MX2015001942A - Anticuerpos anti-jagged y métodos de uso. - Google Patents

Anticuerpos anti-jagged y métodos de uso.

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Abstract

La invención proporciona anticuerpos anti-Jagged y métodos para utilizarlos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-JAGGED Y MÉTODOS DE USO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una solicitud no provisional presentada según el titulo 37, § 1.53(b)(1) del C.F.R. (Código de Reglamentos Federales, por sus siglas en inglés), que reivindica prioridad según el título 35, § 119(e) del U.S.C. (Código de los Estados Unidos, por sus siglas en inglés) a la solicitud provisional estadounidense N.° de Serie 61/682640, presentada el 13 de agosto de 2012, y la solicitud provisional estadounidense N.° de Serie 61/784332, presentada el 14 de marzo de 2013, cuyos contenidos se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se presentó en formato ASCII a través de la EFS-Web y se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. Dicha copia de ASCII, creada el 9 de agosto de 2013, se denomina P4959Rl_WO_SeqList.txt y tiene un tamaño de 121.708 bytes.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención hace referencia a anticuerpos anti-Jagged y métodos para utilizarlos.
ANTECEDENTES La vía de señalización de Notch regula un conjunto diverso de funciones celulares (Kopan et ál., Cell 137, 216-233 (2009)). Se han identificado cuatro receptores Notch en mamíferos, es decir, Notch 1-4, que comparten elementos estructurales básicos que incluyen un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular. De manera similar, los ligandos canónicos de Notch comparten determinadas similitudes estructurales pero también se han identificado una cantidad de ligandos no canónicos de Notch (Kopan et ál., Cell 137, 216-233 (2009)). Los cinco ligandos canónicos en mamíferos son tipo Delta 1, tipo Delta 3, tipo Delta 4, Jaggedl y Jagged2. La unión de un ligando de Notch al dominio extracelular de un receptor de Notch establece una cascada de señalización en movimiento que comienza con la escisión proteolítica en el sitio extracelular S2 mediante una alfa secretasa de la familia ADAM (una desintegrina y metaloproteinasa). La escisión en S2 es seguida por la escisión proteolítica mediante una gamma secretasa en el sitio S3 intracelular, que da como resultado la liberación del dominio intracelular y eventos posteriores que, en última instancia, activan los factores de transcripción dependientes de Notch, tales como Hesl y Hcy.
Dado que la expresión y señalización anómala de Notch ha participado en una cantidad de enfermedades, incluyendo el cáncer (Koch et al., Cell . Mol . Life Sci . 64, 2746-2762 (2007)), se han investigado los moduladores de la señalización de Notch como agentes terapéuticos posibles para dichas enfermedades. Por ejemplo, se han analizado los inhibidores de gamma secretasa en ensayos clínicos para determinar su eficacia en el tratamiento de varias neoplasias malignas (Shih et ál, C ncer Res.67, 1879-1882 (2007)). Los inhibidores de gamma secretasa evitan la escisión en S3 y, por lo tanto, evitan la señalización a través de receptores de Notch. Sin embargo, los inhibidores de gamma secretasa no distinguen a los miembros individuales de la familia Notch y, por lo tanto, inhiben la señalización a través de múltiples receptores al mismo tiempo, así como también a través de vías no relacionadas (Beel et ál., Cell . Mol . Life Sci. 65, 1311-1334 (2008)). Por consiguiente, la administración de los inhibidores de gamma secretasa está asociada a la toxicidad intestinal marcada por la pérdida de peso y la metaplasia intestinal de células caliciformes, indicadores de un rol de Notch en la determinación del destino celular al mantener la proliferación de las células progenitoras de la cripta intestinal y al prohibir la diferenciación a un destino celular de secreción (Véase van Es et ál., Nature 435:959-963 (2005)). De manera similar, la inhibición de la señalización de Notchl y Notch2 mediante la inactivación génica de Notch condicional (Riccio et ál., EMBO Rep. 9:377-383 (2008)) o mediante la inhibición de anticuerpo antagonista (publicación de solicitud de patente estadounidense N.° 2010/0080808) también causa la metaplasia intestinal de células caliciformes.
Debido a la toxicidad grave asociada a los inhibidores de múltiples receptores de Notch, existe la necesidad imperiosa en la téenica de una inhibición dirigida de la señalización a través de receptores específicos.
COMPENDIO La invención proporciona anticuerpos anti-Jagged y métodos para utilizarlos.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a Jaggedl. En una modalidad, el anticuerpo es un antagonista de la señalización mediada por Jaggedl. En una modalidad, el anticuerpo comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR que se seleccionan de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:81; (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:84; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:87; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:110; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:114. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:81; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:82; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:85; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:110; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:111; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:112. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:81; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:82; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:86; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:110; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:111; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:113. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:81; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:83; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:85; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:110; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:111; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:112.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a Jagged2. En una modalidad, el anticuerpo es un antagonista de la señalización mediada por Jagged2. En una modalidad, el anticuerpo comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR que se seleccionan de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:94; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:115; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:116; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:122. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:90; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:117. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:91; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:118. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:90; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:119. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:92; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:93; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:121.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a Jaggedl y Jagged2 (Jaggedl/2). En una modalidad, el anticuerpo es un antagonista de la señalización mediada por Jaggedl/2. En una modalidad, el anticuerpo comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR que se seleccionan de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:95; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96; (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:99; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:123; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124; y (f) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:127. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:95; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:97; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:123; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:95; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:98; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:123; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:126.
En otra modalidad, el anticuerpo comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR que se seleccionan de: (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:105; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:109; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:100; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:100; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:108; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:101; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:102; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:103; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132. En una modalidad, el anticuerpo comprende: (a) una HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:104; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132.
En determinadas modalidades de la invención, cualquiera de las modalidades anteriores es un anticuerpo monoclonal. En determinadas modalidades, cualquiera de las modalidades anteriores es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En determinadas modalidades, cualquiera de las modalidades anteriores es un fragmento de anticuerpo.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado tal como se describió anteriormente, que comprende además un marco de dominio variable de cadena ligera FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:60; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:61; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:62; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:135. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende un marco de dominio variable de cadena pesada FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:136; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:57; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:35. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende un marco de dominio variable de cadena pesada FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:57; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:35.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a Jaggedl, que comprende (a) una secuencia de VH con al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10; (b) una secuencia de VL con al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 o (c) una secuencia de VH como en (a) y una secuencia de VL como en (b). En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de VH de la SEQ ID NO:10. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de VL de la SEQ ID NO:19. En algunas modalidades, el anticuerpo que comprende una secuencia de VH de la SEQ ID NO:10 y una secuencia de VL de la SEQ ID NO:19. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una secuencia de VH con al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:11; (b) una secuencia de VL con al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20 o (c) una secuencia de VH como en (a) y una secuencia de VL como en (b). En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de VH de la SEQ ID NO:11. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de VL de la SEQ ID NO:20. En algunas modalidades, el anticuerpo que comprende una secuencia de VH de la SEQ ID NO:11 y una secuencia de VL de la SEQ ID NO:20.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a Jaggedl, que comprende (a) una secuencia de VH con al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15; (b) una secuencia de VL con al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24 o (c) una secuencia de VH como en (a) y una secuencia de VL como en (b). En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de VH de la SEQ ID NO:15. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de VL de la SEQ ID NO:24. En algunas modalidades, el anticuerpo que comprende una secuencia de VH de la SEQ ID NO:15 y una secuencia de VL de la SEQ ID NO:24.
Cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un anticuerpo IgGl de longitud completa.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que compite con cualquiera de las modalidades anteriores por la unión específica a Jaggedl. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que compite con cualquiera de las modalidades anteriores por la unión específica a Jagged2. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo aislado de las modalidades anteriores. En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula hospedadora de modo que se produzca el anticuerpo.
En otro aspecto, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de cualquiera de las modalidades anteriores y un agente citotóxico.
En un otro aspecto, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo de cualquiera de las modalidades anteriores y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, el anticuerpo de cualquiera de las modalidades anteriores se proporciona para su uso como medicamento. En algunas modalidades, el anticuerpo de cualquiera de las modalidades anteriores se proporciona para su uso en el tratamiento del cáncer. En algunas modalidades, el anticuerpo de cualquiera de las modalidades anteriores se proporciona para su uso en la reducción del crecimiento de células cancerosas.
En otro aspecto, se proporciona un método para inhibir la señalización mediada por Jaggedl. En una modalidad, se proporciona un método para inhibir la señalización mediada por Jaggedl in vitro. En una modalidad, se proporciona un método para inhibir la señalización mediada por Jaggedl in vivo.
En otro aspecto, un método para tratar a un individuo que tiene cáncer comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo de cualquiera de las modalidades anteriores. En una modalidad, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer del cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer del ducto biliar, cáncer pancreático, cáncer de piel, neoplasias malignas de linfocitos B y neoplasias malignas de células T.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra secuencias de aminoácidos de ejemplo de la proteína Jaggedl humana y murina.
La Figura 2 muestra secuencias de aminoácidos de ejemplo de la proteína Jagged2 humana y murina.
Las Figuras 3A-3D muestran las secuencias de aminoácidos de péptidos usados para la selección y tamizaje de la biblioteca de anticuerpos de fagos. Todas las proteínas se expresaron como proteína secretada en células BEVS y sus secuencias se enumeran en la dirección de extremo N a extremo C. (fig.3A) Secuencia de aminoácidos de Jagged 1-DSL-EGF1-4 (Q34-D377) murino de proteína expresada. La letra en negrita en el extremo N representa una secuencia de enlazador corta (ADLGS) (SEQ ID NO: 31). La letra en negrita en el extremo C representa una secuencia de enlazador corta (EFG), un sitio de escisión de trombina (LVPRGS) (SEQ ID NO: 137), un espaciador G y una etiqueta 6-His (SEQ ID NO: 138). (fig.3B) Secuencia de aminoácidos de Jagl-DSL-EGFl-4 humano de proteína expresada. Solo se muestra la secuencia Jagl aunque el antígeno también contenía un sitio de escisión de proteasa TEV y etiqueta 6-His (SEQ ID NO: 138) en el extremo C. (fig.3C) Secuencia de aminoácidos de Jag2-DSL-EGF1-4 (M27-E388) murino de proteína expresada. La letra en negrita en el extremo N representa una secuencia de enlazador corta (ADLGS) (SEQ ID NO: 31). La letra en negrita en el extremo C representa una secuencia de enlazador corta (EFG), un sitio de escisión de trombina (LVPRGS) (SEQ ID NO: 137), un espaciador G y una etiqueta 6-His (SEQ ID NO: 138). (fig.3D) Secuencia de aminoácidos de Jag2-DSL-EGF1-4 (R2-E388) humano de proteína expresada. La letra en negrita en el extremo C representa una secuencia de enlazador corta (EFG), un sitio de escisión de trombina (LVPRGS) (SEQ ID NO: 137), un espaciador G y una etiqueta 6-His (SEQ ID NO: 138).
Las figuras 4A-1-4B-2 muestran una alineación de las secuencias de aminoácidos para los dominios variables de cadena pesada (Figura 4A-1 y Figura 4A-2) y ligera (Figura 4B-1 y Figura 4B-2) de los anticuerpos anti-Jagged (Ejemplo 1-2). Se indican las posiciones de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés).
Las Figuras 5A-5B muestra ejemplos de secuencias de marco de consenso de variable pesada humana (VH) de aceptor para su uso en la práctica de la presente invención. Los identificadores de secuencia son los siguientes: - marco de consenso "A" del subgrupo I de VH humana menos las CDR de Kabat (SEQ ID NOs:32, 33, 34, 35). - marcos de consenso "B", "C" y "D" del subgrupo I de VH humana menos las regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOS:36, 37, 34, 35; SEQ ID NOs:36, 37, 38, 35 y SEQ ID NOS:36, 37, 39, 35). - marco de consenso "A" del subgrupo II de VH humana menos CDR de Kabat (SEQ ID NOs:40, 41, 42, 35). - marcos de consenso "B", "C" y "D" del subgrupo II de VH humana menos las regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOS:43, 44, 42, 35; SEQ ID NOs:43, 44, 45, 35 y SEQ ID NOs:43, 44, 46 y 35). - marco de consenso "A" del subgrupo III de VH humana menos CDR de Kabat (SEQ ID NOs:47, 48, 49, 35). - marcos de consenso "B", "C" y "D" del subgrupo III de VH humana menos las regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOs:50, 51, 49, 35; SEQ ID NOs:50, 51, 52, 35 y SEQ ID NOs:50, 51, 53, 35). - marco de consenso "A" del aceptor de VH humana menos las CDR de Kabat (SEQ ID NOs:54, 48, 55, 35). - marcos de aceptor de VH humana "B" y "C" menos las regiones hipervariables (SEQ ID NOs:50, 51, 55, 35 y SEQ ID NOs:50, 51, 56, 35). - marco de consenso "A" del aceptor 2 de VH humana menos las CDR de Kabat (SEQ ID NOs:54, 48, 57, 35). - marco de consenso "B", "C" y "D" del aceptor 2 de VH humana menos las regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOs:50, 51, 57, 35; SEQ ID NOs:50, 51, 58, 35 y SEQ ID NOs:50, 51, 59, 35).
La Figura 6 muestra ejemplos de secuencias de marco de consenso de variable ligera (VL) de aceptor para su uso en la práctica de la presente invención. Los identificadores de secuencia son los siguientes: - marco de consenso del subgrupo de kappa I de VL humana (kn?): SEQ ID NO:60, 61, 62, 63 - marco de consenso del subgrupo de kappa II de VL humana (KV2): SEQ ID NO:64, 65, 66, 63 - marco de consenso del subgrupo de kappa III de VL humana (KV3): SEQ ID NO:67, 68, 69, 63 - marco de consenso del subgrupo de kappa IV de VL humana (KV4): SEQ ID NO:70, 71, 72, 63.
Las Figuras 7A-7F muestran las secuencias de región hipervariable (HVR, por sus siglas en ingles) de cadena pesada Hl, H2, y H3 de anticuerpos anti-Jagged, como se describe en los Ejemplos. Las posiciones de los aminoácidos se enumeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat como se describe más adelante.
Las Figuras 8A-8E muestran las secuencias de HVR de cadena ligera Ll, L2 y L3 de anticuerpos anti-Jagged, descritas en los Ejemplos. Las posiciones de los aminoácidos se enumeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat como se describe más adelante.
La Figura 9 muestra las secuencias marco de cadena ligera y pesada de anticuerpos anti-Jagged descritas en los Ejemplos. Los números en superíndice indican las posiciones de los aminoácidos de acuerdo con Kabat.
Las Figuras 10A-10B muestran la especificidad de unión de los anticuerpos obtenidos para la primera (Figura 10A) y la segunda (Figura 10B) ronda de tamizaje. (fig.lOA) Los resultados de los ensayos ELISA que miden la unión del anticuerpo D-l (panel izquierdo) y C-l (panel derecho) con respecto a Jaggedl humana (Jag-lh), Jagged2 humana (Jag-2h), tipo Delta 1 humana (DLL-lh), tipo Delta 1 murina (DLL-lm) o tipo Delta 4 humana (DLL-4h). Las concentraciones de anticuerpos se indican en el eje x y OD650 en el eje y. (fig.lOB) Resultados de los ensayos de ELISA que miden la especificidad de unión de los Anticuerpos A y B, ambos identificados durante el tamizaje adicional usando Jagl-DSL-EGF1-4 humano (Figura 3B) para el anticuerpo A y Jag2-DSL-EGF1-4 humano y murino (Figuras 3C y 3D) para el anticuerpo B. Columnas negras = unión a Jaggedl humano; columnas grises = unión a Jagged2 humano. Se utilizó C-l como un control para unirse con Jaggedl y Jagged2.
La Figura 11 muestra constantes de unión para los anticuerpos A, A-1, A-2, B, B-l, B-2, B-3, C, C-l, D, D-l y D-2 que se unen a Jaggedl humano purificado (Jagl humano), Jagged2 humano (Jag2 humano) y Jagged2 de ratón (Jag2 de ratón).
La Figura 12 muestra la inhibición dependiente de la dosis de la señalización inducida por Jaggedl de Notch 1 por los anticuerpos anti-Jagged. Se obtuvieron los resultados de experimentos de cocultivo que miden la señalización inducida por Jaggedl a través del receptor Notchl, tal como se describe en el Ejemplo 4. El eje y indica los niveles de expresión del gen indicador luciferasa de luciérnaga dependiente de Notch relativa a la expresión de un gen de control (promotor constitutivamente activo que induce la expresión de Renilla lucif erase) . El eje x indica las concentraciones para los anticuerpos D y C (0,4-50 mg/ml). El cocultivo sin anticuerpos (control positivo inducido por Jl) se utilizó para como control positivo para la señalización inducida por Jaggedl. Un anticuerpo de control de isotipo se utilizó como control para una inhibición de anticuerpos específica. Un inhibidor de gamma secretasa (compuesto E+) se utilizó como control para la inhibición de la señalización de Notch.
Las Figuras 13A-13B muestran la inhibición de la señalización Notch por anticuerpos anti-Jagged madurados por afinidad. Los ensayos de cocultivo se realizaron tal como se describe en la Figura 12 y Ejemplo 4. (fig.l3A) Los anticuerpos de fagos y sus concentraciones (pg/ml) se indican en el eje x (se utilizaron anticuerpos parentales C y D como control). El Compuesto E (CmpE) de los inhibidores de gamma secretasa (GSI, por sus siglas en inglés) y áster de N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-L-alanil]-S-fenilglicina de t-butilo (DAPT) como las concentraciones indicadas se utilizaron como control positivo para la inhibición de la señalización Notch; se utilizó DMSO como el control vehículo para los GSI; se utilizó un anticuerpo irrelevante con el mismo isotipo que los analizados en el panel como control de isotipo. (fig 13B) Los anticuerpos de fagos en la concentración indicada se indican en el eje x. DAPT en las concentraciones indicadas sirvió como control positivo para la inhibición de la señalización Notch; DMSO sirvió como vehículo de control. La señalización se indujo por Jaggedl (columnas gris oscuro) o por Jagged2 (columnas gris claro). Sin tratar = cultivos que no se estimularon con ligando y no se trataron con anticuerpo; Sin estimulación o 3T3P = cultivos no estimulados con ligando; agD o gD = anticuerpo de control de isotipo; Estim/sin AB o sin Ab = cultivos estimulados con ligando pero no tratados con anticuerpo; inhibidor DAPT gamma-secretasa o el vehículo de control DAPT de DMSO.
Las Figuras 14A-14B muestran que la inhibición combinada de Jaggedl y Jagged2 provoca una rápida pérdida de peso. (fig.l4A) A los ratones se los dosificó dos veces por semana con el anticuerpo anti-Jaggedl/2 C-l (anti-Jl/2; 5-10 mpk), el anticuerpo anti-Jaggedl A-2 (anti-Jl; 5-20mpk), el anticuerpo anti-Jagged2 B-3 (anti-J2; 5-20mpk), el anticuerpo A-2 y B-3 juntos (anti-Jl y 2; 5mpk cada uno) o un anticuerpo de control de isotipo (20 mpk). La concentración de anticuerpo total de cada dosificación se aumentó hasta 20mpk con el anticuerpo de control de isotipo, cuando fue necesario. Los cambios de peso corporal promedio (eje y) se grafican como un porcentaje de peso corporal de partida en el tiempo (eje x). (fig.l4B) Los ratones Balb/c (diez por grupo, alojados individualmente) fueron inyectados IP dos veces por semana ya sea con 30 mpk de anticuerpo de control de isotipo anti-gD o con una combinación de 15 mpk de anticuerpo A-2 más 15 mpk de anticuerpo B-3 durante ocho días. La ingesta de comida se evaluó pesando diariamente la comida administrada y el sobrante en cada caja. Las barras de error representan desviaciones estándar (n = 10).
Las Figuras 15A-15B muestran una histología intestinal normal del tratamiento de anticuerpo anti-Jagged a continuación. (fig.l5A) Las muestras intestinales de los ratones tratados como se describe en el Ejemplo 6 se aislaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (Figuras 15A, H&E) o con Alcian Blue (Figura 15A, Alcian Blue). (fig.l5B) Se tiñeron secciones de las muestras intestinales con anticuerpos primarios para tanto lizozima o Ki-67 (Figura 15B).
Las Figuras 16A-1-16B-2 muestran la inhibición del crecimiento celular de cáncer de pulmón humano por un anticuerpo antagonista anti-Jaggedl in vivo. Los ratones que tienen xenoinjertos de cáncer de pulmón humano fueron inyectados dos veces por día de forma intraperitoneal (IP) con 20mpk de anticuerpo de control de isotipo anti-gD (Ab de control de isotipo) o con anticuerpo anti-Jaggedl A-2 (Anti-Jagl), con las inyecciones comenzando luego de que los volúmenes tumorales promedio (medidos con calibradores) alcanzaran aproximadamente 180 mm3. Los volúmenes tumorales (eje y) se midieron posteriormente durante 19 días. Figura 16A-1 y Figura 16A-2: Los volúmenes tumorales promedio para cada grupo (n=10) se graficaron en el tiempo (eje x) usando un modelo de efectos mixtos lineales (Figura 16A-1). Los volúmenes tumorales para cada ratón en cada grupo se describen en los dos paneles en la Figura 16A-2. La Figura” 16B-1 y la Figura 16B-2: El peso corporal total de cada ratón se midió y gráfico como el cambio de porcentaje promediado para cada grupo (Figura 16B-1) o para cada ratón en cada grupo (Figura 16B-2).
Las Figuras 17A-17B muestran la inhibición del crecimiento celular de cáncer de mama humano por los anticuerpos antagonistas anti-Jaggedl y anti-Jagged2 in vivo. Los ratones C.B-17 SCID.bg con xenoinjertos de cáncer de mama humano fueron inyectaron los días 0, 4, 7, 12, 15, 18, 22, 25, 29, 32, 36, 43, 50 y 57 con anticuerpo de control de isotipo anti-gD (Anti-gD), anticuerpo de control de isotipo anti-ambrosía (anti-ambrosía), anticuerpo anti-Jaggedl A-2 en la estructura IgGl humana (anti-Jagl A-2 (IgGlh)), anticuerpo anti-Jaggedl A-2 en la estructura IgG2a murina (anti-Jagl A-2 (mIgG2a)), o anticuerpo anti-Jagged2 B-3 en la estructura IgGl humana (anti-Jag2 B-3 (hlgGl)). Los volúmenes tumorales (eje y) de los grupos de tratamiento (fig.l7A) o animales individuales (fig.l7B) se graficaron usando un modelo de efectos mixtos lineales en el tiempo (eje x).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE MODALIDADES DE LA INVENCIÓN I. DEFINICIONES Un "marco humano aceptor" a efectos de la presente es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco de dominio variable de cadena ligera (VL) o de un marco de dominio variable de cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina humana o de un marco de consenso humano, tal como se define a continuación. Un marco humano aceptor "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o de un marco de consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de este, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas modalidades, la cantidad de cambios de aminoácidos son 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunas modalidades, el marco humano aceptor de VL es idéntico en secuencia a la secuencia de marco de inmunoglobulina humana VL o secuencia de marco de consenso humana.
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en la presente, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de un molécula X con su compañera Y puede estar representada generalmente por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede calcularse usando métodos comunes conocidos en la téenica, que incluyen los descritos en la presente. A continuación se describen modalidades específicas ilustrativas y de ejemplo para medir la afinidad de unión.
Un anticuerpo de "afinidad madura" hace referencia a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee tales alteraciones, las cuales tienen como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo para antigeno.
Los términos "anticuerpo anti-Jagged" y "un anticuerpo que se une a Jagged" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unirse a Jaggedl, Jagged2, o Jaggedl y 2 (Jaggedl/2) con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico al dirigirse a Jagged. En una modalidad, el alcance de la unión de un anticuerpo anti-Jagged con una proteína no-Jagged no relacionada es menor que alrededor del 10 % de la unión del anticuerpo a Jagged según se midió, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés). En determinadas modalidades, un anticuerpo que se une a Jagged tiene una constante de disociación (Kd) de £ ImM, £ 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, o < 0,001 nM (por ejemplo 108 M o menos, por ejemplo de 108 M a 1013 M, por ejemplo, de 109M a 10~13 M). En determinadas modalidades, un anticuerpo anti-Jagged se une a un epítopo de Jagged que se conserva entre Jagged de diferentes especies.
El término "anticuerpo" se utiliza en la presente en el sentido más amplio y comprende varias estructuras de anticuerpo, que incluyen, de modo no taxativo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que exhiban la actividad deseada de unión al antígeno.
Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe significativamente (ya sea parcial o totalmente) una actividad biológica del antígeno al que se une.
Un "fragmento de anticuerpo" hace referencia a una molécula distinta a un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al cual se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, de modo no taxativo, Fv, Fab, Fab', Fab' -SH, F(ab')2 ; diacuerpos; anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena simple (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" como un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en 50% o más, y en cambio, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición en 50% o más. En la presente se proporciona un ejemplo de ensayo de competición.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el cual una parte de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie en particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie diferente.
La "clase" de un anticuerpo hace referencia al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, lgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, y y m, respectivamente.
El término "agente citotóxico" tal como se usa en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular y/o provoca destrucción o muerte celular. Los agentes citotóxicos incluyen, de modo no taxativo, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes quimioterapéuticos o fármacos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubíciña u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; sus enzimas y fragmentos, por ejemplo enzimas nucleoliticas; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimátreamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluso sus fragmentos y/o variantes; y los diversos agentes antitumorales o anticáncer divulgados a continuación.
Las "funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen: unión a Clq y citotoxicidad dependiente de complementos (CDC, por sus siglas en inglés); unión al receptor de Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de las células B); y activación de las células B.
Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
El término "región Fe" se utiliza en la presente para definir una región de extremo C de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una parte de la región constante. El término incluye regiones Fe de secuencia natural y regiones Fe variantes. En una modalidad, una región Fe de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxilo de cadena pesada. Sin embargo, la U sina en el extremo C (Lys447) de la región Fe puede estar presente o no. A menos que se especifique lo contrario en la presente, la numeración de los residuos de aminoácidos en la región Fe o región constante se realiza de acuerdo con el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, como se describe en Kabat et ál., Sequences of Proteins of I unological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Marco" o "FR" hacen referencia a los residuos del dominio variable distintos a los residuos de la región hipervariable (HVR). El FR de un dominio variable generalmente consiste en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(Ll)-FR2-H2(L2)-FR3- H3(L3)-FR4.
Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en la presente de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe tal como se define en la presente.
Los términos "célula hospedadora", "línea de células hospedadoras" y "cultivo de células hospedadoras" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, que incluye la progenie de dichas células. Las células hospedadoras incluyen las "células transformantes" y las "células transformadas" que incluyen la célula primaria transformada y la progenie derivada de esta independientemente de la cantidad de pasajes. Es posible que la progenie no sea completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula progenitora, pero puede contener mutaciones. En la presente se incluye progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica examinada o seleccionada en la celula originalmente transformada.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivada de un origen no humano que utiliza repertorios de anticuerpo humano u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente al anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
Un "marco de consenso humano" es un marco que representa los residuos de aminoácidos de origen más común en una selección de secuencias de marco VL o VH de inmunoglobulina humana. Generalmente, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana se realiza a partir de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et ál., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, N1H Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En una modalidad, para el VL, el subgrupo es un subgrupo kappa I como en Kabat et ál., supra. En una modalidad, para el VH, el subgrupo es un subgrupo III según Kabat et ál., supra.
Un anticuerpo "humanizado" hace referencia a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVR no humanas y residuos de aminoácidos de FR humanos. En determinadas modalidades, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos un, y normalmente dos, dominios variables, en el cual todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, las CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano y todas o sustancialmente todas los FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha experimentado humanización.
La expresión "región hipervariable" o "HVR", tal como se utiliza en la presente, hace referencia a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de complementariedad" o "CDR") y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contiene los residuos que entran en contacto con antígenos ("contactos de antígenos"). Generalmente, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en la VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2, L3). Las HVR de ejemplo en la presente incluyen: (a) bucles hipervariables que se producen en los residuos de aminoácidos 26-32 (Ll), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Hl), 53-55 (H2), y 96-101 (H3) (Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196 : 901-917 (1987 ) ) ; (b) CDR que ocurren en los residuos de aminoácidos 24-34 (Ll), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (Hl), 50-65 (H2), y 95- 102 (H3) (Kabat et ál., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) los contactos de antígenos se producen en los residuos de aminoácidos 27c-36 (Ll), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (Hl), 47-58 (H2), y 93-101 (H3) (MacCallum et ál. J. Mol . Biol . 262: 732-745 (1996)); y (d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), incluyendo los residuos de aminoácidos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).
A menos que se especifique de otra manera, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se enumeran en la presente de acuerdo con Kabat et ál., supra .
Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, que incluyen de modo no taxativo, un agente citotóxico.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, de modo no taxativo, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinadas modalidades, el individuo o sujeto es un humano.
Un "anticuerpo aislado" es uno que ha sido separado de un componente de su entorno natural. En algunas modalidades, un anticuerpo se purifica hasta más del 95 % o el 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, mediante electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF, por sus siglas en inglés), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los métodos de evaluación de pureza de un anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatman et ál., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
Un ácido nucleico "aislado" hace referencia a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que comúnmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural. "Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-Jagged" hace referencia a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o fragmentos de estas), que incluyen dicha o dichas moléculas de ácido nucleico en un único vector o en vectores separados y dicha o dichas moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula hospedadora.
La expresión "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en la presente, hace referencia a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por los anticuerpos variantes posibles, por ejemplo, que contienen mutaciones de origen natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, dichas variantes generalmente están presentes en cantidades mínimas. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no se debe interpretar que requiere la producción del anticuerpo a través de ningún método específico. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizarán de acuerdo con la presente invención se pueden hacer a través de diversas téenicas, incluso, de modo no taxativo, el método de hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de visualización de fagos y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o partes de los locus de la inmunoglobulina humana, dichos métodos y otros ejemplos de métodos para realizar anticuerpos monoclonales se describen en la presente.
Un "anticuerpo no conjugado" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo no conjugado puede estar presente en una formulación farmacéutica.
"Anticuerpos naturales" hace referencia a moléculas de inmunoglobulina de origen natural con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glicoproteínas heterotetraméricas de alrededor de 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por enlace disulfuro. Del extremo N al extremo C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también denominada dominio variable pesado o dominio variable de cadena pesada, seguida por los tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, del extremo N al extremo C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también denominada dominio variable ligero o dominio variable de cadena ligera, seguida por un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (K) y lambda (l), con base en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
La expresión "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones que se suelen incluir en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, el uso, las dosis, la administración, la terapia de combinación, las contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de dichos productos terapéuticos.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación a efectos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras conocidas por el experto en la téenica, por ejemplo, mediante el uso de software informático disponible al público, tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la téenica pueden determinar parámetros adecuados para alinear las secuencias, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. A efectos de la presente, sin embargo, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc. y el código fuente se presentó con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de Estados Unidos, Washington D.C., 20559, donde se encuentra registrada con el n.° de Registro de Derechos de Autor de Estados Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede compilarse a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, lo que incluye UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias están establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en las que se usa ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos para, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como se indica a continuación: 100 veces la fracción X/Y donde X es la cantidad de residuos aminoácidos marcados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación del programa de A y B, y donde Y es la cantidad total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se indique específicamente de otra manera, todos los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente se obtienen tal como se describe en el párrafo inmediatamente anterior mediante el programa informático ALIGN-2.
El término "formulación farmacéutica se refiere a una preparación que es de una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en esta sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al cual se le administraría la formulación.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, de modo no taxativo, un amortiguador, excipiente, estabilizante o conservante.
El término "Jagged" o "Jag," como se usa en la presente, se refiere a cualquier Jagged natural de cualquier fuente vertebrada, que incluye mamíferos como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo ratas y ratones), a menos que se especifique de otro modo. El término comprende Jagged" de longitud completa" no procesado, así como cualquier forma de Jagged que resulte del procesamiento en la célula. El término también abarca las variantes de origen natural de Jagged, como por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de un ejemplo de Jaggedl y Jagged2 humano y murino se muestra en las Figura 1 y 2 (SEQ ID NOS:l-4), respectivamente.
Tal como se usa en la presente, "tratamiento" (y sus variaciones gramaticales como "tratar" o "se trata") se refiere a una intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo que se está tratando y se puede realizar ya sea para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseados del tratamiento incluyen, de modo no taxativo, evitar la aparición o la recurrencia de una enfermedad, aliviar los síntomas, disminuir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, evitar la metástasis, disminuir la velocidad de avance de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión o mejora en el pronóstico. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se utilizan para retardar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar el avance de una enfermedad.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que participa en la unión del anticuerpo a un antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen generalmente estructuras similares y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR) (Véase, por ej., Kindt et ál. Kuby Iwmunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007).) Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para lograr especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno en particular se pueden aislar mediante el uso de un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para analizar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et ál., J. Immunol . 150:880-887 (1993); Clarkson et ál., Nature 352:624-628 (1991).
El término "vector", tal como se utiliza en la presente, hace referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al cual se encuentra enlazado. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico auto-replicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula hospedadora en la cual se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los cuales están unidos de forma operativa. En la presente se hace referencia a dichos vectores como "vectores de expresión" II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS En un aspecto, la invención se basa, en parte, en la identificación de anticuerpos anti-Jagged y fragmentos de estos. En determinadas modalidades, se proporcionan anticuerpos que se unen al menos a un Jagged. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento del cáncer. Por lo tanto, la invención proporciona métodos, composiciones, kits y artículos de fabricación relacionados con los anticuerpos anti-Jagged.
A. Ejemplos de anticuerpos anti-Jagged En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que se unen a Jagged. En determinadas modalidades, el anticuerpo anti-Jagged es un anticuerpo anti-Jaggedl.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti- Jaggedl que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR que se seleccionan de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:81; (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:84; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:87; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:110; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111; y (f) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:114.
En un aspecto adicional, el anticuerpo anti-Jaggedl comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:81 y al menos una, dos, tres, cuatro o cinco HVR seleccionadas de (b), (c), (d), (e) y (f) anteriores. En una modalidad, el anticuerpo comprende (a), (b), (c), (d), (e) y (f) anteriores, donde con respecto a (b), (c) y (f) se contempla una o más cualesquiera de las siguientes modalidades: HVR-H2 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de las SEQ ID NOS: 82-83; HVR-H3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOS: 85- 86; y HVR-H3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOS: 112-113.
En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jaggedl, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:81; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:82; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:85; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:110; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:112; En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jaggedl, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:81; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:82; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:86; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:110; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:113; En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jaggedl, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:81; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:83; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:85; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:110; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:112; En determinadas modalidades, el anticuerpo anti-Jagged es un anticuerpo anti-Jagged2.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-Jagged2 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR que se seleccionan de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:94; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:115; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID O:116; y (f) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:122.
En un aspecto adicional, el anticuerpo anti-Jagged2 comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88 y al menos una, dos, tres, cuatro o cinco HVR seleccionadas de (b), (c), (d), (e) y (f) anteriores. En una modalidad, el anticuerpo comprende (a), (b), (c), (d), (e) y (f) anteriores, donde con respecto a (c) y (f) se contempla una o más cualesquiera de las siguientes modalidades: HVR-H3 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de SEQ ID NOS:90-93; y HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de SEQ ID NOS:117-121.
En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jagged2, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:90; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:117; En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jagged2, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:91; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:118; En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jagged2, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:90; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:119; En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jagged2, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:92; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:120; En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jagged2, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:93; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:121; En determinadas modalidades, el anticuerpo anti-Jagged es un anticuerpo anti-Jaggedl/2.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-Jaggedl/2 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionados de una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 95; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 96; una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99; una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 123; una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 124; y una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 127.
En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jaggedl/2, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:95; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:96; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:97; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:123; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:124; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:125; En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jaggedl/2, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:95; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:96; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:98; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:123; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:124; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:126; En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-Jaggedl/2 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 105; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 106; una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 109; una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128; una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 129; y una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134.
En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jaggedl/2, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:100; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:130; En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jaggedl/2, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:100; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:108; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:131; En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jaggedl/2, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:101; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:132; En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jaggedl/2, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:102; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:133; En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jaggedl/2, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:103; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:132; En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Jaggedl/2, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:104; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:132; En cualquiera de las modalidades que anteceden, un anticuerpo anti-Jagged es humanizado. En una modalidad, un anticuerpo anti-Jagged comprende HVR como en cualquiera de las modalidades que anteceden y comprende además un marco aceptor humano, por ejemplo, un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano. En otra modalidad, un anticuerpo anti-Jagged comprende HVR como en cualquiera de las modalidades que anteceden y comprende además una VH que comprende al menos una, dos, tres o cuatro FR que se seleccionan de una FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:32, 36, 40, 43, 47, 50 o 54; una FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:33, 37, 41, 44, 48, 51 o 136; una FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:34, 38, 39, 42, 45, 46, 49, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59; y una FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:35. En otra modalidad, un anticuerpo anti-Jagged comprende HVR como en cualquiera de las modalidades que anteceden y comprende además una VL que comprende al menos una, dos, tres o cuatro FR que se seleccionan de un FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:60, 64, 67 o 70; un FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:61, 65, 68 o 71; un FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:62, 66, 69 o 72; y un FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:.63 o 135.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-Jagged comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9-17, 29-30 o 73-76. En determinadas modalidades, una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-Jagged que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse al menos a un Jagged. En determinadas modalidades, las sustituciones, inserciones o eliminaciones suceden en regiones que se encuentran fuera de las HVR (es decir, en los FR). En determinadas modalidades, un anticuerpo anti-Jagged comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11. Opcionalmente, el anticuerpo anti-Jagged comprende la secuencia VH en la SEQ ID NO: 11, incluidas las modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una modalidad particular, la VH comprende una, dos o tres HVR que se seleccionan de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:81, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:83 y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:85.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-Jagged, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:18-28 o 77-80. En determinadas modalidades, una secuencia VL que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-Jagged que comprenda esa secuencia conserva la capacidad de unirse a Jagged. En determinadas modalidades, se ha sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO:20. En determinadas modalidades, las sustituciones, inserciones o eliminaciones suceden en regiones fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-Jagged comprende la secuencia VL en la SEQ ID NO: 20, incluidas las modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una modalidad particular, la VL comprende una, dos o tres HVR que se seleccionan de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:110, (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111 y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:112.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-Jagged, donde el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente y una VL como en cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente. En una modalidad, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEQ ID NO:10 y la SEQ ID NO:19, respectivamente, incluidas las modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En una modalidad, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 20, respectivamente, incluidas las modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En una modalidad, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente, incluidas las modificaciones postraduccionales de esas secuencias.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-Jagged que se proporciona en la presente. Por ejemplo, en determinadas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-Jaggedl que comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:10 y una secuencia VL de la SEQ ID NO:19. En otras modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-Jaggedl que comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:11 y una secuencia VL de la SEQ ID NO:20. En otras modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-Jagged2 que comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:15 y una secuencia VL de la SEQ ID NO:24.
En determinadas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de un péptido Jagl-DSL-EGFl-4 murino de la SEQ ID NO:5. En determinadas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de un péptido Jagl-DSL-EGFl-4 humano de la SEQ ID NO:6. En determinadas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de un péptido Jag2-DSL-EGFl-4 murino de la SEQ ID NO:7. En determinadas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de un péptido Jag2-DSL-EGF1-4 humano de la SEQ ID NO:8.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que compite por unirse a cualquiera de los anticuerpos que se proporcionan en la presente.
En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-Jagged de acuerdo con cualquiera de las modalidades que anteceden es un anticuerpo monoclonal, inclusive un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una modalidad, un anticuerpo anti-Jagged es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')2. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgGl humano intacto u otra clase o isotipo de anticuerpo tal como se define en la presente.
En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-Jagged de acuerdo con cualquiera de las modalidades que anteceden puede incorporar cualquiera de las características, solas o combinadas, descritas en las Secciones 1-7 a continuación: 1. Afinidad de anticuerpos En determinadas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente tiene una constante de disociación (Kd) de < ImM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 108M o menos, por ejemplo, de 108M a 1013M, por ejemplo, de 109M a 1013 M).
En una modalidad, Kd se mide por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En una modalidad, se realiza un RIA con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, la afinidad de unión de una solución de Fab con un antígeno se mide al equilibrar Fab con una concentración mínima de un antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de titulación de un antígeno no marcado, capturando luego el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpos anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et ál., J. Mol . Biol . 293 : 865-881 (1999) ) . Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocilios MICROTITER* (Thermo Scientific) durante la noche con 5 mg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6), y luego se bloquean con albúmina de suero bovino al 2 % (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc #269620), 100 pM o 26 pM de antígeno [125I] se mezclan con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consistentes con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et ál., C ncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés se incuba a continuación durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período de tiempo mayor (por ejemplo, alrededor de 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Luego se retira la solución y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN-20°) al 0.1 % en PBS. Una vez secas las placas, se agregan 150 ml/pocillo de centelleante (MICROSCINT-20 ™; Packard) y se realiza el conteo de las placas en un contador gamma TOPCOUNT ™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que producen menos o el equivalente de 20 % de la unión máxima se eligen para su uso en ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con otra modalidad, la Kd se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial BIACORE®. Por ejemplo, un ensayo que usa BIACORE-2000 o un BIACORE -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) se lleva a cabo a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (RU). En una modalidad, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE Inc.) con clorhidrato de N-etil-1'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato de sodio, pH 4,8, a 5 mg/ml (~ 0,2 mM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 ml/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie dobles de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 ml/min. Las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (kQff) se calculan utilizando un modelo de unión simple de Langmuir uno a uno (BIACORE Evaluation Software versión 3.2) mediante el ajuste simultáneo de los sensograma de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación (Kd) de equilibrio como la proporción k0ff/k0n_ Véase, por ejemplo, Chen et ál., J. Mol . Biol . 293:865-881 (1999). Si la velocidad de asociación supera 106 M 1 s_1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial que antecede, la velocidad de asociación puede determinarse usando una téenica de desactivación fluorescente que mide el aumento o la disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso banda) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno de 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno según lo medido en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotóme ro SL -AMINCO ™ de 8000 series (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. 2. Fragmentos de anticuerpos En determinadas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, de modo no taxativo, fragmentos Fab, Fab', Fab'-XH, F(ab')2, Fv y scFv, y otros fragmentos que se describen más adelante. Para ver una reseña sobre determinados fragmentos de anticuerpos, véase Hudson et ál. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para ver una reseña sobre fragmentos scFv, véase, por ejemplo, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), pp. 269-315 (1994); véase también WO 93/16185; y patentes estadounidenses n.° 5,571,894 y 5,587,458. Véase una discusión sobre fragmentos Fab y F(ab’)2 que comprenden residuos de epítopo de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida aumentada in vivo en la patente estadounidense N.° 5,869,046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véase, por ejemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et ál., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et ál., Proc. Nati . Acad. Sci . EUA 90: 6444-6448 (1993)). Los triacuerpos y tetracuerpos se describen también en Hudson et ál., Nat . Med. 9:129-134 (2003).
Los anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpos que comprenden la totalidad o una parte del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas modalidades, un anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6,248,516 Bl).
Los fragmentos de anticuerpos pueden elaborarse mediante varias téenicas, incluida, de modo no taxativo, la digestión proteolitica de un anticuerpo intacto así como también la producción mediante células hospedadoras recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), tal como se describe en la presente. 3. Anticuerpos quiméricos y humanizados En determinadas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un anticuerpo quimérico. Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 4,816,567; y en Morrison et ál., Proc. Nati . Acad. Sci . EUA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con conmutación de clase" en el que la clase o subclase se ha cambiado de forma que no es aquella del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígenos de estos.
En determinadas modalidades, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en humanos, mientras que mantiene la especificidad y la afinidad del anticuerpo no humano original. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR, (o partes de estas) derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o partes de estas) derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá, opcionalmente, al menos una parte de una región constante humana. En algunas modalidades, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del cual derivan los residuos de las HVR), por ejemplo, para reparar o mejorar la especificidad o afinidad de un anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y los métodos para elaborarlos se resumen en, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front . Biosci . 13:1619-1633 (2008), y se describen más detalladamente en, por ejemplo, Riechmann et ál., Nature 332:323-329 (1988); Queen et ál., Proc. Nat 'l Acad. Sci . EUA 86:10029-10033 (1989); patentes estadounidenses n.° 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, y 7,087,409; Kashmiri et ál . , Methods 36:25-34 (2005) (que describe el injerto de región determinante de especificidad (SDR)); Padlan, Mol . Inmuno 1. 28:489-498 (1991) (que describe la "recomposición de superficie"); Dall'Acqua et ál., Methods 36:43-60 (2005) (que describe la "mezcla de FR"); y Osbourn et ál., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et ál., Br. J. Cáncer, 83:252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección orientada" para mezclar FR).
Las regiones marco de humanos que pueden usarse para la humanización incluyen de modo no taxativo: regiones marco que se seleccionan mediante el uso del método "de mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et ál. J. Inmuno 1. 151:2296 (1993)); las regiones marco derivadas de una secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena pesada o ligera (véase, por ejemplo, Cárter et ál. Proc. Nati . Acad. Sci . EUA, 89:4285 (1992); y Presta et ál. J. Immunol . , 151:2623 (1993)); regiones marco humanas maduras (mutadas de forma somática) o regiones marco de línea germinal humanas (véase, por ejemplo. Almagro y Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008)); y regiones marco derivadas del cribado de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca et ál., J. Biol . Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et ál., J. Biol . Chem. 271:22611-22618 (1996)). 4. Anticuerpos humanos En determinadas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir utilizando diversas téenicas conocidas en la técnica. En términos generales, se describen los anticuerpos humanos en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol . 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin.
Immunol . 20:450-459 (2008).
Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos intactos humanos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición de antígenos. Tales animales contienen normalmente la totalidad o parte de los locus de inmunoglobulina humana, los cuales reemplazan los locus de inmunoglobulina endógena o están presentes extraerornosómicamente o integrados aleatoriamente a los cromosomas del animal. En tales ratones transgénicos, en general, se han desactivado los locus de inmunoglobulina endógena. Por reseñas de métodos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Wat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véase también, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 6,075,181 y 6,150,584 que describen la teenología XENOMOUSE™; la patente estadounidense n.° 5,770,429 que describe la tecnología HUMAB®; la patente estadounidense n.° 7,041,870 que describe la tecnología K-M MOUSE® y la solicitud de patente estadounidense n.° US 2007/006190Ó, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por tales animales pueden modificarse de forma adicional mediante, por ejemplo, una combinación con una región constante humana diferente.
Los anticuerpos humanos pueden obtenerse también mediante métodos basados en hibridomas. Se han descrito las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma humano/ratón para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, por ejemplo, Kozbor J. Immunol . , 133: 3001 (1984); Brodeur et ál., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et ál., J. Immunol . , 147: 86 (1991). También se describen anticuerpos humanos generados mediante teenología de hibridoma de células B humanas en Li et ál., Proc. Nati . Acad. Sci . EUA, 103:3557-3562 (2006)). Los métodos adicionales incluyen aquellos descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 7,189,826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de las líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano).
También se describe la tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacol ogy, 27(3):185-91 (2005).
Los anticuerpos humanos pueden generarse también mediante el aislamiento de las secuencias de dominio variable del clon de Fv que se seleccionan de bibliotecas de expresión en fagos derivados de humanos. Tales secuencias de dominios variables pueden luego combinarse con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpos se describen a continuación. 5. Anticuerpos derivados de bibliotecas Se puede aislar los anticuerpos de la invención mediante cribados de bibliotecas combinatorias con la actividad o las actividades deseadas. Por ejemplo, se conoce en la téenica una variedad de métodos para generar bibliotecas de visualización de fagos y explorar tales bibliotecas en busca de anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Se puede encontrar una reseña de tales métodos, por ejemplo, en Hoogenboom et ál. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et ál., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y descritos en más detalle, por ejemplo, en McCafferty et ál., Nature 348:552-554; Clackson et ál., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et ál., J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et ál., J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee et ál., J. Mol . Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati . Acad. Sci .
EUA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et ál., J. Irmunol . Methods 284(1-2): 119-132 (2004).
En ciertos métodos de visualización de fagos, se clonan repertorios de genes de VH y VL por separado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de fagos que pueden explorarse luego en busca de fagos de unión a antígenos tal como se describe en Winter et ál., Ann. Rev. Iimunol . , 12: 433-455 (1994). Típicamente los fagos presentan fragmentos de anticuerpos, ya sea como fragmentos Fv de cadena simple (scFv) o como fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan al inmunógeno anticuerpos de alta afinidad sin que sea necesaria la construcción de hibridomas. De manera alternativa, el repertorio sin inmunización puede clonarse (por ejemplo, de un humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos a una amplia gama de xenoantígenos y autoantígenos sin ningún tipo de inmunización tal como se describe en Griffiths et ál., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, las bibliotecas sin inmunización también se pueden elaborar de forma sintética mediante la clonación de segmentos génicos V sin reorganización a partir de células madre, y mediante el uso de cebadores PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr la reorganización in vitro, tal como se describe en Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol . , 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente estadounidense n.° 5,750,373, y las publicaciones de patentes estadounidenses n.° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aislados de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos de la presente. 6. Anticuerpos multiespecíf icos En determinadas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos sitios diferentes. En determinadas modalidades, una de las especificidades de unión es para Jagged y la otra es para cualquier otro antígeno. En determinadas modalidades, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de Jagged. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse para localizar agentes citotóxicos a células que expresan Jagged. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos.
Las téenicas para generar anticuerpos multiespecíficos incluyen, de modo no taxativo, la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, y Traunecker et ál., EMBO J. 10: }3655 (1991)), y modificación de "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5,731,168). Los anticuerpos multiespecíficos también pueden generarse al diseñar efectos de direccionamiento electroestático para crear moléculas heterodiméricas de Fe de anticuerpos (WO 2009/089004A1); reticular dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4,676,980, y Brennan et ál., Science, 229: 81 (1985)); utilizar cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et ál., J. Immunol . , 148(5):1547-1553 (1992)); usar tecnología de "diacuerpo" para generar fragmentos de anticuerpo biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et ál., Proc. Nati . Acad. Sci . EUA, 90:6444-6448 (1993)); y utilizar dímeros Fv de cadena simple (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et ál., J. Immunol . , 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos tal como se describe en, por ejemplo, Tutt et ál. J. Immunol . 147: 60 (1991).
También se incluyen en la presente anticuerpos modificados genéticamente con tres o más sitios de unión a antígenos funcionales, que incluyen los "anticuerpos pulpo", (véase, por ejemplo, US 2006/0025576A1).
El anticuerpo o fragmento descrito en la presente incluye también un "FAb de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a Jaggedl así como otro antígeno diferente (véase, por ejemplo, US 2008/0069820). 7. Variantes de anticuerpos En determinadas modalidades, se contemplan las variantes de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos que se proporcionan en la presente. Por ejemplo, puede que sea deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo se pueden preparar mediante la introducción de modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica al anticuerpo o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de residuos y/o inserciones en estos y/o sustituciones de estos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución puede realizarse para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, la unión a antígenos. a) Variantes de sustitución, inserción y eliminación En determinadas modalidades, se proporcionan variantes de anticuerpos que presentan una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las HVR y las FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 con el título "sustituciones preferidas". Se proporcionan cambios más sustanciales en la Tabla 1 con el título "Ejemplos de sustituciones," y tal como se describe más adelante con respecto a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo de interés y analizar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, mantenimiento/mejora de unión al antígeno, inmunogenicidad disminuida o ADCC o CDC mejorados.
TABLA 1 Se pueden agrupar los aminoácidos de acuerdo con propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo de variante sustitutiva implica la sustitución de uno o más residuos de regiones hipervariables de un anticuerpo progenitor (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado). En general, la o las variantes resultantes seleccionadas para estudios más detallados tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, aumento de afinidad, disminución de inmunogenicidad) en comparación con el anticuerpo original y/o mantendrán sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Un ejemplo de variante sustitucional es un anticuerpo madurado por afinidad, el cual puede generarse de manera conveniente, por ejemplo, mediante el uso de téenicas de maduración por afinidad basada en la visualización de fagos tales como aquellas que se describen en la presente. Brevemente, se mutan uno o más residuos de HVR y se presentan los anticuerpos variantes en fagos y se realiza un análisis en busca de una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).
Se pueden generar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad de los anticuerpos. Tales alteraciones pueden realizarse en "puntos de interés" de HVR es decir, residuos codificados por codones que experimentan una mutación a una frecuencia alta durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol . Biol . 207:179-196 (2008)), y/o residuos que entran en contacto con el antígeno, donde la variante resultante VH o VL se evalúa para determinar la afinidad de unión. Se describe la maduración por afinidad mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias en, por ejemplo, Hoogenboom et ál. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et ál., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En algunas modalidades de la maduración por afinidad, la diversidad se introduce en los genes variables elegidos para su maduración mediante cualquiera de diversos métodos (por ejemplo, PCR susceptible a errores, transposición de cadena o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). Posteriormente, se crea una segunda biblioteca. Luego se examina la biblioteca para identificar cualesquiera variantes de anticuerpos con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica enfoques dirigidos por HVR, en los que se aleatorizaron varios residuos HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Los residuos HVR implicados en la unión al antígeno pueden identificarse específicamente, por ejemplo, mediante la utilización de mutagénesis por barrido de alanina o modelado. En particular CDR-H3 y CDR-L3 son elegidos como objetivo.
En determinadas modalidades, pueden ocurrir sustituciones, inserciones o eliminaciones dentro de una o más HVR siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse a un antígeno. Por ejemplo, las alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras que se proporcionan en la presente) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión pueden generarse en las HVR. Estas alteraciones pueden, por ejemplo, estar fuera de los residuos que entran en contacto con el antígeno en las HVR. En determinadas modalidades de las secuencias VH y VL variantes provistas anteriormente, cada HVR o bien se encuentra sin alteraciones o contiene no más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.
Un método útil para identificar residuos o regiones de un anticuerpo que pueden elegirse como objetivos para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" tal como se describe en Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, un residuo o grupo de residuos objetivo (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) son identificados y reemplazados por un aminoácido neutro o con carga negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De manera alternativa o adicional, una estructura de cristal de un complejo antígeno-anticuerpo identifica los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y residuos limitantes pueden elegirse como objetivo o eliminarse como candidatos para sustitución. Se pueden analizar las variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones de extremos amino y/o carboxilo que varían en cuanto a longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como también inserciones intrasecuencia de un único o de múltiples residuos de aminoácidos. Los ejemplos de inserciones en extremos incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo de extremo N. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión a los extremos N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida del anticuerpo en suero. b)Variantes de glicosilación En determinadas modalidades, se modifica un anticuerpo que se proporciona en la presente para aumentar o disminuir el punto hasta el cual se puede glicosilar un anticuerpo. La adición o eliminación de sitios de glicosilación a un anticuerpo se puede lograr convenientemente modificando la secuencia de aminoácidos de modo tal que se creen o eliminen uno o más sitios de glicosilación.
En los casos en que el anticuerpo comprende una región Fe, el carbohidrato unido al mismo puede modificarse. Los anticuerpos naturales producidos por celulas mamíferas comprenden, normalmente, un oligosacárido ramificado de dos antenas que normalmente se encuentra unido mediante un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Véase, por ejemplo, Wright et ál. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, mañosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como también una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura del oligosacárido de dos antenas. En algunas modalidades, las modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención pueden realizarse para crear variantes de anticuerpos con determinadas propiedades mejoradas.
En una modalidad, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en tal anticuerpo puede ser de 1 % a 80 %, de 1 % a 65 %, de 5 ¾ a 65 I o de 20 ¾ a 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, en comparación con la suma de todas las glicoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alta mañosa) tal como se mide mediante espectrómetro de masas MALDI-TOF, tal como se describe en, por ejemplo, WO 2008/077546. Asn297 se refiere al residuo de asparagina ubicado aproximadamente en la posición 297 en la región Fe (numeración Eu de los residuos de la región Fe); sin embargo, Asn297 también puede ubicarse aproximadamente en ± 3 aminoácidos antes o después de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en los anticuerpos. Tales variantes de fucosilación pueden haber mejorado la función de ADCC. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patentes estadounidenses N°. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionados con variantes de anticuerpos "defucosilados" o "deficientes de fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 8; W02005/053742; W02002/031140; Okazaki et ál. J. Mol . Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et ál. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos defucosilados incluyen células CHO Lecl3 con deficiencia en fucosilación proteica (Ripka et ál. Arch. Biochem. Biophys . 249:533-545 (1986); Solicitud de patente estadounidense N° US 2003/0157108 Al, Presta, L; y WO 2004/056312 Al, Adams et ál., especialmente en el Ejemplo 11) y líneas celulares desactivadas, tales como el gen alfa- 1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO desactivadas (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et ál. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et ál., Biotechnol . Bioeng. , 94(4):680-688 (2006); y W02003/085107).
Además se proporcionan variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisectados, por ejemplo, donde un oligosacárido con dos antenas unido a la región Fe del anticuerpo se bisecta por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpos se describen en, por ejemplo, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et ál.); patente estadounidense N.° 6.602.684 (Umana et ál); y US 2005/0123546 (Umana et ál). También se proporcionan variantes de anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpos se describen en, por ejemplo, WO 1997/30087 (Patel et ál.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.). c)Variantes de la región Fe En determinadas modalidades, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe de un anticuerpo proporcionado en la presente, generando así una variante de la región Fe. La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de la región Fe humana (por ejemplo, una región Fe de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.
En determinadas modalidades, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, que lo convierten en un candidato deseable para aplicaciones en las cuales la semivida del anticuerpo in vivo es importante, sin embargo determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reduceión/pérdida de las de actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión al receptor Fe (FcR) se pueden realizar para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por lo tanto, probablemente carece de actividad ADCC), pero mantiene la capacidad de unión a FcRn. Las principales células para mediar células ADCC, NK, solamente expresan Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Iwmunol . 9:457-492 (1991). Se describen los ejemplos no taxativos de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la patente estadounidense N.° 5,500,362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I. et ál. Proc. Nat 'l Acad. Sci . EUA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et ál., Proc. Nat 'l Acad. Sci . EUA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (véase Bruggemann, M. et ál., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). De manera alternativa, se pueden emplear métodos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para la citometría de flujo (CellTechnology, Inc., ountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad CytoTox 96 no radioactivo (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) y células destructoras naturales (NK, por sus siglas en inglés). Alternativamente, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et ál. Proc . Nat'l Acad. Sci . EÜA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a Clq para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a Clq y, por lo tanto, carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a Clq y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación de complementos, se puede realizar un ensayo con CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et ál, J. Immunol . Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). También se puede realizar la unión a FcRn y las determinaciones in vivo de eliminación/semivida utilizando métodos conocidos en la téenica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et ál., Int 'l . Immunol . 18(12):1759-1769 (2006)).
Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen los que tienen sustitución de uno o más residuos de la región Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente estadounidense N.° 6,737,056). Dichos mutantes Fe incluyen los mutantes Fe con sustituciones en dos o más posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, que incluye el mutante Fe también denominado "DANA" con sustitución de residuos 265 y 297 con alanina (patente estadounidense N.° 7,332,581).
Se describen determinadas variantes de anticuerpos con unión a FcR mejorada o disminuida. (Véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° 6,737,056; WO 2004/056312, y Shields et ál., J. Biol . Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).) En determinadas modalidades, una variante de anticuerpo comprende una región Fe con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe (numeración EU de residuos).
En algunas modalidades, se realizan modificaciones en la región Fe que dan como resultado la unión a Clq modificada (es decir, ya sea mejorada o disminuida) y/o citotoxicidad dependiente de complementos (CDC), por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense n.° 6,194,551, WO 99/51642, e Idusogie et ál. J. Iimunol . 164: 4178-4184 (2000).
Los anticuerpos con semividas aumentadas y unión mejorada al receptor Fe neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternal al feto (Guyer et ál., J. Immunol . 117:587 (1976) y Kim et ál., J. Iimunol . 24:249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et ál.). Esos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en ella que mejoran la unión de la región Fe a FcRn. Dichas variantes de Fe incluyen las que tienen sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo de la región Fe 434 (patente estadounidense n.° 7,371,826).
Véase también Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); patente estadounidense N°. 5,648,260; patente estadounidense N°. 5,624,821; y WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fe. d) Variantes de anticuerpos modificados genéticamente con cisterna En determinadas modalidades, puede ser deseable crear anticuerpos modificados genéticamente con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los cuales uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En modalidades particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, se ubican grupos tiol reactivos en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden utilizar para conjugar el anticuerpo con otros restos, por ejemplo restos de fármacos o restos fármaco-enlazadores, para crear un inmunoconjugado, tal como se describe adicionalmente en el presente. En determinadas modalidades, uno cualquiera o más de los siguientes residuos se puede sustituir con cisteína: V205 (numeración Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fe de cadena pesada. Los anticuerpos modificados genéticamente con cisteína pueden generarse como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 7,521,541. e)Derivados de anticuerpos En determinadas modalidades, se puede modificar adicionalmente un anticuerpo proporcionado en la presente para contener restos no proteináceos adicionales que se conocen en la téenica y se encuentran fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivación del anticuerpo incluyen, de modo no taxativo, polímeros solubles en agua. Los ejemplos no taxativos de polímeros solubles en agua incluyen, de modo no taxativo, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímeros de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinil pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de estos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si hay más de un polímero unido, pueden ser las mismas moléculas o moléculas diferentes. En general, la cantidad y/o tipo de polímeros utilizados para la derivación se pueden determinar en base a consideraciones que incluyen, de modo no taxativo, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se mejorará, ya sea que el derivado de anticuerpo se utilice en un tratamiento en condiciones definidas, etc.
En otra modalidad, se proporcionan los conjugados de un anticuerpo y resto no proteináceo que se puede calentar de forma selectiva mediante la exposición a la radiación. En una modalidad, el resto no proteináceo es un nanotubo de carbono (Kam et ál., Proc. Nati . Acad. Sci . EUA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, de modo no taxativo, longitudes de onda que no dañan las células comunes, pero que calientan el resto no proteináceo a una temperatura en la cual las células próximas al resto no proteináceo del anticuerpo mueren.
B. Composiciones y métodos recombinantes Los anticuerpos se pueden producir utilizando composiciones y métodos recombinantes, por ejemplo, tales como se describen en la patente estadounidense N°.4,816,567. En una modalidad, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-Jagged descrito en la presente. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). En otra modalidad, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En una modalidad adicional, se proporciona una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucleico. En dicha modalidad, una célula hospedadora comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una modalidad, la célula hospedadora es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfoide (por ejemplo, célula YO, NSO, Sp20). En una modalidad, se proporciona un método para realizar un anticuerpo anti-Jagged, donde el método comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se describió anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora (o medio de cultivo de células hospedadoras).
Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-Jagged, se aísla un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describió anteriormente, y se inserta en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicional en una célula hospedadora. Tal ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo).
Las células hospedadoras adecuadas para clonar o para la expresión de vectores que codifican anticuerpos incluyen células procariotas o eucariotas descritas en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular cuando no son necesarias la glicosilación y la función efectora de Fe. Para la expresión de fragmentos y polipéptidos de anticuerpos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses N.° 5,648,237, 5,789,199 y 5,840,523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpos en E. coli) . Después de la expresión, el anticuerpo se puede aislar de la pasta de células bacteriana en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.
Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o la levadura son huéspedes de clonación o de expresión adecuados para los vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levadura cuyas vías de glicosilación se han "humanizado", dando lugar a la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o completamente humano. Véase Gerngross, Wat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et ál., Wat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Las células hospedadoras adecuadas para la expresión del anticuerpo glicosilado también derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden utilizar junto con células de insectos, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperd .
También se pueden utilizar como hospedadores los cultivos celulares vegetales. Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la teenología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
También se pueden utilizar como hospedadoras las células de los vertebrados. Por ejemplo, pueden ser útiles las líneas celulares de mamíferos que se adaptan para crecer en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos útiles son las líneas de células CV1 de riñón de mono transformadas por SV40 (COS-7), líneas embrionarias humanas de riñón (293 o células 293 como se describe, por ejemplo, en Graham et ál., J. Gen Virol . 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (DCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor de mama de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather et ál., Annals N. Y. Acad. Sci . 383:44-68 (1982); células MRC 5 y células FS . Otras líneas celulares de mamífero hospedadoras útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), que incluyen células DHFR~ CHO (Urlaub et ál., Proc . Nati . Acad. Sci. EUA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, NSO y Sp2/0. Para una reseña de determinadas líneas celulares hospedadoras de mamíferos adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.255-268 (2003).
C. Ensayos Los anticuerpos anti-Jagged proporcionados en la presente se pueden identificar, evaluar o caracterizar para conocer sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas a través de diversos ensayos conocidos en la téenica. 1. Ensayos de unión y otros ensayos En un aspecto, se evalúa un anticuerpo de la invención para determinar su actividad de unión al antígeno, por ejemplo, mediante métodos conocidos, tales como ELISA, análisis de transferencia Western, etc.
En otro aspecto, los ensayos de competición se pueden usar para identificar un anticuerpo que compite con anticuerpo A, A-1, A-2, C, C-l, D, D-l, D-2, D-3, D-4 y D-5 para unirse a Jaggedl humano o murino. En otro aspecto, los ensayos de competición se pueden usar para identificar un anticuerpo que compite con anticuerpo B, B-l, B-2, B-3, C, C-l, D, D-l, D-2, D-3, D-4 y D-5 para unirse a Jagged2 humano o murino. En determinadas modalidades, tal anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que está unido por A, A-l, A-2, B, B-l, B-2, B-3, C, C-l, D, D-l, D-2, D-3, D-4 o D-5.
Los ejemplos de métodos detallados para mapear un epítopo al cual se une un anticuerpo se proporcionan en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
En un ejemplo de ensayo de competición, se incuba el Jaggedl o Jagged2 inmovilizado en una solución que comprende un primer anticuerpo etiquetado que se une a Jaggedl o Jagged2 (por ejemplo, A, A-l, A-2, B, B-l, B-2, B-3, C, C-l, D, D-l, D-2, D-3, D-4 o D-5) y un segundo anticuerpo sin etiquetar que se está evaluando para determinar su capacidad de competir con el primer anticuerpo para la unión a Jaggedl o Jagged2. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridomas. Como control, se incuba Jaggedl o Jagged2 inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo etiquetado pero no el segundo anticuerpo sin etiquetar. Después de la incubación en condiciones que permitan la unión del primer anticuerpo a Jaggedl o Jagged2, se elimina el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de etiqueta asociada al Jaggedl o Jagged2 inmovilizado. Si la cantidad de etiqueta asociada al Jaggedl o Jagged2 inmovilizado se ve sustancialmente reducida en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control, eso indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo para la unión a Jaggedl o Jagged2. Véase Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual c.14 (Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, NY). 2. Ensayos de actividad En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-Jagged de estos que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la inhibición de la señalización celular inducida por Jaggedl o Jagged2 a través de un receptor Notch, como la inhibición de la señalización inducida por Jaggedl a través de Notchl. Se proporciona un ejemplo de ensayo en los Ejemplos. En determinadas modalidades, un anticuerpo de la invención se evalúa para determinar su capacidad de inhibir la expresión de un gen indicador que responde a la señalización de Notch inducida por Jaggedl. Se proporciona un ejemplo de ensayo en los Ejemplos. En determinadas modalidades, un anticuerpo de la invención se evalúa para determinar tal actividad biológica. También se proporcionan anticuerpos que tienen tal actividad biológica in vivo y/o in vitro.
D. Inmunoconjugados La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-Jagged conjugado en la presente con uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas de proteínas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de estas) o isótopos radioactivos.
En una modalidad, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC, por sus siglas en inglés) donde un anticuerpo se conjuga con uno o más fármacos, incluyendo, de modo no taxativo, un maitansinoide (véanse las patentes estadounidenses n.° 5,208,020, 5,416,064 y la patente europea EP 0425 235 Bl); una auristatina tal como restos de fármaco de monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véanse las patentes estadounidenses n.° 5,635,483 y 5,780,588, y 7,498,2981; una dolastatina; una caliqueamiciña o derivado de esta (véanse las patentes estadounidenses n.° 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, y 5,877,296; Hinman et ál., Cáncer Res. 53:3336- 3342 (1993); y Lode et al., Cáncer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antracielina tal como daunomicina o doxorrubicina (véase Kratz et ál., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrcy et ál., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj . Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et ál., Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 97:829-834 (2000); Dubowchik et ál., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et ál., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y la patente estadounidense N.° 6,630,579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.
En otra modalidad, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en la presente conjugado con una toxina enzimáticamente activa o un fragmento de esta, incluyendo, de modo no taxativo, cadena A de la difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina de la difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidores de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos.
En otra modalidad, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en la presente conjugado con un átomo radiactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos se encuentran disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el radioconjugado se usa para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo, tc99m o 1123, o una etiqueta de rotación para imagenología por resonancia magnética nuclear (NMR, por sus siglas en inglés) (también denominado imagenología por resonancia magnética, mri), tal como yodo-123 nuevamente, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los conjugados de un anticuerpo y agente citotóxico pueden realizarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato (SMCC), i inotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de dimetil adipimidato), ásteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolieno 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal como se describe en Vitetta et ál., Science 238:1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminapentaacético etiquetado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de un radionucleótido con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindióle" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un enlazador lábil a ácidos, un enlazador sensible a la peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Res. 52:127-131 (1992); patente estadounidense N.° 5,208,020).
Los inmunoconjugados o ADC en la presente contemplan expresamente, pero no se limitan a dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, de modo no taxativo, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y Sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que se encuentran comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA).
E. Métodos y composiciones para el diagnóstico y detección En determinadas modalidades, cualquiera de los anticuerpos anti-Jaggedl proporcionados en la presente son útiles para detectar la presencia de Jaggedl en una muestra biológica. En ciertas modalidades, cualquiera de los anticuerpos anti-Jagged2 proporcionados en la presente es útil para detectar la presencia de Jagged2 en una muestra biológica. El término "detectar" tal como se usa en la presente abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En determinadas modalidades, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como tejidos cancerosos.
En una modalidad, se proporciona un anticuerpo anti-Jagged para su uso en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de Jaggedl en una muestra biológica. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de Jagged2 en una muestra biológica. En ciertas modalidades, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-Jaggedl o con un anticuerpo anti-Jagged2 tal como se describe en la presente en condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-Jaggedl o el anticuerpo anti-Jagged2 con Jaggedl y Jagged2, respectivamente, y detectar si se formó un complejo entre el anticuerpo anti-Jaggedl y Jaggedl o entre el anticuerpo anti-Jagged2 y Jagged2. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo. En una modalidad, se usa un anticuerpo anti-Jaggedl para seleccionar sujetos que son susceptibles a la terapia con anticuerpo anti-Jaggedl, por ejemplo, donde Jaggedl es un biomarcador para la selección de pacientes. En una modalidad, se usa un anticuerpo anti-Jagged2 para seleccionar sujetos que son susceptibles a la terapia con anticuerpo anti-Jagged2, por ejemplo, donde Jagged2 es un biomarcador para la selección de pacientes.
Los ejemplos de trastornos que se pueden diagnosticar usando un anticuerpo de la invención incluyen cáncer, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de ducto biliar, cáncer pancreático, cáncer de piel, neoplasias malignas de células B y neoplasias malignas de células T.
En determinadas modalidades, se proporcionan anticuerpos anti-Jagged etiquetados. Las etiquetas incluyen, de modo no taxativo, etiquetas o restos que se detectan directamente (tales como etiquetas fluorescentes, cromofóricas, electrodensas, quimioluminiscentes y radiactivas), así como restos, tal como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los ejemplos de etiquetas incluyen, de modo no taxativo, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H, and 131I, fluoróforos tales como quelatos tórreos poco comunes o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente estadounidense N” 4,737,456), luciferina, 2,3- dihidroftalazinedionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatase alcalina, b-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas sacáridas, por ejemplo, oxidasa de glucosa, oxidasa de galactosa y glucosa-6-fosfato deshidrogenase, oxidasas heterocíclicas, tal como uricasa y oxidasa xantina, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de salto, etiquetas bacteriófagas, radicales libres estables y similares.
F. Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-Jagged como se describe en la presente se preparan mediante la mezcla de dicho anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington 's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, de modo no taxativo: amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de proteína Zn) y/o tensioactivos no-iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables de la presente incluyen adicionalmente agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glicoproteínas hialouronidasa activa neutral soluble (sHASEGP), por ejemplo, glicoproteínas hialouronidasa PH-20 humanas solubles, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinados ejemplos de sHASEGP y métodos de uso, que incluyen rHuPH20, se describen en las patentes estadounidenses n.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, un sHASEGP se combina con una o más glicoaminoglicanasas adicionales tales como condroitinasas.
Los ejemplos de formulaciones de anticuerpo liofilizado se describen en la patente estadounidense n.° 6,267,958. Las formulaciones de anticuerpo acuoso incluyen aquellas descritas en la patente estadounidense n.° 6,171,586 y W02006/044908, las formulaciones de esta última incluyen un amortiguador histidina-acetato.
La formulación de la presente también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Por ejemplo, puede ser conveniente proporcionar además un agente citotóxico, por ejemplo un agente quimioterapéutico. Tales ingredientes activos se encuentran presentes adecuadamente en combinación con cantidades que son eficaces para los fines deseados.
Los ingredientes activos pueden estar contenidos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por téenicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas coloidales de liberación de fármaco (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales téenicas se describen en Remington 's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices se encuentran en forma de elementos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las formulaciones que pueden utilizarse para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilización se logra fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
G. Composiciones y métodos terapéuticos Cualquiera de los anticuerpos anti-Jagged proporcionados en la presente pueden usarse en métodos terapéuticos.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-Jagged para su uso como un medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo anti-Jaggedl para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con la señalización Notch anormal, por ejemplo, un cáncer. En determinadas modalidades, se proporciona un anticuerpo anti-Jaggedl para su uso en un método de tratamiento. En determinadas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-Jaggedl para su uso en un método para tratar a un individuo que tiene un cáncer, que comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-Jaggedl. En una de estas modalidades, el método comprende adicionalmente administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe más adelante. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo ant-Jagged2 para usar en el tratamiento de un cáncer. En determinadas modalidades, se proporciona un anticuerpo anti-Jagged2 para su uso en un método de tratamiento. En determinadas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-Jagged2 para su uso en un método para tratar a un individuo que tiene un cáncer, que comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-Jagged2. En una de estas modalidades, el método comprende adicionalmente administrarle al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe más adelante.
En modalidades adicionales, la invención proporciona un anticuerpo anti-Jagged para su uso en la inhibición del crecimiento de cáncer de pulmón. En determinadas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-Jaggedl para su uso en un método para reducir el crecimiento de cáncer de pulmón en un individuo que comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-Jaggedl para reducir el crecimiento de cáncer de pulmón. En determinadas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-Jagged2 para su uso en un método para reducir el crecimiento de cáncer de pulmón en un individuo que comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-Jagged2 para reducir el crecimiento de cáncer de pulmón. En determinadas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-Jaggedl para su uso en un método para reducir el crecimiento de cáncer de mama en un individuo que comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-Jaggedl para reducir el crecimiento de cáncer de mama. En determinadas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-Jagged2 para su uso en un método para reducir el crecimiento de cáncer de mama en un individuo que comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-Jagged2 para reducir el crecimiento de cáncer de mama. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferentemente un ser humano.
En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-Jagged en la fabricación o preparación de un medicamento. En una modalidad, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con señalización Notch anormal. En una modalidad, el medicamento es para el tratamiento de un cáncer. En una modalidad adicional, el medicamento es para su uso en un método para tratar un cáncer, que comprende administrarle a un individuo que tiene un cáncer una cantidad eficaz del medicamento. En una de estas modalidades, el método comprende adicionalmente administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe más adelante. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un ser humano.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la señalización Notch anormal. En una modalidad, el método comprende administrarle a un individuo que tiene dicha enfermedad o trastorno una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Jagged. En una modalidad, el método comprende administrarle a un individuo que tiene un cáncer una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Jaggedl. En una de estas modalidades, el método comprende adicionalmente administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, como se describe más adelante. En una modalidad, el método comprende administrarle a un individuo que tiene un cáncer una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Jagged2. En una de estas modalidades, el método comprende adicionalmente administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, como se describe más adelante. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un ser humano.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de células cancerosas en un individuo. En una modalidad, el método comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Jaggedl o un anticuerpo anti-Jagged2 para inhibir el crecimiento de células cancerosas. En una modalidad, un "individuo" es un humano.
En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-Jagged proporcionados en la presente, por ejemplo, para su uso en los métodos terapéuticos mencionados anteriormente. En una modalidad, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-Jagged provistos en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-Jagged provistos en la presente y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe más adelante.
Los anticuerpos de la invención pueden usarse ya sea solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede administrarse conjuntamente con al menos un agente terapéutico adicional. En determinadas modalidades, un agente terapéutico adicional es un agente citotóxico. En determinadas modalidades, un agente terapéutico adicional es un anticuerpo.
Dichas terapias de combinación indicadas anteriormente comprenden la administración combinada (donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma o en formulaciones separadas) y la administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede ocurrir antes, simultáneamente y/o después de la administración del o de los agentes terapéuticos adicionales. En una modalidad, la administración del anticuerpo anti-Jagged y la administración de un agente terapéutico adicional ocurren dentro de alrededor de un mes, o dentro de alrededor de una, dos o tres semanas, o dentro de alrededor de uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis días de cada uno. Los anticuerpos de la invención pueden usarse también en combinación con terapia de radiación.
Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) puede administrarse mediante cualquier medio adecuado, que incluye la administración parenteral, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea el tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser mediante cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tal como por vía intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En la presente se contemplan varios cronogramas de dosificación, que incluyen, de modo no taxativo, administraciones simples o múltiples durante varios momentos, administración por bolo e infusión por pulso.
Los anticuerpos de la invención se formularían, dosificarían y administrarían de una manera coherente con la buena práctica médica. Los factores que deberán considerarse en este contexto incluyen el trastorno particular que se esté tratando, el mamífero particular que se esté tratando, la condición médica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el cronograma de administración y otros factores conocidos para los médicos. El anticuerpo se formula opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión, aunque no es necesario. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores mencionados anteriormente. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosificaciones y mediante las mismas vías de administración como se describe en la presente, o alrededor de 1 a 99 % de las dosificaciones descritas en la presente, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine de forma empírica/clínicamente adecuada.
Para la prevención o el tratamiento de enfermedades, la dosis adecuada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, terapia anterior, historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo y el criterio del médico tratante. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o durante una serie de tratamientos. En función del tipo y gravedad de la enfermedad, una posible dosis inicial puede ser de aproximadamente i mg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 m9/k9 a 10 mg/kg) de anticuerpo para la administración al paciente ya sea, por ejemplo, en una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica puede variar de alrededor de 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, en función de los factores anteriores. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, según la afección, el tratamiento se mantiene generalmente hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Un ejemplo de dosificación del anticuerpo está generalmente en el intervalo de alrededor de 0,05 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg. Por lo tanto, pueden administrarse al paciente una o más dosis de alrededor de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de estas). Dichas dosis pueden administrarse de manera intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de manera que el paciente reciba desde alrededor de dos a alrededor de veinte o, por ejemplo, alrededor de seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga inicial mayor seguida por una o más dosis menores. Un ejemplo de régimen de dosificación comprende administrar una dosis de carga inicial de alrededor de 4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de alrededor de 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. La evolución de esta terapia se monitorea fácilmente mediante téenicas y ensayos convencionales.
Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriores pueden llevarse a cabo usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo anti-Jagged.
H. Artículos de fabricación En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden estar compuestos por una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que, por sí misma o combinada con otra composición, es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o vial que tenga un tapón que pueda perforarse mediante una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se utiliza en el tratamiento de la afección elegida. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en este, donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en este, donde la composición comprende otro agente citotóxico o terapéutico de otro modo. El artículo de fabricación en esta modalidad de la invención puede comprender adicionalmente un prospecto que indique que las composiciones pueden usarse para tratar una afección particular. De manera alternativa o adicional, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo anti-Jagged.
III. EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Debe entenderse que pueden llevarse a la práctica otras modalidades diferentes, dada la descripción general provista anteriormente Ejemplo 1. Generación de anticuerpos anti-Jagged. a. Clasificación y selección de biblioteca para identificar anticuerpos anti-Jaggedl/2 Las bibliotecas de anticuerpos fago humanos con diversidades sintéticas en las regiones determinantes de complementariedad, que imitan la diversidad natural del repertorio de IgG humana, se usaron para cribar fragmentos Fab que se muestran en la superficie de las partículas de bacteriófagos M13. Se usó Jagl-DSL-EGFl-4 humano (SEQ ID NO:6) o Jag2-DSL-EGFl-4 humano (SEQ ID NO:8) como antígeno para la clasificación de biblioteca. Se recubrieron inmunoplacas de 96 pocilios Nunc Maxisorp durante la noche a 4 °C con antígeno diana (10pg/ml) y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con amortiguador de bloqueo de fagos PBST (solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y 1 % (p/v) albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) y 0,05 % (v/v) t een-20). Se agregaron bibliotecas de fagos de anticuerpos VH (véase, por ejemplo, Lee et ál., J. Immunol. Meth. 284:119-132 (2004)) y VH/VL (véase Liang et ál., JMB. 366: 815-829 (2007)) a placas de antígeno por separado y se incubaron durante la noche a temperaturas ambiente. Al otro día se lavaron placas recubiertas con antígeno diez veces con PBT (PBS con 0,05 % Tween-20), y los fagos unidos se eluyeron con HCl 50 mM y NaCl 500 mM durante 30 minutos y se neutralizaron con un volumen igual de 1 M base Tris (pH7,5). Los fagos recubiertos se amplificaron en celulas de E. coli XL-1 Blue. Durante las siguientes rondas de selección, la incubación de fago de anticuerpo con las placas recubiertas de antígeno se redujo hasta 2-3 horas, y el rigor del lavado de placas aumentó gradualmente.
Luego de 4 rondas de cribado, se observó enriquecimiento considerable. Se eligieron 96 clones de cada clasificación de biblioteca VH y VH/VL para determinar si se unían específicamente a Jaggedl o Jagged2 humano. Las regiones variables de estos clones eran secuencias de PCR para identificar los clones de secuencia única. Las afinidades de los anticuerpos fago se clasificaron usando competición puntos de ELISA. Los valores de IC50 de anticuerpo fago se determinaron además usando ELISA de unión a fagos competitiva. Se eligieron anticuerpos fago que se unen específicamente a Jaggedl humano (y no a Jagged2), Jagged2 (y no a Jaggedl), o tanto a Jaggedl como a Jagged2 y se reformatearon en igG de longitud completa para la evaluación en ensayos celulares in vi tro.
Los clones de interés se reformatearon en IgG mediante clonación de regiones VL y VH de clones individuales en un vector de expresión celular mamífero pRK (pRK.LPG3.HumanKappa) que contiene el dominio constante kappa humano y el vector de expresión (pRK.LPG4.HumanHC) que codifica el dominio constante IgGl humano de longitud completa, respectivamente (Shields et ál., J Biol Chem 2000; 276: 6591-6604) . Los anticuerpos luego se expresaron transitoriamente en células CHO de mamífero, y se purificaron con una columna de proteína A. b. Construcción de bibliotecas para mejora de afinidad de clones derivados de las bibliotecas de VH o VHVL Fagémido pW0703, derivado de fagémido pV0350-2b (Lee et ál., J. Mol . Biol 340, 1073-1093 (2004), que contiene codón de terminación (TAA) en todas las posiciones de CDR-L3 y que muestra Fab monovalente en la superficie de bacteriófagos M13) sirvió como plantillas de biblioteca para injertar dominios variables de cadena pesada (VH) de clones de interés de la biblioteca de VH para la maduración de afinidad. Las estrategias de aleatorización dura y blanda se usaron para la maduración de afinidad. Para la aleatorización dura, se aleatorizó una biblioteca de cadena ligera con posiciones seleccionadas de las tres CDR de cadena ligera usando aminoácidos diseñados para imitar anticuerpos humanos naturales y la degeneración de ADN diseñada fue como se describe en Lee et ál. ( J . Mol . Biol 340, 1073-1093 (2004)). Para alcanzar las condiciones de aleatorización suave, que introdujo la velocidad de mutación de aproximadamente 50 % en las posiciones seleccionadas, el ADN mutagénico se sintetizó con mezclas de bases de 70-10-10-10 que favorecen los nucleótidos de tipo salvaje (Gallop et ál., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994)). Para la aleatorización blanda, se dirigieron los residuos en las posiciones 91-96 de CDR-L3, 30-33, 35 de CDR-H1, 50, 52, 53- 54, y 56 de CDR-H2, 95-98 de CDR-H3; y se seleccionaron tres combinaciones diferentes de bucles de CDR, H1/L3, H2/L3 y H3/L3 para la aleatorización.
Para clones originados a partir de la biblioteca de VHVL, los fagémidos que contienen 4 codones de terminación (TAA) en cada CDR y que muestran Fab monovalente en la superficie de bacteriófago M13 se generaron de forma individual y sirvieron como las plantillas para mutagénesis de kunkel para la construcción de bibliotecas de maduración de afinidad. Solo la estrategia de aleatorización blanda se usó para clones derivados de la biblioteca de VHVL, ya que la diversidad de CDR-L3 se construyó en la biblioteca sin tratamiento. Para alcanzar las condiciones de aleatorización blanda, se dirigieron los residuos en las posiciones 28-31 de CDR-L1, 50, 53-55 de CDR-L2, 91-96 de CDR-L3, 30-35 de CDR-H1, 50-56 de CDR-H2, 95-100 de CDR-H3; y se seleccionaron cuatro combinaciones diferentes de bucles de CDR, H1/L3*, H2/L3*, y H3/L3* y L1/L2/L3* (donde * denota la posición de codones de terminación en la plantilla) para la aleatorización. c. Estrategia de clasificación de fagos para generar mejora de afinidad Para selección de mejora de afinidad, los antígenos Jagl o Jag2 se biotinilaron primero en una condición de reactivo restrictiva. Las bibliotecas de fagos se sometieron a una ronda de clasificación de placa y cinco rondas de clasificación de solución con rigor en aumento. Para la primera ronda de clasificación de placa, se recubrió primero 10 ug/ml antígeno en placa Maxisorp y se bloqueó previamente con amortiguador de bloqueo (BSA al 1 % y Tween20 al 0,05 % en PBS). Se incubó 3 O.D./ml en amortiguador de bloqueo de entrada de fagos en placas de antígeno durante 3 horas. Los pocilios se lavaron con PBS-0,05 % Tween20 diez veces. El fago unido se eluyó con 150 ml/pocillo HCl 50 mM, KC1500 mM durante 30 minutos y posteriormente se neutralizó mediante 50 ml/pocillo de Tris 1 M pH8, se tituló y propagó para la próxima ronda. Para rondas posteriores, el cribado de las bibliotecas de fagos se realizó en fase de solución, donde la biblioteca de fagos se incubó con 100 nM de proteína diana biotinilada (la concentración se basa en valor de IC50 de fago clon parental) en 100 ml amortiguador que contiene Superblock al 1 % (Pierce Biotechnology) y Tween20 al 0,05 % durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó además 10X con Superblock al 1 %, y IOOmI/pocillo se aplicó a pocilios recubiertos con neutravidina (10pg/ml) durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Para determinar la unión de fondo, se capturaron pocilios de control que contienen fago en placas recubiertas con neutravidina. El fago unido luego se lavó, eluyó y propagó como se describe para la primera ronda. Se realizaron cinco rondas más de clasificación de solución junto con rigor de selección en aumento. Las primeras rondas son para selección de tasa de asociación reduciendo la concentración de proteína diana biotinilada de 100 nM a 0,1 nM, y las últimas dos rondas son para selección de tasa de disociación agregando cantidades excesivas de proteína diana no biotinilada (300 a 1000 veces más) para competir con aglutinantes más débiles a temperatura ambiente. d. ELISA de clasificación de afinidad de alto rendimiento (Competencia de punto simple) Se eligieron colonias de la sexta ronda de clasificación. Las colonias se cultivaron durante la noche a 37 °C en 150 ml/pocillo de medio 2YT con 50 mg/ml carbenicilina y lx 1010/ml M13K07 en placa de 96 pocilios (Falcon). De la misma placa, se eligió una colonia de fago parental infectado XL-1 como control. Se recubrieron placas de 96 pocilios Nunc Maxisorp con IOOmI/pocillo de Jagl o Jag2 (0,5 pg/ml) en PBS a 4 °C durante la noche. Las placas se bloquearon con 150 ml de BSA al 1 % y Tween20 al 0,05 % en PBS 20 durante 1 hora.
Se diluyó 35 m? del sobrenadante fago con 75 m? de en amortiguador de ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) (PBS con BSA al 0,5 %, Tween20 al 0,05 %) con o sin Jagl o Jag2 5 nM y se dejó incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en una placa F (NUNC). Se transfirieron 95 m? de mezcla lado a lado a las placas recubiertas con antígeno. La placa se agitó suavemente durante 15 min y se lavó diez veces con PBS-0,05 % Tween 20. La unión se cuantificó agregando anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en amortiguador de ELISA (1:2500) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS-0,05 % Tween 20 diez veces. A continuación, se agregó IOOmI/pocillo de sustrato de peroxidasa al pocilio y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La reacción se terminó agregando ácido fosfórico (H3PO4) IOOmI 0,1M a cada pocilio y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. La O.D. (densidad óptica) de color amarillo en cada pocilio se determinó usando un lector de placa de ELISA estándar a 450 nm. En comparación con la reducción de OD45onm (%) del pocilio de fago parental (100 %), los clones con reducción de OD45onm (%) menor que 50 % se eligieron para análisis de secuencia. Los clones únicos se seleccionaron para preparación de fagos para determinar la afinidad de unión (IC50 de fago) contra Jagl o Jag2 en comparación con clones parentales correspondientes. Luego los clones con mayor afinidad mejorada se reformatearon en IgGl humana para producción de anticuerpo y además análisis cinetico de unión BIAcore y otros ensayos in vitro o in vivo.
Ejemplo 2. Unión específica de anticuerpos generados contra antígenos Jaggedl o Jagged2 Los anticuerpos D-l (Figura 10A, panel izquierdo) y C-l (Figura 10A, panel derecho) se analizaron para determinar la unión con Jaggedl humano (Jag-lh), Jagged2 (Jag-2h), Jagged2 murino (Jag-2m), tipo Delta 1 humano (DLLlh), tipo Delta 1 murino (DLLlm) y tipo Delta 4 humano (DLL4m) de ligandos Notch purificados recombinantes usando un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas estándar (ELISA). Se recubrieron placas de ELISA (Nunc Maxisorp) con lpg/ml de proteína de ligando Notch en PBS, pH 7,4 a 40 °C durante la noche, incluyendo Jaggedl humano, Jagged2 humano y murino, tipo Delta 1 (DLL-1). Las placas se bloquearon con bloqueador Caseína en PBS (Pierce) durante una hora a temperatura ambiente. Se agregaron diluciones en serie en 3 veces de IgG anti-Jaggedl/2 en amortiguador PBST (amortiguador PBT (PBS + Tween 20 al 0.05 % (v/v)) con BSA al 0,5 % (p/v)) a las placas y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron luego con PBST y se detectaron anticuerpos unidos con IgG antihumana de cabra específica de Fab conjugada con peroxidasa (Sigma). Se utilizó sustrato de TMB (3,31,5,5'-tetrametilbenzidina) y se lcyó la absorbancia a 650nM mediante un lector de placas de ELISA estándar. La absorbancia se gráfico con respecto a las concentraciones de las IgG utilizando un KaleidaGraph (Synergy Software). La figura 10A muestra los resultados, con OD450 en el eje y, que representan la extensión de la unión. Ninguno de los anticuerpos obtenidos en la primera ronda de análisis de anticuerpos descrita en el Ejemplo 1 reconoció, de forma selectiva, solo Jaggedl o solo Jagged2. D-l une Jaggedl humano y de ratón así como también Jagged2 humano y murino (Figura 10A, panel izquierdo y datos no mostrados). C-1 une Jaggedl humano y murino, Jagged2 humano y murino, y tipo Delta 1 humano y murino (Figura 10A, panel derecho, y datos no mostrados). Ninguno de los anticuerpos se unió con tipo Delta 4 humano.
Otras rondas de clasificación identificaron anticuerpos específicos solo para uno de los miembros de la familia Jagged como se determina por ELISA. El anticuerpo A se unió a Jaggedl humano y murino, pero no a Jagged2 (Figura 10B). Por el contrario, el anticuerpo B se unió a Jagged2 humano y murino, pero no a Jaggedl (Figura 10B). Se utilizó C-l como un control para unirse con Jaggedl y Jagged2.
Ejemplo 3. Afinidades de unión a anticuerpo y mapeo de epítopo.
Las afinidades de unión de anticuerpos fago anti-Jaggedl/2 se midieron por resonancia de plasmones superficiales (SRP) usando un instrumento BiAcore™-3000. Se capturaron IgG humanos fagos anti-Jaggedl/2 por IgG anti-humano de ratón que recubría al chip sensor CM5 para alcanzar aproximadamente 150 unidades de respuesta (RU). Para la medición de cinética, se inyectaron diluciones en serie dos veces de Jagl/2 DSL_EGFl-4 humano o de ratón (1,95 nM a 250 nM) en amortiguador PBT (PBS con Tween 20 al 0,05 %) a 25 °C con una velocidad de flujo de 30ml/min. Se calculan las velocidades de asociación (kon) Y las velocidades de disociación (koff) utilizando un modelo de unión de Langmuir uno a uno simple (BIAcore Evaluation Software, versión 3.2). Se calcula la constante de equilibrio de disociación (kd) como la relación k0ff/k0n.
La Figura 11 resume las constantes de unión para los anticuerpos A, A-l, A-2, B, B-l, B-2, B-3, B-4, C, C-l, D, D-1, y D-2 que se unen a Jaggedl humano purificado, Jagged2 humano y Jagged2 de ratón. El anticuerpo A original se une específicamente a Jaggedl humano y murino (Figura 11 y datos no mostrados). La afinidad maduró los anticuerpos A-l y A-2 unidos a Jaggedl humano y murino con alta afinidad (Figura 11). Los anticuerpos A, A-l y A-2 no se unieron a Jagged2 humano o murino (Figura 11). Por el contrario, ninguno de los anticuerpos B, B-l, B-2, B-3 o B-4 se unió a Jaggedl humano o murino. Los anticuerpos madurados por afinidad B-l, B-2, B-3 o B-4 se unieron específicamente a Jagged2 humano y de ratón (Figura 11 y datos no mostrados). Los anticuerpos C, C-l, D, D-l, D-2, D-3, D-4 y D-5 se unieron a Jaggedl y Jagged2 (Figura 11). Con respecto a Jaggedl, la unión de los anticuerpos C, C-l, D, D-l, D-2, D-3, D-4 y D-5 se mapearon hasta un fragmento DSL-EGF1-4 de Jaggedl mediante experimentos de bloqueo cruzado ELISA.
Ejemplo 4. Anticuerpos antagonistas anti-Jagged inhiben la señalización inducida por Jaggedl in vi tro.
Para determinar si los anticuerpos anti-Jagged pueden actuar como antagonistas de señalización Notch inducida por Jagged, se realizaron experimentos de cocultivo esencialmente como se describe en Wu et ál., Nature 464, 1052-1057 (15 de abril de 2010). Las células N1H-3T3 diseñadas para expresar Jaggedl, como el ligando Notch, se cocultivaron con células N1H 3T3 que expresan Notchl de forma estable y que se transfectaron de forma transitoria para expresar un indicador de luciferasa de luciérnaga de TP-1 que responde a Notch (12X CSL) y un indicador de luciferasa Renilla expresado de forma constitutiva (pRL-CMV, Promega). La señal indicadora de Notch fuerte (luciferasa de luciérnaga) se observó en el cocultivo (Figura 12, Control positivo inducido por Jl). La expresión indicadora se redujo a niveles de fondo cuando un inhibidor de g-secretasa se agregó al cocultivo (Figura 12, Compuesto E+), que demuestra la expresión dependiente de Notch de la construcción indicadora.
La adición de cantidades aumentadas (0,4-50mg/ml) de anticuerpos anti-Jagged C o D tuvo como resultado una inhibición dependiente de la dosis de la expresión indicadora (Figura 12, comparar C y D con el control positivo inducido por Jl). Por el contrario, un anticuerpo de control de isotipo que no reconoce Jagged o Notch no reduce de forma significativa la expresión génica indicadora (Figura 12, Control de Isotipo AB). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que los anticuerpos C y D actúan como antagonistas, es decir, inhiben la señalización mediada por Jaggedl a través del receptor de Notch Notchl de forma dependiente de la dosis.
Se obtuvieron resultados similares con anticuerpos madurados por afinidad analizados en el ensayo de cocultivo descrito anteriormente para determinar su habilidad para inhibir la señalización de Notch mediada por Jaggedl. Los anticuerpos originales C y D, anticuerpos madurados por afinidad C-l, D-1, D-2, D-3, D-4 y D-5 respectivos inhibieron la señalización de Notch mediada por Jaggedl en una forma dependiente de la dosis, mientras que no se observó inhibición para el control de isotipo (Figura 13A).
Ejemplo 5. Anticuerpos antagonistas anti-Jagged que inhiben la señalización inducida por Jaggedl in vitro.
Los anticuerpos C y D, y sus descendientes madurados por afinidad respectivos, se unen a Jagged humano y murino y a Jagged2 humano y murino (por ejemplo, Figura 10A). Para determinan si los anticuerpos selectivos para Jaggedl sólo o Jagged2 sólo pueden inhibir selectivamente la señalización de Notch inducida por Jaggedl y/o 2, respectivamente, los experimentos de cocultivo descritos en el Ejemplo 4 se repitieron con el anticuerpo específico de Jaggedl A-2 o el anticuerpo específico de Jagged2 B-3. La señalización se indujo por Jaggedl (Figura 13B, columnas gris oscuro) o por Jagged2 (Figura 13B, columnas gris claro) y la inhibición se determinó como se describe en el Ejemplo 4 mediante los anticuerpos a concentraciones de 0,016-50 mg/ml. Los controles incluyeron cultivos que no se estimularon con ligando y no se trataron con anticuerpo (Figura 13B, No tratado), no se estimularon con ligando (Figura 13B, Sin estimulación o 3T3P), tratados con 5-10 pg/ml de anticuerpo de control de isotipo (Figura 13B, agD o gD), estimulado con un ligando, pero no tratado con un anticuerpo (Estim/sin AB o Sin Ab), tratado con 5 mM del inhibidor gamma-seeretasa DAPT o el control vehículo DAPT de DMSO.
El anticuerpo A-2 inhibió la señalización inducida por Jaggedl, pero no la señalización inducida por Jagged2, de forma dependiente de la dosis (Figura 13B, panel izquierdo superior). La IC50 para A-2 fue entre 2 y 10 mg/ml para la inhibición de Jaggedl mientras se observó poco o nada de Jagged2 aun en la mayor concentración de 50 pg/ml. Los resultados demostraron que el anticuerpo A-2 es un antagonista selectivo de Jaggedl, es decir, el anticuerpo A-2 inhibe la señalización mediada por Jaggedl, pero no la señalización mediada por Jagged2. Por el contrario, el anticuerpo B-3 inhibió de forma potente la señalización inducida por Jagged2 en la menor concentración analizada pero no inhibió la señalización inducida por Jaggedl en la mayor concentración analizada, estableciendo así B-3 como un antagonista selectivo de Jaggedl (panel izquierdo inferior). El anticuerpo C-l inhibió la señalización inducida por Jaggedl y Jagged2, de una forma dependiente de la dosis (panel derecho superior). Tomados conjuntamente, los resultados muestran que A-2 y B-3 funcionan como inhibidores selectivos de Jaggedl y Jagged2, respectivamente, mientras que C-l funciona como un inhibidor de ambos Jaggedl y Jagged2.
Ejemplo 6. Efecto del tratamiento de anticuerpo anti-Jagged sobre peso corporal.
Como se describe anteriormente, los inhibidores de gamma-secretasa y otros inhibidores de múltiples receptores Notch, provocan pérdida de peso y metaplasia intestinal de células calciformes, que no es deseable para la administración clínica. Para determinar cómo los anticuerpos descritos en la presente afectan el peso corporal y la salud intestinal, los ratones se dosificaron dos veces por semana con el anticuerpo anti-Jaggedl/2 C-l (5-10 mg de anticuerpo por kg de peso corporal del ratón (mpk)), el anticuerpo ant-Jaggedl A-2 (5- 20mpk), el anticuerpo anti-Jagged2 B-3 (5-20 mpk), el anticuerpo A-2 y B-3 en conjunto (5mpk cada uno) o el anticuerpo ant-gD de control de isotipo (20mpk). El anticuerpo de control de isotipo también se usó para llevar la concentración total de anticuerpo de cada dosificación a 20 mpk. El peso corporal total de cada ratón se determinó antes de la primera administración de anticuerpos y se monitoreó hasta el día 12 del estudio. Los cambios en el peso corporal promedio se representan en la Figura 14A-14B, graficados como un porcentaje del peso corporal de partida. La inhibición dual de Jaggedl y Jagged2, usando el anticuerpo anti-Jaggedl/2 C-l o una combinación del anticuerpo A-2 específico de Jaggedl y el anticuerpo B-3 específico de Jagged2 juntos, provocó una pérdida de peso rápida y sustancial (Figura 14A). Al día 4, algunos ratones que recibieron el anticuerpo anti-Jaggedl/2 C-l habían perdido más del 5 % de su peso corporal, que evolucionó a cerca de 8-10 % de pérdida en el peso corporal al día 7 (Figura 14A). Los ratones que recibieron A-2 y B-3 también perdieron peso rápidamente, en algunos casos hasta 17 % al día 11 (Figura 14A). Por el contrario, ninguno de los anticuerpos específicos de Jaggedl o específicos de Jagged2 por sí solos provocaron pérdida de peso durante el transcurso del estudio a 5 o 20mpk (Figura 14A). El tratamiento con la combinación de anticuerpos anti-Jaggedl más anti-Jagged2 dio como resultado una ingesta reducida de alimento (Figura 14B), que se correlaciona con la reducción observada en el peso corporal (Figura 14A) y sugiere que la ingesta reducida de alimento puede justificar en parte o totalmente las reducciones correlacionadas de peso corporal.
Ejemplo 7. Histología intestinal luego del tratamiento con anticuerpos anti- La inhibición Pan-Notch, por ejemplo, por los inhibidores gamma-secretasa, así como también la inhibición combinada de Notchl más Notch2 o Dlll más D114 (véase u et ál., Nature 2010; Pellegrinet et ál., Gastroenterology, 2011), causa mataplasia de células calciformes en ratones, y se cree que esta metaplasia es responsable de la pérdida de peso observada.
Para determinar si la rápida pérdida de peso corporal que sucede luego de la inhibición combinada de Jaggedl y Jagged2 observada en el Ejemplo 6 se asocia con metaplasia de células calciformes, se aislaron y se examinaron las muestras intestinales de los ratones tratadas como se describe en el Ejemplo 6. Se tiñeron los intestinos con hematoxilina y eosina (Figuras 15A, H&E) o con Alcian Blue para determinar mucosidad, un marcador de células calciformes secretoras (Figura 15A, Alcian Blue). Algunas muestras se analizaron mediante inmunohistoquímica para determinar la expresión de lisozima, un marcador de células Paneth, o para determinar el marcador de proliferación Ki-67 (Figura 15B). No pudieron observarse diferencias obvias entre la expresión de la histología o del marcador en las secciones intestinales de los ratones tratados con, el anticuerpo de control o el anticuerpo anti-Jaggedl/2 C-l. Estos resultados sugieren que la pérdida de peso observada luego de la inhibición de Jaggedl y 2 no puede atribuírsele a la metaplasia de células calciformes. Además, estos resultados descubren un mecanismo nuevo para la pérdida de peso que sigue al tratamiento con inhibidores de Notch, lo que indica que la metaplasia de células calciformes puede ser insuficiente para explicar la pérdida de peso luego del tratamiento con inhidores de pan-Notch.
Ejemplo 8. Anticuerpos antagonistas de anti-Jaggedl que inhiben el crecimiento de célula de cáncer de pulmón humano in vivo. Se inocularon ratones lampiños atímicos Harían por vía subcutánea con células Calu-6, una línea de cáncer de pulmón no microcítico humano. Luego de que el volumen tumoral alcanzara aproximadamente 200 mm cúbicos, se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal (IP) dos veces por semana (días 0, 4, 7, 11, 14 y 18) con 20 mpk de anticuerpo de control de isotipo anti-gD (n=10) o con anticuerpo anti- Jaggedl A-2 (n=10). El volumen tumoral en cada ratón se midió con calibradores durante otros 19 días. El peso corporal total de cada ratón se monitoreó durante el transcurso del estudio.
Los tumores en los ratones tratado con anti-Jaggedl mostraron una reducción considerable del volumen tumoral con respecto a tumores en el grupo de control (Figura 16A-1-16A-2). El efecto del tratamiento con anticuerpo anti-Jaggedl se puede detectar tan pronto como al día siete luego del tratamiento (Figura 16A-1-16A-2). El día 18, el volumen tumoral promedio en ratones que recibieron el anticuerpo anti-Jaggedl alcanzó aproximadamente 500mm3, mientras que el volumen tumoral promedio en los animales de control alcanzó aproximadamente 750 mm3 el día 18. No se observó un cambio considerable en el peso corporal entre el grupo de tratamiento y de control (Figura 16B-1-16B-2).
Ejemplo 9. Anticuerpos anti-Jaggedl y anti-Jagged2 que inhiben el crecimiento de célula de cáncer de mama humano in vivo.
Se inocularon ratones C.B-17 SCID.bg en la almohadilla de grasa mamaria con células MDA-MD-468, una línea de cáncer de mama basal humano. Luego de que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 200 mm cúbicos, los ratones se dosificaron de forma IP con 30 mpk de tanto el anticuerpo anti-gD de control de isotipo (isotipo de IgGl humana), anticuerpo anti-ambrosía del control de isotipo (isotipo de IgG2a murina), anticuerpo anti-Jaggedl A-2 en la estructura principal de la IgGl humana, anticuerpo anti-Jaggedl A-2 en la estructura principal de la IgG2a murina o anticuerpo ant-Jagged2 B-3 en la estructura principal de la IgGl humana en los días 0, 4, 7, 12, 15, 18, 22, 25, 29, 32, 36, 43, 50, y 57. El volumen tumoral (eje y) se midió con calibradores durante 60 días luego de la primera inyección. Los volúmenes tumorales para cada grupo (n=9 por grupo) se graficaron usando un modelo de efecto mixto lineal (Figura 17A). Los volúmenes tumorales para cada ratón en cada grupo se representaron en la Figura 17B.
Los tres anticuerpos anti-Jagged inhibieron el crecimiento tumoral significativamente. Ambos anticuerpos anti-Jaggedl inhibieron el crecimiento tumoral en una extensión similar, demostrando que las propiedades de crecimiento antitumoral observadas son consistentes e independientes de la estructura principal del anticuerpo.
Pese a que la invención anterior ha sido descrita en detalle a modo ilustrativo y de ejemplo con fines de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no deberían interpretarse como que limitan el alcance de la invención. Las descripciones de todas las patentes y bibliografía científica citada en la presente se incorporan expresamente a modo de referencia en su totalidad.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado que se une con Jaggedl, el anticuerpo comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR que se seleccionan de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:81; (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:84; (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:87; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:110; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111; y (f) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:114. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:81; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:82; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:85; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:110; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:112. 3. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:81; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:82; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:86; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:110; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:113. 4. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:81; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:83; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:85; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:110; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:111; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:112. 5. Un anticuerpo aislado que se une con Jagged2, el anticuerpo comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR que se seleccionan de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89; (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:94; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:115; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:116; y (f) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:122. 6. El anticuerpo de la reivindicación 5, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88 (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:90; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:117. 7. El anticuerpo de la reivindicación 5, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:91; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:118. 8. El anticuerpo de la reivindicación 5, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:90; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:119. 9. El anticuerpo de la reivindicación 5, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:92; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:120. anticuerpo de la reivindicación 5, donde anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:88; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:93; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:115; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:116; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:121. 11. Un anticuerpo aislado que se une con Jaggedl/2, el anticuerpo comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR que se seleccionan de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:95; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:96; (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:99; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:123; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:124; y (f) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:127. 12. El anticuerpo de la reivindicación 11, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:95; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:96; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:97; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:123; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:124; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:125. 13. El anticuerpo de la reivindicación 11, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:95; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:96; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:98; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:123; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:124; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:126. 14. Un anticuerpo aislado que se une con Jaggedl/2, el anticuerpo comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR que se seleccionan de: (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:105; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:109; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:134. 15. El anticuerpo de la reivindicación 14 , donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:100; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:130. 16. El anticuerpo de la reivindicación 14, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:100; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:108; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:131. 17. El anticuerpo de la reivindicación 14, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:101; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:132. anticuerpo de la reivindicación 14, donde anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:102; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:133. 19. El anticuerpo de la reivindicación 14, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:103; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:132. 20. El anticuerpo de la reivindicación 14, donde el anticuerpo comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:104; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:106; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:107; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:128; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:129; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:132. 21. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1- 20, el cual es un anticuerpo monoclonal. 22. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-20, el cual es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. 23. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-20, el cual es un fragmento de anticuerpo. 24. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1- 20, que comprende adicionalmente un marco de dominio variable de cadena ligera FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:60; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:61; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:62; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:135. 25. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 9 que comprende un marco de dominio variable de cadena pesada FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:136; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:57; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:35. 26. El anticuerpo de la reivindicación 15, que comprende un marco de dominio variable de cadena pesada FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:57; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:35. 27. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende (a) una secuencia de VH con al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10; (b) una secuencia de VL con al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19; o (c) una secuencia de VH como en (a) y una secuencia de VL como en (b). 28. El anticuerpo de la reivindicación 27, que comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:10. 29. El anticuerpo de la reivindicación 27, que comprende una secuencia VL de la SEQ ID NO:19. 30. Un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:10 y una secuencia VL de la SEQ ID NO:19. 31. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende (a) una secuencia de VH con al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:11; (b) una secuencia de VL con al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20; o (c) una secuencia de VH como en (a) y una secuencia de VL como en (b). 32. El anticuerpo de la reivindicación 31, que comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:11. 33. El anticuerpo de la reivindicación 31, que comprende una secuencia VL de la SEQ ID NO:20. 34. Un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:11 y una secuencia VL de la SEQ ID NO:20. 35. El anticuerpo de la reivindicación 5, que comprende (a) una secuencia de VH con al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15; (b) una secuencia de VL con al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24; o (c) una secuencia de VH como en (a) y una secuencia de VL como en (b). 36. El anticuerpo de la reivindicación 35, que comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:15. 37. El anticuerpo de la reivindicación 35, que comprende una secuencia VL de la SEQ ID NO:24. 38. Un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:15 y una secuencia VL de la SEQ ID NO:24. 39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 5, que es un anticuerpo IgGl de longitud completa. 40. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el anticuerpo es un antagonista de la señalización mediada por Jaggedl. 41. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 5- 10, donde el anticuerpo es un antagonista de la señalización mediada por Jagged2. 42. Un anticuerpo aislado que compite con el anticuerpo de la reivindicación 1 por la unión específica con Jaggedl. 43. Un anticuerpo aislado que compite con el anticuerpo de la reivindicación 5 por la unión específica con Jagged2. 44. El ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de la reivindicación 1. 45. Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 44. 46. El ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de la reivindicación 5. 47. Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 46. 48. Un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 45 o 47 para que se produzca el anticuerpo. 49. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 y un agente citotóxico. 50. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 y un portador farmacéuticamente aceptable. 51. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-41 para su uso como un medicamento. 52. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-41 para su uso como en el tratamiento de un cáncer. 53. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-41 para su uso como en la reducción del crecimiento celular de células cancerosas. 54. El uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-41 en la fabricación de un medicamento. 55. El uso de la reivindicación 54, donde el medicamento es para tratar un cáncer. 56. El uso de la reivindicación 54, donde el medicamento es para reducir el crecimiento de células cancerosas. 57. Un método para tratar a un individuo que tiene un cáncer que comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-41. 58. El método de la reivindicación 57, donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer del ducto biliar, cáncer pancreático, cáncer de piel, neoplasias malignas de células B, y neoplasias malignas de células T.
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