CN110054661A - 使用含丙烯酰胺的过滤器分离蛋白 - Google Patents

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Abstract

用于从含有感兴趣的蛋白(例如，抗体)的样品去除杂质(如蛋白聚集体)的新颖组合物。可以在蛋白纯化过程中的病毒过滤步骤之前使用这种组合物，以便去除聚集体且保护病毒过滤器免于淤塞，因此改进病毒过滤器容量。包括具有至少两种单体的共聚物的多孔固体支持物，其中所述单体中的至少一种包含丙烯酰胺且至少第二单体包含疏水性结合基团，其中所述固体支持物选择性结合蛋白聚集体，由此将感兴趣的单体蛋白与蛋白聚集体分离。可以在中性至高pH和高导电率条件下进行所述方法。

Description

使用含丙烯酰胺的过滤器分离蛋白
本申请是申请日为2014年11月6日、申请号为“201480067562.6”、发明名称为“使用含丙烯酰胺的过滤器分离蛋白”的申请的分案申请。
本申请要求2013年12月12日提交的美国临时申请序列号61/915,125的优先权，所述申请通过引用并入本文。
发明领域
本文公开的实施方案涉及使用含丙烯酰胺的过滤器从含有感兴趣的产物的生物药物制剂去除杂质(包括蛋白聚集体)的方法。
背景
用于蛋白纯化的常规方法通常涉及细胞培养方法，例如，使用经重组工程改造以产生感兴趣的蛋白(例如，单克隆抗体)的哺乳动物或细菌细胞系，随后为从细胞培养液移取细胞和细胞碎片的细胞收获步骤。细胞收获步骤通常随后为捕获步骤，其通常随后为一个或多个层析步骤，也称为精加工步骤(polishing steps)，通常包括阳离子交换层析和/或阴离子交换层析和/或疏水性相互作用层析和/或混合模式层析和/或羟基磷灰石层析中的一种或多种。在捕获步骤之后也可以包括病毒灭活步骤。抛光步骤通常随后为病毒过滤和超滤/渗滤，其完成纯化过程。参见，例如，Shukla等人, J. Chromatography B., 848 (2007)28-39; Liu等人, MAbs, 2010: Sep-Oct 2(5): 480-499。
病毒过滤步骤是蛋白纯化中的重要步骤，尤其是当期望产品用于诊断或治疗应用中时。病毒过滤步骤通常利用保留病毒颗粒、同时允许感兴趣的蛋白通过的病毒保留过滤器。实现有效的病毒过滤的挑战之一在于，一些杂质，尤其是蛋白聚集体，具有与病毒颗粒类似的大小。因此，蛋白聚集体最终淤塞或堵塞病毒保留过滤器，由此显著降低感兴趣的蛋白通过过滤器的流速。
杂质如蛋白聚集体在纯化过程的不同阶段形成，并且为了维持病毒保留过滤器的足够通量，需要在到达病毒保留过滤器之前去除蛋白聚集体。现有技术中已尝试实施基于疏水相互作用层析(HIC)介质的流通聚集体去除(参见例如美国专利号7,427,659)。但是，基于HIC的制备型分离具有窄应用性，这是因为通常方法开发难，操作窗口窄，并且缓冲液中所需的盐浓度高。
弱分配层析(WPC)是层析操作的另一种模式，其中产物结合比结合-洗脱层析情况下更弱，但比流通层析情况下更强(参见例如美国专利号8,067,182)；但是，WPC也具有与其相关的特定缺点，包括操作窗口窄和与结合-洗脱方法相比更低的杂质去除容量。
此外，选择性去除蛋白聚集体的最方便方式之一是通过使蛋白和/或其他生物分子的溶液在到达病毒保留过滤器前通过过滤介质，由此去除蛋白聚集体，允许所纯化的蛋白流过病毒保留过滤器。这种过滤器的实例可见于美国专利号7,118,675，其讨论在病毒过滤步骤前，使蛋白和病毒的溶液过滤通过吸附深度过滤器或带电荷或表面改性的膜。
此外，PCT公开号WO2010/098867讨论使用带负电荷的多孔介质用于去除蛋白聚集体，且PCT公开号WO2012/175156讨论基于聚酰胺的过滤器用于去除蛋白聚集体。最后，2013年3月4日提交的美国申请序列号13/783,941，US 20130245139 A1讨论使用包含阳离子交换基团的组合物用于去除蛋白聚集体，但是，其中描述的组合物仅在适合于阳离子交换层析的pH和导电率条件下操作良好。
概述
本文公开的实施方案提供用于从含有感兴趣的蛋白(例如，抗体)的样品去除杂质(如蛋白聚集体)的新颖组合物。因此，可以在蛋白纯化过程中的病毒过滤步骤之前使用这种组合物，以便去除聚集体且保护病毒过滤器免于淤塞，因此提高病毒过滤器容量。
本文描述的组合物相比于先前已知在病毒过滤步骤前使用以去除杂质(如蛋白聚集体)的组合物提供优点，因为它们可以在广泛范围的溶液条件下使用。
在一些实施方案中，所述组合物是带负电荷的。在其他实施方案中，所述组合物是中性的(疏水的)。
在一些实施方案中，所述组合物可以在低pH和低导电率条件下使用(例如，带负电荷的组合物)。在其他实施方案中，所述组合物可以在中性至较高pH和中度至高导电率条件下使用(例如，疏水性组合物)。
在一些实施方案中，提供从样品中的蛋白聚集体分离感兴趣的单体蛋白的流通方法，其中所述方法包括使所述样品与包含共聚物(其包含至少两种单体)的多孔固体支持物接触，其中所述单体中的至少一种包含丙烯酰胺，且至少第二单体包含疏水性结合基团，其中所述固体支持物选择性结合蛋白聚集体，由此从蛋白聚集体分离感兴趣的单体蛋白；且其中所述方法可以在有利于疏水性相互作用的条件(例如，中性至较高pH和中度至高导电率条件)下进行。
在一些实施方案中，疏水性结合基团选自乙基、丁基、己基、2-乙基己基、十二烷基、硬脂基、羟丙基、苯基和苄基。
在一个具体实施方案中，所述疏水性结合基团是苄基丙烯酰胺。
在一些实施方案中，根据本文描述的组合物的共聚物包含以下结构：
　　式A
其中x、y和z是该共聚物中的各单体的平均摩尔分数，且独立地范围为约0.01至0.99；
R1是选自乙基、丁基、己基、2-乙基己基、十二烷基、硬脂基、羟丙基、苯基和苄基的疏水性脂族或疏水性芳族结合基团；
R2是两种聚合物之间的衍生自选自丙烯酸酯类、丙烯酰胺类、甲基丙烯酸酯类、乙烯基醚类和苯乙烯类的可聚合的单体的不带电荷的脂族或芳族有机接头；且
m表示类似的共聚物链在接头的另一端连接。
在一些实施方案中，根据本文描述的组合物的共聚物包含以下结构：
　　式B
其中x和y是该共聚物中的各单体的平均摩尔分数，且独立地范围为约0.01至0.99；且R1是选自乙基、丁基、己基、2-乙基己基、十二烷基、硬脂基、羟丙基、苯基和苄基的疏水性脂族或疏水性芳族结合基团，其中所述共聚物经由共价键接枝至显示为矩形的固体支持物上。
在本文描述的各种结构中，所述疏水性结合基团是苄基丙烯酰胺。在某些实施方案中，提供过滤系列，其包括预过滤器、澄清过滤器、层析介质(例如，阳离子交换、阴离子交换)、膜吸附器和去除产品/过程污染物的病毒清除过滤器中的一种或多种。
在某些实施方案中，所述预过滤器包含多孔固体支持物，所述多孔固体支持物包含含有至少两种单体的共聚物，其中所述单体中的至少一种包含丙烯酰胺且至少第二单体包含疏水性结合基团。
附图简述
图1描绘了等高线图，其表明当对于不同pH和导电率值的IgG进料溶液在病毒过滤器的上游使用带负电荷的预过滤器时病毒过滤器Viresolve® Pro的通量。X-轴代表导电率(mS/cm)，且右侧Y-轴代表pH。
图2描绘了柱状图，其表明当在病毒过滤器的上游使用下列预过滤器时Viresolve® Pro (VPro)病毒过滤器的质量通量： 含有1.8% AMPS和3.0% AM的预过滤器(3)；含有1.5% AMPS和3.3% DMAM的预过滤器(4)；含有1.8% AMPS和3.0% DMAM的预过滤器(5)；含有2.1% AMPS和2.7% DMAM的预过滤器(6)；含有2.4% AMPS和2.4% DMAM的预过滤器(7)；含有4.8% AMPS和0% DMAM的预过滤器(8)；含有1.5% AMPS和3.3% BMA(9)；含有1.8% AMPS和3.0% BMA的预过滤器(10)；含有2.1% AMPS和2.7% BMA的预过滤器(11)；含有1.8% AMPS和3.0% IOA的预过滤器(12)；含有1.8% AMPS和6.0% IOA的预过滤器(13)；含有1.5% AMPS和3.3% HPMAM的预过滤器(14)和含有2.5% AMPS和2.3% HPMAM的预过滤器(15)。柱状图中的前两个柱描绘对照： 仅病毒过滤器(1)和无任何改性的预过滤器基膜(2)。X-轴代表预过滤器组合物，且Y轴代表在V75以kg IgG/ m2病毒膜过滤器计的质量通量。在3.1 cm2的预过滤器：病毒过滤面积比率为1:1。
图3描绘了这样的图，其表明对于各种预过滤器/病毒过滤器组合的缓冲液和蛋白溶液的体积vs.时间曲线(表2)。曲线的斜率对应于渗透率。X-轴代表时间(min)，且Y-轴代表体积(mL)。含有1.8% AMPS和3.0% AM的预过滤器(3)是显示在用于初始流量的相同缓冲液中存在IgG的情况下的渗透率增加的唯一系列。
图4描绘了柱状图，其代表各种预过滤器/病毒过滤器组合(x轴)的过滤系列的渗透率变化(y-轴，以LMH/psi计)(表2)，因为它们从仅缓冲液切换为相同缓冲液中的IgG溶液。包含含有1.8% AMPS和3.0% AM的预过滤器(3)的系列是显示在IgG存在的情况下的渗透率增加的唯一系列。
图5描绘了图3和4中对于含有丙烯酰胺的膜表面(预过滤器3)观察到的渗透率增加的可能机制的图示。预过滤器3/VPro组合(表2)的渗透率增加是由与带正电荷的IgG的离子相互作用导致的含有丙烯酰胺的独特带负电荷的水凝胶表面的结果。
图6描绘了在pH 4.0和在不同的溶液导电率(y-轴，mS/cm)的表3中的各种CEX表面改性膜对于IgG的静态结合容量(y-轴，以mg IgG/mL膜计)。膜3和17中小的、中性和亲水性的丙烯酰胺与CEX结合基团AMPS的存在得到独特的聚合物水凝胶，其在≤ 25 mS/cm的导电率提供更大的静态IgG容量。
图7描绘了在CEX结合条件下等效动态负载至膜之后，表3中的各种CEX表面改性膜(x轴)对于IgG的聚集体结合容量(y-轴，mg/mL)。使用等效负载后的CEX洗脱物以测定表4中的膜的IgG容量、通过分析型大小排阻色谱(SEC)的聚集体选择性，并计算聚集体容量。对于表3中的膜测量动态CEX聚集体容量以定量表3中的膜的聚集体选择性差异。
图8显示，具有更高聚集体容量的膜(表4，图7)倾向于提供更好的病毒过滤器(Viresolve® Pro)保护，由此使用实施例1中的方法得到更高的IgG质量通量(右侧Y-轴)。
图9是包括来自表4的膜3、16、5和8的进料负载溶液和洗脱物的归一化的SEC-HPLC覆盖的代表性色谱图(y-轴是UV230nm Ab，且x-轴以分钟计)。重叠显示，与无中性共单体的膜8和16或具有共单体DMAM的膜5相比，含有丙烯酰胺的膜3的洗脱物具有更高百分数的聚集体。该结果表明，丙烯酰胺的存在改进对于聚集体的膜选择性(从6-8.5分钟的更大峰面积)。
图10、11和12显示，与不含丙烯酰胺的膜5、6、7或8(表5，x-轴)相比，用2.5 % BAM、1.0%或2.0%丙烯酰胺改性的膜3和4(表5)提供病毒去除过滤器的更大保护(kg/m2，y-轴)(在pH 7.0和5 mS/cm，pH 7.5和15 mS/cm以及pH 6.0和25 mS/cm，更大的质量通量)。在3种溶液条件下，含丙烯酰胺的膜3和4还提供与病毒预过滤器(Viresolve®预过滤器)(主要是疏水性机制)类似的质量通量，和比Viresolve® Shield (CEX机制)好得多的通量。
图13显示了膜(3)(表5和6)比来自表6的市售的预过滤器和未改性的膜在pH 6.0和25 mS/cm提供病毒清除过滤器的更大保护(kg/m2，y-轴)。
图14(表7)显示了膜(3)与未预过滤的Vpro相比在降低压力增加(y-轴)以降低淤塞方面是有效的，并且在pH 7.0、4.2 mS/cm、15.3 g/L、0.22 mL/min (166 LMH)下提供VPro对于含有0.8%聚集体(通过SEC-HPLC)的MAb01的更大的质量通量(x-轴)。
图15(表7)显示了对于在pH 7.5、18 mS/cm、9.2 g/L、0.22 mL/min (166 LMH)下对于MAb05，与未预过滤的VPro相比，膜(3)保护VPro以通过降低压力(其指示淤塞)(y-轴)而使含有0.4%聚集体(通过SEC-HPLC)的MAb 05的质量通量(x-轴)改进4倍。
图16(表7)显示了对于在pH 7.0、8 mS/cm、8 g/L、0.22 mL/min (166 LMH)下对于含有4%聚集体(通过SEC-HPLC)的MAb07，与未预过滤的VPro病毒过滤和用由聚酰胺构成的未改性的膜过滤器(5)以及商业除菌级膜过滤器(4)相比，膜(3)保护VPro以通过降低压力增加(其指示淤塞)(y-轴)而提高质量通量(x-轴，kg/m2)。
详述
为了更容易理解本文公开的实施方案，首先定义某些术语。其他定义在整个详述中阐述。
I. 定义
本文中使用的术语“层析”是指在生物药学制剂中将感兴趣的产物(例如治疗性蛋白或抗体)与污染物和/或蛋白聚集体分离的任何种类的技术。
本文中可互换使用的术语“流通方法”、“流通模式”和“流通层析”是指产物分离技术，其中含有感兴趣的产物的生物药学制剂意欲流通过材料。在一些实施方案中，感兴趣的产物流通过材料，并且不期待的种类与材料结合。在本文描述的各个实施方案中，感兴趣的产物流通过含有丙烯酰胺的材料。在一个具体实施方案中，所述材料含有包含丙烯酰胺的共聚物，其中所述材料在蛋白纯化过程中的病毒过滤步骤前施用，即用作病毒过滤器。
本文可互换使用的术语“污染物”、“杂质”和“碎片”是指任何外源或者不适宜的分子，包括生物大分子如DNA、RNA、一种或多种宿主细胞蛋白、内毒素、脂质和一种或多种添加剂，所述添加剂可存在于含有待与一种或多种外源或者不适宜的分子分离的感兴趣产物的样品中。此外，这种污染物可包括可在分离方法前进行的步骤中使用的任何试剂。在一个特定实施方案中，本文所述的组合物和方法将蛋白聚集体与含有感兴趣产物的样品选择性分离。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法在病毒过滤步骤前使用，由此通过过滤器去除淤塞病毒保留过滤器且对感兴趣的蛋白的渗透率产生不利影响的蛋白聚集体和其他杂质。
术语“免疫球蛋白”、“Ig”或“抗体”(本文可互换使用)是指具有基础的四-多肽链结构的蛋白，该结构由两个重链和两个轻链构成，所述链例如通过链间的二硫键稳定，该蛋白具有特异性结合抗原的能力。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(本文可互换使用)是指具有二-多肽链结构的蛋白，该结构由一个重链和一个轻链构成，所述链例如通过链间的肽接头稳定，该蛋白具有特异性结合抗原的能力。术语“结构域”是指包含肽环(例如包括3-4个肽环)的重链或轻链多肽的球形区域，所述球形区域例如通过β-片层和/或链内的二硫键稳定。基于在“恒定”结构域的情况下各类成员的结构域中相对缺少序列变化、或在“可变”结构域的情况下各类成员的结构域中的明显变化，在本文中将结构域进一步称为“恒定的”或“可变的”。抗体或多肽“结构域”通常在本领域中可互换地被称为抗体或多肽“区域”。抗体轻链的“恒定”结构域可互换地被称为“轻链恒定区域”、“轻链恒定结构域”、“CL”区域或“CL”结构域。抗体重链的“恒定”结构域可互换地称为“重链恒定区域”、“重链恒定结构域”、“CH”区域或“CH”结构域。抗体轻链的“可变”结构域可互换地称为“轻链可变区域”、“轻链可变结构域”、“VL”区域或“VL”结构域。抗体重链的“可变”结构域可互换地称为“重链可变区域”、“重链可变结构域”、“VH”区域或“VH”结构域。
免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆的，并且以单体或多聚形式存在，例如以五聚形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚或多聚形式存在的IgA抗体。术语“片段”是指比完全或完整的抗体或抗体链包含更少的氨基酸残基的抗体或抗体链的部分。片段可通过对完全或完整抗体或抗体链的化学或酶处理而得到。片段还可通过重组方法得到。示例性片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc和/或Fv片段。
术语“抗原-结合片段”是指结合抗原或与完整抗体(即与它们来源于的完整抗体)竞争抗原结合(即特异性结合)的免疫球蛋白或抗体的多肽部分。结合片段可通过重组DNA技术、或通过完整的免疫球蛋白的酶或化学切割得到。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链和单链抗体。
本文中使用的术语“样品”是指任何含有待纯化的目标蛋白的组合物或混合物。样品可衍生自生物或其他来源。生物来源包括真核和原核来源，如植物和动物细胞、组织和器官。在一些实施方案中，样品包括含有待纯化的感兴趣的蛋白的生物药物制剂。在一个具体实施方案中，所述样品是含有待纯化的蛋白的细胞培养物进料。样品还可包括稀释剂、缓冲剂、洗涤剂和发现与目标蛋白或感兴趣的蛋白混合的污染性种类、碎片等。样品可以是“部分纯化的”(即已进行一种或多种纯化步骤，如过滤步骤)、或可从产生目标分子的宿主细胞或生物体直接得到(例如，样品可包括收获的细胞培养流体)。在一些实施方案中，进行本文所述的流通纯化方法的样品是来自结合-洗脱层析步骤，例如蛋白A亲和层析的洗脱物。
术语“病毒膜堵塞种类”或“病毒膜堵塞杂质”可指明显促进经设计以保留病毒颗粒的多孔膜(即，病毒过滤膜或病毒保留膜)的孔阻塞或淤塞的溶液的任何可溶性或溶解的组分。通常，这些种类的大小将大于感兴趣的蛋白，并且在一些情况下，可以与意欲由病毒膜保留的病毒颗粒的大小相当。
在各个实施方案中，本文提供的组合物意欲捕获这种病毒膜堵塞种类，并且在蛋白纯化过程期间的病毒保留膜前使用。在各个实施方案中，所述病毒膜堵塞种类包括蛋白聚集体。
本文可互换使用的术语“蛋白聚集体”或“蛋白聚集物”是指至少两分子感兴趣产物(例如治疗性蛋白或抗体)的缔合。至少两分子感兴趣产物的缔合可通过任何方式产生，包括但不限于共价、非共价、二硫化或不可还原的交联。
使用大小排阻层析(SEC)测量蛋白样品中的聚集体浓度，所述大小排阻层析是现有技术中公知且广为接受的方法(参见例如Gabrielson等人, J. Pharm. Sci., 96,(2007), 268–279)。使用UV吸光度在流出物中测量各分子量种类的相对浓度，而通过按照柱制造商的说明进行***校正而测定级分的分子量。
本文可互换使用的术语“二聚体”、“蛋白二聚体”或“蛋白二聚物”是指蛋白聚集体的低阶级分，其主要由含有两个单体分子的聚集体构成，但还可含有一些量的三聚体和四聚体。该级分通常观察为在主单体峰之前不久的SEC色谱图中的第一个可分辨的峰。
本文可互换使用的术语“高分子量聚集体”或“HMW”是指蛋白聚集体的高阶级分，即五聚体及更高聚集体。该级分通常观察为二聚体峰之前的SEC色谱图中的一种或多种峰。
本文中使用的术语“固体支持物”通常是指包括包含丙烯酰胺和疏水性结合基团的共聚物的任何材料(多孔或无孔的)。本文所述的方法和组合物中使用的固体支持物形式的实例包括但不限于膜、多孔珠、翅状纤维(winged fibers)、整料、层析树脂、纺织布和无纺布。
本文中使用的术语“选择性”是指；流动相和固定相之间的两种种类的分配系数的无量纲比值。分配系数(Kp)是比率Q/C，其中Q和C分别是结合蛋白浓度和游离蛋白浓度。
本文中使用的术语“疏水性结合基团”是指能够与另一疏水性表面分子间缔合(其被定义为疏水性相互作用)的非极性脂族或芳族有机“疏水性”残基。示例性疏水性基团是烷基、环烷基、卤代烷基、氟烷基、芳基等。在一个具体实施方案中，疏水性结合基团是苄基丙烯酰胺。
术语“中性至较高pH”是指从离子在水中的平衡(其为[H3O+][OH-] = 1.0 x 10-14，其中pH = - log [H3O+])测定的0-14的刻度的6或更大的pH。
术语“中度至高导电率”是指其中以毫西门子/厘米测量的离子电导率等于或通常大于5 mS/cm的溶液条件。溶液导电率是通过测定由固定距离分开的两个平面或圆柱形电极之间的溶液的电阻而测量的具有电解质的溶液的导电率。
术语“病毒预过滤器”或“预过滤器”是指病毒过滤器或病毒保留过滤器上游使用且用于通过去除过早堵塞病毒过滤器的杂质(例如，蛋白聚集体)而提高病毒过滤器的通量的正常流动过滤介质、膜或装置。
术语“病毒过滤器”或“病毒保留过滤器”是指通过大小排阻机制保留20-100 nm的量级的病毒或病毒颗粒以便在蛋白纯化过程期间提供病毒清除的膜或介质。病毒保留过滤器的实例包括Viresolve® Pro、Viresolve® NFP和Virosolve® NFR。
II. 示例性的固体支持物
本文公开的实施方案提供包含共聚物的固体支持物，其中所述单体中的至少一种是丙烯酰胺。本文描述的固体支持物结合堵塞病毒过滤器的种类或杂质，如蛋白聚集体，比结合通常为感兴趣产物的蛋白的单体形式更容易。不希望受任何理论束缚，考虑可以使用任何合适的固体支持物。例如，固体支持物可以是多孔或非多孔的，或者它可以是连续的，如以整料或膜的形式。固体支持物还可以是非连续的，如以颗粒、珠或纤维的形式。在任一种情况(连续或非连续的)下，固体支持物的重要特征是它们具有高比表面积、机械完整性、含水环境中的完整性和提供流体分布以确保可接近结合基团的能力。
示例性的连续多孔固体支持物包括微孔膜，即孔径在约0.05微米和10微米之间。可用于根据本文公开的实施方案的组合物和方法中的多孔膜可分类为性质上对称或非对称的，其是指遍及膜厚度的孔径均一性，或者对于空心纤维是遍及纤维的微孔壁的孔径均一性。本文中使用的术语“对称性膜”是指遍及膜的横截面具有基本均一的孔径的膜。本文中使用的术语“非对称性膜”是指平均孔径在膜横截面上不恒定的膜。在一些实施方案中，在非对称性膜的情况下，孔径可随着整个膜横截面的位置而均匀或不连续地变化。在一些实施方案中，非对称性的膜可具有一个外表面上的孔径对相反外表面上的孔径的比值，该比率基本上大于1。
从各种材料制得的各种微孔膜可用于本文所述的组合物和方法中。这些材料的实例包括多糖类、合成性和半合成性聚合物类、金属类、金属氧化物类、陶瓷类、玻璃及它们的组合。
可用于制造可用于本文所述的组合物和方法中的微孔膜的示例性聚合物包括但不限于取代或未取代的聚丙烯酰胺类、聚苯乙烯类、聚甲基丙烯酰胺类、聚酰亚胺类、聚丙烯酸酯类、聚碳酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、聚乙烯基亲水性聚合物类、聚苯乙烯类、聚砜类、聚醚砜类、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物类、芳族聚砜类、聚四氟乙烯类(PTFE)、全氟热塑性聚合物类、聚烯烃类、芳族聚酰胺类、脂族聚酰胺类、超高分子量聚乙烯类、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚醚酮类(PEEK)、聚酯类及它们的组合。
示例性的市售微孔膜是购自EMD Millipore Corp. (Billerica, MA)的Durapore®和Millipore Express®；和购自Pall Corp. (Port Washington, NY)的Supor®；和购自Sartorius Stedim Biotech S.A. (Aubagne Cedex, France)的Sartopore®和Sartobran®。
其他示例性的连续性固体支持物是整料，例如购自BIA Separations (Villach,Austria)的CIM®整体材料。
示例性的非连续性的固体支持物包括多孔层析珠。如本领域技术人员将容易认识到，层析珠可从各种各样的聚合性和无机材料，如多糖类、丙烯酸酯类、甲基丙烯酸酯类、聚苯乙烯类、乙烯基醚类、孔径受控的玻璃、陶瓷类等制造。
示例性的市售层析珠是来自EMD Millipore Corp.的CPG；来自GE HealthcareLife Sciences AB的Sepharose®；来自Tosoh Bioscience的TOYOPEARL®；和来自LifeTechnologies的POROS®。
其他示例性的固体支持物是机织和无纺的纤维材料，如纤维垫和毡、以及包装入合适的外壳的纤维，所述外壳例如层析柱、一次性塑料外壳等。示例性的固体支持物还包括翅状纤维。
III. 示例性的结合基团
在本文描述的各个实施方案中，组合物包含丙烯酰胺和结合基团的共聚物。
各种各样的结合基团或配体可与固体支持物连接，并用于从样品有效去除蛋白聚集体，如上所述。通常，结合基团应能够吸引并结合至溶液中的蛋白聚集体。蛋白与结合基团的吸引可以是任何类型的，包括离子性(阳离子交换基团)、极性、色散性、疏水性、亲和性、金属螯合性或范德华力性的。
示例性的离子性结合基团包括但不限于硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯、羧酸酯；伯胺、仲胺、叔胺和季铵；杂环胺，如吡啶、嘧啶、吡啶鎓、哌嗪等。
极性基团包括各种各样的包含极性化合物键，例如C-O、C=O、C-N、C=N、C=N、N-H、O-H、C-F、C-Cl、C-Br、C-S、S-H、S-O、S=O、C-P、P-O、P=O、P-H的化学实体。示例性的极性基团是羰基、羧基、醇、硫醇、酰胺、卤化物、胺、酯、醚、硫酯等。
在本文描述的一些实施方案中，本文描述的组合物包括丙烯酰胺和疏水性结合基团的共聚物。疏水性结合基团能够疏水性相互作用。示例性疏水性基团是烷基、环烷基、卤代烷基、氟烷基、芳基等。示例性芳基是苄基、苯基、萘基、甲苯基等。
亲和性结合基团是一致提供与目标蛋白的高特异性相互作用的几种结合官能团的排列。示例性的亲和性结合基团包括蛋白A和蛋白G及它们的结构域和变体。
在一些实施方案中，优选的结合基团是离子基团。在一个特定实施方案中，结合基团是带负电荷的磺酸酯基团。通常，带负电荷的磺酸酯基团具有几个优点。例如，它们在溶液中显示出对结合带正电荷的蛋白的宽应用性；化学法成本低，并且是直接的，其中容易得到许多合成制备方法；结合基团和蛋白之间的相互作用是公知的(参见例如Stein等人, J.Chrom. B, 848 (2007) 151–158)，并且相互作用可通过改变溶液条件容易地控制，并且这种相互作用可以与其他相互作用分离。
在一些实施方案中，优选的结合基团是疏水性基团。疏水性结合基团提供在较高离子导电率的条件(其中离子结合基团不太有效)下结合溶液种类的优点。在一个具体实施方案中，结合基团是芳族烃基，例如苄基，或者另外乙基、丁基、己基、2-乙基己基、十二烷基、硬脂基、羟丙基或苯基。
除了结合基团以外，所述固体支持物还可含有中性基团(例如，丙烯酰胺)，其与结合基团一起存在，并且充当以下中的任何一种或多种： 将结合基团分离至彼此之间的最佳距离，为多孔支持物提供水润湿性，降低样品和固体支持物之间的非特异性相互作用，控制水吸收和含有结合基团的聚合物结构的膨胀，为含有结合基团的聚合物结构提供合适的机械特性，改进聚合物结构与固体支持物的粘附，提供增加能力和/或选择性的与样品的次级相互作用。
示例性中性基团是醇类、糖类、乙二醇类、醚类、酰胺类、腈类等。优选的中性基团是简单的酰胺基，C(=O)-NH2。
IV.将结合基团连接至固体支持物的方法
在本文所述的组合物和方法中，合适的结合基团(例如，离子或疏水性结合基团)连接至固体支持物，以提供相对于感兴趣产物更大的结合蛋白聚集体的能力。
本文所述的组合物和方法基于以下出人意料且不可预见的发现：组合物中丙烯酰胺的存在显著增强固体支持物对于病毒膜堵塞种类(包括较大阶蛋白聚集体)的选择性。
本文所述的组合物和方法在流通模式中去除低阶蛋白聚集体，例如二聚体、三聚体和四聚体方面是特别有效的，与高阶聚集体，例如五聚体及更高阶聚集体相比，低阶蛋白聚集体通常较难以与蛋白的单体形式分离。
本领域已知的各种方法和本文所述的方法可用于将结合基团与本文所述的方法中使用的固体支持物连接。通常，成功连接的标准包括实现期望的结合基团密度和结合基团的低脱离速率(即结合基团的低浸出)。结合基团可与固体支持物直接连接，或可并入聚合分子，其进而可与固体支持物结合。或者，结合基团可并入施用于固体支持物上的交联涂层中，而在涂层和固体支持物之间不形成或形成化学键。
本领域中已知许多方法用于将结合基团连接至固体支持物(参见例如，Ulbricht, M., Advanced Functional Polymer Membranes, Polymer, 47, 2006, 2217-2262)。这些方法包括但不限于通过合适的偶联化学法，使用结合基团对固体支持物直接改性；吸附和连接聚合分子。后者可通过接枝“至”(当聚合物在与表面反应之前预制备时)或接枝“自”(当使用表面基团开始聚合反应时)而实现。
单体的反应性决定产生包含结合基团的聚合物中使用的单体的选择。各种单体类型的反应性和对于聚合物组合物的效果已深入研究并公开(参见例如，Polymer Handbook,第三版, John Wiley & Sons, 1989, p. II)。预测聚合物组成及其结构的公认的单体参数是单体的反应性比率(参见例如Odian, J., Principles of Polymerization, 第4版,John Wiley & Sons, 2004, p. 466)。
将离子或疏水性结合基团连接至固体支持物的一种优选方法是将结合基团并入施用于固体支持物上的交联涂层中的原位聚合反应。该方法公开于美国专利4,944,879和4,618,533、以及公开的美国专利公开US2009/208784中。该方法方便且经济。可用于降低疏水或带电荷的结合配体密度的中性单体可选自一大群丙烯酸、甲基丙烯酸和丙烯酰胺的单体，例如丙烯酰胺、丙烯酸羟丙酯、丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯酸羟乙酯。在本文所述的各个实施方案中，所述中性单体是丙烯酰胺。
包被于固体支持物上的含有结合基团的聚合物的代表性化学结构描绘于式A中。为了包被聚合物，通常将其与其他聚合物交联。在式A中，显示聚合物结构，其中R1是含有疏水性或阳离子交换基团的任何脂族或芳族有机残基，所述基团例如，选自乙基、丁基、己基、2-乙基己基、十二烷基、硬脂基、羟丙基、苯基和苄基的疏水性脂族或芳族有机基团，或选自磺酸、硫酸酯、磷酸、膦酸或羧酸基团的阳离子交换基团；R2是任何两个或更多个聚合物链之间的任何不带电荷的脂族或芳族有机接头，例如丙烯酸酯类、丙烯酰胺类、甲基丙烯酸酯类、乙烯基醚类和苯乙烯类。
在式A中绘制的聚合物结构中，x、y和z是该聚合物中的各单体的平均摩尔分数，且独立地范围为约0.01至0.99；且m表示经由接头连接第二聚合物。
接枝至固体支持物的含有结合基团的聚合物的代表性化学结构描绘于式B中。在式B中，显示聚合物结构，其中R1是含有疏水性或阳离子交换基团的任何脂族或芳族有机残基，所述基团例如，选自乙基、丁基、己基、2-乙基己基、十二烷基、硬脂基、羟丙基、苯基和苄基的疏水性脂族或芳族有机基团，或选自磺酸、硫酸酯、磷酸、膦酸或羧酸基团的阳离子交换基团。
在式B中绘制的聚合物结构中，x和y是该聚合物中的各单体的平均摩尔分数，且独立地范围为约0.01至0.99。
在一些实施方案中，含有结合基团(例如，疏水性结合基团)的聚合物是嵌段共聚物，这意味着其包括一种类型的单体的长串或长嵌段，随后为不同类型的单体的长串或长嵌段。
在其他实施方案中，含有结合基团的共聚物以随机顺序含有单体。
在还有其他实施方案中，含有结合基团的共聚物是交替共聚物，其中每个单体在任一侧总是邻近于不同种类的两种单体。
在其他实施方案中，含有结合基团(例如，疏水性结合基团)的共聚合物以随机顺序含有单体。
在其他实施方案中，含有结合基团的共聚物是交替共聚物，而每个单体总是邻近于不同种类的两种单体。
IV. 掺入本文所述的组合物的装置
在一些实施方案中，将本文所述的组合物掺入装置中。固体支持物，例如微孔膜的合适装置包括过滤筒、胶囊状件(capsules)和荚状件(pods)。示例性的装置还包括美国公开号US20100288690 A1和US20080257814 A1(通过引用并入本文)中公开的堆叠的平板过滤筒。在这些装置的情况下，固体支持物永久性地与聚合性外壳粘结，并且装置具有液体入口、出口和放空口，并且进一步使保留的液体体积最小化。其他示例性装置包括折叠式过滤筒和旋转缠绕式过滤筒。另外的其他示例性装置是层析柱。层析柱可从许多材料，如玻璃、金属、陶瓷和塑料制备。这些柱可由终端用户用固体支持物装填，或还可由制造商预装填，并以装填状态送至终端用户。
V. 使用本文所述的组合物和装置的方法
含有本文所述的组合物的装置可用于以流通模式去除蛋白聚集体。在应用制备级的分离之前，必须针对合适的溶液条件如pH和导电率开发并验证所述方法，并且必须确定装置上的蛋白负载率的范围。用于方法开发和验证的方法是本领域中公知且常规实施的。
通常在使用前用合适的缓冲溶液冲洗、消毒并平衡所述装置。将蛋白溶液调整至期待的导电率和pH，并且随后在恒压或恒流下泵入通过装置。可以收集流出物，并分析蛋白得率和聚集体浓度。
在一些实施方案中，本文所述的用于聚集体去除的装置与例如美国专利7,118,675(其整体通过引用并入本文)教导的病毒过滤装置直接连接，该病毒过滤装置被设计用于确保基于大小去除病毒颗粒。
实施方案通过以下实施例进一步说明，其不应理解为限制性的。本申请通篇引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请以及附图均通过引用并入本文。
实施例1. 含丙烯酰胺的带负电荷的过滤器的制备和与含二甲基丙烯酰胺的过滤器的比较
本实验表明添加丙烯酰胺作为共单体以制备用于去除杂质如蛋白聚集体的吸附膜的意料之外的益处。
用结合基团制备一系列阳离子交换(CEX)表面改性的膜，在该情况下，所述结合基团是带负电荷的磺酸残基。通过配制用于表面改性的反应溶液的制剂来控制CEX密度。为了评估用于实现较低CEX密度的不带电荷的反应性共单体的影响，以不同的量将不带电荷的反应性单体丙烯酰胺(AM)、N, N-二甲基丙烯酰胺(DMAM)、甲基丙烯酸苄酯(BMA)或丙烯酸异辛酯(IOA)、 N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMAM)添加至所述反应溶液。选择共单体以覆盖各种大小和疏水性或亲水性程度。
制备一系列水性溶液或水:乙腈(50:50)溶液，其含有范围为1.5至2.5 % wt.的CEX单体2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸(AMPS)，与AM、DMAM、BMA、IOA或HPMAM和固定质量百分比的交联剂N, N’-亚甲基双丙烯酰胺(0.8% wt.)和UV引发剂Irgacure 2959 (0.2% wt.)、(2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮)。将0.10 µm的孔径额定值和0.100mm的厚度的亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜切成14 cm × 14 cm的方形片，并将各片在溶液之一中浸没30秒以确保完全润湿。去除过量溶液，并将膜暴露于UV辐射。将该膜随后用去离子水冲洗并在空气中干燥。表Ⅰ列出制备以评估共单体的影响的CEX表面改性膜的变体。
表1. 病毒保留过滤器Viresolve Pro (VPro)的质量通量。
使用新吸附膜作为预过滤器。
含丙烯酰胺的带负电荷的预过滤器和含其他共单体的预过滤器的评估通过确定它们改进过滤过程中的下游病毒保留过滤器的通量的预过滤性能来完成。进料流含有多克隆IgG聚集体，其通常迅速淤塞(foul)在过滤器的上游不具有病毒预过滤器的病毒过滤器。因为所使用的结合基团是带负电荷的，所以IgG的强CEX溶液结合条件用于评估预过滤器的性能。
使用SeraCare Life Sciences人γ球蛋白粉末(目录号HS-470-90)(pH 4)以4.0g/L IgG的浓度以及10 mM乙酸钠在2.0 mS/cm新鲜制备用于测试病毒过滤器提供的保护的多克隆IgG进料。使用10 M HCl、NaOH或4 M NaCl进行最终的pH和导电率调整，并在使用前无菌过滤溶液。
具有3.1 cm2的过滤面积的微滤装置使用3层膜预模制，并与Viresolve® ProMicro装置(EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)以1:1面积比串联放置。将两种装置均预润湿，并仅使用缓冲液(pH 4, 10 mM乙酸盐, 2 mS/cm)排气以去除空气。在30psi的恒定压力下，通过测量经20分钟时段达到初始渗透率值的质量而测定以mL缓冲液/分钟计的初始流量。在30 psi下将进料转换至4 g/L多克隆IgG进料，并测量体积通量并针对时间作图，直到流量衰减至25％仅初始缓冲液的流量。多克隆IgG溶液的总通量在V75以L/m2测量，并转换为 kg多克隆IgG/m2膜。
如从表1和图2可见，与AMPS和共单体的其他组合相比，用1.8% AMPS、3.0%丙烯酰胺改性的膜3为病毒去除过滤器提供了更大的保护(更大的质量通量)。与基膜对照膜2和非预过滤的病毒膜1相比，含丙烯酰胺的膜3还提供了更高的质量通量。
实施例2. 响应于溶液中蛋白的存在的渗透率变化表明含有丙烯酰胺的表面涂层的三维性质
本实施例表明使用丙烯酰胺作为共单体制备的表面化学的性质。使用含有4 g/L IgG的进料溶液和无任何蛋白的相同缓冲溶液两者测试实施例1中使用的装置组合的渗透率。据观察，含有丙烯酰胺作为共单体的装置具有一些独特特性，因为与其他预过滤器和未预过滤的VPro(膜1)的情况下的渗透率相比，在IgG存在的情况下的系列(train)的渗透率增加(表2，图3和4)。不希望受理论束缚，假设在膜3 中使用亲水性小的共聚合的丙烯酰胺与CEX结合基团AMPS允许独特的聚合物水凝胶(图5)，当IgG形成离子交联时，其可以容易收缩，因此打开膜孔并导致渗透率的增加。
表2中使用共单体BMA和DMAM的疏水性更高的制剂(膜4、5和9)对渗透率不具有相同的效果(表2，图3和4)。
表2. 各种预过滤器/VPro组合的缓冲液和蛋白溶液的渗透率。
实施例3. 作为导电率的函数的蛋白结合容量
本实施例通过测量在pH 4.0和不同的溶液导电率的表3中的表面改性膜的静态IgG结合容量说明作为共单体的丙烯酰胺的独特效果。
使用SeraCare Life Sciences人γ球蛋白粉末(目录号HS-470-90)(pH 4)以1.0g/L IgG以及10 mM乙酸钠新鲜制备用于测量静态结合容量的多克隆IgG进料。使用10 MHCl、NaOH和NaCl实现最终pH 4.0和表3中的导电率。在使用前将溶液无菌过滤。
使用圆形冲模将膜样品切成已知半径。使用100微米的膜厚度计算膜体积(V = πr2h)。将膜圆盘样品用水预润湿，并根据表3交换为适当的pH 4.0缓冲溶液。随后将膜圆盘制成1 g/L IgG(pH 4.0)的适当体积。目标负载率为约100 mg/ml(对于2 mS/cm)，50 mg/ml(对于15和25 mS/cm)，和25 mg/mL(对于37和49 mS/cm)。
将膜样品和IgG溶液旋转混合8小时，并通过UV280吸光度测量上清液的最终IgG浓度。基于最终上清液浓度通过质量平衡计算以mg IgG/mL膜计的静态IgG容量。表3和图6中的最终膜静态IgG容量显示，含有丙烯酰胺的膜(即，膜3和17)(以四(乙二醇)二丙烯酸酯交联剂代替MBAM)，具有在pH4在直至25 mS/cm比测试的其他膜(即，基膜2)、具有更大数目的结合基团(即，膜7和8)、无丙烯酰胺的膜(即，膜8、16、18)和具有共单体DMAM的膜(即，膜7、5、19)具有更高的静态IgG容量。
膜3和17中小的、中性和亲水性的丙烯酰胺与CEX结合基团AMPS的存在得到独特的聚合物水凝胶，其提供更大的静态IgG容量。
表3. 各种CEX表面改性膜对于IgG的静态结合容量。膜17-19以四(乙二醇)二丙烯酸酯交联剂替代膜3、5和16中的N, N’-亚甲基双丙烯酰胺。
实施例4. 含丙烯酰胺的膜对蛋白聚集体的选择性，如通过从CEX动态结合的洗脱的SEC测量所评价
本实施例表明含丙烯酰胺的膜对IgG聚集体的选择性。
对于表3中的膜测量动态CEX聚集体容量以定量所述膜的聚集体选择性差异。使用含有聚集体的多克隆IgG进料以提供在结合条件下对表3中的膜的等效动态CEX负载率。使用等效负载后的CEX洗脱以测定表4中的膜的IgG容量、通过分析型大小排阻色谱(SEC)的聚集体选择性和聚集体容量。
使用SeraCare Life Sciences人γ球蛋白粉末(目录号HS-470-90)(pH 4)以10.0g/L IgG以及10 mM乙酸钠在2.0 mS/cm(使用NaCl)新鲜制备进料。使用10 M HCl、NaOH或4M NaCl进行最终的pH和电导率调整，并在使用前无菌过滤溶液。
使用3层膜预模制具有3.1 cm2的过滤面积的微滤装置。将装置预润湿，并用20 mL缓冲溶液(pH 4)、10 mM乙酸盐(2 mS/cm)冲洗，然后使40 mL 10 g/L IgG (4.0 kg/L或1.3kg/m2的负载率)以0.2 mL/min (2 CV/min)流过各装置。将装置用2 mL (20 CV)缓冲液洗涤，并用2 mL (20 CV) pH 4, 0.5 M NaCl洗脱。
使用分析型大小排阻色谱(SEC)分析洗脱物的分子量种类。使用从SEC色谱的积分测定的聚集体百分比和IgG结合容量(来自UV280洗脱浓度)来计算表4以及图7和8中的膜的聚集体容量。
图9是包括来自表4的膜3、16、5和8的进料负载溶液和洗脱物的归一化的SEC-HPLC覆盖的代表性色谱图。重叠显示，与无中性共单体的膜8和16或具有共单体DMAM的膜5相比，含有丙烯酰胺的膜3的洗脱物具有更高百分数的聚集体。该结果表明，丙烯酰胺的存在改进对于聚集体的膜选择性。
表4以及图7和8中的聚集体容量对于含丙烯酰胺的膜3和17(以四(乙二醇)二丙烯酸酯交联剂替代MBAM)是最高的。与基膜2、具有更高数目的结合基团的膜(膜8和7)、无丙烯酰胺的膜(膜8、16、18)以及具有DMAM的膜(膜7、5、19)相比，含丙烯酰胺的膜具有更高的聚集体容量。
图8表明，具有更高聚集体容量的膜倾向于提供更好的Viresolve® Pro保护，由此使用实施例1中的方法得到更高的IgG质量通量。
表4. 各种CEX表面改性膜对于IgG的聚集体结合容量。
实施例5. 含丙烯酰胺的疏水性预过滤器(与无丙烯酰胺的预过滤器相比)的制备和测试
本实施例表明使用丙烯酰胺作为共单体与疏水性结合基团对于在疏水性结合条件(中性至较高pH和中度至高导电率)下保护病毒过滤器的益处。
疏水性单体N-苄基丙烯酰胺2.5 % wt (Alfa Aesar L11450)用作结合基团，并与2.0 wt %丙烯酰胺和交联剂N, N’-亚甲基双丙烯酰胺(0.8% wt.)共聚。将单体溶解于50:50水:MPD ((±)-2-甲基-2,4-戊二醇)，将0.22微米额定的亲水性聚醚砜(PES)膜的14x14cm薄片在溶液中浸泡30秒，并去除过量溶液。使用电子束(2.5 MRad @ 170 kV)起始聚合，并将膜随后用去离子水冲洗并在空气中干燥。评估具有疏水性结合基团且具有和不具有丙烯酰胺共单体的预过滤膜的改进下游病毒过滤器的通量的预过滤性能。进料流含有多克隆IgG聚集体，其通常迅速淤塞(foul)未预过滤的病毒过滤器(实施例1)。由于结合基团是疏水性的，所以在中性至较高pH和中度至高导电率的溶液条件(其通常增强抗体的疏水相互作用)下评估具有和不具有丙烯酰胺的效果。
以0.5或2.0 g/L IgG SeraCare Life Sciences人γ球蛋白粉末(目录号HS-470-90)(pH 7.0，5 mS/cm，pH 7.5，15 mS/cm以及pH 6.0，25 mS/cm)使用Tris缓冲液和NaCl新鲜制备多克隆IgG进料(表5)。使用10 M HCl、NaOH或4 M NaCl进行最终的pH和电导率调整，并在使用前无菌过滤溶液。
具有过滤面积3.1 cm2的微滤装置使用3层膜预模制，并与Viresolve® ProMicro装置(EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)以1:1面积比串联放置。将两种装置均预润湿，并使用缓冲溶液排气以去除空气。在30 psi的恒定压力下，通过经20分钟时段的质量测量以mL/min计的初始流量以测定初始恒定流量值。在30 psi下将进料转换至多克隆IgG溶液，并测量体积通量并针对时间作图，直到流量衰减至25%初始缓冲液流量。多克隆IgG溶液的总通量在V75以L/m2测量，并转换为 kg多克隆IgG/m2膜。如从表5以及图10、11和12可见，与不含丙烯酰胺的膜5、6、7或8相比，用2.5 % BAM、1.0%或2.0%丙烯酰胺改性的膜3和4提供病毒去除过滤器的更大保护(更大的质量通量)。在3种溶液条件下，含丙烯酰胺的膜3和4还提供与Viresolve®预过滤器(主要是疏水性机制)类似的质量通量，和比Viresolve® Shield (CEX机制)好得多的通量。
表5. 含丙烯酰胺的疏水性预过滤器(与目前可得的商业预过滤器和无丙烯酰胺的预过滤器相比)的配制和性能。
实施例6. 含丙烯酰胺的疏水性预过滤器与商业预过滤器和使用多克隆IgG的未改性的基础膜的比较
本实施例表明，来自实施例5(表5)的具有疏水性结合配体N-苄基丙烯酰胺(BAM)和丙烯酰胺(AM)的表面改性化学的膜(3)在疏水性结合条件(中性至较高pH和中度至高导电率)下保护病毒过滤器。如观察，膜(3)比市售的预过滤器和未改性的基础聚合物膜更好地改进下游病毒过滤器(Viresolve® Pro, EMD Millipore Corp., Billerica, MA)的多克隆IgG质量通量。
评估表6中的预过滤器的改进下游病毒过滤器的多克隆IgG质量通量的预过滤性能。膜样品(1)是Viresolve® Shield，具有基于CEX机制的表面改性的膜过滤器(VPMSKITNB9, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)。样品(2)是OptiScale-40Viresolve®预过滤器，具有5 cm2的过滤面积的基于疏水性机制的深度过滤器(SSPVA40NM9, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)。
膜(4)是具有110 µm的厚度的亲水的聚醚砜(PES) 0.2 µm膜(快速除菌级，GEPP,EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)。膜(5)是具有170 µm的厚度的亲水的尼龙(聚酰胺) 0.20 µm膜(GNWP, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)。膜(6)是具有110 µm的厚度的未改性的聚醚砜(PES) 0.2 µm膜(GEHP, EMD Millipore Corporation,Billerica, MA)。
进料流含有多克隆IgG聚集体，其迅速淤塞(foul)未预过滤的病毒过滤器(实施例1)。由于膜(3)的结合基团是疏水性的，所以在通常增强抗体的疏水性相互作用的溶液条件(中性至较高pH和中度至高导电率)下评估其预过滤性能。
以2.0 g/L IgG SeraCare Life Sciences人γ球蛋白粉末(目录号HS-470-90)(pH 6.0，25 mS/cm)使用乙酸盐缓冲液和NaCl新鲜制备多克隆IgG进料。使用10 M HCl、NaOH或4 M NaCl进行最终的pH和电导率调整，并在使用前无菌过滤溶液。
具有3.1 cm2的过滤面积的微滤装置使用2或3层膜预模制以得到等效厚度或总体积，并与病毒过滤装置Viresolve® Pro Micro (EMD Millipore Corporation,Billerica, MA)以1:1面积比串联放置。将两种装置均预润湿，并使用缓冲溶液排气以去除空气。在30 psi的恒定压力下，通过经20分钟时段的质量测量以mL/min计的仅缓冲液的初始流量以测定初始恒定流量值。在30 psi下将进料转换至含多克隆IgG的缓冲溶液，并测量体积通量并针对时间作图，直到流量衰减至25％和10％初始缓冲液流量。多克隆IgG溶液的总通量在V75和V90以L/m2测量，并转换为 kg多克隆IgG/m2膜。
如表6和图13中可见，与商业膜过滤器(1)和(4)以及未改性的基础聚合物膜(5)和(6)相比，用2.5 % BAM、2.0%丙烯酰胺、0.8% MBAM改性的膜(3)提供病毒去除过滤器的更大保护(多克隆IgG的更大质量通量)。这表明，与商业膜过滤器(1)、CEX机制和(4)、亲水化的PES以及由聚酰胺(5)和聚醚砜(6)构成的未改性的膜相比，使用疏水性配体BAM共聚物与丙烯酰胺的表面改性在典型疏水性结合条件(pH 6, 25 mS/cm)下更好地保护。当针对3.1cm2归一化时，膜(3)比样品(2)Viresolve®预过滤器(EMD Millipore Corp., Billerica,MA)(已知其主要通过疏水性机制吸附蛋白)提供更大的质量通量。
表6. 含丙烯酰胺的疏水性预过滤器与目前可得的商业预过滤器和未改性的基础膜的比较。
实施例7. 含丙烯酰胺的疏水性预过滤器对于单克隆抗体的性能
本实施例表明，来自实施例6(表6)的具有疏水性结合配体N-苄基丙烯酰胺(BAM)与丙烯酰胺(AM)的表面改性化学的膜(3)在疏水性结合条件下保护病毒过滤器(Viresolve®Pro, EMD Millipore Corp., Billerica, MA)，以改进单克隆抗体(MAbs)的质量通量。这些实施例表明，与无预过滤的过滤、使用由聚酰胺(5)或亲水的PES膜(4)构成的未改性的膜预过滤器相比，用膜(3)预过滤病毒过滤器表现更好。
评估表7中的膜预过滤器(3)、(4)和(5)用下游病毒过滤器(Viresolve® Pro,EMD Millipore Corp., Billerica, MA)在疏水性结合条件(中性至较高pH和中度至高导电率)下改进单克隆抗体(MAb)的质量通量的预过滤性能。
膜(4)是具有110 µm的厚度的亲水的聚醚砜(PES) 0.2 µm膜(快速除菌级，GEPP,EMD Millipore Corp., Billerica, MA)。膜(5)是具有170 µm的厚度的亲水的尼龙(聚酰胺) 0.20 µm膜(GNWP, EMD Millipore Corp., Billerica, MA)。
MAb进料流MAb 01、05和07的详情以及过滤容量实验条件和结果详述于表7，图14-16。将三种MAb都纯化至至少蛋白A洗脱后的状态，并且将溶液条件使用10 M HCl、NaOH或4M NaCl调解至表7条件。
具有0.8 cm2的过滤面积的不锈钢Swinney 13 mm直径过滤器托架(XX3001200,EMD Millipore Corp., Billerica, MA)使用2层或3层预过滤膜(3)、(4)和(5)组装以得到等效厚度或总体积，并且使用相同托架与2层Viresolve® Pro病毒过滤膜(EMD MilliporeCorp., Billerica, MA)以1:1面积比串联放置。
预过滤器和病毒膜装置在30 psi下用缓冲液预润湿，并转移至单克隆抗体进料用于测试。容量实验以166 LMH (L/m2.hr)的恒定流速运行，并在过滤的上游侧监测压力以检测过滤系列的堵塞。MAb溶液的总通量以体积测量，并转换为 kg MAb/m2病毒膜。
使用三种不同的MAb的三个实例都在更有利的疏水性结合条件(中性至较高pH和中度至高导电率)下，所述条件接近MAb的等电点和/或中度溶液导电率。
图14显示，与未预过滤的VPro相比，膜(3)在降低压力增加方面是有效的。图15显示，与未预过滤的VPro相比，膜(3)保护Vpro以便使MAb 05的质量通量改进4倍。图16显示，对于MAb 07，与无预过滤的VPro病毒过滤和由聚酰胺(5)构成的未改性的膜预过滤器以及商业除菌级膜过滤器(4)相比，膜(3)表现更好。
表7. 使用含丙烯酰胺的疏水性预过滤器(3)与商业膜相比的单克隆抗体病毒过滤性能
总之，新发现的膜化学法能够显著改善预过滤器用于保护病毒过滤器的性能。
鉴于本说明书中引用的参考文献(通过引用并入本文)的教导而最彻底地理解本说明书。本说明书中的实施方案提供实施方案的说明，并且不应理解为限制其范围。本领域技术人员可容易地认识到本公开包括许多其他实施方案。所有出版物和参考文献材料以其整体通过引用并入。在通过引用并入的材料与本说明书相矛盾或不一致的程度上，本说明书将替代任何这种材料。本文对任何参考文献的引用并不承认这种参考文献是现有技术。
除非另有指出，本说明书(包括权利要求)中使用的表示成分、细胞培养物、处理条件等数量的所有数字在所有情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，除非另有相反指出，数值参数是近似值，并且可根据本文公开的实施方案寻求得到的所需性质而改变。除非另有指出，在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每一要素。本领域技术人员将认识到或能够仅仅使用常规实验来确定本文所述的具体实施方案的许多等同方案。该等同方案意图包括于以下权利要求中。
在不偏离本文公开的实施方案的精神和范围下，可以对其进行多种修改和改变，这对本领域技术人员而言将是显而易见的。本文描述的具体实施方案仅以实例的方式提供，并不意欲以任何方式限制本发明。本说明书和实施例应被认为是仅仅示例性的，本公开的真正范围和精神由以下权利要求表明。

Claims (6)

1.多孔固体支持物，其包含交联涂层，所述交联涂层包含苄基丙烯酰胺、丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物。
2.根据权利要求1所述的多孔固体支持物，其中，所述固体支持物包含膜。
3.根据权利要求1所述的多孔固体支持物，其中，所述固体支持物包含微孔膜。
4.根据权利要求3所述的多孔固体支持物，其中，所述微孔膜包含取代或未取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基亲水性聚合物、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、芳族聚砜、聚四氟乙烯(PTFE)、全氟热塑性聚合物、聚烯烃、芳族聚酰胺、脂族聚酰胺、超高分子量聚乙烯、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚醚酮(PEEK)、聚酯及它们的组合。
5.根据权利要求1所述的多孔固体支持物，其中，所述固体支持物选自层析树脂、多孔珠、多孔整料、翅状纤维、纺织布和无纺布。
6.外壳，其包含权利要求1所述的多孔固体支持物。
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