MX2013009538A - Composiciones y metodos para alterar la especifidad tisular y mejorar la transferencia de genes mediada por vector viral adeno-asociado. - Google Patents

Abstract

Se describe un método para alterar la eficiencia de captación de direccionamiento y/o celular de un vector viral de virus adeno-asociado (MV) que tiene una cápside que contiene un dominio de unión a superficie celular de AAV9; el método implica modificar un receptor de superficie celular de ciado E que comprende un glicano que tiene un residuo de ácido siálico terminal y un penúltimo residuo de ß-galactosa; la modificación puede implicar redirigir el vector suprimiendo funcionalmente de manera temporal la unión de AAV9 en un subconjunto de células, redirigiendo así el vector a otro subconjunto de células; alternativamente, la modificación puede implicar aumentar la eficiencia de la actualización celular tratando las células con una neuraminidasa para exponer la ß-galactosa de superficie celular; también se proporcionan composiciones que contienen el vector de AAV9 y una neuraminidasa; también se proporciona un método para purificar AAV9 usando una ß-galactosa enlazada a un soporte sólido; también se proporcionan vectores mutantes que han sido modificados para alterar su especificidad de direccionamiento, incluido AAV9 mutante en el que el dominio de unión a galactosa es mutado y AAV en el que se diseña un dominio de unión a galactosa de MV9.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA ALTERAR LA ESPECIFICIDAD TISULAR Y MEJORAR LA TRANSFERENCIA DE GENES MEDIADA POR VECTOR VIRAL APENO-ASOCIADO 9 DECLARACIÓN RELATIVA A INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADOS FEDERALMENTE Esta invención fue realizada con el apoyo del gobierno según NHLBI P01 # P01-HL-059407, concedido por el Instituto Nacional de Salud. El gobierno posee algunos derechos respecto de la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los primeros vectores virales adeno-asociados (AAV) evaluados para la terapia génica se basaban en serotipo 2 (AAV2) y demostraron que transducen una variedad de células somáticas tras la administración in vivo [Z. Wu, et al (2006) Mol Ther, 14:316-327]. Uno de los primeros éxitos clínicos de la terapia génica utilizaba un vector de AAV2 para restaurar algunos aspectos de la visión tras una inyección subretiniana en pacientes con una forma hereditaria de ceguera [A. Kern, et al, (2003) J Virol, 77: 1 1072-1 1081 ; AM Maguire, et al, (2008) N Engl J Med, 358: 2240-2248]. Sin embargo, la aplicación de vectores de AAV2 para el tratamiento de otras enfermedades no ha sido exitosa debido a las bajas eficiencias de transducción y varios problemas inmunológicos tales como anticuerpos neutralizadores preexistentes y activación de células T a la cápside [Wu, et al, citado anteriormente]. Se sabe que el AAV2 utiliza proteoglicanos de sulfato de heparán (HS) como un receptor primario para el reconocimiento celular [Kern et al, citado anteriormente]. Se desarrollaron vectores adicionales en función de cápsides de AAV de otros serotipos existentes, tales como AAV1 y su pariente cercano AAV6, habiendo mostrado ambos una transducción mejorada del músculo y unión celular mediada por glicoproteínas sialiadas [Z. Wu et al, (2006) J Virol, 80:9093-9103; W. Xiao, et al, (1999) J Virol, 73: 3994-4003]. Los vectores basados en AAV5 también requieren unirse a ácido siálico (SA) unido a N a la vez que muestran una transducción mejorada en el SNC tras inyección directa en el cerebro [RW Walters et al, (2001 ) J Biol Chem, 276: 20610-20616; BL Davidson, et al, (2000) Proc Nati Acad Sci USA, 97:3428-3432]. El potencial de los vectores de AAV para la terapia génica humana se expandió a través del descubrimiento de una familia grande y diversa de cápsides novedosas de los genomas latentes en tejidos humanos y de primates no humanos. Esta familia expandida de AAV cuenta con más de 120 genomas que abarcan 6 ciados antigénicos [G. Gao et al, (2003) Proc Nati Acad Sci USA, 100:6081-6086; G. Gao, er a/, (2004) J Virol, 78: 6381-6388; G Gao et al, (2002) Proc Nati. Acad Sci USA, 99: 11854-11859]. Se han determinado estructuras determinadas por radiocristalografía de alta resolución e imágenes reconstruidas por criomicroscopía electrónica de resolución más baja para muchas cápsides de AAV demostrando una región de núcleo altamente conservada con un total de 9 regiones hipervariables expuestas en la superficie [HJ Nam et al, (2007) J Virol, 81 :12260-12271]. La evaluación de vectores en función de estas cápsides endógenas novedosas ha sido bastante prometedora en términos de alcanzar eficiencias de transducción sustancialmente más altas con secuelas inmunológicas disminuidas [G. Gao er a/, (2002) Proc Nati Acad. Sci, citado anteriormente].

Los vectores en función del serotipo 9 del virus adeno-asociado (AAV) han emergido como candidatos principales para la administración de genes in vivo a muchos órganos. AAV9 ha mostrado una promesa significativa al dirigirse al corazón para el tratamiento de cardiomiopatías [LT Bish, et al, (2008) Hum Gene Ther 19: 1359-1368] y neuronas para tratar enfermedades tales como atrofia muscular espinal [S. Duque, et al, (2009) Mol Ther, 17: 1 187-1 196; KD Foust et al, (2009) Nat Biotechnol, 27: 59-65]. El AAV9 también transduce muy eficientemente células epiteliales alveolares del pulmón sin provocar una respuesta humoral, permitiendo una readministración eficiente del vector [MP Limberis y JM Wilson, (2006) Proc Nati. Acad Sci. USA, 103: 12993-12998]. Sin embargo, los receptores que median estos tropismos no han sido definidos aún.

Lo que se necesita son métodos eficientes y seguros para una administración mediada por AAV dirigida de transgenes dentro de un huésped.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un abordaje farmacológico para modificar la disponibilidad del receptor de AAV9 en una célula objetivo deseada y para modificar la eficacia del vector. Este abordaje fue posible debido al descubrimiento de los inventores de que la ß-galactosa terminal es el receptor primario para AAV9. Además, se anticipa que el abordaje sea aplicable a otro AAV que contenga el dominio de unión de ß-galactosa de AAV9.

En un aspecto, la invención proporciona un método para alterar la eficiencia de captación dirigida y/o celular de un vector viral del virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de AAV9. El método comprende administrar a un sujeto una composición que modifica la disponibilidad del receptor de superficie celular de ß-galactosa para unirse el vector.

En un aspecto, la superficie celular de una célula objetivo en un huésped contiene un glicano que tiene un residuo de ácido siálico terminal y un penúltimo residuo de ß-galactosa, siendo el glicano modificado por la invención para exponer el residuo de ß-galactosa. En una modalidad, el método comprende administrar el vector viral de AAV a un sujeto en combinación con una neuraminidasa, mediante el cual la neuraminidasa escinde el ácido siálico terminal en el glicano y aumenta la eficiencia de la captación de AAV por parte de la célula mediante el aumento de la disponibilidad de la ß-galactosa. El sujeto puede ser pre-tratado con la neuraminidasa. En una modalidad, la neuraminidasa es una exo-neuraminidasa (es decir, se dirige a ácidos siálicos terminales para la escisión, a diferencia de los ácidos siálicos internos).

En otra modalidad, los vectores de AAV9 son alejados de un primer subconjunto de células que tienen ß-galactosa terminal mediante la extirpación funcional de un residuo de ß-galactosa terminal de superficie celular expuesto en el primer subconjunto de células que tiene receptores para AAV9 (por ejemplo, glicanos de superficie celular que tienen residuos de ß-galactosa terminal) y el AAV se redirige de este modo a un segundo subconjunto de células en el sujeto que tiene ß-galactosa terminal y/o el número de AAV en contacto con el segundo subconjunto de células se incrementa, aumentado así la captación por parte de estas células. En una modalidad, el resto que extirpa funcionalmente el primer subconjunto de células se administra localmente al primer subconjunto de células. En una modalidad, una ß-galactosa se elimina enzimáticamente en un primer subconjunto de células que tiene los receptores de superficie celular de AAV9, reduciendo o eliminando así la captación de AAV mediante dicho subconjunto de células y redirigiendo el AAV a un segundo subconjunto de células en el sujeto que tiene receptores de AAV9 (ß-galactosa terminal). En una modalidad, la ß-galactosa se elimina enzimáticamente mediante la administración de galactosidasa al primer subconjunto de células en combinación con los vectores de AAV9. En otra modalidad, se administra al sujeto una lectina que une los residuos de ß-galactosa terminal, la cual bloquea la ß-galactosa mediante la unión de estos residuos.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un método para aumentar la administración de genes de un vector de AAV9 en una célula que tiene glicanos de superficie con ácido siálico terminal y los penúltimos residuos de ß-galactosa mediante la administración a un sujeto de una combinación que comprende una neuraminidasa y un vector de AAV9, comprendiendo dicho vector además un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un gen heterólogo operativamente enlazado a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula huésped.

En un aspecto, la composición proporciona además un vector de AAV9 mutante en el cual la capacidad nativa del AAV9 natural (wt) para transducir las vías respiratorias de conducción sustancialmente disminuye o se elimina, pero la transducción del hígado y el corazón similar al AAV9 natural se retiene. En una modalidad, el AAV mutante tiene una cápside de AAV9 en la cual se reemplaza el aminoácido nativo en la posición 470 (Asn). En un ejemplo, el reemplazo es una alanina. En otra modalidad, el AAV mutante tiene una cápside de AAV9 en la cual se reemplaza el aminoácido nativo en la posición 446 (Tyr). En un ejemplo, el reemplazo es una alanina. En otra modalidad adicional, el AAV mutante tiene una cápside de AAV9 en la cual se reemplaza el aminoácido nativo en la posición 271 (Asp). En un ejemplo, el aminoácido se reemplaza por alanina.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para desviar un vector de AAV9 al epitelio de las vías respiratorias mientras retiene su capacidad de transducir el hígado y el corazón mediante la modificación de uno o más aminoácidos en la posición 271 , 446 y 470 a alanina u otro aminoácido, es decir, preferiblemente un aminoácido con una cadena lateral no cargada pequeña. En otra modalidad, el aminoácido tiene una cadena lateral pequeña con un grupo metilo que no afecta la conformación del sitio de unión.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un vector de AAV que tiene una cápside de AAV diseñada para contener un dominio de unión a galactosa de AAV9. En una modalidad, la cápside de AAV diseñada contiene los Y446, N470, A472 y V472 de AAV9 y D271, N272 y W503 de AAV9 insertados en la correspondiente ubicación de aminoácidos del AAV9 base.

En otra modalidad adicional, el método proporciona un método para aislar un vector viral del virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de AAV9. Este método implica (a) exponer una muestra que comprende el vector viral de AAV que tiene una cápside de AAV9 para poner en contacto una molécula que comprende ß-galactosa que se ha enlazado a un soporte sólido, con lo cual el objetivo de purificación que tiene un sitio de unión para la ß-galactosa está selectivamente unido por la molécula; (b) lavar el soporte sólido para eliminar el material de la muestra que no está específicamente unido al soporte sólido; y (c) separar el vector viral del soporte sólido.

En otra modalidad, la invención proporciona una composición que comprende una combinación de (a) una neuraminidasa, (b) un vector del virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de AAV9, y (c) un portador farmacéuticamente aceptable. El vector comprende además un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un gen heterólogo operativamente enlazado a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula huésped.

En otra modalidad adicional, la invención proporciona una composición que comprende una combinación de (a) una lectina, (b) un vector del virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de AAV9, y (c) un portador farmacéuticamente aceptable.

Estos y otros aspectos de la invención serán fácilmente evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las Figs. 1A-1C proporcionan los resultados de un estudio de unión de AAV a glicanos desprovistos de ácido siálico (SA). La Fig. 1A es un esquema de glicanos enlazados a N y O para cada tipo de célula o tratamiento enzimático. La Fig. 1B muestra los resultados cuando el SA se retiró de la superficie de células Pro-5 mediante tratamiento con neuraminidasa (NA) y se aplicaron vectores a células tratadas y no tratadas con NA y se evaluaron para la unión. Las cápsides de AAV9 vacías se sometieron a prueba para la unión a 465 glicanos diferentes en función de unidades de fluorescencia relativa promedio (presentada en UFR) y se identificaron los mejores cinco glicanos que se unieron a AAV9 (no se muestra). La Fig. 1C muestra las estructuras de los mejores cinco glicanos y sus dibujos representativos. % de CV: coeficiente de variación (la relación entre la desviación estándar de los datos y la media) expresado como un porcentaje.

Las Figs. 2A-2F muestran los resultados de un estudio de dependencia de galactosa de AAV9 para la unión y transducción de células CHO. Los AAV 2, 6 o 9 que expresan ffLuc se agregaron a células Pro-5, Lec-2 o Lec-8 y se incubaron a 4°C durante 1 hr y el ADN total se aisló para determinar las copias de genoma unidas mediante qPCR (Fig. 2A) o se incubaron células a 37°C durante 48 hrs y se analizaron para detectar la expresión de ffLuc (Fig. 2B). Las AAV2 y AAV9 se aplicaron a células Pro-5 tratadas con NA en presencia de varias lectinas para completar la unión (Fig, 2C) o transducción (Fig. 2D) de AAV. No se utilizó RCA en estudios de transducción debido a su toxicidad para las células. Los AAV2 y AAV9 se agregaron a las células Pro-5 que fueron tratadas con NA o NA y ß-galactosidasa (NA y ß-gal) para evaluar la unión (Fig. 2E) y transducción (Fig. 2F) de AAV, ffLuc, luciferasa de luciérnaga; URL, unidades de luz relativa.

Las Figs. 3A y 3B muestran los resultados de estudios de aminoácidos de cápside de AAV9 requeridos para la unión de galactosa. Fig. 3A. Los aminoácidos específicos únicos para AAV9 que contienen cadenas cargadas o laterales polares se mutaron a alanina (A) para identificar aquellos responsables de la unión de galactosa. Se construyeron catorce vectores mutantes y se nombraron de acuerdo con los aminoácidos nativos y su posición específica seguida por el nuevo aminoácido-alanina, A. Los mutantes se evaluaron para determinar la unión de las células Pro-5, Lec-2 y Lec-8 en comparación con el AAV9. Se agregó vector (5x109 de GC) a cada línea celular y se incubó a 4°C durante 1 hora. Después del lavado, el ADN total se aisló para determinar los GC del vector unido mediante PCR cuantitativa. Se determinó que N470 es necesario para la unión de galactosa de AAV9. Fig. 3B. Posteriormente, diecinueve aminoácidos ubicados en proximidad cercana a N470 se mutaron a alanina para examinar el efecto en la unión de galactosa de AAV9. Además, se produjeron otros cuatro mutantes que contenían mutaciones de los aminoácidos no polares A472 o V473 a serina o ácido aspártico. La unión de estos vectores mutantes se evaluó entonces según se describió anteriormente. Se encontró que D271 , N272, Y446 y W503, así como también A472 y V473, son importantes para la unión de galactosa de AAV9. Los datos se muestran como media + DE.

Las Figs. 4A y 4B proporcionan la eficiencia de transducción in vitro de vectores mutantes. Los cinco mutantes que perdieron la capacidad de unirse a la galactosa (N470A, D271A, N272A, Y446A y W503A), así como dos mutantes que retuvieron la unión de galactosa (S469A y E500A) y un vector de control de AAV9, todos expresando ffLuc, se agregaron a células Lec-2 (Fig. 4A) o Pro-5 (Fig. 4B) a razón de 109 GC/pocillo (MOI= 104) y la expresión de ffLuc se midió 48 horas más tarde. Los datos se muestran como media + DE. URL, unidades de luz relativa.

La Fig. 5 es un gráfico de líneas que muestra los resultados de un estudio in vivo de los efectos de pre-tratamiento con neuraminidasa en la expresión de transgén en la nariz después de la instalación de rAAV2/9. Los resultados se muestran como flujo radiante total (fotones por segundo (f/s) de luciferasa como imágenes por luciferina intranasalmente los días 1 , 3, 7, 14, 21 y 28 (número de días (tiempo) después de la infección).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se describe un abordaje farmacológico para modificar la disponibilidad del receptor de AAV9 en una célula objetivo y para modificar la eficacia del vector. Este abordaje fue posible debido al descubrimiento de los inventores de que la ß-galactosa terminal es el principal receptor para AAV9. Por razones de conveniencia en toda esta memoria descriptiva, se hace referencia a AAV9. Sin embargo, se comprenderá que se puede sustituir otro AAV que contenga el dominio de unión de cápside de AAV9 para una ß-galactosa terminal de superficie celular o un AAV que contenga otro dominio de unión de cápside de AAV para la ß-galactosa terminal de superficie celular, por ejemplo, otro AAV de Ciado F. Adicionalmente, los métodos y composiciones descritos en la presente son útiles para un vector que es una partícula viral (es decir, una cápside de AAV que tiene empaquetadas en ella secuencias genómicas que se administran a una célula huésped tras la captación del vector viral), así como a cápsides de AAV9 vacías (una cápside de AAV intacta sin secuencias empaquetadas en ella). Además, se anticipa que la invención esté disponible para las cápsides naturales y diseñadas.

En una modalidad, se proporciona el vector de AAV que tiene una cápside de AAV diseñada para contener un dominio de unión a galactosa de AAV9 que comprende una cavidad en la superficie externa de las salientes que enfrentan los ejes de de orden 2 y 5 de la cápside de AAV que están formados por una región variable I. En una modalidad, la cápside de AAV diseñada contiene el Y446 (domino conservado inmediato ante la región variable (VR) IV), N470 (VR IV), A472 (VR IV) y V473 (VR IV) de AAV9 y D271 (VR I), N272 (VR I) y W503 (VR V) de AAV9 insertada en la ubicación de aminoácidos correspondiente del AAV9 base. Si bien puede tener uno o más de estos aminoácidos nativamente, el AAV base no une nativamente la galactosa ni contiene todos estos aminoácidos nativamente. Por ejemplo, Y446, D271 y N272 se conservan entre varios serotipos, mientras que N470 no. Por lo tanto, una cápside de AAV modificada puede sólo requerir el diseño de N470 (en función de los números de posición de AAV9). Sin embargo, dicha cápside de AAV puede requerir el diseño de uno o más de los aminoácidos anteriores de modo de proporcionar el dominio de unión de AAV9. En una modalidad, el AAV9 diseñado deriva de un AAV que en su tipo natural tiene una unión de ácido siálico pero, debido al diseño de la galactosa, ahora carece de una unión de ácido siálico debido a un impedimento estérico.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para desviar un vector de AAV9 al epitelio de las vías respiratorias mientras retiene su capacidad de transducir el hígado y el corazón mediante la modificación de uno o más aminoácidos en la posición 271 , 446 y 470 (región variable IV) a alanina u otro aminoácido. En una modalidad, el aminoácido que reemplaza el aminoácido natural es un aminoácido con una cadena lateral no cargada pequeña. En otra modalidad, el aminoácido tiene una cadena lateral pequeña con un grupo metilo, por ejemplo, Val, He y Leu. En otra modalidad adicional, otro aminoácido adecuado que no afecta la conformación del sitio de unión de modo de eliminar la función de unión de galactosa se selecciona de, por ejemplo, Arg, His, Lys, Asp, Glu, Ser, Thr, Asp, Gln, Cys, Ala, Val, Isle, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp. En una modalidad, el aminoácido se selecciona de un grupo que excluye Pro.

También se proporcionan vectores de AAV9 muíante que tienen eficiencias dirigidas que son diferentes del AAV9 natural, que se dirige a células de las vías respiratorias de conducción, corazón e hígado. En un ejemplo, dicho vector de AAV9 mutante desvía el epitelio de las vías respiratorias mientras retiene su capacidad de transducir el hígado y el corazón mediante la modificación de uno o más de los aminoácidos en la posición 271 , 446 y 470 a alanina u otro aminoácido. En una modalidad, el aminoácido que reemplaza el aminoácido natural es un aminoácido con una cadena lateral no cargada pequeña. En otra modalidad, el aminoácido tiene una cadena lateral pequeña con un grupo metilo, por ejemplo, Val, lie y Leu. En otra modalidad adicional, otro aminoácido adecuado que no afecta la conformación del sitio de unión de modo de eliminar la función de unión de galactosa se selecciona de, por ejemplo, Arg, His, Lys, Asp, Glu, Ser, Thr, Asp, Gln, Cys, Ala, Val, Isle, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp. En una modalidad, el aminoácido se selecciona de un grupo que excluye Pro.

En una modalidad, la invención proporciona un vector de AAV9 mutante en el cual la capacidad nativa del AAV9 natural (wt) para transducir las vías respiratorias de conducción sustancialmente disminuye o se elimina, pero la transducción del riñon y corazón similar al AAV9 natural se retiene. En una modalidad, el AAV mutante tiene una cápside de AAV9 en la cual se reemplaza el aminoácido nativo en la posición 470 (Asn). En un ejemplo, el reemplazo es una alanina. En otra modalidad, el AAV mutante tiene una cápside de AAV9 en la cual se reemplaza el aminoácido nativo en la posición 446 (Tyr). En un ejemplo, el reemplazo es una alanina. En otra modalidad adicional, el AAV mutante tiene una cápside de AAV9 en la cual se reemplaza el aminoácido nativo en la posición 271 (Asp). En un ejemplo, el aminoácido se reemplaza por alanina.

I. Definiciones Un ciado F es un grupo de AAV que se relaciona de manera filogenética con AAV9, hu.14/AAV9 [No. de acceso de GenBank AY530579], hu.31 [AY530596] y hu.32 [No. de acceso de GenBank AY530597] según se determina utilizando un algoritmo de Neighbor-Joining por un valor de remuestreo de al menos 75% (de al menos 1000 repeticiones) y una medición de distancia de corrección de Poisson de no más de 0.05, en función de la alineación de secuencia de aminoácidos de vp1 de AAV. El algoritmo de Neighbor-Joining se ha descrito ampliamente en la literatura. Ver, por ejemplo, M. Nei y S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, New York (2000). Están disponibles programas informáticos que pueden utilizarse para implementar este algoritmo. Por ejemplo, el programa MEGA v2.1 implementa el método Nei-Gojobori modificado. Utilizando estas técnicas y programas informáticos, y la secuencia de una proteína de cápside vp1 de AAV, un experto en la técnica puede determinar fácilmente si un AAV está contenido en uno de los ciados identificados en la presente, en otro ciado, o si está fuera de estos ciados.

El AAV del Ciado F puede ser cápsides vp1 de AAV naturales. Sin embargo, los AAV no están limitados a AAV naturales. El ciado puede abarcar AAV no naturales, que incluyen, a modo no taxativo, AAV re.combinante, modificado o alterado, diseñado, quimérico, híbrido, sintético, artificial, etc., que están relacionados de manera filogenética según se determina utilizando un algoritmo de Neighbor-Joining al menos 75% (de al menos 1000 repeticiones) y una medición de distancia de corrección de Poisson de no más de 0.05, en función de la alineación de la secuencia de aminoácidos de vp1 de AAV.

En otra modalidad, un AAV recombinante puede ser de un ciado que no sea un AAV de Ciado F que tiene una cápside que ha sido diseñada para contener el dominio de unión de AAV9 que se une a la ß-galactosa terminal de la superficie celular.

En otra modalidad, un AAV utilizado en la presente invención es un vector de AAV que comprende una cápside que es al menos 95% idéntica a la proteína vp3 de AAV9 (aminoácidos 203 a 736 de la SEQ ID NO: 1), al menos 95% idéntica a la vp2 de AAV9 (aproximadamente a 138 a 736 de la SEQ ID NO: 1), y/o al menos 95% idéntica a la cápside vp1 de AAV9 de longitud completa. (aminoácidos 1 a 736 o 2 a 736 de la SEQ ID NO: 1). En otra modalidad, el AAV es de aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% a la vp1 , vp2 y/o vp3 de AAV9 natural (SEQ ID NO:1) y contiene el dominio de unión de superficie celular de AAV9 para ß-galactosa. Un experto en la técnica debe comprender que, ya que el dominio vp3 contiene la mayor parte de la región variable, es posible que un AAV tenga el 95% de identidad con respecto a AAV9 en la vp1 de AAV9, y que tenga a la vez una mayor identidad con la vp3 de AAV9. En una modalidad, el AAV utilizado para preparar un vector de AAV tiene una cápside que es 100% idéntica a la vp1 , vp2 y/o vp3 de AAV9. En otra modalidad adicional, el AAV utilizado para preparar un vector de AAV tiene una cápside de AAV9, con la excepción de que contiene una o más mutaciones según se define en la presente.

La expresión "homología sustancial" o "similitud sustancial", cuando se refiere a aminoácidos o fragmentos de los mismos, indica que, cuando se alinean óptimamente con inserciones o eliminaciones apropiadas de aminoácidos con otro aminoácido (o su hebra complementaria), existe una identidad de secuencia de aminoácidos en al menos aproximadamente 95 a 99% de las secuencias alineadas. Preferiblemente, la homología se encuentra en la secuencia de longitud completa, o una proteína de la misma, por ejemplo, una proteína cap, una proteína rep, o un fragmento de la misma que tiene al menos 8 aminoácidos o, más preferiblemente, al menos 15 aminoácidos de longitud. Ejemplos de fragmentos adecuados se describen en la presente.

Por la expresión "altamente conservado" se entiende al menos 80% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad y más preferiblemente más de 97% de identidad. La identidad puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica recurriendo a algoritmos y programas informáticos conocidos por los expertos en la técnica.

Generalmente, cuando se hace referencia a "identidad", "homología" o "similitud" entre dos virus adeno-asociados diferentes, la "identidad", "homología" o "similitud" se determina en referencia a las secuencias "alineadas". Secuencias "alineadas" o "alineaciones" se refiere a múltiples secuencias de ácido nucleico o secuencias de proteínas (aminoácidos) que contienen a menudo correcciones por faltante o bases o aminoácidos adicionales en comparación con una secuencia de referencia. Las expresiones "identidad de secuencia", "identidad de secuencia porcentual" o "por ciento idéntica", en el contexto de secuencias de ácido nucleico, se refiere a los residuos en las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para una máxima correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser en la longitud completa del genoma, en la longitud completa de una secuencia que codifica genes o en un fragmento de al menos aproximadamente 500 a 5000 nucleótidos, que es deseable. Sin embargo, la identidad entre los fragmentos más pequeños, por ejemplo, de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, generalmente al menos aproximadamente 20 a 24 nucleótidos, al menos aproximadamente 28 a 32 nucleótidos, al menos aproximadamente 36 o más nucleótidos, también puede ser deseable. De manera similar, la "identidad de secuencia porcentual" puede determinarse fácilmente para secuencias de aminoácidos en la longitud completa de una proteína o un fragmento de la misma. De manera adecuada, un fragmento tiene al menos aproximadamente 8 aminoácidos de longitud y " puede ser de hasta aproximadamente 700 aminoácidos. Ejemplos de fragmentos adecuados se describen en la presente.

Las alineaciones se realizan utilizando cualquiera de una variedad de programas de alineación de secuencias múltiples disponibles públicamente o comercialmente. Ejemplos de dichos programas incluyen, "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "MAP" y "MEME", a los que se puede acceder a través de servidores web en Internet. Los expertos en la técnica conocen otras fuentes de dichos programas. Alternativamente, también se utilizan utilidades de Vector NTI. Existen también varios algoritmos conocidos en la técnica que pueden utilizarse para medir la identidad de secuencia de nucleótidos, incluyendo aquellos contenidos en los programas descritos anteriormente. Como otro ejemplo, las secuencias de polinucleótidos pueden compararse utilizando Fasta™, un programa en GCG Versión 6.1. Fasta™ proporciona alineaciones e identidad de secuencia porcentual de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de consulta y de búsqueda. Por ejemplo, la identidad de secuencia porcentual entre secuencias de ácido nucleico puede determinarse utilizando Fasta™ con sus parámetros por defecto (un tamaño de letra 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntaje) como se proporciona en GCG Versión 6.1 , incorporada a la presente a modo de referencia. Programas de alineación de secuencias múltiples también están disponibles para secuencias de aminoácidos, por ejemplo, los programas "Clustal X", "MAP", TIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME" y "Match-Box". Generalmente, cualquiera de estos programas se utiliza con las configuraciones por defecto, aunque un experto en la técnica puede alterar estas configuraciones según sea necesario. Alternativamente, un experto en la técnica puede utilizar otro algoritmo o programa informático que proporcione al menos el nivel de identidad o alineación que el proporcionado por los algoritmos y programas mencionados. Ver, por ejemplo, JD Thomson et al, (1999) Nucí. Acids. Res., "A comprehensive comparison of múltiple sequence alignments", 27(13):2682-2690.

El término "serotipo" es una distinción con respecto a un AAV que tiene una cápside que es serológicamente distinta de otros serotipos de AAV. La diferenciación serológica se determina en función de la carencia de reactividad cruzada entre los anticuerpos con el AAV en comparación con otro AAV. La reactividad cruzada típicamente se mide en un ensayo de anticuerpos neutra lizadores. Para este ensayo se genera suero policlonal contra un AAV específico en un conejo u otro modelo de animal adecuado utilizando los virus adeno-asociados. En este ensayo, el suero generado contra un AAV específico se evalúa entonces en su capacidad para neutralizar ya sea el mismo AAV (homólogo) o un AAV heterólogo. La dilución que alcanza el 50% de neutralización se considera el título de anticuerpo neutralizador. Si para dos AAV el cociente del título heterólogo dividido entre el título homólogo es menor que 16 en una manera recíproca, esos dos vectores se consideran como el mismo serotipo. Por el contrario, si la relación entre el título heterólogo y el título homólogo es 16 o más en una manera recíproca, los dos AAV se consideran de serotipos distintos.

Tal como se utiliza en la presente, una ß-galactosa "terminal" es un receptor de la superficie celular para un AAV9 que tiene el sitio de unión natural que se expone de modo que está disponible esféricamente o de otro modo para unirse al dominio de unión de la galactosa de AAV9.

A menos que se especifique lo contrario, el término "aproximadamente", cuando se utiliza para modificar un número, significa una varianza de ± 10%.

Tal como se utiliza en toda esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las expresiones "que comprende" y "que incluye" son inclusivas de otros componentes, elementos, números enteros, etapas y similares. Por el contrario, la expresión "que consiste" y sus variantes son exclusivas de otros componentes, elementos, números enteros, etapas y similares.

II. Regímenes de tratamiento En un aspecto, la invención proporciona un método para alterar la eficiencia dirigida y/o de captación celular de un vector viral del virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de AAV9. Él método comprende administrar a un sujeto una composición que modifica la disponibilidad de la ß-galactosa para unirse a un vehículo de administración en función de AAV9. En una modalidad, la superficie de la célula objetivo deseada contiene un glicano que tiene un residuo de ácido siálico terminal y un penúltimo residuo de ß-galactosa, siendo el glicano modificado por la invención para exponer el residuo de ß-galactosa.

En una modalidad, el método comprende administrar el vector viral de AAV a un sujeto en combinación con una neuraminidasa (NA), con lo cual la neuraminidasa escinde el ácido siálico terminal de la superficie celular y aumenta la eficiencia de la captación de AAV por parte de la célula. El sujeto puede ser pre-tratado con la neuraminidasa.

Se entiende por pre-tratamiento que el tratamiento (por ejemplo, neuraminidasa) se administra al sujeto antes de la terapia mediada por AAV9. Típicamente, esto implica la administración del pre-tratamiento antes de la administración de la terapia mediada por AAV9. Sin embargo, en determinadas modalidades, el transgén codificado por un vector de AAV9 puede estar bajo el control de un promotor regulable que se activa después del pre-tratamiento. En dicha modalidad, el vector de AAV9 puede administrarse antes, o sustancialmente de manera simultánea con, la administración del pre-tratamiento, pero la administración del agente de activación para el promotor constitutivo es posterior al pre-tratamiento.

Las neuraminidasas, también conocidas como sialidasas, se dirigen específicamente a ácido siálico para la escisión y pueden adquirirse comercialmente u obtenerse de una variedad de fuentes. En una modalidad, la neuraminidasa es una exo-neuraminidasa, es decir, se dirige específicamente a ácidos siálicos terminales para escisión, a diferencia de los ácidos siálicos internos. En una modalidad, una exo-neuraminidasa funciona en hidrólisis de a-(2?3)-, a-(2?6)-, a-(2?8)-enlaces glicosídicos de residuos de ácido siálico terminales. Ejemplos de neuraminidasas útiles en la invención incluyen, por ejemplo, una neuraminidasa bacteriana, neuraminidasas virales y de mamífero. La neuraminidasa (Acil-neuraminil hidrolasa: EC3.2.1.18) puede ser de cualquier fuente incluyendo, a modo no taxativo, Arthrobacter ureafaciens, Vibrio cholerae, Clostridium perfringens o de fuentes de mamíferos. En una modalidad, la neuraminidasa es una neuraminidasa bacteriana, tal como neuraminidasa tipo III de Vibrio cholerae (Sigma). Sin embargo, pueden seleccionarse otros tipos de neuraminidasa. En otra modalidad, puede seleccionarse una neuraminidasa viral, por ejemplo, una neuraminidasa de influenza. En otra modalidad adicional, una neuraminidasa de mamífero puede seleccionarse de entre, por ejemplo, una fuente humana, de roedor, simio u otro mamífero.

La neuraminidasa puede formularse como un líquido o puede ser un sólido, por ejemplo, en donde la neuraminidasa se mezcla con excipientes farmacéuticos convencionales, incluyendo, por ejemplo, fijarse o agregarse en una matriz biodegradable o bioerosionable. La matriz puede ser una matriz de libración gradual. Los expertos en la técnica conocen bien estas matrices. La neuraminidasa puede administrarse mediante inyección o por vía sublingual. En una modalidad, el vehículo es una solución acuosa (por ejemplo, una solución salina, incluyendo una solución salina tamponada u otro portador líquido adecuado) que está dentro de un recipiente inerte. En otra variación, la composición se encuentra en forma de un supositorio. La forma líquida de la composición puede administrarse a través de métodos estándares, incluyendo vías intravenosa, intramuscular y subcutánea, vías sublingual o intranasal. En una modalidad, el portador es 0.1% a 0.4% fenol en 0.9% de cloruro de sodio (USP).

La neuraminidasa puede administrarse en una dosis de, por ejemplo, aproximadamente 300 U a aproximadamente 5000 U de neuraminidasa, es decir, el equivalente a aproximadamente 15 mg a 250 mg de neuraminidasa por dosis. Alternativamente, pueden utilizarse dosis más bajas, tales como en el rango de aproximadamente 0.0001 mg a 0.01 mg. Alternativamente, pueden utilizarse cantidades entre estos dos rangos, por ejemplo, de 0.01 mg a aproximadamente 250 mg.

En una modalidad, la invención proporciona una administración de genes mediada por AAV en la cual la administración a un sujeto de un vector viral de AAV9 (o un Ciado F o un dominio de unión celular (galactosa) de AAV9) y la neuraminidasa se produce sustancialmente de manera simultánea. La neuraminidasa puede formularse de manera separada del vector de AAV y/o administrarse mediante una vía diferente, pero sustancialmente al mismo tiempo. Alternativamente, el vector viral de AAV se administra al sujeto en un portador que comprende además la neuraminidasa.

Aunque se anticipa que un cuerpo naturalmente eliminará una enzima tal como la neuraminidasa de modo que su efecto es sólo temporal, en una modalidad puede administrarse un inhibidor de neuraminidasa de modo de neutralizar cualquier efecto de neuraminidasa persistente. Los inhibidores de neuraminidasa adecuados son conocidos en la técnica y pueden incluir fármacos anti-virales que están comercialmente disponibles, por ejemplo, Oseltaminivir (Tamiflu), Zanamivir (Relenza), Lanimavir (Inavir) y Peramivir. El régimen de dosificación típico para un inhibidor de neuraminidasa sistémica tal como oseltaminivir es de aproximadamente 75 mg oralmente, dos veces al día durante 5 días o más según se prescriba. Sin embargo, para su uso en la invención, puede desearse un régimen de dosificación más corto, por ejemplo, 1-2 días, y/o una dosis diaria más baja o más alta. Alternativamente, un inhibidor de neuraminidasa inhalado tal como zanamivir puede desearse para aplicaciones relacionadas con los pulmones. Típicamente las dosis para este fármaco son de 10 mg por inhalación, dos veces diariamente durante 5 días o más según se prescriba. Sin embargo, para su uso en la invención, puede desearse un régimen de dosificación más corto, por ejemplo, 1-2 días, y/o una dosis diaria más baja o más alta. Alternativamente, puede seleccionarse otro tipo de inhibidor de neuraminidasa.

En otro aspecto, los vectores de AAV se redirigen y alejan de un primer subconjunto de células que tienen receptores de ciado F mediante la extirpación funcional de un residuo de ß-galactosa de superficie celular expuesto en el primer subconjunto de células que tiene receptores para AAV9 (por ejemplo, glicanos de superficie celular que tienen residuos de ß-galactosa terminal) y el AAV se redirige de este modo a un segundo subconjunto de células en el sujeto que tienen un receptor de ciado F y/o el número de AAV en contacto con el segundo subconjunto de células se aumenta, aumentado así la captación de estas células. En una modalidad, una ß-galactosa se elimina enzimáticamente en un primer subconjunto de células que tiene los receptores de superficie celular de AAV, reduciendo o eliminando así la captación de AAV por parte de dicho subconjunto de células y redirigíendo el AAV a un segundo subconjunto de células en el sujeto que tienen receptores de AAV9.

En una modalidad, el resto que bloquea funcionalmente el dominio de unión en la superficie del primer subconjunto de células se administra localmente al primer subconjunto de células. Típicamente, este efecto de bloqueo se mantiene relativamente localizado en las células ubicadas próximas al sitio de administración. Por ejemplo, la administración local puede alcanzarse, por ejemplo, mediante inhalación, instalación intranasal, inyección directamente en una articulación o administración directamente en el ojo, así como por una variedad de otros métodos conocidos en la técnica.

Un compuesto puede administrarse para eliminar el efecto de la galactosidasa, lectina u otro resto de bloqueo. Por ejemplo, puede administrarse al sujeto una anti-p-galactosidasa. Por ejemplo, puede utilizarse un compuesto tal como GT-2558 [US 4,497,797] o feniletil-beta-D-tiogalactopiranósido [PETG]. Alternativamente, puede administrarse otro resto para acelerar la eliminación de la ß-galactosidasa o lectina. Sin embargo, se anticipa que el resto (por ejemplo, la enzima galactosidasa) será eliminado fácilmente por el cuerpo del sujeto.

En una modalidad, la ß-galactosa se elimina enzimáticamente mediante la administración de galactosidasa al primer subconjunto de células en combinación con los vectores de AAV. Puede utilizarse una variedad de ß-galactosidasas. En una modalidad, puede utilizarse una isoforma 1 , [GLB1, RefSeq: NM_000404; UniProt P16278]. También están disponibles comercialmente ß-galactosidasas adecuadas, por ejemplo, por NewEnglánd Biolabs, Roche Applied Science y Sigma Aldrich (de fuentes de E. Coli). Esta enzima puede formularse y administrarse según se describió anteriormente para la neuraminidasa. Pueden utilizarse dosis de ß-galactosidasas en el rango de aproximadamente 0.0001 mg a aproximadamente 250 mg por dosis, o aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 100 mg por dosis. Estas dosis pueden ajustarse según sea necesario o deseado. La ß-galactosidasa funciona escindiendo la galactosa y reduciendo significativamente o eliminando sustancialmente la captación de AAV9 por parte de aquellas células en las cuales la galactosa se escindió. De este modo, el vector de AAV9 se redirige a otras células que retienen la galactosa de superficie celular.

En otra modalidad, una lectina que une los residuos de ß-galactosa y, particularmente, residuos de ß-galactosa terminal, se administra al sujeto en combinación con un vector de AAV según se describió en la presente. Entre las lectinas útiles se encuentran lectinas dependientes de calcio (tipo C), tales como lectina tipo C de receptor depurador humano (SRCL) y una lectina dependiente de calcio (tipo C) de macrófago humano. Otras lectinas útiles incluyen la lectina Erythrína Cristagalli (ECL) y una lectina de galactosa de macrófago (MGL). Otras lectinas adicionales pueden incluir lectina de aglutinina de cacahuate o aglutinina de germen de trigo. Varias de estas lectinas se han descrito en la literatura y/o pueden obtenerse a través de fuentes comerciales (por ejemplo, Vectorlabs). Tal como se describe en la presente, una lectina puede formularse en un portador líquido adecuado y puede estar en el rango de 200 a 10,000 g/ml, tal como de 200 a 5000 g/ml, por ejemplo de 200 a 3000 pg/ml, tal como de 200 a 2000 pg/ml, por ejemplo de 200 a 1500 pg/ml de lectina.

En otra modalidad adicional, puede administrarse al sujeto un anticuerpo anti-galactosa terminal.

Los métodos para preparar los vectores en función de AAV9 y otros vectores de AAV según se describe en la presente son conocidos. Ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Publicada No. 2007/0036760 (15 de febrero de 2007), que se incorpora a la presente a modo de referencia. La invención no está limitada al uso de secuencias de aminoácidos de AAV9 u otro AAV de ciado F, pero abarca péptidos y/o proteínas que contienen la unión de ß-galactosa terminal generada por otros métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, por síntesis química, por otras técnicas sintéticas o por otros métodos. Las secuencias de cualquier cápside de AAV proporcionadas en la presente pueden generarse fácilmente utilizando una variedad de técnicas. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas de producción adecuadas. Ver, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Alternativamente, los péptidos también pueden sintetizarse por los métodos bien conocidos de síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield, (1962) J. Am. Chem. Soc, 85:2149; Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) páginas 27-62). Estos y otros métodos de producción adecuados se encuentran dentro del conocimiento de los expertos en la técnica y no constituyen una limitación de la presente invención.

Son conocidos los métodos para generar un virus adeno-asociado (AAV) recombinante, tales como los descritos en la presente (por ejemplo, un AAV que tiene un dominio de unión celular para ß-galactosa). Dicho método implica cultivar una célula huésped que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una cápside de AAV; un gen rep funcional; un minigén compuesto, como mínimo, por repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un transgén; y funciones auxiliares suficientes para permitir el empaquetamiento del minigén en la proteína de cápside de AAV.

Los componentes requeridos para ser cultivados en la célula huésped para empaquetar un minigén de AAV en una cápside de AAV pueden proporcionarse a la célula huésped en trans. Alternativamente, uno o más de los componentes requeridos (por ejemplo, minigén, secuencias rep, secuencias cap y/o funciones auxiliares) pueden ser proporcionados por una célula huésped estable que haya sido diseñada para contener uno o más de los componentes requeridos utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Más adecuadamente, dicha célula huésped estable contendrá los componentes requeridos bajo el control de un promotor inducible. Sin embargo, los componentes requeridos pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo. En la presente se proporcionan ejemplos de promotores inducibles y constitutivos adecuados en la descripción de elementos reguladores para su uso con el transgén. En otra alternativa adicional, una célula huésped estable seleccionada puede contener componentes seleccionados bajo el control de un promotor constitutivo y otro componente seleccionado bajo el control de uno o más promotores inducibles. Por ejemplo, puede generarse una célula huésped estable que sea derivada de células 293 (que contienen funciones auxiliares E1 bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contiene las proteínas rep y/o cap bajo el control de promotores inducibles. Incluso otras células huésped estables pueden generarse por un experto en la técnica.

El minigén, las secuencias rep, las secuencias cap y las funciones auxiliares que se requieren para la producción de AAVr de la invención pueden administrarse a la célula huésped de empaquetamiento en forma de cualquier elemento genético que transfiere las secuencias portadas por el mismo. El elemento genético seleccionado puede administrarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo aquellos descritos en la presente. Los métodos utilizados para construir cualquier modalidad de esta invención son conocidos para los expertos en la manipulación de ácido nucleico e incluyen la ingeniería genética, ingeniería recombinante y técnicas sintéticas. Ver, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. De manera similar, los métodos para generar viriones de rAAV son bien conocidos y la selección de un método adecuado no constituye una limitación para la presente invención. Ver, por ejemplo, K. Fisher et al, (1993) J. Virol., 70:520-532 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,478,745.

A menos que se especifique lo contrario, las ITR de AAV y otros componentes de AAV seleccionados descritos en la presente pueden seleccionarse fácilmente de entre cualquier AAV. Estas ITR u otros componentes de AAV pueden aislarse fácilmente utilizando técnicas disponibles por los expertos en la técnica a partir de una secuencia de AAV. Dicho AAV puede aislarse u obtenerse de fuentes académicas, comerciales o públicas (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassas, VA). Alternativamente, las secuencias de AAV pueden obtenerse a través de medios sintéticos u otros adecuados en referencia a secuencias publicadas, tales como las disponibles en la literatura o en bases de datos tales como, por ejemplo, GenBank®, PubMed® o similares.

A. El miniqén El minigén está compuesto, como mínimo, por un transgén y sus secuencias reguladoras, y las repeticiones terminales invertidas (ITR) de AW 5' y 3'. En una modalidad, se utilizan las ITR del serotipo 2 de AAV. Sin embargo, pueden seleccionarse ITS de otras fuentes adecuadas. Este es el minigén que está compactado en una proteína de cápside y es administrado a una segunda célula huésped. 1. El transgén El transgén es una secuencia de ácido nucleico, heterólogo a las secuencias de vector que flanquean el transgén, que codifica un polipéptido, proteína u otro producto de interés. La secuencia que codifica ácido nucleico está operativamente enlazada a componentes reguladores de un modo tal que permite la transcripción, traducción y/o expresión de transgenes en una célula huésped.

La composición de la secuencia de transgenes dependerá del uso que se le dará al vector resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia de transgenes incluye una secuencia reportera, que tras la expresión produce una señal detectable. Estas secuencias codificantes, cuando se asocian con elementos reguladores que conducen su expresión, proporcionan señales detectables mediante medios convencionales, incluyendo ensayos enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescencia u otros espectrográficos, ensayos de clasificación celular de activación fluorescente y ensayos inmunológicos, incluyendo ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) e inmunohistoquímica. Sin embargo, de forma deseable, el transgén es una secuencia no marcadora que codifica un producto que es útil en biología y medicina, tal como proteínas, péptidos, ARN, enzimas, mutantes dominantes negativos o ARN catalíticos. Las moléculas de ARN deseables incluyen ARNt, ANRbc, ARN ribosómico, ARN catalíticos, ARNsi, ARN de horquilla pequeña, ARN de trans-empalme y ARN antisentido. Un ejemplo de una secuencia de ARN útil es una secuencia que inhibe o extingue la expresión de una secuencia de ácido nucleico objetivo en el sujeto tratado. Típicamente, las secuencias objetivo adecuadas incluyen objetivos oncológicos y enfermedades virales. Ver, como ejemplos de dichos objetivos, los objetivos oncológicos y virus identificados más adelante en la sección que se refiere a inmunógenos.

El transgén puede utilizarse para corregir o aliviar las deficiencias de genes, que pueden incluir deficiencias en las cuales los genes normales se expresan en niveles menores que lo normal o deficiencias en las cuales el producto génico funcional no se expresa. Alternativamente, el transgén puede proporcionar un producto a la célula que no está expresado nativamente en el tipo de célula o en el huésped. Un tipo preferido de secuencia de transgenes codifica una proteína terapéutica o polipéptido que se expresa en una célula huésped. La invención incluye además utilizar múltiples transgenes. En determinadas situaciones, puede utilizarse un transgén diferente para codificar cada subunidad de una proteína o para codificar diferentes péptidos o proteínas. Esto es deseable cuando el tamaño del ADN que codifica la subunidad de proteína es grande, por ejemplo, para una inmunoglobulina, el factor de crecimiento derivado de plaquetas o una proteína distrofina. Para que la célula produzca la proteína de múltiples subunidades, se infecta una célula con el virus recombinante que contiene cada una de las diferentes subunidades. Alternativamente, las diferentes subunidades de una proteína pueden ser codificadas por el mismo transgén. En este caso, un solo transgén incluye el ADN que codifica cada una de las subunidades, con el ADN para cada subunidad separado por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Esto es deseable cuando el tamaño del ADN que codifica cada una de las subunidades es pequeño, por ejemplo, el tamaño total del ADN que codifica las subunidades y el IRES es menor que cinco kilobases. Como una alternativa al IRES, el ADN puede separarse por secuencias que codifican un péptido 2A, que se autoescinde en un evento post-translacional. Ver, por ejemplo, ML Donnelly, et al, (enero de 1997) J. Gen. Virol., 78(Pt 1 ): 13-21 ; S. Furler, S et al, (junio de 2001) Gene Ther., 8(1 1):864-873; H. Klump, et al., (mayo de 2001 ) Gene Ther., 8(10):81 1-817. Este péptido 2A es significativamente más pequeño que un IRES, lo que lo hace más adecuado para su uso cuando el espacio es un factor limitante. Más a menudo, cuando el transgén es grande, consiste en múltiples subunidades o dos transgenes se administran conjuntamente, el rAAV que porta los transgenes o subunidades deseados se administran conjuntamente para permitirles concatemerizarse in vivo para formar un genoma de un solo vector. En dicha modalidad, un primer AAV puede portar un cassette de expresión que expresa un solo transgén y un segundo AAV puede portar un cassette de expresión que expresa un transgén diferente para la coexpresión en la célula huésped. Sin embargo, el transgén seleccionado puede codificar cualquier producto biológicamente activo u otro producto, por ejemplo, un producto deseable para el estudio.

Los expertos en la técnica pueden seleccionar fácilmente transgenes adecuados. La selección del transgén no se considera como una limitación de esta invención. 2. Elementos reguladores Además de los elementos principales identificados anteriormente para el minigén, el vector también incluye elementos de control convencionales que están operativamente enlazados al transgén de un modo que permite su transcripción, traducción y/o expresión en una célula transfectada con el vector plásmido o infectada con el virus producido por la invención. Tal como se utiliza en la presente, "operativamente enlazado" incluye ambas secuencias de control de expresión que son contiguas con el gen de interés y secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.

Las secuencias de expresión de control incluyen secuencias de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción apropiadas; señales de procesamiento de ARN eficientes tales como señales de empalme y poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficiencia de la traducción (es decir, secuencia de consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de la proteína y, cuando se desea, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. Una gran cantidad de secuencias de control de expresión, incluyendo promotores que son nativos, constitutivos, inducibles y/o específicos del tejido, son conocidas en la técnica y pueden ser utilizadas.

Ejemplos de promotores constitutivos incluyen, a modo no taxativo, el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV) (opcionalmente con el potenciador de RSV), el promotor del citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV) [ver, por ejemplo, Boshart et al, (1985) Cell, 41 :521 -530], el promotor SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de ß-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK) y el promotor de EF1 [Invitrogen]. Los promotores inducibles permiten la regulación de la expresión de genes y pueden ser regulados por compuestos suministrados exógenamente, factores ambientales tales como la temperatura o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula o sólo en células replicantes. Los promotores inducibles y sistemas inducibles están disponibles en una variedad de fuentes comerciales, incluyendo, a modo no taxativo, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito muchos otros sistemas, los cuales pueden ser seleccionados fácilmente por un experto en la técnica. Ejemplos de promotores inducibles regulados por compuestos suministrados exógenamente incluyen el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc, el promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema promotor de polimerasa 17 [Publicación de Patente Internacional No. WO 98/10088]; el promotor de insecto de ecdisona [No et al, (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351], el sistema reprimible por tetraciclina [Gossen et al, (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551], el sistema inducible por tetraciclina [Gossen et al, (1995) Science, 268: 766-1769, ver también Harvey et al, (1998) Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518], el sistema inducible por RU486 [Wang et al, (1997) Nat. Biotech., 15:239-243 y Wang et al, (1997) Gene Ther., 4:432-441] y el sistema inducible por rapamicina [Magari et al, (1997) J. Clin. Invest, 100:2865-2872]. Otros tipos de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son aquellos que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula o sólo en células replicantes.

En otra modalidad, se utilizará el promotor nativo para el transgén. El promotor nativo puede preferirse cuando se desea que la expresión del transgén imite la expresión nativa. El promotor nativo puede utilizarse cuando la expresión del transgén debe regularse temporalmente o por el desarrollo, o en un modo específico del tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una modalidad adicional, otros elementos de control de expresión nativos, tales como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias de consenso de Kozak, también pueden utilizarse para imitar la expresión nativa.

Otra modalidad del transgén incluye un gen operativamente enlazado a un promotor específico del tejido. Por ejemplo, si se desea una expresión en el músculo esquelético, debe utilizarse un promotor activo en el músculo. Estos incluyen los promotores de genes que codifican la ß-actina esquelética, la cadena 2A liviana de miosina, distrofina, creatina quinasa muscular, así como promotores musculares sintéticos con actividades más altas que los promotores naturales (ver Li et al., (1999) Nat. Biotech., 17:241 -245). Ejemplos de promotores que son específicos del tejido se conocen para el hígado (albúmina, Miyatake et al., (1997) J. Virol., 71:5124-32; promotor del núcleo del virus de hepatitis B, Sandig er al., (1996) Gene Ther., 3:1002-9; alfa-fetoproteína (AFP), Arbuthnot er a/., (1996) Hum. Gene Ther., 7:1503-14), osteocalcina ósea (Stein er al., (1997) Mol. Biol. Rep., 24:185-96); sialoproteína ósea (Chen et al., (1996) J. Bone Miner. Res., 11 :654-64), linfocitos (CD2, Hansal et a/., (1998) J. Immunol., 161 :1063-8; cadena pesada de inmunoglobulina; cadena receptora de células T); neuronal tal como el promotor de enolasa específica de neuronas (NSE) (Andersen er al., (1993) ell. Mol. Neurobiol., 13:503-15), el gen de neurofilamento de cadena liviana (Piccioli et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:5611-5) y el gen vgf específico de neuronas (Piccioli et al., (1995) Neuron, 15:373-84), entre otros.

La combinación del transgén, promotor/potenciador y los ITR de AAV 5' y 3' se denomina un "minigén" para facilitar la referencia en la presente. Dadas las enseñanzas de esta invención, el diseño de dicho minigén puede realizarse recurriendo a técnicas convencionales. 3. Administración del minigén a una célula huésped de empaquetamiento El minigén puede portarse en cualquier vector adecuado, por ejemplo, un plásmido, que se administra a una célula huésped. Los plásmidos útiles en la presente invención pueden diseñarse de manera que sean adecuados para la replicación y, opcionalmente, la integración en células procariotas, células de mamíferos o ambas. Estos plásmidos (u otros vectores que portan el ITR de AW 5' -molécula heteróloga - ITR de AAV 3') contienen secuencias que permiten la replicación del minigén en eucariotas y/o procariotas y marcadores de selección para estos sistemas. Los marcadores o genes reporteros seleccionables pueden incluir secuencias que codifican la resistencia a geneticina, higromicina o puromicina, entre otros. Los plásmidos pueden contener determinados genes marcadores o reporteros seleccionables que pueden utilizarse para señalar la presencia del vector en células bacterianas, tales como resistencia a ampicilina. Otros componentes del plásmido pueden incluir un origen de replicación y un amplicón, tal como el sistema de amplicones que emplea el antígeno nuclear del virus de Epstein Barr. Este sistema de amplicones u otros componentes de amplicones similares permiten una replicación episomática de alto nivel de copia en las células. Preferiblemente, la molécula que porta el minigén se transfecta en la célula, donde puede salir transitoriamente. Alternativamente, el minigén (que porta el ITR de AAV 5' - molécula heteróloga - ITR 3') puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula huésped, ya sea cromosomalmente o como un episoma. En determinadas modalidades, el minigén puede estar presente en múltiples copias, opcionalmente en concatémeros cabeza a cabeza, cabeza a cola o cola a cola. Se conocen técnicas de transfección adecuadas y pueden utilizarse fácilmente para administrar el minigén a la célula huésped.

Generalmente, cuando se administra el vector que comprende el minigén mediante transfección, el vector se administra en una cantidad de aproximadamente 5 g a aproximadamente 100 pg de ADN, aproximadamente 10 pg a aproximadamente 50 pg de ADN, aproximadamente 1 x 104 células a aproximadamente 1 x 1013 células o aproximadamente 1 x 105 células. Sin embargo, las cantidades relativas de vector de ADN a células huésped puede ajustarse, tomando en cuenta factores tales como el vector seleccionado, el método de administración y las células huésped seleccionadas.

B. Células huésped de empaquetamiento Además del minigén, la célula huésped contiene las secuencias que conducen la expresión de una proteína de cápside de AAV novedosa de la invención (o una proteína de cápside que comprende un fragmento de la misma) en la célula huésped y secuencias rep de la misma fuente como la fuente de los ITR de AAV encontrados en el minigén, o una fuente de complementación cruzada. La célula huésped de empaquetamiento también requiere funciones auxiliares para empaquetar el rAAV de la invención. Dichas funciones auxiliares son bien conocidas en la técnica y no se repetirán en la presente. De manera similar, se conocen los métodos para producir vectores adecuados que tienen cápsides de AAV. [Ver, por ejemplo, la Solicitud de patente de los Estados Unidos publicada No. US 2007/0036760].

Por lo tanto, la invención proporciona además vectores generados utilizando el ácido nucleico y secuencias de aminoácidos del AAV novedoso de la invención. Dichos vectores son útiles para una variedad de propósitos, incluyendo para la administración de moléculas terapéuticas y para su uso en regímenes de vacuna. Particularmente deseable para la administración de moléculas terapéuticas son los AAV recombinantes que contienen cápsides del AAV novedoso de la invención. Estos u otros constructos de vector que contienen secuencias de AAV novedosas de la invención pueden utilizarse en regímenes de vacuna, por ejemplo, para la administración conjunta de una citoquina, o para la administración del inmunógeno en sí.

Por lo tanto, por técnicas conocidas, un experto en la técnica puede generar un rAAV que tenga una cápside de ciado F de AAV, una cápside de AAV9 y/o un vector que tenga una cápside de AAV que comprende un dominio de unión de ß-galactosa de AAV9. En una modalidad, puede utilizarse una cápside de longitud completa de un solo AAV, por ejemplo, hu.14/AAV9 [SEQ ID NO: 1]. En otra modalidad, puede generarse una cápside de longitud completa que contiene uno o más fragmentos de la cápside de AAV9 (por ejemplo, un fragmento que comprende el dominio de unión de ß-galactosa de AAV9) fusionada en el marco con secuencias de otro AAV seleccionado, o de porciones heterólogas (es decir, no contiguas) del mismo AAV. En otra modalidad adicional, un vector con una cápside de AAV9 muíante o un AAV diseñado para contener el dominio de unión a galactosa de AAV9 se ensamblan utilizando técnicas similares.

Los vectores recombinantes descritos anteriormente pueden administrarse a células huésped de acuerdo con métodos publicados. El rAAV, preferiblemente suspendido en un portador fisiológicamente compatible, puede administrarse a un paciente humano o mamífero no humano. Portadores adecuados pueden seleccionarse fácilmente por un experto en la técnica en vista de la indicación para la cual el virus de transferencia se dirige. Por ejemplo, un portador adecuado incluye solución salina, que puede formularse con una variedad de soluciones amortiguadoras (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Otros portadores ejemplares incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de maní, aceite de sésamo y agua. La selección del portador no es una limitación de la presente invención.

Opcionalmente, las composiciones de la invención pueden contener, además del rAAV y portadores, otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tales como conservantes o estabilizadores químicos. Conservantes ejemplares adecuados incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, propil galato, los parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol y paraclorofenol. Estabilizadores químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.

Los vectores se administran en cantidades suficientes para transfectar las células y proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión de genes para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos, o con efectos fisiológicos médicamente aceptables, que pueden determinarse por los expertos en la técnica médica. Vías convencionales y farmacéuticamente aceptables de administración incluyen, a modo no taxativo, administración directa a un órgano deseado (por ejemplo, el pulmón, corazón o cerebro), vía oral, inhalación, intranasal, intratraqueal, intraarterial, infraocular, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica y otras vías parentales de administración. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea.

Las dosificaciones del vector viral dependerán principalmente de factores tales como la afección a tratar, la edad, peso y salud del paciente, y por lo tanto pueden variar entre pacientes. Por ejemplo, una dosificación humana terapéuticamente efectiva del vector viral está generalmente en el rango de aproximadamente 0.1 mL a aproximadamente 100 mL de la solución que contiene concentraciones de aproximadamente 1 x 109 a 1 x 1016 genomas del vector del virus. Una dosificación humana preferida para la administración de órganos grandes (por ejemplo, músculo esquelético, corazón o pulmón) o el sistema nervioso central (por ejemplo, cerebro) puede ser de aproximadamente 5 x 1010 a 5 x 1013 genomas de AAV por 1 kg, en un volumen de aproximadamente 1 a 100 mL. Una dosificación preferida para la administración en el ojo (por ejemplo, retina) es de aproximadamente 5 x 109 a 5 x 1012 copias de genoma, en un volumen de aproximadamente 0.1 mL a 1 mL. La dosificación se ajustará para equilibrar el beneficio terapéutico contra cualquier efecto secundario y dichas dosificaciones pueden variar dependiendo de la aplicación terapéutica para la cual se emplea el vector recombinante. Los niveles de expresión del transgén pueden monitorearse para determinar la frecuencia de dosificación que resulta en vectores virales, preferiblemente vectores de AAV que contienen el minigén.

Tal como se ilustró en los ejemplos para los vectores en función de AAV9, la transducción de células aumentó cuando el SA terminal se retiró enzimáticamente, lo que sugiere que el penúltimo monosacárido comúnmente observado para SA, la galactosa, media la transducción de AAV9. Esto se diferencia de una cantidad de otros serotipos de AW, para los cuales la captación por parte de los glicanos con ácidos siálicos (SA) terminales es un modo común de entrada. La captación de los vectores en función de AAV9 por parte de SA terminal se confirmó en células con deficiencia de enzimas implicadas en la biogénesis de glicoproteínas y estudios de interferencia de lectina. La unión de AAV9 a glicanos con galactosa terminal se determinó en ensayos de unión de glicanos. La importancia de este pasaje para la transferencia de genes dirigidos al pulmón se demostró por co-instilación del vector de AAV9 con neuraminidasa en el pulmón de un ratón que resultó en la exposición de galactosa terminal en la superficie apical de células epiteliales de las vías respiratorias de conducción y un aumento sustancial en la transducción mediada por vector de estas células que son el objetivo relevante para la terapia de genes para la fibrosis quística.

Más adelante se proporcionan ejemplos de productos terapéuticos y productos inmunogénicos para la administración por parte de los vectores que contienen AAV de la invención. Estos vectores pueden utilizarse para una variedad de regímenes, tal como se describe en la presente. Adicionalmente, estos vectores pueden administrarse en combinación con uno o más de otros vectores o ingredientes activos en un régimen deseado.

Por ejemplo, los transgenes adecuados pueden incluir aquellos a ser preferentemente dirigidos al pulmón, incluyendo las células epiteliales de las vías respiratorias de conducción. Dichos transgenes pueden incluir aquellos útiles para tratar la fibrosis quística, incluyendo, por ejemplo, gen regulador de la conductancia de la transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), incluyendo, por ejemplo, uno o más mini-genes CFTR [L. Zhang et al, (18 de agosto de 1998) Proc. Nati. Acad Sci USA, 95(17):10158-63]. De manera similar, pueden utilizarse genes para el tratamiento de otras afecciones del pulmón, incluyendo, por ejemplo, citoquinas anti-inflamatorias u otras moléculas útiles para el tratamiento de EPOC y otros trastornos del pulmón.

En otro ejemplo, los transgenes útiles para tratar trastornos de la retina y/o del ojo más generalmente pueden incluir, por ejemplo, proteína de 65 kDa específica de epitelio de pigmento retinal (RPE65) (para el tratamiento de amaurosis congénita de Leber (LCA), factor derivado del epitelio del pigmento bPDE y AIPL í(PEDF) (por ejemplo, para el tratamiento de degeneración macular y retinopatía diabética), factores antiangiogénicos que incluyen, por ejemplo, factor de crecimiento endotelial anti-vascular (VEGF) (por ejemplo, para el tratamiento de degeneración macular asociada con la edad (AMD) húmeda, así como otros genes asociados con retinitis pigmentosa y LCA, y distrofias de conos y bastones.

En otro ejemplo adicional, pueden seleccionarse transgenes útiles para tratar trastornos de una articulación, por ejemplo, artritis reumatoide. Dichos transgenes pueden ser, por ejemplo, factor de necrosis tumoral (TNF) alfa o agentes bloqueadores de la interleuquina 1 (IL-1) tales como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-TNF alfa, receptores solubles de TNF alfa, receptor soluble tipo II de IL-1 , un antagonista del receptor de IL-1 (IL-1 Ra), citoquinas anti-inflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL1). Dichos antagonistas pueden ser, por ejemplo, un anticuerpo o un Fab o un fragmento funcional del mismo u otro resto.

Otros genes adicionales pueden incluir aquellos útiles para el tratamiento de varias afecciones asociadas con el sistema nervioso central incluyendo, por ejemplo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y trastorno de almacenamiento; genes terapéuticos asociados con la enfermedad coronaria congénita (por ejemplo, SERCA2a, angiopoyetina-1 (Ang1) y Ang2), genes asociados con los trastornos de almacenamiento lisosomal sistémicos; y trastorno de debilitamiento muscular (por ejemplo, distrofina, mini-distrofina), entre otros.

Otros productos terapéuticos útiles adicionales codificados por el transgén pueden seleccionarse para una indicación deseada. Dichos transgenes incluyen hormonas y factores de crecimiento y diferenciación incluyendo, a modo no taxativo, insulina, glucagón, hormona del crecimiento (GH), hormona paratiroidea (PTH), factor de liberación de la hormona del crecimiento (GRF), hormona estimuladora de folículos (FSH), hormona luteinizante (LH), gonadotropina coriónica humana (hCG), factor de crecimiento endoteliaí vascular (VEGF), angiopoyetinas, angiostatina, factor de estimulación de las colonias de granulocitos (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF), factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), factor de crecimiento de fibroblastos ácidos (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento de insulina I y II (IGF-I y IGF-II), cualquiera de la superfamilia de factores a de transformación de crecimiento, incluyendo TGFa, activinas, inhibinas o cualquiera de las proteínas morfogénicas óseas (BMP) BMPs 1-15, cualquiera de la familia de factores de diferenciación de heregulina/neurregulina/ARIA/neu (NDF) de factores de crecimiento, factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 y NT-4/5, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de una línea celular glial (GDNF), neurturina, agrina, cualquiera de la familia de semaforinas/colapsinas, netrina-1 y netrina-2, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), efrinas, nogina, sonic hedgehog y tirosina hidroxilasa.

Otros productos de transgenes útiles incluyen proteínas que regulan el sistema inmune incluyendo, a modo no taxativo, citoquinas y linfocinas tales como trombopoyetina (TPO), interleuquinas (IL) IL-1 hasta IL-25 (incluyendo, por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-12 y IL-18), proteína quimioatractante de monocitos, factor inhibidor de leucemia, factor de estimulación de las colonias de granulocitos-macrófagos, ligando Fas, factores de necrosis tumoral a y ß, ¡nterferones a, ß y ?, factor de células madre y ligando flk-2/flt3. Los productos génicos producidos por el sistema inmune también son útiles en la invención. Estos incluyen, a modo no taxativo, inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de una sola cadena, receptores de célula T, receptores de célula T quiméricos, receptores de célula T de una sola cadena, moléculas MHC de clase I y clase II, así como inmunoglobulinas y moléculas MHC diseñadas. Los productos génicos también incluyen proteínas reguladoras complementarias tales como proteínas reguladoras complementarias, proteína cofactor de membrana (MCP), factor acelerador del decaimiento (DAF), CR1 , CF2 y CD59.

Otros productos génicos adicionales útiles incluyen cualquiera de los receptores para las hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, linfoquinas, proteínas reguladoras y proteínas del sistema inmune. La invención abarca receptores para la regulación del colesterol y/o modulación lipídica, incluyendo el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL), receptor de lipoproteína de alta densidad (HDL), el receptor de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) y los receptores depuradores. La invención también abarca productos génicos tales como membranas de la superfamilia de receptores de hormonas esferoides, incluyendo receptores de glucocorticoides y receptores de estrógeno, receptores de vitamina D y otros receptores nucleares. Además, productos génicos útiles incluyen factores de transcripción tales como jun, fos, max, mad, factor de respuesta de suero (SRF), AP-1 , AP2, myb, MyoD y miogenina, proteínas que contienen una caja de ETS, proteínas de unión de cajas de TFE3, E2F, ATF1 , ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1 , CCAAT, factor de regulación de interferones (IRF-1), proteína del tumor de Wilms, proteína de unión a ETS, STAT, proteína de unión de caja de GATA, por ejemplo, GATA-3, y la familia forkhead de proteínas de alas hélice.

Otros productos génicos útiles incluyen carbamoil-sintetasa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato Nasa, arginasa, fumarilacetacetato hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, alfa-1 antitripsina, glucosa-6-fosfatasa, porfobilinogeno deaminasa, cístationa beta-sintasa, decarboxilasa cetoácida de cadena ramificada, albúmina, isovalerilo-coA deshidrogenasa, propionilo CoA carboxilasa, metilmalonil-CoA-mutasa, glutaril-CoA-deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvato carboxilato, fosforilasa hepática, fosforilasa quinasa, glicina decarboxilasa, proteína H, proteína T, un secuencia reguladora de la transmembrana de fibrosis quística (CFTR), y un producto génico de distrofina [por ejemplo, una mini- o micro-distrofina]. Otros productos génicos adicionales útiles incluyen enzimas tales como las que pueden ser útiles en una terapia de reemplazo de enzimas, que es útil en una variedad de afecciones que resultan de una actividad deficiente de las enzimas. Por ejemplo, pueden utilizarse enzimas que contienen manosa-6-fosfato en terapias para enfermedades de almacenamiento lisosomal (por ejemplo, un gen adecuado incluye que codifica ß-glucuronidasa (GUSB)).

Otros productos génicos adicionales útiles incluyen aquellos utilizados para el tratamiento de hemofilia, incluyendo hemofilia B (incluyendo el Factor IX) y hemofilia A (incluyendo el Factor VIII y sus variantes, tales como la cadena liviana y cadena pesada del heterodímero y el dominio de eliminación de B; Patente de los Estados Unidos No. 6,200,560 y Patente de los Estados Unidos No. 6,221 ,349). Los códigos de genes del Factor VIII para los aminoácidos 2351 y la proteína tiene seis dominios, designados del amino al extremo carboxi terminal como A1-A2-B-A3-C1-C2 [Wood et al, (1984) Nature, 312:330; Vehar et al., (1984) Nature 312:337; y Toóle et al, (1984) Nature, 342:337]. El Factor VIII humano se procesa dentro de la célula para proporcionar un heterodímero que comprende primariamente una cadena pesada que contiene los dominios A1 , A2 y B y una cadena liviana que contiene los dominios A3, C1 y C2. El polipéptido de una sola cadena y el heterodímero circulan ambos en el plasma como precursores inactivos, hasta que se activan por escisión de trombina entre los dominios A2 y B, que liberan el dominio B y resultan en una cadena pesada que consiste en los dominios A1 y A2. El dominio B se elimina en la forma activada de procoagulante de la proteína. Adicionalmente, en la proteína nativa, dos cadenas de polipéptido ("a" y "b"), que flanquean el dominio B, están unidas a un catión de calcio divalente.

En algunas modalidades, el minigén comprende los primeros 57 pares de bases de la cadena pesada del Factor VIII que codifica la secuencia de señal de 10 aminoácidos, así como la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana (hGH). En modalidades alternativas, el minigén comprende además los dominios A1 y A2, así como 5 aminoácidos del extremo N del dominio B y/o 85 aminoácidos del extremo C del domino B, así como los dominios A3, C1 y C2. Aun en otras modalidades, los ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada y cadena liviana del Factor VIII se proporciona en un solo minigén separado por 42 ácidos nucleicos que codifican 14 aminoácidos del dominio B [Patente de los Estados Unidos No. 6,200,560].

Tal como se utiliza en la presente, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad de vector de AAV que produce cantidades suficientes de Factor VIII para disminuir el tiempo que necesita la sangre de un sujeto para coagularse. Generalmente, los hemofílicos severos que tienen menos de 1% de los niveles normales del Factor VIII tienen un tiempo de coagulación de la sangre completo mayor que 60 minutos en comparación con aproximadamente 10 minutos para los no hemofílicos.

La presente invención no está limitada a ninguna secuencia de Factor VIII específica. Se han aislado y generado muchas formas naturales y recombinantes del Factor VIII. Ejemplos de formas naturales y recombinantes del Factor VII pueden encontrarse en la patente y literatura científica que incluyen, Patente de los Estados Unidos No. 5,563,045, Patente de los Estados Unidos No. 5,451 ,521, Patente de los Estados Unidos No. 5,422,260, Patente de los Estados Unidos No. 5,004,803, Patente de los Estados Unidos No. 4,757,006, Patente de los Estados Unidos No. 5,661 ,008, Patente de los Estados Unidos No. 5,789,203, Patente de los Estados Unidos No. 5,681 ,746, Patente de los Estados Unidos No. 5,595,886, Patente de los Estados Unidos No. 5,045,455, Patente de los Estados Unidos No. 5,668,108, Patente de los Estados Unidos No. 5,633,150, Patente de los Estados Unidos No. 5,693,499, Patente de los Estados Unidos No. 5,587,310, Patente de los Estados Unidos. No. 5,171 ,844, Patente de los Estados Unidos No. 5,149,637, Patente de los Estados Unidos No. 5,112,950, Patente de los Estados Unidos No. 4,886,876; Publicación de Patente Internacional Nos. WO 94/11503, WO 87/07144, WO 92/16557, WO 91/09122, WO 97/03195, WO 96/21035 y WO 91/07490; Solicitud de Patente Europea Nos. EP 0 672 138, EP 0 270618, EP 0 182 448, EP 0 162 067, EP 0 786 474, EP 0 533 862, EP 0 506 757, EP 0 874 057.EP 0 795 021 , EP 0 670 332, EP 0 500 734, EP 0 232 112 y EP 0 160 457; Sanberg et al., (1992) XXth Int. Congress of the World Fed. Of Hemophilia y Lind er a/., (1995) Eur. J. Biochem., 232:19.

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el Factor VIII descrito anteriormente pueden obtenerse utilizando métodos recombinantes o derivando la secuencia de un vector que se conoce incluya las mismas. Además, la secuencia deseada puede aislarse directamente de células y tejidos que contienen la misma, utilizando técnicas estándares, tales como extracción de fenol y PCR de ADNc o ADN genómico [Ver, por ejemplo, Sambrook et al]. Las secuencias de nucleótidos también pueden producirse sintéticamente, más que clonarse. La secuencia completa puede ensamblarse a partir de oligonucleótidos preparados por métodos estándares y ensamblarse en una secuencia de codificación completa [Ver, por ejemplo, Edge, (1981) Nature 292:757; Nambarí et al, (1984) Science, 223:1299; y Jay er a/, (1984) J. Biol. Chem. 259:6311].

Además, la invención no está limitada al Factor VIII humano. De hecho, se pretende que la presente invención abarque el Factor VIII de animales que no sean humanos incluyendo, a modo no taxativo, animales de compañía (por ejemplo, caninos, felinos y equinos), ganado (por ejemplo, caprinos y ovinos), animales de laboratorio, mamíferos marinos, grandes felinos, etc.

Los vectores de AAV pueden contener un ácido nucleico que codifica fragmentos del Factor VIII que no es biológicamente activo en sí. Sin embargo cuando se administra a un sujeto mejora o restaura el tiempo de coagulación de la sangre. Por ejemplo, como se describió anteriormente, la proteína de Factor VIII comprende dos cadenas de polipéptidos: una cadena pesada y una cadena liviana separadas por un dominio B que se escinde durante el procesamiento. Como se demostró por la presente invención, co-transducir células receptoras con las cadenas pesada y liviana del Factor VIII conduce a la expresión del Factor VIII biológicamente activo. Debido a que la mayoría de los hemofílicos contienen una mutación o eliminación en sólo una de las cadenas (por ejemplo, cadena pesada o liviana), puede ser posible administrar sólo la cadena defectuosa en el paciente para suministrar la otra cadena.

Otros productos génicos útiles incluyen polipéptidos no naturales, tales como polipéptidos quiméricos o híbridos que tienen una secuencia de aminoácidos no natural que contiene inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, inmunoglobulinas diseñadas de una sola cadena podrían ser útiles en determinados pacientes inmunocomprometidos. Otros tipos de secuencias de genes no naturales incluyen moléculas antisentido y ácidos nucleicos catalíticos, tales como ribozimas, que podrían utilizarse para reducir la sobreexpresión de un objetivo.

La reducción y/o modulación de expresión de un gen es particularmente deseable para el tratamiento de afecciones hiperproliferativas caracterizadas por células hiperproliferantes, así como cánceres y psoriasis. Los polipéptidos objetivos incluyen aquellos polipéptidos que se producen exclusivamente o a niveles más altos en células hiperproliferativas en comparación con células normales. Los antígenos objetivos incluyen polipéptidos codificados por oncogenes tales como myb, myc, fyn y el gen de transposición bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Además de productos oncogénicos como antígenos objetivo, los polipéptidos objetivo para el tratamientos anti-cáncer y regímenes protectores incluyen regiones variables de anticuerpos hechos por linfomas de célula B y regiones variables de receptores de célula T de linfomas de célula T que, en algunas modalidades, también se utilizan como antígenos objetivo para enfermedades autoinmunes. Pueden utilizarse otros polipéptidos asociados a tumores como polipéptidos objetivos tales como polipéptidos que se encuentran en niveles más altos en células tumorales, incluyendo el polipéptido reconocido por el anticuerpo monoclonal 17-1 A y polipéptidos de unión a folatos.

Otros polipéptidos y proteínas terapéuticos adecuados incluyen aquellos que pueden ser útiles para tratar individuos que sufren de enfermedades autoinmunes y trastornos concediendo una respuesta inmune protectora de base amplia contra objetivos que están asociados con la autoinmunidad, incluyendo receptores celulares y células que producen anticuerpos "auto" -dirigidos. Las enfermedades autoinmunes mediadas por las células T incluyen artritis reumatoide (RA), esclerosis múltiple (MS), síndrome de Sjógren, sarcoidosis, diabetes mellitus insulino dependiente (IDDM), tiroiditis autoinmune, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, esclerodermia, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa. Cada una de las enfermedades está caracterizada por receptores de célula T (TCR) que se unen a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada con enfermedades inmunes.

Los expertos en la técnica conocen otros productos adicionales para la administración a células objetivo.

III. Método de aislamiento y purificación La presente invención proporciona un método para aislamiento y detección de AAV9 mediante el uso de ß-galactosa unida a un soporte sólido. La invención también puede aplicarse fácilmente a la purificación de otro AAV de ciado F que tiene sitios de unión para ß-galactosa o a las denominadas "cápsides de AAV9 vacías" (proteínas de cápside intactas sin secuencias genómicas empaquetadas en las mismas) que contienen sitios de unión para ß-galactosa. Por ejemplo, se comprenderá que los vectores de AAV que contienen una cápside de AW quimérica, por ejemplo, aquellos que contienen porciones de AAV9 u otra proteína de cápside de ciado F que tienen sitios de unión a ß-galactosa, pueden ser detectados, separados y aislados de acuerdo con la invención. A efectos de conveniencia a lo largo de la presente memoria descriptiva, estos vectores virales y otras proteínas que tienen sitios de unión específicos para ß-galactosa, tal como se describe en la presente, se denominan "objetivos de purificación". Tal como se indicó anteriormente, se comprenderá que la referencia a AAV9 en esta sección se usa a efectos de abreviación y no excluye otras cápsides de AAV que tengan sitios de unión para ß-galactosa.

Mediante el uso de los métodos descritos en la presente, la eliminación de los virus específicamente unidos (o "proteínas de cápsides vacías") mediante elución o incubación con una solución de alto contenido de sal recupera de forma eficiente AAV9 de una pureza que es más deseable de lo que se logra con una sedimentación de CsC^. Además, esta técnica es rápida, no requiere de equipos especiales y puede utilizarse fácilmente a mayor escala. La invención proporciona además kits útiles para aislamiento y detección de cápsides de AAV9 (ya sea una partícula viral empaquetada o "vacía") usando los métodos descritos en la presente, que utilizan una columna de afinidad de una sola etapa para purificación y detección de vectores virales y, opcionalmente, un sistema de marcadores visualmente detectables.

En una modalidad, el método proporciona un método para aislar un objetivo de purificación. Este método implica exponer una muestra que comprende el objetivo de purificación en contacto con una molécula que comprende ß-galactosa que se ha enlazado a un soporte sólido, con lo cual el objetivo de purificación que tiene un sitio de unión para ß-galactosa se une selectivamente por medio de la molécula. A continuación, el soporte sólido se lava para quitar el material de la muestra que no se une específicamente al soporte sólido. El objetivo de purificación puede separarse entonces del soporte sólido. Opcionalmente, el objetivo de purificación separado del soporte sólido se concentra para uso posterior. En una modalidad, el soporte sólido se carga en una columna de cromatografía por afinidad.

La invención es adecuada para separación y aislamiento de vectores virales que tienen cápsides de un AW de ciado F o un AAV que tiene un dominio de unión celular de AAV9. Estos AAV pueden separarse de los materiales que se encuentran en los cultivos en los que se producen estos virus por la capacidad de sus cápsides de unirse específicamente a la ß-galactosa. El método de la invención es útil en un proceso para separación y aislamiento de un AAV de ciado F o un AAV que tiene un dominio de unión celular de AAV9 de cultivos de producción dependiente de un auxiliar, como adenovirus, AAV1 y los otros materiales virales o celulares que se encuentran en dichos cultivos que no se unen específicamente a la ß-galactosa.

Para su uso en la presente invención, una o más moléculas de ß-galactosa pueden unirse directa o indirectamente (por ejemplo, por medio de un enlazante adecuado) a un soporte sólido, tal como se define en la presente. Alternativamente, la ß-galactosa puede encontrarse en una variedad de moléculas, incluidos restos proteináceos, de azúcar y químicos, que pueden unirse (directa o indirectamente) a un soporte sólido. Para unir de forma eficiente el AAV9, otro AAV de ciado F o quimérico que contiene un dominio de unión celular de AAV9, dichas moléculas contienen una (exo) galactosa terminal. Un ejemplo de una molécula que contiene ß-galactosa es un glicano que tiene ß-galactosa terminal. Dichas moléculas pueden obtenerse de fuentes comerciales o prepararse de acuerdo con una variedad de métodos naturales, sintéticos, recombinantes u otros métodos adecuados.

La síntesis química de ß-galactosa se conoce en la técnica, tal como protección de TBOC o FMOC de grupos alfa-amino. (Ver Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991 , Unidad 9). Alternativamente, los péptidos también pueden sintetizarse mediante métodos de síntesis peptídica de fase sólida bien conocidos (Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1962); Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) págs. 27-62). Alternativamente, puede utilizarse una molécula química que contiene uno o más restos de ß-galactosa, de forma tal que la molécula química esté unida a un soporte sólido. En otra alternativa adicional, un soporte sólido para su uso en purificación puede modificarse químicamente o de otra forma para que contenga un, y preferiblemente más de un, resto de ß-galactosa. Dichos restos de ß-galactosa pueden enlazarse directamente al soporte sólido, por ejemplo, mediante un enlace covalente u otra unión adecuada que soporte la unión de la ß-galactosa al objetivo de purificación y la eliminación de materiales no específicamente unidos. Alternativamente, los restos de ß-galactosa pueden enlazarse indirectamente al soporte sólido, por ejemplo, por medio de un resto que facilita la unión de la ß-galactosa al soporte. Dicho resto puede ser una proteína, un resto químico u otro enlazante adecuado. Los métodos adecuados para enlazar un resto que contiene ß-galactosa o ß-galactosa terminal se conocen en la técnica y también pueden adquirirse de fabricantes de soportes sólidos.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión "soporte sólido" se refiere a cualquier sustancia, incluidos geles, resinas, perlas, polvos y otros sólidos, a los que la ß-galactosa o una molécula que contiene una ß-galactosa terminal puede unirse de forma tal que la molécula de ß-galactosa unida al soporte sólido soporte la unión de la ß-galactosa al objetivo de purificación y la eliminación de materiales no específicamente unidos. Ejemplos de soportes sólidos adecuados incluyen resinas compuestas por sefarosa, agarosa, agarosa reticulada, agarosa-poliacrilamida mixta o poliacrileína; perlas (incluidas microperlas); silicio; vidrio; microcélulas; microcápsulas; placas de microtitulación y biochips. Soportes útiles incluyen los que se describen en la Publicación de Patente Internacional WO 99/27351 , publicada el 3 de junio de 1999; Publicación de Patente Internacional WO 99/27140, publicada el 3 de junio de 1999; Patente de los Estados Unidos No. 6,096,273, Publicación de Patente Internacional WO 00/14197, publicada el 16 de marzo de 2000, entre otras.

Se conocen una variedad de microperlas, incluidas las perlas de aminodextrano descritas en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,074,884; 5,945,293; y 5,658,741. Dispersiones coloidales monodispersas recubiertas de aminodextrano de ferrito magnético [Patente de los Estados Unidos No. 5,240,640]; metal [Patente de los Estados Unidos No. 5,248,772]; poliestireno [Patente de los Estados Unidos No. 5,466,609; Patente de los Estados Unidos No. 5,707,877; Patente de los Estados Unidos No. 5,639,620; Patente de los Estados Unidos No. 5,776,706], y partículas de poliestireno-metal [Patente de los Estados Unidos No. 5,552,086; Patente de los Estados Unidos No. 5,527,713] pueden emplearse también como soportes sólidos de acuerdo con la presente invención. Otro tipo de soporte sólido puede contener el sustrato recubierto descrito anteriormente con una capa de sólido metálico de tamaño coloidal superpuesta al recubrimiento de aminodextrano. Se han descrito perlas de poliestireno-aminodextrano recubiertas de coloides de oro/plata, su preparación, caracterización y uso en análisis de subpoblaciones de glóbulos blancos en sangre entera. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,248,772; Patente de los Estados Unidos No. 5,552,086; Patente de los Estados Unidos No. 5,945,293; O. Siiman y A. Burshteyn, J. Phys. Chem., 104:9795-9810 (2000); y O. Siiman et al, Cytometry, 41 :298-307 (2000). Una alternativa a este sustrato recubierto emplea partículas de poliestireno carboxi-funcionalizadas como el sustrato principal, recubiertas con aminodextrano mediante acoplamiento de EDAC, tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,639,620. Estos y otros soportes sólidos son conocidos por los expertos en la técnica y están disponibles de una variedad de fuentes comerciales, incluidas, a modo no taxativo, Amersham Pharmacia (Uppsala, Suecia); Pierce; Biorad (Richmond, VA) y Beckman Coulter, entre otras.

En una modalidad, el soporte sólido está compuesto por sefarosa activada. La sefarosa activada por CnBr puede adquirirse en Amersham Pharmacia. Sin embargo, se conocen otras fuentes de sefarosa y sefarosa activada, al igual que métodos de activación y compuestos de activación. Ejemplos de sefarosa activada adecuados incluyen sefarosa activada por CnBr, carbonildiimidazol, glutaraldehído, hidroxisuccinimida y tosil cloruro.

Los métodos para la unión de la ß-galactosa, o la molécula que comprende ß-galactosa, al soporte sólido pueden seleccionarse de entre métodos conocidos. Dichos métodos también son proporcionados por los fabricantes de los soportes sólidos. En una modalidad, el soporte sólido enlazado a ß-galactosa se carga en una columna de afinidad para separación, aislamiento y/o purificación del objetivo. En esta modalidad, una muestra que contiene el objetivo de purificación (por ejemplo, lisado de un cultivo de producción de AAV) se deja fluir a través de la columna de forma tal que el objetivo de purificación se una específicamente al soporte sólido enlazado a ß- galactosa. A continuación, la columna se lava para quitar el material no específicamente unido, reteniendo el objetivo de purificación específicamente unido. Es deseable que el reactivo de lavado sea solución salina u otro -reactivo adecuado, tamponada hasta pH fisiológico (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). La columna se somete entonces a una etapa adicional de lavado en condiciones que quiten el objetivo de purificación. Es adecuado que el reactivo de elución sea una solución que contenga altas concentraciones de sal. Un ejemplo adecuado es una solución salina tamponada con fosfato que contiene NaCI en concentraciones de al menos aproximadamente 0.1M. Otra solución adecuada contiene solución salina tamponada con fosfato y al menos aproximadamente 0.4 M de NaCI. Con esta información un experto puede seleccionar fácilmente una solución salina alternativa que tendrá un efecto similar. Alternativamente, el reactivo de elución puede ser cualquier reactivo ácido adecuado o una sal del mismo (por ejemplo, un reactivo que tiene un pH bajo en el rango de aproximadamente 1 a aproximadamente 5). Ejemplos de dichos reactivos incluyen ácido acético (por ejemplo, 1 mM) y sales de los mismos tales como acetato de sodio y 0.1 M de glicina (pH 3), entre otros, que serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Tras la elución del objetivo de purificación (por ejemplo, que tiene un dominio de unión celular de AAV9), el AAV puede someterse a concentración mediante técnicas convencionales.

En otra modalidad, el soporte sólido enlazado a ß-galactosa puede incubarse con una muestra que contiene el objetivo de purificación. En dicha modalidad, la muestra puede ser una solución que contiene el lisado de un cultivo celular en el que se produzca la proteína que debe aislarse. Alternativamente, la muestra puede ser una muestra biológica de un sujeto, o una muestra biológica de un sujeto junto con un diluyente adecuado. Las "muestras biológicas de un sujeto" de la invención pueden incluir cualquier muestra, incluidos, entre otros fluidos, sangre entera, plasma o suero, donde los cuerpos formados son células, particularmente glóbulos rojos. Dichas muestras pueden purificarse mediante métodos convencionales, tales como preparación mediante centrifugación, etc., para el manejo de otras muestras de ese tipo. Estas "muestras biológicas de un sujeto" pueden mezclarse con compuestos de etiquetado y/o mezclarse opcionalmente con soluciones amortiguadoras o diluyentes para ajustar la concentración de la muestra, o preparar de otro modo la muestra para análisis. En otra alternativa adicional, la muestra biológica puede ser una muestra de tejido, y el soporte sólido enlazado a ß-galactosa puede mezclarse con una solución amortiguadora adecuada u otro diluyente para incubación con la muestra de tejido.

En otra modalidad, la invención proporciona un kit útil para separar el objetivo de purificación. Este kit está particularmente bien adaptado para utilizarse en la producción de vectores virales (por ejemplo, un ciado F o vector de AAV que contiene un dominio de unión celular de AAV9 en su cápside).

Normalmente, dicho kit contiene un soporte sólido que tiene ß-galactosa o una molécula que contiene ß-galactosa enlazada a la misma. Dichos soportes sólidos pueden seleccionarse de entre los que se describieron anteriormente. En una modalidad deseable, el soporte sólido es una perla o gel para incubación con la muestra. En otra modalidad deseable, el soporte sólido se carga en una columna de afinidad (por ejemplo, columna de cromatografía líquida) y la muestra se pasa a través de la columna.

Además, un kit de la invención también puede contener los reactivos deseados, incluidos reactivos de lavado, reactivos de elución y reactivos de concentración. Dichos reactivos pueden seleccionarse fácilmente de entre los reactivos descritos en la presente y de entre reactivos de concentración convencionales. En una modalidad deseable, el reactivo de lavado es una solución salina ¡sotónica que ha sido tamponada hasta pH fisiológico, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS); el reactivo de elución es PBS que contiene 0.4 M de NaCI y los reactivos y dispositivos de concentración. Por ejemplo, un experto en la técnica reconocerá que reactivos tales como polietilenglicol (PEG) o NH4SO4 pueden ser útiles, o dispositivos tales como dispositivos de filtro. Por ejemplo, un dispositivo de filtro con una membrana de 100 K concentraría rAAV.

Estos kits pueden contener adicionalmente reactivos necesarios para mantener o preservar las muestras. En un aspecto más importante, el kit contiene instrucciones para realizar el ensayo competitivo y preparar los testigos. También pueden proporcionarse en un kit diluyentes y soluciones amortiguadoras adecuadas para las muestras, gráficas indicadoras para comparaciones de señal, guantes desechables, instrucciones para descontaminación, tiras aplicadoras o recipientes y cubetas de preparación de muestras. Los kits preferiblemente contienen también sustancias o medios de tamponación necesarios, según sea necesario. Un experto en la técnica podría armar cualquier número de kits con la información y los componentes necesarios para realizar el método en un paciente para cualquier receptor y célula objetivo específica, y comparar los resultados con las normas para dicho sitio de unión.

En otra modalidad adicional, la invención proporciona un kit útil para detectar la presencia del objetivo de purificación (por ejemplo, AAV9) en una muestra. Además de contener los componentes descritos anteriormente, dicho kit puede contener también un reactivo marcador que permite la detección visual de la unión del objetivo de purificación a la molécula. Este kit está particularmente bien adaptado para detección del objetivo de purificación en una muestra biológica de un sujeto, por ejemplo, la sangre. Este tipo de kit, además de contener el soporte y los reactivos enlazados a ß-galactosa descritos anteriormente, puede incluir además marcadores que son visualmente detectables.

El término "marcadores" generalmente se refiere a moléculas, preferiblemente moléculas proteináceas, pero también pequeñas moléculas químicas, preferiblemente aquellas que son visualmente detectables. En un ejemplo, estos marcadores permiten la detección emitiendo una señal detectable de una longitud de onda particular tras la excitación mediante un láser. Las ficobiliproteínas, tintes en serie, ciertas proteínas fluorescentes, pequeñas moléculas químicas y ciertas moléculas detectables a través de otros medios, pueden considerarse marcadores para estos análisis. Ver, por ejemplo, los marcadores enumerados en Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6ta Ed., R.P. Haugland, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR (1996).

Ejemplos de ficobiliproteínas útiles en la presente invención son ficocianina, aloficocianina (APC), aloficocianina B, ficoeritrina (PE) y preferiblemente R-ficoeritrina. La PE se encuentra entre los tintes fluorescentes más brillantes disponibles actualmente. Conjugada con un anticuerpo, la PE se ha utilizado para detectar la interleuquina-4 en un ensayo de placa fluorescente (MC Custer y MT Lotze, (1990) J. Immunol. Meth., 128, 109-117) y se encontró que era el único fluoróforo evaluado en producir la señal adecuada. Los tintes en serie son moléculas no naturales que pueden formarse de una ficobiliproteína y otro tinte. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,542,104 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,272,257. Ejemplos de tintes en serie útiles en la presente invención son ficoeritrocianina o PC5 (PE-Cy5, ficoeritrina-cianina 5.1 ; excitación, 486-580 nm, emisión, 660-680 nm) [A.S. Waggoner et al, (1993) Ann. N. Y. Acad. Sci., 677:185-193 y la Patente de los Estados Unidos No. 5, 171 ,846] y ECD (ficoeritrina-rojo Texas; excitación, 486-575 nm, emisión, 610-635 nm) [Patente de los Estados Unidos No. 4,542,104 y Patente de los Estados Unidos No. 5,272,257]. Otros tintes en serie conocidos son PE-Cy7, APC-Cy5 y APC-Cy7 [M. Roederer et al, (1996) Cytometry, 24:191-197]. Los tintes en serie, PC5 y ECD, han sido conjugados directamente de forma exitosa con anticuerpos monoclonales mediante varios métodos que implican la activación del tinte por iminotiolano. Otros marcadores adicionales que pueden conjugarse directamente con un ligando y utilizarse con las ficobiliproteínas o tintes en serie en la presente invención para agregar números adicionales de marcadores (ligandos etiquetados) al método incluyen pequeñas moléculas que con la excitación emiten longitudes de onda de menos de 550 nm. Dichas moléculas no se superponen con las emisiones de las ficobiliproteínas. Un ejemplo de dicho marcador es el isotiocianato de fluoresceína (FITC). Otros se enumeran en el Manual citado anteriormente. Otros marcadores adicionales que pueden emplearse en este método para proporcionar colores adicionales son las proteínas conocidas como proteínas fluorescentes verdes y las proteínas fluorescentes azules. También pueden ser útiles marcadores que emiten tras la excitación con luz ultravioleta. Las biliproteínas y tintes en serie están disponibles en el mercado de varias fuentes, incluidas Coulter International Corporation, Miami, FL, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR y Prozyme, Inc., San Leandro, CA. Los otros marcadores o etiquetas descritos anteriormente pueden obtenerse en el mercado de fuentes conocidas.

Los métodos para utilizar estos marcadores serán evidentes para los expertos en la técnica, y pueden implicar incubar la muestra en presencia de un marcador antes de poner en contacto el soporte sólido enlazado a ß-galactosa. Alternativamente, el marcador puede unirse al soporte sólido. En otra alternativa adicional, el marcador puede incubarse en un eluido que contiene el objetivo de purificación después de la etapa de lavado que elimina el objetivo de purificación unido del soporte sólido. La selección del marcador y el sistema de detección no constituyen una limitación de la presente invención. Los kits proporcionados por la presente invención son útiles para realizar los métodos descritos en la presente.

Los siguientes ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

IV. EJEMPLOS EJEMPLO 1 Ensayos de unión y transducción celular.

A. Ensayos de unión Para ensayos de unión, las células se rasparon de matraces de 150cm2 y se sembraron en placas de 96 pocilios a 5x105 células/pocilio en 100 µ? de medios fríos libres de suero (SF). Los vectores de AAV se produjeron de la forma descrita anteriormente por Penn Vector (http://www.med.upenn.edu/gtp/-vector_core.shtml) y se agregaron a 5x109 copias de genoma (CG)/pocillo en 100 µ? de medios fríos SF y se incubaron a 4°C durante 1 hr. Las células se lavaron tres veces con medios de SF y se resuspendieron en 200 pl de PBS. El ADN total se extrajo usando el Mini kit de ADN QlAamp (QIAGEN). Las CG unidas a células se cuantificaron por PCR en tiempo real. Los cebadores y sonda utilizados eran complementarios a la secuencia SV40 poliA del genoma del vector. Cebador F: AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA [SEQ ID NO: 2]; cebador R: CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT [SEQ ID NO: 3]; sonda TaqMan: 6FAM-AGCA I I I I I I I CACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC [SEQ ID NO: 4 J-TA RA. Para ensayos de transducción celular, las células se sembraron a 105 células/pocilio en placas de 96 pocilios de color negro de fondo claro durante toda la noche. Las placas se colocaron entonces a 4°C durante 15 min y 109 CG de vector de AAV con expresión de ffLuc se agregaron en 100 µ? de medios fríos SF y se incubaron durante 1 hr a 4°C. Las células se lavaron tres veces con medios SF. Los miembros tibios que contenían suero se complementaron y las células se incubaron a 37 °C durante 48 hrs. La expresión de ffLuc se monitoreó agregando 150 pg/ml de sustrato de D-luciferina por pocilio y midiendo las unidades de luz relativa/segundo (ULR/s) usando un luminómetro.

B. Ensayos de transducción celular Para ensayos de transducción celular, las células se rasparon de matraces de 150cm2 y se sembraron a 5xs105 células/pocilio en placas de 96 pocilios de color negro de fondo claro durante toda la noche. Luego se colocaron las placas a 4°C durante 15 min y 109 CG de vector de AAV con expresión ffLuc se agregaron en 100 µ? de medios fríos SF y se incubaron durante 1 hr a 4°C. Las células se lavaron tres veces con medios de SF. Los miembros cálidos que contienen suero se complementaron y las células se incubaron a 37°C durante 48 hrs. La expresión de ffLuc se monitoreó agregando 150 pg/ml de sustrato de D-luciferina por pocilio y midiendo las unidades de luz relativa/segundo (ULR/s) usando un luminómetro.

C. Experimentos ¡n vivo AAV con o sin 100 mU de NA en 50µ? de PBS. NA se administró 1 hr antes o simultáneamente con la instalación del vector. La expresión de nLacZ en los pulmones se examinó 21 días post-administración mediante los métodos descritos anteriormente [Bell, et al, Histochem Cell Biol, 124 (6): 2427-35 (2005)]. Las secciones de pulmón fueron examinadas con un aumento de 100x y 200x. Las células positivas LacZ en las vías respiratorias de conducción fueron cuantificadas contando las células positivas por campo de vista de aumento 200x. Los ratones fueron anestesiados con cetamina/xilazina y se les administró una instilación intranasal de 100 mU de NA en 30µ? de PBS o PBS solo como testigo. Los pulmones se cultivaron 1hr después mediante los métodos descritos anteriormente (Bell, 2005, citado anteriormente) y se fijaron secciones en acetona fría (-20°C) durante 5 min. Las secciones de pulmón se bloquearon luego con Solución Bloqueadora Carbo-freeTM (Vector Laboratories) y se incubaron con 15 pg/ml de Aglutinina I de Ricinus Communis (RCA I) etiquetada con rhodamina y 7.5pg/ml de Lectina de Sambucus Nigra etiquetada con fluoresceína (SNA) durante 30 min a temperatura ambiente. Luego se lavaron los portaobjetos dos veces en PBS y se montaron en Vectashield con DAPI (Vector Laboratories). Se tomaron imágenes mediante microscopía de campo amplio (200x) y confocal (microscopía confocal Zeiss LSM 510). Para tinción de RCA de músculo, corazón, hígado y cerebro, se extirparon los órganos de ratones sin tratar y las secciones se tiñeron como se indicó anteriormente. Para tinción de CD31 de cerebro, se incubaron los portaobjetos 48 con anticuerpo primario anti-CD31 (BD Pharmingen) y posteriormente anticuerpo secundario anti-rata etiquetado con fluoresceína (Vector Laboratories) y RCA etiquetada con rhodamina. Para tinción de a-tubulina de pulmón, los portaobjetos se procesaron como se indicó anteriormente, salvo que las secciones se fijaron en 4% de paraformaldehído y se tiñeron con anticuerpo primario anti-a-tubulina de ratón (Sigma) y posteriormente un anticuerpo secundario anti-ratón de caballo etiquetado con fluoresceína (Vector Laboratories) y RCA etiquetada con rhodamina. Las imágenes se tomaron a un aumento de 400x. La significación estadística se determinó usando una prueba t Student de 2 colas. Los valores P de menos de 0.001 se consideraron significativos. Los datos son representados como media ± DE.

EJEMPLO 2 Tratamiento de glicosidasa y competición de lectina.

Se trataron las células Pro-5 con 50 mU/ml de NA tipo III de Vibrio cholerae (Sigma) en 100 µ? de medios SF o células testigo con medios solos durante 2 hrs a 37°C. Algunas células fueron tratadas adicionalmente con 60 mU/ml de p-(1 ,4)-galactosidasa en 50 µ? de solución amortiguadora de reacción (Sigma) o células testigo con solución amortiguadora de reacción sola durante 3 hrs a 37°C. Las células se lavaron luego tres veces antes de los estudios de unión y transducción, tal como se describió anteriormente.

Para estudios de competición de lectina, las células Pro-5 se trataron primero con NA para quitar el ácido siálico. Las células se lavaron con medios SF fríos y se agregaron lectinas a 50 pg/ml en 100 µ? de medios SF o medios solos como testigo y se incubaron a 4°C durante 15 min. Luego se retiró la solución de lectina y la mezcla del vector de AAV (5x109 CG para ensayos de unión y 109 CG para ensayos de transducción) y se agregaron 50 pg/ml de lectina o vector solo como testigo y se incubaron a 4°C durante 1 hr. Las células se lavaron y se analizaron para la unión o transducción de AAV tal como se describió anteriormente. Las lectinas utilizadas en este estudio incluyen Lectina de Erythrina Cristagalli (ECL), que une galactosil (ß-1 ,4) N-acetilglucosamina, Aglutinina I de Ricinus Communis (RCA I), que une los residuos de galactosa terminal, Aglutinina de Germen de Trigo (WGA), que une N-acetilglucosamina y también interactúa por medio de ácido siálico, Lectina Híbrida de Hippeastrum (HHL), que une (a-1 ,3) y (a-1 ,6) mañosa, isolectina B4 de Lectina I de Griffonia Simplicifolia (GSL B4), que une a-galactosa, y Lectina de Lotus Tetragonolobus (LTL), que une la fucosa a-enlazada (Vector Laboratories).

EJEMPLO 3 Detección de la especificidad de unión a glicano de AAV9 Para estudios de unión a microarreglo de glicanos (GMA) se prepararon partículas tipo virus (VLP) de AAV9 usando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac/sistema de expresión de Sf9 como se describió anteriormente [Mitchell, et al, 2004, PLoS Biol 2(8): E234] y se detectaron en un microarreglo de glicanos de alto rendimiento desarrollado por los Núcleos D y H del Consorcio para Glicómica Funcional (CFG; una Iniciativa del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales del NIH). El arreglo impreso (Arreglo Impreso de Mamíferos [PA] V4.1 , http://www.functional-glycomics.org/static/consortium/resources/resourcecoreh14.shtml) estaba compuesto por 465 glicanos de mamíferos naturales y sintéticos diferentes, incluidas azúcares sialiladas con diferentes enlaces y modificaciones que se generaron usando acoplamiento de amina a glicanos funcionalizados de amina de enlace covalente o glicanoconjugados a un portaobjetos de vidrio activado con N-hidroxisuccinimida amina-reactiva. Un portaobjetos impreso, que. contenía seis copias por glicano o glicoconjugado, se incubó con VLP de AAV9 a 200 pg/ml, luego ADK9, un anticuerpo monoclonal de cápside (proporcionado por Jurgen Kleinschmidt, Germán Cáncer Research Centre, Heidelberg, Alemania) se superpuso en las cápsides unidas y posteriormente un anticuerpo secundario etiquetado con FITC (a 5 pg/ml) para detección. La intensidad de la fluorescencia se detectó usando un escáner confocal ScanArray 5000 (Perkin Elmer Inc.). Se utilizó el software de análisis de imágenes IMAGENE (BioDiscovery, El Segundo, CA) para analizar la imagen. La unión relativa para cada glicano se expresó como unidades de fluorescencia relativa media (UFR) de cuatro de las seis copias, calculada sin usar los valores más altos y más bajos. Los datos de unión se analizaron usando dos criterios de selección: (I) Glicanos que se encontraban dentro de 3 desviaciones estándar de la media del glicano con el valor de UFR más alto y (II) Glicanos con coeficiente de variación (%CV) de < 20% entre las UFR de los cuatro copias usadAs para calcular el valor de UFR promedio (con % CV = coeficiente de variación, definido como la relación entre la desviación estándar de los datos de la media expresada como porcentaje). La información relevante a la generación de los datos del arreglo de glicanos está disponible en el sitio web de acceso libre en el siguiente URL/sitio de acceso: http://wvm.functionalglycomics.org/glycomics/HSen/let?operation=view&sideM enu=no&psld=primscreen_3528. Se incluyen en estos datos los datos sin procesar, los datos normalizados, anotación simple, diseño experimental, anotación del arreglo de glicanos y protocolos experimentales (id de acceso primscreen_3528).

Resultados Tal como se describe en la presente, varios AAV descritos anteriormente (serotipos 1 , 2, 5 y 6) y los serotipos de AAV novedosos 7, 8, 9 y rh32.33 se evaluaron para la unión a la línea celular de CHO Pro-5, que se utiliza para estudiar la genética y la bioquímica de la glucosilación, con y sin tratamiento con ß??-ß-sialidasa (neuraminidasa, NA). Los resultados con los AAV de la primera generación fueron como se esperaba, ya que el pretratamiento de NA (Fig. 1A) no tuvo efecto en la unión de AAV2 y la unión de AAV1 , AAV5 y AAV6 se redujo en al menos dos logaritmos (Fig. 1 B). Los estudios con los AAV novedosos no demostraron un efecto del tratamiento de NA en la unión de AAV7, 8 y rh32.33, mientras que AAV9 demostró un inesperado aumento logarítmico de 2.5 en la unión (Fig. 1 B).

Los inventores especularon que la presencia de SA terminal en un oligosacárido inhibió la unión a AAV9 o que la eliminación de SA expuso una molécula que mejoró la unión. Se consideró que el candidato más probable sería ß-1,3 o ß-1,4 galactosa, que es el penúltimo monosacárido en la mayoría de los glicanos ricos en SA (Fig. 1A). Estas hipótesis se exploraron inicialmente usando mutantés de células somáticas de la línea celular de CHO base, Pro-5, que son deficientes en varias enzimas que participan en la glucosilación en virtud de la resistencia a la lectina [SK Patnaik y P. Stanley (2006) Methods Enzymol 416:159-182]. Lec-2 es deficiente en el transportador del aparato de golgi CMP-SA y debería tener un complemento completo de N-y O-glicanos que carecen de SA terminal (Fig. A). Lec-8 es deficiente en el transportador del aparato de golgi UDP-Gal, que debería producir N- y O-glicanos que faltan tanto en SA como en sacáridos de galactosa (Fig. 1A). Los vectores en función de los AAV 2, 6, y 9 que expresan luciferasa de luciérnaga (ffLuc) se incubaron con células Pro-5, Lec-2 y Lec-8 y se analizó la unión y transducción (Fig. 2A, Fig. 2B). La unión y transducción de AAV2 fue igual en las tres líneas celulares y disminuyó con AAV6 en células Lec-2 y Lec-8 con respecto a células Pro-5, lo que era de esperar en función de los estudios anteriores que demostraron la importancia de SA para facilitar la entrada de AAV6. Para AAV9, la unión y transducción aumentó sustancialmente en Lec-2 pero disminuyó hasta los niveles de referencia en células Lec-8, lo que es más consistente con la hipótesis de que la unión a ß-galactosa terminal facilita la captación en vez de que SA inhiba la captación. La concurrencia de unión con transducción sugiere que la unión a galactosa terminal es la etapa de limitación de velocidad en la transducción de AAV9. El impacto de la eliminación de ácido siálico fue mayor en la unión que en la transducción, lo que siguiere que las etapas posteriores a la entrada también pueden limitar la transducción.

El rol de la galactosa terminal en la unión de AAV9 se estudió también en células Pro-5 que se pretrataron con NA y luego se cocultivaron con lectinas de diferentes especificidades (Fig. 2C, unión; Fig. 2D, transducción). Las únicas lectinas que bloquearon la unión de AAV9 fueron Lectina de Erythrina Crístagalli (ECL) que reconoce ß-1 ,4 galactosa y Aglutinina I de Ricinus Communis (RCA I) que reconoce varios tipos de enlaces de ß-galactosa, mostrando la ß-1 ,4 galactosa la afinidad más alta; tampoco afectaron la unión de AAV2. Las lectinas que reconocen a-galactosa [isolectina B4 de Lectina I de Griffonia Simplicifolia (GSL B4)], a-1 ,3 y a-1 ,6 mañosa [Lectina Híbrida de Hippeast m (HHL)] y a-fucosa [Lectina de Lotus Tetragonolobus (LTL)] no interfirieron en la unión de AAV2 o AAV9. La Aglutinina de Germen de Trigo (WGA) tuvo un efecto leve en la unión de AAV9, probablemente debido a su interacción con N-acetilglucosamina que comúnmente está unida a galactosa. La inhibición de la lectina de la transducción de AAV2 y AAV9 confirmó los resultados de unión excepto para RCA que no fue informativa porque fue tóxica para las células.

Una confirmación final de la especificidad de glicano de la captación de AAV9 se realizó en células Pro-5 pretratadas con NA para escindir SA o NA terminal y ß-galactosidasa (ß-gal) que eliminaría tanto NA y sacáridos de ß-galactosa (Fig. 1A). La unión y transducción con AAV2 no fueron afectadas por el pretratamiento de enzimas, mientras que NA mejoró la transducción de AAV9, tal como se describió anteriormente, un efecto que se revirtió mediante el tratamiento posterior con ß-gal (Fig. 2E, Fig. 2F).

Las interacciones entre glicano-cápside de AAV9 se interrogaron también usando un microarreglo de glicanos compuesto por 465 glicanos de mamífero naturales y sintéticos diferentes que contiene 6 copias para cada glicano. Se utilizó una estrategia similar para verificar la unión de AAV1 a glicanos sialilados según se determinó mediante abordajes bioquímicos y moleculares (Wu et al., 2006, J Viral, 80: 9093-9103). En nuestro análisis, cada glicano se evaluó para detectar la unión, según se midió mediante unidades fluorescentes relativas (UFR) en términos de la media de cuatro copias dentro del arreglo ± 1 DE (se eliminó la unión más alta y más abaja dentro de las seis copias). La variación dentro de las 4 copias se evaluó como el %CV que se consideró bajo si fue menor que 20. La selección de glicanos con afinidad de unión específica para cápsides de AAV9 se basó en dos criterios independientes; alta unión total según se midió mediante UFR y variación baja entre las 4 copias tal como se evaluó mediante %CV. Los glicanos de unión más alta fueron definidos arbitrariamente como aquellos con valores UFR medios que estaban dentro de 3 de D.E. del glicano de unión más alto 415. De los cuatro glicanos que cumplieron con los criterios de alta afinidad de unión, tres mostraron especificidad alta tal como se midió mediante %CV de menos de 20. Estos tres glicanos, 415, 297 y 399, demostraron suficiente afinidad y especificidad para considerarse receptores potenciales para la unión de AAV9. Los tres glicanos seleccionados por ser específicos para la unión a AAV9 en función de la unión total y especificidad de unión se demostró que tenían galactosa terminal (Gal) con enlaces ß-1 ,4 (415 y 399) o un enlace ß-1 ,3 (297). Cada glicano contiene ß1-3 enlazado a Gai i-4(Fuc a1-3) o ß1-6 a GalNAc en sus estructuras, lo que sugiere un contexto estructural del glicano con deficiencia de ácido siálico para la unión a AAV9. Reconciliar los datos de unión con los experimentos de unión/transducción en función de células confirma el papel de los enlaces de ß-galactosa terminal en tropismo de AAV9.

Tal como se describe en la presente, se llevaron a cabo estudios en ratones para determinar si la traducción de las vías respiratorias de conducción con AAV9 podría mejorarse mediante el pretratamiento de las vías respiratorias de ratones con una formulación que contenía NA. Se realizaron comparaciones con ratones a los que se les administró AAV6 que en estudios anteriores mostró una transducción in vivo eficiente de las vías respiratorias de conducción [MP Limberis, et al, (2009) Mol Ther 17:294-301] que en función de estudios in vitro con líneas celulares puede depender de la unión con SA [Z. Wu, et al., (2006) J Virol 80:9093-9103]. La administración pulmonar de AAV9 en ausencia de NA demostró el patrón esperado de transducción restringida alveolar; la administración de NA en el pulmón 1 hr antes o al momento de la administración de AAV9 proporcionó un patrón muy diferente con un alto nivel de transducción en las células epiteliales de las vías respiratorias alveolares y de conducción. El alto nivel de transducción de las vías respiratorias de conducción obtenido con AAV6 se eliminó por completo cuando los animales se trataron con NA, confirmando la dependencia de la transducción in vivo en la unión a SA. Las consecuencias de la administración de NA a las vías respiratorias en la abundancia y la distribución de la estructura de glicano se estudiaron directamente mediante tinción de las secciones de pulmón con lectinas fluorescentes que unen residuos de galactosa terminal (RCA) o residuos de SA terminal (SNA). Antes del tratamiento con NA, la tinción con RCA se limitó a las células alveolares y la región lateral basal de las vías respiratorias de conducción.'" Se observó un patrón similar con SNA a pesar de que la superficie apical de las vías respiratorias de conducción también se tiñó. El tratamiento con NA tuvo el resultado más drástico en la tinción de las células epiteliales de las vías respiratorias de conducción que aumentó sustancialmente con respecto a RCA y se redujo moderadamente con respecto a SNA.

Se llevaron a cabo estudios microscópicos de resolución más alta para determinar si la unión de RCA se ubicaba en la membrana de plasma o la capa de moco subyacente. Las secciones de pulmón de animales pretratarados con NA se evaluaron para la colocalización de tinción de RCA con localización inmunitaria de a-tubulina, que delinea los cilios de la superficie apical de las células epiteliales de las vías respiratorias. Estos estudios demostraron la unión de RCA a la superficie celular de las células epiteliales en las vías respiratorias de conducción de pulmones pretratados con NA.

Un gran impedimento para la transducción tras administración intravascular (IV) de vectores de AAV es la barrera física del endotelio contiguo y la lámina basal de la microcirculación. La única excepción es el hígado que contiene endotelio fenestrado que permite el acceso directo del vector en sangre a los hepatocitos. AAV9 es único porque supera parcialmente la barrera que permite el direccionamiento de músculo esquelético y cardíaco y, en menor medida, las células del sistema nervioso central (Inagaki, K., S. et al. (2006), Mol Ther 14(1 ): 45-53.; Duque, et al. , (2009) Mol Ther 17: 1 187-1 196; K.D. Foust, et al, (2009), Nat Biotechnol 27:59-65). La transducción de lacZ se analizó tras la administración IV del vector de AAV9 en dosis de 1011 y 1012 copias de genoma (CG)/ratón. Esto se correlacionó con la presencia de ß-galactosa terminal a través de la tinción con RCA. Tal como se ha descrito, el hígado se transduce de manera eficiente a dosis bajas de vector [Vandendriessche, et al, 2007, J Thromb Haemost 5(1 ): 16-24)]; es posible transducir de forma eficiente el músculo cardíaco y esquelético a dosis de vector más altas [Inagaki, 2006, citado anteriormente]. Las superficies de fibras de músculo de tejidos esquelético y cardíaco demostraron niveles altos de ß-galactosa terminal tal como se prueba mediante unión a RCA. Los hepatocitos demostraron niveles más bajos de unión de RCA a pesar de que las superficies endoteliales de vasos hepáticos se tiñeron de color brillante.

Los estudios de unión de lectina de tejidos cerebrales fueron notables para la unión importante de RCA pero no de SNA a célula endotelial. Esto es intrigante dado que AAV9 tiene la única propiedad de dirigir las células del SNC después de la inyección intravenosa a pesar de que se logra una transducción eficiente con AAV9 y AAV5 cuando se inyectan directamente en el cerebro [B.L. Davidson, et al., (2000) Proc Nati Acad Sci U S A 97:3428-3432; S.]. Un gran impedimento de la administración al SNC de agentes terapéuticos tras la administración sistémica es la barrera cerebral de sangre que se forma de una red única apretada de células endoteliales. Las vías receptoras y de transcitosis mediada por absorción en el endotelio han sido explotadas para superar esta barrera. Los altos niveles del receptor de AAV9 que se encuentra en la micro-circulación del cerebro puede participar en su capacidad de dirigir el SNC a través de vías transcitóticas.

El posible papel de los glicanos para mediar la transducción de AAV9 fue el centro de este estudio dado que sirven como receptores para infección de virus generalmente con una especificidad exquisita con respecto al componente monosacárido. Se han descrito interacciones específicas con glicanos que contienen ácido siálico terminal para muchos virus que incluyen varios otros serotipos de AAV. Nuestro hallazgo de que la unión y transducción por AAV9 ocurre mediante enlaces de ß-galactosa terminal no se ha descrito para ningún otro virus, incluidos los AAV conocidos, a pesar de que el Norovirus se une a glicanos con enlaces de a-galactosa (Zakhour, M., (2009). El epítopo alphaGal de la familia del antígeno del grupo de histo-sangre es un ligando para el norovirus bovino Newbury2 que se espera que prevenga la trasmisión de la especie cruzada. PLoS Pathog 5(7): e1000504.).

Los estudios de arreglo de glicanos demostraron unión específica de AAV9 a 3 glicanos, los cuales contenían enlaces de ß-galactosa terminal confirmando la importancia de este sacárido en la transducción como se delineó en múltiples líneas celulares usando tres abordajes independientes (es decir, pretratamiento de glicosidasa, competición de lectina y mutantes de células somáticas). Estos glicanos contenían ß1-3 enlazado a GIcNAc de Gal 1-4(Fuca1-3) o ß1-6 a GalNAc en sus estructuras y se enlazaron mediante treoinina a través de GalNAc, lo que indica que los glicanos que contienen galactosa enlazada a O pueden unirse a AAV9 a pesar de que interacciones funcionales con glicanos asociados con otros tipos de enlaces no pueden descartarse (Marth, J. D. 1999. O-Glycans. Essentials of Glycobiology. A. Varki, R. Cummings, J. Eskoet al. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press: p. 101-113.). Una advertencia importante con respecto a los datos de unión es que la afinidad de unión no necesariamente se correlaciona con la importancia funcional en términos de receptores glucosilados que median la transducción. Los receptores para vectores de terapia génica importante han sido bien caracterizados in vitro pero raramente se ha confirmado la significación de estos receptores para la transducción in vivo. Un ejemplo de una discordancia entre la transducción in vitro e in vivo es el del adenovirus humano 5 (Ad5). El receptor del virus coxsackie y adenovirus (CAR) se aisló como receptor para Ad5 en función de estudios in vitrq e intentos por confirmar la importancia de CAR tras la transferencia de genes in vivo utilizaron Ad5 con supresión de la unión a CAR. Después de la administración intravenosa, los niveles de transducción y el perfil selectivo de hígado de vectores de Ad5 suprimidos de la unión a CAR fueron similares a Ad5, lo que sugiere vías de captación redundantes potenciales in vivo. Las investigación del mecanismo de transducción de Ad5 in vivo determinó que la presencia de factores de coagulación sanguínea podría mediar la transducción a través de una vía no dependiente de CAR. En comparación, nuestros estudios con vectores de AAV9 tras la transferencia de genes dirigidos a los pulmones en combinación con NA confirmó directamente la importancia de enlaces de ß-galactosa en la transducción de las células epiteliales de las vías respiratorias de conducción mediante AAV9.

Evaluando el papel de los enlaces de ß-galactosa en la transducción de células de tejidos que no sean los pulmones tras la transferencia de genes in vivo es más complicado debido a las barreras de administración que no están presentes cuando el vector se administra a las vías respiratorias permitiendo el acceso directo a células epiteliales. La transducción tras la administración IV de AAV9, que es una vía de administración que se considera en muchas aplicaciones clínicas de terapia de genes, ilustra este punto. La infusión IV de vectores en función de la mayoría de los serotipos de AAV resulta en la transducción principalmente limitada a hepatocitos debido a que la fenestra de los sinusoides hepáticos elimina la barrera vascular. En nuestros estudios, AAV9 transduce de forma eficiente los hepatocitos a pesar de los niveles limitados de ß-galactosa. Dosis más altas de AAV9 pueden superar la barrera vascular y transducir de manera eficiente las fibras de músculo cardíaco y esquelético que contienen niveles altos de glicanos de ß-galactosa de superficie celular. Tal como se indicó mediante varios grupos, AAV9 atraviesa de forma única la barrera cerebral de sangre aun más fortificada para permitir la transducción limitada de neuronas. Se especuló que la presencia de glicanos con enlaces de ß-galactosa sobre la superficie de células endoteliales de alguna estructura vascular, como hemos demostrado en el cerebro, pueden formar parte para facilitar este egreso posiblemente a través de un proceso de transcitosis. La unión demostrada de AAV9 a glicanos enlazados a O de diversas estructuras sugiere que las interacciones con glicoproteínas no mediadas por células tal como en sangre o en superficies de mucosa pueden modular la biodistribución de vector y los perfiles de transducción.

La identificación del receptor primario para AAV9 también fue útil en el desarrollo de un abordaje farmacológico para mejorar su transducción en las vías respiratorias de conducción del pulmón. Se espera que el efecto se logre para otros objetivos de AAV9, particularmente cuando el vector formulado con NA pueda administrarse directamente al tejido, tal como la retina, o en un espacio cerrado, tal como una articulación.

EJEMPLO 5 Identificación del dominio de unión a galactosa de la cápside de AAV9 En este estudio, nuestro objetivo era identificar los aminoácidos específicos de la cápside de AAV9 necesarios para la unión a galactosa. Con la mutagénesis dirigida a sitio y los ensayos de unión celular, más los estudios de anclaje computacional de ligandos, descubrimos cinco aminoácidos necesarios para la unión de galactosa que forman un bolsillo en la base de las salientes alrededor de los ejes de simetría ternarios icosaédricos. La importancia de estos aminoácidos también se confirmó mediante estudios in vivo en pulmón de ratón. Identificar las interacciones necesarias para la unión de AAV9 a galactosa puede producir avances en el diseño de los vectores.

En este estudio, pretendíamos identificar el motivo de unión a galactosa en la cápside de AAV9. Generamos una serie de mutantes de alanina para determinar la necesidad de aminoácidos específicos para la unión de galactosa tanto in vitro como in vivo. Esto nos llevó a descubrir un bolsillo de unión a galactosa en la base de las salientes que rodean los ejes de simetría ternarios de la cápside de AAV9, que también se confirmó mediante estudios de anclaje molecular.

A. Materiales y métodos 1. Líneas celulares.

Todas las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Se usaron tres líneas celulares diferentes de Ovario de Hámster Chino (CHO) en experimentos de unión y transducción, incluida la línea celular parenteral Pro-5, la línea celular Lec-2 con deficiencia de ácido siálico y la línea celular Lec-8 con deficiencia de galactosa. Estas células fueron cultivadas en un medio esencial a-mínimo (a-MEM) complementado con ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos (Invitrogen) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina. 2. Animales Se adquirieron ratones macho C57BL/6 (6-8 semanas de edad) de Charles River Laboratories y se almacenaron en las Instalaciones para Animales de los Laboratorios de Investigación Translacional en la Universidad de Pensilvania. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por la Comisión Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad de Pensilvania. 3. Mutaqénesis de AAV9 v preparación de vector a pequeña escala Aminoácidos de carga específica o polares de la secuencia de cápside de AAV9 fueron seleccionados para mutación a alanina no polar, tal como se indica en las Figs. 3A-3B. La mutagénesis se llevó a cabo usando el Kit de Mutagénesis Dirigida a Sitio de Iluminación QuikChange de Agilent Technologies. Para una producción posterior de vectores mutantes a pequeña escala para utilizar en ensayos de unión y transducción in vitro, la triple transfección de células HEK293 en placas de 6 pocilios (9.6cm2) se realizó usando un plásmido de expresión del gen de AAV2 rep y el gen mutante de AAV9 cap, así como plásmidos que expresan el transgén ffLuc expresado de un promotor del citomegalovirus (CMV) flanqueado por las repeticiones terminales invertidas de AAV2, y un plásmido auxiliar del adenovirus (pAdAF6). Las células y el sobrenadante se cosecharon después de 72 horas en 2 mi de medios totales y se sometieron a tres ciclos de congelado/descongelado y luego se centrifugaron a 3500 x g durante 30 min para quitar los desechos de células. Las titulaciones de los vectores (CG/ml) se determinaron por PCR cuantitativa. 4. Producción y purificación de vectores para estudios in vivo Se produjeron vectores de AAV para utilizar in vivo y los mismos fueron purificados por Penn Vector, tal como se describe en: http://www.med. upenn.edu/gtp/vector_core/production.shtml. Un plásmido que expresaba nLacZ de un promotor de ß-actina de pollo y flanqueado por repeticiones terminales invertidas de AAV2 se empaquetó por triple transfección de células HEK293 con plásmidos que codificaban el gen de AAV2 rep y el gen de AAV9 o muíante cap, y un plásmido auxiliar del adenovirus (pAdAF6). Los vectores se purificaron por centrifugación de gradiente de yodixinol y las titulaciones se determinaron mediante PCR cuantitativa. 5. Ensayos de unión y transducción celular Para ensayos de unión, se rasparon células Pro-5, Lec-2 y Lec-8 de matraces de 150cm2 y se sembraron a 5x105 células/pocilio en placa de 96 pocilios en 100µ? de a-MEM frío, libre de suero. Los vectores se agregaron a 5x109 CG/pocillo en 10?µ? de a-MEM frío y se incubaron a 4°C durante una hora. Luego, las células se lavaron tres veces con 200µ? de a-MEM y se resuspendieron en 200µ? de PBS. El ADN total extraído usando el Mini Kit de ADN QlAamp (QUAGEN) y CG de vector unido a célula se determinó por PCR cuantitativa. Para ensayos de transducción celular, se sembraron 105 células/pocilio en placas de 96 pocilios de color negro de fondo claro durante toda la noche. Después de quitar los medios, el vector de AAV con expresión de ffLuc (109 CG) se agregó a las células en 100µ? de medios completos y se incubó a 37°C durante 48 horas. La expresión de ffLuc se determinó entonces agregando 150 pg/ml de sustrato de D-luciferina por pocilio en 10?µ? de a-MEM y midiendo las unidades de luz relativa/segundo (ULR/s) usando un luminómetro. La eficiencia de transducción ¡n vitro de vectores mutantes se muestra en la Fig. 4A y 4B. 6. Transducción de pulmón de ratón Tal como se describe en el Ejemplo 3, los ratones fueron anestesiados con cetamina/xilazina y se les proporcionó instilación intranasal de 100mU de NA en 30µ? de PBS. Una hora después, 1011 CG de AAV9 o vector mutante con expresión de nLacZ se administraron por vía intranasal en 50µ? de PBS. Veintiún días post-administración, la expresión de ß-gal en los pulmones se examinó a través de los métodos descritos anteriormente (Bell, 2005, citados anteriormente). Las secciones de pulmón se examinaron a 100x de aumento. 7. Predicción del sitio de unión a galactosa en la cápside de AAV9 mediante estudios de anclaje molecular Se llevó a cabo un anclaje molecular para predecir el sitio de unión a galactosa en la cápside de AAV9 usando el servidor web de anclaje molecular PatchDock (http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock/index.html) (Schneidman-Duhovny, et al., Nucleíc Acids Res 33 (ejemplar del Servidor Web): W363-7 2005). La estructura cristalina de rayos x para galactosa unida a la galectina-3 humana, número de acceso de PDB 1A3K, se utilizó para proporcionar las coordenadas para galactosa (Seetharaman, et al., J Biol Chem, 273 (21): 13047-52 (1998). Las coordenadas para la estructura cristalina de rayos x de AAV9 (datos sin publicar) se utilizaron para construir un trímero usando un generador VIPERdb Oligomer (http://viperdb.scripps.edu/oligomer_multi.php) (Carrillo-Tripp, Nucleic Acids Res, 37 (ejemplar de la Base de datos): D436-42 (2009). La salida del archivo PDB para el trímero de AAV9 se truncó para incluir aminoácidos que fueron de superficie accesible y se mantuvo la integridad estructural de los bucles de superficie de cápside viral. Los aminoácidos incluidos en el archivo de PDB de trímero de AAV9 como el archivo de entrada para el anclaje molecular fueron N262 - Y277, L435 - G475 y F501 - M559. El anclaje molecular se realizó de manera no dirigida para evaluar el sitio en la cápside de AAV9 que tenía probabilidad de interactuar con galactosa. El anclaje también se realizó usando el trímero de AAV9 truncado y ácido siálico. La estructura cristalina de rayos X para el Virus de Rinitis Equina A formando un complejo con su receptor de ácido siálico, No. de acceso de PDB 2XBO, se utilizó para proporcionar las coordenadas para ácido siálico (Fry, et al. J Gen Virol, 91(Pt8): 1971-7 (2010).

B. Resultados 1. N470 es necesario para la unión de galactosa de AAV9 Para identificar los potenciales aminoácidos de la cápside de AAV9 que podrían participar en la unión de galactosa, la secuencia de aminoácidos de cápside de AAV9 se alineó con la de los serotipos que no se unen a galactosa, tales como AAV 1 , 2, 6, 7 y 8, para determinar qué aminoácidos son únicos para AAV9. En función de esta alineación, 14 aminoácidos que tienen cadenas laterales polares o cargadas se seleccionaron para mutación a alanina no polar para examinar el efecto en la unión de AAV9 (Fig. 3A). Estos constructos de cápside mutantes se utilizaron para hacer el vector mediante métodos de preparación a pequeña escala y proporcionaron titulaciones similares en comparación con AAV9 natural.

Los vectores mutantes se agregaron luego a las tres líneas celulares de CHO diferentes para evaluar sus capacidades de unión. La línea celular de CHO parenteral Pro-5, así como los mutantes de glucosilación de células somáticas de esta línea celular, Lec-2 y Lec-8, se utilizaron en estos experimentos. Las células Lec-2 son deficientes en el transportador de Golgi de monifosfato de citidina-ácido siálico y, por lo tanto, carecen de residuos de ácido siálico en sus glicanos de superficie, lo que permite la exposición del penúltimo sacárido más común, galactosa. Las células Lec-8 tienen deficiencia de difosfato de uridina-transportador del aparato de Golgi de galactosa y, por lo tanto, carecen de sacáridos de galactosa en sus estructuras de glicano de superficie. Cuando se examina la unión del vector a estas líneas celulares de CHO, los resultados esperados se observaron para AAV9. Se observó un nivel de unión bajo en células Pro-5, pero se demostró que aumentó 100 veces en células Lec-2, que tienen residuos de galactosa terminal libre para la unión de AAV9. La unión a células Lec-8 se redujo al nivel de referencia debido a su falta de galactosa de superficie celular. Trece de catorce vectores mutantes demostraron esta tendencia de una mayor unión en células Lec-2, lo que sugiere que retuvieron la capacidad de unirse a galactosa. Sin embargo, la mutación del residuo de asparagina en la posición 470 a alanina (N470A) redujo la unión a células Lec-2 hasta el nivel observado en células Pro-5 y Lec-8. Esto indicó que N470 es necesario para la unión de AAV9 a galactosa. 2. Los aminoácidos adicionales ubicados próximos a N470 son necesarios para la unión de galactosa de AAV9 Se generaron mutantes de AAV9 adicionales para determinar si alguno de los aminoácidos que rodean estructuralmente N470 también contribuyen a unión de galactosa. Este segundo conjunto de mutantes se dirigió a los aminoácidos a lo largo de múltiples regiones variables (VR) definidas de la cápside, incluidas VR I, IV, V, y VII, que en la estructura icosaédrica ensamblada del virión entran en contacto entre sí. Se seleccionaron diecinueve aminoácidos cerca a N470 para mutación a alanina (Fig. 3B) y se produjeron vectores a través de métodos a pequeña escala. Al igual que antes, todos los mutantes proporcionaron un vector de titulación alto al testigo de AAV9, lo que sugiere que ninguna de las mutaciones tuvo un efecto negativo en el montaje de cápside. Se evaluó entonces la capacidad de los vectores mutantes de unir células Pro-5, Lec-2, y Lec-8 (Fig. 3B). Nuevamente, AAV9 mostró el resultado esperado de un aumento de 100 veces de la unión a células Lec-2 en comparación con las células Pro-5 y Lee- 8. A pesar de que la mayoría de los mutantes evaluados también exhibieron este fenotipo, cuatro mutantes demostraron una pérdida de unión a células Lec-2. La mutación de D271 , N272, Y446 o W503 suprimieron la capacidad de AAV9 de unirse a galactosa.

Junto con estos diecinueve mutantes de alanina, se realizaron otras cuatro mutaciones dirigidas a sitio de AAV9. Los aminoácidos no polares A472 y V473 están ubicados directamente junto a N470 y podrían participar potencialmente en la unión de galactosa. Para probar esta idea, A472 y V473 mutaron a la serina de aminoácido polar o el ácido aspártico de aminoácido con carga. La construcción de estos vectores mediante métodos a pequeña escala fue exitosa y se lograron titulaciones similares a AAV9 natural. Cuando se examina la unión de estos vectores a células de CHO, se observó que estos cuatro mutantes (A472S, A472D, V473S y V473D) perdieron la capacidad de unirse a células Lec-2. Esto sugiere que estos residuos no polares son esenciales para la formación de la región de unión a galactosa porque agregar polaridad o carga a esta región alteró la interacción con galactosa. 3. La unión a galactosa de mutantes de AAV9 indica la eficiencia de transducción in vitro Para evaluar la transducción de mutantes de AAV9 in vitro, vectores que expresaban luciferasa de luciérnaga (ffLuc) se agregaron a células Pro-5 y Lec-2. Los cinco mutantes que perdieron la unión a galactosa (N470A, D271A, N272A, Y446Ay W503A), así como dos mutantes que retuvieron la unión a galactosa (S469A y E500A) y un vector testigo de AAV9 se agregaron a las células (MOI= 104) y se evaluó la expresión de ffLuc 48 horas después. Tal como se esperaba, los mutantes que carecen de la capacidad de unión a galactosa demostraron una disminución de 3 veces o mayor en la transducción de células Lec-2 en comparación con AAV9, S469A y E500A. W503A y N272A demostraron los niveles de transducción más bajos, justo encima del fondo. En las células Pro-5, la transducción total fue 2 a 5 veces más baja debido a que las células carecen de abundantes residuos de galactosa terminal para la unión. Sin embargo, una tendencia similar en la transducción se observó como la que se determinó para célula Lec-2. Los mutantes con deficiencia de unión a galactosa mostraron la transducción más baja y los dos mutantes que retuvieron la unión a galactosa (S469A y E500A), así como el vector testigo de AAV9, demostraron niveles altos de transducción. E500A, sin embargo, mostró aproximadamente una expresión 2 veces más alta que AAV9 en células Pro-5, lo que sugiere que este vector puede tener interacciones intracelulares favorables. 4. Los vectores mutantes con deficiencia de unión a galactosa no transducen el epitelio de las vías respiratorias de conducción La administración de neuraminidasa (NA) intranasal a ratones antes de la administración intranasal del vector de AAV9 permite una transducción de AAV9 eficiente del epitelio de las vías respiratorias de conducción del pulmón. Esto ocurre porque ÑA escinde los residuos de ácido siálico terminal de los glicanos de superficie las células de las vías respiratorias, lo que expone los residuos de galactosa subyacentes y permite la unión y transducción de AAV9. Se estudió si los vectores mutantes que tienen deficiencia de unión a galactosa pueden transducir el epitelio de las vías respiratorias de conducción in vivo. Los vectores (101 GC) que expresan LacZ de direccionamiento nuclear (nLacZ) se administraron por vía intranasal a ratones una hora después de la instilación de 100 mU de NA y después, veintiún días después, los pulmones fueron extirpados y teñidos para expresión de ß-gal. El vector testigo de AAV9 demostró la transducción eficiente de las vías respiratorias de conducción, tal como se esperaba en función de nuestros resultados anteriores. Los cinco mutantes que perdieron la capacidad de unirse a galactosa (N470A, D271A, N272A, Y446A y W503A) no lograron transducir el epitelio de las vías respiratorias de conducción, demostrando también su incapacidad para unirse a galactosa in vivo. Los mutantes S469A y E500A, que retuvieron la unión a galactosa retenida, demostraron la transducción eficiente de las vías respiratorias de conducción similar a AAV9. 5. Los aminoácidos necesarios para la unión forman un bolsillo en la cápside de AAV9 que soporta la interacción con galactosa Usando el conocimiento de la estructura de AAV9, se determinó la ubicación de los aminoácidos importantes para la unión de galactosa sobre la superficie de la cápside. Se utilizó un abordaje de anclaje molecular para identificar los sitios de unión a galactosa en un trímero VP de AAV9. Se evaluaron los primeros 100 resultados del anclaje y las soluciones de anclaje que colocaron a la galactosa en la superficie interna de la cápside se desecharon. Las 13 soluciones restantes anclan la galactosa en contacto con N470, con 12 de 13 soluciones que anclan galactosa entre N470 y W503. N470, D271, N272, Y446 y W503 forman un bolsillo en la base de los salientes que rodean los ejes de simetría ternarios. El bolsillo está formado por la superficie externa de los salientes frente a los ejes binarios y quinarios y la saliente de pequeña superficie entre los ejes binarios y quinarios formados por VR I. AAV9 contiene un bolsillo de unión donde se ilustra además cómo se ajusta en esta región el residuo de galactosa. Los aminoácidos A472 y V473 no polares que resultan ser importantes para la unión de galactosa se ubican en la base del bolsillo de unión y, por lo tanto, es probable que permitan la inserción exitosa del sacárido de galactosa. Una característica interesante del sitio de unión a galactosa es que los aminoácidos que se ha demostrado que son importantes para la unión son de dos monómeros diferentes, donde Y446, N470, A472 y V473 forman la base del bolsillo de unión, y los aminoácidos que forman la parte superior del bolsillo de unión, D271 , N272 y W503, son de otro monómero colaborador. Esto puede proporcionar un mecanismo para asegurar que sólo las cápsides ensambladas de manera apropiada puedan unirse al receptor. De manera significativa, tras la identificación del bolsillo de unión de galactosa, un intento por anclar una molécula de ácido siálico en la misma región de cápside demostró que este glicano no puede alojarse en el bolsillo debido a un impedimento estérico. Esa observación es consistente con la falta de unión de ácido siálico por parte de AAV9.

C. Descripción Experimentos anteriores que estudiaron las interacciones de glicanos de superficie celular de AAV9 demostraron que este vector usa galactosa como receptor celular. El análisis de la unión y transducción de AAV9 de múltiples líneas celulares, incluidas células Pro-5, HEK293 y Huh-7, reveló que la eliminación enzimática de residuos de ácido siálico terminal de glicanos de superficie celular usando NA provocó un aumento importante de la unión de AAV9. Este aumento se debió a la exposición de los sacáridos de galactosa subyacentes, que facilitó la unión y transducción de AAV9. Otros estudios que utilizaron las líneas celulares mutantes de glucosilacion de CHO Lec-2 y Lec-8, así como ensayos de competición de lectina, confirmaron este papel de la galactosa. Adicionalmente, NA administrado por vía intranasal a los ratones produjo un aumento de los residuos de galactosa terminal en la superficie de las células de las vías respiratorias y, por lo tanto, un aumento de la transducción de AAV9.

El objetivo de este estudio fue identificar los aminoácidos de la cápside de AAV9 necesarios para la unión de galactosa, lo que se determinó que incluía N470, D271 , N272, Y446 y W503. Durante la comparación del sitio de unión a galactosa de AAV9 con el de las proteínas de unión de galactosa, se descubrieron similitudes con respecto a la composición de los aminoácidos. La interacción de azúcares con residuos aromáticos es común en el sitio de unión de proteínas de unión a carbohidratos y se ha observado para proteínas específicas de galactosa (Elgavish, et al., 1997, Trends Biochem Sci 22(12): 462-7.; Sujatha, et al., 2005, Biochemistry 44(23): 8554-62). Estos residuos forman interacciones hidrófobas con el sacárido y también participan en la discriminación de la galactosa de otros azúcares, tales como glucosa (Elgavish, 1997; Sujatha, 2005). Esto es consistente con nuestro sitio de unión mapeado para AAV9, que contiene dos residuos aromáticos, Y446 y W503. Adicionalmente, muchas proteínas de unión a galactosa contienen aminoácidos polares y cargados, incluidos asparagina, ácido aspártico y glutamina, que se ha demostrado que contribuyen a la unión de galactosa formando enlaces de hidrógeno con los grupos hidroxilo del azúcar (Montfort, et al., 1987, J Biol Chem 262( 1): 5398-403; Elgavish, 1997). Es probable que N470, D271 y N272 de la cápside de AAV9 formen interacciones similares con galactosa. También se determinó la ubicación del dominio de unión al receptor de otros serotipos de AAV. Este sitio de unión a HS de AAV2 se mapeó con respecto a cinco aminoácidos: R484, R487, R585, R588 y K532 (Kern, 2003 J Virol 77(20): 1 1072-81.; Opie, 2003, J Virol 77(12): 6995-7006). Estos aminoácidos forman una ruta básica dentro de cada saliente relacionado con una simetría ternaria de la cápside. AAV6, que también se ha demostrado que se une a HS, contiene una extensión básica similar de aminoácidos en posiciones análogas tal como se observó para AAV2, incluidos R485, R488, K528 y K533 (Ng, et al., 2010, J Virol 84(24): 12945-57). Además, a través de los estudios de mutagénesis, K493, K459, R576 y K531 , se ha demostrado que es necesario para la unión a HS de AAV6 y se ubican en posiciones cercanas. El dominio de unión a galactosa de AAV9, ubicado en la base de las salientes que rodean los ejes ternarios, se encuentra del otro lado de esta estructura en comparación con la región de unión a HS de AAV2, que se ubica en la superficie interna frente al eje ternario. Los residuos de unión a HS de AAV6 también se ubican en la pared exterior de las salientes, pero en la pared opuesta más cerca de VR III y el eje binario icosaédrico en comparación con los residuos de unión a galactosa de AAV9. Estas observaciones ilustran también la importancia de los aminoácidos y las estructuras que ensamblan las salientes que rodean los ejes ternarios y los residuos adyacentes a esta región en reconocimiento del receptor para diferentes serotipos de AAV. También respalda una propuesta de que la variabilidad estructural común de las cápsides de AAV, particularmente las salientes de superficie expuesta, ha evolucionado para permitir la utilización de moléculas de superficie diferente para infección exitosa, que es un determinante importante de sus fenotipos de transducción respectivos.

AAV9 muestra características únicas que podrían explicarse potencialmente por interacciones de receptor. Por ejemplo, después de inyección intravenosa, AAV9 puede sobrepasar la barrera sangre-cerebro y transducir las neuronas motoras en la médula espinal de ratones y gatos adultos y neonatales, así como neuronas en el cerebro de ratones neonatales y astrocitos en el cerebro de ratones adultos. Además, cuando se evaluó en primates no humanos, AAV9 transdujo neuronas motoras en la médula espinal y principalmente células gliales en el cerebro. Mediante tinción de lectina fluorescente, hemos observado una expresión abundante de galactosa en la superficie de los vasos sanguíneos en el cerebro de ratones. AAV9 podría estar utilizando posiblemente galactosa para facilitar la transcitosis en toda la vasculatura, permitiendo la entrada al sistema nervioso central. El diseño del dominio de unión a galactosa en la cápside de otros serotipos de AAV puede permitir la transferencia de-fenotipos atractivos de AAV9 y el desarrollo de vectores nuevos para terapia génica.

EJEMPLO 6 El pretratamiento con NA mejora la expresión de ffLuc mediada por AAV en las vías respiratorias nasales de ratones · Se anestesiaron ratones C57BL6 (de 6-8 semanas de edad, 20-25 g de peso, machos) con una mezcla de cetamina/xilazina. Se proporcionó a los ratones 5µ? de neuraminidasa (NA) de Vibrio cholera (Sigma, N7885) en cada orificio nasal (total de 80-1 OOmU de NA). Dentro de 10 mins de pretratamiento con NA, el vector de AAV9 (dosis total de 1011 CG) que expresaba luciferasa de luciérnaga (ffLuc) bajo el control transcripcional del promotor de ß-actina se instiló como dos alícuotas 15µ? diluidas en PBS ( 5 µ? por orificio nasal). Se dejó que los ratones se recuperaran y se monitoreó la expresión del transgén (ffLuc) 24 hrs después de la inoculación con el vector.

En el momento de la formación de imágenes de luminiscencia los ratones se anestesiaron y se les administró luciferina [15µ? de una solución de 15mg/ml de D-Luciferina (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) por orificio nasal en ambos orificios] y se formaron imágenes para expresión dentro de los 5 mins de la aplicación de luciferina. Se dejó que los ratones se recuperaron para procedimientos de formación de imágenes posteriores los días 3, 7, 14, 21 y 28.

Estos resultados se ilustran en la gráfica de barras de la Fig. 5. Estos datos muestran una mejora de aproximadamente dos veces en la expresión génica de luciferasa de luciérnaga en las vías respiratorias nasales tras el pretratamiento con neuraminidasa. Esta diferencia se observó en dos ocasiones separadas. Asimismo, la adición de neuraminidasa resultó en un inicio rápido de la expresión génica con la expresión génica más alta observada dentro de las 24 horas posteriores a la instalación del vector de AAV9 que cayó a niveles constantes en la semana posterior.

Todas las publicaciones, documentos de patentes y secuencias de GenBank citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan a la presente a modo de referencia. Si bien la invención se ha descrito con referencia a modalidades particularmente preferidas, se apreciará que pueden realizarse modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención.

Claims (35)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición que modifica la capacidad de una célula que comprende una neuraminidasa y un residuo de ß-galactosa para unirse a AAV de ciado F para usarse en la alteración de la eficiencia de captación dirigida y/o celular de un vector del virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de un AAV de ciado F.

2 - El uso de una composición que modifica la capacidad de una célula que comprende un residuo de ß-galactosa de unirse a un AAV de ciado F, para la fabricación de una composición farmacéutica para la alteración de la eficiencia de captación dirigida y/o celular de un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de un AAV de ciado F.

3.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 1 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde la composición se adapta para proporcionar a un sujeto que tiene células con un glicano de superficie celular que tiene ácido siálico terminal y una penúltima ß-galactosa dicho vector viral de AAV en combinación con neuraminidasa, con lo cual la neuraminidasa escinde el ácido siálico terminal y convierte la penúltima ß-galactosa en una ß-galactosa terminal.

4.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 3 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el sujeto se trata previamente con la neuraminidasa.

5. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 3 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde la composición se adapta para proporcionar al sujeto dicho vector viral de AAV y la neuraminidasa básicamente de forma simultánea.

6. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 5 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en donde dicho vector viral de AAV se adapta para ser administrable al sujeto en un portador que comprende además, la neuraminidasa.

7.- La composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 o el uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde la neuraminidasa se selecciona del grupo que consiste en una neuraminidasa bacteriana o una neuraminidasa humana.

8 - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 1 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde el residuo de ß-galactosa subterminal se suprime funcionalmente en un sujeto en un primer subconjunto de células que tienen receptores de superficie celular de AAV, reduciendo o eliminando así la captación de AAV por parte de dicho subconjunto de células y redireccionando el AAV a un segundo subconjunto de células en el sujeto que tienen receptores de ciado F de AAV.

9.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 1 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde la ß-galactosa se elimina enzimáticamente.

10.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 9 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde la ß-galactosa se elimina enzimáticamente administrando galactosidasa al primer subconjunto de células en combinación con los vectores de AAV.

1 1 .- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 8 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 8, en donde una lectina que se une a residuos de ß-galactosa terminal se adapta para ser administrable a un primer subconjunto de células en un sujeto que nativamente tiene receptores de ciado F de AAV en combinación con los vectores de AAV, de forma tal que la capacidad de los receptores de unirse a los vectores de AAV se suprime funcionalmente en dicho primer subconjunto de células y los vectores de AAV se dirigen a un segundo subconjunto de células en el sujeto que nativamente tienen los receptores de ciado F de AAV.

12.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 1 1 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 1 1 , en donde la lectina se selecciona del grupo que consiste en una lectina dependiente de calcio, lectina de Erythrina Cristagalli (ECL), una lectina de galactosa de macrófago (MGL), lectina tipo C del receptor depurador humano (SRCL) y una lectina dependiente de calcio de macrófago humano (tipo C).

13.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 1 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde la MGL se selecciona de MGL humana o de rata.

14.- La composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 13 o el uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, en donde el vector de AAV y una composición para modificar el glicano que tiene un residuo de ácido siálico terminal y residuo de ß-galactosa subterminal se instilan en el pulmón.

15.- La composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 14 o el uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, en donde la cápside se selecciona de una cápside de ciado F de AAV, en donde dicho ciado de AAV está filogenéticamente relacionado con AAV9 según se determina mediante el uso de un heurístico del sistema Neighbor-Joining mediante un valor de análisis de remuestreo de al menos 75 % por 1000 aislados y una medición de la distancia de corrección Poisson de no más de 0.05.

16. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 15 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 15, en donde dicho ciado comprende al menos hu.14/AAV9, hu.31 y hu.32 de AAV.

17. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 15 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 15, en donde dicho ciado comprende AAV9 o un AAV que contiene el dominio de unión del receptor del mismo.

18.- Una combinación que comprende una neuraminidasa y un vector del virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside que comprende un dominio de unión celular de AAV9, para usarse en el incremento de la administración de genes de un vector del virus adeno-asociado (AAV) en una célula que tiene un receptor de la superficie celular que comprende un glicano que tiene un residuo de ácido siálico terminal y un residuo de ß-galactosa subterminal, y en donde dicho vector además comprende un minigen que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un gen heterólogo operativamente enlazado a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula huésped.

19. - El uso de una combinación que comprende una neuraminidasa y un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside que comprende un dominio de unión celular AAV9, para la fabricación de una composición farmacéutica para aumentar la administración de genes de un vector de virus adeno-asociado (AAV) en una célula que tiene un receptor de superficie celular que comprende un glicano que tiene un residuo de ácido siálico terminal y un residuo de ß-galactosa subterminal, y en donde dicho vector comprende además un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un gen heterólogo operativamente enlazado a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula huésped.

20. - La combinación para usarse de conformidad con la reivindicación 18 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 19, en donde el vector de AAV comprende una cápside de AAV9, en donde la cápside de AAV9 es al menos 95% idéntica al vp3 de AAV9 que tiene los aminoácidos 203 a 736.

21. - La combinación para usarse de conformidad con la reivindicación 18 o el uso como el que se reclama en la reivindicación 19, en donde la neuraminidasa se adapta para ser administrable al sujeto antes de la administración del AAV.

22. - Un método para aislar un vector viral de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de un AAV de ciado F, comprendiendo dicho método: exponer una muestra que comprende el vector viral de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de un AAV de ciado F para ponerse en contacto con una molécula que comprende ß-galactosa que se ha enlazado a un soporte sólido, mediante lo cual el objetivo de purificación que tiene un sitio de unión para ß-galactosa está unido selectivamente por la molécula; lavar el soporte sólido para quitar el material de la muestra que no se une específicamente al soporte sólido; y separar el vector viral del soporte sólido.

23. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque comprende, además, la etapa de concentrar el vector viral separado.

24. - El método de conformidad con la reivindicación 22 o la reivindicación 23, caracterizado además porque el soporte sólido se carga en una columna de cromatografía por afinidad.

25. - Una composición que comprende una combinación de (a) una neuraminidasa, (b) un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de ciado F de AAV, comprendiendo dicho vector, además, un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un gen heterólogo operativamente enlazado a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula huésped, y (c) un portador farmacéuticamente aceptable.

26. - Una composición que comprende una combinación de (a) una lectina, (b) un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de ciado F de AAV, comprendiendo dicho vector, además, un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un gen heterólogo operativamente enlazado a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula huésped, y (c) un portador farmacéuticamente aceptable.

27. - La composición de conformidad con la reivindicación 25 o la reivindicación 26, caracterizada además porque dicha cápside de ciado F comprende un dominio de unión celular de AAV9.

28. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, caracterizada además porque el vector de AAV comprende una cápside de AAV9, en donde la cápside de AAV9 es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEO. ID NO: 123 en los aminoácidos 203 a 736.

29. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque dicho AAV está filogenéticamente relacionado con AAV9, según se determina mediante el uso de un heurístico del sistema Neighbor-Joining mediante un valor de análisis de remuestreo de al menos 75 % por 1000 aislados y una medición de la distancia de corrección Poisson de no más de 0.05.

30. - La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicho AAV se selecciona de una cápside de hu.31 y hu.32.

31. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, caracterizada además porque la neuraminidasa se selecciona del grupo que consiste en una neuraminidasa bacteriana o una neuraminidasa humana.

32. - Un vector de AAV recombinante que tiene una cápside de AAV con un dominio de unión celular de AAV9 diseñado, comprendiendo dicho dominio de unión celular de AAV9 los aminoácidos Y446, N470, A472, V473, D271 , N272 y W503 que forma un dominio de unión a galactosa con las posiciones en función de la numeración de AAV9, SEQ ID NO:1 , en donde uno o más de estos aminoácidos ha reemplazado a otro aminoácido que es nativo de la cápside de AAV en la cual el dominio de unión celular de AAV9 ha sido diseñado.

33.- Un vector de AAV9 recombinante modificado para reducir o suprimir sustancialmente la capacidad nativa de AAV9 natural (wt) de transducir las vías respiratorias de conducción, teniendo dicho vector una cápside de AAV9 en la que se reemplaza un aminoácido de AAV9 nativo seleccionado del grupo que consiste en: la posición 271 , 446 y 470 en función de las posiciones de la SEQ ID NO: 1.

34.- El vector de AAV9 recombinante de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque el aminoácido de AAV9 nativo es reemplazado por una alanina.

35.- Un método para cambiar el direccionamiento de un vector de AAV9 al epitelio de las vías respiratorias reteniendo a la vez la capacidad de transducir hígado y corazón, comprendiendo dicho método reemplazar una cápside de AAV9 en la que un aminoácido de AAV9 nativo se selecciona del grupo que consiste en: la posición 271 , 446 y 470 en función de las posiciones de la SEQ ID NO: 1 por otro aminoácido.