MX2014005330A - Cromatografia de sobrecarga y elucion. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos para purificar un polipéptido a partir de una composición que comprende el polipéptido y al menos un contaminante al sobrecargar un material de cromatografía y eluir el producto.

Description

CROMATOGRAFÍA DE SOBRECARGA Y ELUCIÓN SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de patente de E.U. Serie No. 61/554,898 presentada el 2 de noviembre de 2011, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para purificar un producto a partir de una composición que comprende el producto y al menos un contaminante y formulaciones que comprenden el producto purificado mediante los métodos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La cromatografía de intercambio aniónico (AEX) se utiliza ampliamente en un modo de flujo continuo como una etapa de pulido de plataforma para anticuerpos monoclonales (MAbs) . Ciertos MAbs que se enlazan a la resina de AEX bajo condiciones de flujo continuo estándar pueden plantear retos de adaptación de la planta. Para el desarrollo clínico en etapa temprana en donde el requerimiento de masa es típicamente bajo, estos MAbs no de plataforma se han purificado utilizando resina AEX o en modo mezclado en un modo de enlace y elución. Sin embargo, debido a la baja capacidad dinámica de enlace (DBC) de estas resinas, la implementación en etapa tardía requeriría columnas de un tamaño de aproximadamente 1000 1 o múltiples ciclos en una columna más pequeña limitando así el rendimiento de la planta.

La purificación del MAb se lleva a cabo típicamente utilizando cromatografía de enlace y elución (B/E) o cromatografía de flujo continuo (F/T) . Recientemente, la cromatografía de separación débil (Kelley, BD et al., 2008 Biotechnol Bioeng. 101(3): 553-566; Publicación de la Solicitud de Patente de E.U. No. 2007/0060741) y la cromatografía de sobrecarga (PCT/US2011/037977 ) se han introducido en las resinas AEX y en las resinas de intercambio catiónico (CEX) respectivamente para mejorar la purificación del MAb. El mecanismo y las limitaciones generales de cada una de estos modos de cromatografía se destacan más adelante .

Cromatografía de enlace y elución: Bajo la cromatografía B/E el producto se carga comúnmente para maximizar la DBC para el material de cromatografía y después se identifican las condiciones de lavado y elución de manera que se logre esa máxima pureza del producto en el eluato. Una limitación de la cromatografía B/E es la restricción de la densidad de carga para la DBC real de la resina.

Cromatografía de flujo continuo: Al utilizar la cromatografía F/T se identifican condiciones de carga en donde las impurezas se enlazan fuertemente al material de cromatografía mientras el producto fluye. La cromatografía F/T permite alta densidad de carga para MAbs estándar pero puede no ser posible implementarla para MAbs no de plataforma o las condiciones de solución que permiten la operación F/T para estos MAbs no de plataforma pueden ser tales que no sea posible implementarla en plantas de fabricación existentes.

Cromatografía de separación débil: Este modo de operación mejora el modo F/T identificando condiciones de solución en donde existe un débil enlace del MAb a la resina (de 2 a 20 g/1) . Bajo estas condiciones las impurezas se enlazan más fuertemente que el modo F/T y por tanto se obtiene una purificación mejorada. Sin embargo, las condiciones de carga apuntan a tener un bajo coeficiente de separación del producto (Kp) en el rango de 0.1 a 20.

Cromatografía de sobrecarga: En este modo de cromatografía el producto de interés se carga más allá de la capacidad dinámica de enlace del material de cromatografía para el producto, referido por tanto como sobrecarga. El modo de operación ha demostrado proporcionar la purificación del MAb con medios de intercambio catiónico (CEX) y particularmente con membranas. Sin embargo, la limitación de este procedimiento es que podrían existir bajos rendimientos con la resina debido a que no existe una fase de elución.

La purificación a gran escala, efectiva en costo de un polipéptido a una pureza suficiente para uso como terapéutico humano permanece como un formidable reto.

Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo solicitudes y publicaciones de patente, se incorporan mediante la referencia en su totalidad.

SUMARIO La invención proporciona métodos para purificar un polipéptido a partir de una composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes, comprendiendo dicho método a) cargar la composición en un material de cromatografía en una cantidad que excede la capacidad dinámica de enlace del material de cromatografía para el polipéptido, b) eluir el polipéptido a partir del material de cromatografía bajo condiciones en donde los uno o más contaminantes permanecen enlazados al material de cromatografía, y c) depositar las fracciones que comprenden el polipéptido en el efluente de cromatografía proveniente de las etapas a) y b) .

En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo o una inmunoadhesina . En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; por ejemplo, pero sin limitarse a, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.

En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de enlace al antígeno; por ejemplo, pero sin limitarse a, un fragmento Fab, un fragmento Fab' , un fragmento F(ab')2, un scFv, un di-scFv, un bi-scFv, un (di, tri) -scFv en tándem, un Fv, un sdAb, un anticuerpo tri-funcional, un BiTE, un diabody y un triabody.

En algunas modalidades, el polipéptido es una enzima, una hormona, una proteína de fusión, una proteína que contiene Fe, un inmunoconjugado, una citosina o una interleucina .

En algunas modalidades, el polipéptido se purifica a partir de una composición que comprende uno o más contaminantes, por ejemplo, proteína de ovario de hámster chino (CHOP) , una proteína de célula huésped (HCP) , una proteína A lixiviada, carboxipeptidasa B, ácido nucleico, ADN, variantes de producto, proteína agregada, componente del medio de cultivo celular, gentamicina, fragmentos de polipéptido, endotoxinas, y contaminantes virales.

En algunas modalidades de la invención, el material de cromatografía se selecciona de un material en modo mezclado, un material de intercambio aniónico, un material de interacción hidrófoba, y un material de afinidad.

En algunas modalidades, la composición se carga en el material de cromatografía a aproximadamente las capacidades dinámicas de enlace de los materiales de cromatografía para los uno o más contaminantes.

En algunas modalidades, el coeficiente de separación del material de cromatografía para el polipéptido es mayor que 30 o mayor que 100.

En algunas modalidades, los métodos proporcionan la OEC en donde el amortiguador de elución tiene una conductividad menor que la conductividad del amortiguador de carga. En otras modalidades, el amortiguador de elución tiene una conductividad mayor que la conductividad del amortiguador de carga. En algunas modalidades, el método proporciona una OEC en donde el amortiguador de elución tiene un pH menor que el pH del amortiguador de carga. En otras modalidades, el amortiguador de elución tiene un pH mayor que el pH del amortiguador de carga.

En algunas modalidades, el polipéptido de los métodos se encuentra en un eluyente proveniente de una cromatografía de afinidad, una cromatografía de intercambio catiónico, una cromatografía de intercambio aniónico, una cromatografía en modo mezclado, y una cromatografía de interacción hidrófoba. En algunas modalidades, el polipéptido es un eluyente proveniente de una cromatografía de proteína A.

En algunas modalidades, el polipéptido de los métodos se purifica adicionalmente , por ejemplo, mediante filtración de virus, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía en modo mezclado y/o cromatografía de interacción hidrófoba. En algunas modalidades, el polipéptido se concentra adicionalmente, por ejemplo, mediante ultrafiltración, diafiltración o una combinación de ultrafiltración y diafiltración . En algunas modalidades, el polipéptido de los métodos se combina además con un vehículo farmacéuticamente aceptable .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra los resultados del cribado de alto rendimiento (HTS) en resina Capto Adhere bajo condiciones de enlace por lotes para MAb 3. La Figura 1A muestra los perfiles de valores constantes de Kp para MAB 3. La Figura IB muestra la capacidad real de enlace de MAb 3 en el sobrenadante a un estímulo del producto a 80 g/1 a la resina. La Figura 1C muestra la capacidad real de enlace de la impureza (proteína de célula huésped) en el sobrenadante a un estímulo del producto a 80 g/1 a la resina. Todos los trazos de perfiles se generaron utilizado un modelo de superficie de respuesta derivado de los datos duros.

La Figura 2 muestra un cromatograma para un modo de operación de OEC optimizado. Se utilizó MAb 3 para esta prueba con una densidad de carga de 180 g/1.

La Figura 3 muestra la optimización de carga para un modo de OEC utilizando MAb 3.

La Figura 4 muestra un cromatograma con condiciones de carga objetivo para un modo de operación de OEC. Similares condiciones de carga y elución dan como resultado residuos y por tanto un incremento de 45% en el volumen de depósito. Se utilizó MAb 3 para esta prueba con una densidad de carga de 180 g/1.

La Figura 5 muestra la optimización de la elución para el modo de OEC que utiliza MAb 3.

La Figura 6 muestra el análisis de impurezas e fracciones y el análisis acumulativo de impurezas, La Figura 7 muestra el análisis del avance de CHOP de MAb 3 de la resina Capto Adhere bajo el modo de OEC a una densidad de carga de 1000 g/1.

La Figura 8 muestra el análisis de rendimiento a través de pruebas a escala piloto sobre un amplio rango de densidades de carga de 70 g/1 a 180 g/1.

La Figura 9 muestra una comparación del modo de operación de la cromatografía de separación débil y el modo de operación de la cromatografía de sobrecarga y elución. El producto fue MAb 3 y el material de cromatografía fue una resina Capto Adhere.

La Figura 10 muestra el análisis de CHOP de MAb 3 en una resina QMA bajo el modo de operación de OEC a una densidad de carga de 150 g/1.

La Figura 11 muestra el análisis de CHOP de MAb 4 en una resina Capto Adhere bajo el modo de operación de OEC a una densidad de carga de 150 g/1.

La Figura 12 muestra el análisis de CHOP de MAb 4 en una resina Capto MMC bajo el modo de operación de OEC a una densidad de carga de 150 g/1.

La Figura 13 muestra el análisis del avance de CHOP de MAb 3 en resina Capto Adhere bajo el modo de OEC a una densidad de carga de 200 g/1. Se cargó el depósito de proteína MAb 3 en resina Capto Adhere a 200 g/1 (que se encuentra más allá de su capacidad de enlace al producto de 50 g/1) . El análisis del avance de CHOP mostró que la CHOP no avanzó hasta el procesamiento de MAb de 200 g/1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Definiciones El término "producto" como se describe en la presente es la sustancia que va a purificarse mediante OEC; por ejemplo, un polipéptido.

El término "polipéptido" o "proteína" se utiliza de manera intercambiable en la presente para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que se ha modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlace bisulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente de etiquetado. También se encuentran incluidos en la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los términos "polipéptido" y "proteína" como se utilizan en la presente abarcan específicamente anticuerpos.

Polipéptido (e.g., anticuerpo o inmunoadhesina) "purificado" significa que el polipéptido se ha incrementado en pureza, de tal manera que existe en una forma más pura que aquella en la que existe en su ambiente natural y/o cuando se sintetiza inicialmente y/o se amplifica bajo condiciones de laboratorio. La pureza es un término relativo y no significa necesariamente una pureza absoluta.

El término "etiquetado con epítope" cuando se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido fusionado a un "polipéptido etiqueta" . El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el cual puede producirse un anticuerpo, aunque es suficientemente corto de manera que no interfiere con la actividad del polipéptido al cual se fusiona. El polipéptido etiqueta es también preferentemente suficientemente único de manera que el anticuerpo no reacciona sustancialmente de manera cruzada con otros epltopes . Los polipéptidos etiqueta adecuados tienen generalmente al menos seis residuos de aminoácido y comúnmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácido (preferentemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácido) .

"Activo" o "actividad" para los propósitos en la presente se refieren a una forma (s) de un polipéptido que retienen una actividad biológica y/o inmunológica de polipéptidos nativos o de origen natural, en donde la actividad "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibitoria o estimulatoria) ocasionada por un polipéptido nativo o de origen natural diferente a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por un polipéptido nativo o de origen natural y la actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por un polipéptido nativo o de origen natural .

El término "antagonista" se utiliza en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquee, inhiba o neutralice parcial o totalmente la actividad biológica de un polipéptido nativo. De manera similar, el término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imite la actividad biológica de un polipéptido nativo. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen específicamente anticuerpos agonistas o antagonistas o fragmentos de anticuerpo, variantes de fragmentos o de secuencias de aminoácido de polipéptidos nativos, etc. Los métodos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido pueden comprender poner en contacto un polipéptido con una molécula agonista o antagonista candidato y medir un cambio detectable en una o más de las actividades biológicas asociadas con el polipéptido .

"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para lisar un objetivo en presencia del complemento. La trayectoria de activación del complemento se inicia por el enlace del primer componente del sistema de complementos (Clq) a una molécula (e.g., polipéptido (e.g., un anticuerpo)) complejado con un antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento puede llevarse a cabo un análisis CDC, e.g., como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol Methods 202:163 (1996) .

Un polipéptido "que se enlaza" a un antígeno de interés, e.g., un objetivo de antígeno del polipéptido asociado al tumor, es uno que se enlaza al antígeno con suficiente afinidad de manera que el polipéptido es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a una célula o tejido que expresa el antígeno, y no reacciona significativamente de manera cruzada con otros polipéptidos.

En tales modalidades, el grado de enlace del polipéptido a un polipéptido "no objetivo" será menor que aproximadamente el 10% del enlace del polipéptido a si polipéptido objetivo particular como se determina por el análisis de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA) .

Con respecto al enlace de un polipéptido a una molécula objetivo, el término "enlace específico" o "se enlaza específicamente a" o es "específico para" un polipéptido o un epítope particular en un objetivo polipéptido particular significa el enlace mediblemente diferente de una interacción no específica. El enlace específico puede medirse, por ejemplo, determinando el enlace de una molécula en comparación con el enlace de una molécula de control, que es generalmente una molécula de estructura similar que no tiene actividad de enlace. Por ejemplo, el enlace específico puede determinarse por competencia con una molécula de control similar al objetivo, por ejemplo, un exceso del objetivo no etiquetado. En este caso, el enlace específico se indica si el enlace del objetivo etiquetado a una sonda se inhibe competitivamente por el exceso del objetivo no etiquetado.

El término "anticuerpo" en la presente se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecíficos (e.g., anticuerpos biespecíficos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo siempre que exhiban la actividad biológica deseada. El término "inmunoglobulina" (Ig) se utiliza de manera intercambiable con anticuerpo en la presente.

Los anticuerpos son moléculas de inmunoglobulina de origen natural que tienen estructuras variables, todas basadas en el pliegue de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos IgG tienen dos cadenas "pesadas" y dos cadenas "ligeras" que se encuentran enlazadas por bisulfuro para formar un anticuerpo funcional. Cada cadena pesada y ligera en sí comprende una región "constante" (C) y una "variable" (V) . Las regiones V determinan la especificidad de enlace al antígeno del anticuerpo, mientras las regiones C proporcionan soporte estructural y funcionan en interacciones no específicas al antígeno con efectores inmunes. La especificidad de enlace al antígeno de un anticuerpo o fragmento de enlace al antígeno del anticuerpo es la capacidad del anticuerpo para enlazarse específicamente a un antígeno particular.

La especificidad de enlace al antígeno de un anticuerpo se determina por las características estructurales de la región V. La variabilidad no se distribuye uniformemente a través de la extensión de los 110 aminoácidos de los dominios variables. En su lugar, las regiones V consisten de estiramientos relativamente invariables llamados regiones de estructura (FRs) de 15 a 30 aminoácidos separados por regiones más cortas de variabilidad extrema llamadas "regiones hipervariables" que son cada una de 9 a 12 aminoácidos de longitud. Los dominios variables de las cadenas nativas pesada y ligera comprenden cada uno cuatro FRs, que adoptan en gran medida una configuración de lámina ß, conectadas por tres regiones hipervariables que forman circuitos que se conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en cercana proximidad mediante las FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace al antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (Secuencias de proteínas de interés inmunológico) 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . Los dominios constantes no están implicados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, sino que exhiben varias funciones de efector, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) .

Cada región V comprende típicamente tres regios determinantes de complementariedad ("CDRs", de las cuales cada una contiene un "circuito hipervariable" ) , y cuatro regiones de estructura. Un sitio de enlace al anticuerpo, la unidad estructural mínima requerida para enlazarse con sustancial afinidad a un antígeno particular deseado, incluirá típicamente en consecuencia las tres CDRs y al menos tres, preferentemente cuatro, regiones de estructura intercaladas entre las mismas para mantener y presentar las CDRs en la conformación apropiada. Los clásicos anticuerpos de cuatro cadenas tienen sitios de enlace al antígeno que se definen por los dominios VH y VL en cooperación. Ciertos anticuerpos, tales como los anticuerpos de camello y tiburón, carecen de cadenas ligeras y se basan en los sitios de enlace formados solamente por cadenas pesadas . Pueden prepararse inmunoglobulinas fabricadas de un solo dominio en las cuales los sitios de enlace se forman por cadenas pesadas o cadenas ligeras solas, en ausencia de la cooperación entre VH y VL.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en el enlace y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de todos los dominios variables de los anticuerpos. Ésta se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables en los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada. Las regiones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones de estructura (Frs) . Los dominios variables de las cadenas nativas pesada y ligera comprenden cuatro FRs, que adoptan en gran medida una configuración de lámina ß, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman circuitos que se conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en cercana proximidad mediante las FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace al antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (Secuencias de proteínas de interés inmunológico) 5* Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . Los dominios constantes no están implicados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, sino que exhiben varias funciones de efector, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) .

El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables del enlace al antígeno. La región hipervariable puede comprender residuos de aminoácido provenientes de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (e.g., alrededor de aproximadamente los residuos 24 a 34 (Ll) , 50 a 56 (L2) y 89 a 97 (L3) en el VL y alrededor de aproximadamente los residuos 31 a 35B (Hl) , 50 a 65 (H2) y 95 a 102 (H3) en el VH (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (Secuencias de proteínas de interés inmunológico) 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) y/o aquellos residuos provenientes de un "circuito hipervariable" (e.g., los residuos 26 a 32 (Ll) , 50 a 52 (L2) y 91 a 96 (L3) en el ¾ y 26 a 32 (Hl) , 52A a 55 (H2) y 96 a 101 (H3) en el VH (Chothia y Lesk J. Mol. Biol . 196 : 901-917 (1987) ) .

Los residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se definen en la presente.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente su región de enlace al antígeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab' , F(ab'>2, y F ; diabodies; diabodies Tándem (taDb) , anticuerpos lineales (e.g., Patente de E.U. No. 5,641,870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995) ) ; anticuerpos de un solo brazo, anticuerpos de dominio variable único, minibodies, moléculas de anticuerpo monocatenario; anticuerpos multiespecífieos formados a partir de fragmentos de anticuerpo (e.g., incluyendo, pero sin limitarse a, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, di-scFv, bi-scFv, o (di, tri) -scFv) tándem y embragadores Bi-específicos de célula T (BiTEs) .

La digestión de papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de enlace al antígeno idénticos llamados fragmentos "Fab" , cada uno con un sitio único de enlace al antígeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento de pepsina produce un fragmento F(ab' )2 que tiene dos sitios de enlace al antígeno y aún tiene la capacidad de enlazarse de manera cruzada al antígeno.

"Fv" es el fragmento mínimo del anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento del antígeno y de enlace al antígeno. Esta región consiste de un dimero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación no covalente . Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace al antígeno en la superficie del dimero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de enlace al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y enlazarse al antígeno, aunque a una afinidad más baja que el sitio de enlace completo.

El fragmento Fab contiene también el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de pocos residuos en la terminación carboxi del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas provenientes de la región de articulación del anticuerpo. Fab' -SH es la designación en la presente para Fab' en la cual el (los) residuo (s) de cisteína de los dominios constantes contienen al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de articulación entre los mismos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo .

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) provenientes de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos llamados kappa ( ) y lambda (?) en base a las secuencias de aminoácido de sus dominios constantes .

Dependiendo de la secuencia de aminoácido del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, igD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos), e.g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a diferentes clases de anticuerpos se denominan OÍ, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las subestructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios se encuentran presentes en una cadena de polipéptido única. En algunas modalidades, el polipéptido Fv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para el enlace al antígeno. Para una revisión del scFv ver Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies (La farmacología de anticuerpos monoclonales) , vol. 113, Rosenburg y oore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) .

El término "diabodies" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) . Al utilizar un enlazador que es demasiado corto para permitir la formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a formar pares con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de enlace al antígeno. Los diabodies se describen más completamente, por ejemplo en la EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993).

El término "anticuerpo multiespecífico" se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente un anticuerpo que tiene especificidad de poliepítope. Tales anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) en donde la unidad VHVL tiene una especificidad de poliepítope, anticuerpos que tienen dos o más dominios VL y VH enlazándose cada unidad VHVL a un epítope diferente, anticuerpos que tienen dos o más dominios variables únicos enlazándose cada dominio variable único a un epítope diferente, anticuerpos de longitud total, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diabodies, diabodies específicos, triabodies, anticuerpos tri-funcionales, fragmentos de anticuerpo que se han enlazado de manera covalente o no covalente . "Especificidad de poliepítope" se refiere a la capacidad para enlazarse específicamente a dos o más epítopes diferentes en el mismo o en diferentes objetivos. "Monoespecífico" se refiere a la capacidad de enlazarse solamente a un epítope. De acuerdo con una modalidad, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo IgG que se enlaza a cada epítope con una afinidad de 5 µ? a 0.001 pM, de 3 µ? a 0.001 pM, de 1 µ? a 0.001 pM, de 0.5 µ? a 0.001 ??, o de 0.1 µ? a 0.001 pM.

La expresión "anticuerpos de dominio único" (sdAbs) o "anticuerpos de dominio variable único (SVD)" se refiere generalmente a anticuerpos en los cuales un dominio variable único (VH o VL) puede conferir enlace al antígeno. En otras palabras, no es necesario que el dominio variable único interactúe con otro dominio variable a fin de reconocer el antígeno objetivo. Ejemplos de anticuerpos de dominio único incluyen los derivados de camélidos (llamas y camellos) y de peces cartilaginosos (e.g., tiburones nodriza) y aquellos derivados de métodos recombinantes de anticuerpos humanos y de ratón (Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003 ): 21 : 484 -490 ; WO 2005/035572; WO 03/035694; Febs Lett (1994) 339:285-290; WOOO/29004; WO 02/051870).

El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, i.e., los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se enlazan al mismo epítope, excepto por posibles variantes que puedan surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, estando presentes tales variables generalmente en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpo monoclonal que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra una sola determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que no se encuentran contaminados por otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a utilizarse de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente pueden producirse mediante el método de hibridoma primeramente descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante (ver, e.g., la Patente de E.U. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpo fago utilizando las técnicas descritas por ejemplo, en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).

En la presente los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" ( inmunoglobulina) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o pertenece a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras el resto de la(s) cadena (s) son idénticas u homologas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, asi como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de E.U. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprende secuencias de enlace al antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (e.g., mono del viejo mundo, tal como un mono baboon, Rhesus o cinomolgo) y secuencias de región constante humana (Patente de E.U. No. 5,693,780).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (e.g., murinos) son los anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia miSnima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos provenientes de una región hipervariable del receptor se remplazan por residuos provenientes de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como de ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se remplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los circuitos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana, excepto por la(s) sustitución (es) de FR como se anotó anteriormente. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Para los propósitos en la presente, un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominios variables pesados y ligeros así como una región Fe. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (e.g., dominios constantes de secuencia nativa humana) o una variante de secuencia de aminoácido de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones de efector.

Los "anticuerpos nativos" son comúnmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada mediante un enlace bisulfuro covalente, mientras el número de enlaces bisulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes bisulfuro intracadenas separados . Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se considera que los residuos de aminoácido particulares forman una interconexión entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada.

Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo (como se define en la presente) que no se encuentra conjugado a una molécula heteróloga, tal como un residuo citotóxico o una radioetiqueta .

En algunas modalidades, las "funciones efector" del anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de las funciones efector del anticuerpo incluyen: enlace a Clq y citotoxicidad dependiente del complemento; enlace al receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; sub-regulación de receptores de superficie celular.

"Citotoxicidad mediada por células, dependiente del anticuerpo" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fe (FcRs) (e.g., células T asesinas (NK) , neutrófilos y macrófagos) reconocen al anticuerpo enlazado en una célula objetivo y subsecuentemente ocasionan la lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar la ADCC, células NK, expresan solamente FCYRIII, mientras los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FCYRIII. La expresión FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravtech y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991) . Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede llevarse a cabo un análisis de ADCC in vitro, tal como el descrito en la Patente de E.U. No. 5,500,362 o 5,821,337. Las células efector útiles para tales análisis incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células T asesinas ( K) o, adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse un vivo, e.g., en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., Proc. Nati. Acad. Sci., (EUA) 95:652-656 (1998) .

Las "células efector humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y llevan a cabo funciones de efector. En algunas modalidades, las células expresan al menos FCYRIII y llevan a cabo la función de efector de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células T asesinas (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos, siendo preferidas las células PBMC y NK.

El término "receptor Fe" o "FcR" se utiliza para describir un receptor que se enlaza a la región Fe de un anticuerpo. En algunas modalidades, el FcR es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se enlaza a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo las variantes alélicas y las formas alternativamente separadas de estos receptores . Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición") que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos . El receptor de activación FCYRIIA contiene un motivo de activación en base al inmunorreceptor de tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FCYRIIB contiene un motivo de inhibición en base al inmunorreceptor de tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico. (ver Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcRs se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo aquellos a identificar en el futuro, se encuentran abarcados por el término "FcR" en la presente. El término incluye también el receptor neonatal, FcRn, que es responsable por la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994) ) .

El término "secuencial" como se utiliza en la presente con respecto a la cromatografía se refiere a tener una primera cromatografía seguida por una segunda cromatografía. Pueden incluirse etapas adicionales entre la primera cromatografía y la segunda cromatografía.

El término "continuo" como se utiliza en la presente con respecto a la cromatografía se refiere a tener un primer material de cromatografía y un segundo material de cromatografía ya sea directamente conectado o algún otro mecanismo que permita el flujo continuo entre los dos materiales de cromatografía.

"Contaminantes" se refiere a materiales que son diferentes al producto de polipéptido deseado. el contaminante incluye, sin limitación: materiales de célula huésped, tal como CHOP; proteína A lixiviada, ácido nucleico; una variante, fragmento, agregado o derivado del polipéptido deseado; otro polipéptido; endotoxinas ; contaminante viral; componente del medio de cultivo celular, etc. En algunos ejemplos, el contaminante puede ser una proteína de célula huésped (HCP) de, por ejemplo, pero sin limitarse a, una célula bacteriana tal como una célula de E. coli, una célula de insecto, una célula eucariótica, una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula aviar, una célula de hongo.

La "capacidad dinámica de enlace" de un material de cromatografía es la cantidad del producto, e.g., polipéptido, que enlazará el material bajo condiciones reales de flujo antes de que se presente un avance significativo del producto no enlazado.

"Coeficiente de separación" , Kp, como se utiliza en la presente, se refiere a la concentración molar del producto, e.g., polipéptido, en la fase estacionaria dividida entre la concentración molar del producto en la fase móvil.

"Densidad de carga" se refiere a la cantidad, e.g., en gramos, de la composición colocada en contacto con un volumen del material de cromatografía, e.g., en litros. En algunos ejemplos, la densidad de carga se expresa en g/1.

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) variaciones que se dirigen a esa valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción referente a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X" .

Como se utiliza en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un (a)", "o" y "el (la)" incluyen los referentes al plural a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. Se entiende que los aspectos y variaciones de la invención descritos en la presente incluyen aspectos y variaciones de "que consiste" y/o "que consiste esencialmente de" .

II. Métodos de Purificación Se proporcionan en la presente métodos para purificar un producto, tal como un polipéptido, a partir de una composición que comprende el producto y al menos un contaminante utilizando cromatografía de sobrecarga y elución (OEC) . La OEC proporciona un modo de operación en donde los beneficios proporcionados por los diferentes modos de cromatografía se realizan dentro de un solo modo de cromatografía. La OEC puede implementarse en múltiples resinas mientras proporciona el retiro mejorado de impurezas y significativas ventajas de fabricación, tales como columnas más pequeñas, mejor adaptación de la planta y menor costo. El modo de operación con la OEC puede separarse en tres componentes diferentes . 1. Sobrecarga - La composición se carga en el material de cromatografía de tal manera que el producto, e.g., un polipéptido, se carga en el material de cromatografía en una cantidad que excede la capacidad dinámica de enlace (DBC) del material para el producto. En algunas modalidades, se determinan las condiciones de carga, tales como el pH y la conductividad, en donde las impurezas se enlazan fuertemente al material de cromatografía. En algunas modalidades, las condiciones de la cromatografía se seleccionan de tal manera que, incluso si el producto avanza después del enlace, la mayoría de, si no todas, la impurezas no lo hacen. En algunas modalidades la composición se carga a o cercana a la DBC del material para los uno o más contaminantes. El modo de sobrecarga permite utilizar el material de cromatografía más allá de la DBC típica del material para el producto. 2. Depósito - El depósito del producto, e.g., un polipéptido, en el eluyente comienza al avance del producto. Debido a que las condiciones de carga son tales que las impurezas continúan enlazándose durante la fase de avance, puede obtenerse un depósito del producto limpio en el eluyente durante la fase de carga de la cromatografía. 3. Elución - Al completar la carga de la composición en el material de cromatografía, el producto, e.g., un polipéptido, se eluye a partir del material de cromatografía utilizando condiciones de elución que se identifican de tal manera que el producto enlazado se eluye mientras la mayoría de las impurezas permanecen enlazadas al material de cromatografía.

En algunos aspectos, la OEC incrementa significativamente la utilización del material de cromatografía más allá de la DBC del material para el producto proporcionando así beneficios en comparación con otros métodos de cromatografía. Por ejemplo, una utilización 10 veces mayor del material de cromatografía puede dar como resultado un costo significativamente menor.

A diferencia de la cromatografía tradicional de enlace y elución en donde la carga del material de cromatografía se optimiza para maximizar el enlace al producto, e.g., un polipéptido, a la resina de cromatografía, con las condiciones de carga de la OEC puede optimizarse para maximizar el enlace de los contaminantes al material de cromatografía y sin enlace del producto al material de cromatografía. En algunos aspectos, la composición se carga en un material de cromatografía a una cantidad que excede la capacidad dinámica de enlace del material de cromatografía para el producto. En el proceso de carga del material de cromatografía, parte del producto avanzará en el lavado y parte del producto permanecerá enlazado al material de cromatografía. Al completar la carga, el producto restante enlazado al material de cromatografía puede eluirse a partir del material de cromatografía. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía es una columna de cromatografía. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía es una membrana de cromatografía.

En algunos aspectos de la invención, la composición se carga sobre un material de cromatografía a aproximadamente la capacidad dinámica de enlace del material de cromatografía para uno o más de los contaminantes en la composición. En algunas modalidades, la composición se carga sobre el material de cromatografía a una cantidad que excede la capacidad de enlace del material de cromatografía para el producto. En algunas modalidades, la composición se carga sobre un material de cromatografía a aproximadamente la capacidad dinámica de enlace del material de cromatografía para uno o más de los contaminantes y excediendo la capacidad de enlace del material de cromatografía para el producto. En algunas modalidades, la composición se carga sobre el material de cromatografía a 20 veces la DBC del material de cromatografía para el producto. En algunas modalidades, la composición se carga sobre el material de cromatografía a 100 veces la DBC del material de cromatografía para el producto.

En algunas modalidades, la composición se carga sobre el material de cromatografía a aproximadamente la capacidad dinámica de enlace del material de cromatografía para todos los contaminantes en la composición. En algunas modalidades, la composición se carga sobre el material de cromatografía a aproximadamente la capacidad dinámica de enlace del material de cromatografía para todos los contaminantes y excediendo la capacidad de enlace del material de cromatografía para el producto. En algunas modalidades, la composición se carga sobre el material de cromatografía a menos de la capacidad dinámica de enlace del material de cromatografía para todos los contaminantes y excediendo la capacidad de enlace del material de cromatografía para el producto. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía es una columna de cromatografía. En algunas modalidades la columna de cromatografía es una columna de cromatografía de escala industrial. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía es una membrana de cromatografía.

La capacidad dinámica de enlace del material de cromatografía para un producto y para uno o más contaminantes puede estimarse determinando el coeficiente de separación (Kp) para el producto o los contaminantes como una función del pH y la concentración del contraión para un material de cromatografía particular. Por ejemplo, puede determinarse la capacidad dinámica de enlace del material de cromatografía, e.g., una resina en modo mezclado, para un polipéptido. Las capacidades reales de enlace de un material de cromatografía para un producto o contaminante a una combinación específica de pH y concentración de contraión pueden determinarse estimulando el enlace con un exceso del producto y/o contaminante .

En algunas modalidades, se lleva a cabo una OEC en donde el Kp del producto, e.g., un polipéptido, es mayor que aproximadamente 30. En algunas modalidades, se lleva a cabo una OEC en donde el Kp del producto es mayor que aproximadamente 50. En algunas modalidades, se lleva a cabo una OEC en donde el Kp del producto es mayor que aproximadamente 75. En algunas modalidades, se lleva a cabo una OEC en donde el Kp del producto es mayor que aproximadamente 100.

Las condiciones para la OEC de una composición particular que comprende un producto, tal como un polipéptido, y un contaminante pueden determinarse midiendo el Kp y la capacidad dinámica de enlace de un material de cromatografía particular a pH y concentraciones de contraión diferentes. Puede conducirse un cribado de alto rendimiento para determinar condiciones de OEC en donde el enlace de los contaminantes es alto y en donde el producto puede eluirse sin eluir la mayor parte de, si no todos, los contaminantes. Por ejemplo, la composición puede incubarse con un material de cromatografía en amortiguador a varios pH y concentraciones de contraión bajo un sistema de alto rendimiento; por ejemplo, en pozos de una placa de pozos múltiples. Después de un período de incubación, el sobrenadante se separa del material de cromatografía y se determina la cantidad del producto o contaminante en el sobrenadante. En algunas modalidades, se utilizan bajas concentraciones de la composición para determinar el Kp. En algunas modalidades, se utilizan altas concentraciones de la composición para determinar las capacidades dinámicas de enlace .

Además de proporcionar información acerca del Kp y la capacidad dinámica de enlace de un material de cromatografía para productos y contaminantes particulares, el cribado de alto rendimiento proporciona una guía para las condiciones de carga y elución en términos del pH y las concentraciones de contraión. Por ejemplo, en algunas modalidades, el amortiguador de carga se selecciona mediante el cribado de alto rendimiento para el pH las concentraciones de contraión para maximizar el enlace del contaminante al material de cromatografía pero también para maximizar la cantidad del producto, e.g., el polipéptido, en el eluyente mientras se maximiza la cantidad del contaminante, e.g., proteína de célula huésped, en el eluyente. En algunas modalidades, la composición se carga sobre el material de cromatografía a un pH y a una conductividad determinados por el cribado de alto rendimiento en donde aproximadamente todos los contaminantes en la composición se enlazan al material de cromatografía. En algunas modalidades, el producto se eluye a partir del material de cromatografía a un pH y a una conductividad determinados por el cribado de alto rendimiento en donde aproximadamente todo el producto se eluye a partir del material de cromatografía y aproximadamente todos los contaminantes permanecen enlazados al material de cromatografía.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para identificar las condiciones de operación (e.g., utilizando técnicas de cribado de alto rendimiento) que ocasionan que el material de cromatografía enlace una cantidad máxima de contaminantes sin importar la cantidad del producto enlazada por mi del material de cromatografía. La etapa de cribado se utiliza para identificar las condiciones de elución de tal manera que el producto enlazado se eluya a partir del material de cromatografía y las impurezas permanezcan estrechamente enlazadas al material de cromatografía.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el material de cromatografía es un material en modo mezclado que comprende grupos funcionales con capacidad para una o más de las siguientes funcionalidades: intercambio aniónico, intercambio catiónico, enlace de hidrógeno e interacciones hidrófobas. En algunas modalidades, el material en modo mezclado comprende grupos funcionales con la capacidad para intercambio aniónico e interacciones hidrófobas . El material en modo mezclado puede contener N-bencil-N-metil etanol amina, 4 -mercapto-etil-pridina, hexilamina o fenilpropilamina como ligando o contener polialilamina reticulada. Ejemplos de los materiales en modo mezclado incluyen resina Capto Adhere, resina QMA, resina Capto MMC, resina MEP HyperCel. Resina HEA HyperCel, resina PPA HyperCel, o membrana ChromaSorb o Sartobind STIC. En algunas modalidades, el material en modo mezclado es resina Capto Adhere. En algunas modalidades de lo anterior, el material en modo mezclado es una columna de cromatografía en modo mezclado. En algunas modalidades de lo anterior, el material en modo mezclado es una membrana en modo mezclado.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio de ion; por ejemplo, un material de cromatografía de intercambio aniónico o un material de cromatografía de intercambio catiónico. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el material de cromatografía es un material de intercambio aniónico. En algunas modalidades, el material de cromatografía de intercambio aniónico es una fase sólida que se carga de manera positiva y tiene aniones libres para el intercambio con aniones en una solución acuosa pasados sobre o a través de la fase sólida. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el material de intercambio aniónico puede ser una membrana, un monolito o una resina. En una modalidad, el material de intercambio aniónico puede ser una resina. En algunas modalidades, el material de intercambio aniónico puede comprender una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria o un grupo funcional de ion de amonio cuaternario, un grupo funcional poliamina o un grupo funcional dietilaminoetilo. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía de intercambio aniónico es una columna de cromatografía de intercambio aniónico. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía de intercambio aniónico es una membrana de cromatografía de intercambio aniónico.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el material de cromatografía es un material de intercambio catiónico. En algunas modalidades el material de intercambio catiónico es una fase sólida que se carga de manera negativa y tiene cationes libres para el intercambio con cationes en una solución acuosa pasados sobre o a través de la fase sólida. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el material de intercambio catiónico puede ser una membrana, un monolito o una resina. En algunas modalidades, el material de intercambio catiónico puede ser una resina. El material de intercambio catiónico puede comprender un grupo funcional de ácido carboxílico o un grupo funcional de ácido sulfónico tal como, pero sin limitarse a, sulfonato, ácido carboxílico, carboximetil sulfónico, sulfoisobutilo, sulfoetilo, carboxilo, sulfopropilo, sulfonilo, sulfoxietilo u ortofosfato. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía de intercambio catiónico es una columna de cromatografía de intercambio catiónico. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía de intercambio catiónico es una membrana de cromatografía de intercambio catiónico. En algunas modalidades de la invención el material de cromatografía no es un material de cromatografía de intercambio catiónico.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el material de intercambio de ion puede utilizar un material de cromatografía convencional o un material de cromatografía convectivo. Los materiales de cromatografía convencionales incluyen, por ejemplo, materiales perfusivos (e.g., resina de poli (estireno-divinilbenceno) ) y materiales difusores (e.g., resina de agarosa reticulada) . En algunas modalidades, la resina de poli (estireno-divinilbenceno) puede ser resina Poros. En algunas modalidades la resina de agarosa reticulada puede ser resina de sulfopropil-sefarosa Fast Flow ("SPSFF") . El material de cromatografía convectivo puede ser una membrana (e.g., poliétersulfona) o un material monolítico (e.g., polímero reticulado) . La membrana de poliétersulfona puede ser Mustang. El material monolítico de polímero reticulado puede ser poli (glicidil metacrilato-co-etileno dimetacrilato) .

Ejemplos de materiales de intercambio aniónico son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, Poros HQ 50, Poros PI 50, Poros D, Mustang Q, Q sefarosa FF, y DEAE sefarosa.

Ejemplos de materiales de intercambio catiónico son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, Mustang S, Sartobind S, monolito de S03, S Ceramic HyperD, Poros XS, Poros HS50, Poros HS20, SPSFF, SP-sefarosa XL (SPXL) , CM sefarosa Fast Flow, Capto S, Fractogel Se HiCap, Fractogel S03, o Fractogel COO. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el material de intercambio catiónico es Poros HS50. En algunas modalidades, la resina Poros HS puede ser partículas Poros HS de 50 µ??? o Poros HS de 20 µp?.

En algunos aspectos de la invención, el material de cromatografía es un material de cromatografía de interacción hidrófoba. La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) es una técnica de cromatografía líquida que separa las biomoléculas de acuerdo con su hidrofobicidad. Ejemplos de materiales de cromatografía HIC incluyen, pero no se limitan a, Toyopearl hexilo 650, Toyopear butilo 650, Toyopearl fenilo 650, Toyopearl éter 650, Source, Resource, sefarosa Hi-Trap, Octil sefarosa, fenil sefarosa. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía HIC es una columna de cromatografía HIC. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía HIC es una membrana de cromatografía HIC.

En algunos aspectos de la invención, el material de cromatografía es un material de cromatografía de hidroxilapatita (HAP) . Ejemplos del material de cromatografía de hidroxilapatita incluyen, pero no se limitan a, HA Ultrogel, e hidroxilapatita CHT. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía HAP es una columna de cromatografía HAP. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía HAP es una membrana de cromatografía HAP.

En algunos aspectos de la invención, el material de cromatografía es material de cromatografía de afinidad. Ejemplos de materiales de cromatografía de afinidad incluyen, pero no se limitan a, materiales de cromatografía derivatizados con una proteína A o proteína G. Ejemplos del material de cromatografía de afinidad incluyen, pero no se limitan a, Prosep-VA, Prosep-VA Ultra Plus, sefarosa de proteína A Fast Flow, proteína A Tyopearl, MAbSelect, MAbSelect SuRe y MAbSelect SuRe LX. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía de afinidad es una columna de cromatografía de afinidad. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía de afinidad es una membrana de cromatografía de afinidad.

La carga de la composición en el material de cromatografía puede optimizarse para la separación del producto de los contaminantes mediante OEC. En algunas modalidades, el producto es un polipéptido. En algunas modalidades, la carga de la composición en el material de cromatografía se optimiza para el enlace de los contaminantes al material de cromatografía. Por ejemplo, la composición puede cargarse sobre el material de cromatografía, e.g., una columna de cromatografía, en un amortiguador de carga a numerosos pH diferentes mientras la conductividad del amortiguador de carga es constante. Alternativamente, la composición puede cargarse sobre el material de cromatografía en un amortiguador de carga a numerosas conductividades diferentes mientras el pH del amortiguador de carga es constante. Al completar la carga de la composición sobre el material de cromatografía y la elución del producto a partir del material de cromatografía en una fracción de depósito, la cantidad del contaminante en la fracción de depósito proporciona información referente a la separación del producto a partir de los contaminantes para un pH o conductividad dados . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la composición se carga sobre el material de cromatografía a una densidad de carga del polipéptido mayor que aproximadamente cualquiera de 30 g/1, 40 g/1, 50 g/1, 60 g/1, 70 g/1, 80 g/1, 90 g/1, 100 g/1, 110 g/1, 120 g/1, 130 g/1, 140 g/1, 150 g/1, 160 g/1, 170 g/1, 180 g/1, 190 g/1, 200 g/1, 300 g/1, 400 g/1, 500 g/1, 550 g/1, 600 g/1, 650 g/1, 700 g/1, 800 g/1, 900 g/1, 1000 g/1, 2000 g/1 o 5000 g/1 del material de cromatografía. En algunas modalidades, la composición se carga sobre el material de cromatografía a una densidad de carga del polipéptido de aproximadamente cualquiera de 30 g/1, 40 g/1, 50 g/1, 60 g/1, 70 g/1, 80 g/1, 90 g/1, 100 g/1, 110 g/1, 120 g/1, 130 g/1, 140 g/1, 150 g/1, 160 g/1, 170 g/1, 180 g/1, 190 g/1, 200 g/1, 300 g/1, 400 g/1, 500 g/1, 550 g/1, 600 g/1, 650 g/1, 700 g/1, 800 g/1, 900 g/1, 1000 g/1 o 2000 g/1 del material de cromatografía. La composición puede cargarse sobre el material de cromatografía a una densidad de carga del polipéptido de entre aproximadamente cualquiera de 30 g/1 y 2000 g/1, 30 g/1 y 1000 g/1, 30 g/1 y 200 g/1, 30 g/1 y 180 g/1, 50 g/1 y 2000 g/1, 50 g/1 y 1000 g/1, 50 g/1 y 200 g/1, 50 g/1 y 180 g/1, 150 g/1 y 2000 g/1, 150 g/1 y 1500 g/1, 150 g/1 y 1000 g/1, 200 g/1 y 1000 g/1, 200 g/1 y 1500 g/1, 300 g/1 y 1500 g/1, 400 g/1 y 1000 g/1, o 500 g/1 y 1000 g/1 del material de cromatografía.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la composición se carga sobre un material de cromatografía en modo mezclado a una densidad de carga del polipéptido mayor que aproximadamente cualquiera de 30 g/1, 40 g/1, 50 g/1, 60 g/1, 70 g/1, 80 g/1, 90 g/1, 100 g/1, 110 g/1, 120 g/1, 130 g/1, 140 g/1, 150 g/1, 160 g/1, 170 g/1, 180 g/1, 190 g/1, 200 g/1, 300 g/1, 400 g/1, 500 g/1, 550 g/1, 600 g/1, 650 g/1, 700 g/1, 800 g/1, 900 g/1, 1000 g/1, 2000 g/1 o 5000 g/1 del material de cromatografía en modo mezclado. En algunas modalidades, la composición se carga sobre un material de cromatografía en modo mezclado a una densidad de carga del polipéptido de aproximadamente cualquiera de 30 g/1, 40 g/1, 50 g/1, 60 g/1, 70 g/1, 80 g/1, 90 g/1, 100 g/1, 110 g/1, 120 g/1, 130 g/1, 140 g/1, 150 g/1, 160 g/1, 170 g/1, 180 g/1, 190 g/1, 200 g/1, 300 g/1, 400 g/1, 500 g/1, 550 g/1, 600 g/1, 650 g/1, 700 g/1, 800 g/1, 900 g/1, 1000 g/1 o 2000 g/1 del material de cromatografía en modo mezclado. La composición puede cargarse sobre un material de cromatografía en modo mezclado a una densidad de carga del polipéptido de entre aproximadamente cualquiera de 30 g/1 y 2000 g/1, 30 g/1 y 1000 g/1, 30 g/1 y 200 g/1, 30 g/1 y 180 g/1, 50 g/1 y 2000 g/1, 50 g/1 y 1000 g/1, 50 g/1 y 200 g/1, 50 g/1 y 180 g/1, 150 g/1 y 2000 g/1, 150 g/1 y 1500 g/1, 150 g/1 y 1000 g/1, 200 g/1 y 1000 g/1, 200 g/1 y 1500 g/1, 300 g/1 y 1500 g/1, 400 g/1 y 1000 g/1, o 500 g/1 y 1000 g/1 del material de cromatografía en modo mezclado. En algunas modalidades, el polipéptido se carga sobre el material de cromatografía a una densidad de 70 g/1 a 180 g/1. En algunas modalidades de la invención, la cromatografía en modo mezclado es una resina Capto Adhere. En algunas modalidades, el polipéptido se carga sobre un material de cromatografía Capto Adhere a una densidad de 70 g/1 a 180 g/1. En modalidades adicionales de las modalidades anteriores, el polipéptido es un anticuerpo de un fragmento del mismo.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la composición se carga sobre un material de cromatografía de intercambio catiónico a una densidad de carga del polipéptido mayor que aproximadamente cualquiera de 30 g/1, 40 g/1, 50 g/1, 60 g/1, 70 g/1, 80 g/1, 90 g/1, 100 g/1, 110 g/1, 120 g/1, 130 g/1, 140 g/1, 150 g/1, 160 g/1, 170 g/1, 180 g/1, 190 g/1, 200 g/1, 300 g/1, 400 g/1, 500 g/1, 550 g/1, 600 g/1, 650 g/1, 700 g/1, 800 g/1, 900 g/1, 1000 g/1, 2000 g/1 o 5000 g/1 del material de cromatografía de intercambio catiónico. En algunas modalidades, la composición se carga sobre un material de cromatografía de intercambio catiónico a una densidad de carga del polipéptido de aproximadamente cualquiera de 30 g/1, 40 g/1, 50 g/1, 60 g/1, 70 g/1, 80 g/1, 90 g/1, 100 g/1, 110 g/1, 120 g/1, 130 g/1, 140 g/1, 150 g/1, 160 g/1, 170 g/1, 180 g/1, 190 g/1, 200 g/1, 300 g/1, 400 g/1, 500 g/1, 550 g/1, 600 g/1, 650 g/1, 700 g/1, 800 g/1, 900 g/1, 1000 g/1 o 2000 g/1 del material de cromatografía de intercambio catiónico. La composición puede cargarse sobre el material de cromatografía de intercambio catiónico a una densidad de carga del polipéptido de entre aproximadamente cualquiera de 30 g/1 y 2000 g/1, 30 g/1 y 1000 g/1, 30 g/1 y 200 g/1, 30 g/1 y 180 g/1, 50 g/1 y 2000 g/1, 50 g/1 y 1000 g/1, 50 g/1 y 200 g/1, 50 g/1 y 180 g/1, 150 g/1 y 2000 g/1, 150 g/1 y 1500 g/1, 150 g/1 y 1000 g/1, 200 g/1 y 1000 g/1, 200 g/1 y 1500 g/1, 300 g/1 y 1500 g/1, 400 g/1 y 1000 g/1, o 500 g/1 y 1000 g/1 del material de cromatografía de intercambio catiónico.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la composición se carga sobre un material de cromatografía de intercambio catiónico a una densidad de carga del polipéptido mayor que aproximadamente cualquiera de 30 g/1, 40 g/1, 50 g/1, 60 g/1, 70 g/1, 80 g/1, 90 g/1, 100 g/1, 110 g/1, 120 g/1, 130 g/1, 140 g/1, 150 g/1, 160 g/1, 170 g/1, 180 g/1, 190 g/1, 200 g/1, 300 g/1, 400 g/1, 500 g/1, 550 g/1, 600 g/1, 650 g/1, 700 g/1, 800 g/1, 900 g/1, 1000 g/1, 2000 g/1 o 5000 g/1 del material de cromatografía de intercambio catiónico. En algunas modalidades, la composición se carga sobre un material de cromatografía de intercambio catiónico a una densidad de carga de aproximadamente cualquiera de 30 g/1, 40 g/1, 50 g/1, 60 g/1, 70 g/1, 80 g/1, 90 g/1, 100 g/1, 110 g/1, 120 g/1, 130 g/1, 140 g/1, 150 g/1, 160 g/1, 170 g/1, 180 g/1, 190 g/1, 200 g/1, 300 g/1, 400 g/1, 500 g/1, 550 g/1, 600 g/1, 650 g/1, 700 g/1, 800 g/1, 900 g/1, 1000 g/1 o 2000 g/1 del material de cromatografía de intercambio catiónico. La composición puede cargarse sobre el material de cromatografía de intercambio catiónico a una densidad de carga del polipéptido de entre aproximadamente cualquiera de 30 g/1 y 2000 g/1, 30 g/1 y 1000 g/1, 30 g/1 y 200 g/1, 30 g/1 y 180 g/1, 50 g/1 y 2000 g/1, 50 g/1 y 1000 g/1, 50 g/1 y 200 g/1, 50 g/1 y 180 g/1, 150 g/1 y 2000 g/1, 150 g/1 y 1500 g/1, 150 g/1 y 1000 g/1, 200 g/1 y 1000 g/1, 200 g/1 y 1500 g/1, 300 g/1 y 1500 g/1, 400 g/1 y 1000 g/1, o 500 g/1 y 1000 g/1 del material de cromatografía de intercambio catiónico.

Los métodos descritos anteriormente pueden comprender además la etapa de cargar sobre un material de cromatografía de afinidad de proteína A. En algunas modalidades el producto de polipéptido es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se purifica mediante cromatografía de afinidad de proteína A antes de la OEC. La etapa de carga sobre un material de cromatografía de afinidad de proteína A se lleva a cabo generalmente, pero no necesariamente, antes de la(s) otra(s) etapa (s) de cromatografía. En algunas modalidades, la etapa de carga sobre un material de cromatografía de afinidad de proteína A puede combinarse con las etapas secuenciales de cromatografía de intercambio sobrecargado y elución. En algunas modalidades, las etapas secuenciales son continuas. En algunas modalidades, la purificación continua utiliza la misma tasa de flujo, conductividad y/o pH.

La elución de un producto tal como un polipéptido a partir de un material de cromatografía bajo el modo OEC puede optimizarse para producir el producto con mínimos contaminantes y a un volumen de depósito mínimo. Por ejemplo, la composición puede cargarse sobre el material de cromatografía, e.g., una columna de cromatografía, en un amortiguador de carga. Al completar la carga, el producto se eluye con amortiguadores a numerosos pH diferentes mientras la conductividad del amortiguador de elución es constante. Alternativamente, el producto puede eluirse sobre el material de cromatografía en un amortiguador de elución a numerosas conductividades diferentes mientras el pH del amortiguador de elución es constante . Al completar la elución del producto a partir del material de cromatografía, la cantidad del contaminante en la fracción de depósito proporciona información referente a la separación del producto a partir de los contaminantes para un pH o conductividad dados . La elución del producto en un alto número de fracciones (e.g., volúmenes en ocho columnas) indica el "residuo" del perfil de elución. En algunas modalidades de la invención, el residuo de la elución se minimiza.

Pueden emplearse diversos amortiguadores dependiendo, por ejemplo, del pH deseado del amortiguador, de la conductividad deseada del amortiguador, de las características de la proteína de interés, y del método de purificación. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, los métodos comprenden el uso de un amortiguador. El amortiguador puede ser un amortiguador de carga, un amortiguador de equilibrio, o un amortiguador de lavado. En algunas modalidades, uno o más del amortiguador de carga, el amortiguador de equilibrio y/o el amortiguador de lavado son el mismo. En algunas modalidades, el amortiguador de carga, el amortiguador de equilibrio y/o el amortiguador de lavado son diferentes. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el amortiguador comprende una sal. El amortiguador de carga puede comprender cloruro de sodio, acetato de sodio o una mezcla de los mismos. En algunas modalidades, el amortiguador de carga es un amortiguador de cloruro de sodio. En algunas modalidades, el amortiguador de carga es un amortiguador de acetato de sodio.

Carga, como se utiliza en la presente, es la composición cargada sobre un material de cromatografía. El amortiguador de carga es el amortiguador utilizado para cargar la composición que comprende el producto de interés sobre el material de cromatografía. El material de cromatografía puede equilibrarse con un amortiguador de equilibrio antes de cargar la composición que va a purificarse. En algunos ejemplos, el amortiguador de lavado se utiliza después de cargar la composición sobre el material de cromatografía y antes de la elución del polipéptido de interés a partir de la fase sólida. Sin embargo, parte del producto de interés, e.g., un polipéptido, puede retirarse del material de cromatografía mediante el amortiguador de lavado (e.g., similar a un modo de flujo continuo) .

Elución, como se utiliza en la presente, es el retiro del producto, e.g., un polipéptido, del material de cromatografía. El amortiguador de elución es el amortiguador utilizado para eluir el polipéptido u otro producto de interés a partir de un material de cromatografía. En muchos casos, el amortiguador de elución tiene una característica física diferente a la del amortiguador de carga. Por ejemplo, el amortiguador de elución puede tener una conductividad diferente a la del amortiguador de carga o un pH diferente al del amortiguador de carga. En algunas modalidades, el amortiguador de elución tiene una conductividad más baja que el amortiguador de carga. En algunas modalidades, el amortiguador de elución tiene una conductividad más alta que el amortiguador de carga. En algunas modalidades, el amortiguador de elución tiene un pH más bajo que el del amortiguador de carga. En algunas modalidades, el amortiguador de elución tiene un pH más alto que el del amortiguador de carga. En algunas modalidades, el amortiguador de elución tiene una conductividad diferente y un pH difer4ente a los del amortiguador de carga. El amortiguador de elución puede tener cualquier combinación de conductividad más alta o más baja y pH más alto o más bajo.

Conductividad se refiere a la capacidad de una solución acuosa para conducir una corriente eléctrica entre dos electrodos. En solución, la corriente fluye mediante transporte de ion. En consecuencia, con una cantidad en incremento de iones presente en la solución acuosa, la solución tendrá una conductividad más alta. La unidad de medición básica para la conductividad es la Siemen (o mho) , mho (mS/cm), y puede medirse utilizando un medidor de conductividad, tal como los varios modelos de los medidores de conductividad Orion. Debido a que la conductividad electrolítica es la capacidad de los iones en una solución para transportar la corriente eléctrica, la conductividad de una solución puede alterarse cambiando la concentración de los iones en la misma. Por ejemplo, la concentración de un agente amortiguador y/o la concentración de una sal (e.g., cloruro de sodio, acetato de sodio, o cloruro de potasio) en la solución pueden alterarse a fin de lograr la conductividad deseada. Preferentemente, la concentración de sal de los diversos amortiguadores se modifica para lograr la conductividad deseada.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el amortiguador de carga tiene una conductividad mayor que aproximadamente cualquiera de 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, o 10 mS/cm. La conductividad puede encontrarse entre aproximadamente cualquiera de 4 mS/cm y 17 mS/cm, 4 mS/cm y 10 mS/cm, 4 mS/cm y 7 mS/cm, 5 mS/cm y 17 mS/cm, 5 mS/cm y 10 mS/cm, o 5 mS/cm y 7 mS/cm. En algunas modalidades, la conductividad es de aproximadamente cualquiera de 4 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, o 10 mS/cm. En un aspecto, la conductividad es la conductividad del amortiguador de carga, el amortiguador de equilibrio y/o el amortiguador de lavado. En algunas modalidades, la conductividad de uno o más del amortiguador de carga, el amortiguador de equilibrio y/o el amortiguador de lavado es la misma. En algunas modalidades, la conductividad del amortiguador de carga es diferente a la conductividad del amortiguador de lavado y/o del amortiguador de equilibrio. En algunas modalidades, la composición se carga en un material de cromatografía en modo mezclado en un amortiguador con una conductividad de aproximadamente 5.5 mS/cm. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo o un fragmento del mismo.

En algunas modalidades, el amortiguador de elución tiene una conductividad menor que la conductividad del amortiguador de carga. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el amortiguador de elución tiene una conductividad de menos de aproximadamente cualquiera de 0.0 mS/cm, 0.5 mS/cm, 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, o 7.0 mS/cm. La conductividad puede encontrarse entre aproximadamente cualquiera de 0 mS/cm y 7 mS/cm, 1 mS/cm y 7 mS/cm, 2 mS/cm y 7 mS/cm, 3 mS/cm y 7 mS/cm, o 4 mS/cm y 7 mS/cm, 0 mS/cm y 5.0 mS/cm, 1 mS/cm y 5 mS/cm, 2 mS/cm y 5 mS/cm, 3 mS/cm y 5 mS/cm, o 4 mS/cm y 5 mS/cm. En algunas modalidades, la conductividad del amortiguador de elución es de aproximadamente cualquiera de 0.0 mS/cm, 0.5 mS/cm, 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, o 7.0 mS/cm. En algunas modalidades, los amortiguadores de elución descritos anteriormente se utilizan en la OEC en modo mezclado, la OEC de intercambio aniónico, la OEC de intercambio catiónico, la OEC de afinidad o LA OEC HIC.

En algunas modalidades, el amortiguador de elución tiene una conductividad mayor que la conductividad del amortiguador de carga. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el amortiguador de elución tiene una conductividad mayor que aproximadamente cualquiera de 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17.0 mS/cm, 18.0 mS/cm, 19.0 mS/cm, 20.0 mS/cm, 21.0 mS/cm, 22.0 mS/cm, 23.0 mS/cm, 24.0 mS/cm, o 25.0 mS/cm. La conductividad puede encontrarse entre aproximadamente cualquiera de 5.5 mS/cm y 17 mS/cm, 6.0 mS/cm y 17 mS/cm, 7 mS/cm y 17 mS/cm, 8 mS/cm y 17 mS/cm, 9 mS/cm y 17 mS/cm, o 10 mS/cm y 17 mS/cm. En algunas modalidades, la conductividad del amortiguador de elución es de aproximadamente cualquiera de 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, o 17.0 mS/cm. En algunas modalidades, los amortiguadores de elución descritos anteriormente se utilizan en la OEC en modo mezclado, la OEC de intercambio aniónico, la OEC de intercambio catiónico, la OEC de afinidad, o LA OEC HIC. En algunas modalidades, el polipéptido se eluye a partir de una cromatografía en modo mezclado a una conductividad de aproximadamente 4 a aproximadamente 1 mS/cm. En algunas modalidades, el polipéptido se eluye a partir de una cromatografía de Capto Adhere a una conductividad de aproximadamente 4 a aproximadamente 1 mS/cm. En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento del mismo se eluye a partir de una cromatografía de Capto Adhere a una conductividad de aproximadamente 4 mS/cm a aproximadamente 1 mS/cm.

En algunos aspectos de cualquiera de las modalidades anteriores, la conductividad del amortiguador de elución cambió del amortiguador de carga y/o de lavado por el gradiente de etapa o por el gradiente lineal.

En algunas modalidades de la invención, la composición que comprende un polipéptido se carga sobre el material de cromatografía en un amortiguador con una conductividad de aproximadamente 5.5 mS/cm y el polipéptido se eluye a partir del material de cromatografía en un amortiguador de elución con una conductividad de aproximadamente 4 mS/cm. En algunas modalidades, el amortiguador de carga tiene una conductividad de aproximadamente 5.5 mS/cm y el amortiguador de elución tiene una conductividad de aproximadamente 3 mS/cm. En algunas modalidades, el amortiguador de carga tiene una conductividad de aproximadamente 5.5 mS/cm y el amortiguador de elución tiene una conductividad de aproximadamente 2 mS/cm. En algunas modalidades, el amortiguador de carga tiene una conductividad de aproximadamente 5.5 mS/cm y el amortiguador de elución tiene una conductividad de aproximadamente 1 mS/cm. En modalidades adicionales de las modalidades anteriores, el material de cromatografía es una resina Capto Adhere. En modalidades adicionales de las modalidades anteriores, el polipéptido es un anticuerpo del fragmento del mismo .

En algunos aspectos de cualquiera de las modalidades anteriores, la conductividad del amortiguador de elución cambió del amortiguador de carga y/o de lavado por el gradiente de etapa o por el gradiente lineal. En algunas modalidades, la composición que comprende un polipéptido se carga sobre una cromatografía de Capto Adhere a aproximadamente 5.5 mS/cm y el polipéptido de interés se eluye a partir de una cromatografía de Capto Adhere por un gradiente de conductividad lineal de aproximadamente 5.5 mS/cm a aproximadamente 1 mS/cm sobre aproximadamente 5 volúmenes de columna (CV) . En algunas modalidades, la composición que comprende un polipéptido se carga sobre una cromatografía de Capto Adhere a aproximadamente 5.5 mS/cm y el polipéptido de interés se eluye a partir de una cromatografía de Capto Adhere por un gradiente de conductividad lineal de aproximadamente 5.5 mS/cm a aproximadamente lmS/cm sobre 10.0 CV. En algunas modalidades, la composición que comprende un polipéptido se carga sobre una cromatografía de Capto Adhere a aproximadamente 10 mS/cm y el polipéptido de interés se eluye a partir de una cromatografía de Capto Adhere por un gradiente de conductividad lineal de aproximadamente 10.0 mS/cm a aproximadamente lmS/cm sobre aproximadamente 5 CV. En algunas modalidades, la composición que comprende un polipéptido se carga sobre una cromatografía de Capto Adhere a aproximadamente 10 mS/cm y el polipéptido de interés se eluye a partir de una cromatografía de Capto Adhere por un gradiente de conductividad lineal de aproximadamente 10.0 mS/cm a 1 mS/cm sobre aproximadamente 10 CV. En algunas modalidades, la composición que comprende un polipéptido se carga sobre una cromatografía de Capto Adhere a aproximadamente 10 mS/cm y el polipéptido de interés se eluye a partir de una cromatografía de Capto Adhere por un gradiente de conductividad lineal de aproximadamente 10.0 mS/cm a aproximadamente 1 mS/cm sobre aproximadamente 15 CV.

En algunos aspectos de cualquiera de las modalidades anteriores, la conductividad del amortiguador de elución cambió del amortiguador de carga y/o de lavado por el gradiente de etapa o por el gradiente lineal. En algunas modalidades, la composición que comprende un polipéptido se carga sobre un material de cromatografía a aproximadamente 5.5 mS/cm y el polipéptido de interés se eluye a partir de un material de cromatografía por un gradiente de conductividad lineal entre 5.5 mS/cm y lmS/cm sobre una columna de 5 volúmenes, de 5.5 mS/cm a 1 mS/cm sobre 10.0 volúmenes de columna. En algunas modalidades, la composición que comprende un polipéptido se carga sobre un material de cromatografía a aproximadamente 10 mS/cm y el polipéptido de interés se eluye a partir de un material de cromatografía por un gradiente de conductividad lineal entre 10.0 mS/cm y 1 mS/cm sobre una columna de 5 volúmenes, de 10.0 mS/cm a 1 mS/cm sobre 10 volúmenes de columna, de 10.0 mS/cm a 1 mS/cm sobre 15 volúmenes de columna.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el amortiguador de carga tiene un pH de menos de aproximadamente cualquiera de 10, 9, 8, 7, 6, o 5. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el amortiguador de carga tiene un pH de más de aproximadamente cualquiera de 4, 5, 6, 7, 8, o 9. El amortiguador de carga puede tener un pH de entre aproximadamente cualquiera de 4 y 9, 4 y 8, 4 y 7, 5 y 9, 5 y 8, 5 y 7, 5 y 6. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de carga es aproximadamente cualquiera de 4 , 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, u 8. El pH puede ser el pH del amortiguador de carga, el amortiguador de equilibrio, o el amortiguador de lavado. En algunas modalidades, el pH de uno o más del amortiguador de carga, el amortiguador de equilibrio, y/o el amortiguador de lavado es el mismo. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de carga es diferente al pH del amortiguador de equilibrio y/o el amortiguador de lavado.

En algunas modalidades, el amortiguador de elución tiene un pH menor que el pH del amortiguador de carga. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el amortiguador de elución tiene un pH de menos de aproximadamente cualquiera de 8 , 7 , 6 , 5 , 4 , 3 o 2. El pH del amortiguador de elución puede encontrarse entre aproximadamente cualquiera de 4 y 9, 4 y 8, 4 y 7, 4 y 6, 4 y 5, 5 y 9, 5 y 8, 5 y 7, 5 y 6, 6 y 9, 6 y 8, 6 y 7. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución es aproximadamente cualquiera de 4.0, 4.5, 5.0. 5.5, 6.0, 6.5, 7/0, 7.5, 8.0, 8.5 o 9.0.

En algunas modalidades, el amortiguador de elución tiene un pH mayor que el pH del amortiguador de carga. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el amortiguador de elución tiene un pH de más de aproximadamente cualquiera de 5, 6, 7, 8, o 9. El pH del amortiguador de elución puede encontrarse entre aproximadamente cualquiera de 4 y 9, 5 y 9, 6 y 9, 7 y 9, 8 y 9, 4 y 8, 5 y 8, 6 y 8, 7 y 8, 4 y 7, 5 y 7, y 6 y 7. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución es aproximadamente cualquiera de 4.0, 4.5, 5.0. 5.5, 6.0, 6.5, 7/0, 7.5, 8.0, 8.5 O 9.0.

En algunos aspectos de cualquiera de las modalidades anteriores, el pH del amortiguador de elución cambió del amortiguador de carga y/o de lavado por el gradiente de etapa o por el gradiente lineal.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la tasa de flujo es menor que aproximadamente cualquiera de 50 CV/hora, 40 CV/hora, o 30 CV/hora. La tasa de flujo puede encontrarse entre aproximadamente cualquiera de 5 CV/hora y 50 CV/hora, 10 CV/hora y 40 CV/hora, o 18 CV/hora y 36 CV/hora. En algunas modalidades, la tasa de flujo es aproximadamente cualquiera de 9 CV/hora, 18 CV/hora, 25 CV/hora, 30 CV/hora, 36 CV/hora, o 40 CV/hora. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la tasa de flujo es menor que aproximadamente cualquiera de 100 cm/hora, 75 cm/hora, o 50 cm/hora. La tasa de flujo puede encontrarse entre aproximadamente cualquiera de 25 cm/hora y 150 cm/hora, 25 cm/hora y 100 cm/hora, 50 cm/hora y 100 cm/hora, o 65 cm/hora y 85 cm/hora.

La altura de lecho es la altura del material de cromatografía utilizado. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la altura de lecho es mayor que aproximadamente cualquiera de 3 cm, 10 cm, o 15 cm. La altura de lecho puede encontrarse entre aproximadamente cualquiera de 3 cm y 35 cm, 5 cm y 15 cm, 3 cm y 10 cm, o 5 cm y 8 cm. En algunas modalidades, la altura de lecho es aproximadamente cualquiera de 3 cm, 5 cm, 10 cm, o 15 cm. En algunas modalidades, la altura de lecho se determina en base a la cantidad del polipéptido o los contaminantes en la carga.

En algunas modalidades, la cromatografía es en una columna del recipiente con un volumen mayor que aproximadamente 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 75 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1 L, 2 L, 3 L, 4 L, 5 L, 6 L, 7 L, 8 L, 9 L, 10 L, 25 L, 50 L, 100 L, 200 L, 300 L, 400 L, 500 L, 600 L, 700 L, 800 L, 900 L o 100 L.

En algunas modalidades de la invención, las fracciones se recolectan a partir de la cromatografía. En algunas modalidades, las fracciones recolectadas son mayores que aproximadamente 0.01 CV, 0.02 CV, 0.03 CV, 0.04 CV, 0.05 CV, 0.06 CV, 0.07 CV, 0.08 CV, 0.09 CV, 0.1 CV, 0.2 CV, 0.3 CV, 0.4 CV, 0.5 CV, 0.6 CV, 0.7 CV, 0.8 CV, 0.9 CV, 1.0 CV, 2.0 CV, 3.0 CV, 4.0 CV, 5.0 CV, 6.0 CV, 7.0 CV, 8.0 CV, 9.0 CV, o 10.0 CV. En algunas modalidades, las fracciones que contienen el producto, e.g. polipéptido, se depositan. En algunas modalidades, las fracciones que contienen el polipéptido proveniente de las fracciones de carga y de las fracciones de elución se depositan. La cantidad de polipéptido en una fracción puede determinarse por el experto en la técnica; por ejemplo, la cantidad de polipéptido en una fracción puede determinarse mediante espectroscopia UV. En algunas modalidades, las fracciones que contienen el fragmento de polipéptido detectable se depositan.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el al menos un contaminante es cualquiera o más de los materiales de célula huésped, tales como CHOP; proteína A lixiviada, ácido nucleico; una variante, fragmento, agregado o derivado del polipéptido deseado; otro polipéptido; endotoxinas; contaminante viral; componente del medio de cultivo celular, carboxipeptidasa B, gentamicina, etc. En algunos ejemplos, el contaminante puede ser una proteína de célula huésped (HCP) de, por ejemplo, pero sin limitarse a, una célula bacteriana tal como una célula de E. coli, una célula de insecto, una célula procariótica, una célula eucariótica, una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula aviar, una célula de hongo .

Las proteínas de célula huésped (HCP) son proteínas provenientes de las células en las cuales se produjo el polipéptido. Por ejemplo, las CHOP son proteínas provenientes de células huésped, i.e., proteínas de ovario de hámster chino. La cantidad de CHOP puede medirse mediante un análisis inmunoabsorbente enlazado a enzimas ("ELISA") o Meso Scale Discovery ( "MSO" ) . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la cantidad de HCP (e.g. CHOP) se reduce por más de aproximadamente cualquiera de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 %. La cantidad de HCP puede reducirse por entre aproximadamente cualquiera de 10 % y 99 %, 30% y 95%, 30 % y 99 %, 50% y 95%, 50 % y 99 %, 75 % y 99 %, o 85 % y 99 %. En algunas modalidades, la cantidad de HCP se reduce por aproximadamente cualquiera de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 98 %. En algunas modalidades, la reducción se determina comparando la cantidad de HCP en la composición recuperada de una etapa (s) de purificación con la cantidad de HCP en la composición antes de la(s) etapa (s) de purificación.

El polipéptido agregado puede ser una proteína de alto peso molecular (HMW) . En algunas modalidades, el polipéptido agregado son multímeros del polipéptido de interés. Los métodos para medir la proteína agregada (e.g., proteína HMW) se conocen en la técnica y se describen en la sección de ejemplos. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la cantidad de la proteína agregada se reduce por más de aproximadamente cualquiera de 5%, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 %. La cantidad de la proteína agregada puede reducirse por entre aproximadamente cualquiera de 10 % y 99 %, 30% y 95%, 30 % y 99 %, 50% y 95%, 50 % y 99 %, 75 % y 99 %, o 85 % y 99 %. La cantidad de la proteína agregada puede reducirse por aproximadamente cualquiera de 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 %. En algunas modalidades, la reducción se determina comparando la cantidad de la proteína agregada (e.g., proteína HMW) en la composición recuperada de una etapa (s) de purificación con la cantidad de la proteína agregada (e.g., proteína HMW) en la composición antes de la(s) etapa (s) de purificación.

El polipéptido fragmentado puede ser una proteína de bajo peso molecular (LMW) . En algunas modalidades, el polipéptido fragmentado es un fragmento del polipéptido de interés. Ejemplos de proteína LMW incluyen, pero no se limitan a, regiones Fab (enlace de antígeno fragmentado) , Fe (fragmento cristalizable) o combinaciones de ambas o cualquier parte fragmentada aleatoria de un anticuerpo de interés . Se conocen en la técnica métodos para medir la proteína fragmentada (e.g., la proteína LMW) y se describen en la sección de ejemplos. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la cantidad de proteína LMW se reduce por más de aproximadamente cualquiera de 5%, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 %. La cantidad de proteína LMW puede reducirse por entre aproximadamente cualquiera de 10% y 99 %, 30% y 95%, 30 % y 99 %, 50% y 95%, 50 % y 99 %, 75 % y 99 %, o 85 % y 99 %. La cantidad de proteína LMW puede reducirse por aproximadamente cualquiera de 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 %. En algunas modalidades, la reducción se determina comparando la cantidad de proteína fragmentada (e.g., proteína LMW) en la composición recuperada de una etapa (s) de purificación con la cantidad de proteína fragmentada (e.g., proteína LMW) en la composición antes de la(s) etapa (s) de purificación.

La proteína A lixiviada es la proteína A retirada o lavada de una fase sólida a la cual está unida. Por ejemplo, la proteína A lixiviada puede lixiviarse a partir de una columna de cromatografía de proteína A. La cantidad de proteína A puede medirse, por ejemplo, mediante ELISA. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la cantidad de la proteína A lixiviada se reduce por más de aproximadamente cualquiera de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o 90 %. La cantidad de la proteína A lixiviada puede reducirse por entre aproximadamente cualquiera de 10 % y 99 %, 30% y 95%, 30 % y 99 %, 50% y 95%, 50 I y 99 %, 75 I y 99 ¾, o 85 % y 99 %. En algunas modalidades, la cantidad de la proteína A lixiviada se reduce por aproximadamente cualquiera de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 %. En algunas modalidades, la reducción se determina comparando la cantidad de la proteína A lixiviada en la composición recuperada de una etapa (s) de purificación con la cantidad de la proteína A lixiviada en la composición antes de la(s) etapa (s) de purificación.

Se conocen en la técnica métodos para medir el ADN tal como el ADN de célula huésped y se describen en la sección de ejemplos. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la cantidad de ADN se reduce por más de aproximadamente cualquiera de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o 90 %. La cantidad de ADN puede reducirse por entre aproximadamente cualquiera de 10 % y 99 %, 30% y 95%, 30 % y 99 %, 50% y 95%, 50 % y 99 %, 75 % y 99 %, o 85 % y 99 %. La cantidad de ADN puede reducirse por aproximadamente cualquiera de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o 99 %. En algunas modalidades, la reducción se determina comparando la cantidad de ADN en la composición recuperada de una etapa (s) de purificación con la cantidad de ADN en la composición antes de la(s) etapa (s) de purificación.

Componente del medio de cultivo celular se refiere a un componente presente en un medio de cultivo celular. El medio de cultivo celular puede ser el medio de cultivo celular al momento de cosechar las células . En algunas modalidades, el componente del medio de cultivo celular es gentamicina. La cantidad de gentamicina puede medirse mediante ELISA. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la cantidad de componente del medio de cultivo celular se reduce por más de aproximadamente cualquiera de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o 90 %. La cantidad de componente del medio de cultivo celular puede reducirse por entre aproximadamente cualquiera de 10 % y 99 %, 30% y 95%, 30 % y 99 %, 50% y 95%, 50 % y 99 %, 75 % y 99 %, o 85 % y 99 %. En algunas modalidades, la cantidad de componente del medio de cultivo celular se reduce por aproximadamente cualquiera de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, O 98 %. En algunas modalidades, la reducción se determina comparando la cantidad de componente del medio de cultivo celular en la composición recuperada de una etapa (s) de purificación con la cantidad de componente del medio de cultivo celular en la composición antes de la(s) etapa (s) de purificación.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, los métodos pueden comprender además una o más etapas de purificación ya sea antes o después de, cualquiera de las OEC descritas en la presente. Otros procedimientos de purificación incluyen, por ejemplo, cromatografía de intercambio de ion tal como una cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de afinidad tal como cromatografía de proteína A y cromatografía de proteína G, cromatografía en modo mezclado, cromatografía de hidroxilapatita; cromatografía de filtración de gel; cromatografía de afinidad; electroforesis de gel; diálisis; precipitación de etanol; HPLC en fase inversa; cromatografía en sílice; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; y columnas de quelado de metal para enlazar las formas etiquetadas con epítope del polipéptido.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, los métodos comprenden además recuperar el polipéptido purificado. En algunas modalidades, polipéptido purificado se recupera de cualquiera de las etapas de purificación descritas en la presente. La etapa de cromatografía puede ser cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía en modo mezclado, o cromatografía de proteína A. En algunas modalidades, la Cromatografía OEC es una cromatografía en modo mezclado y la cromatografía adicional es una cromatografía de intercambio aniónico. En algunas modalidades, la cromatografía OEC es una cromatografía en modo mezclado y la cromatografía adicional es una cromatografía de intercambio catiónico. En algunas modalidades, la cromatografía OEC es una cromatografía en modo mezclado y la cromatografía adicional es una Cromatografía HIC. En algunas modalidades, la cromatografía OEC es una cromatografía de intercambio aniónico y la cromatografía adicional es una cromatografía de intercambio catiónico. En algunas modalidades, la cromatografía OEC es una cromatografía de intercambio aniónico y la cromatografía adicional es una cromatografía en modo mezclado. En algunas modalidades, la cromatografía OEC es una cromatografía de intercambio aniónico y la cromatografía adicional es una cromatografía HIC. En algunas modalidades, la cromatografía OEC es una cromatografía de intercambio catiónico y la cromatografía adicional es una cromatografía de intercambio aniónico. En algunas modalidades, la cromatografía OEC es una cromatografía de intercambio catiónico y la cromatografía adicional es una cromatografía en modo mezclado. En algunas modalidades, la cromatografía OEC es una cromatografía de intercambio catiónico y la cromatografía adicional es una cromatografía HIC. En algunas modalidades, la cromatografía OEC es una cromatografía HIC y la cromatografía adicional es una cromatografía en modo mezclado. En algunas modalidades, la cromatografía OEC es una cromatografía HIC y la cromatografía adicional es una cromatografía de intercambio aniónico. En algunas modalidades, la cromatografía OEC es una cromatografía HIC y la cromatografía adicional es una cromatografía de intercambio catiónico.

En algunas modalidades, el polipéptido se purifica adicionalmente después de la OEC mediante filtración viral.

La filtración viral es el retiro de los contaminantes virales en una corriente de alimentación de purificación del polipéptido. Ejemplos de filtración viral incluyen ultrafiltración y microfiltración. En algunas modalidades el polipéptido se purifica utilizando un filtro para parvovirus .

En algunas modalidades, el polipéptido se concentra después de la cromatografía por medo del modo OEC. Se conocen en la técnica ejemplos de métodos de concentración e incluyen pero no se limitan a ultrafiltración y diafiltración.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, los métodos comprenden además combinar el polipéptido purificado de los métodos de purificación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para purificar un anticuerpo, que comprenden a) cargar una composición que comprende el anticuerpo en una resina Capto Adhere a una densidad de carga de 150 a 200 g de anticuerpo por litro de Resina Capto Adhere en un amortiguador de carga con un pH de aproximadamente 6.5 y una conductividad de aproximadamente 5.3 mS/cm a aproximadamente 5.6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo a partir de la resina con un amortiguador de elución que comprende 100 mM de ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES) con un pH de aproximadamente 6.5 y una conductividad de aproximadamente 1 mS/cm; y recolectar un depósito que comprende el anticuerpo.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para purificar un anticuerpo, que comprenden a) cargar una composición que comprende el anticuerpo en una resina Capto Adhere en una columna de 1.6 a 10.8 L a una densidad de carga de 70 a 180 g de anticuerpo por litro de resina Capto Adhere en un amortiguador de carga con un pH de aproximadamente 6.5 y una conductividad de aproximadamente 5.3 mS/cm a aproximadamente 5.6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo a partir de la resina con un amortiguador de elución que comprende 100 mM de MES con un pH de aproximadamente 6.5 y una conductividad de aproximadamente 1 mS/cm; y recolectar un depósito que comprende el anticuerpo.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para purificar un anticuerpo, que comprenden a) cargar una composición que comprende el anticuerpo en una resina Capto Adhere a una densidad de carga de aproximadamente 200 g de anticuerpo por litro de resina Capto Adhere en un amortiguador de carga con un pH de aproximadamente 8.6 y una conductividad de aproximadamente menos de 6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo a partir de la resina con un amortiguador de elución de 20 mM de MES con un pH de aproximadamente 6.5 y una conductividad de aproximadamente 1 mS/cm; y recolectar un depósito que comprende el anticuerpo.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para purificar un anticuerpo, que comprenden a) cargar una composición que comprende el anticuerpo en una resina Capto Adhere a una densidad de carga de aproximadamente 200 g de anticuerpo por litro de resina Capto Adhere en un amortiguador de carga con un pH de aproximadamente 6.1 y una conductividad de aproximadamente menos de 6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo a partir de la resina con un amortiguador de elución de 20 mM de MES con un pH de aproximadamente 6.0 y una conductividad de aproximadamente 0.65 mS/cm; y recolectar un depósito que comprende el anticuerpo.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para purificar un anticuerpo, que comprenden a) cargar una composición que comprende el anticuerpo en una resina Capto Adhere a una densidad de carga de aproximadamente 200 g de anticuerpo por litro de resina Capto Adhere en un amortiguador de carga con un pH de aproximadamente 5.5 y una conductividad de aproximadamente menos de 6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo a partir de la resina con un amortiguador de elución de 20 mM MES con un pide aproximadamente 4.9 y una conductividad de aproximadamente 1.1 mS/cm; y recolectar un depósito que comprende el anticuerpo .

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para purificar un anticuerpo, que comprenden a) cargar una composición que comprende el anticuerpo en una resina Capto Adhere a una densidad de carga de aproximadamente 200 g de anticuerpo por litro de resina Capto Adhere en un amortiguador de carga con un pH de aproximadamente 6.5 y una conductividad de aproximadamente menos de 6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo a partir de la resina con un amortiguador de elución de 20 mM de MES con un pH de aproximadamente 6.5 y una conductividad de aproximadamente 1 mS/cm; y recolectar un depósito que comprende el anticuerpo.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para purificar un anticuerpo, que comprenden a) cargar una composición que comprende el anticuerpo en una resina QMA a una densidad de carga de aproximadamente 103 g de anticuerpo por litro de Resina QMA en un amortiguador de carga con un pH de aproximadamente 6.5 y una conductividad de aproximadamente menos de 5.5 mS/cm; b) eluir el anticuerpo a partir de la resina con un amortiguador de elución de 20 mM de MES con un pH de aproximadamente 6.5 y una conductividad de aproximadamente 1 mS/cm; y recolectar un depósito que comprende el anticuerpo.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para purificar un anticuerpo, que comprenden a) cargar una composición que comprende el anticuerpo en una resina Poros XS a una densidad de carga de aproximadamente 200 g de anticuerpo por litro de resina Poros XS en un amortiguador de carga con un pH de aproximadamente 5.5 y una conductividad de aproximadamente menos de 6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo a partir de la resina con 50 a 350 m de amortiguador de elución de acetato con un pH de aproximadamente 5.5; y recolectar un depósito que comprende e1 anticuerpo .

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para purificar un anticuerpo, que comprenden a) cargar una composición que comprende el anticuerpo en una resina Capto MMC a una densidad de carga de aproximadamente 147 g de anticuerpo por litro de resina Capto MMC en un amortiguador de carga con un pH de aproximadamente 7.0 y una conductividad de aproximadamente menos de 6 mS/cm; b) eluir el anticuerpo a partir de la resina con un amortiguador de elución de 20 mM de MES con un pH de aproximadamente 6.5 y una conductividad de aproximadamente 1 mS/cm; y recolectar un depósito que comprende el anticuerpo.

III. Polipéptidos Se proporcionan polipéptidos para su uso en cualquiera de los métodos de purificación de polipéptidos y formulaciones que comprenden los polipéptidos purificados mediante los métodos descritos en la presente.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para purificar un polipéptido utilizando cromatografía de sobrecarga y elución. En algunas modalidades, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunas modalidades, el polipéptido es un antagonista. En algunas modalidades, el polipéptido es un agonista. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido se etiqueta por epítope. En algunas modalidades, el polipéptido retiene una actividad biológica y/o inmunológica. En algunas modalidades, el polipéptido es un antagonista. En algunas modalidades, el polipéptido inicia la citotoxicidad dependiente del complemento. En algunas modalidades el polipéptido es un anticuerpo o una inmunoadhesina. En modalidades adicionales de las modalidades anteriores, el polipéptido se purifica mediante OEC utilizando un medio de cromatografía en modo mezclado. En modalidades adicionales de las modalidades anteriores, el polipéptido se purifica mediante OEC utilizando un medio de cromatografía de intercambio aniónico. En modalidades adicionales de las modalidades anteriores, el polipéptido se purifica mediante OEC utilizando un medio de cromatografía de intercambio catiónico. En modalidades adicionales de las modalidades anteriores, el polipéptido se purifica mediante OEC utilizando un medio de cromatografía HIC. En modalidades adicionales de las modalidades anteriores, el polipéptido se purifica mediante OEC utilizando un medio de cromatografía HAP. En modalidades adicionales de las modalidades anteriores, el polipéptido se purifica mediante OEC utilizando un medio de cromatografía de afinidad. En modalidades adicionales de las modalidades anteriores, el polipéptido se purifica mediante OEC utilizando un medio de cromatografía que no es o no incluye una cromatografía de intercambio catiónico.

En algunas modalidades, el polipéptido tiene un peso molecular de más de aproximadamente cualquiera de 5,000 Daltons, 10,000 Daltons, 15,000 Daltons, 25,000 Daltons, 50,000 Daltons, 75,000 Daltons, 100,000 Daltons, 125,000 Daltons, o 150,000 Daltons. El polipéptido puede tener un peso molecular entre aproximadamente cualquiera de 50,000 Daltons a 200,000 Daltons o de 100,000 Daltons a 200,000 Daltons. Alternativamente, el polipéptido para uso en la presente puede tener un peso molecular de aproximadamente 120,000 Daltons o de aproximadamente 25,000 Daltons. pl es el punto isoeléctrico y es el pH al cual una molécula o superficie particular no transporta ninguna carga eléctrica neta. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el pl del polipéptido puede encontrarse entre aproximadamente cualquiera de 6 a 10, de 7 a 9, o de 8 a 9. En algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl de aproximadamente cualquiera de 6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, o 10.

El polipéptidos que va a purificarse utilizando los métodos descritos en la presente se produce generalmente utilizando técnicas recombinantes . Los métodos para producir proteínas recombinantes se describen, e.g., en las Patentes de E.U. Nos. 5,534,615 y 4,816,567, específicamente incorporadas en la presente mediante la referencia. En algunas modalidades, la proteína de interés se produce en una célula CHO (ver, e.g. WO 94/11026) . Cuando se utilizan técnicas recombinantes, los polipéptidos pueden producirse de manera intracelular, en el espacio periplásmico o secretarse directamente hacia el medio.

Los polipéptidos pueden recuperarse del medio de cultivo o de lisados de célula huésped. Las células empleadas en la expresión de los polipéptidos pueden separarse mediante varios medios físicos o químicos, tales como ciclo de congelación-descongelación, sonicación, separación mecánica, o agentes de lisado celular. Si el polipéptido se produce de manera intracelular, como primera etapa, el polvo en partículas, ya sea de células huésped o fragmentos lisados, se retira, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar polipéptidos secretados hacia el espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, se descongela la pasta celular en presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos . El polvo celular puede retirarse mediante centrifugación. Cuando el polipéptido se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión se concentran primero generalmente utilizando un filtro de concentración de polipéptido comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad Amicon o Millipore Pellicon de ultrafiltración. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes inesperados .

Ejemplos de polipéptidos que pueden purificarse mediante los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas , inmunoadhesinas , anticuerpos, enzimas, hormonas, proteínas de fusión, proteínas que contienen Fe, inmunoconjugados , citosinas e interleucinas . Ejemplos de polipéptido incluyen, pero no se limitan a, proteínas de mamífero, tales como, e.g., renina; una hormona; una hormona de crecimiento, incluyendo hormona humana de crecimiento y hormona bovina de crecimiento; factor de liberación de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimuladora de tiroides; lipoproteínas; alpha-l-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora de folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como el factor VIIIC, el factor IX, el factor de tejido, y el factor von illebrands; factores anti-coagulación tales como Proteina C; factor atrial natriurético; surfactante pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana o un activador de plasminógeno tipo tejido (t-PA) ; bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor-alfa y -beta de necrosis de tumor; encefalinasa; RA TES (regulado en activación normalmente expresada y secretada por la célula T) ; proteína humana macrófago inflamatoria (???-1-alfa) ; una albúmina de suero tal como albúmina de suero humana; sustancia de inhibición Muellerian; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; pro-relaxina; péptido de ratón asociado con gonadotropina; una enzima; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNase; IgE; un antígeno asociado con linfocito T citotóxico (CTLA) , tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ; receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF) , neurotrofina-3 , -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6) , o un factor de crecimiento de nervios tal como NGF-b; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ,· factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF) ; factor de crecimiento de transformación (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-ß?, TGF^2, TGF-33, TGF^4, o TGF- 5; factor-I y -II de crecimiento similar a insulina (IGF-I e IGF-II) ; des(l-3)-IGF-I (IGF-I cerebral) , proteínas de enlace del factor de crecimiento similar a insulina (IGFBPs) ; una citosina; proteínas CD tales como CD3 , CD4 , CD8 , CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas ; un polipéptido de fusión, i.e. a polipéptido comprendido en dos o más polipéptidos heterologos o sus fragmentos y codificados por un ácido nucleico recombinante; un polipéptido que contiene Fe, por ejemplo, una proteína de fusión que comprende una región Fe de inmunoglobulina, o su fragmento, fusionada a un segundo polipéptido; un inmunoconjugado; una proteína morfogenética ósea (BMP) ; un interferón tal como interferón-alfa, -beta, y -gamma; factores estimuladores de colonia (CSFs) , e.g., M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleucinas (ILs) , e.g., IL-1 to IL-10; superóxido dismutasa; receptores de célula T; proteínas de membrana de superficie; factores de aceleración de disminución; antígenos virales tales como, por ejemplo, una porción de la envoltura del SIDA; proteínas de transporte; receptores de alojamiento; adhesinas; proteínas regulatorias; integrinas tales como CDlla, CDllb, CDllc, CD18, un ICAM, VLA-4 y VCAM; a antígeno asociado a tumor tal como CA125 (antígeno de célula ovárica) o receptor HER2, HER3 o HER4 ; inmunoadhesinas ; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de las proteínas antes listadas así como anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpo, que se enlazan a una proteína, incluyendo, por ejemplo, cualquiera de las proteínas antes listadas.

(A) Anticuerpos En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el polipéptido para uso en cualquiera de los métodos para purificar polipéptidos y formulaciones que comprenden los polipéptidos purificados mediante los métodos descritos en la presente es un anticuerpo .

Los objetivos moleculares para anticuerpos incluyen Proteínas CD y sus ligandos, tales como, pero sin limitarse a: (i) CD3, CD4, CD8 , CD19, CDlla, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79a (CD79a), y ??79ß (CD79b) ; (ii) miembros de la familia del receptor ErbB tales como el receptor EGF, receptor HER2, HER3 o HER4 ; (iii) moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Macl, pl50,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e integrina a?/ß3, incluyendo sus subunidades alfa o beta (e.g., anticuerpos anti-CDlla, anti-CD18 o anti-CDllb) ; (iv) factores de crecimiento tales como VEGF; IgE; antígenos del grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB) ; receptor mpl; CTLA-4; proteína C, BR3, c-met, factor de tejido, ß7 etc.; y (v) antígenos asociados a tumor de superficie celular y transmembrana (TAA) , tales como los descritos en la Patente de E.U. No. 7,521,541.

Otros anticuerpos ejemplares incluyen los seleccionados de, y sin limitación, anticuerpo anti-receptor de estrógeno, anticuerpo anti-receptor de progesterona, anticuerpo anti-p53, anticuerpo anti-HER-2/neu, anticuerpo anti-EGFR, anticuerpo anti-catepsina D, anticuerpo anti-Bcl-2, anticuerpo anti-E-cadherina, anticuerpo anti-CA125, anticuerpo anti-CA15-3, anticuerpo anti-CA19-9, anticuerpo anti-c-erbB-2, anticuerpo anti-P-glicoproteina, anticuerpo anti-CEA, anticuerpo anti-proteína de retinoblastoma, anticuerpo anti-oncoproteína ras, anticuerpo anti-Lewis X, anticuerpo anti-Ki-67, anticuerpo anti-PCNA, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD4, anticuerpo anti-CD5, anticuerpo anti-CD7, anticuerpo anti-CD8, anticuerpo anti-CD9/p24 , anticuerpo anti-CD10, anticuerpo anti-CDlla, anticuerpo anti-CDllc, anticuerpo anti-CD13, anticuerpo anti-CD14, anticuerpo anti-CD15, anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-CD22, anticuerpo anti-CD23, anticuerpo anti-CD30, anticuerpo anti-CD31, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD34, anticuerpo anti-CD35, anticuerpo anti-CD38, anticuerpo anti-CD41 anticuerpo, anti-LCA/CD45 , anticuerpo anti-CD45RO, anticuerpo anti-CD45RA, anticuerpo anti-CD39, anticuerpo anti-CD100, anticuerpo anti-CD95/Fas, anticuerpo anti-CD99, anticuerpo anti-CD106, anticuerpo anti-ubiquitina, anticuerpo anti-CD71, anticuerpo anti-c-myc, anticuerpo anti- citoqueratinas , anticuerpo anti-vimentinas , anticuerpo antiproteínas HPV, anticuerpo anti-cadenas ligeras kappa, anticuerpo anti-cadenas ligeras lambda, anticuerpo anti-me1anosornas , anticuerpo anti-antígeno de próstata específico, anticuerpo anti-S-100, anticuerpo anti-antígeno tau, anticuerpo anti-fibrina, anticuerpo anti-queratinas y anticuerpo anti-Tn-antígeno . (i) Anticuerpos policlonales En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales se cultivan preferentemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a un polipéptido inmunógeno en la especie que va a inmunizarse, e.g., hemocianina de lapa, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Se inmuniza a los animales contra el antígeno, conjugados inmunógenos o derivados combinando, e.g., 100 g o 5 g del polipéptido o conjugado 8para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución de manera intradérmica en múltiples sitios . Un mes más tarde se refuerza a los animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De 7 a 14 días después se sangra a los animales y se analiza el suero por titulación de anticuerpos . Se refuerza a los animales hasta que se estabiliza la titulación. En algunas modalidades, se refuerza al animal con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a un polipéptido diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también pueden producirse en cultivo celular recombinante como fusiones de polipéptido. También, se utilizan adecuadamente agentes de agregación tales como alum para mejorar la respuesta inmune . (ii) Anticuerpos Monoclonales En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales . Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, i.e., los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se enlazan al mismo epítope excepto por posibles variantes que surgen durante la producción del anticuerpo monoclonal, estando presentes tales variantes generalmente en cantidades menores.

Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo no siendo una mezcla de anticuerpos separados o policlonales .

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando el método de hibridoma primeramente descrito por Kohler et al., Nature 256_495 (1975) o pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante (Patente de E.U. No. 4,816,567) .

En el método de hibridoma, se inmuniza a un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, como se describe en la presente para obtener linfocitos que producen o tienen la capacidad de producir anticuerpos que se enlazarán específicamente al polipéptido utilizado para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Después los linfocitos se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol , para formar una célula de hibridoma (Gooding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice (Anticuerpos monoclonales: principios y práctica) pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

En algunas modalidades, las células de mieloma son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción estable a alto nivel del anticuerpo por medio de las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio, tal como el medio HAT. Entre estas, en algunas modalidades, las líneas celulares de mieloma son líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California E.U.A. y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles del American type Culture Collection, Rocksville, Maryland, E.U.A. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos ( ozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Técnicas de producción y aplicaciones de anticuerpos monoclonales) pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) ) .

El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma se analiza por la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno. En algunas modalidades, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un análisis de enlace in vitro, tal como el radioinmunoanálisis (RIA) o el análisis inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA) .

La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson et al., Anal Biochem. 107:220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse limitando los procedimientos de dilución y cultivarse mediante métodos estándar (Gooding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (Anticuerpos monoclonales : principios y práctica) pp. 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Adicionalmente , las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de ascitis en un animal .

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, el fluido de ascitis o el suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita de polipéptido A-sefarosa, electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (e.g., utilizando sondas de oligonucleótidos con la capacidad de enlazarse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos) . En algunas modalidades, las células de hibridoma sirven como una fuente de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transfectan en células huésped tales como las células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) , o células de mieloma que de otra manera no producen el polipéptido de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes . Los artículos que revisan la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican para el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol . 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol. Revs . , 130:151-188 (1992).

En una modalidad adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos fago generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol . 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas fago. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) mediante restructuración de cadena (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategias para construir bibliotecas fago muy grandes (Waterhouse et al., Nucí. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación por el dominio constante humano de cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de E.U. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc . Nati Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)), o mediante la unión covalente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina a toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no inmunoglobulina.

Típicamente, tales polipéptidos no inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígenos de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígenos que tiene la especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígenos que tiene especificidad para un antígeno diferente.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el anticuerpo es IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgG monoclonal. (iii) Anticuerpos humanizados En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos se han descrito en la técnica. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo provenientes de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácido no humanos se refieren frecuentemente como residuos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable "importado" . La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de E.U. No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor .

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que van a utilizarse en la producción de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método llamado "mejor adaptado"), la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se explora contra la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta entonces como la región de estructura (FR) humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol . 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol . 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región de estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada. Puede utilizarse la misma estructura para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J.

Immunol. 151:2623 (1993)).

Es además importante que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables . Para lograr este propósito, en algunas modalidades de los métodos, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias de origen y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias de origen y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran comercialmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Se encuentran disponibles programas computarizados que ilustran y despliegan estructuras tridimensionales conformacionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidato seleccionadas . La inspección de estas imágenes permite el análisis del posible papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, i.e., el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidato para enlazarse a su antigeno. De esta manera, pueden seleccionarse los residuos FR y combinarse desde las secuencias receptoras e importadas de manera que se logren las características del anticuerpo deseadas, tales como la capacidad incrementada para el (los) antígeno (s) objetivo. En general, los residuos de la región hipervariable se encuentran directamente de más sustancialmente involucrados en influir en el enlace al antígeno. (v) Anticuerpos Humanos En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Como una alternativa a la humanización, los anticuerpos pueden ser generados. Por ejemplo, actualmente es posible producir animales transgénicos (e.g., ratones) que tienen la capacidad, a su inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homózigua del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción del anticuerpo endógeno. La transferencia de la disposición del gen de inmunoglobulina de línea germinal humana en tales ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos al desafío con antígeno. ver, e.g., Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); y Patentes de E.U. Nos. 5,591,669; 5,589,369; y 5,545,807.

Alternativamente, puede utilizarse tecnología de visualización fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de gen de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes del dominio V de anticuerpo se clonan en marco en un gen de polipéptido cubierto mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como MI3 o fd, y se despliegan como fragmentos de anticuerpo funcional en la superficie de la partícula fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenaria del genoma fago, las selecciones en base a las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado en la selección del gen que codifica para el anticuerpo que exhibe esas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La visualizacion fago puede llevarse a cabo en una variedad de formatos; para su revisión, ver, e.g., Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J. , Current Opinión in Structural Biology (Opinión actual en biología estructural) 3:564-571 (1993) . Varias fuentes de segmentos del gen V pueden utilizarse para la visualizacion fago. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) aislaron una disposición diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivada de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V provenientes de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos para una disposición diversa de antígenos (incluyendo auto-antígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol . 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver también, Patentes de E.U. Nos. 5,565,332 y 5,573,905.

También pueden generarse anticuerpos humanos mediante células B activadas in vitro (ver Patentes de E.U. 5,567,610 y 5,229,275) . (v) Fragmentos de anticuerpo En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, e.g., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods (Diario de Métodos Bioquímicos y Biofísicos) 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse actualmente directamente mediante células huésped recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de las bibliotecas fago de anticuerpo descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab'>2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro procedimiento, los fragmentos F(ab' )2 pueden aislarse directamente a partir de un cultivo de célula huésped recombinante . Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes para el practicante experto. En otras modalidades, el anticuerpo seleccionado es un fragmento Fv monocatenario (scFv) . Ver WO 93/16185; Patente de E.U. No. 5,571,894; y Patente de E.U. No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", e.g., como se describe, por ejemplo, en la Patente de E.U. 5,641,870. Tales fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser mono-específicos o bi-específicos .

En algunas modalidades, se proporcionan fragmentos de los anticuerpos descritos en la presente. En algunas modalidades, el fragmento de anticuerpo es un fragmento de enlace al antígeno. En algunas modalidades, el fragmento de enlace al antígeno se selecciona del grupo que consiste de un fragmento Fab, un fragmento Fab' , un fragmento F(ab' )2/ un scFv, un Fv y un diabody. (vi) Anticuerpos biespecíficos En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para al menos dos epítopes diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden enlazarse a dos epítopes diferentes. Alternativamente, el brazo de enlace del anticuerpo biespecífico puede combinarse con un brazo que se enlaza a una molécula desencadenadora en un leucocito tal como una molécula del receptor de célula T (e.g., CD2 o CD3) , o receptores Fe para IgG (FCYR) , tales como FCYRI (CD64) , FCYRII (CD32) y FCYRIII (CD16) a fin de enfocar los mecanismos de defensa celular hacia la célula. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud total o fragmentos de anticuerpo (e.g., anticuerpos F(ab0)2 biespecíficos) .

Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos biespecíficos . La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud total se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983) ) . Debido a la selección aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridoma (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que comúnmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es trabajosa y los rendimientos del producto son bajos. Se describen procedimientos similares en la WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) .

De acuerdo con un procedimiento diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. En algunas modalidades, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de las regiones de articulación CH2 y CH3. En algunas modalidades, la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para el enlace de la cadena ligera, se presenta en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, de cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transíectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modalidades en donde las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación de dos o todas estas tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no son de particular significancia.

En algunas modalidades de este procedimiento, los anticuerpos biespecíficos se componente de una cadena pesada híbrida de inmunoglobulina con una primera especificidad de enlace en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera híbrida de inmunoglobulina (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, debido a que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina solamente en la mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera fácil de separación. El procedimiento se describe en la WO 94/04690. Para detalles adicionales de generación de anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology (Métodos en enzimología) 121:210 (1986).

De acuerdo con otro procedimiento descrito en la Patente de E.U. No. 5,731,168, puede fabricarse una interconexión entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recupera del cultivo celular recombinante . En algunas modalidades, la interconexión comprende al menos parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más pequeñas cadenas laterales de aminoácidos provenientes de la interconexión de la primera molécula de anticuerpo se remplazan con cadenas laterales más grandes (e.g., tirosina o triptófano) . Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) lateral (es) grande (s) en la interconexión de la segunda molécula de anticuerpo remplazando grandes cadenas laterales de aminoácidos con unas más pequeñas (e.g., alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros subproductos no deseados tales como homodímeros .

Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de E.U. No. 4,676, 980) y para el tratamiento de infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden producirse utilizando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son muy conocidos en la técnica, y se describen en la Patente de E.U. No. 4,676,980, junto con numerosas técnicas de reticulación.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos pueden prepararse utilizando enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde anticuerpos intactos se dividen proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente de complejación ditiol arsenita de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y evitar la formación de bisulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten después en derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB se re-convierte entonces en el Fab' -tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

También se han descrito varias técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente a partir del cultivo celular recombinante . Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cierres de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos del cierre de leucina provenientes de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión del gen. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región de articulación para formar monómeros y después se re-oxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por medio de un enlazador demasiado corto para permitir la formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a formar pares con los dominios VH y VL complementarios de otro fragmento formando así dos sitios de enlace al antígeno. También se ha reportado otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv (dFv) monocatenarios . Ver Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos . Tutt et al., J. Immunol 147:60 (1991). (vii) Anticuerpos ultivalentes En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos multivalentes. Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápido que un anticuerpo bivalente mediante una célula que expresa un antígeno al cual se enlazan los anticuerpos. Los anticuerpos proporcionados en la presente pueden ser anticuerpos multivalente (que son diferentes a la clase IgM) con tres o más sitios de enlace al antígeno (e.g., anticuerpos tetravalentes) que pueden producirse fácilmente mediante la expresión recombinante del ácido nucleico que codifica para las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerizacion y tres o más sitios de enlace al antígeno. El dominio de dimerizacion preferido comprende (o consiste de) una región Fe o una región de articulación. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de enlace al antígeno amino-terminales a la región Fe. El anticuerpo multivalente preferido en la presente comprende (o consiste de) tres a aproximadamente ocho, pero preferentemente cuatro, sitios de enlace al antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptido (y preferentemente dos cadenas de polipéptido) , en donde la(s) cadena (s) de polipéptido comprende (n) dos o más dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena (s) de polipéptido puede (n) comprender VD1- (XI) n-VD2- (X2) n-Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptido de una región Fe, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido y n es 0 o 1. Por ejemplo, la(s) cadena (s) de polipéptido puede (n) comprender una cadena VH-CHl-enlazador flexible-VH-CHl-región Fe o una cadena VH-VH1-VH-CH1-región Fe. El anticuerpo multivalente en la presente comprende además preferentemente al menos dos (y preferentemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en la presente puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en la presente comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, comprenden además un dominio CL.

En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico . Ejemplos de anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) , en donde la unidad VHVL tiene especificidad de poliepítope, anticuerpos que tienen dos o más dominios VH y VL enlazándose cada unidad VH VL a un epítope diferente, anticuerpos que tienen dos o más dominios variables enlazándose cada dominio variable único a un epítope diferente, anticuerpos de longitud total, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diabodies, diabodies específicos, triabodies, anticuerpos tri-funcionales, fragmentos de anticuerpo que se han enlazado covalentemente o no covalentemente . En algunas modalidades, ese anticuerpo tiene especificidad de poliepítope, por ejemplo, la capacidad de enlazarse específicamente a dos o más epítopes diferentes en objetivo (s) iguales o diferentes.

En algunas modalidades, los anticuerpos son monoespecíficos, por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza solamente a un epítope. De acuerdo con una modalidad el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo IgG que se enlaza a cada epítope con una afinidad de 5 µ? a 0.001 pM, 3 µ? a 0.001 pM, 1 µ? a 0.001 pM, 0.5 µ? a 0.001 pM, o 0.1 µ? a 0.001 pM. (viii) Otras Modificaciones de Anticuerpo Puede ser deseable modificar el anticuerpo proporcionado en la presente con respecto a la función de efector, e.g., a fin de mejorar la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse introduciendo una o más sustituciones de aminoácido en una región Fe del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, puede (n) introducirse un residuo (s) de cisteína en la región Fe, permitiendo así la formación del enlace bisulfuro inter-cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o destrucción celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) incrementadas. Ver Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J., Immunol . 148:2918-2922 (1992) . Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada también pueden prepararse utilizando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993).

Alternativamente, puede fabricarse un anticuerpo que tiene regiones Fe dobles y por tanto puede tener capacidades mejoradas de lisis mediada por el complemento y ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design (Diseño de fármacos anticáncer) 3:219-230 (1989).

Para incrementar la vida media en suero del anticuerpo, pueden realizarse alteraciones de aminoácidos en el anticuerpo como se describe en la US2006/0067930 , que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad.

(B) Variantes y Modificaciones de Polipéptido La(s) modificación (es) de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos, incluyendo anticuerpos, descritos en la presente puede (n) utilizarse en los métodos para purificar los polipéptidos (e.g., anticuerpos) descritos en la presente . (i) Polipéptidos Variantes "Variante de polipéptido" significa un polipéptido, preferentemente un polipéptido activo, como se define en la presente, que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80% con una secuencia nativa de longitud total del polipéptido, una secuencia de polipéptidos que carece del péptido de señal, un dominio extracelular de un polipéptido, con o sin el péptido de señal. Tales variantes de polipéptido incluyen, por ejemplo, polipéptidos en donde se agregan, o se suprimen, uno o más residuos de aminoácido, en la terminación N o C de la secuencia de aminoácido nativa de longitud total. Ordinariamente, una variante de polipéptido TAT tendrá una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80%, alternativamente al menos aproximadamente cualquiera de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, con una secuencia nativa de longitud total del polipéptido, una secuencia de polipéptidos que carece del péptido de señal, un dominio extracelular de un polipéptido, con o sin el péptido de señal. Opcionalmente , los polipéptidos variantes tendrán no más de una sustitución de aminoácido conservativa en comparación con la secuencia de polipéptidos nativa, alternativamente no más de aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de aminoácido conservativas en comparación con la secuencia de polipéptidos nativa.

El polipéptido variante puede estar truncado en la terminal N o la terminal C, o puede carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se compara con un polipéptido nativo de longitud total. Ciertos polipéptidos variantes pueden carecer de residuos de aminoácido que no son esenciales para la actividad biológica deseada. Estos polipéptidos variantes con truncamientos, supresiones e inserciones pueden preparase mediante cualquiera de numerosas técnicas convencionales. Los polipéptidos variantes deseados pueden sintetizarse químicamente. Otra técnica adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ácido nucleico que codifica para un polipéptido variante deseado, mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR) . Los oligonucleótidos que definen las terminaciones deseadas del fragmento de ácido nucleico se emplean en los iniciadores 5' y 3' en la OCR. Preferentemente, los polipéptidos variantes comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido nativo descrito en la presente.

Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de terminal amino y/o carboxilo que varían en longitud de un residuo a los polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intra-secuencia de residuos de aminoácido únicos o múltiples. Ejemplos de inserciones de terminal incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo de terminal N o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión a la terminación N o C del anticuerpo a una enzima o un polipéptido lo cual incrementa la vida media en suero del anticuerpo.

Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del polipéptido. Las variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido se preparan introduciendo cambios apropiados de nucleótido en el ácido nucleico del anticuerpo o mediante la síntesis del péptido. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de y/o inserciones en y/o sustituciones de, los residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del polipéptido. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se realiza para llegar a la construcción final siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácido también pueden alterar los procesos post-translacionales del polipéptido (e.g., anticuerpo) tales como el cambio del número o la posición de los sitios de glicosilación.

Puede encontrarse una guía para determinar cuál aminoácido puede insertarse, sustituirse o suprimirse sin afectar de manera adversa la actividad deseada, comparando la secuencia del polipéptido con la de las moléculas de polipéptido homologas conocidas y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos efectuados en las regiones de alta homología.

Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del polipéptido (e.g., anticuerpo) que son las ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de cribado de alanina" como se describe por Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Aquí, se identifica un residuo o grupo de residuos objetivo (e.g., residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se remplaza por un aminoácido neutro o de carga negativa (más preferentemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Las ubicaciones de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces introduciendo variantes adicionales o diferentes en, o para, los sitios de sustitución. Por tanto, aunque se predetermina el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácido, no es necesario predeterminar la naturaleza de la mutación per se. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se conduce un cribado o mutagénesis de Ala o aleatoria en el codón o región objetivo y las variantes de anticuerpo expresadas se exploran por la actividad deseada.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo remplazada por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables , pero también se contemplan las alteraciones de FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 siguiente bajo el encabezado de "sustituciones preferidas" . Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describen adicionalmente más adelante con referencia a las clases de aminoácidos, y pueden explorarse los productos .

Tabla 1 Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del polipéptido se logran seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura de la estructura del polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo, como una lámina de conformación helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con la similitud en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, Biochemistry segunda ed., pp. 73 a 75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) no polar: Ala (A), Val (V), Leu (L) , lie (I) , Pro (P) , Phe (F) , Trp (W) , Met (M) (2) polar sin carga: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gln (Q) (3) acídico: Asp (D) , Glu (E) (4) básico: Lys (K) , Arg (R) , His (H) Alternativamente, los residuos de origen natural pueden dividirse en grupos en base a las propiedades comunes de la cadena lateral : (1) hidrófoba: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrófila neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídica: Asp, Glu; (4) básica: His, Lys, Arg; (5) residuos que incluyen en la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromática: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservativas supondrán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase .

Cualquier residuo de cisterna no implicado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación aberrante. Contrariamente, el (los) enlace (s) de cisteína puede (n) agregarse al polipéptido para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) .

Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de región variable de un anticuerpo original (e.g., un anticuerpo humanizado). Generalmente, la(s) variante(s) resultante (s) seleccionada (s) para desarrollo posterior tendr (n) propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo original a partir del cual se genera (n). Una forma conveniente para generar tales variantes de sustitución implica maduración de afinidad utilizando visualización fago. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (e.g., sitios 6 y 7) se mutan para generar todas las sustituciones de aminoácido posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se despliegan de una manera monovalente a partir de partículas fago filamentosas como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes visualizadas por fago se exploran entonces por su actividad biológica (e.g., afinidad de enlace) como se describe en la presente. A fin de identificar los sitios de la región hipervariable candidato para su modificación, puede llevarse a cabo una mutagénesis de cribado de alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente al enlace al antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser benéfico analizar la estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el objetivo. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez generadas tales variantes, el panel de variantes se somete a cribado como se describe en la presente y pueden seleccionarse anticuerpos con propiedades superiores en uno o más análisis relevantes para su desarrollo posterior.

Otro tipo de variante de aminoácido del polipéptido altera el patrón original de glicosilación del anticuerpo. El polipéptido puede comprender moléculas no aminoácido. Por ejemplo, el polipéptido puede ser glicosilado. Tal glicosilación puede presentarse de manera natural durante la expresión del polipéptido en la célula huésped u organismos huésped, o puede ser una modificación deliberada que surge de la intervención humana. Por alterar se entiende suprimir uno o más residuos carbohidrato encontrados en el polipéptido, y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no se encuentran presentes en el polipéptido.

La glicosilación del polipéptido típicamente se encuentra enlazada a N o enlazada a O. Enlazada a N se refiere a la unión del residuo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del residuo carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación enlazada a 0 se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiamino ácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido se acompaña convenientemente por la alteración de la secuencia de aminoácidos de tal manera que contiene una o más de las secuencias de tripéptido antes descritas (para sitios de glicosilación enlazados a N) . La alteración también puede efectuarse por medio de la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación enlazados a O) .

El retiro de los residuos carbohidrato presentes en el polipéptido puede lograrse químicamente o enzimáticamente o mediante la sustitución por mutación de los codones que codifican para los residuos de aminoácido que sirven como objetivos para la glicosilación. La división enzimática de los residuos carbohidrato en los polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo y exo glicosidasas .

Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos glutaminilo y asparaginilo a los residuos glutamilo o aspartilo correspondientes, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos -amino de las cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina, la acetilación de la amina de terminación N y la amidación de cualquier grupo carboxilo de terminación C. (ii) Polipéptidos Quiméricos El polipéptido descrito en la presente puede modificarse de manera que forme moléculas quiméricas que comprenden el polipéptido fusionado a otra secuencia heteróloga de polipéptido o aminoácido. En algunas modalidades, una molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítope al cual puede enlazarse selectivamente el anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta de epítope se coloca generalmente en la terminación amino o carboxilo del polipéptido. La presencia de tales formas del polipéptido etiquetadas con epítope puede detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. También, la provisión de la etiqueta de epítope permite que el polipéptido se purifique fácilmente mediante purificación de afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se enlace a la etiqueta de epítope .

En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Una forma bivalente de la molécula quimérica se refiere como una "inmunoadhesina" .

Como se utiliza en la presente, el término 2inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpo que combinan la especificidad de enlace de un polipéptido heterólogo con las funciones de efector de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de enlace deseada que es diferente al reconocimiento del antígeno y el sitio de enlace de un anticuerpo (i.e., es "heteróloga" ) y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina es típicamente una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de enlace de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2) , IgE, IgD o IgM.

Las fusiones Ig incluyen preferentemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana suprimido o inactivado) de un polipéptido en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones de articulación CH2 y CH3, o de articulación, CHlf CH2 y CH3 de una molécula IgGl. (iii) Conjugados de Polipéptido El polipéptido para uso en formulaciones de polipéptido puede conjugarse a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (e.g., una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, de hongos, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos), o un isótopo radiactivo (i.e., un radioconjugado) .

Pueden utilizarse agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales conjugados. Adicionalmente, las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden utilizarse incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos no de enlace de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, nitrogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Una variedad de radionúclidos se encuentra disponible para la producción de polipéptidos radioconjugados . Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re. Los conjugados del polipéptido y el agente citotóxico se producen utilizando una variedad de agentes bifuncionales de acoplamiento a proteínas tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) (SPDP) , iminotiolano (IT) , derivados bifunctionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL) , ásteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoilo) hexanodiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (tales como tolieno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , -dinitrobenceno) . Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético ( X-DTPA) etiquetado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido al polipéptido.

También se contemplan en la presente los conjugados de un polipéptido y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como una caliqueamicina, maitansinoides , un tricoteno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.

Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló primeramente a partir del arbusto de África del este Maytenus serrata. Subsecuentemente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3. También se contempla el maitansinol sintético y sus derivados y análogos. Existen muchos grupos de enlace conocidos en la técnica para producir conjugados de polipéptido-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, los descritos en la Patente de E.U. No. 5,208,020. Los grupos de enlace incluyen grupos bisulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles al ácido, grupos foto-lábiles , grupos lábiles a peptidasa, o grupos lábiles a esterasa, como se describe en las patentes anteriormente identificadas, siendo preferidos los grupos bisulfuro o tioéter.

El enlazador puede estar unido a la molécula maitansinoide en varias posiciones dependiendo del tipo del enlace. Por ejemplo, un enlace éster puede formarse mediante la reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas convencionales de acoplamiento. La reacción puede presentarse en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, en la posición C-14 modificada con hidroximetilo, en la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y en la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición C-3 del maitansinol o de un análogo del maitansinol.

Otro conjugado de interés comprende un polipéptido conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia caliqueamicina de antibióticos tiene la capacidad de producir separaciones de ADN bicatenario a concentraciones sub-picomolares . Para la preparación de conjugados de la familia caliqueamicina, ver, e.g., la Patente de E.U. No. 5,712,374. Los análogos estructurales de caliqueamicina que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, ??1, a2t , 0Í31, N-acetil-??1, PSAG y T11. Otro fármaco anti- tumor al que puede conjugarse el anticuerpo es QFA que es un antifolato. Tanto caliqueamicina como QFA tienen sitios de acción intracelulares y no cruzan fácilmente la membrana de plasma. En consecuencia, la absorción celular de estos agentes a través de la internalización mediada por el polipéptido (e.g., anticuerpo) mejora en gran medida sus efectos citotóxicos .

Otros agentes anti-tumor que pueden conjugarse a los polipéptidos descritos en la presente incluyen BC U, estreptozoicina, vincristina y 5-fluoroacilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 así como esperamicinas .

En algunas modalidades, el polipéptido puede ser un conjugado entre un polipéptido y un compuesto con actividad nucleolítica (e.g., ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como desoxirribonucleasa, DNasa) .

Aún en otra modalidad, el polipéptido (e.g., anticuerpo) puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para su uso en la pre-dirección del tumor en donde el conjugado receptor del polipéptido se administra al paciente seguido por el retiro del conjugado no enlazado de la circulación utilizando un agente de limpieza y después la administración de un "ligando" (e.g., avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (e.g., un radionucleótido) .

En algunas modalidades, el polipéptido puede conjugarse a una enzima de activación de profármaco que convierte un profármaco (e.g., un agente quimioterapéutico de peptidilo) en un fármaco activo anticáncer. El componente de enzima del inmunoco jugado incluye cualquier enzima con la capacidad de actuar en un profármaco de tal manera que lo convierte en si forma citotóxica más activa.

Las enzimas que son útiles incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticáncer, 5-fluoroacilo; proteasas, tales como la serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como las catepsinas B y L) , que son útiles para convertir los profármacos que contienen péptido en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas , útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de aminoácido-D; enzimas de separación de carbohidratos tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con ß-lactam en fármacos libres; y amidasas de penicilina, tales como la amidasa de penicilina V o la amidasa de penicilina G, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas" , pueden utilizarse para convertir los profármacos en fármacos activos libres, (iv) Otros Otro tipo de modificación covalente del polipéptido comprende enlazar el polipéptido a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, e.g., polietilenglicol , polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El polipéptido también puede atraparse en micro-cápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, micro-cápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y micro-cápsulas de poli-(metilmetacrilato) , respectivamente) , en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, micro-esferas de albúmina, micro-emulsiones, nano-partículas y nano-cápsulas) o en macro-emulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Gennaro, A.R., Ed. , (1990).

IV. Obtención de Polipéptidos para uso en las Formulaciones y Métodos Los polipéptidos útiles en los métodos de purificación descritos en la presente pueden obtenerse utilizando métodos muy conocidos en la técnica incluyendo los métodos de recombinación. Las siguientes secciones proporcionan una guía referente a estos métodos .

(A) Polinucleótidos "Polinucleótido" o "ácido nucleico" como se utiliza de manera intercambiable en la presente, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN.

Los polinucleótidos que codifican para polipéptidos pueden obtenerse de cualquier fuente incluyendo, pero sin limitarse a, una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejidos que se considera poseen el ARNm del polipéptido y que lo expresan a un nivel detectable. Por consiguiente, los polinucleótidos que codifican para un polipéptido pueden obtenerse convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada de tejido humano. El gen que codifica para el polipéptido puede obtenerse también de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (e.g., síntesis de ácido nucleico automatizada).

Por ejemplo, el polinucleótido puede codificar para una cadena completa de la molécula de inmunoglobulina, tal como una cadena ligera o una cadena pesada. Una cadena pesada completa incluye no solamente una región variable de cadena pesada (VH) sino también una región constante de cadena pesada (CH) que típicamente comprenderá tres dominios constantes: CH1, CH2 y CH3 ; y una región de "articulación". En algunas situaciones, es deseable la presencia de una región constante .

Otros polipéptidos que pueden codificarse por el polinucleótido incluyen fragmentos de anticuerpo de enlace al antígeno tales como los anticuerpos de dominio único ("sANs"), Fv, scFv, Fab' y F(ab')2 Y "minibodies". Los minibodies son (típicamente) fragmentos de anticuerpo bivalentes a partir de los cuales se ha extirpado el domino CH1, CK O Cl. Debido a que los minibodies son más pequeños que los anticuerpos convencionales, éstos deben lograr mejor penetración en el tejido en el uso clínico/diagnóstico, pero siendo bivalentes deben retener mayor afinidad de enlace que los fragmentos de anticuerpo monovalentes tales como los dAbs . Por consiguiente, a menos que el contexto lo dicte de otra manera, el término "anticuerpo" como se utiliza en la presente abarca no solamente moléculas de anticuerpo completo sino también fragmentos de anticuerpo de enlace al antígeno del tipo tratado anteriormente. Preferentemente cada región de estructura presente en el polipéptido codificado comprenderá al menos una sustitución de aminoácido relativa a la estructura aceptor humana correspondiente. Por tanto, por ejemplo, las regiones de estructura pueden comprender en total, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones de aminoácido en relación a las regiones de estructura aceptor.

Adecuadamente, los polinucleótidos descritos en la presente pueden aislarse y/o purificarse. En algunas modalidades, los polinucleótidos son polinucleótidos aislados .

El término "polinucleótido aislado" pretende indicar que la molécula se retira o se separa de su ambiente normal o natural o que se ha producido de tal manera que no se encuentra presente en su ambiente normal o natural. En algunas modalidades, los polinucleótidos son polinucleótidos purificados. El término purificado pretende indicar que se han retirado al menos algunas moléculas o sustancias contaminantes .

Adecuadamente, los polinucleótidos se encuentran sustancialmente purificados, de tal manera que los polinucleótidos relevantes constituyen los polinucleótidos dominantes (i.e., más abundantes) presentes en una composición.

(B) Expresión de Polinucleótidos La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de polipéptidos mediante el cultivo de células transformadas o transíectadas con un vector que contiene polinucleótidos que codifican para el polipéptido. Por supuesto, se contempla que puedan emplearse los métodos alternativos, que son muy conocidos en la técnica, para preparar los polipéptidos. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos apropiada, o porciones de la misma, puede producirse mediante síntesis directa del péptido utilizando técnicas de fase sólida (ver, e.g., Stewart et al., Solid- Phase Peptide Synthesis (Síntesis de péptido en fase sólida) W.H. Freeman Co. , San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). La síntesis de proteína in vitro puede llevarse a cabo utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptido Applied Biosystems (Foster City, California) utilizando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del polipéptido pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse utilizando métodos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido deseado.

Los polinucleótidos como se describe en la presente se insertan en un vector (es) de expresión para la producción de los polipéptidos . El término "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operablemente enlazada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, promotores (e.g., promotores asociados naturalmente o heterólogos) , secuencias de señal, elementos mejoradores, y secuencias de terminación de transcripción.

Un polinucleótido está "enlazado operablemente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, los ácidos nucleicos para una pre-secuencia o guía secretoria están enlazados operablemente a ácidos nucleicos para un polipéptido si éste se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador está enlazado operablemente a una secuencia de codificación si se coloca a fin de facilitar la translación. Generalmente, "enlazado operablemente" significa que las secuencias de ácido nucleico que se enlazan son contiguas y, en el caso de una guía secretoria, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que estar contiguos. El enlace se logra mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se utilizan adaptadores o enlazadores sintéticos de oligonucleótido de acuerdo con la práctica convencional .

Para anticuerpos, las cadenas ligera y pesada pueden clonarse en los mismos o diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ácido nucleico que codifican para las cadenas de inmunoglobulina se encuentran enlazados operablemente a las secuencias de controlen el (los) vector (es) de expresión que asegura (n) la expresión de los polipéptidos de inmunoglobulina.

Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótido (e.g., las secuencias de codificación de cadena pesada variable y/o ligera variable y las secuencias de control de expresión opcionales) pueden transferirse a una célula huésped mediante métodos muy conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transíección de cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procarióticas , mientras el tratamiento de fosfato de calcio, la electroporación, la lipofección, la biolistica o la transfección en base viral pueden utilizarse para otros huéspedes celulares . (Ver generalmente Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio) (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed. , 1989) . Otros métodos utilizados para transformar células de mamífero incluyen el uso de poliestireno, fusión de protoplasto, liposomas, electroporación, y micro-inyección. Para la producción de animales transgénicos , los transgenes pueden micro-inyectarse en oocitos fertilizados, o pueden incorporarse en el genoma de mastocitos embrionarios, y los núcleos de tales células transferirse a los oocitos enucleados .

(C) Vectores El término "vector" incluye vectores de expresión y vectores de transformación y vectores de transporte.

El término "vector de expresión" significa una construcción con la capacidad de expresión in vivo o in vitro.

El término "vector de transformación" significa una construcción con la capacidad de transferirse desde una entidad a otra entidad - que puede ser de la especie o puede ser de una especie diferente. Si la construcción es capaz de transferirse de una especie a otra - tal como desde un plásmido de Escherichia coli hasta una bacteria, tal como el género Bacillus, entonces el vector de transformación se denomina algunas veces "vector de transporte" . Incluso puede ser una construcción con la capacidad de transferirse de un plásmido de E- coli a una Agrobacterium a una planta.

Los vectores pueden transformarse en una célula huésped adecuada como se describe más adelante para proporcionar la expresión de un polipéptido. Varios vectores se encuentran públicamente disponibles. El vector, por ejemplo, puede encontrarse en forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general el ADN se inserta en un sitio (s) de endonucleasa de restricción adecuado (s) utilizando técnicas conocidas en la técnica. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación estándar conocidas por el técnico experto.

Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores de plásmido, virus o fago provistos con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables muy conocidos en la técnica.

Estos vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huésped ya sea como episomas o como parte integral del ADN huésped cromosómico .

(D) Células Huésped La célula huésped puede ser, por ejemplo, una bacteria, una levadura u otra célula de hongo, célula de insecto, célula vegetal o una célula de mamífero.

Puede utilizarse un organismo huésped multicelular transgénico que se ha manipulado genéticamente para producir un polipéptido. El organismo puede ser, por ejemplo, un organismo transgénico de mamífero (e.g., una línea transgénica de cabra o ratón) .

Las procariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, eubacterias, tales como los organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como E. coli. Se encuentran públicamente disponibles varias cepas de E. coli tales como la cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); la cepa W3110 de E. coli (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células huésped procarióticas adecuadas incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (e.g., B. licheniformis 41P) , Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces . Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110 es un huésped o huésped de origen particularmente preferido debido a que es una cepa huésped común para fermentaciones de productos de polinucleótido recombinante . Preferentemente, la célula huésped secreta mínimas cantidades de enzimas proteolíticas . Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para efectuar una mutación genética en los genes que codifican para polipéptidos endógenos al huésped, incluyendo ejemplos de tales huéspedes la cepa 1A2 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA; la cepa 9E4 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 ; la cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55,244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan1; la cepa 37D6 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan1; la cepa 40B4 de E. coli W3110, que es la cepa 37D6 con una mutación de supresión degP no resistente a la canamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante. Alternativamente, son adecuados los métodos de clonación in vitro, e.g., PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico.

En estos huéspedes procarióticos, pueden producirse vectores de expresión que típicamente contendrán secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (e.g., un origen de replicación) . Adicionalmente, se encontrará presente cualquier número de una variedad de promotores muy conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp) , un sistema promotor de beta-lactamasa, o un sistema promotor proveniente del lambda fago. Los promotores controlarán típicamente la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tendrán secuencias del sitio de enlace de ribosoma y lo similar, para iniciar y completar la transcripción y la translación.

Pueden utilizarse microbios eucarióticos para la expresión. Los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levadura son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican para el polipéptido. Saccaromyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico menor comúnmente utilizado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe; huéspedes Kluyveromyces tales como, e.g., K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574) , K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans , y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris; Candida; Trichoderma reesia,- Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y Aspergillus hosts tales como A. nidulans, y A. niger. Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente e incluyen, pero no se limitan a, levaduras con la capacidad de crecer en metanol seleccionadas del género que consiste de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Saccharomyces es un huésped de levadura preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresión (e.g., promotores), un origen de replicación, secuencias de terminación y lo similar, según se desee. Los promotores típicos incluyen 3-fosfoglicerato cinasa y otras enzimas glicolíticas . Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.

Además de los microorganismos, también puede utilizarse cultivo celular de células de mamífero para expresar y producir los polipéptidos como se describen en la presente y, en algunos casos se prefieren (Ver Winnacker, From Genes to Clones (De genes a clones) VCH Publishers, N.Y. N.Y. (1987) . Para algunas modalidades, pueden preferirse las células eucarióticas debido a que se han desarrollado en la técnica numerosas líneas de células huésped con la capacidad de secretar polipéptidos heterologos (e.g., inmunoglobulinas intactas) , e incluyen líneas de célula CHO, varias líneas de células Cos, células HeLa, preferentemente líneas de célula de mieloma, o células B transformadas o hibridomas . En algunas modalidades, la célula huésped de mamífero es una célula CHO.

En algunas modalidades, la célula huésped es una célula huésped vertebrada. Ejemplos de líneas celulares de huésped mamífero útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; línea de riñon embrionaria humana (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión) ; células de riñon de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/ -DHFR (CHO o línea CHO-DP-12) ; células sertoli de ratón; células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células caninas de riñon (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) ; células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI; células MRC 5; células FS4 ; y una línea de hepatoma humano (Hep G2) .

V. Formulaciones y Métodos para Producir las Formulaciones También se proporcionan en la presente formulaciones y métodos para producir la formulación que comprende los polipéptidos (e.g., anticuerpos) purificados mediante los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, el polipéptido purificado puede combinarse con un vehículo farmacéuticamente aceptable .

Las formulaciones de polipéptido, en algunas modalidades, pueden prepararse para su almacenamiento mezclando un polipéptido que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas.

"Vehículos" como se utiliza en la presente incluyen vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que son no tóxicos para la célula o mamífero que se expone a los mismos en las dosis y concentraciones empleadas . Frecuentemente el vehículo farmacéuticamente aceptable es una solución acuosa de pH amortiguado.

Los vehículos, excipiente o estabilizadores son no tóxicos a los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno,- catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menor que aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos; disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol, contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (e.g., complejos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) .

En algunas modalidades, el polipéptido en la formulación de polipéptido mantiene la actividad funcional.

Las formulaciones que van a utilizarse para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Las formulaciones en la presente también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que va a tratarse, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, además del polipéptido, puede ser deseable incluir en la formulación, un polipéptido adicional (e.g., un anticuerpo) . Alternativamente o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, una citosina, un agente inhibitorio del crecimiento, un agente anti-hormonal, y/o un cardioprotector . Tales moléculas se encuentran adecuadamente presentes en combinación en cantidades efectivas para el propósito pretendido.

V. Artículos de Fabricación Los polipéptidos purificados mediante los métodos descritos en la presente y/o las formulaciones que comprenden los polipéptidos purificados mediante los métodos descritos en la presente pueden estar contenidos dentro de un artículo de fabricación. El artículo de fabricación puede comprender un contenedor que contiene el polipéptido y/o la formulación de polipéptido. Preferentemente, el artículo de fabricación comprende (a) un contenedor que comprende una composición que comprende el polipéptido y/o la formulación de polipéptido descritos en la presente dentro del contenedor; y (b) un inserto de paquete con instrucciones para administrar la formulación a un sujeto.

El artículo de fabricación comprende un contenedor y una etiqueta o inserto de paquete en o asociados con el contenedor. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los contenedores pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor tiene o contiene una formulación y puede tener un puerto estéril de acceso (por ejemplo el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un obturador que puede perforarse por medio de una aguja hipodérmica de inyección) . Al menos un agente activo en la composición es el polipéptido. La etiqueta o inserto de paquete indica el uso de la composición en un sujeto con la guia específica referente a las cantidades de dosis y los intervalos del polipéptido y cualquier otro fármaco que se proporciona. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. En algunas modalidades, el contenedor es una jeringa. En algunas modalidades, la jeringa se encuentra contenida además dentro de un dispositivo de inyección. En algunas modalidades, el dispositivo de inyección es un auto-inyector.

Un "inserto de paquete" se utiliza para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosis, administración, contraindicaciones, otros productos terapéuticos que van a combinarse con el producto empacado, y/o advertencias concernientes al uso de tales productos terapéuticos .

VI. Modalidades ejemplares En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para purificar un polipéptido a partir de una composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes, comprendiendo dicho método a) cargar la composición sobre un material de cromatografía en una cantidad que excede la capacidad dinámica de enlace del material de cromatografía para el polipéptido, b) eluir el polipéptido del material de cromatografía bajo condiciones en donde los uno o más contaminantes permanecen enlazados al material de cromatografía, y c) depositar las fracciones que comprenden el polipéptido en el efluente de cromatografía proveniente de las etapas a) y b) .

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el polipéptido es un anticuerpo o inmunoadhesina .

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el polipéptido es una inmunoadhesina.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el polipéptido es un anticuerpo.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

Aún en una modalidad adicional de la modalidad anterior, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal de IgG.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el anticuerpo es un fragmento de enlace al antigeno .

Aún en modalidades adicionales de la modalidad anterior, el fragmento de enlace al antigeno se selecciona del grupo que consiste de un fragmento Fab, un fragmento Fab' , un fragmento F(ab')2, un scFv, un di-scFv, un bi-scFv, un (di, tri) -scFv en tándem, un Fv, un sdAb, un anticuerpo tri-functional , un BiTE, un diabody y un triabody.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el polipéptido se selecciona de una enzima, una hormona, una proteina de fusión, una proteína que contiene Fe, un inmunoconj ugado , una citosina y una interleucina .

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el al menos un contaminante es cualquiera o más de proteína de ovario de hámster chino (CHOP) , una proteína de célula huésped (HCP) , una proteína A lixiviada, carboxipeptidasa B, ácido nucleico, ADN, variantes del producto, proteína agregada, componente del medio de cultivo celular, gentamicina, fragmento de polipéptido, endotoxina y contaminante viral .

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el material de cromatografía se selecciona de un material en modo mezclado, un material de intercambio aniónico, un material de intercambio catiónico, un material de interacción hidrófobo, y un material de afinidad.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, la densidad de carga se encuentra entre aproximadamente 50 g/1 y aproximadamente 2000 g/1.

Aún en modalidades adicionales de la modalidad anterior, la densidad de carga se encuentra entre aproximadamente 200 g/1 y aproximadamente 1000 g/1.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, la composición se carga sobre el material de cromatografía aproximadamente a las capacidades dinámicas de enlace de los materiales de cromatografía para los uno o más contaminantes .

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, la composición se carga sobre el material de cromatografía a 20 veces la capacidad dinámica de enlace del material de cromatografía para el polipéptido.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el coeficiente de separación del material de cromatografía para polipéptido es mayor que 30.

Aún en modalidades adicionales de la modalidad anterior, el coeficiente de separación del material de cromatografía para el polipéptido es mayor que 100.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el método comprende además el uso de un amortiguador de carga y un amortiguador de elución.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el amortiguador de elución tiene una conductividad menor que la conductividad del amortiguador de carga.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el amortiguador de carga tiene una conductividad de aproximadamente 4.0 mS a aproximadamente 7.0 mS .

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el amortiguador de elución tiene una conductividad de aproximadamente 0.0 mS a aproximadamente 7.0 mS .

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el amortiguador de elución tiene una conductividad mayor que la conductividad del amortiguador de carga.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el amortiguador de carga tiene una conductividad de aproximadamente 4.0 mS a aproximadamente 7.0 mS .

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el amortiguador de elución tiene una conductividad de aproximadamente 5.5 mS a aproximadamente 17.0 mS.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, la conductividad del amortiguador de elución disminuye en un gradiente de aproximadamente 5.5 mS a aproximadamente 1.0 mS sobre aproximadamente 10 volúmenes de columna (CVs) .

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, la conductividad del amortiguador de elución disminuye en un gradiente de aproximadamente 5.5 mS a aproximadamente 1.0 mS sobre aproximadamente 15 CVs.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, la conductividad del amortiguador de elución disminuye en un gradiente de aproximadamente 10.0 mS a aproximadamente 1.0 mS sobre aproximadamente 5 CVs .

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, la conductividad del amortiguador de elución disminuye en un gradiente de aproximadamente 10.9 mS a aproximadamente 1.0 mS sobre aproximadamente 10 CVs.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el amortiguador de elución tiene un pH menor que el pH del amortiguador de carga.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el amortiguador de carga tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el amortiguador de elución tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el amortiguador de elución tiene un pH mayor que el pH del amortiguador de carga.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el amortiguador de carga tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el amortiguador de elución tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, la composición es un eluyente proveniente de una cromatografía de afinidad, una cromatografía de intercambio catiónico, una cromatografía de intercambio aniónico, una cromatografía en modo mezclado y una cromatografía de interacción hidrófoba.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, la cromatografía de afinidad es una cromatografía de proteína A.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el polipéptido se purifica adicionalmente .

Aún en modalidades adicionales de la modalidad anterior, el polipéptido se purifica adicionalmente mediante filtración de virus.

Aún en modalidades adicionales de la modalidad anterior, el polipéptido se purifica adicionalmente por una o más de una cromatografía de afinidad, una cromatografía de intercambio catiónico, una cromatografía de intercambio aniónico, una cromatografía en modo mezclado o una cromatografía de interacción hidrófoba.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, el polipéptido se concentra adicionalmente .

Aún en modalidades adicionales de la modalidad anterior, el polipéptido se concentra mediante ultrafiltración, diafiltración o una combinación de ultrafiltración y diafiltración.

En modalidades adicionales de la modalidad anterior, los métodos comprenden además combinar el polipéptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Todas las características descritas en esta especificación pueden combinarse en cualquier combinación. Cada característica descrita en esta especificación puede remplazarse por una característica alternativa que sirva para un propósito igual, equivalente o similar. Por tanto, a menos que se defina expresamente de otra manera, cada característica descrita es solamente un ejemplo de una serie genérica de características equivalentes o similares.

Detalles adicionales de la invención se ilustran por los siguientes Ejemplos no limitantes. Las descripciones de todas las referencias en la especificación se incorporan expresamente en la presente mediante la referencia.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos pretender ser puramente ejemplares de la invención y en consecuencia no deben considerarse limitantes de la invención en modo alguno. Los siguientes ejemplos y la descripción detallada se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Materiales y Métodos Los materiales y métodos para todos los Ejemplos se llevaron a cabo como se indica más adelante a menos que se anote de otra manera en el Ejemplo.

Cargas de alimentación de MAb Las cargas de alimentación de MAb para todos los ejemplos se seleccionaron a partir de lotes de cultivo celular industriales, piloto o a pequeña escala en Genentech (South San Francisco, CA, E.U.A.) . Después de un período de fermentación del cultivo celular, las células se separaron y el fluido clarificado se purificó mediante cromatografía de proteína A. El depósito de proteína A se utilizó para investigar el mecanismo de limpieza de impurezas . La Tabla 2 muestra las características de las cargas de alimentación para cada MAb utilizado en los ejemplos.

Tabla 2 Características de las cargas de alimentación de MAb La concentración del anticuerpo se determinó a través de absorbencia a 280 y 320 nm utilizando un espectrofotómetro UV visible (8453 modelo G1103A; Agilent Technologies; Santa Clara, CA, E.U.A.) o NanoDrop 1000 modelo ND-1000 (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, E.U.A. ). Las especies diferentes al anticuerpo (i.e., impurezas) fueron demasiado bajas en concentración para tener un efecto apreciable en la absorbencia UV. Según fue necesario, las muestras se diluyeron con un diluyente apropiado no interférente en el rango de 0.1 a 1.0 unidades de absorbencia. La preparación de la muestra y las mediciones UV se llevaron a cabo en duplicado y se registró el valor promedio. Los coeficientes de absorción del MAb variaron de 1.42 a 1.645/mg-ml-cm.

Cuantificación de la proteína de célula CHO huésped (CHOP) Se utilizó un ELISA para cuantificar los niveles de la proteína de célula huésped llamada CHOP. Se inmovilizaron anticuerpos anti-CHOP en pozos de placas de microtitulación.

Las diluciones de las muestras conteniendo CHOP, los estándares y controles se incubaron en los po20s, seguido por la incubación con anticuerpos anti-CHOP conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) . La actividad enzimática de HRP se detectó con o-fenilenodiamina, y la CHOP se cuantificó leyendo la absorbencia a 490 nm en un lector de placa de microtitulación. En base a los principios de ELISA intercalado, la concentración de peroxidasa correspondió a la concentración de CHOP. El rango de análisis para el ELISA fue típicamente de 5 a 320 ng/ml con variabilidad intra-análisis de < 10%. Los valores de CHOP se reportaron en unidades de ng/ml. Alternativamente, los valores de CHOP se dividieron entre la concentración de MAb y los resultados se reportaron en PPM (partes por millón, e.g., ng de CHOP/mg de MAb) . El ELISA de CHOP puede utilizarse para cuantificar los niveles totales de CHOP en una muestra pero no para cuantificar las concentraciones de proteínas individuales.

Condiciones Operativas de la Cromatografía Se obtuvieron resinas Capto Adhere y Capto MMC Capto Adhere de GE Healthcare (Uppsala, Suecia) . Se obtuvieron fuertes resinas de intercambio catiónico (Poros XS y Poros 50 HS) de Applied Biosystems (Address) . Todos los experimentos de cromatografía de laboratorio se llevaron a cabo utilizando un sistema de cromatografía AKTA FPLC de GE Healthcare (Uppsala, Suecia) utilizando software UNICORN.

Las columnas de laboratorio fueron de 0.66 cm de diámetro y de 10 a 20 cm de altura. Las columnas se equilibraron a las condiciones de operación especificadas de pH y conductividad antes de la carga. Después se cargaron depósitos de proteína A en la columna seguido por el amortiguador de elución según se requirió para eluir la proteína enlazada. El flujo continuo o eluato durante las fases de carga, sobrecarga y elución se recolectó como fracciones y después se analizó por impurezas. La densidad de carga de MAb varió de 100 a 1000 g por litro de la resina.

Análisis del Depósito de Cromatografía Los depósitos de flujo continuo durante las fases de carga, sobrecarga y elución se recolectaron en fracciones (1 volumen de columna cada una) y se analizaron por concentración de MAb, concentración de CHOP, agregados, proteína A lixiviada, ADN de CHO y rendimiento. Se generaron diagramas acumulativos como una función de las fracciones de depósito de elución. Se obtuvo el rendimiento acumulativo utilizando la Ecuación 1, en donde, para la fracción i, Ci es la concentración de MAb (mg/ml) , Vi es el volumen de la fracción (mi), Mp es la masa de proteína cargada (mg) .

Rendimiento del % acumulativo = y ? C * V¡ Ecuación 1 j = i 1 „m M P Cromatografía de Exclusión por Tamaño La heterogeneidad de tamaño de los anticuerpos monoclonales se determinó mediante un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento. Una columna TSK G3000SWXL SEC (diámetro = 7.8 mm, altura = 300 mm; número de parte 08541) fabricada por Tosoh Bioscience (Tokio, Japón) se operó a temperatura ambiente en un instrumento de HPLC serie 1200 (Agilent Technologies) y se utilizó para determinar los niveles relativos del monómero de MAb para las muestras recolectadas . La columna se operó a una tasa de flujo de 0.3 ml/min utilizando una fase móvil de 200 mM de fosfato de potasio, 250 mM de cloruro de potasio, pH 6.2. Se inyectaron 20 g del anticuerpo para cada muestra. Se utilizó absorbencia UV a 280 nm para monitorear la separación del monómero, las proteínas LMW y las proteínas HMV. Los porcentajes de monómero, proteínas LMW y proteínas HMV se analizaron manualmente utilizando software ChemStation (Agilent Technologies) .

Cuantificación del ADN de CHO El ADN de CHO en las muestras de producto se cuantificó utilizando PCR en tiempo real (TaqMan PCR) . El ADN de las muestras y los controles se extrajo primeramente utilizando el equipo Virus Biorobot de Qiagen. Las muestras, controles y el ADN estándar extraídos se sometieron a reacción de cadena de polimerasa en tiempo real (PCR) TaqMan utilizando iniciadores y sondas de PCR en una placa de 96 pozos con el sistema de detección de secuencia de ABI . Los iniciadores se definieron por un segmento de par base 110 de una secuencia de ADN repetitiva en el genoma Cricetulus griseus . La sonda se etiquetó con un tinte informante fluorescente en el extremo 5' y un tinte de templado en el extremo 3'. Cuando la sonda está intacta, el espectro de emisión del informante se suprime por el de templado. La actividad de nucleasa en 5' de la polimerasa hidroliza la sonda y libera el informante, lo cual da como resultado un incremento en la emisión de fluorescencia. El detector de secuencia cuantificó el producto amplificado en proporción directa al incremento en la emisión de fluorescencia medida de manera continua durante la amplificación del ADN. Se calcularon los números de ciclo a los cuales se había amplificado el ADN más allá del umbral (CT) para la curva estándar. Se generó una curva estándar variando de 1 pg/mL a 10,000 pg/mL, que se utilizó para cuantificar el ADN en las muestras .

Cuantificación de la Proteína A Lixiviada El nivel de la proteína A lixiviada en los depósitos de proteína A se determinó mediante un ELISA intercalado de proteína A. Se inmovilizaron anticuerpos de proteína A de pollo anti-estafilococo en pozos de placa de microtitulación. El procedimiento de tratamiento de la muestra incluyó la dilución de la muestra y después la disociación del complejo de proteína A/IgG utilizando microondas ayudó al calentamiento como una etapa de pre-tratamiento antes de correr las muestras en un ELISA intercalado. La proteína A, si se encontró presente en la muestra, se enlazó al anticuerpo recubierto. La proteína A enlazada se detectó utilizando anticuerpos anti-proteína conjugados a peroxidasa de rábano. La actividad enzimática de la peroxidasa de rábano se cuantificó con una solución de sustrato TBM de 2 componentes que produce una señal colorimétrica .

Acondicionamiento de las Cargas de Alimentación Las cargas de alimentación utilizadas para los experimentos en este estudio fueron ya sea frescas o se retiraron de un almacenamiento en frío (2 a 8°C o -70°C) y se dejaron equilibrar a temperatura ambiente. Subsecuentemente, se ajustó su pH y/o conductividad según fue necesario utilizando un agente de titulación (1.5 M de Tris base o 1 M de ácido acético) o diluyente (agua purificada, 5 M de cloruro de sodio, o 5 M de acetato de sodio) . Todas las cargas de alimentación se filtraron a 0.2 µp? utilizando un Millipak 20 (Millipore) , AcroPak TM 20 (Pall Corporation) o un filtro de vacío (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, E.U.A. ) .

Cribado de alto rendimiento Se utilizó un robot Tecan Freedom Evo 200 (Tecan US, Research TRiangle Park, NC) para manipulación del líquido y la resina. Se utilizó una placa de filtro de 96 pozos (Seahorse 800 µ? polipropileno, placas cortas de filtro de goteo de 0.45 µp?, E&K Scientific EK-2223) para incubar la resina con la proteína y amortiguador. Después de incubar la solución de proteína con la resina, la placa de filtro se centrifugó a 1200 x g durante 3 minutos para separar la solución de la resina. Para cada etapa, 900 mL de la solución se pusieron en contacto con 50 mL de resina, dando como resultado una proporción de volumen de fase de 6:1. Cada pozo se equilibró al pH y concentración de acetato de sodio, apropiados. El pH varió de 5.00 a 7.5 a intervalos de unidad de pH de 0.5 8se utilizó acetato para amortiguar las condiciones del pH de 5.00 a 5.5, se utilizó MES para amortiguar las condiciones del pH de 6.00 a 6.5, y se utilizó MOPS para amortiguar las condiciones de 7.00 a 7.5). Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente . Se utilizó un depósito de proteína A parcialmente purificado, concentrado a 5 g/1 o 97 mg/ml, y con intercambio de amortiguador a 15 mM de NaOAc, como la carga para estos experimentos. Se estimuló la resina a 5 g/1 para los experimentos para determinar los valores Kp del producto. Sin embargo, para la capacidad de enlace del producto real la resina se estimuló a 97 g/1. La solución filtrada se capturó en una placa de recolección y después se analizó utilizando el lector de placa Infinite M200. La proteína enlazada se desprendió subsecuentemente de la resina utilizando dos etapas de 2 M de un amortiguador de NaCl para cerrar el balance de masa.

Estudios de Limpieza de Virus El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de retiro del virus del Capto Adhere para los 2 modelos de virus (MMV y X-MuL V). Las columnas, 0.66 cm de diámetro, se empaquetaron con las resinas sin tratamiento a una altura de lecho de 20 cm. La alimentación de MAb se adicionó con virus al 1% y después se procesó sobre la resina Capto Adhere . Los depósitos se recolectaron inmediatamente y las muestras de carga y elución se analizaron por cuentas virales. Se realizaron múltiples diluciones con medio completo (1:10 y 1:100) para determinar cualquier potencial interferencia entre los componentes del amortiguador y los virus .

E emplo 1. Cribado de Alto Rendimiento Este ejemplo describe métodos de cribado de alto rendimiento para determinar las capacidades de unión del material de cromatografía. El cribado de alto rendimiento se llevó a cabo sobre la resina Capto Adhere bajo condiciones de unión por lote para el anticuerpo monoclonal Mab3.

Los resultados del cribado de alto rendimiento de las condiciones de unión se presentan en la Figura 1. En respuesta a las figuras de superficie (Figuras 1A y IB) , las regiones de unión al producto se indican en rojo (región 8 de la Figura 1A y región 7 en la Figura IB) y el producto, e.g., polipéptido, regiones sin unión son verdes, (indicada como la región 1) . Los contenidos de la proteína celular huésped (HCP) actual (ng/mg) en el sobrenadante se muestran en el diagrama de contorno de la Figura 1C. Se muestra en la Figura 1A el producto Kp como una función de pH y una concentración de contraión para MAb3. La resina se cargó a 5 g/1 y se analizaron los datos sin procesar utilizando un modelo de superficie de respuesta. El modelo se utilizó entonces para estimar el Kp para cualquier combinación de pH y concentración de contraión en el espacio experimetal. Los datos mostraron que a medida que se incrementa el pH y a medida que se incrementa la conductividad, se incrementa log Kp. Los incrementos en log Kp reflejan los incrementos en la unión del producto a la resina. A fin de encontrar la capacidad de unión del producto actual sobre la resina, la resina se probó a 80 g/1 a 48 diferentes condiciones que combinan diferentes pH y concentraciones de contraión (Figura IB) . También se analizó el sobrenadante de la misma placa experimental para HCP (ng/mg) y los datos se graficaron en la forma de contorno (Figura 1C) . Un depósito de Proteína A parcialmente purificada que contiene varios miles de ppm de CHOP se utilizó como una carga para los experimentos de cribado de alto rendimiento. Las regiones verdes (región 1) en la figura indican la cantidad inferior de CHOP en el sobrenadante y las regiones rojas (región 8 de la Figura IB y región 9 de la Figura 1C) indican una cantidad mayor de CHOP en el sobrenadante.

El diseño de espacio para condiciones óptimas de carga y elución pueden determinarse a partir del CHOP y los diagramas de contorno de los datos de unión. Estos diagramas permiten el diseño de ya sea un modo de operación de flujo continuo o un modo de operación de unión y elución. Las condiciones de carga para un Cromatografía completa de flujo continuo son generalmente condiciones en donde se minimiza la unión del producto, e.g., unión de polipéptido y se maximiza la unión de impurezas (CHOP) . Las regiones verdes de sobreposición completa (región 1) entre las Figuras IB y 1C sugieren que es posible un modo F/T. Sin embargo, la región verde (región 1) en este diagrama es una región en donde la conductividad es realmente baja ~l mS . Tales condiciones requieren aproximadamente 4 veces la dilución del depósito de Proteína A dando como resultado pruebas potenciales de ajuste de la planta a escala.

Las regiones rojas (región 7 en Figura IB y región 8 en Figura 1C) indican las regiones de unión tanto para MAb como CHOP. Existen algunas regiones rojas de sobreposición en ambos diagramas. Sin embargo, la Figura IB muestra que, dentro de los pHs y concentraciones de contraión operables, fue posible una capacidad de unión máxima de 55 g/1. Para un proceso de alta valoración con un titulo de cultivo celular de ~3.5 g/1, se necesitaría una columna de 1000 1 para recuperar todo el producto, tal como un polipéptido, se tendría que llevar a cabo en un ciclo o múltiples ciclos sobre una columna más pequeña.

En un modo OEC, puede seleccionarse una condición de carga en base al comportamiento de las impurezas (e.g., CHOP) sobre la columna. La cantidad de MAb que se une a la columna no es preocupante debido a que el MAb unido puede recuperarse mediante la fase de elución. De este modo existe un espacio experimental completo para diseñar la condición de carga a fin de obtener una máxima eliminación de impurezas sin limitarse por la capacidad de unión del producto de resina. Aunque el modo de unión y elución permiten 55 g/1 de densidad de carga, el OEC permite aproximadamente una capacidad de carga 10 veces mayor permitiendo mediante esto la implementación de una columna más pequeña la cual a su vez puede reducir el costo de la resina por gramo del producto y ofrecer un buen ajuste de la planta.

Ejemplo 2. Modo OEC optimizado Los datos HTS se utilizaron para la determinación del parámetro para operar en un modo OEC. En base a los requerimientos de densidad de carga, el ajuste de planta y la eliminación de impurezas, se seleccionaron las condiciones de carga para MAb 3 para ser de pH 6.5 y 5.5 mS/cm. La densidad de carga para la prueba de la cromatografía optimizada mostrada en la Figura 2 fue 180 g/1. Fueron aproximadamente 50 g/1 de la unión del producto de polipéptido a la resina durante la fase de carga. El depósito de producto se recolectó iniciando a aproximadamente 0.5 OD, y el producto se sobrecargó sobre la resina hasta 180 g/1. Después que se completó la fase de carga, se utilizó la fase de elución con un amortiguador de baja conductividad de 1 mS/cm (amortiguador de elución: 20 mM MES pH 6.5) para eluir la proteína unida dando como resultado una reducción de volumen del recipiente de 10-15% comparada con la cromatografía de flujo continuo. El rendimiento y la eliminación de impurezas para esta prueba de cromatografía se muestran en la Figura 3. Ejemplo 3. Optimización de Carga Este estudio se condujo para comparar los datos HTS y los datos de desempeño de la columna actual en el modo de operación OEC. Las columnas se cargaron a tres diferentes pHs . Se seleccionó el pH 6.5 para ser la mejor condición en base a la eliminación de CHOP inicial y los datos de rendimiento. Las concentraciones de CHOP en los depósitos variaron desde 900 hasta 50 hasta 400 ppm como una función del pH de carga. A partir de este estudio, se determinó el pH 6.5 para ser la mejor condición para la carga de la composición. Además, aunque no se optimizó el rendimiento, también el pH 6.5 proporcionó un rendimiento máximo (Figura 3, Tabla 3) .

Tabla 3 Optimización de la condición de carga para un modo OEC Ejemplo 4. Optimización de la Elución Este estudio se condujo para optimizar las condiciones de elución para OEC. A fin de recuperar el producto (MAb 3, ~50 g/1) que se unió durante la fase de carga, se pasaron algunos volúmenes de columna del amortiguador de lavado (50 nM MES, 30 mM Acetato de Na, pH 6.5, ~5.5 mS/cm) a través de la columna después que se completó la fase de carga. Se observó una gran cantidad de residuos, dando como resultado un incremento en el volumen del depósito al final de la fase de carga. El incremento en el volumen del depósito fue de aproximadamente 45% utilizando un amortiguador de lavado con un pH y conductividad similares que el amortiguador de carga. Este incremento en el volumen del depósito puede dar como resultado retos del ajuste de planta (Figura 4) .

El objetivo del estudio de optimización de la elución fue obtener un rendimiento máximo con el CHOP mínimo y reducción máxima del volumen del depósito. La fase de elución se desarrolló para eluir los 50 g/1 del producto unido a partir de la columna. La Figura 5 muestra la fase de elución de los cromatogramas . El amortiguador de conductividad inferior eluye el producto de la columna dentro de 2 volúmenes de columna dando como resultado un mayor rendimiento y menor volumen del depósito (Tabla 4) . Por otro lado, los amortiguadores de elución de mayor conductividad, dan como resultado residuos mayores a 8 volúmenes de columna. Como se muestra en la Tabla 4, el CHOP del depósito fue menor de 20 ppm en todos los amortiguadores de elución probados. Por lo tanto, se seleccionaron 20 mM MES como el amortiguador de elución para incrementar el rendimiento y minimizar los residuos .

Tabla 4 Optimización de elución por OEC Ejemplo 5. Análisis de Impureza sobre OEC Se analizaron las fracciones de OEC para impurezas. La Figura 6A muestra las concentraciones MAb y niveles CHOP en fracciones recolectadas durante la fase de carga y durante la fase de elución. Durante la fase de carga, CHOP permaneció entre 20-25 ppm y durante la fase de elución en donde solo se eluyó el MAb unido, disminuyeron los niveles de CHOP fraccional. El análisis acumulativo demuestra que el CHOP y otras impurezas permanecen bastante consistentes a través de toda la carga y las fases de elución (Figura 6B) . La densidad de la carga para esta prueba fue 180 g/1. También se estudió la eliminación del virus, utilizando X- MuLV y MMV como modelos de virus para la misma densidad de carga (Tabla 5) . Para este experimento el pH de la carga fue 6.5 y la conductividad de la carga fue 5.5 mS/cm. Las condiciones de elución fueron 20 mM MES pH 6.5 y conductividad de ~1 mS/cm.

Tabla 5. Eliminación del virus por cromatografía de modo OEC Ejemplo 6. Determinación de la Capacidad Máxima de Unión de Impurezas Para encontrar la capacidad máxima de unión de impurezas sobre la resina cargada con MAb3 mediante el modo OEC, la resina Capto Adhere se probó a 1000 g/1 con el depósito de Proteína A. El amortiguador de carga fue pH 6.5, ~5.5 mS/cm; el amortiguador de elución fue 20 mM MES pH 6.5, ~1 mS/cm. Se recolectó la muestra del depósito cada 50 g/1 y se analizó para CHOP y concentración de proteína (Figura 7) . Para las densidades de carga de hasta 800 g/1, CHOP no se separó y el CHOP en el eluato fue menor de 20 ng/mg.

Ejemplo 7. Implementación a Escala Piloto Se implemento el modo de operación OCE en columnas de escala piloto que varían en tamaño desde 1.6 1 hasta 10.8 1. Los diámetros de columna variaron desde 10 cm hasta 25 cm con alturas de lecho que varían desde 20-22 cm (Tabla 6) . Las muestras se cargaron a pH 6.5, ~5.5 mS/cm y se eluyeron con 20 mM MES pH 6.5, ~1 mS/cm. Las pruebas del rendimiento a través de la escala piloto se muestran en la Figura 8. Las densidades de carga en las pruebas de la escala piloto cubrieron un rango de densidades de carga en cualquier lugar desde 70 hasta 180 g/1. A través de todas las densidades de carga, se logró un rendimiento promedio del 94%. No existió impacto sobre el rendimiento a través del rango de densidades de carga probadas. A través de todas las pruebas de la escala piloto, el CHOP del depósito del modo OEC fue menor a 25 ppm el cual se eliminó entonces corriente abajo a <2 ppm de CHOP en el producto de polipéptido final (depósito UFDF) (Tabla 7). En promedio, existió aproximadamente 1.1% de reducción en las proteínas HMW a través de todas las pruebas de la escala piloto (Tabla 8) y 0.19% de reducción en las proteínas LMW a través de todas las pruebas de la escala piloto (Tabla 9) . 5 Tabla 6 Tamaño de columna Adhere Capto para pruebas a escala piloto 15 Tabla 7. Datos de CHOP a Escala Piloto * CHOP después de filtración profunda a pH 6.5 HCCF es fluido de cultivo celular cosechado 25 Tabla 8. % Promedio de reducción de proteínas HMW a través de 12 Pruebas a escala piloto Prom. % HMW Reducción de proteína | 0.95 ± 0.49 Tabla 9. % Promedio de reducción de proteínas LMW a través de 12 Pruebas a escala piloto Prom. % LMW Reducción de proteína | 0.19 ± 0.08 ADN de CHO y Proteína A lixiviada fueron menos detectables en el depósito después de OEC Ejemplo 8. Implementación a Escala de Fabricación Se implemento el modo de operación OEC sobre una columna a escala de fabricación con un tamaño de 157 1 (100 cm de diámetro x 20 cm de altura) . A la escala de fabricación, la columna se cargó a ~96 g/1. El % de rendimiento a través de las dos pruebas a la escala de fabricación fue >95% para ambas pruebas. A través de todas las pruebas a escala de fabricación, el CHOP del depósito del modo OEC fue menor a 17 ppm (Tabla 10) el cual se eliminó corriente abajo a menos del nivel detectable de CHOP. En promedio, existió aproximadamente 1.1% de reducción en HMWs, 0.1% de reducción en LMWs, y 1.65% de reducción en acídicos a través de las dos pruebas de escala de fabricación.

Tabla 10. Datos de CHOP a Escala de Fabricación El ADN de CHO y la Proteína A lixiviada fue menos que detectable en el depósito después del modo OEC.

Ejemplo 9. Aplicabilidad de OEC a otros MAbs Se utilizaron los depósitos de Proteína A como cargas para estas pruebas. Se seleccionaron las condiciones de carga y elución a fin de permitir el modo OEC. Se muestran las densidades de carga, % de rendimiento, unión MAb a la resina (g/1) , impurezas en la carga y depósito en las siguientes tablas (Tabla 11, 12, 13 y 14) .

Tabla 11. Aplicabilidad de OEC a otros MAb: CHOP Tabla 12. Aplicabilidad de OEC a otros MAb: % proteínas HMW Tabla 13. Aplicabilidad de OEC a otros MAb: % de proteína A lixiviada Tabla 14. Aplicabilidad de OEC a otros MAb: ADN de CHO Ejemplo 10. Modos de operaciones de cromatografía AEX en base a valores Kp En la cromatografía completa de flujo continuo (F/T) , Kp es<0.1 y no existe proteína de unión a la resina. En la cromatografía de partición débil (WPC) , Kp es 0.1 a 20 y existe partición débil entre el producto y el medio de cromatografía. En un modo de unión y elución, el producto se une fuertemente a la resina, y Kp es >100 pero la densidad de carga se limita a la capacidad de unión del producto. Sin embargo, en un modo de sobrecarga y elución de la cromatografía (MAb 3) , se descubrieron las condiciones de carga de tal manera que el producto y las impurezas Kp fueron >100 y aunque el producto fluye a través después de alcanzar su capacidad de unión, las impurezas conservan la unión a la resina y no se rompen hasta que alcanzan su capacidad de unión, la cual puede ser mayor que la capacidad de unión del producto .

Se descubrieron las condiciones de elución de tal manera que el producto de polipéptido es Kp<2. Se recuperó el producto de unión pero la mayoría de las impurezas permanecen unidas (impureza KP>100) . Como tal, este modo permite la buena eliminación de impurezas mientras proporciona muy alto rendimiento (e.g., ~95 ) (Tabla 15).

Tabla 15. MAb 3 como un anticuerpo modelo en resina Capto Adhere Los cromatogramas a partir de las pruebas de columna bajo condiciones de partición débil (Kp = 2.4) y condiciones de sobrecarga y elución (Kp>100) muestran los efectos de incrementar mAb Kp en las regiones de rompimiento del producto del cromatograma (Figura 9) . Condiciones de carga de WPC: pH 5.5, 4.4 mS/cm; Condiciones de lavado de WPC: 20 mM Acetato pH 5, 4.4 mS/cm. Condiciones de carga de OEC: pH 6.5, 5.5 mS/cm; Condiciones de elución de OEC: 20 mM MES pH 6.5, ~1 mS/cm.

Tabla 16. Análisis de una etapa de pulido AEX para un MAb que se une a la resina AEX en flujo típico a través de las condiciones de proceso Anticuerpo modelo: MAb 2 * Suponiendo 12,500 1 cosechados a valoración de 3.5 g/1 ** Resina CA a $3,500/1 Ejemplo 11. Aplicabilidad de OEC a diferentes resinas Dependiendo del pl de la molécula, OEC puede aplicarse a las siguientes Resinas Multimodo (Capto Adhere, QMA, MEP Hypercel, HEA Hypercel, PPA Hypercel, Capto MMC) . La unión de producto de polipéptido sobre la resina Capto Adhere fue de naturaleza más hidrófoba y el producto de unión puede eluirse de la columna al disminuir la conductividad del amortiguador de elución (Figura 5) . Sin embargo, el modo de unión del producto en la resina y la elución producto de la resina no se limita a las interacciones hidrófobas y así el modo de operación OEC puede utilizarse también ampliamente en otros materiales de cromatografía. La Tabla 17 demuestra que OEC puede aplicarse a otras Resinas CEX y resinas IEX. Los amortiguadores de elución fueron 20 mM MES a menos que se indique de otro modo. El potencial de OEC no se limita a las resinas anteriores y se están evaluando actualmente . El análisis de ruptura de MAb 3 sobre la resina QMA se muestra en la Figura 10. El análisis de ruptura de MAb 4 sobre la resina Capto Adhere se muestra en la Figura 11. El análisis de ruptura de MAb4 sobre la resina Capto MMC se muestra en la Figura 12. El análisis de ruptura de MAb 3 sobre la resina Capto Adhere se muestra en la Figura 13.

Tabla 17. Aplicabilidad de OEC a diferentes resinas **Condiciones de carga de poros XS MAb 3: pH 5.5, <6mS/cm Condiciones de elución: Amortiguador A - 50 mM acetato p] 5.5, ~3 mS/cm, Amortiguador B-350 mM acetato pH 5.5, ~2· mS/cm, Gradiente: 20-85% sobre 10 CVs, Depósito: 1-8 CVs Ejemplo 12. Elución de Gradiente sobre OEC Otro objetivo del estudio de optimización de elución fue evaluar el efecto de las condiciones de elución de gradiente en el modo OEC sobre la resina Capto Adhere. La fase de elución se desarrolló para eluir el producto de unión (Tabla 18) . En una prueba de elución de gradiente, pueden variarse, la resistencia iónica, pH, composición y concentración de la fase móvil en base a los requerimientos. La Tabla 18 muestra las condiciones de prueba: las condiciones tanto de la carga (pH y conductividad) como de la elución (pH y el gradiente de conductividad) . Todos los datos mostrados en la tabla se obtuvieron a partir de las pruebas de cromatografía cargadas a 150 g/1 de densidad de carga con MAb 3. Estas pruebas se hicieron como prueba del concepto para demostrar que puede llevarse a cabo la elución del gradiente sobre el modo OEC de cromatografía y puede optimizarse la pendiente del gradiente (concentración de la sal (mM) /Volumen de Columna) . Puede observarse que se reduce el % de HMWS por 38% sobre un promedio cuando se compara con la carga (Tabla 18) . CHOP se reduce a <20 ppm en una prueba de conductividad de 5.5 mS/cm y la mayor prueba de conductividad a 10 mS/cm, dando como resultado un depósito de CHOP de -150 ppm (Tabla 19) .

Tabla 18. Pruebas de Elución de Gradiente en OEC: datoa de % HMW Tabla 19. Pruebas de Elución de Gradiente en OEC: datos de CHOP

Claims (44)

REIVINDICACIONES

1. Un método para purificar un polipéptido a partir de una composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes, comprendiendo dicho método: a) cargar la composición sobre un material de cromatografía en una cantidad en exceso de la capacidad de unión dinámica del material de cromatografía para el polipéptido, b) eluir el polipéptido a partir del material de cromatografía bajo condiciones en donde el uno o más contaminantes permanece unido al material de cromatografía, y c) depositar las fracciones que comprenden el polipéptido en el efluente de cromatografía a partir de las etapas a) y b) .

2. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido es un anticuerpo o inmunoadhesina.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el polipéptido es una inmunoadhesina.

4. El método de la reivindicación 2 , en donde el polipéptido es un anticuerpo.

5. El método de la reivindicación 4 , en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo humano.

7. El método de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal IgG.

8. El método de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo es un fragmento de unión a antígeno.

9. El método de la reivindicación 8, en donde el fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un scFv, un di-scFv, un bi-scFv, un (di-tri) -scFv en tándem, un Fv, un sdAb, un anticuerpo tri- funcional, un BiTE, un diacuerpo o un triacuerpo.

10. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido es una enzima, una hormona, una proteína de fusión, una proteína que contiene Fe, un inmunoconjugado, una citosina o una interleucina .

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el al menos un contaminante es cualquiera de uno o más de la Proteína de Ovario de Hámster Chino (CHOP) , una proteína de célula huésped (HCP) , una proteína A lixiviada, carboxipeptidasa B, ácidos nucleicos, ADN, variantes de producto, proteína agregada, componente del medio de cultivo celular, gentamicina, fragmento de polipéptido, endotoxina y contaminante viral.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el material de cromatografía es un material de modo mezclado, un material de intercambio aniónico, un material de interacción hidrófoba, o un material de afinidad.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la densidad de carga se encuentra entre aproximadamente 50 g/1 hasta aproximadamente 2000 g/1.

14. El método de la reivindicación 13, en donde la densidad de carga se encuentra entre aproximadamente 200 g/1 hasta aproximadamente 1000 g/1.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde la composición se carga sobre el material de cromatografía a aproximadamente las capacidades de unión dinámica de los materiales de cromatografía para el uno o más contaminantes.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde la composición se carga sobre el material de cromatografía a 20 veces la capacidad de unión dinámica del material de cromatografía para el polipéptido.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde el coeficiente de partición del material de cromatografía para el polipéptido es mayor a 30.

18. El método de la reivindicación 17, en donde el coeficiente de partición del material de cromatografía para el polipéptido es mayor a 100.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde el método comprende además el uso de un amortiguador de carga y un amortiguador de elución.

20. El método de la reivindicación 19, en donde el amortiguador de elución tiene una conductividad menor a la conductividad del amortiguador de carga.

21. El método de la reivindicación 20, en donde el amortiguador de carga tiene una conductividad de aproximadamente 4.0 mS hasta aproximadamente 7.0 mS .

22. El método de la reivindicación 20, en donde el amortiguador de elución tiene una conductividad de aproximadamente 0.0 mS hasta aproximadamente 7.0 mS .

23. El método de la reivindicación 19, en donde el amortiguador de elución tiene una conductividad mayor a la conductividad del amortiguador de carga.

24. El método de la reivindicación 23, en donde el amortiguador de carga tiene una conductividad de aproximadamente 4.0 mS hasta aproximadamente 10.0 mS .

25. El método de la reivindicación 23, en donde el amortiguador de carga tiene una conductividad de aproximadamente 4.0 mS hasta aproximadamente 7.0 mS .

26. El método de la reivindicación 23, en donde el amortiguador de elución tiene una conductividad de aproximadamente 5.5 mS hasta aproximadamente 17.0 mS .

27. El método de la reivindicación 19, en donde la conductividad del amortiguador de elución disminuye en un gradiente desde aproximadamente 5.5 mS hasta aproximadamente 1.0 mS sobre aproximadamente 10 volúmenes de columna (CVs) .

28. El método de la reivindicación 19, en donde la conductividad del amortiguador de elución disminuye en un gradiente desde aproximadamente 5.5 mS hasta aproximadamente 1.0 mS sobre aproximadamente 15 CVs.

29. El método de la reivindicación 19, en donde la conductividad del amortiguador de elución disminuye en un gradiente desde aproximadamente 10.0 mS hasta aproximadamente 1.0 mS sobre aproximadamente 5 CVs .

30. El método de la reivindicación 19, en donde la conductividad del amortiguador de elución disminuye en un gradiente desde aproximadamente 10.9 mS hasta aproximadamente 1.0 mS sobre aproximadamente 10 CVs.

31. El método de la reivindicación 19, en donde el amortiguador de elución tiene un pH menor al pH del amortiguador de carga.

32. El método de la reivindicación 31, en donde el amortiguador de carga tiene un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 9.

33. El método de la reivindicación 31, en donde el amortiguador de elución tiene un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 9.

34. El método de la reivindicación 19, en donde el amortiguador de elución tiene un pH mayor que el pH del amortiguador de carga.

35. El método de la reivindicación 34, en donde el amortiguador de carga tiene un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 9.

36. El método de la reivindicación 34, en donde el amortiguador de elución tiene un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 9.

37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-36, en donde la composición es un eluyente de una cromatografía de afinidad, una cromatografía de intercambio catiónico, una cromatografía de intercambio aniónico, una cromatografía de modo mezclado o una cromatografía de interacción hidrófoba.

38. El método de la reivindicación 37, en donde la cromatografía de afinidad es una cromatografía de Proteína A.

39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-38, en donde el polipéptido se purifica adicionalmente .

40. El método de la reivindicación 39, en donde el polipéptido se purifica adicionalmente mediante filtración de virus .

41. El método de la reivindicación 39, en donde el polipéptido se purifica adicionalmente por una o más de cromatografía de afinidad, una cromatografía de intercambio catiónico, una cromatografía de intercambio aniónico, una cromatografía de modo mezclado y una cromatografía de interacción hidrófoba.

42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-41, en donde el polipéptido se concentra adicionalmente .

43. El método de la reivindicación 42, en donde el polipéptido se concentra mediante ultrafiltración, diafiltración o una combinación de ultrafiltración y diafiltración.

44. El método de cualquiera de las reivindicaciones 39-43, que comprende además combinar el polipéptido con un portador farmacéuticamente aceptable.