JP2003508058A - γ−セクレターゼインビトロテストシステム - Google Patents

γ−セクレターゼインビトロテストシステム

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クラウス フッフス
マルクス コストカ
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ベーリンガー インゲルハイム ファルマ コマンディトゲゼルシャフト
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、神経変性障害の治療に使用できる特異的γ−セクレターゼインヒビターの同定方法、特にインビトロ実施可能な方法に関する。本発明は、この方法を使用のために使用可能なテストキット、さらに特異的にγ−セクレターゼを阻害する物質を同定するためのこのテストキット又は方法の使用にも関する。さらなる実施形態は、神経変性障害を治療するための薬物製造のためのこれら物質の使用及び前記物質を含有する医薬品製剤に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の技術分野 本発明は、神経変性障害の治療に使用できる特異的γ−セクレターゼインヒビ
ターの発見方法、特にインビトロ実施可能な方法の分野に関する。この発明は、
さらに本発明の方法を実施可能なテストキット、及びこのテストキット又はγ−
セクレターゼを特異的に阻害する物質の発見方法の使用に関する。別の実施形態
は、神経変性障害の治療用薬物を調製するためのこれら物質の使用及びこれら物
質を含有する医薬品製剤に関する。
【０００２】 発明の背景 タンパク質の凝集及び沈殿は、アルツハイマー病、パーキンソン病及びセント
ヴィッツ舞踏病（“ハンチントン舞踏病”）のような種々の神経変性障害の原因
に関係があるとされている。アルツハイマー病では、アミロイドβ−ペプチド（
Ａβ）が凝集して、この病気の病理学的マーカーの１つを構成する不溶性老化プ
ラークの原因となる（Selkoeら,1996）。Ａβは、前駆タンパク質、アミロイド
前駆タンパク質（APP）のタンパク質分解的分解によって形成される。APPを代謝
する２つの方法、非アミロイド形成的方法及びアミロイド形成的方法が認められ
ている（Selkoe,1991,1994）。 APPの非アミロイド形成的代謝では、α−セクレターゼがAPPのＡβ領域内で分
裂し、こうしてタンパク質（α-APPs）のＮ−末端領域の分泌、そしてγ−セク
レターゼ切断が起こった後、p3の遊離となる。対照的に、アミロイド形成的ルー
トは、Ａβの形成、それぞれＡβのＮ−終端（β−セクレターゼ）及びＣ−終端
（γ−セクレターゼ）を産生する２つのプロテアーゼの形成につながる。
【０００３】 Ａβは、ヒト血漿及び脳脊髄液内でインビボ検出されうる。細胞培養では、AP
P若しくはその断片を内因的に発現又は過剰発現する種々のタイプの細胞の細胞
培養上清内でも分泌されたＡβを検出できる。Ａβ産生ひいてはアミロイドプラ
ークの形成は、両方とも種々の遺伝的危険因子によって影響される。これら因子
としては、相同タンパク質プレセニリン１とプレセニリン２及びAPP自体におけ
る変異が挙げられる。家族性アルツハイマー病（FAD）のアルツハイマー病患者
の線維芽細胞についてのこれら変異の解析は、それらがＡβの形成に及ぼす影響
を示した。これは、形質移入された細胞及びトランスジェニック動物についての
研究によって確認された。すべての変異はＡβの産生を増加し、プレセニリンの
場合、変異は、より長いＡβ変異体、Ａβ42の選択的増加につながる（Selkoe,1
996；Price,1998）。このペプチドは、より短い形態、Ａβ40より広範囲に凝集
し、また散在性プラーク内及びＡβ40と一緒に老化プラーク内で見られる（Leme
reら,1996；Mannら,1996）。この変異の影響に加え、野生型のプレセニリンもＡ
βの生理学的産生において基礎機能を有することの指標がある。PS1遺伝子（PS
：プレセニリン）が遺伝子工学によってスイッチオフされたマウス胎仔の神経細
胞では、Ａβ40及びＡβ42の大幅な減少が検出された。さらに、APPのＣ−末端
断片はこれら細胞内に蓄積し、プレセニリンがγ−セクレターゼを活性化するか
、又はそれ自体がγ−セクレターゼ活性を有するという仮説をもたらす（De Str
ooperら,1998；Sisodiaら,1998）。まず、プレセニリン１の保存アスパルテート
に関する変異の研究と合わせたインビトロテストシステムにより、プレセニリン
が、膜内におけるγ−セクレターゼ切断の原因である特異的な自己触媒的活性の
アスパラギン酸プロテアーゼであるという仮説を導いた（Wolfeら,1999）。
【０００４】 Ａβの産生ひいてはアルツハイマー病の発症の重大な段階としてのγ−セクレ
ターゼの同定についての議論は、今日に至るまで結論されていない。これとは全
く別に、このプロテアーゼは、その活性を選択的に低減するインヒビターを発見
することにより、Ａβ形成プロセスで薬理学的に介在する興味深い標的である。
この理由のため、動物モデル及び細胞アッセイに加え、細胞内における輸送プロ
セスの特異的な活性物質を独立的に試験できるインビトロテストシステムを開発
することが重要である。
【０００５】 Wolfeらは（1999）、γ−セクレターゼの活性を測定するためのインビトロシ
ステムを示した。このシステムを調製するため、安定的にPS1を発現する細胞由
来の膜が作られる。それらを、LC99ポリペプチドをコードするプラスミドと混ぜ
、かつ35Ｓ-メチオニンの存在下における転写／翻訳のインビトロ反応に供し、
γ−セクレターゼ基質C99を生成する。混合物を適切な条件下インキュベートし
、その間にAPPのC99断片がタンパク質分解的にγ−セクレターゼから***され、
その分解産物は、免疫沈降後ゲル電気泳動法によって検出される。本発明の範囲
内のLC99は、γ−セクレターゼ基質C99とシグナル配列（L：「リーダー」；Shoj
iら,1992）の融合タンパク質を意味する。
【０００６】 発明の簡単な概要 本発明は、神経変性障害の治療に使用できる特異的γ−セクレターゼインヒビ
ターの発見方法、特にインビトロ実施可能な方法の範囲内である。この発明は、
さらに本発明の方法を実施可能なテストキット、及びこのテストキットの使用又
は特異的にγ−セクレターゼを阻害する物質の発見方法の使用に関する。別の実
施形態は、神経変性障害を治療するための薬物調製のためのこれら物質の使用及
びこれら物質を含有する医薬品製剤に関する。
【０００７】 図面 図１：ミクロソームフラクションSIIIの特徴づけ LC99の発現を誘発するため、H4-ind/APP-LC99細胞を３日間ドキシサイクリン
の非存在下で成長させた。記載どおりに、後核上清（PNS）を調製し、さらにシ
ョ糖段階勾配を用いて濃縮した（Taylorら,1997）。 Ａ．ミクロソームフラクションSIII中のγ−セクレターゼ基質C99の濃度 一定分量（各場合に30μg）のPNS及びミクロソームフラクション（SIII）を12
％SDS-ポリアクリルアミドゲル上に置いた。この目的のため、PNSは、ドキシサ
イクリンの存在下及び非存在下で成長したH4-ind/APP-LC99細胞から調製した。
タンパク質をポリ二フッ化ビニリデン（PVDF）膜（Poly Screen,New Life Scien
ce）に移し、かつC99は、C99の最下位アミノ酸に対して配向されるポリクロナー
ル抗体5818（希釈1:1000；同一活性の代替抗体：製品番号SAD 3138,Labgen）で
検出した。 Ｂ．ミクロソームフラクションSIII中のプレセニリンの濃度 一定分量（各場合に30μg）のPNS及びショ糖段階勾配のフラクションを12％SD
Sポリアクリルアミドゲル上に装填し、分離されたタンパク質をPVDF膜（Poly Sc
reen,New Life Science）に移した。２つのPSタンパク質を検出するため、モノ
クロナール抗体BI.3D7（PS1 CTF-特異性；1:3000；Steinerら,1999）又はモノク
ロナール抗体BI-HF5C（PS2 CTF-特異性；1:3000；Steinerら,1999）のどちらか
を用いた。PS1及びPS2のCTFsは、SIIIフラクション内で濃縮されたことが分かっ
た。各場合に約46〜50kDaの分子量で観察されるタンパク質バンドが全長PS1又は
PS2であるかどうかを見分けることはできなかった。 Ｃ．特定区画の特徴である標識タンパク質の検出によるSIIIフラクションの特 徴づけ 一定分量（各場合に30μg）のPNS及びショ糖段階勾配（９）を12％SDSポリア
クリルアミドゲル上に装填し、分離されたタンパク質をPVDF膜（Poly Screen,Ne
w Life Science）に移した。 SIIIフラクション中の原形質内細網の膜の濃度を実証するため、抗−カルレテ
ィキュリン抗体（Stressgen Biotechnologies；1:2000）を用いた。勾配内のエ
ンドソーム膜の分布は、抗−rab5抗体（Transduction Laboratories Inc.）を用
いて示した。
【０００８】 図２：単離されたミクロソームからのＡβ40及びＡβ42の無細胞産生 Ａ．APP-LC99で安定的に形質移入されたH4細胞の単離ミクロソームによる無細
胞γ−セクレターゼテストシステムにおけるデノボ(de novo)Ａβ産生。記載ど
おりにミクロソームを調製し（Taylorら,1997）（SIII-フラクション）、かつ37
℃又は４℃で４時間、中性条件下（ｐＨ6.8）でインキュベートした。基質C99の
インキュベーション後、その産物Ａβ40及びＡβ42を抗体6E10及び4G8（Senetek
,Great Britain；Galliら,1998）で免疫沈降させた。このように、基質／産物比
を評価できる。Ａβ40及びＡβ42ペプチドだけを沈降させるため、特異的な抗体
BI.40及びBI.42を使用した。沈降タンパク質をトリス−ビシンゲルで分離し、ニ
トロセルロース膜に移し、高感度ウェスタンブロット手順（Idaら,1996）を用い
て抗体6E10及び4G8で可視化した。基本的な細胞内Ａβ含量を決定するため、-80
℃で貯蔵されたミクロソームフラクションで直接免疫沈降を行った（レーンＣ）
。インビトロ産生されたＡβ40及びＡβ42は、合成Ａβペプチドと共に移動する
。低部：より長い露出。 Ｂ．Ａβのインビトロ産生の時間依存性 記載どおりにSIIIフラクションを調製し、中性条件下（ｐＨ6.8）37℃又は４
℃で規定時間インキュベートした。Ａβペプチドを、特異的な抗体BI.40及びBI.
42で免疫沈降させた。沈降タンパク質をトリス−ビシンゲル電気泳動法（Klafki
ら,1996）で分離してから抗体6E10及び4G8を用いて高感度ウエスタンブロット手
順で検出した（Idaら,1996）。標準物質として合成Ａβ40及びＡβ42ペプチドを
使用した。37℃における３〜４時間のインキュベーション後、Ａβのデノボ産生
がピークに達した。
【０００９】 図３：γ−セクレターゼ分解産物Ａβは、Ｃａ2+依存性プロテアーゼによって 分解される 記載どおりにSIIIフラクションを生成し、標準条件下（37℃；ｐＨ6.8；４時
間）、EDTA又はBAPTAのようなカチオンキレート剤の存在下又は非存在下でイン
キュベートした。対照としてミクロソームをEDTAの存在下４℃でインキュベート
した。Ａβペプチドを特異的抗体BI.40及びBI.42で免疫沈降させ、かつ抗体6E10
及び4G8を用いて、記載どおりにウエスタンブロットで検出した（Senetek,Great
Britain；Galliら,1998）。標準物質として合成ペプチドＡβ40及びＡβ42を使
用した。全反応を３回行った。キレート剤不存在下で、デノボＡβ産生は劇的に
減少する。Ｃａ2+イオンのみをキレート化するEDTA及びBAPTAは両方とも大量の
Ａβデノボをもたらす。このことは、Ａβが、産生直後にＣａ2+依存性プロテア
ーゼによって再び分解されるという事実によって説明できる。
【００１０】 図４：γ−セクレターゼは膜貫通プロテアーゼである 記載どおりにSIIIフラクションを調製し、標準条件下（ｐＨ6.8；５mM EDTA；
４時間）、37℃又は対照として４℃でインキュベートした。弱く結合されたタン
パク質をミクロソーム膜から除去するため、ミクロソーム膜を高生理食塩水（１
Ｍ KCl）で洗浄するか、又はNa2CO3で抽出した。これを行うため、ペレット化膜
をKCl緩衝液（１Ｍ KCl，250mMショ糖，20mM Hepes，ｐＨ6.8）に再懸濁させ、3
0分間４℃でインキュベートした。Na2CO3抽出については、膜を100mM Na2CO3、
ｐＨ11.5内でホモジネートし、かつ30分間０℃でインキュベートした。膜を220.
000ｇで１時間４℃でインキュベートし、慎重に冷却水で洗浄し、かつ均質化の
際に１mlの反応緩衝液（９）で洗浄した。記載どおりに膜を遠心分離し、反応緩
衝液に再懸濁させた。一定分量を液体窒素中で凍結した。特異的抗体BI.40及びB
I.42を用いてＡβペプチドを免疫沈降させ、抗体6E10及び4G8でウエスタンブロ
ットによって検出した。標準物質として合成ペプチドＡβ40及びＡβ42を使用し
た。全反応を二通り行った。膜の前処理とは関係なく、デノボ産生されたＡβの
含量は、実質的に同一だった。これらデータは、γ−セクレターゼが、膜に固定
して結合されているか、又は一体膜タンパク質であると仮定する手がかりとなる
。
【００１１】 図５：γ−セクレターゼ活性にとって最適なｐＨは、ｐＨ6.8〜7.4である。 SIIIフラクションを記載どおりに調製し、標準条件下（ｐＨ6.8；５mM EDTA；
４時間）、規定されたｐＨ値でインキュベートした。特異的抗体BI.40及びBI.42
を用いてＡβペプチドを免疫沈降させ、抗体6E10及び4G8でウエスタンブロット
によって検出した。全反応を二通り行った。対照として、インビトロ反応を４℃
かつｐＨ6.8で行った。インビトロγ−セクレターゼ活性にとって最適のｐＨは
、ｐＨ6.8〜ｐＨ7.4の中性範囲内である。わずかに酸性及び塩基性ｐＨの両条件
下でγ−セクレターゼ活性の急激な減少が見られた。
【００１２】 図６：無細胞γ−セクレターゼテストシステムにおいて考えられるγ−セクレ ターゼインヒビターの効果 記載どおりにSIIIフラクションを調製し、ｐＨ6.8、標準条件下、種々の濃度
の化合物Ａ（図：Ａ）の存在下又は非存在下でインキュベートした（ｐＨ6.8；
５mM EDTA；４時間）。特異的抗体BI.40及びBI.42を用いてＡβペプチドを免疫
沈降させ、抗体6E10及び4G8でウエスタンブロットによって検出した（Senetek,G
reat Britain；Galliら,1998）。全反応を二通り又は三通り行った。対照として
、４℃で反応を行った。 Ａ．化合物Ａは、Ａβのインビトロ産生の濃度依存性の阻害を示した。デノボ
産生されたＡβは、化学発光画像処理システム（Biorad）で定量し、これは低部
に示される。 Ｂ．化合物Ａは、細胞外Ａβ40及びＡβ42の濃度依存性減少を示した。 化合物Ａは、U373細胞系（U373：ATCC番号 HTB 14）によって分泌されるＡβ4
0及びＡβ42の細胞外含量を決定する細胞テストシステムにおいても活性だった
。この細胞系U373/APP751は、ヒトAPP751を過剰発現し、かつ大量のＡβ40（〜1
000pg/ml/４時間、15mlの培地中５×107個の細胞で）及びＡβ42（〜100pg/ml/
４時間、15mlの培地中５×107個の細胞で）を分泌する星状細胞腫細胞系である
。分析はELISAを用いて行った（ELISA：“酵素結合免疫吸着検定法”（Steiner
ら,1998））。化合物Ａによって、阻害用量以下ではＡβ42の分泌をわずかに高
め、それからまた、より高用量ではそれを阻害するという濃度依存的様式で、Ａ
β40分泌がはっきりと減少した。
【００１３】 図７：無細胞γ−セクレターゼテストシステムで述べたようなγ−セクレター ゼインヒビターの効果 記載どおりにSIIIフラクションを調製し、ｐＨ6.8で、標準条件下、種々の濃
度の化合物MG132（Biomol注文番号：PI-102；De Strooperら,1999）の存在下又
は非存在下でインキュベートした（ｐＨ6.8；５mM EDTA；４時間）。記載どおり
に、特異的抗体BI.40及びBI.42を用いてＡβペプチドを免疫沈降させ、抗体6E10
及び4G8でウエスタンブロットによって検出した（Senetek,Great Britain；Gall
iら,1998）。全反応を二通り行った。対照として、４℃で又は37℃でいかなるイ
ンヒビターも無しで行った。 Ａ）化合物MG132は、Ａβのインビトロ産生の濃度依存的阻害を示した。 Ｂ）デノボ産生されたＡβの定量は、化学発光画像処理システム（Biorad）を使
用して行い、低部に示される。
【００１４】 図８：H4-indLC99細胞のミクロソームフラクションの特徴づけ LC99の発現を誘発するため、ドキシサイクリンの非存在下３日間H4-ind/APP-L
C99細胞を成長させた。記載どおりにフラクションを調製した（Schroterら,1999
）。 Ａ）特定区画の特徴である標識タンパク質の検出 一定分量の（各場合に30μg）フラクションを12％SDSポリアクリルアミドゲル
上に装填し、分離されたタンパク質をPVDF膜上に移した（Poly Screen,New Life
Science）。Ｍｉフラクション中の原形質内細網の膜の濃度を示すため、抗−PD
I抗体（Stressgen Biotechnologies；１:2000）を用いた。比較として、最初の
ミクロソームフラクションのSIIIフラクションも加えた。PDIはミクロソームフ
ラクション内で濃縮される。フラクション中のリソソーム膜の分布は、抗−カテ
プシンＤ抗体（Transduction Laboratories Inc.；1:1000）を用いて示した。ミ
クロソームフラクションは、リソソームタンパク質が無い。比較として、H4-ind
LC99細胞のPNSも加えた。 Ｂ）ミクロソームフラクションにおけるＡβの無細胞形成 記載どおりにミクロソーム（Ｍｉフラクション）を調製し、ｐＨ6.8で標準条
件下インキュベートした（ｐＨ6.8；５mM EDTA；４時間）。 特異的抗体BI.40及びBI.42を用いてＡβペプチドを免疫沈降させ、抗体6E10及
び4G8でウエスタンブロットによって検出した（Senetek,Great Britain；Galli
ら,1998）。37℃でのインキュベーションを二通り行った。Ａβの形成は、ミク
ロソームフラクション内でもエンドソームフラクション内でも起こる。
【００１５】 発明の詳細な説明 改良されたテストシステムを提供するという課題が、詳細な説明及び特許請求
の範囲内の本発明によって解決される。本発明によって、γ−セクレターゼを特
異的に阻害可能な物質を発見するためのインビトロテストシステムが提供される
。本発明の別の実施形態では、γ−セクレターゼを特異的に阻害可能な物質を発
見するためのテストキットが開示される。本発明の別の実施形態は、γ−セクレ
ターゼを特異的に阻害可能な物質を発見するための本発明の方法又は本発明のテ
ストキットの使用に関する。さらに、本発明の方法又は本発明のテストキットを
用いて発見されうる物質が調製される。別の実施形態は、神経変性障害を治療す
るための薬物を調製するためのこれら物質の使用及びこれら物質を含有する医薬
品製剤に関する。
【００１６】 本発明の方法は、検出可能にγ−セクレターゼの基質を発現し、かつγ−セク
レターゼ活性を有する細胞から単離される精製膜を使用する。γ−セクレターゼ
によって、本発明の範囲内では、ｐ３又はＡβ内で、タンパク質分解的にAPP又
はその断片、特にC99ペプチド（Shojiら,1992）を分解する特性を有するタンパ
ク質を意味する。従って、当業者がウエスタンブロット及び特異的抗体の使用に
よって、γ−セクレターゼの基質又はその分解産物を検出できるいずれの細胞も
、本発明の方法に適する。当業者がウエスタンブロット及び特異的抗体の使用に
よってγ−セクレターゼの基質を検出できるいずれの膜も好適な膜であり、好ま
しくはリソソーム及びエンドソーム膜、最も好ましくはミクロソーム膜である。
具体的に膜を精製する方法は、Method in Enzymology,219巻、表題：細胞内輸送
の認識、及び書籍“Biochemische Arbeitsmethoden”[生化学的実用方法],T.G.C
ooper,De Gruyter出版,1981から当業者にはわかる。本発明の方法を実施するた
め、実施例の非限定的な実施形態で述べているように、細胞に、γ−セクレター
ゼの基質をコードするDNA配列（DNA＝デオキシリボ核酸）を形質移入することが
できる。例としての一実施形態では、この基質の発現は、ドキシサイクリンの除
去によって誘発されうる。例えば、細胞を開き、かつ後核上清（PNS）を調製し
、さらに仕上げてミクロソームフラクションを単離することができる。このフラ
クションは、適宜な条件下インキュベートすることができ、かつγ−セクレター
ゼの適宜な基質との反応産物の形成は、免疫沈降及びその後の適切な抗体を用い
たウエスタンブロット法によって決定することができる。γ−セクレターゼ基質
は、PNS及び高濃度のミクロソームフラクション内で見出された（図１Ａ）。PS1
及びPS2のＣ末端断片（CTF）も、SIIIフラクション中に集中していた（図１Ｂ）
。ミクロソームフラクションはエンドソーム膜を含んでいなかったが、ER及びGo
lgi区画が集中していた（図１Ｃ）。デノボ産生されたＡβは、37℃でインキュ
ベートされたミクロソームフラクション内で見られた。４℃でのインキュベーシ
ョンは、Ａβのデノボ形成を妨げた。少量のＡβは、新たに調製されたミクロソ
ームフラクション中の細胞内Ａβの存在の結果だった（図２Ａ、痕跡ｃ）。Ａβ
のデノボ形成は時間に依存し、３〜４時間のインキュベーション後にそのピーク
に達した（図２Ｂ）。しかし、基質／産物式の評価は、Ａβのインビトロ産生は
、有効なタンパク質分解反応でないことを示した（図２Ａ）。EDTA不存在下にお
けるミクロソーム膜のインキュベーションは、Ａβのインビトロ産生の劇的な減
少を招来した（図３）。カルシウムキレート剤BAPTAは同様の効果を有した。こ
のことは、同一フラクション内に存在するＣａ2+依存性プロテアーゼがＡβを分
解するという仮説を導く。γ−セクレターゼテストシステムを行う前の緩衝液中
１Ｍ KClによるミクロソーム膜の処理又はこれら膜の0.1Ｍ Na2CO3ｐＨ11.5によ
る抽出から、γ−セクレターゼが、膜上に位置づけされているか、又は少なくと
も膜にしっかり結合されているにちがいないことがわかる（図４）。以前に公表
されたデータ（Wolfeら,1999）と対照的に、γ−セクレターゼ活性についてこの
テストシステムで決定された最適ｐＨは、6.8〜7.4である（図５）。より塩基性
ｐＨ（ｐＨ8.0〜8.5）又はより酸性ｐＨ（ｐＨ6.0〜6.4）のどちらでもＡβのイ
ンビトロ産生は無かった。
【００１７】 本発明の一実施形態では、述べた精製膜、特にミクロソーム膜を適切な反応緩
衝液及び被験物質と混合する。被験物質とは、本発明の目的では、それがγ−セ
クレターゼ活性に阻害効果を持っているかどうかを調べるために試験されるいず
れの物質をも意味する。そして、その被験物質不存在下においてγ−セクレター
ゼの基質が分解される条件下で混合物をインキュベートする。形成される分解産
物の量を決定し、得られる値を被験物質不存在下において得られる値と比較する
。被験物質の存在下で形成された分解産物の量が、被験物質の不存在下における
よりも少ない場合、その被験物質は、分解産物の形成を阻害し、かつその被験物
質はγ−セクレターゼのインヒビターである。先行技術では、とりわけ、特異的
なγ−セクレターゼインヒビターと呼ばれ、かつＡβの形成に影響を及ぼすこと
なく、Ａβ40及びＡβ42の分泌に対して阻害効果を有する化合物が同定されてい
る。いまや、本発明のγ−セクレターゼテストシステムは、特異的γ−セクレタ
ーゼインヒビターを同定かつ確証し、またそれらをＡβ40及びＡβ42の分泌を妨
げるインヒビターから区別するために有利に使用できる。実施例に記載されるよ
うに、Ａ化合物を本発明のテストシステムによって試験した。化合物Ａ（[αＳ(
αＲ*,γＲ*,δＲ*)]Ｎ-ブチル-γ-ヒドロキシ-α-(１-メチルエチル)-δ-[(４-
メチルフェニル)アミノ]シクロヘキサンヘキサミド-ハイドロクロライド；EP 77
8,266 A1の実施例20参照）は、欧州特許出願EP 778,266 A1の実施例20に記載ど
おりに調製され、Ａβ産生の濃度依存性阻害を示し、IC50値は約６μMだった（
図６Ａ）両Ａβペプチドに特異的である分泌Ａβ40及びＡβ42を定量的ELISAで
測定するテストシステムで同様の結果が得られた（Steinerら,1999）。ここで、
野生型APP751を過剰発現し、かつ検出可能量の両種のＡβを分泌する星状細胞腫
細胞系（U373）が使用される。化合物Ａによる一晩中の処理後、細胞外Ａβ40及
びＡβ42の量のＡ濃度依存性の減少が観察された（図６Ｂ）。本発明の一実施形
態では、γ−セクレターゼの基質である内因性ポリペプチドを発現する細胞が培
養される。本発明の範囲内では、用語「内因性」は、この細胞又は細胞系が、さ
らに例えば遺伝子工学法による操作の必要もなく、十分な量と呼べるポリペプチ
ドを発現することを意味する。本発明の範囲内では、γ−セクレターゼの基質の
十分な量とは、特異的抗体を用いる確立した生化学的検出方法（例えば、ELISA
、ウエスタンブロット）でバックグラウンドから際だって検出可能なシグナルを
生成する量を意味する。
【００１８】 本発明の特に好ましい実施形態では、γ−セクレターゼの基質である外因性ポ
リペプチドを発現する細胞がインキュベートされる。本発明の範囲内では、用語
「外因性」は、この細胞又は細胞系が、遺伝子工学法で操作され、それによって
、それがγ−セクレターゼ基質を発現することを意味する。細胞又は細胞系が、
これら操作をしないにもかかわらずγ−セクレターゼ基質を含む場合、この用語
は、γ−セクレターゼ基質の量が、いずれの操作もしない値と比較して測定可能
に増加していることを意味する。外因的にγ−セクレターゼ基質を発現する細胞
を調製するため、γ−セクレターゼ基質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列を、真核生物発現ベクターの適切な発現カセット内に挿入することがでこ
る。適切な発現カセットは、例えば、シトメガロウイルスプロモーター（CMVプ
ロモーター）のような真核生物宿主内で機能性であるプロモーター及び例えばSV
40ウイルス（Simian Virus；略称SV）由来の機能性ポリアデニル化シグナルを有
する。適切な発現ベクターは、真核生物宿主内で複製できる、すなわち複製の機
能的起源を有するベクターである。これら発現ベクターは、形質移入後エピソー
ム的に存在してよく、又はそれらが組込みを可能にする適切な配列を保有する場
合ゲノム中に組み込まれてよい。
【００１９】 好ましい実施形態では、外因性ポリペプチドの発現を誘発できるようにする発
現システムが使用され；ここでは種々のシステム、例えば「Tet-on」又「Tet-of
f」システム（米国特許第5,464,758号；Gossen及びBujard,1992,1995、Clontech
,Heidelbergによって上市）又はLacSwitchシステム（米国特許第5,589,392号；S
tratageneによって販売）が使用できる。本発明の特に好ましい実施形態では、
γ−セクレターゼ基質の発現は、テトラサイクリン又はドキシサイクリンの除去
によって誘発される（「Tet-Off」システム）。これを行うため、γ−セクレタ
ーゼ基質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、テトラサイクリンリ
プレッサーの少なくとも１つの結合部位の後ろにクローン化される。さらに、別
のヌクレオチド配列が同一プラスミド、別のプラスミド上に見られ、又は染色体
性に組み込まれて、Tetリプレッサーと、恒常的に発現可能である酸性の活性化
ドメインとの間の融合タンパク質をコードしうる。酸性の活性化ドメインとは、
酸性アミノ酸の比率が高く、かつ該ドメインが遺伝子の前に位置する転写複合物
の適宜の位置に配置された場合、遺伝子の転写を媒介する能力を有するタンパク
質ドメインを意味する。この能力は、公知の「ワン−ハイブリッドアッセイ」で
決定できる。この方法では、DNA結合ドメインが、調査すべきドメインと融合さ
れ、配列に結合しているDNA結合ドメインがリポータータンパク質の前に位置づ
けられ、かつ前記リポータータンパク質の活性が測定される（Clontech,Heidelb
erg）。上述の場合、細胞内のテトラサイクリン又は例えばドキシサイクリンの
ようなテトラサイクリン誘導体の濃度が特定レベルを超えると、テトラサイクリ
ンリプレッサーがテトラサイクリン又はその誘導体に結合し、その結果DNA内の
それの結合部位には結合せず、ひいてはγ−セクレターゼ基質をコードするこの
結合部位の後ろに挿入された遺伝子の転写を誘発しないので、γ−セクレターゼ
基質の発現は起こらないだろう。テトラサイクリン又はその誘導体不存在下にお
いて、Tetリプレッサーと酸性活性化ドメインとの間の融合タンパク質は、そのD
NA結合部位に結合し、かつそれの後ろに挿入された、γ−セクレターゼ基質をコ
ードする遺伝子の転写を誘発する。これは、γ−セクレターゼ基質の制御かつ目
標にされた発現が起こることを保証する。
【００２０】 本発明の一実施形態では、γ−セクレターゼ基質は、アミロイド前駆タンパク
質（APP）、又はγ−セクレターゼ切断部位を含むことを条件とするその断片で
ある。本発明の好ましい実施形態では、γ−セクレターゼ基質は、アミロイド前
駆タンパク質のC99断片である（Shojiら,1992）。 γ−セクレターゼ基質は、一般的に膜付随型でよいが、好ましくは膜ベース型
である。「膜ベース型」とは、本発明の範囲内では、該基質が膜の一体部分であ
ることを意味する。「膜付随型」とは、本発明の範囲内では、該基質が膜の表面
又は一体膜タンパク質に結合されていることを意味する。この膜付随型基質の定
義は、翻訳後修飾によって加えられる化学群化を介して膜の疎水性部分と相互作
用する基質を包含する意図でもある。さらに、用語「膜付随型基質」は、一体膜
タンパク質よりも小程度ではあるが、アミノ酸側鎖を介して膜の疎水性部分と相
互作用する基質を含める意図でもある。ここで、例としてプロスタグランジンシ
ンセターゼが挙げられる。
【００２１】 本発明の別の実施形態では、γ−セクレターゼ基質は、リポータータンパク質
と、アミロイド前駆タンパク質又はγ−セクレターゼ切断部位を含むことを条件
としたその断片との融合タンパク質である。好ましい実施形態では、γ−セクレ
ターゼ基質は、リポータータンパク質とC99断片との融合タンパク質である。こ
の発明の目的のため、リポータータンパク質は、容易に検出可能なシグナルを生
成し、かつその量を問題の分解産物の量と関連させるタンパク質である。シグナ
ルは、容易に検出される基質を有するリポータータンパク質の酵素的活性を決定
するか、又はリポータータンパク質の蛍光強度を測定することによって生成され
る。リポータータンパク質の例は、緑色蛍光タンパク質（GFP；例えばWO95/0746
3を参照）又は異なる波長で蛍光を発するその誘導体又はルシフェラーゼ、分泌
アルカリ性ホスファターゼ若しくはβ-グラクトシダーゼのような酵素である。
本発明のこの実施形態では、分解産物とリポータータンパク質との融合タンパク
質は、例えば免疫沈降によって、未分解γ−セクレターゼ基質とリポータータン
パク質との融合タンパク質から分離される。これは、その分解産物を選択的に認
識する抗体によって行うことができる。そして、リポータータンパク質の量は、
その性質と無関係の上記方法で決定される。リポータータンパク質及びγ−セク
レターゼ基質をコードするDNAが入手できれば、言及した融合タンパク質は、最
新の遺伝子工学法によって調製できる（Sambrookら,1989）。例えば、Heidelber
gのClontechのような市販業者からリポータータンパク質をコードするDNAを得、
標準的な方法で所望のベクター中に挿入することができる（Sambrookら,1989）
。γ−セクレターゼ基質又はC99断片をコードするDNAは、標準的な方法で適切な
遺伝子銀行から得ることができる（Sambrookら,1989）。
【００２２】 本発明は、当業者に公知のいずれの細胞又は細胞系、特に真核生物細胞又は細
胞系を用いても遂行できる。神経学的又は神経生物学的研究で使用される細胞又
は細胞系は、例えば、H4、U373、NT2、NEK293、PC12、COS、CHO、線維芽細胞、
骨髄腫細胞、神経芽細胞腫、ハイブリドーマ細胞、卵母細胞、胚幹細胞のような
哺乳類細胞又は細胞系が好ましい。昆虫細胞系（例えば、pPbac又はpMbac(Strat
agene,La Jolla,CA)のようなバキュロウィルスベクターを用いて）、酵母菌（例
えば、pYESHIS（Invitrogen,CA）のような酵母菌発現ベクターを用いて）、及び
真菌も適する。 神経細胞又は膠細胞起源の細胞又は細胞系が特に好ましい。本発明の特に好ま
しい一実施形態で使用する細胞は、H4細胞、American Type Culture Collection
（ATCC）、Manassas,Virginia,USAに、ATCC番号HTB-148で寄託されている脳由来
のヒト神経膠腫細胞である。
【００２３】 本発明の好ましい実施形態では、精製細胞膜、好ましくは細胞内膜、最も好ま
しくは精製リソソーム又はエンドソーム膜が用いられる。特に好ましくは、細胞
を溶解し、細胞核を除去し、ショ糖密度勾配によって精製し、超遠心分離で再沈
降させ、均質化し、超遠心分離で再沈降させ、かつ再均質化することによって、
使用細胞から精製したミクロソーム膜を使用する。膜を精製する標準的な方法は
、Methods in Enzymology,219巻及び書籍“Biochemische Arbeitsmethoden”[生
化学的実用方法],T.G.Cooper,De Gruyter出版,1981に記載されている。理論的に
は、ショ糖、メトリザミド、フィコール及びヨードキサノールの勾配による超遠
心分離が膜の精製にとって好適である。
【００２４】 本発明の好ましい実施形態では、反応緩衝液は、５〜10の範囲、好ましくは6.
0〜8.0の範囲、特に好ましくは6.8〜7.4の範囲のｐＨ値を有し、かつ少なくとも
１種の膜安定剤をも含む。膜安定剤とは、本発明の範囲内では、膜の凝集を防止
する物質を意味する。膜の凝集とは、本発明の範囲内では、一緒にかたまり又は
凝集し、おそらくその後ベシクル若しくはリポソームの融合又は多層構造になる
ことを意味する。これは、調査される溶液又は懸濁液の濁度又は光回折における
実験的に測定可能な増加によって測定でき、このように、その膜安定化活性の面
から、ある物質の特性を決定することもできる。本発明の範囲内では、膜安定剤
は、好ましくはショ糖又はソルビトールであるが、当業者はこれらを等価な活性
の物質に置き換えることができる。好ましくは、反応緩衝液中の膜安定剤の濃度
は、200〜1000mM、好ましくは200〜500mM、最も好ましくは200〜300mMである。
【００２５】 本発明の方法の最も好ましい実施形態では、反応緩衝液は、さらに、好ましく
は二価イオン用の錯化剤を含有する。これは、例えば、エチレン−ジアミン−四
酢酸（EDTA）若しくはその塩又は1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',
N'-四酢酸（BAPTA）若しくはその塩又はエチレングリコール-ビス(b-アミノエチ
ル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）若しくはその塩でよい。錯化剤は、好ましくは0.
1〜20mM、好ましくは５〜10mMの濃度である。用語「錯化剤」は、リガンドとし
て錯体を形成できる、すなわち特に金属、特に二価金属イオンを錯化かつマスク
する化合物を意味する。この用語は、よくキレート剤と同義に使用される。本発
明の方法では、他の錯化剤も使用できる。
【００２６】 本発明の一実施形態では、反応混合物にATP-再生系も添加される。この系は、
アデノシン三リン酸（ATP）、グアニジン三リン酸（GTP）、ホスホクレアチン、
クレアチンホスホキナーゼを、好ましくは１mM ATP、0.1mM GTP、８mMホスホク
レアチン、31mMクレアチンホスホキナーゼの濃度で、中性範囲のｐＨ値、好まし
くは6.8〜7.2、最も好ましくは7.0のｐＨで含む。 本発明の好ましい実施形態では、分解産物の量は、免疫沈降又はウエスタンブ
ロッによって、好ましくは免疫沈降とウエスタンブロットを併用して決定される
。免疫沈降及びウエスタンブロットは、Idaら(1996)によって記載されているよ
うに行われる。ウエスタンブロットは、タンパク質がゲル電気泳動、通常はポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって、タンパク質の天然又は通常は変性状態の
電荷が、例えばニトロセルロース若しくはポリ二フッ化ビニリデンのようなキャ
リヤー上を移動され、そして抗体を用いて検出されることによって分離される。
本発明の別の実施形態では、分解産物の量は、エンザイムイムノアッセイ（酵素
結合免疫吸着検定法；略称：ELISA）（Steinerら,1999）又は質量スペクトルで
決定される。 本発明の別の実施形態では、分解産物の量は、未分解γ−セクレターゼ基質と
リポータータンパク質との融合タンパク質が精製された後、その分解産物に融合
されているリポータータンパク質の量を測定することによって決定される。分解
産物に融合されたルシフェラーゼ、分泌アルカリ性ホスファターゼ又はβ-ガラ
クトシダーゼの量は、基質添加後のリポータータンパク質の酵素活性を測定する
ことによって決定される。本発明の別の実施形態では、緑色蛍光タンパク質又は
その誘導体は、その蛍光の強度を測定することによって決定される。
【００２７】 本発明の好ましい実施形態は、本発明に従って特異的にγ−セクレターゼを阻
害可能な物質を見つけるためのテストキットである。テストキットは、本発明の
方法のための全成分の集合である。本発明の方法を実施するための他要素の網羅
的はないくつかの例は、例えば96−ウェルプレート又は微量定量プレート、試験
官、他の適宜の器、表面及び基材のような容器、ニトロセルロースフィルタのよ
うな膜、洗浄試薬及び緩衝液等である。同様に、テストキットは、例えば標識第
２抗体、発色団、酵素（例えば、抗体に接合された）及びその基質又は抗体を結
合可能な他の物質のような抗体を結合した試薬を含んでよい。本発明のテストキ
ットは、少なくとも、γ−セクレターゼ活性を発現し、かつγ−セクレターゼの
基質を含む細胞由来の精製細胞膜と、反応緩衝液とを含む。好ましい実施形態で
は、膜は、精製された細胞内膜、好ましくはリソソーム又はエンドソーム、最も
好ましくはミクロソーム膜であ。最も好ましくは、膜は、外因的にγ−セクレタ
ーゼの基質を発現する細胞から精製される。本発明の好ましい実施形態では、反
応緩衝液は、５〜10の範囲、好ましくは6.0〜8.0の範囲、最も好ましくは6.8〜7
.4の範囲のｐＨを有し、かつ他の成分として、上述したような本発明の少なくと
も１種の膜安定剤を含む。好ましくは、膜安定剤はショ糖又はソルビトールが好
ましく、その濃度は、反応緩衝液中、200〜1000mM、好ましくは200〜500mM、最
も好ましくは200〜300mMである。 最も好ましくは、反応緩衝液は、さらに本発明の好ましくは二価イオン用の錯
化剤を含む。これは、上述したように、例えば、EDTA、BAPTA若しくはEGTA又は
これらの塩でよい。錯化剤は、0.1〜20mM、好ましくは５〜10mMの濃度で存在す
る。
【００２８】 本発明の一実施形態において、テストキットは、さらに上述したような本発明
のATP−再生系を含み、それは反応混合物に添加できる。本発明の別の実施形態
では、テストキットは、免疫沈降又はウエスタンブロット、好ましくは免疫沈降
とウエスタンブロットの併用によって、分解産物の量の決定を可能にする抗体を
含む。 本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法又は本発明のテストキットを用
いて、γ−セクレターゼを特異的に阻害できる物質を見出す。別の実施形態では
、本発明の方法又は本発明のテストキットによって見出すことができ、かつ特異
的にγ−セクレターゼ基質のタンパク質分解的分解を阻害する物質が調製される
。本発明のこの物質を用いて、神経変性障害、特にアルツハイマー病の治療用薬
物を調製できる。さらに、本発明の物質と、製薬的に許容されるキャリヤーとを
含有する医薬品製剤が調製される。
【００２９】 製薬的に許容されるキャリヤーは、例えば本発明の該物質の安定性又は吸着を
高める生理学的に許容される化合物を含むことができる。このような生理学的に
許容される化合物は、例えばブドウ糖、ショ糖若しくはデキストランのような炭
水化物、アスコルベート若しくはグルタチオンのような抗酸化薬、キレート剤、
低分子量のタンパク質又は他の安定剤を含む（例えば、Remington's Pharmaceut
ical Sciences(1990)参照）。当業者は、生理学的に許容される化合物を含む製
薬的に許容されるキャリヤーの選択は、例えば投薬ルートによって決まることを
知っている。
【００３０】 実施例１−本テストシステムを使用する： 1.1 適切な細胞系の調製 H4神経膠腫細胞（“American Type Culture Collection”,Manassas,Virginia
,USAにおける受入れ番号HTB 148）を、標準的な条件下、テトラサイクリン抑制
トランス活性化因子（Gossenn及びBujard,1992,1995）の遺伝子を運ぶ調節プラ
スミドpUHD15-1neo（ネオマイシン耐性遺伝子を有するpUHD15-1）で形質移入し
た。過渡的な形質移入実験によって、リポーター遺伝子（pUHD10-3/SEAP；SEAP
：分泌アルカリ性ホスファターゼ）の厳密に調節されかつ強誘発性の過渡的発現
を有するAPP-LC99構成物による第２の安定形質移入のために個々のクローンを選
択した。このAPP-LC99構成物を調製するため、APPのＮ末端シグナル配列及び最
後の99個のアミノ酸を含む配列を（Shojiら,1992）、テトラサイクリン制御型発
現ベクターpUHD10-3中に、BamHI及びSacII制限切断部位を介してクローン化した
。この構成物は、pUHD10-3/APP-LC99と呼ばれる。上述したように得られた細胞
クローンを、10μgのpUHD10-3/APP-LC99及び１μgのpTK-Hyg（Clontech,Heidelb
erg；遺伝子銀行受入れ番号U40398）で共−形質移入し、かつBoehringer Mannhe
imによるFugene形質移入システムを用い、製造業者の使用説明書に従って選択を
行った。個体のハイグロマイシン耐性細胞クローンは、ドキシサイクリンの除去
、続く免疫沈降及び／又はAPP-CTF-特異的抗体によるウエスタンブロットにるLC
99の誘発性発現について調査された。選択されたクローンは、H4-ind/APP-LC99
と呼ばれた。
【００３１】 1.2 H4 LC99細胞からミクロソームフラクションを作り上げる H4-ind/APP-LC99細胞を、15cmのペトリ皿上37℃、５％CO2で、ドキシサイクリ
ンの非存在下、DMEM培地（DMEM：Bio Wittackerによって販売される“Dulbecco'
s Modified Eagle Medium”）と、10％胎児ウシ血清（FCS）、１％グルタミン、
１％ペニシリン及びストレプトマイシンとコンフルエントになるまで成長させた
。ドキシサイクリンの除去により、融合タンパク質の発現が誘発された。後核上
清を調製する全工程は、氷上又は４℃で行った。各ペトリ皿毎に２mlのPBSを添
加後、細胞スクレーパでペトリ皿から細胞を除去した。500ｇで10分間の遠心分
離後、HIS緩衝液中に（250mM ショ糖、５mM イミダゾール、10m MHEPES ｐＨ6.8
）、細胞を慎重に再懸濁させ、再び1400ｇで10分間遠心分離してから、各ペトリ
毎に300μlのHIS+緩衝液（５mM EDTAを有するHIS緩衝液）に細胞を再懸濁させた
。均質化された細胞材料を、１ml注射器で22ゲージ針の中を通させ、その細胞の
溶解を位相差顕微鏡で監視した。細胞ライセートを2500ｇで10分間遠心分離し、
無処置細胞及び細胞デブリから上清を分離した。
【００３２】 さらにショ糖段階勾配（Taylorら,1997）で、まずそれを100mM KH2PO4/K2HPO4 、ｐＨ6.8に調整してPNSを作り上げた。すべてのショ糖溶液は、100mM KH2PO4/K 2 HPO4、ｐＨ6.8、５mM MgCl2及びプロテアーゼインヒビターロイペプチン（10μ
g/ml）及びアプロチニン（10μg/ml）を含有していた。勾配は、1.3Ｍ、0.86Ｍ
及び0.5Ｍショ糖の段階を含んでおり、PNSでオーバレイしてから100,000ｇで1.5
時間２℃で遠心分離した。1.3Ｍと0.86Ｍショ糖の間の中間層が、ミクロソーム
フラクションSIIIである。この膜をペレット化するため、SIIIフラクションを、
100mM KH2PO4/K2HPO4、ｐＨ6.8で250mMショ糖に調整し、220,000ｇで20分間４℃
で遠心分離した。膜を反応緩衝液（250mMショ糖、50mM KCl、2.5mM酢酸マグネシ
ウム、20mM HEPES、ｐＨ6.8、５mM EDTA）で洗浄し、上述したように遠心分離し
、かつ１mlの反応緩衝液中に、均質になるまで再懸濁させた。少アリコートのミ
クロソームフラクションを液体窒素中で凍結させ、-80℃で貯蔵した。
【００３３】 1.3 γ−セクレターゼインヒビターテストシステムを使用する 誘発されたH4-ind/APP-LC99細胞の凍結ミクロソームフラクションを氷上で解
凍し、10μlアリコートを各無細胞反応に用いた。試料を反応緩衝液液で30μlに
希釈し、特定の温度及びｐＨ値かつ特定時間インキュベートした。インキュベー
ション後、試料を２％SDSに調整し、95℃に５分間加熱した。１ml IP緩衝液（15
0mM NaCl、10mM トリスｐＨ7.4、１mM EDTA、0.2％NP40及びプロテアーゼインヒ
ビターアプロチニン（10μg/ml）、ロイペプチン（10μg/ml）、５μg/mlのペプ
スタチン、１mM Pefabloc）と、各場合に６μg/mlの特異的抗体BI.40及びBI.42
（同一効果を有する代替抗体は、QCB,Quality Control Biochemicals,Inc.,Hopk
inton,USAから入手できる；カタログ番号44-348及び44-344）を試料に添加した
。４℃で１時間後、20μlの予備洗浄されたGammabind-Sepharose G ビーズ（Pha
rmacia Biotech）を添加し、一晩中４℃でインキュベートした。セファロース免
疫複合体をIP緩衝液で洗浄し、沈降タンパク質を20mlのトリス−ビシン（Klafki
ら,1996）試料緩衝液で溶離した。上述したように、試料をトリス−ビシンポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分離した（Klafkiら,1996）。前述の高感度ウエ
スタンブロット法を用い、抗体6E10及び4G8（製品番号mAb 200-10及びmAb 300-1
0,Senetek,Great Britain；Galliら,1998）によって、免疫沈降されたＡβ種を
検出した（Idaら,1996）。 ウエスタンスター基質（Tropix）で化学発光を検出し、BioRad製の化学発光検
出システムで定量した。
【００３４】 1.4 モルモット肝臓細胞からサイトゾルを得る モルモットの肝臓から上述のような均質化及び遠心分離によって、後核上清（
PNS）を得る（Taylorら,1997）。この上清をショ糖段階勾配に適用し（Taylorら
,1997）、かつ100,000ｇ及び４℃で1.5時間遠心分離する。500mMショ糖を有する
フラクションを、250mMショ糖について１ｘKPi緩衝液で希釈し、200,000ｇ及び
４℃で20分間遠心分離した。この上清がサイトゾルである（Jonesら,1998）。
【００３５】 1.5 ATP再生系を伴うγ−セクレターゼインヒビターテストシステムの代替法 これら組換え型H4細胞の精製ミクロソームフラクションを適宜の緩衝液系（50
〜150mM KCl、1.5〜５mMの酢酸マグネシウム、250mM ショ糖、20mM Hepes ｐＨ6
.8）、ATP再生系（１mM ATP、0.1mM GTP ｐＨ7.0；８mM ホスホクレアチン、31m
M クレアチンホスホキナーゼ）及び上記1.2のように作られたサイトゾルと共に3
7℃でインキュベートし、上述したようにウエスタンブロットで産物Ａβを検出
することによって、γ−セクレターゼ活性を測定する。
【００３６】 実施例−本テストシステムを使用する 1.6 H4 LC99細胞からミクロソームフラクションの代替作成 1.1で述べたのと同一の細胞系（APP-LC99構成物を有するH4神経膠腫細胞クロ
ーン）を使用した。 H4-ind/APP-LC99細胞を、15cmのペトリ皿上37℃、５％CO2で、ドキシサイクリ
ンの非存在下、DMEM培地（DMEM：Bio Wittackerによって販売される“Dulbecco'
s Modified Eagle Medium”）と、10％胎児ウシ血清（FCS）、１％グルタミン、
１％ペニシリン及びストレプトマイシンとコンフルエントになるまで成長させた
。ドキシサイクリンの除去により、融合タンパク質の発現が３日間誘発された。
後核上清を調製する全工程は、氷上又は４℃で行った。調製用バッチのため、10
回15cmペトリ皿を一緒に処理した。各ペトリ皿毎に２mlの氷冷PBSを添加後、細
胞スクレーパでペトリ皿から細胞を除去した。以下の工程は、すべてSchroterら
の記載どおりに行った。500ｇで10分間の遠心分離後、ST緩衝液中に（250mM シ
ョ糖、10mM トリス ｐＨ7.4）細胞を慎重に再懸濁させ、再び1400xｇで10分間遠
心分離してから、全細胞を５mlのST緩衝液中に再懸濁させた。５mlポッター（Br
aun,Melsungen）を用いて500rpmで細胞を均質化し、細胞の溶解を位相差顕微鏡
で監視した。細胞ライセートを、まず2000xgで２分間遠心分離し、いずれの無処
置細胞及び大きい細胞デブリをも沈降させた。それから上清を4000xgで２分間遠
心分離して細胞膜と細胞核を分離した（フラクションPN）。上述したように、細
胞核と原形質膜から成る沈降物を２回ST緩衝液で洗浄し、遠心分離した。上清を
新しい容器内で混ぜ合わせ、100,000xgで２分間遠心分離して、ミトコンドリア
、リソソーム及びエンドソームを除去した（フラクションEL）。最後に、精製ミ
クロソームを沈降させるため、上清を400,000xgで遠心分離した。リソソームと
エンドソームを分離させるため、ELフラクションをさらに処理した。リソソーム
を氷上の10分間の低浸透圧性溶解によってバーストオープンし（Bohleyら,1969
）、100,000xgで２分間無処置エンドソームを沈降させた（リソソーム＝フラク
ションＬ；エンドソーム＝フラクションＥ）。
【００３７】 分離を特徴づけるため、各フラクションから全タンパク質の30μgをポリアク
リルアミドゲル上に置き、ウエスタンブロット法によって、フラクション内の個
々の区画のいろいろな標識タンパク質の分布を検出した。 エンドソーム及びミクロソーム膜は、反応緩衝液（250mM ショ糖、50mM KCl、
2.5mM 酢酸マグネシウム、20mM HEPES、ｐＨ6.8、５mM EDTA）で処理し、１mlの
反応緩衝液中に再懸濁させて均質にした。少アリコートを液体窒素中凍結し、-8
0℃で貯蔵した。 γ−セクレターゼインヒビターテストシステムは、1.3で述べたのと全く同様
に行った。
【００３８】 参考文献: Bohley et al. (1969), FEBS Lett. 5,233-236 De Strooper et al. (1998). Nature 391, 387-390. De Strooper et al. (1999). Nature 398, 518-522. Galli et al. (1998). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1247-1252. Gossen, M., and Bujard, H. (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 5547-51. Gossen, M., and Bujard, H. (1995). Biotechniques 19, 213-216. Haass, C., and Selkoe, D.J. (1993). Cell 75, 1039-1042. Ida et al. (1996). J. Biol. Chem. 271, 22908-22914. Jones, S.M., et al. (1998). Science 279, 573-577. Klafki et al. (1996). Anal. Biochem. 237, 24-29. Lemere et al. (1996): Nat. Med. 2, 1146-1150. Mann et al. (1996). Ann. Neurol. 40, 149-156. Price, D., and Sisodoa, S. (1998). Ann. Rev. Neuroscience 21, 479-505. Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18th edition, Mack Publ., E
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ミクロソームフラクションSIIIの特徴づけを示す。
【図２】 図２は、単離されたミクロソームからのＡβ40及びＡβ42の無細胞産
生を示す。
【図３】 図３は、γ−セクレターゼ分解産物Ａβは、Ｃａ2+依存性プロテアー
ゼによって分解されることを示す。
【図４】 図４は、γ−セクレターゼは膜貫通プロテアーゼであることを示す。
【図５】 図５は、γ−セクレターゼ活性にとって最適なｐＨは、ｐＨ6.8〜7.4
であることを示す。
【図６】 図６は、無細胞γ−セクレターゼテストシステムにおいて考えられる
γ−セクレターゼインヒビターの効果を示す。
【図７】 図７は、無細胞γ−セクレターゼテストシステムで述べたようなγ−
セクレターゼインヒビターの効果を示す。
【図８】 図８は、H4-indLC99細胞のミクロソームフラクションの特徴づけを示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ (72)発明者 コストカ マルクス ドイツ連邦共和国 55128 マインツ ウ ーヴェ ブレヤー シュトラッセ 45 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA20 DA36 FB03 4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ20 QQ79 QQ95 QR02 QR13 QR15 QR41 QR43 QR44 QR53 QR57 QR77 QS24 QS33 QS36 QX02

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 特異的にγ−セクレターゼを阻害可能な物質の発見方法であ
    って： ａ）精製膜を、γ−セクレターゼ活性を有し、かつγ−セクレターゼの基質を含
    有する細胞から調製し、 ｂ）これらの膜を、反応緩衝液及び被験物質と混合し、 ｃ）この混合物を、前記被験物質不存在下において前記γ−セクレターゼの前記
    基質が分解される条件下でインキュベートし、 ｄ）形成されるいずれの分解産物の量も決定し、及び ｅ）得られる結果を、前記被験物質不存在下において得られる結果と比較する ことを特徴とする前記方法。
  2. 【請求項２】 γ−セクレターゼの基質である内因性ポリペプチドを発現す
    る細胞が培養されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 γ−セクレターゼの基質である外因性ポリペプチドを発現す
    る細胞が培養されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記外因性ポリペプチドの前記発現が誘発性であることを特
    徴とする請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記γ−セクレターゼ基質の前記発現が、テトラサイクリン
    又はテトラサイクリン誘導体の除去によって誘発されることを特徴とする請求項
    ４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記γ−セクレターゼ基質が、アミロイド前駆タンパク質又
    はその断片であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記アミロイド前駆タンパク質の前記断片が、C99断片であ
    ることを特徴とする請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記γ−セクレターゼ基質が、アミロイド前駆タンパク質又
    はその断片、特にC99断片と、リポータータンパク質との融合タンパク質である
    ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記リポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質又はその
    誘導体、ルシフェラーゼ、分泌アルカリ性ホスファターゼ又はβ−ガラクトシダ
    ーゼであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記細胞が、元来神経細胞又は膠細胞であることを特徴と
    する請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記細胞が、H4細胞であることを特徴とする請求項１０に
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記膜が、細胞膜、好ましくは細胞内膜であることを特徴
    とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記膜が、リソソーム又はエンドソーム膜であることを特
    徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記膜が、ミクロソーム膜であることを特徴とする請求項
    １２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記ミクロソーム膜が、以下の工程によって精製されるこ
    とを特徴とする請求項１４に記載の方法： ａ）前記細胞の溶解工程、 ｂ）その細胞核の除去工程、 ｃ）ショ糖密度勾配を通じた精製工程、 ｄ）超遠心分離による再沈降工程、 ｅ）均質化工程、 ｆ）超遠心分離による再沈降工程、及び ｇ）再均質化工程。
  16. 【請求項１６】 前記反応緩衝液のｐＨ値が、５〜10の範囲、好ましくは6.
    0〜8.0の範囲、最も好ましくは6.8〜7.4の範囲であり、かつ付加成分として少な
    くとも１種の膜安定剤を含むことを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に
    記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記膜安定剤が、ショ糖又はソルビトールであることを特
    徴とする請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記膜安定剤の濃度が、200〜1000mM、好ましくは200〜50
    0mM、最も好ましくは200〜300mMであることを特徴とする請求項１６又は１７に
    記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記反応緩衝液が、さらに錯化剤を含むことを特徴とする
    請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記錯化剤が、EDTA、EGTA若しくはBAPTA又はそれらの塩
    であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 EDTA、EGTA若しくはBAPTA又はそれらの塩が、0.1〜20mM、
    好ましくは５〜10mMの濃度で存在することを特徴とする請求項２０に記載の方法
    。
  22. 【請求項２２】 さらに、前記反応混合物にATP-再生系が添加されることを
    特徴とする請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記分解産物の量が、免疫沈降又はウエスタンブロットに
    よって、好ましくは免疫沈降とウエスタンブロットの併用によって決定されるこ
    とを特徴とする請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記分解産物の量が、ELISAによって決定されることを特
    徴とする請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記分解産物の量が、質量分析によって決定されることを
    特徴とする請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記分解産物の量が、該分解産物に融合されたリポーター
    タンパク質の量を決定することによって決定されることを特徴とする請求項８〜
    ２２のいずれか１項に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記分解産物に融合されたルシフェラーゼ、分泌アルカリ
    性ホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼの量が、前記基質の付加後の酵素活
    性を測定することによって決定されることを特徴とする請求項２６に記載の方法
    。
  28. 【請求項２８】 前記緑色蛍光タンパク質又はその誘導体の量が、蛍光の強
    度を測定することによって決定されることを特徴とする請求項２６に記載の方法
    。
  29. 【請求項２９】 特異的にγ−セクレターゼを阻害可能な物質を発見するた
    めのテストキットであって、γ−セクレターゼ活性を有し、かつγ−セクレター
    ゼの基質を含有する精製膜を少なくとも含み、かつ反応緩衝液をも含むことを特
    徴とするテストキット。
  30. 【請求項３０】 前記膜が、リソソーム又はエンドソーム、好ましくはミク
    ロソーム膜であることを特徴とする請求項２９に記載のテストキット。
  31. 【請求項３１】 前記細胞が、外因的にγ−セクレターゼの基質を発現する
    ことを特徴とする請求項２９又は３０に記載のテストキット。
  32. 【請求項３２】 前記反応緩衝液が、５〜10の範囲、好ましくは6.0〜8.0の
    範囲、最も好ましくは6.8〜7.4の範囲のｐＨ値を有し、かつ付加成分として少な
    くとも１種の膜安定剤を含むことを特徴とする請求項２９〜３１のいずれか１項
    に記載のテストキット。
  33. 【請求項３３】 前記膜安定剤が、ショ糖又はソルビトールであることを特
    徴とする請求項３２に記載のテストキット。
  34. 【請求項３４】 前記膜安定剤の濃度が、200〜1000mM、好ましくは200〜50
    0mM、最も好ましくは200〜300mMであることを特徴とする請求項３２又は３３に
    記載のテストキット。
  35. 【請求項３５】 前記反応緩衝液が、さらに錯化剤を含むことを特徴とする
    請求項２９〜３４のいずれか１項に記載のテストキット。
  36. 【請求項３６】 前記錯化剤が、EDTA、EGTA若しくはBAPTA又はそれらの塩
    であることを特徴とする請求項３５に記載のテストキット。
  37. 【請求項３７】 EDTA、EGTA若しくはBAPTA又はそれらの塩が、0.1〜20mM、
    好ましくは５〜10mMの濃度で存在することを特徴とする請求項３６に記載のテス
    トキット。
  38. 【請求項３８】 前記テストキットが、さらにATP-再生系を含むことを特徴
    とする請求項２９〜３７のいずれか１項に記載のテストキット。
  39. 【請求項３９】 前記分解産物の量が、免疫沈降又はウエスタンブロットに
    よって、好ましくは免疫沈降とウエスタンブロットの併用によって決定されるこ
    とを特徴とする請求項２９〜３８のいずれか１項に記載のテストキット。
  40. 【請求項４０】 特異的にγ−セクレターゼを阻害可能な物質を発見するた
    めの、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法又は請求項２９〜３９のいず
    れか１項に記載のテストキットの使用。
  41. 【請求項４１】 請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法又は請求項２
    ９〜３９のいずれか１項に記載のテストキットによって発見されうる物質であっ
    て、それがγ−セクレターゼ基質のタンパク質分解的分解を特異的に阻害するこ
    とを特徴とする物質。
  42. 【請求項４２】 神経変性障害、特にアルツハイマー病の治療用薬物を調製
    するための、請求項４１に記載の物質の使用。
  43. 【請求項４３】 請求項４１に記載の物質を含有する医薬品製剤。
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