MXPA02001754A - Sistema de ensayo in vitro de gama-secretasa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se encuentra en el campo de los procedimientos para la deteccion de inhibidores especificos de la ?-secretasa, que pueden ser utilizados en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en especial de procedimientos que pueden ser llevados a cabo in vitro Adicionalmente, la presente invencion se refiere a un equipo de ensayo, con el que se puede llevar a cabo el lo procedimiento segun la invencion, asi como al uso de este equipo de ensayo procedimiento para la deteccion de sustancias que inhiben especificamente la ?-secretasa. Otra forma de realizacion se refiere al uso de estas sustancias para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y formulaciones farmaceuticas que contienen estas sustancias.

Description

SISTEMA DE ENSAYO IN VITRO DE GAMA-SECRETASA Campo de la invención La presente invención pertenece al campo de los procedimientos para la detección de inhibidores específicos 5 de la ?-secretasa que pueden ser utilizados para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en especial de procedimientos que puedan ser llevados a cabo in vitro. Adicionalmente, esta invención se refiere a un equipo de ensayo con el cual se pueda llevar a cabo el procedimiento según la invención, así como al uso de este equipo de ensayo o del procedimiento para la detección de sustancias que inhiben específicamente la ?-secretasa. Otra forma de realización se refiere al uso de estas sustancias para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y de formulaciones farmacéuticas que contienen estas sustancias. Antecedentes de la Invención t La_agregación y precipitación de proteínas intervienen en el establecimiento de diferentes enfermedades neurodegenerativas tales como Alzheimer, Parkinson y Veitstanz (en inglés, "Chorea Huntington") . En la enfermedad de Alzheimer, se agrega el péptido amiloide- ß (Aß) y da lugar a placas seniles insolubles, las cuales REF.: 136038 -"--•-- —-*- - representan un marcador patológico de la enfermedad (Selkoe et al., 1996). Aß se forma por escisión proteolítica de una proteína precursora, la proteína precursora del amiloide (inglés: "amyloid precursor protein"; inglés: APP). Se distinguen dos vías metabólicas de la APP, la vía no amiloidógena y la vía amiloidógena (Selkoe, 1991, 1994). En el metabolismo no amiloidógeno de la APP, se escinde la a-secretasa dentro de la región Aß de la APP y conduce así a la secreción de la región N-terminal soluble de la proteína (a-APP) , así como, tras el corte de la ?- - secretasa, a la liberación de p3. Por el contrario, la vía amiloidógena conduce a la formación de Aß, en la que dos proteasas generan el extremo N (ß-secretasa) o el extremo C (?-secretasa) de Aß (Haass, 1993; Selkoe, 1994) . In vivo se puede detectar Aß en el plasma humano y en el líquido céfalo-raquídeo. También en cultivos celulares puede detectarse Aß secretada en el sobrenadante del cultivo celular en distintos tipos de células, que expresan o sobre- expresan de forma endógena APP o fragmentos de la misma. Tanto la producción de Aß como también la formación de la placa de amiloide están afectadas por diferentes factores genéticos de riesgo. A ellos pertenecen las mutaciones en las proteínas homologas presenilina 1 y presenilina 2, así como en la propia APP. El análisis de estas mutaciones en fibroblastos de pacientes con Alzheimer, con enfermedad de Alzheimer heredada familiarmente (inglés: "Familiar Alzheimer Disease" (FAD)), ha demostrado la influencia que tienen sobre la formación de Aß. Ello se ha podido confirmar mediante investigaciones en células transfectadas y en animales transgénicos. Todas las mutaciones incrementan la producción de Aß y dan lugar, en caso de mutaciones de presenilina, a un aumento selectivo de la variante más larga de Aß, el Aß42 (Selkoe, 1996; Price, 1998) . Este péptido se agrega en mayor medida que la forma más corta, el Aß40, y se encuentra en las placas difusas y, junto con Aß40, en las placas seniles (Lemere et al., 1996; Mann et al., 1996). Además de esta influencia de las mutaciones, existen indicios de que también las formas de tipo salvaje de las presenilinas juegan un papel fundamental en la formación fisiológica de Aß. En neuronas de embriones de ratón, en los que se inactivo por medios de técnica génica el gen PS1 (PS: presenilina), se ha podido demostrar una drástica reducción de Aß40 y Aß42. Además, en e-stas células se acumulan los fragmentos C-terminales de la APP, lo que dio lugar a la opinión de que las presenilinas activan la ?-secretasa o poseen, por sí ?. mismas, actividad de ?-secretasa (De Strooper et al., 1998; Sisodia et al., 1998). Los primeros sistemas de ensayo in vitro combinados con estudios de mutaciones en aspartatos conservados de la presenilina 1 permiten suponer que las 5 presenilinas podrían ser aspartato-proteasas especiales, autocatalíticamente activas, que son responsables del corte de la ?-secretasa en la membrana ( olfe et al., 1999). La discusión sobre la identificación de la ?-secretasa como etapa decisiva en la generación de Aß y, por tanto, en el establecimiento del Alzheimer no ha finalizado todavía. Independientemente de ello, esta proteasa representa un objetivo interesante para poder intervenir farmacológicamente en el proceso de formación de Aß, hallando inhibidores que reduzcan selectivamente su actividad. Para ello, es importante desarrollar, además de modelos animales y ensayos celulares, sistemas de ensayo in vitro que, independientemente de los procesos de transporte dentro de la célula, hagan posible el ensayo de sustancias activas específicas. 20 Wolfe et al. (1999) describen un sistema in vitro para la medición de la actividad de la ?-secretasa. Para la puesta a punto del sistema se procesan membranas a partir de células que expresan PS1 de forma estable. Éstas se mezclan con el laáttH É lMHMililb plasmidio que codifica el polipéptido LC99 y se someten a una reacción in vitro de transcripción/traducción en presencia de 35S-metionina, formándose el sustrato de la ?- secretasa C99. La mezcla se incuba, a continuación, bajo condiciones adecuadas, en donde el fragmento C99 de APP se escinde proteolíticamente de la ?-secretasa y los productos de escisión se detectan por electroforesis en gel tras una inmunoprecipitación. En el marco de esta invención, LC99 representa una proteína de fusión entre el sustrato de la ?-secretasa C99 y una secuencia de señal (L: "leader" (inglés); Shoji et al., 1992). Breve Descripción de la Invención La presente invención pertenece al campo de los procedimientos para la detección de inhibidores específicos de la ?-secretasa que puedan ser utilizados para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en especial de procedimientos que puedan ser llevados a cabo in vitro. Adiciona±mente, esta invención se refiere a un equipo de ensayo con el que se puede realizar el procedimiento según la invención, así como al uso de este equipo de ensayo o del procedimiento para la detección de sustancias que inhiben específicamente la ?-secretasa. Otra forma de realización se refiere al uso de estas sustancias para la preparación de un , . medicamento para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y formulaciones farmacéuticas que contienen estas sustancias. Figuras Fig. 1: caracterización de la fracción microsómica SIII Se cultivaron células H4-ind/APP-LC99 en ausencia de doxiciclina durante tres días para inducir la expresión de LC99. Los PNS se prepararon de la forma descfita y se siguieron concentrando con gradientes graduales de sacarosa (Taylor et al., 1997) . A. Concentración del sustrato de ?-secretasa C99 en la fracción misrosómica SIII. Se transfirieron partes alícuotas (en cada caso 30 µg) del PNS y de la tracción microsónica (SIII) a un gel de SDS-poliacrilamida al 12%. A tal efecto, se preparó PNS a partir de células H4-ind/APP-LC99, cultivadas en presencia y en ausencia de doxiciclina. Las proteínas se transfirieron a una membrana de poli (difluoruro de vinilideno) (PVDF) (Poly Screen, New Lite Science) y se detectó C99 con el anticuerpo policlonal 5818 dirigido contra los últimos 20 aminoácidos de C99 (diluido a 1:1000; anticuerpo alternativo de acción equivalente: número de producto SAD 3138, Labgen) .

B. Concentración de las presenilinas en la fracción microsómica SIII. Se cargaron partes alícuotas (en cada caso 30 µg) del PNS y fracciones de los gradientes graduales de sacarosa en 5 un gel de SDS-paliacrilamida al 12% y las proteínas escindidas se transfirieron a una membrana de PVDF (Poly Screen, New Life Science) . Para la detección de las dos proteínas PS se utilizó el anticuerpo monoclonal BI.3D7 (específico para PSl CTF; 1:3000; Steiner et al., 1999) o el anticuerpo monoclonal BI-HFSC (específico para PS2 CTF; 1:3000; Steiner et al., 1999). Se pudo demostrar que los CTF de PS1 y PS2 se habían concentrado en la fracción SIII. No se pudo demostrar si la banda de proteína observada, con un peso molecular de aproximadamente 46-50 kDa, era PSl o PS2 de longitud completa. C. Caracterización de la fracción SIII por detección de proteínas marcadoras, características para determinados compartimientos Se cargaron partes alícuotas (en cada caso 30 µg) del PNS y fracciones de los gradientes graduales de sacarosa (9) en un gel de SDS-poliacrilamida al 12% y las proteínas escindidas se transfirieron a una membrana de PVDF (Poly Screen, New Life Science) . Para poner de manifiesto la concentración de membranas **** .«a^^aa*»* del retículo endoplásmico en la fracción SIII se utilizó un anticuerpo anti-calreticulina (Stressgen Biotechnologies; 1:2000). La distribución de membranas endosómicas en gradientes se demostró con ayuda de anticuerpos anti-rab5 (Transduction Laboratories Inc.). Fig. 2: Generación acelular de Aß 40 y Aß 42 de microsomas aislados A. Generación de novo de Aß en un sistema de ensayo de ?- secretasa acelular con microsomas aislados de células H4, transfectadas de forma estable con APP-LC99. Se prepararon microsomas de la manera descrita (Taylor et al., 1997) (fracción SIII) y se incubaron a 37°C o 4°C durante 4 horas bajo condiciones neutras (pH 6.8). Tras la incubación del sustrato C99, se inmunoprecipitaron los productos Aß340 y Aß42 con los anticuerpos 6E10 y 4G8 (Senetek, Gran Bretaña; Galli et al., 1998). De esta forma se pudo calcular la relación sustrato/producto. Para la precipitación de los péptidos- Aß40 y Aß42 solos7 se utilizaron los anticuerpos específicos BI.40 y BI.42. Las proteínas precipitadas se separaron con un gel de tris-bicina, se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa y se hicieron visibles con los anticuerpos 6E10 y 4G8, utilizándose para ello un procedimiento de transferencia Western altamente sensible (Ida et al., 1996). Para determinar el contenido intracelular basal de Aß, se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones directamente con la fracción microsómica almacenada a -80°C (pista c) . Los Aß40 y Aß42 generados in vi tro migran con los péptidos Aß sintéticos. Parte inferior: exposición más prolongada. B. Dependencia del tiempo de la generación ±n vitro de Aß La fracción SIII se preparó de la forma descrita y se incubó a 37°C ó 4°C bajo condiciones neutras (pH 6.8) durante el tiempo indicado. Los péptidos Aß se inmunoprecipitaron con los anticuerpos específicos BI.40 y BI.42. Las proteínas precipitadas se separaron por electroforesis en gel de tris-bicina (Klafki et al. 1996) y, a continuación, se detectaron con un procedimiento de transferencia Western altamente sensible con los anticuerpos 6E10 y 4G8 (Ida et al., 1996). Como patrón se utilizaron los péptidos Aß40 y Aß42 sintéticos. Después de 3-4 horas de incubación a 37 °C, la generación de novo de Aß alcanzó un máximo. Fig. 3: El producto de disociación de ?-secretasa Aß se degrada mediante una proteasa dependiente de Ca2+ La fracción SIII se creó de la forma descrita y se incubó bajo condiciones convencionales (37°C; pH 6.8; 4 horas) en presencia o ausencia de quelantes catiónicos tales como EDTA o BAPTA. Cono controles se incubaron los microsomas a 4°C en presencia de EDTA. Los péptidos Aß se inmunoprecipitaron con los anticuerpos específicos BI.40 y BI.42 y se detectaron por transferencia Western con los anticuerpos 6E10 y 4G8 (Senetek, Gran Bretaña; Galli et al., 1998) de la forma descrita. Como patrón servían los péptidos Aß40 y Aß42 sintéticos. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. En ausencia de un quelante, la producción de novo de Aß se ve drásticamente reducida. Tanto EDTA como BAPTA, que quela sólo iones Ca2+, determinan una cantidad superior de Aß de novo. Ello se puede explicar porqué Aß resulta degradado de nuevo inmediatamente después de su creación por una proteasa dependiente de Ca2+. Fig. 4: La ?-secretasa es una proteasa de transmembrana La fracción SIII se preparó de la forma descrita y se incubó bajo las condiciones convencionales (pH 6.8; EDTA mM; 4 horas) a 37°C ó 4°C como control. Las membranas microsómicas se lavaron con solución salina (KCl 1M) o se extrajeron con Na2C03 para separar de las membranas microsómicas las proteínas débilmente unidas. A tal efecto, las membranas granuladas se resuspendieron en un tampón de KCl (KCl 1M, sacarosa 250 mM, Hepes 20 mM, pH 6.8) y se incubaron durante 30 min. a 4°C. Para la extracción por Na2C03 las membranas se homogeneizaron en Na2C03 100 mM, pH 11.5 y se incubaron durante 30 min. a 0°C. Las membranas se incubaron a 220.000 g durante 1 hora a 4°C, se lavaron cuidadosamente con agua fría y con 1 ml de tampón de reacción (9) durante la homogeneización. Las membranas se centrifugaron como se ha descrito anteriormente y se resuspendieron en el tampón de reacción. Se congelaron partes alícuotas en nitrógeno líquido. Los péptidos Aß se inmunoprecipitaron con los anticuerpos específicos BI.40 y BI.42 y se detectaron de la forma descrita mediante transferencia Western con los anticuerpos 6E10 y 4G8. Como patrón se utilizaron los péptidos Aß40 y Aß42 sintéticos. Todas las reacciones se efectuaron por duplicado. Independientemente del tratamiento previo de las membranas, el contenido en Aß generado de novo fue prácticamente idéntico. Estos datos permiten presumir que la ?-secretasa es una proteasa que está firmemente unida a la membrana o que es una proteína de membrana integral. Fig. 5: El óptimo de pH para la actividad de ?-secretasa se encuentra entre pH 6.8 y 7.4 La fracción SIII se preparó de la forma descrita y se incubó a los valores indicados de pH bajo condiciones convencionales (pH 6.8; EDIA 5 mM; 4 horas). Los péptidos Aß se inmunoprecipitaron con los anticuerpos específicos BI.40 y BI.42 y se detectaron de la forma descrita por transferencia Western con los anticuerpos 6E10 y 4G8. Todas las reacciones se efectuaron por duplicado. Como control, se llevó a cabo la reacción in vi tro a 4°C y a pH 6.8. El óptimo de pH para la actividad in vi tro de la ?-secretasa se encuentra en el intervalo neutro entre pH 6.8 y pH 7.4. Tanto bajo condiciones de pH ligeramente ácido como básico, se encontró una actividad de ?-secretasa fuertemente reducida. Fig. 6: Efecto de un posible inhibidor de ?-secretasa en el sistema de ensayo acelular de ?-secretasa La fracción Sil: se preparó de la forma descrita y se incubó a un valor de pH de 6.8 bajo condiciones convencionales en presencia o ausencia de distintas concentraciones del compuesto A (Fig.: A) (pH 6.8; EDTA 5 mM; 4 horas) . Los péptidos Aß se inmunoprecipitaron con los anticuerpos específicos BI.40 y BI.42 y se detectaron de la forma descrita mediante transferencia Western con los anticuerpos 6E10 y 4G8 (Senetek; Gran Bretaña; Galli et al., 1998). Todas las reacciones se realizaron por duplicado o triplicado. Como control, las reacciones se efectuaron a 4°C.

A. El compuesto A mostró una inhibición dependiente de la concentración de la generación ip vitro de Aß. La cuantificación del Aß generado de novo se realizó con el Sistema de Formación de Imágenes por Quimioluminiscencia (Biorad) y aparece representado en la parte inferior. B. El compuesto A mostró una reducción dependiente de la concentración de Aß40 y Aß42 extracelulares. El compuesto A fue activo también en un sistema de ensayo celular, en el que se determina el contenido extracelular de Aß40 y Aß42 secretado por la línea celular U373 (U373: ATCC n° HTB 14). Esta línea celular U373/APP751 es una línea celular de astrocitoma que sobreexpresa la APP751 humana y secreta grandes cantidades de Aß40 (~1000 pg/ml/4 horas con 5xl07 células en 15 ml de medio) y Aß42 (-100 pg/ml/4 horas con 5xl07 células en 15 ml de medio) . La determinación tiene lugar sobre ELISA (ELISA: "Enzyme linked immunosorbent assay" (Steiner et al., 1998)). El compuesto A redujo fuertemente, de manera dependiente de la concentración, la secreción de Aß40, con lo cual aumentó ligeramente la secreción de Aß42 a dosis sub-inhibitorias, resultando igualmente inhibida más tarde a dosis superiores .

Fig. 7: Efecto de un inhibidor de ?-secretasa descrito en el sistema de ensayo acelular de ?-secretasa La fracción SIII se preparó de la forma descrita y se incubó a un valor de pH de 6.8 bajo condiciones convencionales en presencia o ausencia de diversas concentraciones del compuesto MG132 (N° de pedido de Biomol: PI-102; De Strooper et al., 1999) (pH 6.8; EDTA 5 mM; 4 horas) . Los péptidos Aß se inmunoprecipitaron con los anticuerpos específicos BI.40 y BI.42 y se detectaron de la forma descrita mediante transferencia Western con • los anticuerpos 6E10 y 4G8 (Senetek, Gran Bretaña; Galli et al., 1998). Todas las reacciones se llevaron a cabo por duplicado. Como controles las reacciones se efectuaron a 4°C o a 37°C sin inhibidor. A) El compuesto MG132 mostró una inhibición dependiente de la concentración de la generación in vitro de Aß. B) La cuantificación del Aß generado de novo se llevó a cabo con el Sistema de Formación de Imágenes por Quimioluminiscencia (Firma Biorad) y aparece representada en la parte inferior. Fig. 8: Caracterización del fraccionamiento microsómico de células H4indLC99 Se cultivaron células H4-ind/APP-LC99 en ausencia de doxiciclina durante tres días, para inducir la expresión de LC99. Las fracciones se prepararon de la forma descrita (Schroter en al., 1999). A) Detección de proteínas marcadoras, características para 5 determinados compartimientos Se cargaron partes alícuotas (en cada caso 30 µg) de las fracciones sobre un gel de SDS-poliacrilamida al 12% y las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de PVDF (Poly Screen, New Life Science) . Para demostrar la concentración de membranas del retículo endoplásmico en la fracción Mi, se utilizó un anticuerpo anti-PDI (Stressgen Biotechnologies; 1:2000). Como comparación, se co- transfirió la fracción SIII del primer fraccionamiento microsómico. PDI está concentrado en la primera fracción microsómica. La distribución de membranas lisosómicas en las fracciones se demostró con ayuda de anticuerpos anticatepsina D (Transduction Laboratories) Inc.; 1:1000). La fracción microsómica está exenta de proteínas lisosómicas. Como comparación se co-transfirió la PNS de las células H4IndLC99.

B) Formación de Aß acelular en la fracción microsómica Los microsomas (fracción Mi) se prepararon de la forma descrita y se incubaron a un valor de pH de 6.8 .bajo condiciones convencionales (pH 6.8; EDTA 5 mM; 4 horas). Los péptidos Aß se inmunoprecipitaron con los c|MM¿iateMtf|¡ß - anticuerpos específicos BI.40 y BI.42 y se detectaron de la descrita mediante transferencia Western con los anticuerpos 6E10 y 4G8 (Senetek, Gran Bretaña; Galli et al., 1998). Las incubaciones a 37°C se llevaron a cabo por 5 duplicado. En la fracción microsómica, así como también en la fracción endosómica, tiene lugar una formación de Aß. Descripción Detallada de la Invención La misión de poner a disposición un sistema mejorado de ensayo se ha podido resolver mediante la presente invención en el marco de la descripción y reivindicaciones. De acuerdo con la invención, se pone a disposición un sistema de ensayo in vi tro para el hallazgo de sustancias capaces de inhibir específicamente la ?-secretasa. En una forma adicional de realización de la invención, se da a conocer un equipo de ensayo para el hallazgo de sustancias capaces de inhibir específicamente ?-secretasa. Otra forma de realización de la invención es el uso del procedimiento según la invención o del equipo de ensayo según la invención para el hallazgo de sustancias capaces de inhibir específicamente la ?-secretasa. Además, se ponen a disposición sustancias que se pueden detectar con el procedimiento según la invención o con el equipo de ensayo según la invención. Una forma adicional de realización se refiere al uso de estas sustancias para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y formulaciones farmacéuticas que contienen estas sustancias. El procedimiento según la invención utiliza membranas purificadas, aisladas de células, que expresan de manera detectable un sustrato de la ?-secretasa y muestran actividad ?-secretasa. Por ?-secretasa se debe entender, en el marco de esta invención, una proteína que tiene la propiedad de escindir proteolíticamente la APP o fragmentos y de la misma, en especial el péptido C99 (Shoji et al., 1992), en p3 o Aß. Por lo tanto, para el procedimiento según la invención resultan adecuadas todas las células en las que el especialista puede detectar, mediante transferencia Western y el uso de anticuerpos específicos, un sustrato de la ?-secretasa o de sus productos de escisión. Membranas adecuadas son todas las membranas en las que el especialista, mediante— transferencia Western y uso de anticuerpos específicos, puede detectar un sustrato de la ?-secretasa, preferentemente membranas lisosómicas y endosómicas y, de forma especialmente preferida, membranas microsómicas. El técnico conoce procedimientos para la purificación específica de membranas a partir de "Methods in Enzymology", Vol. 219, título: "Reconstitution of intracellular Transport" y del libro "Biochemische Arbeits ethoden", T.G. Cooper, Editorial De Gruyter, 1981. Para la realización del procedimiento según la invención, tal como se describe en una forma de realización no limitante en el Ejemplo, se pueden transfectar células con una secuencia de ADN (ADN: ácido desoxirribonucleico) que codifica un sustrato de la ?-secretasa. En una forma de realización a título de ejemplo, se puede inducir la expresión de este sustrato mediante la deprivación de doxiciclina. Las células pueden ser abiertas y se puede preparar un sobrenadante post-nuclear (en inglés, "post nuclear supernatant", abreviatura PNS), el cual se continúa procesando para aislar, por ejemplo, la fracción microsómica. Esta fracción se puede incubar bajo condiciones adecuadas y se puede determinar la formación del producto de la reacción de la ?-secretasa con un sustrato adecuado por inmunoprecipitación y consecue_nte detección mediante anticuerpos adecuados en el procedimiento de transferencia Western. El sustrato de la ?-secretasa se ha podido encontrar en el PNS y, en una mayor concentración, en la fracción microsómica (Fiq. LA) . Los fragmentos C-terminales (CTF) de PS1 y PS2 se concentraron también en la fracción SIII (Fig. IB) . La fracción microsómica no contenía membranas endosómicas, pero los compartimientos de ER y Golgi estaban concentrados (Fig. 1C) . En las fracciones microsómicas, incubadas a 37°C (Fig. 2A) , se detectó Aß generado de novo . La incubación a 4°C impidió la formación de novo de Aß. Cantidades reducidas de Aß estaban condicionadas por la existencia de Aß intracelular en las fracciones microsómicas recién preparadas (Fig. 2A, pista c) . La formación de novo de Aß fue dependiente del tiempo y alcanzó su máximo después de 3 a 4 horas de incubación (Fig. 2B) . Sin embargo, una evaluación de la relación sustrato/producto demostró que la generación in vi tro de Aß no constituyó una reacción proteolítica eficaz (Fig. 2A) . La incubación de las membranas microsómicas en ausencia de EDTA dio lugar a una reducción drástica de la generación in vi tro de Aß (Fig.3). El quelante del calcio BAPTA tuvo el mismo efecto. Ello permite suponer que una proteasa dependiente de Ca2+, presente en la misma fracción, degrada el Aß. El tratamiento de las membranas microsómicas con KCl 1M en tampón o una extracción de estas membranas con Na2C03 0.1M a pH 11.5 antes de la realización del sistema de ensayo de ?-secretasa, demuestra que la ?-secretasa es estable frente a la membrana o, al menos, debe estar firmemente unida a la membrana (Fig. 4) . Al contrario que datos anteriormente publicados (Wolfe et al., 1999), el óptimo de pH determinado con este sistema de ensayo para la actividad de la ?-secretasa se encuentra en un valor de pH entre 6.8 y 7.4 (Fig. 5) . La generación de novo de Aß no se produjo a un pH 5 más básico (pH 8.0 hasta 8.5) ni más ácido (pH 6.0 hasta 6.4) . En una forma de realización según la invención, las membranas purificadas descritas, en especial membranas microsómicas, se mezclan con un tampón de reacción purificado y una sustancia de ensayo. Por sustancia de . ensayo se debe entender en el marco de esta invención cada sustancia que debe ser ensayada para determinar si puede actuar de manera inhibitoria sobre la actividad de la ?- secretasa. A continuación, la mezcla se incuba bajo coúdiciones en las que el sustrato de la ?-secretasa resulta escindido por la ausencia de la sustancia de ensayo. Seguidamente, se determina la cantidad de un producto—de escisión formado- y el valor obtenido se compara con el valor que se obtiene en ausencia de la sustancia de ensayo. Si la cantidad de producto de escisión formado en presencia de la sustancia de ensayo es inferior que en ausencia de la sustancia de ensayo, esta sustancia de ensayo inhibe la formación del producto de escisión y la sustancia de ensayo es un inhibidor de la ?-secretasa. En el estado de la técnica se han identificado, entre otros, compuestos que se han designado, como inhibidores específicos de la ?-secretasa y que ejercían una actividad inhibitoria sobre la secreción de Aß40 y Aß42, sin influir sobre la formación de Aß. Con el sistema de ensayo de ?-secretasa según la invención resulta posible ahora, de manera ventajosa, identificar y validar inhibidores específicos de la ?-secretasa, diferenciándolos de los inhibidores que impiden la secreción de Aß40 y Aß42. Tal como se describe en el Ejemplo, se ensayó un compuesto con el sistema de ensayo según la invención. El compuesto A c clorhidrato de [aS- (aR*,?R*,dR*) ] N-butil-?-hidroxi-a- (1-metiletil) - d [ (4-metilpentil) amino] ciclohexanohexanamida; véase el Ejemplo 20 del documento EP 778 266 Al) se preparó según los datos del Ejemplo 20 de la Solicitud de Patente Europea EP 778 266 Al y mostró una inhibición dependiente de la concentración de la generación de Aß, con un valor de CI50 de alrededor de 6 µM (Fig. 6A) . Se calcularon resultados similares con un sistema de ensayo que mide los Aß40 y Aß42 secretados en un ELISA cuantitativo, que es específico para ambos péptidos Aß (Steiner et al., 1998). En este caso, se utiliza una línea celular de astrocitoma (U373) que sobreexpresa el tipo salvaje APP751 y secreta cantidades detectables de ambas especies de Aß. Se observó una reducción dependiente de la concentración de la cantidad de Aß40 y Aß42 extracelular tras un tratamiento durante una noche con el compuesto A (Fig. 6B) . En una forma de realización de la invención se cultivan células que expresan un polipéptido endógeno que es un sustrato de la ?-secretasa. Por el término endógeno se debe entender, en el marco de esta invención, que esta célula o línea celular expresa el polipéptido señalado en cantidad suficiente, sin que sean necesarias manipulaciones adicionales, por ejemplo mediante métodos de tecnología génica. En el marco de la invención se debe entender por una cantidad suficiente de sustrato de la ?-secretasa una cantidad que, en un método de detección bioquímica establecido (por ejemplo, ELISA, transferencia Western), utilizando anticuerpos específicos, de una señal detectable que se encuentre por encima del fondo. En una forma de realización especialmente preferida de la invención se cultivan células que expresan un polipéptido exógeno que es un sustrato de la ?-secretasa. Por el término exógeno en el marco de esta invención se debe entender que esta célula o línea celular se manipula por medio de métodos de tecnología génica de tal forma que expresa el sustrato de ?-secretasa. Si la célula o línea celular contiene el sustrato de ?-secretasa también sin las mencionadas manipulaciones, se debe expresar por ese término que la cantidad del sustrato de ?-secretasa está mensurablemente elevado con respecto al valor sin manipulación. Para la preparación de una célula que exprese de forma exógena el sustrato de ?-secretasa, se puede incorporar una secuencia de nucleótidos que codifique la secuencia de aminoácidos del sustrato de ?-secretasa en un cásete de expresión adecuado de un vector de expresión eucariota. Casetes de expresión adecuados tienen un promotor funcional, en huéspedes eucariotas tal como, por ejemplo el promotor del citomegalovirus (promotor CMV) y una señal de poliadenilación funcional, por ejemplo del virus SV40 (en inglés: "Simian Virus"; abreviatura: SV) . Vectores de expresión adecuados son vectores que pueden replicaf~en huéspedes eucar?btas, es decir poseen un origen de replicación (en inglés: "Origin of replication") funcional. Estos vectores de expresión pueden estar situados, después de la transfección, de forma episómica o estar integrados en el genoma cuando portan las secuencias adecuadas que permiten la integración.

En una forma de realización preferida se utiliza un sistema de expresión que permite inducir la expresión del polipéptido exógeno, pudiéndose utilizar en este caso distintos sistemas tales como, por ejemplo el sistema "Tet-on o "Tet-off" (Patente de los EE.UU. 5.464.758; Gossen y Bujard, 1992, 1995, distribuido par Clontech, Heidelberg), o el sistema LacSwitch (véase la Patente de los EE.UU. 5.589.392; distribuido por Stratagene). En una' forma de realización especialmente preferida de la invención, se induce la expresión del sustrato de la ?-secretasa a través de la retirada de tetraciclina o doxiciclina (sistema "Tet- off") . Para ello se clona la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del sustrato de ?- secretasa, detrás al menos de una posición de unión del represor de tetraciclina. Adicionalmente, se encuentra en el mismo plasmidio, en un plasmidio adicional o integrada en el cromosoma otra secuencia de nucleótidos que codifica una proteína_ de fusión entre _el represor Tet y un dominio activador, ácido, que se puede expresar de forma constitutiva. Por dominio activador ácido se entiende un dominio proteico que posee una elevada fracción de aminoácidos ácidos y que posee la propiedad de inducir la transcripción de un gen cuando el dominio se incorpora en posición adecuada en el complejo de transcripción localizado delante del gen. Esta propiedad se puede determinar a través del denominado "Ensayo de un híbrido". Con este método, se fusiona un dominio que se une al ADN con un dominio a investigar, en donde el dominio que se une al ADN se fija a una secuencia que se encuentra delante de una prote'ina informadora, midiendo la actividad de la citada proteína informadora (Clontech, Heidelberg) . En el caso anteriormente descrito, no se producirá la expresión del sustrato de la ?-secretasa cuando la concentración de tetraciclina o de un derivado de tetraciclina tal como, por ejemplo, la doxiciclina en la célula supere un determinado valor, dado que el represor de tetraciclina fija la tetraciclina o su derivado, como consecuencia de lo cual no se fija en su posición de unión en el ADN y no induce, por tanto, la transcripción del gen situado detrás de esta posición de unión, que codifica el sustrato de la ?-secretasa. En ausencia de tetraciclina o un derivado de la misma, la proteína de fusión_ se une entre el represor Tet y el dominio de activación ácido en su posición de unión del ADN e induce la transcripción del gen situado detrás, que codifica el sustrato de la ?-secretasa. De esta forma, se garantiza que tenga lugar una expresión dirigida y controlada del sustrato de ?-secretasa.

^ « .. En una forma de realización de la invención, el sustrato de ?-secretasa es la proteína precursora del amiloide (APP; inglés: "amyloid precursor protein") o un fragmento de la misma, siempre que contenga la posición de corte de la ?-secretasa. En una forma preferida de realización de la invención, el sustrato de ?-secretasa es el fragmento C99 de la proteína precursora del amiloide (Shoji et al., 1992). El sustrato de ?-secretasa puede estar asociado, en general, a la membrana, pero preferentemente forma parte de la misma. Por formar parte de la membrana se ' debe entender, en el contexto de esta invención, que el sustrato es un componente integral de la membrana. Por asociado a la membrana se debe entender, en el marco de esta invención, que el sustrato está unido a la superficie de la membrana o está fijado a proteína integrales de la membrana. Esta definición de sustratos asociados a la membrana debe abarcar también sustratos que" interactúan a través de agrupamientos químicos con la parte hidrófoba de la membrana, aportados por modificaciones post- traslacionales. Adicionalmente, dentro de la expresión sustratos asociados a la membrana deben estar comprendidos también sustratos que interactúan a través de cadenas laterales de aminoácidos con la parte hidrófoba de la membrana, no obstante en menor grado que las proteínas integrales de la membrana. A modo de ejemplo se debe citar aquí la prostaglandína-sintetasa. En otra forma de realización de la invención, el sustrato de ?-secretasa es una proteína de fusión de una proteína informadora con una proteína precursora del amiloide o un fragmento de la misma, siempre que contenga la posición de corte de la ?-secretasa. En una forma preferida de realización, el sustrato de ?-secretasa es una proteína de fusión entre una proteína informadora y el fragmento C99. En el marco de esta invención, por proteína informadora se debe entender una proteína que posee la propiedad de generar una señal fácilmente detectable, cuya cantidad se correlaciona con la cantidad del producto de escisión que interesa. La generación de la señal tiene lugar a través de la determinación de la actividad enzimática de la proteína informadora con sustratos fácilmente detectables, o po£ la medición de la intensidad de fluorescencia de la proteína informadora. Ejemplos de proteínas informadoras son la proteína verde fluorescente (GFP; inglés: "green fluorescent protein"; véase, por ejemplo, el documento WO95/07463) , o derivados de la misma fluorescentes en otras longitudes de onda, o enzimas tales como la luciferasa, la fosfatasa alcalina secretora o la ß-galactosidasa. En esta forma de realización de la invención, la proteína de fusión del producto de escisión con la proteína informadora de la proteína de fusión del sustrato de ?-secretasa no escindida con la proteína informadora, se separa, por ejemplo, por inmunoprecipitación. Esto se puede llevar a cabo con anticuerpos que reconocen el producto de escisión de manera selectiva. A continuación, se determina la cantidad de proteína informadora con el procedimiento mencionado, que depende de las propiedades del mismo. Las proteínas de fusión citadas se pueden preparar mediante métodos de tecnología génica habituales (Sambrook et al., 1989) cuando está disponible el ADN que codifica la proteína informadora y el sustrato de ?-secretasa. El ADN, que codifica la proteína informadora, se puede obtener, por ejemplo, en proveedores comerciales tales como, por ejemplo, Clontech, Heidelberg, introduciéndolo por procedimientos convencionales (Sambrook et al., 1989) en los vectores deseados. El ADN que codifica el sustrato de ?-secretasa o el fragmento C99 se puede obtener con métodos convencionales a partir de bancos de genes adecuados (Sambrook et al., 1989). Para la realización de la invención resultan adecuadas todas las células o líneas celulares conocidas por el especialista, principalmente las células o líneas celulares eucariotas. Se prefieren las células o líneas celulares que se utilizan en la investigación neurológica o 5 neurobiológica, por ejemplo células o líneas celulares de mamíferos tales como H4, U373, NT2, HEK 293, PC12, COS, CHO, fibroblastos, células de mieloma, células de neuroblastoma, células de hibridoma, oocitos o células madres embrionarias. Adicionalmente resultan adecuadas las líneas celulares de insectos (por ejemplo, utilizando vectores de baculovirus tales como pPbac o pMbac (Stratagene, La Jolla, CA) ) , levaduras (por ejemplo, utilizando vectores de expresión de levaduras tales como pYESHIS (Invitrogen, CA) ) y hongos . 15 Se prefieren especialmente células o líneas celulares de origen neuronal o glial. En una forma de realización muy especialmente preferida de la invención, en el caso de las células utilizadas se trata de células H4, células de neuroglioma humano del cerebro, depositadas bajo el número de ATCC HTB-148 en la "American Type Culture Collection (ATCC)", en Manassas, Virginia, EE.UU. En una forma preferida de realización de la invención se utilizan membranas celulares purificadas, preferentemente membranas intracelulares y, de forma especialmente -a>^*--*¿-a preferida, membranas lisosómicas o endosómicas purificadas. De manera especialmente preferida se utilizan membranas microsómicas purificadas a partir de las células utilizadas por lisis de las células, separación de los núcleos celulares, purificación sobre gradientes de densidad de sacarOsa, sedimentación renovada por ultracentrifugación, homogeneización, sedimentación renovada por ultracentrifugación y homogeneización ' renovada. Procedimientos convencionales para la purificación de membranas se describen en Methods in Enzymology, Vol. 219, y en el libro "Biochemische Arbeitsmethoden", T.G. Cooper, Editorial De Gruyter, 1981. Fundamentalmente, resulta adecuada para la purificación de membranas la ultracentrifugación con gradientes de sacarosa, metrizamida, ficoll y yodoxanol. En una forma preferida de realización de la presente invención, el tampón de reacción tiene un valor de pH en el intervalo de 5-10, preferentemente en el intervalo de 6.0 hasta 8.0 y, de forma especialmente preferida, de 6.8 hasta 7.4 y contiene además, al menos, un estabilizador de membrana. Por estabilizador de membrana se debe entender en el marco de esta invención una sustancia que impide la agregación de las membranas. Por agregación de membranas se debe entender, en el marco de esta inv-ención, el fiBni- ' - apelmazamiento o la agregación y fusión eventualmente subsiguiente de vesículas o liposomas, o también las formaciones multilaminares. Esto se puede determinar por un incremento experimentalmente detectable de la turbidez o de 5 la dispersión de la luz de una solución o suspensión a investigar, pudiéndose establecer con, ello, asimismo, la propiedad de una sustancia en relación con su actividad estabilizadora de membrana. El estabilizador de membrana en el marco de esta invención es, preferentemente, sacarosa o sorbitol, si bien el especialista las pueda sustituir por sustancias con idéntica acción. Preferentemente, la concentración del estabilizador de membrana en el tampón de reacción se encuentra entre 200 y 1000 mM, preferentemente entre 200 y 500 mM y, de forma especialmente preferida, entre 200 y 300 mM. En una forma especialmente preferida de realización del procedimiento según la invención, el tampón de reacción contiene adicionalmente un agente complejante, preferentemente para iones bivalentes. Este puede ser, por ejemplo, ácido etilen-diamino-tetraacético (EDTA) o una sal del mismo, ácido 1, 2-bis (o-aminofenoxi) etano-N,N,N' ,N' - tetraacético (BAPTA) o una sal del mismo, o ácido etilenglicol-bis (b-aminoetil) -N,N,N' ,N' -tetraacético (EGTA) o una sal del mismo. El formador de complejos se encuentra -- —-*"*~r>Wrrrr— * -'' - - ' - • preferentemente en una concentración de 0.1 hasta 20 mM, preferentemente 5 hasta 10 mM. Como formadores de complejos se designan compuestos capaces de actuar como ligandos para la formación de complejos, es decir especialmente para la 5 complejación y el enmascaramiento de metales, en especial de iones metálicos bivalentes. Esta designación se utiliza a menudo como sinónimo de formadores de quelatos. En el procedimiento según la invención se pueden utilizar también otros formadores de complejos. 10 En una forma de realización de la invención, se añade adicionalmente un sistema regenerador de ATP a la tanda de reacción. Este sistema contiene adenosín-trifosfato (ATP), guanosin-trifosfato (GTP) , fosfocreatina, creatinin- fosfoquinasa, preferentemente en una concentración de ATP 1 mM, GTP 0.1 mM, fosfocreatina 8 mN, creatin-fosfoquinasa 31 mM a un valor de pH en el intervalo neutro, preferentemente entre 6.8 y 7.2, de forma especialmente preferida a un valor de pH de 7.0. En una forma preferida de realización de la invención, la determinación de la cantidad del producto de escisión se realiza por inmunoprecipitación o transferencia Western, preferentemente por una combinación de inmunoprecipitación y transferencia Western. La realización de la inmunoprecipitación y de la transferencia Western tiene **--*»* **-*< ** lugar de la forma descrita por Ida et al. (1996). Por transferencia Western se entiende un método en el que las proteínas se separan de acuerdo con su carga en estado nativo o, la mayoría de las veces, desnaturalizado por medio de electroforesis en gel, la mayoría de las veces, electíroforesis en gel de poliacrilamida, son transferidas a portadores tales como por ejemplo, nitrocelulosa o poli (difluoruro de vinilideno) y, a continuación, se detectan por medio de anticuerpos. En otra forma de realización de la invención, la determinación de la cantidad del producto de escisión se efectúa por enzimo-inmunoensayo (inglés: Enzyme-linked immunosorbent assay; abreviatura: ELISA) (Steiner et al., 1999), o por espectrometría de masas. En otra forma de realización de la invención, la determinación de la cantidad del producto de escisión se realiza determinando la cantidad de la proteína informadora fusionada al producto de escisión, después de haberla purificado de la proteína de fusión entre el sustrato de ?-secretasa no escindido y la proteína informadora. La cantidad de luciferasa, fosfatasa alcalina secretora o ß-galactosidasa fusionada al producto de escisión . se determina calculando la actividad enzimática de la proteína informadora tras la adición del sustrato. En otra forma de realización de la invención, la determinación de la cantidad de la proteína fluorescente verde o de un derivado de la misma tiene lugar mediante la medición de la intensidad de la luz de fluorescencia. Una forma preferida de realización de la invención es un equipo de ensayo según la invención para la detección de sustancias capaces de inhibir específicamente la ?- secretasa. Un equipo de ensayo es una composición de todos los componentes para el procedimiento según la invención. Ejemplos no limitantes de otros elementos para llevar a cabo el procedimiento según la invención son recipientes tales como, por ejemplo placas de 96 pocilios o placas de microtitulación, matraces de reacción, otros recipientes, superficies y sustratos adecuados, membranas tales como filtros de nitrocelulosa, reactivos de lavado y tampones o similares. Adicionalmente, un equipo de ensayo puede contener reactivos, que pueden detectar anticuerpos fijados,__ tales como, por ejemplo anticuerpos secundarios marcados, cromóforos y enzimas (por ejemplo, conjugadas al anticuerpo) , y sus sustratos u otras sustancias capaces de fijar anticuerpos. El equipo de ensayo según la invención contiene al menos membranas celulares purificadas a partir de células que muestran actividad de ?-secretasa y que contienen un sustrato de la ?-secretasa, y tampón" de reacción.

En una forma preferida de realización, las membranas son membranas intracelulares purificadas, preferentemente lisosómicas o endosómicas y, de forma especialmente preferida, membranas microsómicas. De manera especialmente preferida, las membranas han sido purificadas a partir de células que expresan de forma exógena un sustrato de la ?-secretasa. En una forma preferida de realización de la invención, el tampón de reacción tiene un valor de pH en el intervalo de 5-10, preferentemente en el intervalo de 6.0- 8.0 y, de forma especialmente preferida, en el intervalo de 6.8 hasta 7.4, y contiene como componentes adicionales todavía al menos un estabilizador de membrana según la invención, tal como ha sido descrito anteriormente. Preferentemente, la concentración del estabilizador de membrana, que es preferentemente sacarosa o sorbitol, en el tampón de reacción es de entre 200 y 1000 mM, preferentemente entre 200 y 500 mM y, de forma especialmente preferida, entre 200 y 300 mM. De manera especialmente preferida, el tampón de reacción contiene adicionalmente un formador de complejos según la invención, preferentemente para iones bivalentes. Como se ha descrito anteriormente, éste puede ser, por ejemplo, EDTA, BAPTA o EGTA, o una sal de los mismos. El formador de complejos se encuentra en una concentración de 0.1 hasta 20 mM, preferentemente 5 hasta 10 mM. En una forma de realización de la invención, el equipo de ensayo contiene adicionalmente un sistema regenerador del ATP según la invención como el descrito anteriormente, que se puede añadir a la tanda de reacción. En otra forma adicional de realización de la invención, el equipo de ensayo 4' contiene anticuerpos que permiten determinar la carítidad del producto de escisión por inmunoprecipitación o transferencia Western, preferentemente mediante una combinación de inmunoprecipitación y transferencia Western. En una forma preferida de realización de la invención, el procedimiento según la invención o el equipo de ensayo según la invención se utiliza para detectar sustancias capaces de inhibir específicamente la ?-secretasa. En otra forma de realización, se pone a disposición una sustancia que se puede detectar con el procedimiento según la invención o con el equipo de ensayo según la invención y que inhibe específicamente la escisión proteolítica de un sustrato de ?-secretasa. La sustancia según la invención se puede utilizar para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en especial de la enfermedad de Alzheimer. Adicionalmente, se ponen a disposición formulaciones farmacéuticas que contienen la **** sustancia según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede contener compuestos fisiológicamente aceptables que, por ejemplo, aumenten la estabilidad o la absorción de la sustancia según la invención. Tales compuestos fisiológicamente aceptables incluyen, por ejemplo, hidratos de carbono tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes tales como ascorbato o glutatión, formadores de quelatos, proteínas con bajo peso molecular u otros estabilizadores (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990)). El técnico sabe que la elección de un vehículo farmacéuticamente aceptable, incluido un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración.

Ejemplo 1 - Realización del sistema de ensayo 1.1 Preparación de una línea celular adecuada Se transfectaron células neurogliómicas H4 (numero de depósito HTB 148 en la "American Type Culture Collection" Manassas, Virginia, EE.UU.) bajo condiciones convencionales con el plasmidio regulador pUHD15-lneo (pUHD15-l-con gen de resistencia a la neomicina) , que porta el gen para un transactivador reprimible de la tetraciclina (Gossen y Bujard, 1992, 1995) . Mediante experimentos transitorios de transfección se seleccionó para la segunda transfección estable con la construcción APP-LC99 un clon individual que mostró una expresión transitoria estrictamente regulada y fuertemente inducible de un gen informador (pUHD10-3/ SEAP; SEAP: fosfatasa alcalina secretora) . Para la preparación de la construcción de APP-LC99 se clonó una secuencia que contiene la secuencia de señal N-terminal y los 99 últimos aminoácidos de la APP (Sho i et al., 1992), sobre las posiciones de corte por restricción BamHl y Sacll en el vector, de expresión controlado de tetraciclina pUHD10-3. Esta construcción se designó pUHD10-3/APP-LC99. El clon celular obtenido de la forma anteriormente descrita se co-transfectó con 10 µg de pUHD10-3/APP-LC99 y 1 µg de pTK-Hyg (Clontech, Heidelberg; Número de acceso de Genbank U40398) y se llevó a cabo la selección con el sistema de transfección Fugene de Boehringer Mannheim según las instrucciones del fabricante. Se investigaron clones celulares individuales, resistentes a la higromicina, mediante la retirada de doxiciclina y subsiguiente inmunofluorescencia y/o transferencia Western con un anticuerpo especifico para APP-CTF sobre la expresión inducible de LC99. El clon seleccionado se designó H4-ind/APP-LC99. 1.2 Tratamiento de una fracción microsómica a partir de células H4 LC99 Las células H4-ind/APP-LC99 se dejaron crecer a confluencia a 37°C, 5% de C02 con medio DMEM (DMEM: "Dulbecco's Modified Eagle Médium" (inglés), suministrado por la Firma BioWittacker) y suero de ternero fetal (inglés: "Fetal Calf Serum", FCS) al 10%, 1% de glutamina, 1% de penicilina y estreptomicina, en ausencia de doxiciclina sobre placas Petri de 15 cm. Mediante la retirada de doxiciclina se indujo la expresión de la proteína de fusión. Todas las etapas de la preparación del sobrenadante post-nuclear se llevaron a cabo sobre hielo o a 4°C. Las células se separaron con un rascador de células de las placas Petri tras la adición de 2 ml de PBS por placa Petri. Tras la centrifugación a 500 g durante 10 min. se volvieron a suspender cuidadosamente las células en tampón HIS (sacarosa 250 mM, imidazol 5 mM, HEPES 10 mM, pH 6.8), se volvieron a centrifugar a 1400 g durante 10 min. y, seguidamente, se volvieron a suspender en 300 µl de tampón HIS+ (tampón HIS con EDTA 5 mM) por placa Petri. El homogeneizado celular se comprimió con una aguja de calibre 22 utilizando una jeringa de 1 ml y se controló la lisis celular por microscopía de contraste de fase. El usado celular se centrifugó a 2500 g durante 10 min., "para separar el sobrenadante de las células intactas y de los fragmentos celulares. El PNS se siguió procesando con un gradiente gradual de sacarosa (Taylor et al., 1997), ajustándolo en primer lugar a KH2P04/K2HPO4 100 mM, pH 6.8. Todas las soluciones de sacarosa contenían KH2P04/K2HP04 100 mM, pH 6.8, MgCl2 5 mM y los inhibidores de proteasa leupeptina (10 µg/ml) y aprotinina (10 µg/ml) . El gradiente contenía etapas de sacarosa 1.3 M, 0.86 M y 0.5 M, que se recubrieron con el PNS ajustado y, a continuación, fueron centrifugados a 100.000 g durante 1.5 horas a 2°C. La capa intermedia entre sacarosa 1.3 M y 0.86 M es la fracción microsómica SIII. Para granular las membranas se ajustó la fracción SIII a sacarosa 250 mM con KH2HP04/K2HP04 100 mM. pH 6.8, y se centrífugo a 220.000 g durante 20 min. a 4°C. Las membranas se lavaron con tampón de reacción (sacarosa 250 mM, KCl 50 mM, acetato de magnesio 2.5 mM, HEPES 20 mM, pH 6.8, EDTA 5 mM) , se centrifugaron de la forma_ anteriormente descrita y se volvieron a suspender hasta homogeneidad en 1 ml de tampón de reacción. Se congelaron en nitrógeno líquido pequeñas partes alícuotas de la fracción microsómica y se almacenaron a -80°C. l il M« i líiii-litlr?i?rtiilÉi i ii- 1.3 Realización del sistema de ensayo del inhibidor de ?- secretasa La fracción microsómica congelada de las células H4- ind/APP-LC99 inducidas se descongeló sobre hielo y se 5 utilizaron respectivamente 10 µl para cada reacción exenta de células. Las muestras se diluyeron con tampón de reacción a 30 µl y se incubaron a temperaturas, valores de pH y tiempos determinados. Tras la incubación, las muestras se ajustaron a 2% de SDS y se calentaron a 95°C durante 5 minutos. A las muestras se añadieron 1 ml de tampón IP (NaCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7.4, EDTA 1 mM, 0.2% de NP40 y los inhibidores de proteasa aprotinina (10 µg/ml), leupeptina (10 µg/ml), 5 µg/ml de pepstatina, pefabloc 1 mM) y, respectivamente, 6 µg/ml de los anticuerpos específicos BI.40 y BI.42 (anticuerpos alternativos equivalentes se pueden obtener de QCB, Quality Control Biochemicals, Inc., Hopkinton, EE.UU.; números de catálogo 44-438 y 44- 344) . Después de una hora a 4°C, se añadieron 20 µl de esferas prelavadas de Gammabind-Sepharose G (Pharmacia Biotech) y se incubó durante una noche a 4°C. El inmunocomplejo de sefarosa se lavó con tampón IP y las proteínas precipitadas se eluyeron con 20 ml de tampón de muestras de Tris-bicma (Klafki et al., 1996). Las muestras -«--'*— * ****.**** -. se separaron por medio de electroforesis en tris-bicina gel de poliacrilamida de la forma descrita (Klafki et al., 1996) . Se utilizó el método altamente sensible ya descrito de transferencia Western con los anticuerpos 6E10 y 4G8 (números de producto mAb 200-10 y mAb 300-10, Senetek, Gran Bretaña; Galli et al., 1998) para detectar las especies de Aß inmunoprecipitadas (Ida et al., 1996). La f' quimioluminiscencia se detectó con el sustrato Western Star (Tropix) y se cuantificó con un sistema de detección por quimioluminiscencia de BioRad. 1.4 Obtención del citosol de hepatocito~ de cobaya A partir del hígado de un cobaya se obtuvo un sobrenadante post-nuclear (PNS) por homogeneización y centrifugación (Taylor et al., 1997) de la forma ya descrita. Este sobrenadante se aplica sobre un gradiente gradual de sacarosa (Taylor et al., 1997) y se centrífuga a 100.000 _g y 4°C durante 1.5 h. La fracción con sacarosa 500 mM se diluye con tampón lxKPi sobre sacarosa 250 mM y se centrífuga a 200.000 g y 4°C durante 20 minutos. El sobrenadante es el citosol (Jones et al., 1998). 1.5 Realización alternativa del sistema de ensayo del inhibidor de ?-secretasa con un sistema regenerador de ATP Una fracción microsómica purificada de estas células H4 recombinantes se incuba a 37°C con un sistema de tampón adecuado (KCl 50-150 mM, acetato de magnesio 1.5-5 mM, sacarosa 250 mM, Hepes 20 mM, pH 6.8), un sistema regenerador de ATP (ATP 1 mM, GTP 0.1 mM, pH 7.0; fosfocreatina 8 mM, creatinina-fosfoquinasa 31 mM) y citosol, tratado de la forma descrita en 1.2, y a continuación se mide la actividad de ?-secretasa a través de la detección del producto Aß por medio de transferencia Western, tal como se ha descrito anteriormente. Ejemplo - realización del sistema de ensayo 1.6 Tratamiento alternativo de una fracción microsómica a partir de células H4 LC99 Se utilizó la misma línea celular (clon celular de neurogli ma 114 con construcción APP-LC99) como se ha descrito en 1.1. Se dejó crecer hasta confluencia las células H4-ind/APP-LC99 a 37°C, 5% de C02 con medio DMEM (DNEM: "Dulbecco's Modified Eagle Mediun" (inglés), suministrado por la Firma BioWittaker) y suero de ternera fetal (inglés: "Fetal calf serum", FCS) al 10%, 1% de glutamina, 1% de penicilina y estreptomicina, en ausencia de doxiciclina, sobre placas Petri de 15 cm de tamaño. Tras la retirada de doxiciclina, se indujo la expresión de la proteína de fusión durante tres días. Todas las etapas de preparación del sobrenadante post-nuclear se llevaron a cabo sobre hielo o a 4°C. Para una tanda preparativa se trataron cada 10 veces 15 placas Petri. Las células se retiraron de la placa Petri tras la adición de 2 ml de PBS helado por placa Petri, por medio de un rascador de células. Todos los demás trabajos se llevaron a cabo de la forma descrita en Schroter et al. Tras la centrifugación a 500 g durante 10 min. las células se volvieron a suspender cuidadosamente en tampón ST (sacarosa 250 mM, Tris 10 mM, pH 7.4), se centrifugaron nuevamente a 1400xg durante 10 min. y, a continuación, todas las células se volvieron a suspender en 5 ml de tampón ST. Las células se homogeneizaron con un crisol de 5 ml (Firma Braun, Melsungen) con 500 rpm y la lisis celular se controló por microscopía de contraste de fase. El lisado celular se centrifugó primeramente a 2000xg durante 2 min., para sedimentar las células intactas y los fragmentos celulares grandes. A continuación, el sobrenadante se centrifugó a 4000xg durante 2 min., para separar las membranas celulares y los núcleos celulares (fracción PN) . El sedimento compuesto por núcleos celulares - y membranas plasmáticas se lavó dos veces con tampón ST y se centrifugó de la forma anteriormente descrita. Los sobrenadantes se reunieron y se centrifugaron en un nuevo recipiente a lOOOOOxg durante 2 min., para separar mitocondrias, lisosonas y endosomas (fracción EL) . Para sedimentar, a continuación, los microsomas reunidos, el sobrenadante se centrifugó a 400000xg. Para la separación de los lisosomas y de los endosomas, se siguió tratando la fracción EL. Los lisosomas se reventaron mediante una lisis hipotónica de 10 minutos sobre hielo (Bohley et al., 1969) y los endosomas intactos sedimentaron a continuación a lOOOOOxg durante 2 min. (lisosomas = fracción L; endosomas = fracción E) . Para la caracterización de la separación se depositaron 30 µg de la proteína total de cada fracción sobre un gel de poliacrilamida y se detectó la distribución de las diferentes proteínas marcadoras de los distintos compartimientos en las fracciones en el procedimiento de transferencia Western. Las membranas endosómicas y microsómicas se recogieron con tampón de reacción (sacarosa 250 mM, KCl 50 mM, acetato de magnesio 2.5 mM, HEPES 20 mM, pH 6.8, EDTA 5 mM) y se volvieron a suspender hasta homogeneidad en 1 ml de tampón de reacción. Se congelaron en nitrógeno líquido pequeñas partes alícuotas de las distintas fracciones y sé" almacenaron a -80°C. A continuación, se lleva a cabo de manera inalterada el sistema de ensayo de inhibidor de ?-secretasa de la forma descrita en 1.3.

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Claims (43)

1. RE I V I N D I CAC I ON E S Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Procedimiento para la detección de sustancias capaces de inhibir específicamente la ?-secretasa, caracterizado porque: a) se preparan membranas purificadas a partir de células que muestran actividad ?-secretasa y contienen un sustrato de la ?-secretasa, b) estas membranas se mezclan con tampón de reacción y una sustancia de ensayo, c) esta mezcla se incuba en condiciones bajo las cuales el sustrato de la ?-secretasa se escinde por ausencia de la sustancia de ensayo, d) se determina la cantidad de un producto de escisión formado, y e) — el valor obtenido se compara con el valor que se obtiene en ausencia de la sustancia de ensayo.
2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se cultivan células que expresan un polipéptido endógeno que es un sustrato de la ?-secretasa.
3. 3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se cultivan células que expresan un polipéptido exógeno que es un sustrato de la ?-secretasa.
4. 4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la expresión del polipéptido exógeno es inducible.
5. 5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la expresión del sustrato de la ?-secretasa se puede inducir por la retirada de tetraciclina o de un derivado de la tetraciclina.
6. 6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el sustrato de la ?-secretasa es la proteína precursora del amiloide o un fragmento de la misma.
7. 7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque el fragmento de la proteína precursora del amiloide es el fragmento C99.
8. 8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el sustrato de la ?-secretasa es una proteína de fusión de la proteína precursora del amiloide o un fragmento de la misma, en especial del fragmento C99, con una proteína informadora.
9. 9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la proteína informadora es la proteína fluorescente verde o un derivado de la misma, la luciferasa, la fosfatasa alcalina secretora o la ß- galactosidasa.
10. 10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque las células son de origen neuronal o glial .
11. 11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque las células son células H4.
12. 12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque las membranas son membranas celulares, preferentemente membranas intracelulares.
13. 13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque las membranas son membranas lisosómicas o endosómicas.
14. 14. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque las membranas son membranas microsómicas.
15. 15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque las membranas microsómicas se purifican a través de las siguientes etapas: a) lisis de las células, b) separación de los núcleos celulares, c) purificación sobre gradientes de densidad de sacarosa, d) sedimentación renovada por ultracentrifugación, e) homogeneización, f) sedimentación renovada por ultracentrifugación, y g) homogeneización renovada.
16. 16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, (Caracterizado porque el valor de pH del tampón de reacción se encuentra en el intervalo de 5-10, preferentemente en el intervalo de 6.0-8.0, de forma especialmente preferida de 6.8 a 7.4 y contiene como componentes adicionales, por lo menos, un estabilizador de membrana.
17. 17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque el estabilizador de membrana es sacarosa o sorbitol.
18. 18. Procedimiento según la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque la concentración del estabilizador de membrana se encuentra entre 200 y 1000 mM, preferentemente entre 200 y 500 mM y, de forma especialmente preferida, entre 200 y 300 mM.
19. 19. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el tampón de reacción contiene, adicionalmenté, un formador de complejos.
20. 20. Procedimiento según la reivindicación 19, caracterizado porque el formador de complejos es -EDTA, EGTA o BAPTA, o una sal de los mismos.
21. 21. Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado porque EDTA, EGTA o BAPTA, o la sal de los mismos, está presente en una concentración de 0.1 hasta 5 20 mM, preferentemente de 5 hasta 10 mM.
22. 22. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque, adicionalmente, se añade a la tanda de reacción un sistema regenerador de ATP.
23. 23. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10 22, caracterizado porque la determinación de la cantidad del producto de escisión tiene lugar por inmunoprecipitación o transferencia Western, preferentemente mediante una combinación de inmunoprecipitación y transferencia Western.
24. 24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15 23, caracterizado porque la determinación de la cantidad del producto de escisión tiene lugar por ELISA.
25. 25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque la determinación de la cantidad del producto de escisión tiene lugar por espectrometría de masas. 20
26. 26. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 a 22, caracterizado porque la determinación de la cantidad del producto de escisión tiene lugar por la determinación de la cantidad de proteína informadora fusionada al producto de escisión. * ---•*** a .
27. 27. Procedimiento según la reivindicación 26, caracterizado porque la cantidad de luciferasa, fosfatasa alcalina secretora o ß-galactosidasa fusionada al producto de escisión tiene lugar mediante la determinación de la actividad enzimática tras la adición del sustrato.
28. 28. Procedimiento según la reivindicación 26, caracterizado porque la determinación de la cantidad de la proteína fluorescente verde o de un derivado de la misma tiene lugar por la medición de la intensidad de la luz de fluorescencia.
29. 29. Equipo de ensayo para la detección de sustancias capaces de inhibir específicamente la ?-secretasa, caracterizado porque el equipo de ensayo contiene, por lo menos, membranas purificadas de células que tienen actividad de ?-secretasa y contienen un sustrato de la ?-secretasa, y tampón de reacción.
30. 30. Equipo de ensayo según la reivindicación 29, caracterizado porque las— membranas son membranas lisosómicas o endosómicas, preferentemente microsómicas.
31. 31. Equipo de ensayo según las reivindicaciones 29 a 30, caracterizado porque las células expresande forma exógena un sustrato de la ?-secretasa.
32. 32. Equipo de ensayo según una de las reivindicaciones 29 a 31, caracterizado porque el tampón de reacción tiene un valor de pH en el intervalo de 5-10, preferentemente en el intervalo de 6.0-8.0, de forma especialmente preferida en el intervalo de 6.8 a 7.4 y, como componentes adicionales, contiene, por lo menos, un estabilizador de membrana .
33. 33. Equipo de ensayo según la reivindicación 32, caracterizado porque el estabilizador de membrana es sacarosa o sorbitol.
34. 34. Equipo de ensayo según la reivindicación 32 ó 33, caracterizado porque la concentración del estabilizador de membrana en el tampón de reacción se encuentra entre 200 y 1000 mM, preferentemente entre 200 y 500 mM y, de forma especialmente preferida, entre 200 y 300 mM.
35. 35. Equipo de ensayo según una de las reivindicaciones 29 a 34, caracterizado porque el tampón de reacción contiene, adicionalmente, un agente complejante.
36. 36. Equipo de ensayo según la reivindicación 35, caracterizado porque el agente complejante es EDTA, EGTA o BAPTA, o una sal de los mismos.
37. 37. Equipo de ensayo según la reivindicación 36, caracterizado porque EDTA, EGTA o BAPTA, o una sal de los mismos se encuentra en una concentración de 0.1 hasta 20 mM, preferentemente 5 hasta 10 mM.
38. 38. Equipo de ensayo según una de las reivindicaciones 29 a 37, caracterizado porque el equipo de ensayo contiene, adicionalmente, un sistema regenerador de ATP.
39. 39. Equipo de ensayo según una de las reivindicaciones 29 a 38, caracterizado porque la determinación de la cantidad del producto de escisión tiene lugar por inmunoprecipitación o transferencia Western, preferentemente por una combinación de inmunoprecipitación y transferencia Western.
40. 40. Uso de un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 28, o de un equipo de ensayo según una de las reivindicaciones 29 a 39 para la detección de sustancias capaces de inhibir específicamente ?-secretasa.
41. 41. Sustancia detectable con un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 28, o un equipo de ensayo según una de las reivindicaciones 29 a 39, caracterizada porque inhibe específicamente la escisión proteolítica de un sustrato_de la ?-secretasa. _
42. 42. Uso de una sustancia según la reivindicación 41 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en especial de la enfermedad de Alzheimer.
43. 43. Formulación farmacéutica que contiene una sustancia según la reivindicación 41.