DE10000161A1 - Verfahren zur Identifikation eines Proteaseinhibitors - Google Patents
Verfahren zur Identifikation eines ProteaseinhibitorsInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch membranständige Proteasen inhibieren können und einen Hochdurchsatzmusterungstest zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch gamma-Sekretase oder Presenilinase inhibieren können. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung dieses Verfahrens oder dieser Hochdurchsatzmusterungstests zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch gamma-Sekretase oder Presenilinase inhibieren können. Auch werden Substanzen offenbart, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren gefunden werden können, die Verwendung besagter erfindungsgemäßer Substanzen zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere der Alzheimer-Krankheit sowie pharmazeutische Formulierungen, welche die erfindungsgemäßen Substanzen enthalten.
Description
Die vorliegende Erfindung liegt im Feld der Verfahren zum Auffinden von Inhibitoren
membranständiger Proteasen, insbesondere sind dies γ-Sekretase- und Presenilinase-
Inhibitoren. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung dieser
Inhibitoren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung neurodegenerativer
Erkrankungen sowie pharmazeutische Formulierungen, die diese Substanzen enthalten.
Aggregation und Präzipitation von Proteinen sind an der Entstehung von verschiedenen
neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Veitstanz (Engl.: "Chorea
Huntington") beteiligt. Bei der Alzheimer Erkrankung aggregiert das Amyloid-β-peptid
(Aβ) und führt zu unlöslichen senilen Plaques, welche einen der pathologischen Marker der
Erkrankung darstellen (Selkoe et al. 1996). Aβ entsteht durch proteolytische Spaltung eines
Vorläuferproteins, dem Amyloid-Vorläuferprotein (Engl.: "amyloid precursor protein";
Engl.: APP). Man unterscheidet zwei Stoffwechselwege des APPs, den nicht
amyloidogenen Weg und den amyloidogenen Weg (Selkoe, 1994).
Im nicht amyloidogenen Metabolismus des APPs spaltet die α-Sekretase innerhalb der Aβ
Region des APPs und führt damit zur Sekretion des löslichen N-terminalen Bereiches des
Proteins (α-APPs) sowie nach erfolgtem γ-Sekretase-Schnitt zur Freisetzung von p3.
Dagegen führt der amyloidogene Weg zur Enstehung von Aβ, indem zwei Proteasen den N-
Terminus (β-Sekretase) bzw. den C-Terminus (γ-Sekretase) von Aβ generieren (Haass,
1993; Selkoe, 1994).
In vivo ist Aβ im humanen Plasma und der Zerebrospinalflüssigkeit nachzuweisen. Auch in
Zellkultur kann sekretiertes Aβ im Zellkulturüberstand in verschiedenen Zelltypen
nachgewiesen werden, die APP oder Fragmente davon endogen exprimieren oder
überexprimieren. Sowohl Aβ-Produktion und damit auch die Amyloid-Plaqueentstehung
werden durch verschiedene genetische Risikofaktoren beeinflußt. Dazu gehören Mutationen
in den homologen Proteinen Presenilin 1 und Presenilin 2 als auch im APP selbst. Die
Analyse dieser Mutationen an Fibroblasten von Alzheimer-Patienten mit familiär vererbter
Alzheimerkrankheit (Engl.: "Familiar Alzheimer Disease" (FAD)), zeigten den Einfluß, den
sie auf die Aβ-Entstehung haben. Dies konnte durch Untersuchungen an transfizierten
Zellen und transgenen Tieren bestätigt werden. Alle Mutationen erhöhen die Produktion
von Aβ und führen im Fall der Presenilin Mutationen zur selektiven Erhöhung der längeren
Aβ Variante, dem Aβ42 (Selkoe, 1996; Price, 1998). Dieses Peptid aggregiert im höheren
Maße als die kürzere Form, das Aβ40, und wirkt toxischer auf Zellen neuronalen wie auch
peripheren Ursprungs (Lemere et al., 1996; Mann et al., 1996). Neben diesem Einfluß der
Mutationen gibt es Hinweise, daß auch die Wildtypform der Preseniline eine fundamentale
Funktion in der physiologischen Entstehung von Aβ haben. In Neuronen von
Mausembryonen, bei denen das PS1-Gen (PS: Presenilin) auf gentechnischen Wege
ausgeschaltet wurde, konnte eine drastische Reduktion von Aβ 40 und Aβ 42 nachgewiesen
werden. Außerdem akkumulieren in diesen Zellen die C-terminalen Fragmente des APPs,
welches zu der Ansicht führte, die Preseniline aktivieren die γ-Sekretase oder besitzen selbst
γ-Sekretase Aktivität (De Strooper et al., 1998; Sisodia et al., 1998). Erste in vitro
Testsysteme kombiniert mit Mutationsstudien an konservierten Aspartaten des Presenilin 1
legen die Vermutung nahe, daß die Preseniline spezielle autokatalytisch aktive
Aspartatproteasen sein könnten, die für den γ-Sekretase Schnitt in der Membran
verantwortlich sind (Wolfe et al., 1999).
Die Diskussion über Identifizierung der γ-Sekretase als entscheidender Schritt in der
Generierung von Aβ und damit in der Entstehung von Alzheimer ist bis heute nicht
abgeschlossen. Unabhängig davon stellt diese Protease ein interessantes Ziel dar, um
pharmakologisch in den Prozeß der Aβ-Entstehung eingreifen zu können, indem man
Inhibitoren findet, die selektiv ihre Aktivität reduzieren. Dazu ist es wichtig, neben
Tiermodellen und in vitro Testsystemen auch zelluläre Assays zu entwickeln, die
unabhängig von Transportprozessen innerhalb der Zelle, das Testen von spezifischen
Wirksubstanzen möglich machen.
Von Wolfe et al. (1999) wird ein in vitro System zur Messung der Aktivität der γ-Sekretase
gezeigt. Zur Bereitstellung des Systems werden Membranen aus Zellen aufgearbeitet, die
stabil PS1 exprimieren. Diese werden mit einem das LC99-Polypeptid kodierenden Plasmid
vermischt und einer in vitro Transkriptions-/Translationsreaktion in Gegenwart von 35S-
Methionin unterworfen, wobei das γ-Sekretäse-Substrat C99 gebildet wird. Die Mischung
wird anschließend unter geeigneten Bedingungen inkubiert, wobei das C99-Fragment von
APP von der γ-Sekretase proteolytisch gespalten und die Abbauprodukte durch
Gelelektrophorese nach einer Immunpräzipitation nachgewiesen werden. Dieses Testsystem
ist sehr langwierig und nicht automatisierbar und damit nicht für das Auffinden von
spezifischen Proteaseinhibitoren geeignet.
Augenblicklich sind keine therapeutischen Ansätze bekannt, um den neuronalen Zelltod
aufgrund von Presenilinfragmenten, welche an der neuronalen Apoptose beteiligt zu sein
scheinen, zu unterbinden. Die Presenilinase, d. h. die Proteaseaktivität, die besagte
Presenilinfragmente generiert, stellt ein exzellentes Zielmolekül dar. Aus dem Stand der
Technik sind keine Verfahren bekannt, die es ermöglichen, Presenilinase-Inhibitoren
aufzufinden, insbesondere nicht in einem gewerblichen Kontext.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Testsystem zum Auffinden
von spezifischen Proteaseinhibitoren bereitzustellen. Die Aufgabe konnte durch die
vorliegende Erfindung im Rahmen der Beschreibung und der Ansprüche gelöst werden.
Bevor die vorliegende Erfindung näher beschrieben wird, sollte angemerkt werden, das
jeglicher Plural auch den Singular umfasst und umgekehrt, d. h. falls auf "die Substanzen"
Bezug genommen wird, ist auch eine einzelne Substanz von der Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die
spezifisch membranständige Proteasen inhibieren können und einen
Hochdurchsatzmusterungstest zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch γ-Sekretase
oder Presenilinase inhibieren können. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung
dieses Verfahrens oder dieser Hochdurchsatzmusterungstests zum Auffinden von
Substanzen, die spezifisch γ-Sekretase oder Presenilinase inhibieren können. Auch werden
Substanzen offenbart, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren gefunden werden
könnnen, die Verwendung besagter erfindungsgemäßer Substanzen zur Herstellung eines
Medikamentes zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere der
Alzheimer-Krankheit sowie pharmazeutische Formulierungen, welche die
erfindungsgemäßen Substanzen enthalten.
Abbildung (Figur) 1: Herstellung von Reporterkonstrukten und Zelllinien.
Abbildung (Figur) 2: Durchführung des Testsystems - HTS Assay Prinzip.
Abbildung (Fig) 3: ER Retention des γ-Sekretase Substrats - die intrazelluläre APP
Prozessierung.
Abbildung (Figur) 4: Charakterisierung der transfizierten Zellinien für den HTS.
- A) Bestimmung der Aβ-KKK/Gal4 Substrat-Expression mittels Western Blot.
- B) Bestimmung der Luziferase-Expression mittels Western Blot.
- C) Bestimmung der Luziferase Expression mittels enzymatischem Nachweis.
- D) Bestimmung der Luziferase Expression mittels enzymatischem Nachweis.
Abbildung (Figur) 5. Bestimmung der Level an extrazellulärem Aβ42 das von den
transfizierten HTS Testzellinien sekretiert wird.
Abbildung (Figur) 6: BFA Effekt in den HTS Testzellinien Aβ-KKK-ER/59 und Aβ-KKK/52.
- A) Luziferase-Test.
- B) Vitalitätstest.
Abbildung (Figur) 7: Effekt der Presenilin (PS1 und PS2) Aspartatmutationen in den HTS
Testzellinien Aβ-KKK-ER/59 und Aβ-KKK/52
- A) Effekt der PS (Asp) Mutanten in den Poolzellen Aβ-KKK/52/D385N (PS1mut) und Aβ-KKK/52/D366A (PS2mut).
- B) Effekt der PS (Asp) Mutanten in den Poolzellen Aβ-KKK-ER/59/D385N (PS1mut) und Aβ-KKK-ER/59/D366A (PS2mut).
- C) Nachweis der Überexpression der PS (Asp) Mutanten in den jeweiligen Zellinien.
Abbildung (Fig) 8: Substanz A.
- A) Konzentrationsabhängige Inhibition der Aβ Bildung durch die Substanz A.
- B) Konzentrationsabhängige Inhibition der Aβ 40 und Aβ 42 Sekretion durch die Substanz A.
Abbildung (Figur) 9: Substanz B.
Konzentrationsabhängige Inhibition der Aβ Bildung durch die Substanz B.
Abbildung (Fig) 10: Substanz C.
Konzentrationsabhängige Inhibition der Aβ Bildung durch die Substanz C.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch
Proteasen, die membranständige Substrate spalten, inhibieren können, bereitgestellt,
welches dadurch gekennzeichnet ist, daß
- a) man Zellen, die besagte Protease-Aktivität endogen oder exogen aufweisen sowie ein membran-assoziiertes rekombinantes Fusionsprotein exprimieren, welches das Substrat der besagten Protease mit der spezifischen Spaltstelle für besagte Protease und einen Reporter umfasst, kultiviert,
- b) diese Zellen mit einer Testsubstanz inkubiert,
- c) man die Menge des abgespaltenen Reporters mißt und
- d) der erhaltene Wert mit dem Wert verglichen wird, der in Abwesenheit der Testsubstanz erhalten wird.
Unter besagter Protease oder Proteaseaktivität wird ein Enzym bzw. eine enzymatische
Aktivität verstanden, die spezifisch, d. h. zwischen bestimmten Aminosäuresequenzen spaltet
und zwischen anderen Aminosäuresequenzen nicht, und deren Substrate membranständig
oder membranassoziiert sind. Unter membranständig soll im Rahmen dieser Erfindung
verstanden werden, daß das Substrat integraler Bestandteil der Membran ist. Unter
membranassoziert soll im Rahmen dieser Erfindung verstanden werden, daß das Substrat an
die Oberfläche der Membran oder an integrale Membranproteine gebunden ist. Es sollen
von dieser Definition für membranassozierte Substrate auch Substrate umfaßt werden, die
über chemische Gruppierungen mit dem hydrophoben Teil der Membran wechselwirken, die
durch posttranslationale Modifikationen hinzugefügt wurden. Ferner sollen unter den
Begriff membranassozierte Substrate auch Substrate fallen, die über
Aminosäurenseitenketten mit dem hydrophoben Teil der Membran wechselwirken,
allerdings in geringerem Maße als die integralen Membranproteine. Beispielhaft soll hier die
Prostaglandinsynthetase genannt werden. Unter Substrat sollen Peptide und Proteine
verstanden werden, die mindestens eine Spaltstelle besagter Protease enthalten. Die
Substrate können auch modifiziert sein, d. h. z. B. glykosyliert. (Sambrook et al., 1989).
Erfindungsgemäß ist besagtes Substrat an einen Reporter (s. unten) fusioniert, der zum
Nachweis der Proteaseaktivität (Spaltung) dient. Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine
können durch gängige gentechnologische Methoden (Sambrook et al., 1989) hergestellt
werden, wenn die für das Substrat und das Reporterprotein kodierende DNS verfügbar ist.
Die DNS, die für die Reporterproteine kodiert, kann z. B. von kommerziellen Anbietern
erhalten werden, wie z. B. Clontech, Heidelberg, und durch Standardverfahren (Sambrook
and Maniatis, 1989) in die gewünschten Vektoren eingesetzt werden. Die DNS, die für das
Substrat kodiert, kann für einige Proteasen mit Standardmethoden aus geeigneten
Genbanken erhalten werden.
Testsubstanzen können jegliche dem Fachmann bekannte oder auch neue Substanzen sein.
Beispielsweise können diese Substanzen Proteine oder chemische Verbindungen sein, die
auch in kommerziellen Substanz-Bibliotheken erhältlich sind.
Indem, wie unter Teil d) des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben, der erhaltene
Wert mit dem Wert verglichen wird, der in Abwesenheit der Testsubstanz erhalten wird,
kann die Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens kontrolliert werden. Der Fachmann
kann mit einer solchen Kontrolle die Substanzen erkennen, die die erfindungsgemäße
Inhibition besagter Proteasen aufweisen.
Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen
kultiviert, die ein Fusionsprotein exprimieren, das die spezifische Spaltstelle der γ-Sekretase
umfasst (Siehe auch Beispiel 1). Das erfindungsgemäße Fusionsprotein mit dem γ-
Sekretase-Substrat kann ganz allgemein membranassoziert, bevorzugt aber
membranständig, sein.
Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen
kultiviert, die ein Fusionsprotein exprimieren, das die spezifische Spaltstelle der
Presenilinase umfasst.
Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren in einer besonderen Ausführungsform
dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein Amyloid β umfaßt. Dies stellt das Substrat
der γ-Sekretase dar.
Für das erfindungsgemäße Verfahren in einer speziellen Ausführungsform umfaßt das
Fusionsprotein ein Fragment von Amyloid β. Dies stellt das Substrat der γ-Sekretase dar
und muß erfindungsgemäß zumindest eine spezifische γ-Sekretase Schnittstelle beinhalten.
Für das erfindungsgemäße Verfahren in einer speziellen Ausführungsform umfaßt das
Fusionsprotein das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP; engl.: "amyloid precursor protein")
oder ein Fragment davon. Beispielsweise kann das Fusionsprotein aus einem
Reporterprotein und dem C99-Fragment bestehen. Die DNS, die für das γ-Sekretase-
Substrat oder für das C99-Fragment kodiert, kann mit Standardmethoden aus geeigneten
Genbanken erhalten werden. Dies stellt das Substrat der γ-Sekretase dar und muß
erfindungsgemäß zumindest eine spezifische γ-Sekretase Schnittstelle beinhalten.
Für das erfindungsgemäße Verfahren in einer speziellen Ausführungsform umfaßt das
Fusionsprotein Presenilin 1 oder ein Fragment davon. Die Fragmente können beispielsweise
N-terminale Fragmente (NTF) von ca. 21-28 kDa oder C-terminale Fragmente (CTF) von
16-24 kDa (Haas et al., 1998; Okochi et al., 1997; Thinakaran et al., 1996) sein, die
allerdings über die Presenilinase Schnittstelle hinausgehen müssen. Presenilin 1 oder dessen
Fragmente stellen die Substrate der Presenilinase dar und muß erfindungsgemäß zumindest
eine spezifische Presenilinase Schnittstelle beinhalten.
Für das erfindungsgemäße Verfahren in einer speziellen Ausführungsform umfaßt das
Fusionsprotein Presenilin 2 oder ein Fragment davon. Die Fragmente können beispielsweise
N-terminale Fragmente (NTF) von ca. 28-30 kDa (NTF) kDa oder C-terminale Fragmente
(CTF) von 20-25 kDa (Haas et al., 1998; Kim et al., J Biol Chem 1997, 272, 11006-11010;
Podlisny et al., 1997) sein, die allerdings über die Presenilinase Schnittstelle hinausgehen
müssen. Presenilin 2 oder dessen Fragmente stellen die Substrate der Presenilinase dar und
muß erfindungsgemäß zumindest eine spezifische Presenilinase Schnittstelle beinhalten.
Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Hochdurchsatzmusterungstest ("high
throughput screening - HTS"). Dieser HTS ist vorteilhaft gegenüber dem Stand der Technik,
da hiermit auf einfache Weise eine Vielzahl von Substanzen auf ihre Wirksamkeit getestet
werden kann. Ein Hochdurchsatztest oder HTS ist ein Verfahren, bei dem eine große bis
sehr große Anzahl an Substanzen gleichzeitig untersucht wird. Vorzugsweise kann ein HTS
in Mikrotiterplatten ausgeführt werden, kann teilweise oder völlig automatisiert werden und
kann an elektronische Geräte wie Computer für die Datenspeicherung, -analyse und
-auswertung mittels Bioinformatik angeschlossen werden. Bevorzugt findet besagte
Automatisierung sowohl mittels Robotern statt, wie sie auch aus der Automobilindustrie
bekannt sind, welche in der Lage sind, große Anzahlen an Mikrotiterplatten gleichzeitig
oder sequenziell zu handhaben als auch mittels automatischer Pipettiereinrichtungen. Diese
automatischen oder teil-automatischen HTS-Anlagen sind in der Lage, mehrere tausend
Tests pro Tag durchzuführen und werden kommerziell angeboten. Testsubstanzen können
als Substanzbibliotheken kommerziell erworben werden. Die Testsubstanzen werden
vorzugsweise in einem organischen Lösungsmittel gelöst, besonders bevorzugt werden sie
in DMSO gelöst. Vorzugsweise werden die Testsubstanzen, welche die gewünschte
Proteaseinhibitorfunktion in einem zellfreien System aufweisen, auch in einem zellbasierten
System getestet. Der Ausdruck Hochdurchsatztest oder HTS beinhaltet auch
Ultrahochdurchsatztests (Englisch: "ultra high throughput screening: UHTS"). Bevorzugt
werden besagte Ultrahochdurchsatztests oder UHTS in 384- oder 1536-Loch
Mikrotiterplatten ausgeführt mit sub-Mikroliter- oder sub-Nanoliter- Pipettoren,
verbesserten Plattenlesegeräten und mit Verfahren, die die Verdunstung verhindern. HTS
Methoden werden beispielsweise in den US Patenten US 5876946 A or US 5902732 A
beschrieben. Dem Durchschnittsfachmann sind weitere Literaturquellen zu HTS oder UHTS
Tests bekannt und er kann die Verfahren der gegenwärtigen Erfindung ohne erfinderischen
Schritt an ein HTS oder UHTS Format anpassen, ohne selbst erfinderisch tätig zu sein.
Im Rahmen dieser Erfindung soll unter einem Reporterprotein ein Protein verstanden
werden, das die Eigenschaft besitzt, ein leicht detektierbares Signal zu generieren, und
dessen Menge mit der Menge des interessierenden Spaltproduktes korreliert. Die
Signalgenerierung erfolgt entweder durch die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des
Reporterproteins mit leicht zu detektierenden Substraten oder durch Messung der Intensität
der Fluoreszenz des Reporterproteins. Beispiele für Reporterproteine sind das grün
fluoreszierende Protein (GFP; engl: "green fluorescent protein"; siehe z. B. WO 95/07463)
oder in anderen Wellenlängenbereichen fluoreszierende Derivate davon oder Enzyme wie
die Luziferase, die sekretorische alkalische Phosphatase oder die β-Galaktosidase.
Daher wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens die Menge des abgespaltenen Reporters mit Luziferase, grün fluoreszierendem
Protein oder einem Derivat davon, der sekretorischen alkalischen Phosphatase oder der β-
Galaktosidase gemessen.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Menge des abgespaltenen Reporters indirekt nachgewiesen.
Eine große Anzahl an Transkriptionsfaktoren ist bekannt, für deren Aktivität zwei
Untereinheiten erforderlich sind. In anderen Fällen kann ein einzelner Transkriptionsfaktor
zwei separate funktionelle Domänen für seine Aktivität erfordern (z. B. eine transkriptionelle
Aktivatordomäne und eine DNA-Bindungsdomäne), so daß jede Domäne alleine inaktiv ist,
aber wenn sie zusammengebracht werden, kann die transkriptionelle Aktivität stattfinden.
Einer dieser Faktoren ist Gal4, der wie beschrieben in zwei Domänen geteilt werden kann
(Laughan, A and Gesteland, R Molec. Cell Biol., 1984, 4: 260-267; Fields and Song,
Nature, 1989, 340: 245). Weitere Transkriptionsfaktoren sind Mitglieder der Jun, Fos, and
ATF/CREB Familien, Oct1, Sp1, HNF-3, die steroide Rezeptor-Superfamilie und ähnliche
mehr.
Ebenso wird in noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens die Menge des abgespaltenen Reporters indirekt nachgewiesen, indem eine
abgespaltene Reporterdomäne in den Nukleus wandert, dort an eine weitere
Reporterdomäne eines Reporterkonstruktes bindet und die Expression des Reporters
aktiviert wird.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Menge des abgespaltenen Reporters Gal4 indirekt nachgewiesen, indem Gal4 im
Nukleus an die Gal4DNA-Bindungsdomäne eines weiteren Reporterkonstruktes bindet und
die Expression von Luziferase aktiviert wird (Siehe Beispiele 2 und 4).
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Menge des abgespaltenen Reporters direkt nachgewiesen. Beispielsweise könnte
dies ein direkter Nachweis der Spaltung durch die Protease mittels eines Reporters, der
beispielsweise erst bei Abspaltung aktiviert wird. Beispiele für Reporter können die oben
beschriebenen sein: GFP, oder Enzyme wie die Luziferase, die sekretorische alkalische
Phosphatase oder die β-Galaktosidase.
Zur Ausführung der Erfindung sind alle Zellen oder Zelllinien geeignet, die dem Fachmann
bekannt sind, vor allem eukaryontische Zellen oder Zelllinien. Bevorzugt sind Zellen oder
Zelllinien, die in der neurologischen oder neurobiologischen Forschung verwendet werden,
z. B. Säugerzellen oder -zelllinien wie H4, U373, NT2, HEK 293, PC12, COS, CHO,
Fibroblasten, Myelomazellen, Neuroblastomzellen, Hybridomzellen, Oozyten, embryonische
Stammzellen. Ferner sind Insektenzelllinien (z. B. unter Verwendung von Baculovirus
Vektoren wie pPbac oder pMbac (Stratagene, La Jolla, CA)), Hefe (z. B. unter Verwendung
von Hefeexpressionsvektoren wie pYESHIS (Invitrogen, CA)), und Pilze geeignet.
Besonders bevorzugt sind Zellen oder Zelllinien neuronalen oder glialen Ursprungs. In einer
ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den
verwendeten Zelten um H4-Zellen, menschliche Neurogliomazellen aus dem Gehirn, die
unter der ATCC-Nummer HTB-148 bei der "American Type Culture Collection (ATCC)",
in Manassas, Virginia, USA, hinterlegt sind.
Daher sind in einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die
Zellen neuronalen oder glialen Ursprungs.
In einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Zellen H4-
Zellen.
Erfindungsgemäß ist auch ein Hochdurchsatzmusterungstest zum Auffinden von
Substanzen, die spezifisch γ-Sekretase inhibieren können, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) man H4 Zellen, die besagte γ-Sekretase-Aktivität endogen oder exogen aufweisen sowie das membran-assoziierte rekombinante Fusionsprotein Aβ-KKK/Gal4 exprimieren, kultiviert,
- b) diese Zellen mit einer Testsubstanz inkubiert,
- c) man mittels der Höhe der Luziferaseexpression die Menge des abgespaltenen und an die Gal4-DNA Bindungsdomäne des Luziferasekonstruktes bindenden Transaktivators Gal4 mißt und
- d) der erhaltene Wert mit dem Wert verglichen wird, der in Abwesenheit der Testsubstanz erhalten wird.
In den Beispielen ist dieser erfindungsgemäße Hochdurchsatztest näher beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Verfahren oder Hochdurchsatzmusterungstests können im Rahmen
dieser Erfindung zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch γ-Sekretase inhibieren
können, verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren oder Hochdurchsatzmusterungstests können im Rahmen
dieser Erfindung zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch Presenilinase inhibieren
können, verwendet werden.
Weiterhin umfasst die Erfindung Substanzen, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren
oder Hochdurchsatzmusterungstest auffindbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie
spezifisch die proteolytische Spaltung eines γ-Sekretase-Substrats inhibieren. Beispielsweise
können diese Substanzen Proteine oder chemische Verbindungen sein. Eine
erfindungsgemäße Substanz ist die Substanz A, wie in der folgenden Formel dargestellt
(siehe auch Beispiel 8):
Weiterhin umfasst die Erfindung Substanzen, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren
oder Hochdurchsatzmusterungstest auffindbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie
spezifisch die proteolytische Spaltung eines Presenilinase-Substrats inhibieren.
Beispielsweise können diese Substanzen Proteine oder chemische Verbindungen sein.
Besagte erfindungsgemäße Substanzen können im Rahmen dieser Erfindung zur Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere der
Alzheimer-Krankheit verwendet werden. Weitere neurodegenerative Erkrankungen
umfassen beispielsweise Alzheimer, Parkinson und Veitstanz (Engl.: "Chorea Huntington").
Die Erfindung umfaßt auch eine pharmazeutische Formulierung, die eine erfindungsgemäße
Substanz sowie übliche pharmazeutische Trägersubstanzen enthält.
Ein pharmazeutisch akzeptabler Träger kann physiologisch akzeptable Verbindungen
enthalten, die z. B. die Stabilität oder Absorption der erfindungsgemäßen Substanz erhöhen.
Solche physiologisch akzeptable Verbindungen beinhalten z. B. Kohlenhydrate wie Glukose,
Saccharose oder Dextrane, Antioxidantien wie Ascorbat oder Glutathion, Chelatbildner,
Proteine mit niedrigem Molekulargewicht oder andere Stabilisatoren (siehe z. B.
Remington's Pharmaceutical Sciences (1990)). Ein Fachmann weiß, daß die Auswahl eines
pharmazeutisch akzeptablen Trägers einschließlich einer physiologisch akzeptablen
Verbindung z. B. vom Administrationsweg abhängt.
Die folgenden Beispiele sollen der Erläuterung dienen und in keiner Weise die Breite der
Erfindung einschränken.
H4 Neurogliomazellen (Hinterlegungsnummer HTB 148 bei der "American Type Culture
Collection", Manassas, Virginia, USA) wurden unter Standardbedingungen mit dem
Reporterkonstrukt pFRLuc (Stratagene) stabil transfiziert, das das Gen für die Luziferase
trägt, welches unter der Kontrolle eines Promotors ist, der die Gal4-DNA Bindungsdomäne
beinhaltet. Durch transiente Transfektionsexperimente mit pcDNA3-Gal4, das für das
lösliche Gal4 codiert, wurde ein individueller Klon ausgewählt, der die höchste Lucifearse
Aktivität aufwies. Zur Herstellung des Aβ-KKK/Gal4-Konstrukts wurde eine Sequenz, die
die N-terminale Signalsequenz des APP und die ersten 55 Aminosäuren von Aβ (Shoji et al.
1992) enthielt, mit der Gal4 kodierenden Sequenz (Laughan, A and Gesteland, R Molec.
Cell Biol., 1984, 4: 260-267) durch gentechnische Methoden verbunden und in den
Expressionsvektor pcDNA3neo (Invitrogen) kloniert. Dieses Konstrukt wurde als Aβ-
KKK/Gal4 bezeichnet. Um ein ER-Retentionssignal in das Substrat der γ-Sekretase
einzufügen, wurden die letzten Nukleotide des Gal4 durch gentechnische Methoden so
verändert, daß sie für die Aminosäuren KKLI kodierten. Dieses Konstrukt wurde Aβ-KKK-
ER/Gal4 genannt. Der wie oben beschrieben erhaltene Zellklon wurde für die zweite stabile
Transfektion mit pcDNA3/Aβ-KKK/Gal4 oder pcDNA3/Aβ-KKK-ER/Gal4 eingesetzt und
die Selektion mit Neomycin unter Standardbedingungen (Sambrook and Maniatis, 1989)
durchgeführt. Einzelne Neomycin resistente Zellklone wurden auf Expression der Luziferase
untersucht. Die Klone mit der höchsten Expression wurden für die Substanz-Analysen
eingesetzt. Alle Transfektionen wurden mit dem Fugene-Transfektionssystem von
Boehringer Mannheim nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
Um Inhibitoren der Presenilinase zu identifizieren, wurde ein Konstrukt entworfen, daß aus
einem Substratanteil (Presenilinanteil) und einem Reporteranteil (Gal4) besteht. Der
Presenilinanteil besteht aus den Nukleotiden, die für die Aminosäuren 3-101 und den
Aminosäuren 263 bis 325 des PS-1 (Sherrington et al., 1995) kodieren. Die erste Region
beinhaltet dabei die erste Transmembranregion des PS-1. Durch gentechnische Methoden
wurde N-terminal der ersten Presenilinsequenz die humane APP Signalsequenz (Shoji et al.
1992) angehängt. Der Reporteranteil schließt sich an die zweite Presenilinregion an (Gal4,
Aminosäure 1-881; Laughan, A and Gesteland, R Molec. Cell Biol., 1984, 4: 260-267).
Dieses Kontrukt wurde in den Expressionsvektor pcDNA3neo (Invitrogen) kloniert.
Die doppelt stabile HTS Zellinie wird auf eine 96/384 Mikrotiterplatte ausgesät. Bei
Konfluenz der Zellen werden diese mit der jeweiligen Testsubstanz für einen definierten
Zeitraum inkubiert. Nach Inkubation wird das Zellmedium abgenommen und die Luziferase-
Enzymaktivität exakt nach Angaben des Herstellers des verwendeten Testkits (SteadyGlo,
Promega oder von einem anderen Hersteller) bestimmt.
Durch die Anwesenheit einer endogenen oder exogenen γ-Sekretaseaktivität in den H4
Zellen wird das Substrat (Aβ-KKK/Gal4) proteolytisch gespalten, wobei sich der
Transaktivator Gal4 aus der Membran lösen und in den Zellkern gelangen kann. Im Zellkern
bindet Gal4 an die Gal4-DNA Bindungsdomäne des Reporterkonstrukts und aktiviert somit
die Expression der Luziferase. Bei Anwesenheit eines spezifischen γ-Sekretase-Inhibitors
kann das Substrat nicht gespalten werden und Gal4 verbleibt, am Substrat gebunden, an der
Zellmembran, was zu einer Reduktion bis hin zur vollständigen Inhibitio in der
Luziferaseaktivität führt.
Zellen werden auf 96/384 Loch-Platten in DMEM Vollmedium (10% FCS, 1% Glutamin,
1% Penicillin/ Streptomycin) ausgesät in einer Verdünnung von 1 : 5. Die Zellen werden 24
bis 48 h (je nach verwendetem Zellklon und Verdünnung) bei 37°C, 5% CO2 inkubiert und
bis 80-90% Konfluenz wachsen gelassen (auch etwas kürzer bzw. länger möglich). Nun
wird die Testsubstanz zugegeben und über Nacht (8-16 h) bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
Die 96/384 Loch-Platten werden auf Raumtemperatur (RT) equilibriert. Das Kit "Steady
Glo"-Luziferase Assay System (Promega Katalog Nr. E2520) wird verwendet. Die
Luziferase Assay Reagenz wird aufgetaut und auf Raumtemperatur equilibriert bzw. frisch
angesetzt (Luziferase Assay-Substrat in Luziferase Assay-Puffer gelöst). Das Medium wird
von den Zellen abgesaugt. Es werden 100 µl (bezogen auf 96 Loch-Platten) frisches
Vollmedium pro Vertiefung zugegeben. Es werden 100 µl (bezogen auf 96 Loch-Platten)
Luziferase Assay-Reagenz zugegeben und 5 min bei RT inkubiert. Nun wird die
Lumineszenz gemessen. Für 384 Loch-Platten werden die pipettierten Mengen
entsprechend reduziert, wie dem Fachmann bekannt ist.
APP ist ein Transmembranprotein, das entlang des sekretorischen Stoffwechselwegs
prozessiert wird. Das 'full length' Protein wird vermutlich dabei bereits in sehr frühen
zellulären Kompartimenten wie ER (endoplasmatisches Retikulum) und Golgi-Apparat
durch die sogenannte β- und γ-Sekretasen gespalten, wobei überwiegend Aβ42 entsteht
(Wild-Bode et al., 1997). Im Trans Golgi-Netzwerk (TGN), in den Vesikeln, die vom TGN
abgeschnürt werden und zur Zellmembran wandern, bzw. direkt an der Zellmembran wird
vermutlich durch die Aktivität der gleichen oder aber ähnlicher Proteasen das Aβ40 gebildet
(Thinakaran et al., 1996). APP, das nicht im sekretorischen Stoffwechselweg prozessiert
wurde, kann dann über Endozytose in das endosomale/lysosomale System gelangen und
dort zu Aβ bzw. ganz degradiert werden (Koo and Squazzo, 1994).
Um die Substratkonzentration in denjenigen zellulären Kompartimenten zu erhöhen, in
denen die Aβ42 Bildung stattfindet, und um die Identifizierung von unspezifischen
Inhibitoren, wie z. B. Transport-Inhibitoren auszuschließen, wurde an das γ-Sekretase
Substrat, das Aβ-KKK/Gal4 Fusionsprotein, eine ER Retention-Signalsequenz gehängt.
Eine größere Anzahl verschiedener doppelt stabiler H4 Zellklone wurde hergestellt und auf
die Expression des Aβ-KKK/Gal4 Substratproteins hin untersucht. Zellextrakte wurden
nach Standardmethoden hergestellt, die Proteine in einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel
aufgetrennt und auf eine PVDF Membran transferriert. Das Fusionsprotein wurde mit einem
primären Antikörper gegen das Gal4 (Clontech; 1 : 5000) sowie mit einem sekundären
'Horseradish-Peroxidase'-gekoppelten Antikörper (Amersham; 1 : 6000) durch
Chemolumineszenz nachgewiesen.
Exemplarisch wird hier die Expression des Fusionsproteins in den Zellklonen Aβ-KKK-
ER/40, 59 und 65 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) sowie in den
Zellklonen Aβ-KKK/40 und 52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) gezeigt.
Hingegen konnte in den untransfizierten H4 Zellen (u. t.) und in den H4-Luc53 Zellen
(luc53), die nur mit dem Reporterkonstrukt Gal4dbd-Luc (Gal4-DNA-
Bindungsdomäne/Luziferase; engl. Luziferase) transfiziert wurden, keine Expression
nachgewiesen werden.
Die Zellklone Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER
Retentionssignal) sowie die Zellklone Aβ-KKK/40 und 52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne
ER Retentionssignal) wurden auf die Expression der Luziferase hin untersucht. Zellextrakte
wurden nach Standardmethoden hergestellt, die Proteine in einem 10%igen SDS-
Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf eine PVDF Membran transferiert. Die Luziferase
wurde mit einem primären Antikörper (Europa) in einer 1 : 100 Verdünnung sowie mit einem
sekundären 'Horseradish-Peroxidase'-gekoppelten Antikörper (Amersham; 1 : 6000) durch
Chemolumineszenz nachgewiesen.
In allen doppelt stabilen Zellklonen, nicht aber in den untransfizierten H4 (u. t.) sowie den
H4-Luc53 Zellen (luc53) konnte die Luziferase-Expression nachgewiesen werden. Als
Positivkontrolle wurden H4 Zellen mit den unterschiedlichen Substraten (lösliches Gal4
[sol. gal4], Aβ-KKK/Gal4 und Aβ-KKK-ER/Gal4) und dem Reporterkonstrukt Gal4dbd-
Luc (Gal4-DNA-Bindungsdomäne/Luziferase; engl. Luziferase) ko-transfiziert. Auch bei
diesen transienten Transfektionen konnte die Luziferase in den H4 Zellen nachgewiesen
werden.
Der Expressionslevel der Luziferase in den Zellidonen Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 (Substrat
Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) sowie in den Zellklonen Aβ-KKK/40 und 52
(Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) wurde auch mittels enzymatischer
Aktivitätsbestimmung (SteadyGlo, Promega) untersucht. Der Luziferase Assay wurde exakt
nach Angaben des Herstellers (Promega) durchgeführt.
In allen doppelt stabilen Zellklonen, nicht aber in den untransfizierten H4 (H4) sowie in den
H4-Luc53 Zellen (luc53) konnte Luziferase-Aktivität nachgewiesen werden. In diesem
Versuch wurde das Signal nicht auf die Proteinmenge bezogen.
In den beiden Zellklonen Aβ-KKK-ER/59 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER
Retentionssignal) und Aβ-KKK/52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal)
wurde die Luziferase-Aktivität bestimmt. Der Luziferase Assay (SteadyGlo, Promega)
wurde exakt nach Angaben des Herstellers (Promega) durchgeführt.
In allen doppelt stabilen Zellklonen, nicht aber in den untransfizierten H4 (H4) sowie in den
H4-Luc53 (luc53) Zellen konnte Luziferase-Aktivität nachgewiesen werden. In diesem
Versuch wurde das Signal auf die Proteinmenge bezogen. Die Unterschiede in der
Signalintensität zwischen den beiden Zellklonen korreliert mit dem Expressionslevel des
Substrats (siehe A).
Die Zellklone Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER
Retentionssignal) sowie die Zellklone Aβ-KKK/40 und 52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne
ER Retentionssignal) wurden auf Level an extrazellulärem Aβ40 und Aβ42 hin untersucht.
Zu den konfluenten Zellen wurde frisches Medium hinzugegeben und diese für weitere 16 h
inkubiert. Das Medium wurde nach der Inkubation abgenommen, und die Konzentration an
Aβ40 und Aβ42 in einem quantitativen ELISA (Steiner et al., 1998) bestimmt. Als
Kontrolle wurden untransfizierte H4 Zeilen verwendet, und die Konzentration an
sekretiertem Aβ40 und Aβ42 als 100% gesetzt.
Die Level an extrazellulärem Aβ42 in den Zellklonen Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 waren
geringfügig erhöht, kein Unterschied konnte allerdings für die Menge an sekretiertem Aβ40
in diesen Klonen festgestellt werden. Für die Zellklone Aβ-KKK/40 und 52 war weder für
Aβ40 noch für Aβ42 eine höhere Konzentration nachzuweisen.
Zellen der Klone Aβ-KKK-ER/59 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) und
Aβ-KKK/52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) wurden für 6 h mit
unterschiedlichen Konzentrationen von Brefeldin A (BFA) behandelt. Als Kontrolle wurden
unbehandelte Zellen verwendet.
Die Luziferase wurde mittels enzymatischer Aktivitätsbestimmung
nachgewiesen. Der Luziferase Assay wurde exakt nach Angaben des Herstellers
(SteadyGlo, Promega) durchgeführt. Im Zellklon Aβ-KKK/52, nicht aber in dem Zellklon
Aβ-KKK-ER/59 zeigte sich ein deutlicher BFA Effekt. Eine Erhöhung der BFA
Konzentration führt zu einer verstärkten Aβ Bildung im ER (Wild-Bode et al., 1997) und
damit zu einem Anstieg des Luziferasesignals.
Eine mögliche toxische Wirkung des BFA (in unterschiedlichen
Konzentrationen) auf die Zellen wurde durch ein Alamar Blue-Test (s. u.) untersucht, der
parallel zum Luziferase-Test durchgeführt wurde. Über den gesamten
Konzentrationsbereich hinweg war kein Vitalitätsverlust festzustellen.
Alamar Blue (Fa. Biosource International, VE = 100 ml, Cat. Nr. DAL 1100 (AL-01-100))
wird sterilfiltriert. Die Aussaat der Zellen und Substanzinkubation erfolgt wie in Beispiel 1.
Die Alamar Blue Inkubation erfolgt parallel zum Luziferase-Test.
Alamar blue wird mit Vollmedium (DMEM m 4,5 g/l Glucose + 10% FCS + 1% Glutamin +
1% Pen/Strep) auf 5% verdünnt. Das Medium wird abgesaugt. Die Zellen werden 1 × mit
Medium oder PBS gewaschen. Es werden 100 µl Alamar blue (5%) zugegeben (96 Well
Platte) und die Platte 1 h bei 37° und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert. Die
Fluorometrische Messung erfolgt bei einer Eingangswellenlänge von 544 nm, einer
Emissionswellenlänge von 590 nm und einer Messzeit: von 0,3 s/well. Die Angaben erfolgen
in Prozent der Kontrolle.
Die Zellklone Aβ-KKK-ER/59 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) und Aβ-
KKK/52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) wurden mit cDNAs
transfiziert, die für PS1 oder PS2 kodierten und eine Aspartat(Asp)mutation (PS1-D385N
oder PS2-D366A) trugen. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen mit Zeozin
selektioniert, um Poolzellen zu erhalten.
Der Expressionslevel der Luziferase in den Aβ-KKK/52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER
Retentionssignal) Poolzellen Pool-PS1mut (D385N) und Pool-PS2mut (D366A) wurde
mittels enzymatischer Aktivitätsbestimmung untersucht. Der Luziferase Assay wurde exakt
nach Angaben des Herstellers (SteadyGlo, Promega) durchgeführt. Eine deutliche
Reduktion der Luziferase-Signals auf ungefähr 10% des Kontrollwertes konnte in beiden
Poolzellen nachgewiesen werden. Als Kontrolle wurden die H4-Luc53 Zellen verwendet.
Der Expressionslevel der Luziferase in den Aβ-KKK-ER/59 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit
ER Retentionssignal) Poolzellen Pool-PS1mut (D385N) und Pool-PS2mut (D366A) wurde
mittels enzymatischer Aktivitätsbestimmung untersucht. Der Luziferase Assay wurde exakt
nach Angaben des Herstellers (SteadyGlo, Promega) durchgeführt. Eine Reduktion des
Luziferase-Signals auf ~60% (PS1mut), bzw ~70% (PS2mut) der Kontrolle konnte in
beiden Poolzellen nachgewiesen werden. Als Kontrolle wurden die H4-Luc53 Zellen
verwendet.
Die Poolzellen Aβ-KKK/52/D385N und D366A sowie die Poolzellen Aβ-KKK-
ER/59/D385N und D366A wurden auf die Überexpression der jeweiligen Presenilin-
Aspartatmutante hin mittels Western Blot Verfahren überprüft. Zellextrakte wurden nach
Standardmethoden hergestellt, die Proteine in einem 12%igen SDS-Polyacrylamidgel
aufgetrennt und auf eine PVDF Membran transferiert. PS1 wurde mit einem polyklonalen
Antikörper (5023; 1: 1000; Walter et al., 1997), PS2 mit einem monoklonalen Antikörper
(BI.HF5C; 1.3000; Steiner et al. 1999b) nachgewiesen. Wie beschrieben (Steiner et al.
1999a; Wolfe et al. 1999) verhindern beide Aspartatmutationen die Proteolyse von PS
Proteinen, so daß nur 'full length' PS nachgewiesen werden kann. Die Überexpression des
exogenen PS führt zudem in allen Fällen zur deutlichen Reduktion des endogenen PS,
ersichtlich durch die Abnahme an PS-C-terminalen Fragmenten (CTFs).
Die Zellklone Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER
Retentionssignal) sowie der Zellklon Aβ-KKK/52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER
Retentionssignal) wurden eingesetzt, um die inhibitorische Wirkung der Substanz A zu
überprüfen. Konfluente Zellen wurde über Nacht mit unterschiedlichen Konzentrationen der
Substanz A inkubiert. Der Luziferase Assay wurde exakt nach Angaben des Herstellers
(SteadyGlo, Promega) durchgeführt.
In allen Zellklonen inhibiert die Substanz A konzentrationsabhängig die Aβ Bildung, was
durch die Abnahme des Luziferasesignals angezeigt wird.
Die Substanz A war auch in einem zellulären Testsystem aktiv, in dem der extrazelluläre
Gehalt an Aβ40 und Aβ42 bestimmt wurde, der von der U373 Zellinie (U373: ATCC No.
HTB 14) sekretiert wurde. Diese Zellinie U373/APP751 ist eine Astrocytoma Zellinie, die
menschliches APP751 überexpremiert und große Mengen an Aβ40 (~100 pg/ml/4 Stunden
mit 5 × 107 Zellen in 15 ml Medium) und Aβ42 (~100 pg/ml/4 Stunden mit 5 × 107 Zellen in
15 ml Medium) sekretiert. Die Bestimmung erfolgt über ELISA (Steiner et al., 1998). Die
Aβ40 Sekretion wurde durch die Substanz A in einer konzentrationsabhängigen Weise stark
reduziert, wobei die Aβ42 Sekretion bei subinhibitorischen Dosen erhöht war und dann bei
höheren Dosen ebenfalls inhibiert wurde.
Die Zellklone Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER
Retentionssignal) sowie die Zellklone Aβ-KKK/40 und 52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne
ER Retentionssignal) wurden eingesetzt, um die inhibitorische Wirkung der Substanz B zu
überprüfen. Konfluente Zellen wurde über Nacht mit unterschiedlichen Konzentrationen der
Substanz B inkubiert. Der Luziferase Assay wurde exakt nach Angaben des Herstellers
(SteadyGlo, Promega) durchgeführt.
In keinem der Zellklone inhibiert die Substanz B konzentrationsabhängig die Aβ Bildung,
was durch gleichbleibende Signalintensität der Luziferase angezeigt wird.
Die Zellklone Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 (Substrat Aβ-KKK mit ER Retentionssignal)
sowie der Zellklon Aβ-KKK/52 (Substrat Aβ-KKK ohne ER Retentionssignal) wurden
eingesetzt, um die inhibitorische Wirkung der Substanz C zu überprüfen. Konfluente Zellen
wurde über Nacht mit unterschiedlichen Konzentrationen der Substanz A inkubiert. Der
Luziferase Assay wurde exakt nach Angaben des Herstellers (SteadyGlo, Promega)
durchgeführt.
In keinem der Zellklone inhibiert die Substanz C konzentrationsabhängig die Aβ Bildung,
was durch gleichbleibende Signalintensität der Luziferase angezeigt wird.
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Claims (23)
1. Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch Proteasen, die
membranständige Substrate spalten, inhibieren können, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) man Zellen, die besagte Protease-Aktivität aufweisen sowie ein membran assoziiertes rekombinantes Fusionsprotein exprimieren, welches das Substrat der besagten Protease mit der spezifischen Spaltstelle für besagte Protease und einen Reporter umfasst, kultiviert,
- b) diese Zellen mit einer Testsubstanz inkubiert,
- c) man die Menge des abgespaltenen Reporters mißt und
- d) der erhaltene Wert mit dem Wert verglichen wird, der in Abwesenheit der Testsubstanz erhalten wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen kultiviert, die
ein Fusionsprotein exprimieren, das die spezifische Spaltstelle der γ-Sekretase umfasst.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen kultiviert, die
ein Fusionsprotein exprimieren, das die spezifische Spaltstelle der Presenilinase umfasst.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das
Fusionsprotein Amyloid β umfaßt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das
Fusionsprotein ein Fragment von Amyloid β umfaßt.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das
Fusionsprotein das Amyloid-Vorläufer-Protein oder ein Fragment davon umfaßt.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
Fusionsprotein Presenilin 1 oder ein Fragment davon umfaßt.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
Fusionsprotein Presenilin 2 oder ein Fragment davon umfaßt.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das
Verfahren ein Hochdurchsatzmusterungstest ("high throughput screening") ist.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge
des abgespaltenen Reporters mit Luziferase, grün fluoreszierendem Protein oder einem
Derivat davon, der sekretorischen alkalischen Phosphatase oder der β-Galaktosidase
gemessen wird.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die
Menge des abgespaltenen Reporters indirekt nachgewiesen wird.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die
Menge des abgespaltenen Reporters indirekt nachgewiesen wird, indem eine
abgespaltene Reporterdomäne in den Nukleus wandert, dort an eine weitere
Reporterdomäne eines Reporterkonstruktes bindet und die Expression des Reporters
aktiviert wird.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die
Menge des abgespaltenen Reporters Gal4 indirekt nachgewiesen wird, indem Gal4 im
Nukleus an die Gal4DNA-Bindungsdomäne eines weiteren Reporterkonstruktes bindet
und die Expression von Luziferase aktiviert wird.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die
Menge des abgespaltenen Reporters direkt nachgewiesen wird.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen
neuronalen oder glialen Ursprungs sind.
16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen
H4-Zellen sind.
17. Hochdurchsatzmusterungstest zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch γ-
Sekretase inhibieren können, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) man H4 Zellen, die besagte γ-Sekretase-Aktivität endogen aufweisen sowie das membran-assoziierte rekombinante Fusionsprotein Aβ-KKK/Gal4 exprimieren, kultiviert,
- b) diese Zellen mit einer Testsubstanz inkubiert,
- c) man mittels der Höhe der Luziferaseexpression die Menge des abgespaltenen und an die Gal4-DNA Bindungsdomäne des Luziferasekonstruktes bindenden Transaktivators Gal4 mißt und
- d) der erhaltene Wert mit dem Wert verglichen wird, der in Abwesenheit der Testsubstanz erhalten wird.
18. Verwendung eines Verfahrens oder Hochdurchsatzmusterungstestes gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 17 zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch γ-Sekretase inhibieren
können.
19. Verwendung eines Verfahrens oder Hochdurchsatzmusterungstestes gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 17 zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch Presenilinase
inhibieren können.
20. Substanz auffindbar mit einem Verfahren oder Hochdurchsatzmusterungstest gemäß
einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch die
proteolytische Spaltung eines γ-Sekretase-Substrats inhibiert.
21. Substanz auffindbar mit einem Verfahren oder Hochdurchsatzmusterungstest gemäß
einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch die
proteolytische Spaltung eines Presenilinase-Substrats inhibiert.
22. Verwendung einer Substanz gemäß Anspruch 20 oder 21 zur Herstellung eines
Medikaments zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere der
Alzheimer-Krankheit.
23. Pharmazeutische Formulierung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Substanz gemäß
Anspruch 20 oder 21 sowie übliche pharmazeutische Trägersubstanzen enthält.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10000161A DE10000161A1 (de) | 2000-01-06 | 2000-01-06 | Verfahren zur Identifikation eines Proteaseinhibitors |
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