JP2009078998A

JP2009078998A - Ｊａｇｇｅｄ２を用いる制癌剤

Info

Publication number: JP2009078998A
Application number: JP2007249034A
Authority: JP
Inventors: Koji Yasutomo; 康二安友
Original assignee: University of Tokushima NUC
Current assignee: University of Tokushima NUC
Priority date: 2007-09-26
Filing date: 2007-09-26
Publication date: 2009-04-16

Abstract

【課題】癌治療は、従来の化学療法だけでは長期的な治癒が期待できないので、従来の抗癌剤とは作用機序の異なる新しい治療方法として、免疫療法の確立が望まれる。癌の治療や再発防止に確固たる術のない現状を打開するため、安全かつ有効な癌の免疫療法の確立が期待される。
【解決手段】ＮｏｔｃｈリガンドであるＪａｇｇｅｄ２遺伝子の発現が増強された抗原提示細胞を有効成分とする制癌剤、配列番号１又は３の全長アミノ酸配列からなるＪａｇｇｅｄ２タンパク質あるいはその活性ドメインを含むＪａｇｇｅｄ２断片を有効成分とする制癌剤、Ｊａｇｇｅｄ２又はそれと同様の活性を有するペプチドをコードする塩基配列をベクターに挿入連係することにより構築される発現ベクター、前記発現ベクターを導入した細胞である抗原提示細胞、及び前記発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチン。
【選択図】図１

Description

本発明は、Ｊａｇｇｅｄ２を用いる制癌剤に関する。更に詳細には、ＮｏｔｃｈリガンドであるＪａｇｇｅｄ２遺伝子の発現が増強された抗原提示細胞を有効成分とする制癌剤、配列番号１又は３の全長アミノ酸配列からなるＪａｇｇｅｄ２タンパク質あるいはその活性ドメインを含むＪａｇｇｅｄ２断片を有効成分とする制癌剤、Ｊａｇｇｅｄ２又はそれと同様の活性を有するペプチドをコードする塩基配列をベクターに挿入連係することにより構築される発現ベクター、前記発現ベクターを導入した細胞である抗原提示細胞、及び前記発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチンに関する。

用語「ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）」は、１９１７年にモルガン（T.H. Morgan）らによる、翅末端にＶ字の切り込み（notch）を有するショウジョウバエの記述において最初に用いられ、その遺伝子ＤＮＡの塩基配列は１９８５年に初めて報告された。ノッチ分子は、そのＮ末端を占めるシクナルペプチド、膜貫通（細胞外）ドメイン、細胞内ドメイン等からなる膜タンパク質ないしは膜貫通レセプターであり、発生や分化を制御するノッチの機能は細胞表面のリガンドにより活性化される。ノッチとそのリガンドは多数の細胞で発現され、哺乳類では４種のノッチ、即ち、Ｎｏｔｃｈ１〜Ｎｏｔｃｈ４、及び５種のノッチリガンド、即ち、Ｄｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、Ｄｅｌｔａ４、Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２が現在知られている（非特許文献１）。

係るノッチとそのリガンドの作用・機能に関しては、例えば、これ等のシグナル伝達によるリンパ球分化の制御、即ち、造血幹細胞のＴ細胞やＢ細胞等への分化、ノッチとそのリガンドによるＴ細胞やＢ細胞への機能化の制御等（非特許文献２）、ノッチによる成熟Ｔ細胞への分化とその活性の支配（非特許文献３）、転写後修飾である糖鎖付加（glycosylation）によるノッチのシグナル伝達の制御（非特許文献１）等が、上記の通り、非特許文献１〜３において総説されている。

更に、前述した哺乳類のノッチとそのリガンド並びにこれ等の遺伝子の利用に関しては以下が知られている：全能性幹細胞培養用フィーダー（特許文献１）、幹細胞培養媒体（特許文献２）、骨髄移植や臓器移植等における拒絶反応やアレルギー反応の抑制（特許文献３）、骨粗鬆症や破骨細胞分化等の治療剤（特許文献４）、血管細胞調節剤（特許文献５）、細胞分化の制御（特許文献６）、前立腺細胞の増殖抑制（特許文献７）、細胞分化の抑制による前駆細胞の増幅（特許文献８）、Ｄｅｌｔａ又はＪａｇｇｅｄ遺伝子、及びアレルゲン、ＭＨＣ抗原、癌抗原等の遺伝子を移入した免疫担当細胞を用いるワクチン（特許文献９）、Ｄｅｌｔａの細胞外ドメインとＩｇＧのＦｃドメインとの融合タンパク質を用いるＩＬ４発現とＴｈ１／Ｔｈ２バランスの調節剤（特許文献１０）、Ｄｅｌｔａを用いる臓器移植での拒絶反応の抑制剤や骨髄移植に伴う疾患の治療剤（特許文献１１）、ノッチリガンドと担体薬物との複合体を用いる癌、アレルギー、感染症等の免疫療法剤（特許文献１２）、サイトカインの発現調節剤（特許文献１３）、Ｄｅｌｔａ１とＪａｇｇｅｄ１による骨髄性白血病細胞株の増殖抑制（非特許文献４）等。

上記に加えて、Ｄｅｌｔａ１又はＤｅｌｔａ４（即ち、Ｄｅｌｔａ１又はＤｅｌｔａ４を強制的に過剰発現させた抗原提示細胞）でＣＤ８陽性Ｔリンパ球を刺激すると、ＣＴＬへの分化が促進されて抗腫瘍作用が生じるが、この時にＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２の発現を強制的に抑制すると、Ｄｅｌｔａ１又はＤｅｌｔａ４の効果は相乗的に増強されるという報告もある（特許文献１４）。また、Ｊａｇｇｅｄ２はin vitroの系において、造血幹細胞からのナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の発生を促進するという報告もある（非特許文献６）。

以上に見られる通り、既にノッチとそのリガンドの作用機能の活用技術は多様に開発されているが、Ｊａｇｇｅｄ２の制癌作用については未だ知られていない。

特開２００５−３４ＷＯ０２／０１６５５６特開２００３−９３０４８特開２００１−１２２７９８特開平１０−３１６５８２特開２００４−６５２４３特表２００４−５２４２６９特表２０００−５１１０４３ＷＯ０４／０８３３７２ＷＯ０４／０６２６８６ＷＯ０４／０２２７３０ＷＯ０３／０８７１５９ＷＯ０３／０１１３１７特開２００６−２４１０８７ Nature Reviews Molecular Cell Biology、第4巻、 786-797、 October 2003. Nature Immunology、第5巻 (3号)、 247-253、 March 2004. Journal of Immunology、第173巻、7109-7113、 2004. International Journal of Molecular Medicine、第14巻 (2号)、 223-226、 2004. Gene Therapy、第7巻、 1063-1066、 2000. Blood、第105巻 (9号)、 3521-3527、 2005.

癌の治療や再発防止に確固たる術のない現状にあっては、安全かつ有効な癌の免疫療法の確立は、患者とその家族、そして担当臨床医のみならず、全人類にとって解決されるべき待望の課題である。

本発明の目的は、Ｎｏｔｃｈリガンドの１つであるＪａｇｇｅｄ２による癌の増殖抑制を利用した制癌剤及び癌に対する治療方法を提供することにある。

Ｊａｇｇｅｄ２遺伝子の発現が増強された抗原提示細胞やＪａｇｇｅｄ２タンパク質を有効成分とする制癌剤、Ｊａｇｇｅｄ２遺伝子の過剰発現をもたらすＤＮＡワクチンなどを投与することによって、癌の増殖を抑制し、更には腫瘍体積を縮小することもできる。従って、本発明によって、癌に対する免疫療法の確立が可能となる。

（略語の説明）
先ず、本明細書で使用する略語について、略語（用語）の形で以下に列記する：ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球；Cytotoxic T Lymphocyte）、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ；Immunoglobulin G）、ＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞；natural killer cell）、抗ａＧＭ１抗体（抗アシアロ−ＧＭ１抗体；anti-GM1 antibody）、及びＩＦＮγ（インターフェロンγ；interferon γ）。

（配列表の説明）
配列番号１：マウスＪａｇｇｅｄ２の全長アミノ酸配列である。
配列番号２：マウスＪａｇｇｅｄ２をコードするｃＤＮＡの塩基配列であって、コード領域は第１２番〜第３７５７番塩基である。
配列番号３：ヒトＪａｇｇｅｄ２の全長アミノ酸配列である。
配列番号４：ヒトＪａｇｇｅｄ２をコードするｃＤＮＡの塩基配列であって、コード領域は第４０５番〜第４１２１番塩基である。
配列番号５と６：マウスＪａｇｇｅｄ２ｃＤＮＡ増幅用のプライマーである。

本発明によれば、前述の課題を解決するための手段として、次の（１）〜（１１）がそれぞれ提供される：
（１）ＮｏｔｃｈリガンドであるＪａｇｇｅｄ２又はその活性ドメインをコードする遺伝子の発現が増強された抗原提示細胞を有効成分とし、薬効を奏する量の該抗原提示細胞を含有することを特徴とする制癌剤。
（２）該遺伝子が、配列番号１又は３の全長アミノ酸配列あるいはその活性ドメインを含む部分有効配列をコードする遺伝子であることを特徴とする、上記１項に記載の制癌剤。
（３）該活性ドメインが、配列番号１の第１番〜第１０８３番アミノ酸又は配列番号３の第１番〜第９４３番アミノ酸であることを特徴とする、上記１又は２項に記載の制癌剤。
（４）該遺伝子が、配列番号２の第１２番〜第３７５７番の配列、配列番号２の第１２番〜第３２６０番の配列、配列番号４の第４０５番〜第４１２１番の配列及び配列番号４の第４０５番〜第３２３３番の配列からなる群より選ばれる塩基配列を含むものであることを特徴とする、上記１〜３項のいずれかに記載の制癌剤。
（５）配列番号１又は３の全長アミノ酸配列からなるＪａｇｇｅｄ２タンパク質、あるいはその活性ドメインを含むＪａｇｇｅｄ２断片を有効成分とし、薬効を奏する量の有効成分を含有することを特徴とする制癌剤。
（６）該活性ドメインが、配列番号１の第１番〜第１０８３番アミノ酸又は配列番号３の第１番〜第９４３番アミノ酸であることを特徴とする、上記５項に記載の制癌剤。
（７）Ｊａｇｇｅｄ２又はその活性ドメインが、ＮＫ細胞のインターフェロンγ誘導能又は細胞傷害活性を増強するものであることを特徴とする、上記１〜６項のいずれかに記載の制癌剤。
（８）Ｊａｇｇｅｄ２又はそれと同様の活性を有するペプチドをコードする塩基配列をベクターに挿入連係することにより構築される発現ベクター。
（９）該塩基配列が、配列番号２の第１２番〜第３７５７番の配列、配列番号２の第１２番〜第３２６０番の配列、配列番号４の第４０５番〜第４１２１番の配列及び配列番号４の第４０５番〜第３２３３番の配列からなる群より選ばれる塩基配列を含むものであることを特徴とする、上記８項に記載の発現ベクター。
（１０）上記８又は９項の発現ベクターを導入した細胞である抗原提示細胞。
（１１）上記８又は９項の発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチン。

本発明者はＮｏｔｃｈリガンドの１つであるＪａｇｇｅｄ２に着目し、Ｊａｇｇｅｄ２遺伝子の過剰発現がもたらす効果について鋭意検討した。その結果、驚くべきことに、Ｊａｇｇｅｄ２を過剰発現させると、腫瘍の増殖が抑制された。具体的には、Ｊａｇｇｅｄ２をコードするｃＤＮＡを挿入連携した発現ベクターをマウスリンパ腫細胞に導入したところ、空のベクターを導入したリンパ腫細胞と比べて、マウス皮下における腫瘍の増殖が抑制された（実施例１と図１を参照）。Ｊａｇｇｅｄ２が生体内で腫瘍の増殖を抑制するメカニズムについては明らかになっていないが、研究を進めたところ、以下に詳述する知見が得られた。

Ｊａｇｇｅｄ２による腫瘍の増殖抑制を詳細に検討するために、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）に着目した。初めに、ＮＫ細胞を除去する抗体である抗ａＧＭ１抗体がＪａｇｇｅｄ２の過剰発現に与える影響を観察した。抗ａＧＭ１抗体を投与した場合には、腫瘍の増殖は抑制されなかった（実施例２と図２（ｂ）を参照）。このことから、Ｊａｇｇｅｄ２の効果はＮＫ細胞を介していると考えられた。更にＪａｇｇｅｄ２がＮＫ細胞に与える影響について検討したところ、Ｊａｇｇｅｄ２はＮＫ細胞からのインターフェロンγの誘導を高めることが明らかになった（実施例３と図３を参照）。また、Ｊａｇｇｅｄ２はＮＫ細胞の細胞傷害活性を増強した（実施例４と図４を参照）。上記の知見から、Ｊａｇｇｅｄ２は生体内において単にＮＫ細胞の分化を促進してその数を増やすのではなく、ＮＫ細胞そのものに作用することでＮＫ細胞を介した抗腫瘍作用を発揮し、腫瘍の増殖を抑制することが明らかとなった。

更に本発明者は、可溶性Ｊａｇｇｅｄ２をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターをＤＮＡワクチンとして構築し、マウスに免疫することでその効果を確認し（実施例５と図５を参照）、本発明を完成するに至った。

尚、上述した非特許文献６にはＪａｇｇｅｄ２はin vitroの系において、造血幹細胞からのＮＫ細胞の発生を促進するという報告がある。しかし、この文献には、生体内におけるＪａｇｇｅｄ２の腫瘍増殖抑制効果や、Ｊａｇｇｅｄ２がＮＫ細胞に与える影響（即ち、ＩＦＮγ誘導能や細胞傷害活性の増強）については全く記載がない。従って、Ｊａｇｇｅｄ２そのもののin vivoにおける抗腫瘍効果は、本発明者によって初めて知見されたものである。

次に、本発明について具体的に説明する。

（１）Ｊａｇｇｅｄ２のアミノ酸配列とそれをコードするｃＤＮＡ
Ｊａｇｇｅｄ２のアミノ酸配列とそれをコードするｃＤＮＡはいずれも公知である。例えば、マウスやヒトのＪａｇｇｅｄ２の配列は公知のデータベース、例えば、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）から入手することができる。ヒトとマウスのＪａｇｇｅｄ２全長アミノ酸配列及びそれをコードするｃＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号１〜４に記載した。

尚、本発明の制癌剤やＤＮＡワクチンを使用する際には、その安全性と有効性を確保するために、同種の生物に由来するタンパク質とそれをコードする遺伝子の使用が望ましい。例えば、ヒトが対象の場合には、配列表の配列番号３と４に記載したヒトＪａｇｇｅｄ２のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列に基づいて発明を実施することが好ましい。

（２）Ｊａｇｇｅｄ２発現ベクター
Ｊａｇｇｅｄ２又はその活性ドメインをコードする遺伝子の発現を強制的に増強するために、Ｊａｇｇｅｄ２又はその活性ドメインをコードするｃＤＮＡ塩基配列を外来遺伝発現用ベクターに挿入連係することにより構築したＪａｇｇｅｄ２発現ベクターを使用することができる。また、発現ベクターに組み込む塩基配列としては、Ｊａｇｇｅｄ２の全長アミノ配列をコードする全長ｃＤＮＡ塩基配列が挙げられる。全長ｃＤＮＡ塩基配列は配列番号２と４に示したが、そのコード領域（配列番号２の第１２番〜第３７５７番の塩基配列と配列番号４の第４０５番〜第４１２１番の塩基配列）のみを使用することもできる。また、Ｊａｇｇｅｄ２の活性ドメインを含むペプチドをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２の第１２番〜第３２６０番の塩基配列と配列番号４の第４０５番〜第３２３３番の塩基配列）を発現ベクターに組み込むこともできる。この部分配列がコードするペプチドは全長Ｊａｇｇｅｄ２と同様の活性を示すが、可溶性になっているので好ましい。

本発明で使用する外来遺伝子発現用ベクターに特に限定はないが、動物細胞を宿主とする公知又は市販のベクターを使用することができる。例えば、レトロウイルス系、アデノウイルス系、ＥＢウイルス系、ＳＶ４０系、ポリオーマ系等々を使用することができる。本願の実施例ではｐＣＤＮＡ３．１（米国、Invitrogen社製）を使用したが、これに限定されるものではない。

（３）Ｊａｇｇｅｄ２遺伝子の発現が増強された細胞
上述したＪａｇｇｅｄ２発現ベクターは、ＤＮＡワクチンとしてそのまま使用することもできるし、Ｊａｇｇｅｄ２を過剰発現する形質転換体の作製に用いることもできる。
Ｊａｇｇｅｄ２を過剰発現する形質転換体は抗原提示細胞として、制癌剤の有効成分として使用することができる。Ｊａｇｇｅｄ２発現ベクターを導入する細胞に特に限定はなく、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ等を挙げることができる。Ｊａｇｇｅｄ２発現ベクターを細胞に導入する方法にも特に限定はなく、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＦｕＧＥＮＥ法（米国、Roche社製）、電気穿孔法等によるトランスフェクション、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクター等を用いるウイルス感染による導入方法、マイクロインジェクション等を挙げることができる。

（４）Ｊａｇｇｅｄ２を用いる制癌剤
本発明においては、Ｊａｇｇｅｄ２タンパク質又はその活性ドメインを含むＪａｇｇｅｄ２断片を、単離した形態あるいは抗原提示細胞に提示された形態で、制癌剤の有効成分として使用することができる。有効成分として使用するＪａｇｇｅｄ２は配列番号１と３に示した全長アミノ酸配列からなるタンパク質のみならず、その活性ドメインを含むＪａｇｇｅｄ２断片でもよい。Ｊａｇｇｅｄ２の活性ドメインは、マウスでは配列番号１の第１番〜第１０８３番アミノ酸であり、ヒトでは配列番号３の第１番〜第９４３番アミノ酸である。これらの活性ドメインを含む部分配列は全長タンパク質と同様の活性を示すものである。

単離したＪａｇｇｅｄ２タンパク質又はＪａｇｇｅｄ２断片は、配列表に示したアミノ酸配列に基づいて、公知のペプチド合成法で合成してもよいし、公知のタンパク質精製法を用いて細胞や組織から抽出してもよい。又、本願の実施例５で作製したＤＮＡワクチン用の発現ベクターは可溶性のＪａｇｇｅｄ２をコードしているので、この発現ベクターを細胞に導入して得た形質転換体を培養すれば、培養上清からＪａｇｇｅｄ２を単離することができる。Ｊａｇｇｅｄ２タンパク質やその断片を単離・精製する方法に特に限定はなく、公知のタンパク質精製方法を実施すればよい。具体的には、塩析、有機溶媒による沈殿、市販のゲルや樹脂への吸着脱着を用いるバッチ法やカラム精製等を使用することができる。

抗原提示細胞に提示された形態で、Ｊａｇｇｅｄ２タンパク質又はその活性ドメインを使用する場合には、上記（３）項で詳述した、Ｊａｇｇｅｄ２発現ベクターを導入した形質転換体を抗原提示細胞として使用することができる。

例えば、抗原提示細胞を皮下や腹腔内等に接種すると、腫瘍の増殖が抑制される。同様の効果が、Ｊａｇｇｅｄ２遺伝子を挿入連結した発現ベクターであるＤＮＡワクチンでマウスを免疫した場合にも観察される。これらの結果は、単離したＪａｇｇｅｄ２タンパク質又はその活性ドメインを含む断片を投与しても、同様の効果が達成されることを示している。本発明の制癌剤が腫瘍の増殖を抑制するメカニズムは明らかではないが、生体内において単にＮＫ細胞の分化を促進してその数を増やすのではなく、ＮＫ細胞そのものに作用することでＮＫ細胞を介した抗腫瘍作用を発揮し、腫瘍の増殖を抑制すると考えられる。

本発明の効果、即ち、Ｊａｇｇｅｄ２を過剰発現する形質転換体、Ｊａｇｇｅｄタンパク質やその断片、及びＪａｇｇｅｄ２発現ベクターであるＤＮＡワクチンの抗腫瘍効果は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性の測定や、腫瘍の増殖の計測によって評価することができる。

ＮＫ細胞の細胞傷害活性を測定するためには、Ｊａｇｇｅｄ２で誘導したＮＫ細胞をエフェクター細胞とし、⁵¹Ｃｒで標識した腫瘍細胞を標的細胞として混合する。次に一定時間培養した後、培養上清に遊離される⁵¹Ｃｒの放射活性を計測する。この場合、培養上清から計測される⁵¹Ｃｒの放射活性が高いほど、細胞傷害活性も高いとみなす（実施例４を参照）。

又、腫瘍の増殖に対する本発明の効果は、例えば、腫瘍細胞の移植前又は移植後にＪａｇｇｅｄ２（又はＪａｇｇｅｄ２を過剰発現する抗原提示細胞）あるいはＤＮＡワクチンを投与し、腫瘍細胞の増殖により拡大する腫瘍のサイズ（円状の腫瘍細胞領域の縦径×横径）を計測することによって評価することができる（実施例１を参照）。この場合、腫瘍のサイズが変化しないか、減少すれば、腫瘍細胞の増殖が抑制されたと評価する。

本発明に係るＪａｇｇｅｄ２タンパク質やその断片、抗原提示細胞又は発現ベクター、及びそれらを有効成分とする制癌剤は、アンプルやバイアル瓶等に分注し、液状又は乾燥品（凍結乾燥品）の形状で、密封された状態で提供かつ使用に供される。

以下、実施例を挙げて本発明の構成と効果を具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。

（１）Ｊａｇｇｅｄ２発現ベクターの構築
マウスＪａｇｇｅｄ２の全長ｃＤＮＡ配列を次の方法で用意した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓からＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを逆転写した。次に、マウスＪａｇｇｅｄ２のコード領域の全長、即ち、配列番号２の第１２番〜第３７５７番塩基をＰＣＲ法で増幅した。具体的には、プライマーとして、以下の配列を使用し、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（日本国、Ｔａｋａｒａ社製）で増幅した：
forward 5' atgcgggcac gcggctgggg acg 3'（配列番号５）及び
reverse 5' ttctgggtgc cagcctggt 3'（配列番号６）。
上記のｃＤＮＡ配列を発現ベクターであるｐＣＤＮＡ３．１（米国、Invitrogen社製）のＣＭＶプロモーターの下流に位置するＸｈｏＩサイトとＥｃｏＲＩサイトに、日本国、Ｔａｋａｒａ社製のラーゲーションキット（DNA Ligation Kit Ver.2.1, カタログ番号：6022）を用いて組み込んで、Ｊａｇｇｅｄ２発現ベクターを構築した。

（２）Ｊａｇｇｅｄ２発現細胞の樹立
次に、構築した発現ベクターをマウスリンパ腫細胞に導入した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のマウスリンパ腫細胞であるＡ２０細胞（ＡＴＣＣのカタログ番号：ＴＩＢ−２０８^TM）に、上記（１）項で作製したＪａｇｇｅｄ２発現ベクターを電気穿孔法で導入した。具体的には、細胞数を５×１０⁶個、導入するベクターの量を１５μｇとし、米国、BIO RAD社製のGenePulser Xcellを用い、２２０Ｖ、９５０μＦ、抵抗∞の条件で電気穿孔法を実施した。得られた細胞を、１０％牛胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に終濃度５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加しもので２０日間培養し、ベクターの導入された細胞を選択した。得られた細胞をＡ２０／Ｊａｇ２細胞と命名した。
コントロール用の細胞は、Ｊａｇｇｅｄ２を組み込んでいないｐＣＤＮＡ３．１を用いて上記と同様にＡ２０細胞をトランスフェクトすることで樹立した。得られたコントロール細胞をＡ２０／ｍｏｃｋ細胞と命名した。

（３）Ｊａｇｇｅｄ２の制癌作用
１０匹のＳＣＩＤマウスの腹部に、腫瘍として上記（２）項で作製したＡ２０／Ｊａｇ２細胞又はＡ２０／ｍｏｃｋ細胞を皮下注射した。注射した細胞の量は１×１０⁶個とした。細胞の注射から１日おきに腫瘍のサイズ（腫瘍領域の縦径×横径）を測定した。
結果を図１に示した。コントロールであるＡ２０／ｍｏｃｋ細胞からなる腫瘍は２２日間で３ｃｍ²以上になったが、Ｊａｇｇｅｄ２を導入したリンパ腫細胞であるＡ２０／Ｊａｇ２細胞はたった０．５ｃｍ²ほどしか増殖しなかった。従って、Ｊａｇｇｅｄ２の過剰発現によって、腫瘍の増殖は抑制された。

Ｊａｇｇｅｄ２の制癌作用に対する抗アシアロＧＭ１抗体の影響
２０匹のＳＣＩＤマウスを２つの群にわけ、一方の群（ｎ＝１０）においては、各マウスの腹腔内に１００μｇの抗アシアロＧＭ１抗体（日本国、ＭＢＬ社製）を、他方の群（ｎ＝１０）においては、コントロールとして１００μｇのウサギ免疫グロブリンＧ（ＲｂＩｇＧ）（米国、Jackson laboratory社製）を投与した。次の日に、全てのＳＣＩＤマウスの腹の左側に腫瘍として１×１０⁶個のＡ２０細胞（以下「Ａ２０／ｗｔ」と略す）を移植し、各群の半分（即ち、５匹）のマウスの腹部右側に抗原提示細胞として上記のＡ２０／Ｊａｇ２細胞を、残り半分（即ち、５匹）にはコントロールとして上記のＡ２０／ｍｏｃｋ細胞を１×１０⁶個移植した。腫瘍移植の３日後と５日後には、各マウスの腹腔内に再び前回と同じ抗体を投与した。細胞を移植してから径時的に左側の腫瘍のサイズを測定し、腫瘍の増殖に対する右側に移植した細胞の影響を確認した。尚、腫瘍のサイズは、腫瘍の縦径×横径とした。

結果を図２（ａ）と（ｂ）に示した。対照として使用したＲｂＩｇＧはＪａｇｇｅｄ２の腫瘍増殖抑制効果に影響を与えなかった（図２（ａ）参照）。一方、抗ａＧＭ１抗体を投与した群においては、Ｊａｇｇｅｄ２による腫瘍増殖抑制効果は見られなかった（図２（ａ）参照）。抗ａＧＭ１抗体はＮＫ細胞を除去する抗体であるため、この結果から、Ｊａｇｇｅｄ２の効果はＮＫ細胞を介していることが判明した。

Ｊａｇｇｅｄ２のインターフェロンγ誘導作用
ＢＡＬＢ／ｃマウスからＤＸ５陽性細胞（即ち、ＮＫ細胞）を分離した。具体的には、ＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓細胞を調製し、ＰＢＳに溶解した。次に細胞を抗ＤＸ５抗体（ドイツ国、Miltenyi Biotech社製）を結合させたビーズと反応させ、ＬＣカラム（ドイツ国、Miltenyi Biotech社製）を用いてＤＸ５陽性細胞を分離した。また、５０μｇ／ｍｌのＡ２０／Ｊａｇ２細胞又はＡ２０／ｍｏｃｋ細胞（２×１０⁵個）（実施例１で作製したもの）をマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）と３７℃で３０分反応させて、ＭＭＣ処理した細胞を得た。２×１０⁶個の分離したＤＸ５陽性細胞を、２×１０⁶個のＭＭＣ処理したＡ２０／Ｊａｇ２細胞又はＡ２０／ｍｏｃｋ細胞と共に１０％の胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間培養した。培養上清を回収し、そこに含まれるＩＦＮγの量をＥＬＩＳＡキット（Mouse IFNg ELISA Ready-SET-Go；米国、eBiosiences社製）を用いて測定した。

結果を図３に示した。ＮＫ細胞をＡ２０／Ｊａｇ２細胞と共に培養した場合には、Ａ２０／ｍｏｃｋ細胞と共に培養した場合の２倍以上のＩＦＮγが培養上清から検出された。従って、Ｊａｇｇｅｄ２はＩＦＮγ誘導能が高いことが明らかとなった。

In vivoにおける、Ｊａｇｇｅｄ２によるＮＫ細胞の細胞傷害活性の増強
２×１０⁷個の、上記のＡ２０／Ｊａｇ２細胞又は上記のＡ２０／ｍｏｃｋ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に移入することにより免疫した。免疫から３日後に、マウスの脾臓から実施例３と同様の方法でＤＸ５陽性細胞（ＮＫ細胞）を分離した。得られた２種のＤＸ５陽性細胞（即ち、Ａ２０／Ｊａｇ２細胞で誘導したＤＸ５陽性細胞とＡ２０／ｍｏｃｋ細胞で誘導したＤＸ５陽性細胞）をそれぞれエフェクター細胞として以下の実験に用いた。
標的細胞としては、⁵¹Ｃｒで標識したＡ２０／Ｊａｇ２細胞を用いた。細胞の標識は、次の方法で行った。１×１０⁶個の細胞を１００μＣｉの⁵¹Ｃｒと共に１時間培養し、フリーの⁵¹Ｃｒは遠心分離で除去した。

エフェクター細胞であるＤＸ５陽性細胞と、標的細胞である⁵¹Ｃｒ標識Ａ２０／Ｊａｇ２細胞とを混合培養した。細胞の混合比、即ち、エフェクター細胞と標的細胞の細胞数の比（Ｅ／Ｔ）は、１００：１、５０：１と２５：１とし、１０％の胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で５時間培養した。培養上清を実施例４と同様の方法で回収し、培養上清に含まれる遊離⁵¹Ｃｒをベーターカウンターで測定した。
⁵¹Ｃｒで標識したＡ２０／Ｊａｇ２細胞をTriton-Xで溶解して測定したＣｒの値を１００とし、それに対する比として結果をグラフ（図４）に示した。この結果から明らかなように、Ｊａｇｇｅｄ２はＮＫ細胞の細胞傷害活性を増強した。

（１）Ｊａｇｇｅｄ２ＤＮＡワクチンの構築
Ｊａｇｇｅｄ２ＤＮＡワクチンとして、図５に示した発現ベクターを構築した。マウスＪａｇｇｅｄ２の全長ｃＤＮＡ配列（配列番号２）の第１２番〜第３２６０番塩基（配列番号１のアミノ酸配列の第１番〜第１０８３番アミノ酸に相当）を用意し、その５’末端にＦｌａｇタグをつけた。この配列を発現ベクターであるｐＣＤＮＡ３．１（米国、Invitrogen社製）のＣＭＶプロモーターの下流に位置するＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＶサイトに組み込んで、可溶性Ｊａｇｇｅｄ２を発現するベクターを構築した。

（２）Ｊａｇｇｅｄ２ＤＮＡワクチンの効果
上記（１）項で構築したＪａｇｇｅｄ２ＤＮＡワクチン又はコントロールＤＮＡとなる空のｐＣＤＮＡ３．１ベクターをＳＣＩＤマウスの腓腹筋に接種することで免疫した。いずれの場合もＤＮＡ量は５０μｇとした。免疫から２日後には１×１０⁶個のＡ２０細胞を腫瘍としてマウスの皮膚に移植した。腫瘍を移植した日にもＪａｇｇｅｄ２ＤＮＡワクチン又は空のｐＣＤＮＡ３．１ベクターでマウスを免疫した。腫瘍を移植した日から経時的に腫瘍のサイズを計測した。尚。腫瘍のサイズは腫瘍の縦径×横径とした。
結果を図６に示した。空のベクターで免疫した群では腫瘍は２０日を過ぎたころから急激に増殖し始めるが、Ｊａｇｇｅｄ２ＤＮＡワクチンで免疫した群においては、腫瘍の増殖はほとんど見られなかった。

本発明は、癌の治療や再発防止のための免疫療法において有用であり、医薬品、診断剤等の製造・販売の分野で利用できる。

ＳＣＩＤマウスにおける、Ｊａｇｇｅｄ２の過剰発現による腫瘍増殖の抑制を示す。Ｊａｇｇｅｄ２の過剰発現による腫瘍増殖の抑制に対する、（ａ）コントロールであるＲｂＩｇＧの影響及び（ｂ）抗ａＧＭ１抗体の影響を示す。ＮＫ細胞のＩＮＦγ誘導能に対するＪａｇｇｅｄ２の影響を示す。ＮＫ細胞の細胞傷害活性に対するＪａｇｇｅｄ２の影響を示す。ＤＮＡワクチンとして用いるＪａｇｇｅｄ２発現ベクターの模式図である。ＳＣＩＤマウスにおける、Ｊａｇｇｅｄ２ＤＮＡワクチンの腫瘍増殖抑制効果を示す。

配列番号５：フォワードプライマーである。
配列番号６：リバースプライマーである。

Claims

ＮｏｔｃｈリガンドであるＪａｇｇｅｄ２又はその活性ドメインをコードする遺伝子の発現が増強された抗原提示細胞を有効成分とし、薬効を奏する量の該抗原提示細胞を含有することを特徴とする制癌剤。
該遺伝子が、配列番号１又は３の全長アミノ酸配列あるいはその活性ドメインを含む部分有効配列をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の制癌剤。
該活性ドメインが、配列番号１の第１番〜第１０８３番アミノ酸又は配列番号３の第１番〜第９４３番アミノ酸であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の制癌剤。
該遺伝子が、配列番号２の第１２番〜第３７５７番の配列、配列番号２の第１２番〜第３２６０番の配列、配列番号４の第４０５番〜第４１２１番の配列及び配列番号４の第４０５番〜第３２３３番の配列からなる群より選ばれる塩基配列を含むものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の制癌剤。
配列番号１又は３の全長アミノ酸配列からなるＪａｇｇｅｄ２タンパク質、あるいはその活性ドメインを含むＪａｇｇｅｄ２断片を有効成分とし、薬効を奏する量の有効成分を含有することを特徴とする制癌剤。
該活性ドメインが、配列番号１の第１番〜第１０８３番アミノ酸又は配列番号３の第１番〜第９４３番アミノ酸であることを特徴とする、請求項５に記載の制癌剤。
Ｊａｇｇｅｄ２又はその活性ドメインが、ＮＫ細胞のインターフェロンγ誘導能又は細胞傷害活性を増強するものであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の制癌剤。
Ｊａｇｇｅｄ２又はそれと同様の活性を有するペプチドをコードする塩基配列をベクターに挿入連係することにより構築される発現ベクター。
該塩基配列が、配列番号２の第１２番〜第３７５７番の配列、配列番号２の第１２番〜第３２６０番の配列、配列番号４の第４０５番〜第４１２１番の配列及び配列番号４の第４０５番〜第３２３３番の配列からなる群より選ばれる塩基配列を含むものであることを特徴とする、請求項８に記載の発現ベクター。
請求項８又は９の発現ベクターを導入した細胞である抗原提示細胞。
請求項８又は９の発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチン。