的桥梁，是一种具有潜能的抗肿瘤分子。然而，IL-15单体在体内半衰期很短(少于40min)，但当其与受体连接能显著延长IL-15在体内的半衰期，具有更强的抗肿瘤效果。
基于上述原因，本发明以靶向性的骨架载体Ad11-Tel-GFP为基础，构建一种新型的复制选择性的溶肿瘤病毒Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，并证实其在肺癌体内外中均具有显著的抗肿瘤效果，因此可能为肺癌的分子靶向治疗提供一种新的治疗方法。
本发明第一方面提供了提供一种肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，其特征是：该病毒为B亚群腺病毒，端粒酶启动子(Tel)替换11型腺病毒(Ad11)的E1A的启动子，同时IL-15R/IL-15融合基因替换11型腺病毒(Ad11)的E3区。
在本发明的第一方面中，IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα或IL-15Rα的sushi结构域。
优选地，在本发明的第一方面中，端粒酶启动子是人端粒酶启动子。
本发明第二方面提供了肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建靶向E1A的穿梭载体pSSA1A4EME1A，将穿梭载体pSSA1A4EME1A和野生型病毒Ad11按1:2-10的比例转化到大肠杆菌BJ5183中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，获得Ad11-Tel病毒载体；
(2)用PCR方法从ptt3-mIL-15R/IL-15载体中扩增出IL-15R/IL-15融合基因，将靶向E3区的载体pSSNRALA3RFP和IL-15R/IL-15融合基因均采用Swa I和Nco I进行双酶切，利用T4DNA连接酶将片段进行连接构建新型的穿梭载体pSS-IL-15R/IL-15；将穿梭载体pSS-IL-15R/IL-15和Ad11-Tel病毒载体按1:2-10的比例转化到大肠杆菌BJ5183中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，获得Ad11-Tel-IL-15R/IL-15病毒载体；将上述病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15转染到JH293细胞中，生产所述病毒Ad11-Tel-IL-15R/IL-15。
在本发明的第二方面中，IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα或IL-15Rα的sushi结构域。
优选地，在本发明的第二方面中，端粒酶启动子是人端粒酶启动子。
本发明的第三方面提供了一种药物，其包含肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，所述载体的特征在于：该病毒为B亚群腺病毒，端粒酶启动子替换11型腺病毒(Ad11)的E1A的启动子，同时IL-15R/IL-15融合基因替换11型腺病毒(Ad11)的E3区。
在本发明的第三方面中，IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα或IL-15Rα的sushi结构域。
优选地，在本发明的第三方面中，端粒酶启动子是人端粒酶启动子。
优选地，所述药物是适于静脉注射的剂型，例如静脉注射液。
进一步优选地，所述的药物在施用于受试者之前被配制成静脉注射液的形式。
配制注射剂时，可加入适宜的附加剂。如渗透压调节剂、pH值调节剂、增溶剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等。所用附加剂应不影响药物疗效，使用浓度不得引起毒性或明显的刺激。其中抗氧剂可以为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和焦亚硫酸钠等，浓度可为0.1％～0.2％；抑菌剂可为0.5％苯酚、0.3％甲酚和0.5％三氯叔丁醇等。
本发明的第四方面提供了肺癌靶向性腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15在制备用于治疗肺癌的药物中的用途，其特征是：该病毒为B亚群腺病毒，其中端粒酶启动子替换11型腺病毒(Ad11)的E1A的启动子，同时IL-15R/IL-15融合基因替换11型腺病毒(Ad11)的E3区。
在本发明的第四方面中，IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα或者IL-15Rα的sushi结构域。
优选地，在本发明的第四方面中，端粒酶启动子是人端粒酶启动子。
优选地，所述药物是适于静脉注射的剂型，例如静脉注射液。
进一步优选地，所述的药物在施用于受试者之前被配制成静脉注射液的形式。
配制注射剂时，可加入适宜的附加剂。如渗透压调节剂、pH值调节剂、增溶剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等。所用附加剂应不影响药物疗效，使用浓度不得引起毒性或明显的刺激。其中抗氧剂可以为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和焦亚硫酸钠等，浓度可为0.1％～0.2％；抑菌剂可为0.5％苯酚、0.3％甲酚和0.5％三氯叔丁醇等。
本发明的新型病毒载体的有效量可为治疗癌症、或缓解癌症症状或抑制癌细胞的任何量，其可以是相当于约0.1-10mg病毒载体，优选0.5-8mg活性成分的剂量单位。更优选地，剂量单位包括约2-6mg的活性成分。最优选地，剂量单位包括约3-4mg的活性成分。有效量的测定在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的公开内容的启示下。
根据本发明，本发明的药物可以以任意有效剂量数施用给药受试者。优选地，本发明的药物可以以多次剂量给药，例如从约2至约15次剂量，更优选从约4-10次剂量，最优选约6次剂量。在特别优选的实施方案，在给药过程中，以隔天给药约一次的频率将本发明的药物给药至受试者，例如输注或瘤内或静脉注射。在特别优选的实施方案，给药为通过静脉注射。
应当理解本发明的药物可以按用于通过任意适宜的途径给药的任意适宜的方式配制。
本发明的药物的剂量单位是基于常规进行给药受试者。例如，剂量单位可以给药多于每日一次、每两天一次、每周一次、每月一次等。剂量单位可以是以两次/周为基础给药，即每周两次，例如每三天一次。
本发明的药物可包含产品的说明书，且所述说明书可以含有如下 内容：适应症(癌症，例如胰腺癌)、施用剂量(例如上述所示例性说明的)以及可能产生的副作用等等。
如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。
本发明的积极有益效果：
(1)本发明提供的肺癌靶向性B亚群腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，利用肿瘤特异性启动子端粒酶启动子，使其增加了肿瘤靶向中的特异性、安全性和高效性，且该载体可用于静脉注射施用。因此，Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15可作为一种***的有效的、安全的基因治疗载体***。
(2)本发明的肺癌靶向性B亚群腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，利用mIL-15R/IL-15作为治疗基因，在端粒酶启动子的引导下，能够在肿瘤部位高效表达IL-15R/IL-15融合蛋白，从而发挥很好的抗肿瘤效果。
(3)本发明的肺癌靶向性B亚群腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，通过适应性免疫发挥极好的抗肿瘤效果，该病毒作为一种肿瘤靶向性基因工程药物推向临床应用打下基础，将为肺癌病人患者提供一种有效的治疗方法，将会产生较好的社会效益和经济效益。
附图说明：
图1：Ad11-Ad5-EP、Ad11-Tel-GFP及Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15的结构图。
图2：融合基因mIL-15R/IL-15在人肺癌细胞系和小鼠肺癌细胞系中的表达。图中可以看出融合基因mIL-15R/IL-15在细胞系中的表达呈现时间依赖性关系。
图3：Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15在人肺癌细胞系和小鼠肺癌细胞系中的复制和杀伤潜能的检测。图中A为病毒复制的研究，B为病毒对肿瘤细胞杀伤的研究。
图4：肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15对肺癌TC1-CD46转基因小鼠的治疗效果——肿瘤生长曲线和生存分析比较图。
图5：肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15对肺癌TC1-CD46转基因小鼠的治疗效果——肿瘤清除率比较图。
图6：不同病毒对小鼠生存时间的影响。
图7：静脉注射后不同病毒的mIL-15R/IL-15表达情况。
具体实施方式：
以下实例只是对本发明的进一步说明，并不限定本发明的保护范围。
实验方法：
肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15对肺癌体内外抗肿瘤效果评价手段包括如下：
(1)Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15病毒在肺癌细胞中的复制和杀伤：将腺病毒Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15感染JH293细胞，大量增殖、纯化和鉴定后，将不同的肿瘤细胞系铺6孔板，分别以5PFU/孔的病毒剂量感染不同的肿瘤细胞，分别在24h、48h、72h和96h收集上清和细胞，每个时间点设置3个复孔，反复冻融3次后，采用TCID50方法评估腺病毒在不同肿瘤细胞系中的复制能力；
将上述不同的肿瘤细胞铺96孔板，每孔2000个细胞，以1×104PFU/mL为起始浓度，稀释9个病毒梯度，于第6d，加入MTS和PMS(20：1)，采用酶标仪测定492nm的吸光度，采用EC50法计算病毒对不同肿瘤细胞的杀伤能力。
(2)Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15病毒在肺癌小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤效果评价：
将5×105TC1-CD46细胞皮下接种人CD46转基因小鼠，当体积大约为100mm3时，将100μl的5×108PFU的Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15、Ad11-Tel-GFP以及PBS于第1d、3d、5d和7d采用肿瘤内注射，在注射的第1d开始监测肿瘤的大小。测量结束后，汇制肿瘤生长曲线从而评估病毒的治疗效果。
实施例1、肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15的构建。步骤如下：
(1)构建靶向E1A的穿梭载体pSSA1A4EME1A(将PBR322的复制子OriR(两端引入PmeI的酶切位点)，E1A启动子两端的序列，其中左臂连入端粒酶逆转录酶的启动子序列，以及氯霉素抗性基因通过基因工程手段采用T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌，在氯霉素抗性中筛选阳性克隆，从而构建pSSA1A4EME1A穿梭载体)，将穿梭载体pSSA1A4EME1A和野生型病毒Ad11按1:2-10的比例转化到大肠杆菌BJ5183中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，获得Ad11-Tel病毒载体；
(2)用PCR方法从ptt3-mIL-15R/IL-15载体(Cheng L,Du X,Wang Z,Ju J,Jia M,Huang Q,Xing Q,Xu M,Tan Y,Liu M,Du P,Su L,Wang S.Hyper-IL-15suppressesmetastatic and autochthonous liver cancer by promoting tumour-specific CD8+Tcell responses.J Hepatol.2014Dec；61(6):1297-303.)中扩增出mIL-15R/IL-15融合基因，将靶向E3区的载体pSSNRALA3RFP和mIL-15R/IL-15融合基因均采用Swa I和Nco I进行双酶切，利用T4DNA连接酶将片段进行连接构建新型的穿梭载体pSS-mIL-15R/IL-15；将穿梭载体pSS-mIL-15R/IL-15和Ad11-Tel病毒载体按1:2-10的比例转化到大肠杆菌BJ5183中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，获得Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15病毒载体；将上述病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15转染到JH293细胞中，生产所述病毒Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15，其结构如图1所示。
实施例2、肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15感染不同肺癌细胞后融合基因mIL-15R/IL-15在细胞内的特异性表达。
在不同时间点收集不同滴度的病毒感染的肿瘤细胞的上清，采用ELISA检测试剂盒Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go分析mIL-15R/IL-15融合蛋白在不同肺癌细胞系中的表达。结果如附图2 所示。
实施例3、肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15在肺癌细胞系中的复制和杀伤能力的检测。
将腺病毒Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15和对照病毒Ad11-Tel-GFP感染JH293细胞，大量增殖、纯化和鉴定后，将不同的肿瘤细胞系铺6孔板，分别以5PFU/孔的病毒剂量感染不同的肿瘤细胞，分别在24h、48h、72h和96h收集上清和细胞，每个时间点设置3个复孔，反复冻融3次后，采用TCID50方法评估腺病毒在不同肿瘤细胞系中的复制能力。由附图3A可知两种病毒均能在肿瘤细胞系中大量复制，特别是在CD46受体介导的细胞中的复制水平显著高于无CD46受体的细胞。
将上述不同的肿瘤细胞铺96孔板，每孔2000个细胞，以1×104PFU/mL为起始浓度，稀释9个病毒梯度，于第6d，加入MTS和PMS(20：1)，采用酶标仪测定492nm的吸光度，采用EC50法计算病毒对不同肿瘤细胞的杀伤能力(EC50越低，表明该病毒杀伤能力更强)。由附图3B可知，Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15与对照病毒相比，其对肿瘤细胞的杀伤潜能均有所下降。
实施例4、肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15对肺癌TC1-CD46荷瘤小鼠的治疗效果。
将6-8周龄的人CD46转基因小鼠右侧背部皮下接种肺癌TC1-CD46细胞，每只小鼠接种细胞数为5×105个细胞，7天后肿瘤达到100mm3左右时进行分组，治疗组5×108pfu/只的Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15进行治疗(瘤内注射)，对照组为磷酸盐缓冲液(PBS)和Ad11-Tel-GFP，实验结果如图4和5所示。
由图4中的左图可知，Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15比对照病毒Ad11-Tel-GFP(图1)具有更强的抗肿瘤效果。
由图4中的右图可知，Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15比对照病毒Ad11-Tel-GFP显著延长小鼠的生存时间。
由图5可知，Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15能使小鼠57.1％的肿瘤完全消除，而对照病毒Ad11-Tel-GFP只能引起小鼠28.6％的肿瘤消除。
实施例5、肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15对转移性肺癌TC1-CD46的治疗效果。
将2×10E6的TC1-CD46细胞通过尾静脉接种于人CD46转基因C57小鼠，在第7d开始治疗，共计3次(第7d、9d和11d)，每组7只，将2×10E8PFU的Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15和Ad11-Tel-GFP病毒通过尾静脉进行注射，记录小鼠死亡时间，采用Kaplan-Meier评估不同病毒对小鼠生存时间的影响，实验结果如图6和图7。
由图6可知，新型的溶肿瘤病毒Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15能显著延长小鼠的存活时间，与PBS组和Ad11-Tel-GFP组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。
由图7可知，Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15病毒静脉注射后，mIL-15R/IL-15的表达在第1d迅速增加，显著高于第3d和第5d，差异具有统计学意义(P<0.05)。相反，PBS和对照病毒Ad11-Tel-GFP静脉注射的小鼠后所有的时间点基本没有mIL-15R/IL-15的表达。
另外，将不同剂量(1×10E8PFU；2×10E8PFU；4×10E8PFU；8×10E8PFU)的本发明的Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15病毒静脉注射至不同类型的小鼠肿瘤模型，发现在不同剂量下本发明的病毒载体均能最显著地延长了患肺癌小鼠的存活期(高达对照的3倍)。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.肿瘤靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，其特征是：端粒酶启动子替换11型腺病毒的E1A的启动子，同时IL-15R/IL-15融合基因替换替换11型腺病毒的E3区。
2.如权利要求1所述的载体，其中IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。
3.如权利要求1或2所述的载体，其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα；且优选端粒酶启动子是人端粒酶启动子。
4.肿瘤靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建靶向E1A的穿梭载体pSSA1A4EME1A，将穿梭载体pSSA1A4EME1A和野生型病毒Ad11按1:2-10的比例转化到大肠杆菌BJ5183中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，获得Ad11-Tel病毒载体；
(2)用PCR方法从ptt3-mIL-15R/IL-15载体中扩增出IL-15R/IL-15融合基因，将靶向E3区的载体pSSNRALA3RFP和IL-15R/IL-15融合基因均采用SwaI和NcoI进行双酶切，利用T4DNA连接酶将片段进行连接构建新型的穿梭载体pSS-IL-15R/IL-15；将穿梭载体pSS-IL-15R/IL-15和Ad11-Tel病毒载体按1:2-10的比例转化到大肠杆菌BJ5183中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，获得Ad11-Tel-IL-15R/IL-15病毒载体；将上述病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15转染到JH293细胞中，生产所述病毒Ad11-Tel-IL-15R/IL-15。
5.药物，其包含肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，所述载体的特征在于：端粒酶启动子替换11型腺病毒的E1A的启动子，同时IL-15R/IL-15融合基因替换替换11型腺病毒的E3区。
6.如权利要求5所述的药物，其中IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。
7.如权利要求5或6所述的药物，其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα；且优选端粒酶启动子是人端粒酶启动子。
8.如权利要求7所述的药物，其是适于静脉注射的剂型，例如静脉注射液。
9.肺癌靶向性腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15在制备用于治疗肺癌的药物中的用途，其特征是：该病毒为B亚群腺病毒，其中端粒酶启动子替换11型腺病毒的E1A的启动子，同时IL-15R/IL-15融合基因替换11型腺病毒的E3区。
10.如权利要求9所述的用途，其中IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα，优选地端粒酶启动子是人端粒酶启动子，更优选地，所述药物是适于静脉注射的剂型，例如静脉注射液。
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