KR20210040984A - 점액다당류증 iva의 치료 - Google Patents

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Abstract

본원에는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(hGALNS)를 MPS IVA로 진단된 인간 대상체의 뼈로 전달하기 위해 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)의 사용을 수반하는 점액다당류증 IVA형(MPS IVA)을 치료하기 위한 유전자 요법이 제공된다. 또한, 유전자 요법에 사용될 수 있는 rAAV 및 이러한 rAAV의 제조 방법도 본원에 제공된다.

Description

점액다당류증 IVA의 치료
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 7월 27일에 출원된 미국 임시 특허 출원 번호 62/711,238, 2018년 11월 7일에 출원된 62/756,880 및 2019년 2월 1일에 출원된 62/799,834의 혜택을 주장하며, 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열목록 참조
본 출원은 2019년 7월 22일에 생성되고 크기가 28,672 바이트인 "Sequence_Listing_12656-116-228.txt"라는 제목의 텍스트 파일로서 본 출원과 함께 제출된 서열목록을 참조로 포함한다.
1. 분야
본 기술분야는 점액다당류증 IVA형(MPS IVA)의 치료에 관한 것이다. 본원에는 재조합 아데노 관련 바이러스(recombinant adeno-associated virus, rAAV)를 수반하는 MPS IVA의 치료를 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
2. 배경
점액다당류증 IVA형(MPS IVA; 모르키오 A 증후군)은 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(GALNS)의 결핍으로 인한 상염색체 열성 라이소좀 저장 장애이다(Khan, 등, Mol Genet Metab., 2017; 120(1-2): 78-95). 상기 효소의 결핍은 글리코사미노글리칸(GAG), 콘드로이틴 6-설페이트(C6S) 및 케라탄 설페이트(KS)의 점진적인 축적을 초래하여 불완전한 골화와 연속적인 성장 불균형에 의한 전신의 독특한 골격 이형성증을 야기하고, 결과적으로 짧은 목과 몸통, 경부 척수 압박, 기관 폐쇄, 돌출흉, 관절 이완, 척추후측만증, 외반고 및 외반슬을 초래한다. 상기 질병의 다른 임상 소견으로는 청력 상실, 심장 판막 병발 및 각막 혼탁을 포함할 수 있다. 200개 이상의 상이한 돌연변이가 환자에서 확인되었으며 미국에서의 유병률은 약 250,000명 중 1명이다.
중증 유형의 환자는 치료되지 않으면 20대 또는 30대에 기도 손상, 경부 척수 합병증 또는 심장 판막 질환으로 인해 사망한다(Khan, 등, Mol Genet Metab., 2017; 120(1-2): 78-95); Tomatsu, S., 등 Mol. Genet. Metab. 2016; 117, 150-156; Montano, A.M., 등 J. Inherit. Metab. Dis. 2007; 30, 165-174; Tomatsu, S., 등 Res. Rep. Endocr. Disord. 2012; 2012, 65-77; Pizarro, C., 등 Ann. Thorac. Surg. 2016; 102, e329-331). 현재 임상 실습에서 MPS IVA 환자를 위한 보조 요법으로는 효소 대체 요법(ERT), 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 및 다양한 수술 개입이 이용가능하다. 2014년 2월에 FDA는 ERT(elosulfase-alpha) 사용을 승인하였다(Hendriksz, 등, J Inherit Metab Dis., 2014; 37(6): 979-990). 현재 치료 표준인 ERT는 MPS IVA 환자의 연조직 병리 및 일상 생활 활동(ADL)의 부분적인 개선을 초래하지만, 이러한 요법은 이 병변의 무혈관 특성으로 인해 뼈와 연골에 매우 제한적인 영향을 준다. 현재 ERT의 제한 사항은 다음을 포함한다: i) 5 내지 6시간 동안 매주 주사가 필요한 점, ii) 약물이 순환계로부터 빠르게 제거되는 점, iii) 치료 비용이 매우 고가인 점(환자 당 연간 500,000 달러), 및 v) 약물이 뼈에 제한된 침투를 나타내는 점(Algahim 및 Almassi, Ther Clin Risk Manag., 2013; 9:45-53; Tomatsu 등, Curr Pharm Biotechnol., 2011; 12:931-945). MPS IVA의 경우, 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(rhGALNS: Vimizim™, elosulfase alfa)의 매주 투여는 현재 MPS IVA 환자의 뼈 및 연골 병변에 영향을 주지 않는다. HSCT는 ERT보다 뼈에 더 나은 영향을 줄 수 있지만, 이 세포 기반 요법은 제한적인 일치 기증자, 효과적인 치료를 위한 연령 제한, 잘 훈련된 시설의 부족, 이식편대숙주 질환(GVHD)과 같은 시술의 사망 위험, 감염, 및 다른 합병증으로 인해 모든 환자에게 적용될 수는 없을 수 있다(Tomatsu 등, Drug Des Devel Ther., 2015; 9: 1937-1953). 이러한 의미에서 MPS IVA를 위한 신약, 특히 MPS IVA 환자의 골격 이형성증을 치료하기 위한 신약이 시급하다.
유전자 요법은 일회성 영구 요법이 될 가능성이 있다. 바이러스 및 비-바이러스 벡터를 사용한 유전자 전이의 많은 전임상 연구는 MPS 질환에서 상기 요법의 치료 가능성을 보여주었다. 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는, 벡터가 전이유전자 생성물의 장기간 발현과 면역원성의 낮은 위험을 제공하기 때문에 치료 유전자를 표적 기관에 전달하는데 매력적인 비히클이다. 이러한 장점으로 인해, AAV 매개 유전자 요법의 임상 시도는 MPS I, II, IIIA, IIIB 및 VI에 대해 진행 중이거나 예정되어 있다(ClinicalTrials.gov; Sawamoto 등, Expert Opin. Orphan Drugs, 2016; 4, 941-951). 연골 병변과 성장판 영역으로 충분한 효소의 전달은 MPS IVA 환자의 골격 이형성증을 해결할 가능성을 갖고 있다. 본 발명자들의 이전 연구는 AAV2 벡터를 사용한 GALNS 유전자 전이가 조직에서 치료적 효소 수준을 제공했음을 보여주었다(
Figure pct00001
, C.J., 등 Pediatr. Res. 2018; 84, 545-551); 하지만, 지금까지 AAV 매개 유전자 요법이 MPS IVA 마우스 모델의 골격 병변을 교정한다는 것을 입증하는 연구는 없었다.
Dvorak-Ewell 및 동료들은 야생형 마우스에게 격일로 5회 정맥내 주사된 10 mg/kg rhGALNS 접합된 Alexa-488 형광단이 성장판 및 관절 연골에서 상기 효소의 검출을 초래하였음을 보여주었다(Dvorak-Ewell, M., 등 PLoS One. 2010; 5, e12194). 이 발견은 높은 수준의 순환 효소가 연골 병변 내로 효소 침투를 제공할 수 있음을 나타낸다. AAV8 벡터는 간의 형질도입에 효율적이고, 간 유전자 전이에 10 내지 100배 큰 효율이, AAV2 벡터의 초기 세대에 비해 재조합 AAV8 벡터에 의해 나타났다(Gao, G.P., 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99, 11854-11859). 간-지향성 AAV 유전자 요법은 전이유전자 생성물에 대한 면역 내성을 유도하는 것으로 보고되어 있으므로, 편재적 프로모터에 비해 간 특이적 프로모터의 사용은 유의적으로 감소된 숙주 면역 반응을 나타내었다(Mingozzi, F., 등 J. Clin. Invest. 2003; 111, 1347-1356; Ziegler, R.J., 등 Mol. Ther. 2004; 9, 231-240; Dobrzynski, E., 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103, 4592-4597; Cao, O., 등 Blood 2007; 110, 1132-1140; Mingozzi, F., 등 Blood 2007; 110, 2334-2341). 이러한 억제된 면역 반응은 상기 전이유전자 생성물의 장기적인 발현을 제공할 수 있다(Wang, L., 등 Mol. Ther. 2000; 1, 154-158; Sondhi, D., 등 Gene Ther. 2005; 12, 1618-1632). 종래의 연구는 간 특이적 프로모터와 조합된 재조합 AAV8 벡터가 MPS VI의 마우스 및 고양이 모델의 골격 병변에 대해 더 큰 영향을 주었음을 입증하였다(Tessitore, A., 등 Mol. Ther. 2008; 16, 30-37; Cotugno, G., 등 Mol. Ther. 2011; 19, 461-469).
MPS IVA 환자는 모든 유형의 MPS에서 가장 심각한 골격 이상을 보이며(Melbouci, M., 등 Mol. Genet. Metab. 2018; 124, 1-10), 뼈 표적화 전략은 연골 영역을 침투하기에 충분한 효소를 공급할 수 있다. 본 발명자들은 여러 효소의 N-말단 또는 C-말단에 짧은 산성 아미노산 태그를 부착함으로써 향상된 뼈 표적화를 이전에 입증한 바 있다(Montano, A.M., 등 Mol. Genet. Metab. 2008; 94, 178-189; Tomatsu, S., 등 Mol. Ther. 2010; 18, 1094-1102). 하이드록시아파타이트(HA)는 뼈의 주요 무기 성분이며 칼슘 이온을 함유하는 양전하를 띤 표면을 갖고 있다. 뼈 시알로단백질 및 오스테오폰틴은 HA에 결합하며, 이러한 인산화된 산성 당단백질은 음전하를 띤 산성 아미노산(Asp 및 Glu)의 반복된 서열을 가지며, 이는 뼈 표적화 전략의 잠재적 표적일 수 있다(Oldberg, A., 등 J. Biol. Chem. 1988; 263, 19430-19432; Kasugai, S., 등 J. Bone Miner. Res. 2000; 15, 936-943).
rAAV는 이의 안전성 프로파일, 다재다능성 및 특정 기능을 위해 조작될 수 있는 능력으로 인해, 많은 질병에서 광범위한 유전자 요법 응용에 사용될 수 있다(예를 들어, Naso 등, BioDrugs. 2017; 31(4): 317-334 참조). AAV 유전자 요법을 사용한 임상 시도는 신경근, 안구 및 면역학적 질환을 포함한 광범위한 유전자 질환에 대해 수행되고 있다(예컨대, Kumar 등, Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 2016, 3:16034 참조).
본원에서 참고문헌의 인용은 이것이 본 개시내용에 대한 선행기술임을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
3. 개요
본원에는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(hGALNS)를 MPS IVA로 진단된 인간 대상체의 뼈로 전달하기 위한 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)의 사용을 수반하는 점액다당류증 IVA형(MPS IVA)을 치료하기 위한 유전자 치료 방법이 제공된다. 또한, 본원에는 상기 유전자 요법에 사용될 수 있는 rAAV, 상기 rAAV를 제조하는 방법, 뿐만 아니라 상기 rAAV를 제조하는데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 및 세포가 제공된다.
일 측면에서, 본원에는 (a) AAV 캡시드(예를 들어, AAV8 캡시드); 및 (b) AAV 역위 말단 반복체(inverted terminal repeat, ITR)(예를 들어, AAV8-ITR)가 측면에 있는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(hGALNS) 발현 카세트를 포함하고, 상기 hGALNS 발현 카세트가 산성 올리고펩타이드(예컨대, D8)에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 전이유전자와 같은 전이유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 AAV 게놈을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)가 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 티록신 결합 글로불린(thyroxine binding globulin, TBG) 프로모터이다.
다른 측면에서, 본원에는 (a) AAV 캡시드(예를 들어, AAV8 캡시드); 및 (b) AAV-ITR(예를 들어, AAV8-ITR)이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈으로서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 AAV 게놈을 포함하는 rAAV가 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 TBG 프로모터이다.
다른 측면에서, 본원에는 본원에 제공된 rAAV 및 약학적 허용성 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
다른 측면에서, 본원에는 AAV ITR(예를 들어, AAV8-ITR)이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 산성 올리고펩타이드(예컨대, D8)에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 전이유전자와 같은 전이유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 여기서 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 TBG 프로모터이다.
다른 측면에서, 본원에는 AAV-ITR(예를 들어, AAV8-ITR)이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는, 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 TBG 프로모터이다.
다른 측면에서, 본원에는, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 rAAV 플라스미드가 제공된다.
다른 측면에서, 본원에는, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 또는 본원에 제공된 rAAV 플라스미드를 포함하는 생체외 세포가 제공된다.
다른 측면에서, 본원에는, 본원에 제공된 rAAV 플라스미드 및 AAV 유전자 Rep, Cap, VA, E2a 및 E4의 뉴클레오타이드 서열을 종합적으로 포함하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드를 이용하여 생체외 세포를 형질감염시키는 것을 포함하는 rAAV의 제조 방법이 제공된다.
다른 측면에서, 본원에는, 본원에 제공된 rAAV 또는 본원에 제공된 약학적 조성물을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 점액다당류증 IVA형(MPS IVA)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
다른 측면에서, 본원에는 MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 인간 대상체에게 본원에 제공된 rAAV를 투여함으로써, 산성 올리고펩타이드(예컨대, D8)에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 전이유전자와 같은 전이유전자의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 hGALNS는 간 세포에서 생성되고 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된다.
다른 측면에서, 본원에는 MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 본원에 제공된 rAAV를 상기 인간 대상체에게 투여함으로써, 간 세포에서 생성되고 간 세포로부터 분비되어 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화되는 hGALNS의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
다른 측면에서, 본원에는 MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 산성 올리고펩타이드(예컨대, D8)에 융합된 hGALNS인 융합 단백질이되, rAAV 게놈(예컨대, 재조합 AAV8 게놈(즉, AAV8 게놈의 백본(backbone)을 포함하는 재조합 게놈))으로부터 생성되는 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근, 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
다른 측면에서, 본원에는 MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 산성 올리고펩타이드(예컨대, D8)에 융합된 hGALNS인 융합 단백질이되, rAAV 게놈(예컨대, 재조합 AAV8 게놈(즉, AAV8 게놈의 백본을 포함하는 재조합 게놈))으로부터 생성되고 간 세포에서 생성되어 간 세포로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화되는 융합 단백질을 암호화하는 전이유전자와 같은 전이유전자를 암호화하는 전이유전자의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근, 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
다른 측면에서, 본원에는 MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, rAAV 게놈(예컨대, 재조합 AAV8 게놈(즉, AAV8 게놈의 백본을 포함하는 재조합 게놈))으로부터 생성되고 간 세포에서 생성되어 간 세포로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화되는 hGALNS의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근, 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
MPS IVA로 진단된 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근, 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 상기 인간 대상체를 치료하는 방법의 특정 측면 및 구현예에서, 상기 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근, 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계는 뼈 및/또는 연골로 전달하는 단계이다.
MPS IVA로 진단된 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근, 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 상기 인간 대상체를 치료하는 방법의 특정 측면 및 구현예에서, 상기 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근, 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계는 (a) 뼈 및/또는 연골, 및 (b) 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 심근, 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계이다.
3.1 예시적 구현예(I)
1. 하기를 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV):
(a) AAV 캡시드; 및
(b) AAV 역위 말단 반복체(ITR)가 측면에 있는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(hGALNS) 발현 카세트를 포함하고, 상기 hGALNS 발현 카세트가 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 AAV 게놈.
2. 단락 1에 있어서, 상기 산성 올리고펩타이드가 D8인 rAAV.
3. 단락 1 또는 2에 있어서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 rAAV.
4. 단락 3에 있어서, 상기 간 특이적 프로모터가 TBG 프로모터인 rAAV.
5. 단락 1-4 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AAV가 AAV8인 rAAV.
6. 하기를 포함하는 rAAV:
(a) AAV 캡시드; 및
(b) AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈으로서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 AAV 게놈.
7. 단락 6에 있어서, 상기 간 특이적 프로모터가 TBG 프로모터인 rAAV.
8. 단락 6 또는 7에 있어서, 상기 AAV가 AAV8인 rAAV.
9. 단락 1-8 중 어느 하나의 rAAV 및 약학적 허용성 담체를 포함하는 약학적 조성물.
10. AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
11. 단락 10에 있어서, 상기 산성 올리고펩타이드가 D8인 폴리뉴클레오타이드.
12. 단락 10 또는 11에 있어서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 폴리뉴클레오타이드.
13. 단락 12에 있어서, 상기 간 특이적 프로모터가 TBG 프로모터인 폴리뉴클레오타이드.
14. AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 폴리뉴클레오타이드.
15. 단락 14에 있어서, 상기 간 특이적 프로모터가 TBG 프로모터인 폴리뉴클레오타이드.
16. 단락 10-15 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AAV가 AAV8인 폴리뉴클레오타이드.
17. 단락 10-16 중 어느 한 단락의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 rAAV 플라스미드.
18. 단락 10-16 중 어느 한 단락의 폴리뉴클레오타이드 또는 단락 17의 rAAV 플라스미드를 포함하는 생체외 세포.
19. 단락 17의 rAAV 플라스미드 및 AAV 유전자 Rep, Cap, VA, E2a 및 E4의 뉴클레오타이드 서열을 종합적으로 포함하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드를 이용하여 생체외 세포를 형질감염시키는 것을 포함하는 rAAV의 제조 방법.
20. 단락 1-8 중 어느 한 단락의 rAAV 또는 단락 9의 약학적 조성물을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 점액다당류증 IVA형(MPS IVA)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법.
21. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 단락 1 내지 5 중 어느 한 단락의 rAAV를 상기 인간 대상체에게 투여함으로써, 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
22. 단락 21에 있어서, 상기 hGALNS는 간 세포에서 생성되고 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 것인, 방법.
23. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 단락 6 내지 8 중 어느 한 단락의 rAAV를 상기 인간 대상체에게 투여함으로써, 간 세포에서 생성되고 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 hGALNS의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
24. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질이되, rAAV 게놈으로부터 생성되는 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
25. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질이되, rAAV 게놈으로부터 생성되고 간 세포에서 생성되어 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
26. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, rAAV 게놈으로부터 생성되고 간 세포에서 생성되어 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 hGALNS의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
27. 단락 24-26 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AAV가 AAV8인 방법.
28. 단락 21-27 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계가 뼈 및/또는 연골로 전달하는 단계인 방법.
29. 단락 21-27 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계가 (a) 뼈 및/또는 연골, 및 (b) 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계인 방법.
3.2 예시적 구현예(II)
1. 하기를 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV):
(a) AAV 캡시드; 및
(b) AAV 역위 말단 반복체(ITR)가 측면에 있는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(hGALNS) 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈으로서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 전이유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 전이유전자가 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 재조합 AAV 게놈.
2. 단락 1에 있어서, 상기 산성 올리고펩타이드가 D8인 rAAV.
3. 단락 1 또는 2에 있어서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 rAAV.
4. 단락 3에 있어서, 상기 간 특이적 프로모터가
(a) TBG 프로모터이거나; 또는
(b) 서열번호 13과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(c) 서열번호 13과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(d) 서열번호 13과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(e) 서열번호 13과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(f) 서열번호 13과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(g) 서열번호 13과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(h) 서열번호 14와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(i) 서열번호 14와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(j) 서열번호 14와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(k) 서열번호 14와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(l) 서열번호 14와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(m) 서열번호 14와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(n) 서열번호 15와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(o) 서열번호 15와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(p) 서열번호 15와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(q) 서열번호 15와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(r) 서열번호 15와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(s) 서열번호 15와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
rAAV.
5. 단락 1 또는 2에 있어서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는, rAAV.
6. 단락 5에 있어서, 상기 프로모터가 CAG 프로모터인 rAAV.
7. 단락 5에 있어서, 상기 프로모터가 간 및 근육 특이적 프로모터인 rAAV.
8. 단락 7에 있어서, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터가
(a) 서열번호 16과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(b) 서열번호 16과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(c) 서열번호 16과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(d) 서열번호 16과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(e) 서열번호 16과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(f) 서열번호 16과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
rAAV.
9. 단락 1-10 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AAV가 AAV8인 rAAV.
10. 단락 1-10 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AAV가 AAV9인 rAAV.
11. 단락 1-10 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 코돈 최적화된 것인, rAAV.
12. 단락 1-13 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 CpG 부위 결핍성인, rAAV.
13. 하기를 포함하는 rAAV:
(a) AAV 캡시드; 및
(b) AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈으로서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 AAV 게놈.
14. 단락 13에 있어서, 상기 간 특이적 프로모터가
(a) TBG 프로모터이거나; 또는
(b) 서열번호 13과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(c) 서열번호 13과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(d) 서열번호 13과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(e) 서열번호 13과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(f) 서열번호 13과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(g) 서열번호 13과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 또는
(h) 서열번호 14와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(i) 서열번호 14와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(j) 서열번호 14와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(k) 서열번호 14와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(l) 서열번호 14와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(m) 서열번호 14와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(n) 서열번호 15와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(o) 서열번호 15와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(p) 서열번호 15와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(q) 서열번호 15와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(r) 서열번호 15와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(s) 서열번호 15와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
rAAV.
15. 하기를 포함하는 rAAV:
(a) AAV 캡시드; 및
(b) AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈으로서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 프로모터는 CAG 프로모터인 재조합 AAV 게놈.
16. (a) AAV 캡시드; 및
(b) AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈으로서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터가
(a) 서열번호 16과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(b) 서열번호 16과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(c) 서열번호 16과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(d) 서열번호 16과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(e) 서열번호 16과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(f) 서열번호 16과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
rAAV.
17. 단락 13-18 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AAV는 AAV8인 rAAV.
18. 단락 13-18 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AAV는 AAV9인 rAAV.
19. 단락 13-18 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 코돈 최적화된 것인, rAAV.
20. 단락 13-19 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 CpG 부위 결핍성인 것인, rAAV.
21. 단락 1 내지 20 중 어느 한 단락의 rAAV 및 약학적 허용성 담체를 포함하는 약학적 조성물.
22. AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 전이유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 전이유전자는 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
23. 단락 22에 있어서, 상기 산성 올리고펩타이드가 D8인 폴리뉴클레오타이드.
24. 단락 22 또는 23에 있어서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는, 폴리뉴클레오타이드.
25. 단락 24에 있어서, 상기 간 특이적 프로모터가
(a) TBG 프로모터이거나; 또는
(b) 서열번호 13과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(c) 서열번호 13과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(d) 서열번호 13과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(e) 서열번호 13과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(f) 서열번호 13과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(g) 서열번호 13과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 또는
(h) 서열번호 14와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(i) 서열번호 14와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(j) 서열번호 14와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(k) 서열번호 14와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(l) 서열번호 14와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(m) 서열번호 14와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 또는
(n) 서열번호 15와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(o) 서열번호 15와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(p) 서열번호 15와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(q) 서열번호 15와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(r) 서열번호 15와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(s) 서열번호 15와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
폴리뉴클레오타이드.
26. 단락 22 또는 23에 있어서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는, 폴리뉴클레오타이드.
27. 단락 26에 있어서, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터가
(a) 서열번호 16과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(b) 서열번호 16과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(c) 서열번호 16과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(d) 서열번호 16과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(e) 서열번호 16과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(f) 서열번호 16과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
폴리뉴클레오타이드.
28. 단락 22 또는 23에 있어서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는, 폴리뉴클레오타이드.
29. 단락 28에 있어서, 상기 프로모터가 CAG 프로모터인 폴리뉴클레오타이드.
30. AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 간 특이적 프로모터가
(a) TBG 프로모터이거나; 또는
(b) 서열번호 13과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(c) 서열번호 13과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(d) 서열번호 13과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(e) 서열번호 13과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(f) 서열번호 13과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(g) 서열번호 13과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 또는
(h) 서열번호 14와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(i) 서열번호 14와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(j) 서열번호 14와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(k) 서열번호 14와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(l) 서열번호 14와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(m) 서열번호 14와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(n) 서열번호 15와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(o) 서열번호 15와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(p) 서열번호 15와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(q) 서열번호 15와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(r) 서열번호 15와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(s) 서열번호 15와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
폴리뉴클레오타이드.
31. AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 프로모터가 CAG 프로모터인, 폴리뉴클레오타이드.
32. AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터가
(a) 서열번호 16과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(b) 서열번호 16과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(c) 서열번호 16과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(d) 서열번호 16과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(e) 서열번호 16과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
(f) 서열번호 16과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
폴리뉴클레오타이드.
33. 단락 22-32 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AAV가 AAV8인 폴리뉴클레오타이드.
34. 단락 22-32 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AAV가 AAV9인 폴리뉴클레오타이드.
35. 단락 22-34 중 어느 한 단락의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 rAAV 플라스미드.
36. 단락 22-34 중 어느 한 단락의 폴리뉴클레오타이드 또는 단락 35의 rAAV 플라스미드를 포함하는 생체외 세포.
37. 단락 35의 rAAV 플라스미드 및 AAV 유전자 Rep, Cap, VA, E2a 및 E4의 뉴클레오타이드 서열을 종합적으로 포함하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드에 의해 생체외 세포를 형질감염시키는 것을 포함하는 rAAV의 제조 방법.
38. 단락 1-20 중 어느 한 단락의 rAAV 또는 단락 21의 약학적 조성물을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 점액다당류증 IVA형(MPS IVA)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법.
39. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 단락 1 내지 5 및 7 내지 12 중 어느 한 단락의 rAAV를 상기 인간 대상체에게 투여함으로써, 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
40. 단락 39에 있어서, 상기 hGALNS는 간 세포에서 생성되고 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 것인, 방법.
41. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 단락 13 내지 14 및 16 내지 20 중 어느 한 단락의 rAAV를 상기 인간 대상체에게 투여함으로써, 간 세포에서 생성되고 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 hGALNS의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
42. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS이고, rAAV 게놈으로부터 생성되는 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
43. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS이고, rAAV 게놈으로부터 생성되고 간 세포에서 생성되어 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
44. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, rAAV 게놈으로부터 생성되고 간 세포에서 생성되어 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 hGALNS의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
45. 단락 42 내지 44 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AAV가 AAV8인 방법.
46. 단락 42 내지 44 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AAV가 AAV9인 방법.
47. 단락 39 내지 46 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계가 뼈 및/또는 연골로 전달하는 단계인 방법.
48. 단락 39-46 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계가 (a) 뼈 및/또는 연골, 및 (b) 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계인 방법.
49. (a) AAV 캡시드; 및
(b) AAV 역위 말단 반복체(ITR)가 측면에 있는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(hGALNS) 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈으로서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 전이유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 전이유전자가 hGALNS를 암호화하는 것인 재조합 AAV 게놈
을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV).
50. 단락 49에 있어서, 상기 AAV가 AAV8인 rAAV.
51. 단락 49에 있어서, 상기 AAV가 AAV9인 rAAV.
52. 단락 49에 있어서, 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 코돈 최적화된 것인, rAAV.
53. 단락 49에 있어서, 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 CpG 부위 결핍성인, rAAV.
4. 약어
MPS IVA 점액다당류증 IVA형
GALNS N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제
hGALNS 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제
GAG 글리코사미노글리칸
C6S 콘드로이틴 6-설페이트
KS 케라탄 설페이트
ERT 효소 대체 요법
HSCT 조혈 줄기 세포 이식
AAV 아데노 관련 바이러스
TBG 티록신 결합 글로불린
ITR 역위 말단 반복체
D8 아스파르트산 옥타펩타이드
ECM 세포외 기질
ELISA 효소 면역흡착 검정
HS 헤파란 설페이트
IS 내부 표준물질
LC-MS/MS 액체 크로마토그래피/직렬식 질량 분광분석법
OD 광학 밀도
PBS 인산염 완충 식염수
RBG pA 토끼 베타-글로빈 폴리 A
KO 녹아웃(knockout)
5. 도면의 간단한 설명
상기 및 다른 목적, 특징 및 이점은 첨부 도면에 예시된 바와 같이 본 발명의 특정 구현예에 대한 하기의 설명으로부터 명백해질 것이다. 도면은 반드시 축척으로 도시될 필요는 없으며, 대신 본 발명의 다양한 구현예의 원리를 설명할 때 강조될 수 있다.
도 1. rAAV 게놈의 개략도.
도 2a-2d. (A) TBG-hGALNS 플라스미드, TBG-hGALNS-CoOpt 플라스미드, TBG-D8-hGALNS 플라스미드 또는 TBG-D8-hGALNS-CoOpt 플라스미드에 의한 형질감염 후, HuH-7 세포에서 세포내 효소 활성을 측정하였다(n=2). (B) HuH-7 세포에서 결정된 개별적인 세포내 효소 활성 진행의 묘사. (C) HuH-7 세포를 TBG-hGALNS 플라스미드, TBG-hGALNS-CoOpt 플라스미드, TBG-D8-hGALNS 플라스미드 또는 TBG-D8-hGALNS-CoOpt 플라스미드로 형질감염시킨 후, 배지에서 효소 활성을 결정하였다(n=2). (D) HuH-7 세포에서 결정된 배지 중의 효소 활성의 개별적인 진행에 대한 묘사.
도 3. TBG-hGALNS 플라스미드, TBG-hGALNS-CoOpt 플라스미드, TBG-D8-hGALNS 플라스미드, 또는 TBG-D8-hGALNS-CoOpt 플라스미드에 의한 형질감염 후, HepG2 세포에서 세포내 효소 활성을 결정하였다.
도 4. AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS를 4주령의 MPS IVA KO 마우스 (galns-/-) 및 면역 내성 마우스(Galnstm(hC79S.mC76S)slu, Mtol)에게 투여한 생체내 연구 일정. 혈액 내 효소 검정 및 KS 검정의 일정이 제시된다. 투여량을 기재할 때, 킬로그램 당 벡터 카피(vc/kg) 및 킬로그램 당 유전자 카피(GC/kg)가 호환적으로 사용된다.
도 5a-5b. AAV8-TBG-hGALNS r 또는 AAV-TBG-D8-hGALNS 투여 후 MPS IVA KO 마우스(galns-/-)의 (A) 백혈구(WBC) 및 (B) 혈장에서 측정된 시간 경과에 따른 hGALNS 효소 활성.
도 6. AAV8-TBG-hGALNS(n=4) 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS(n=4) 투여 후 Mtol 마우스의 혈장에서 측정된 시간 경과에 따른 hGALNS 효소 활성.
도 7a-7d. (A) MPS IVA KO 마우스(galns-/-)의 간, (B) Mtol 마우스의 간, (C) MPS IVA KO 마우스(galns-/-)의 심장 및 Mtol 마우스의 심장, 및 (D) MPS IVA KO 마우스(galns-/-)의 뼈 및 Mtol 마우스의 뼈에서 측정된 hGALNS 효소 활성.
도 8. AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO 마우스(galns-/-)의 혈장 중의 단일 황산화 KS 수준.
도 9a-9b. (A) 미처리 Mtol 및 WT 마우스와 비교된 것으로서, 시간이 경과함에 따른 AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스의 혈장 중의 단일 황산화 KS 수준. (B) AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스의 혈장에서 단일 황산화 KS 수준은 16주령의 미처리된 Mtol 마우스 수준에 비해 현저히 낮았다(n=4-5; 평균±SD; *p<0.05 vs. WT; #p<0.05 vs. 미처리군; 일원 ANOVA).
도 10. AAV8-TBG-hGALNS로 처리되거나, AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리되거나, 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns-/-), 또는 WT 마우스에서 시간 경과에 따라 측정된 혈액 diHS-0S 수준.
도 11a-11p. (A) 뼈 병리 점수의 그래프 묘사. 뼈 병리는 MPS IVA KO 마우스(galns-/-)에 벡터 AAV8-hGALNS 또는 AAV8-D8-hGALNS를 투여하고 12주 후 조직병리학적 분석에 의해 평가하였다. (B) 무릎 관절의 조직병리학(Lig-인대; M-반월판; F-대퇴골; T-경골), (C-F) 대퇴골 관절 연골(40배 확대), (G-J) 대퇴골 성장판(40배 확대), (K) 반월판(40배 확대), (L) 인대(경골 측, 40배 확대), (M, N) 심장 판막 기저부(40 배 확대) 및 (O, P) 심장 판막(40배 확대).
도 12a-12c. (A) 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), 미처리된 Mtol 마우스 및 야생형 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 투여 후 MPS IVA KO 마우스(galns-/-) 및 Mtol 마우스의 간에서 각각 측정된 hGALNS 효소 활성 수준(n=3-8; 평균±SD). (B) 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), 미처리된 Mtol 마우스 및 야생형 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 투여 후 MPS IVA KO 마우스(galns-/-)의 비장 및 Mtol 마우스의 비장에서 각각 측정된 hGALNS 효소 활성 수준(n=3-8; 평균±SD). (C) 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), 미처리된 Mtol 마우스 및 야생형 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 투여 후 MPS IVA KO 마우스(galns-/-)의 폐 및 Mtol 마우스의 폐에서 각각 측정된 hGALNS 효소 활성 수준(n=3-8; 평균±SD).
도 13a-13b. (A) 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), 미처리된 Mtol 마우스 및 야생형 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 투여 후 MPS IVA KO 마우스(galns-/-)의 뼈 및 Mtol 마우스의 뼈에서 각각 측정된 hGALNS 효소 활성 수준(n=3-8; 평균±SD). (B) 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), 미처리된 Mtol 마우스 및 야생형 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 투여 후 MPS IVA KO 마우스(galns-/-)의 심장 및 Mtol 마우스의 심장에서 각각 측정된 hGALNS 효소 활성 수준(n=3-8; 평균±SD).
도 14. 미처리된 MPS IVA KO 마우스 및 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-)의 혈장 중의 단일 황산화 KS 수준(n=4-8; 평균±SD).
도 15a-15b. (A) 미처리된 Mtol 및 WT 마우스와 비교된 것으로서, 시간 경과에 따른 AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스의 혈장 중의 단일 황산화 KS 수준. (B) AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스의 혈장 중의 단일 황산화 KS 수준은 16주령의 미처리된 Mtol 마우스 수준과 비교했을 때 유의적으로 낮았다(n=4-5; 평균±SD; *p<0.05 vs. WT; #p<0.05 vs. 미처리군; 일원 ANOVA).
도 16a-16c. (A) 미처리된 MPS IVA KO 마우스 및 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-)의 간 중의 단일 황산화 KS 수준. (B) 미처리된 MPS IVA KO 마우스 및 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-)의 폐 중의 단일 황산화 KS 수준. (C) 미처리된 Mtol 마우스 및 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스의 간 중의 단일 황산화 KS 수준. (A)-(C)의 경우, n=3-8; 평균±SD; *p<0.05 vs. WT; #p<0.05 vs. 미처리군; 일원 ANOVA.
도 17a-17e. (A) 야생형 마우스(모든 연골세포는 비-액포화되었고 기둥 구조(column structure)는 잘 조직화됨), (B) 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-)(모든 연골세포는 액포화되었고, 기둥 구조는 크게 붕괴되고 비틀어짐), (C) 미처리된 Mtol 마우스(모든 연골세포는 액포화되었고 기둥 구조는 크게 붕괴되고 비틀어짐), (D) AAV8-TBG-hGALNS 처리된 Mtol 마우스(연골세포가 중간 정도로 액포화되었지만 기둥 구조는 더욱 양호했음), 및 (E) AAV8-TBG-D8-hGALNS 처리된 Mtol 마우스(연골세포는 중간 정도로 액포화되었지만 기둥 구조는 부분적으로 회복됨)의 대퇴골 성장판의 조직병리(40배).
도 18a-18d. (A) 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), AAV8-TBG-hGALNS 처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-) 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-)의 대퇴골 성장판에서 측정된 연골세포의 세포 크기. (B) 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 Mtol 마우스, AAV8-TBG-hGALNS 처리된 Mtol 마우스 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 처리된 Mtol 마우스의 대퇴골 성장판에서 측정된 연골세포의 세포 크기. (C) 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), AAV8-TBG-hGALNS 처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-) 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-)의 경골 성장판에서 측정된 연골세포의 세포 크기. (D) 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 Mtol 마우스, AAV8-TBG-hGALNS 처리된 Mtol 마우스 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 처리된 Mtol 마우스의 경골 성장판에서 측정된 연골세포의 세포 크기. (A)-(D)의 경우, n=4-6; 평균±SD; *p<0.05 vs. WT; #p<0.05 vs. 미처리군; 일원 ANOVA.
도 19. 미처리된 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-) 및 Mtol 마우스의 심장 판막의 조직병리학(40배 확대).
도 20. 미처리된 Mtol 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스의 심근의 조직병리(40배 확대).
도 21a-21d. (A) 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스의 심장 판막 조직의 병리 점수. (B) 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 Mtol 마우스, AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스, 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스의 심장 판막 조직의 병리 점수. (C) 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스의 심근 조직의 병리 점수. (D) 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 Mtol 마우스, AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스, 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스의 심근 조직의 병리 점수.(도 21a 내지 21d의 경우, n=4-6; 평균±SD; *p<0.05 vs. WT; #p<0.05 vs. 미처리군; 일원 ANOVA).
도 22. AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV-TBG-D8-hGALNS 투여 후 MPS IVA KO 마우스(galns -/-)의 혈장에서 측정된 시간 경과에 따른 hGALNS 효소 활성(n=4-7; 평균+SD).
도 23. AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 투여 후 Mtol 마우스의 혈장에서 측정된 시간 경과에 따른 hGALNS 효소 활성(n=4-5; 평균+SD).
도 24a-24k. AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA 마우스에서의 혈액 및 조직의 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(hGALNS) 효소 활성. (A) AAV8-TBG-hGALNS 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS 바이러스 벡터 게놈의 개략적 구조. 16주령까지 격주로 MPS IVA 마우스로부터 혈액 샘플을 수집하였고, 혈장 hGALNS 효소 활성을 (B) 녹아웃 (KO) 및 (C) 내성(MTOL) 마우스에서 측정하였다. n=4-7. 뼈-표적화 신호가 있거나없는 AAV 벡터의 주입 12주 후 MPS IVA 마우스로부터 조직 샘플을 수집하였다. (D) 간, (E) 비장, (F) 폐, (G) 신장, (H) 심장 및 (I) 뼈(다리)를 포함하는 조직에서의 hGALNS 효소 활성을 KO 및 MTOL 마우스에서 측정하였다(n=3-8; 통계는 본페로니 사후 검정(Bonferroni's post-hoc test)을 사용하여 일원 ANOVA에 의해 분석하였고 데이터는 평균±SD로 표시된다. *p<0.05). AAV 벡터의 IV 전달 후 12주째 MPS IVA KO 마우스의 간, 비장, 폐, 신장, 심장 및 뼈에서의 hGALNS 활성 수준은 (J)에 도시된다. AAV 벡터의 IV 전달 후 12주째 MTOL 마우스의 간, 비장, 폐, 신장, 심장 및 뼈에서의 hGALNS 활성 수준은 (K)에 도시된다.
도 25a-25d. AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA 마우스에서 혈액 및 조직 글리코사미노글리칸(GAG) 수준. 16주령까지 격주로 MPS IVA 마우스로부터 혈액 샘플을 수집하였고, (A) 녹아웃(KO) 마우스 및 (B) 내성(MTOL) 마우스에서 혈장 단일 황산화 KS 수준을 측정하였다. n=4-8. 조직 샘플은 뼈-표적화 신호가 있거나 없는 AAV 벡터의 주입 후 12주째 MPS IVA 마우스로부터 수집하였다. (C) 간 및 (D) 폐를 포함한 조직에서의 KS 양은 KO 및 MTOL 마우스에서 측정하였다. n=4-8. 통계는 본페로니의 사후 검정을 사용하여 일원 ANOVA로 분석하였다. 데이터는 평균±SD로 표시된다. *p <0.05.
도 26a-26c. AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA 마우스에서의 뼈 병리의 교정. 연골세포 액포화의 교정은 AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA 마우스의 무릎 관절에서 (A) 성장판 및 (B) 관절원반의 광학 현미경법을 사용하여 톨루이딘 블루 염색 분석에 의해 평가하였다. 녹아웃(KO) 및 내성(MTOL) 마우스에서의 뼈 병리를 야생형, 미처리된 MPS IVA, 및 뼈 표적화 신호가 있거나 없는 AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA와 비교하였다. 축척 막대 = 25μm. (C) 대퇴골 또는 경골의 성장판 병변에서 연골세포 크기를 Image J 소프트웨어로 정량하였다. 데이터는 야생형 군으로부터의 변화 배수로 나타내었다. n=4-7. 통계는 본페로니 사후 검정을 이용하여 일원 ANOVA로 분석하였다. 데이터는 평균±SD로 표시된다. *p<0.05.
도 27a-27c. AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA 마우스에서의 심장 병리의 교정. 액포화의 교정은 AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA 마우스의 (A) 심장 판막 및 (B) 심근의 광학 현미경법을 사용하여 톨루이딘 블루 염색 분석에 의해 평가하였다. 녹아웃(KO) 및 내성(MTOL) 마우스에서의 심장 병리를 야생형, 미처리된 MPS IVA, 및 뼈 표적화 신호가 있거나 없는 AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA와 비교하였다. 화살표는 질병 관련 액포의 위치를 나타낸다. 축척 막대 = 25μm.
도 28. AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA 마우스에서 항-hGALNS 항체 역가의 순환. 혈장은 뼈 표적화 신호가 있거나 없는 AAV8 벡터의 주입 후 12주째 MPS IVA 마우스로부터 수집하였다. 순환성 항-hGALNS 항체 역가는 간접 ELISA 검정에 의해 검출하였다. OD 405 값은 마이크로평판 분광광도계에서 측정하였다. n=4-8. 통계는 본페로니의 사후 검정을 사용하여 일원 ANOVA로 분석하였다. 데이터는 평균±SD로 표시된다. *p<0.05.
도 29a-29b. 뼈 표적화 신호가 있거나 없는 최적화된 hGALNS의 평가. Huh-7 세포를 각각 뼈 표적화 신호가 있거나 없는 hGALNS 또는 코돈 최적화된 hGALNS를 발현하는 AAV8 벡터 플라스미드로 형질감염시켰다. 48시간 형질감염 후, 세포 펠릿 및 배지를 수집하였고, hGALNS 활성을 측정하였다. (A) 세포내 효소 활성은 TBG-hGALNS 플라스미드, TBG-hGALNS-CoOpt 플라스미드, TBG-D8-hGALNS 플라스미드, 또는 TBG-D8-hGALNS-CoOpt 플라스미드로 형질감염시킨 후 HuH-7 세포에서 결정하였다. (B) 배지에서의 효소 활성은 HuH-7 세포를 TBG-hGALNS 플라스미드, TBG-hGALNS-CoOpt 플라스미드, TBG-D8-hGALNS 플라스미드 또는 TBG-D8-hGALNS-CoOpt 플라스미드로 형질감염시킨 후 결정하였다. 데이터는 평균으로 표시된다. n=2.
도 30. AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA 마우스에서 혈중 헤파란 설페이트(HS) 수준. MPS IVA 마우스에서 혈액 샘플을 수집하였고 혈장 diHS-0S 수준을 16주령째 녹아웃(KO) 및 내성(MTOL) 마우스에서 측정하였다. 데이터는 평균±SD로 표시된다. AAV: 아데노 관련 바이러스, TBG: 티록신 결합 글로불린, hGALNS: N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제.
도 31. AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA 마우스 중의 조직 헤파린 설페이트(HS) 수준. 조직 샘플은 뼈-표적화 신호가 있거나 없는 AAV 벡터의 주입 후 12주째 MPS IVA 마우스로부터 수집하였다. 간, 비장, 폐 및 신장을 포함한 조직에서 diHS-0S의 양은 KO 및 MTOL 마우스에서 측정하였다. 데이터는 평균±SD로 표시된다.
도 32a-32b. AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA 마우스의 뼈 병리 교정. 연골세포 액포화의 교정은 AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA 마우스의 무릎 관절에서 (A) 인대 및 (B) 반월판을 광학현미경을 사용하여 톨루이딘 블루 염색 분석에 의해 평가하였다. 녹아웃(KO) 및 내성 마우스(MTOL)의 뼈 병리는 야생형, 미처리된 MPS IVA 및 뼈 표적화 신호가 있거나 없는 AAV8 벡터로 처리된 MPS IVA와 비교하였다. 화살표는 질병 관련 액포의 위치를 나타낸다(축척 막대 = 25μm).
도 33. 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 5x1013 GC/kg체중의 AAV8-CAG-hGALNS 또는 AAV8-CAG-D8-hGALNS가 투여된 MPSIVA KO 마우스의 혈장 중의 hGALNS 효소 활성.
도 34. 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 5x1013 GC/kg체중의 AAV8-CAG-D8-hGALNS가 투여된 MPSIVA KO 마우스의 혈장 중의 hGALNS 효소 활성.
도 35. 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 5x1013 GC/kg체중의 AAV8-CAG-hGALNS가 투여된 MPSIVA KO 마우스의 혈장 중의 hGALNS 효소 활성.
도 36. 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 5x1013 GC/kg체중의 AAV8-CAG-hGALNS 또는 AAV8-CAG-D8-hGALNS가 투여된 MPSIVA KO 마우스의 간 중의 hGALNS 효소 활성.
도 37. 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 5x1013 GC/kg체중의 AAV8-CAG-hGALNS가 투여된 MTOL 마우스 혈장 중의 hGALNS 효소 활성.
도 38. 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 5x1013 GC/kg체중의 AAV8-CAG-hGALNS가 투여된 MTOL 마우스 간 중의 hGALNS 효소 활성.
도 39. 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 2x1014 GC/kg체중의 AAV8-TBG-hGALNS가 투여된 MPSIVA KO 마우스 혈장 중의 hGALNS 효소 활성.
도 40. 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 2x1014 GC/kg체중의 AAV8-TBG-D8-hGALNS가 투여된 MPSIVA KO 마우스의 혈장 중의 hGALNS 효소 활성.
도 41. 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 2x1014 GC/kg체중의 AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS가 투여된 MPSIVA KO 마우스의 간 중의 hGALNS 효소 활성.
6. 상세한 설명
본 발명은 점액다당류증 IVA형(MPS IVA)의 동물 모델에서 특정 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)의 투여가 모니터링 기간 동안 높은 수준의 hGALNS 효소 활성을 유지하고 효소 대체 요법(ERT)에 의해 달성된 것보다 개선을 나타내는, 조직, 예컨대 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및 심장 판막에서의 개선을 초래한다는 놀라운 발견을 적어도 부분적으로 기반으로 한다.
본원에는 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 MPS IVA의 치료에 사용하기 위한 rAAV가 제공된다. 상기 rAAV는 hGALNS를 암호화하는 재조합 AAV 게놈을 포함한다. 상기 rAAV는 MPS IVA 환자에게 투여되어 hGALNS의 합성 및 환부 조직(affected tissue), 예컨대 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근, 및/또는 심장 판막으로 hGALNS의 전달을 초래하여, 병리를 개선하고, 상기 질병의 진행을 방지한다.
본원에는 AAV 캡시드, 및 AAV 역위 말단 반복체(ITR)가 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)가 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 rAAV 캡시드는 혈청형 AAV8 캡시드와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일하다. 특정 구현예에서, 상기 rAAV 캡시드의 아미노산 서열은 서열번호 1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일하다. 특정 구현예에서, 상기 rAAV 캡시드의 아미노산 서열은 서열번호 1과 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-99% 또는 99-99.9% 동일하다. rAAV 캡시드에 대한 더욱 자세한 내용은 섹션 6.1.1을 참조한다. 일부 구현예에서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 산성 올리고펩타이드는 D8이다. 특정 구현예에서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 프로모터(예를 들어, 티록신 결합 글로불린(TBG) 프로모터)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 추가로 폴리 A 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 프로모터(예를 들어, TBG 프로모터)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 추가로 폴리 A 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한 본원에는, 본원에 기재된 바와 같은 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 또한, 본원에 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 rAAV를 제조하기 위해 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 및 세포(예를 들어, 생체외 숙주 세포)가 추가로 제공된다.
본원에는, 본원에 기재된 rAAV를 제조하는 방법이 추가로 제공된다.
또한, 본원에는 점액다당류증 IVA형(MPS IVA)로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 일 측면에서, 상기 방법은 본원에 기재된 rAAV를 상기 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 방법은 글리코실화된 hGALNS(예를 들어, 간 세포에서 생성되고 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 hGALNS)를 환부 조직(들)으로 전달하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 방법은 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 환부 조직(들)으로 전달하는 것을 포함한다. 상기 융합 단백질은 간세포에서 생성되고 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화될 수 있다.
추가로, 본원에는 본원에 기재된 rAAV를 포함하는 약학적 조성물 및 키트가 제공된다.
본원에 제공된 rAAV는 섹션 6.1.1의 rAAV 캡시드에 대한 설명과 섹션 6.1.2의 hGALNS 발현 카세트에 대한 설명을 포함하는 섹션 6.1에 설명되어 있다. 본원에 제공된 rAAV의 제조 방법, 뿐만 아니라, 이러한 방법에 사용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드 및 세포가 섹션 6.2에 설명되어 있다. 표적 환자 집단, 투여 경로 및 투여 요법을 포함하여 MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법은 섹션 6.3에 설명되어 있다. 조합 요법은 섹션 6.4에 설명되어 있다. 임상 결과를 평가하기 위한 질병 마커 및 방법은 섹션 6.5에 설명되어 있다. 비제한적인 예시적 실시예는 섹션 7에 제공된다.
이론에 의해 얽매임이 없이, rAAV의 제조, 조성물 및 사용 방법은 MPS IVA에 대한 치료로서 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 및/또는 심장 판막으로 hGALNS 효소의 전달을 여전히 초래하도록 변형될 수 있다.
6.1 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)
본원에는 필요로 하는 인간 대상체에서 MPS IVA의 치료에 유용한 rAAV가 제공되며, 여기서 상기 rAAV는 AAV 캡시드, 및 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈을 포함한다.
일 측면에서, 본원에는 (a) AAV 캡시드; 및 (b) AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈을 포함하고, 상기 hGALNS 발현 카세트가 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 전이유전자와 같은 전이유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, rAAV가 제공된다. 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다.
다른 측면에서, 본원에는 (a) AAV 캡시드; 및 (b) AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈을 포함하고, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 rAAV가 제공된다.
바람직하게는, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하여, hGALNS 단백질이 간에서 발현되고, 일단 간 세포로부터 분비된 hGALNS 단백질이, 예컨대 뼈, 연골 및 관련 조직, 및 심장 판막과 같은 심한 환부 기관을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다른 조직으로 전위된다.
본원에 제공된 rAAV의 여러 구성요소는 이하에 상세히 설명된다.
6.1.1 캡시드
캡시드는 숙주 환경과 상호 작용하면서 바이러스 게놈을 패키징하고 보호하는 바이러스의 단백질 껍질이다. 본 발명에 따르면, 본원에 제공된 rAAV는 AAV 캡시드를 포함한다. 특정 구현예에서, AAV 캡시드는 자연적으로 발견된 AAV의 캡시드(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 또는 AAV11의 캡시드)이다. 다른 특정 구현예에서, AAV 캡시드는 자연적으로 발견된 AAV의 캡시드(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 또는 AAV11의 캡시드)로부터 유래된 것으로서, 예를 들어, 상기 자연적으로 발견된 AAV의 캡시드의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따라 사용될 수 있는 AAV 변이체 캡시드는 전체 내용이 참조로 포함되는 Zinn 등, 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068에 기재된 바와 같은 Anc80 또는 Anc80L65를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따라 사용될 수 있는 AAV 변이체 캡시드는 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 9,193,956; 9,458,517; 및 9,587,282 및 미국 특허 출원 공개 번호 2016/0376323에 기재된 바와 같은 LGETTRP 또는 LALGETTRP와 같은 아미노산 삽입 중 하나를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따라 사용될 수 있는 AAV 변이체 캡시드는 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 9,193,956; 9,458,517; 및 9,587,282 및 미국 특허 출원 공개 번호 2016/0376323에 기재된 바와 같은 AAV.7m8을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따라 사용될 수 있는 AAV 변이체 캡시드는 미국 특허 9,585,971에 개시된 임의의 AAV, 예컨대 AAV-PHP.B를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 AAV 변이체 캡시드는 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 하기 특허 및 특허 출원 중 임의의 것에 개시된 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: 미국 특허 7,282,199; 7,906,111; 8,524,446; 8,906,675; 8,999,678; 8,628,966; 8,927,514; 8,734,809; US 9,284,357; 9,409,953; 9,169,299; 9,193,956; 9458517; 9,587,282; 9,737,618; 9,840,719; 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; 및 국제 특허 출원 번호 PCT/US2002/033630; PCT/US2004/028817; PCT/2002/033629; PCT/US2006/013375; PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335; PCT/US2016/042472; PCT/US2017/027392.
특정 구현예에서, 단일 가닥 AAV(ssAAV)가 상기와 같이 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 자기상보성(self-complementary) 벡터, 예를 들어 scAAV가 사용될 수 있다(예를 들어, Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2): 171-82, McCarty 등, 2001, Gene Therapy, Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254; 및 미국 특허 번호 6,596,535; 7,125,717; 및 7,456,683, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨).
바람직한 구현예에서, 상기 rAAV에 함유된 AAV 캡시드는 AAV8의 캡시드 또는 AAV8의 캡시드로부터 유래된다. AAV8은 다른 혈청형보다 간 형질도입 효율이 더 높고 인간 AAV에 대한 항체에 대해 낮은 반응성을 갖는다. 중요한 것은, 상기 AAV8 캡시드의 특정 영역이 핵 진입 및 캡시드 탈외피(uncoating)을 매개함으로써 높은 간 형질도입에 기여한다는 것이다(Tenney 등, Virology, 2014, 454-455: 227-236; Nam 등, J Virol., 2007 81(22): 12260-12271). 결과적으로, AAV8은 간세포에 대한 향성을 갖는다(Sands, M., Methods Mol Biol., 2011; 807:141-157). 특정 구현예에서, rAAV에 함유된 AAV 캡시드의 아미노산 서열은 AAV8 캡시드의 아미노산 서열(서열번호 1)과 동일하다. 특정 구현예에서, rAAV에 함유된 AAV 캡시드의 아미노산 서열은 AAV8 캡시드의 아미노산 서열(서열번호 1)과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9% 동일한 한편, 바이러스 게놈을 패키징하는 AAV8 캡시드의 능력 및 바람직하게는 또한 간 세포를 높은 효율로 형질도입시키는 AAV8 캡시드의 능력도 유지한다. 특정 구현예에서, rAAV에 함유된 AAV 캡시드의 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 잔기를 제외하고는 AAV8 캡시드의 아미노산 서열(서열번호 1)과 동일한 한편, 바이러스 게놈을 패키징하는 AAV8 캡시드의 능력 및 바람직하게는 또한 간 세포를 높은 효율로 형질도입시키는 AAV8 캡시드의 능력도 유지한다. 본원에 기재된 치료 방법의 바람직한 구현예에서, AAV8은 hGALNS 단백질의 표적화된 간 발현에 사용된다.
6.1.2 hGALNS 발현 카세트
AAV는 말단에 2개의 역위 말단 반복체(ITR)를 함유하는 선형 단일 가닥 DNA(ssDNA) 게놈을 갖는다. AAV는 세포내이입에 의해 세포 내로 들어간다(Meier 및 Greber, J Gene Med., 2004;6 Suppl 1:S152-63). 캡시드가 붕괴되는 즉시, 상기 ssDNA 게놈이 방출되고 이중 가닥 DNA(dsNDA)로 전환되며, 이로부터 바이러스 게놈에 의해 암호화된 유전자가 발현될 수 있다(Ding 등, 2005, Gene Ther., 12:873-880).
본 발명에 따르면, 본원에 제공된 rAAV는 재조합 AAV 게놈을 포함한다. 재조합 AAV 게놈은 AAV 게놈 또는 이의 변이체의 백본(backbone)(예를 들어, AAV1, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 또는 AAV11 게놈 또는 이의 변이체의 백본)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 재조합 AAV 게놈은 AAV8 게놈 또는 이의 변이체의 백본을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 재조합 AAV 게놈은 AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 다른 구현예에서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다.
(a) hGALNS
특정 구현예에서, 융합 단백질의 hGALNS 또는 hGALNS 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2 또는 3의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 융합 단백질의 hGALNS 또는 hGALNS 부분(portion)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2 또는 3에 제시된 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
특정 구현예에서, 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4 또는 5의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4 또는 5에 제시된 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
특정 구현예에서, 융합 단백질의 hGALNS 또는 hGALNS 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 hGALNS의 cDNA 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 융합 단백질의 hGALNS 또는 hGALNS 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 hGALNS의 cDNA 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
특정 구현예에서, 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 융합 단백질의 cDNA 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질의 cDNA 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
특정 구현예에서, hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 본 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 코돈 최적화 기술을 통해 코돈 최적화된다(예를 들어, Quax 등, 2015, Mol Cell 59:149-161에 의한 검토 참조).
특정 구현예에서, CpG 부위는 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결핍된다.
(b) 산성 올리고펩타이드
산성 올리고펩타이드는 뼈 및 연골의 주요 성분인 하이드록시아파타이트에 대해 높은 결합 친화성을 갖는다. 본원에 사용된 용어 "산 올리고펩타이드"는 글루탐산(E) 및/또는 아스파르트산(D) 잔기의 반복 아미노산 서열을 갖는 올리고펩타이드를 지칭한다. 산성 올리고펩타이드에서 아미노산 잔기의 수는 예를 들어 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개일 수 있다. 특정 구현예에서, 산성 올리고펩타이드에서 아미노산 잔기의 수는 4-8개이다. 특정 구현예에서, 산성 올리고펩타이드에서 아미노산 잔기의 수는 6-8개이다. 특정 구현예에서, 산성 올리고펩타이드에서 아미노산 잔기의 수는 6개이다. 다른 특정 구현예에서, 산성 올리고펩타이드에서 아미노산 잔기의 수는 8개이다.
바람직한 구현예에서, 산성 올리고펩타이드는 D8(즉, 8개의 아스파르트산 잔기의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩타이드)이다. 다른 구현예에서, 상기 산성 올리고펩타이드는 E6(즉, 6개의 글루탐산 잔기의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩타이드)이다. E6 서열은 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 Tomatsu 등, 2010, Molecular Therapy, 18(6):11094-1102에 기재되어 있다.
바람직한 구현예에서, 산성 올리고펩타이드는 hGALNS의 N-말단에 융합된다. 다른 구현예에서, 상기 산성 올리고펩타이드는 hGALNS의 C-말단에 융합된다.
특정 구현예에서, 산성 올리고펩타이드는 중재성 아미노산 서열 없이 hGALNS에 직접 융합된다. 다른 특정 구현예에서, 상기 산성 올리고펩타이드는 링커 아미노산 서열(예를 들어, 길이가 1-10, 2-8 또는 4-6개 아미노산 잔기인 아미노산 서열)을 통해 hGALNS에 융합된다.
특정 구현예에서, 상기 hGALNS 효소는 뼈 및 연골 병리를 개선하기 위해 뼈 및 연골 영역의 라이소좀으로 전달될 수 있다.
(c) 유전자 발현의 프로모터 및 변형자:
특정 구현예에서, 본원에 기재된 hGALNS 발현 카세트는 유전자 전달 또는 유전자 발현을 조절하는 성분(예를 들어, "발현 제어 요소")을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 상기 hGALNS 발현 카세트는 유전자 발현을 조절하는 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 상기 hGALNS 발현 카세트는 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 hGALNS 발현 카세트는 흡수 후 세포 내에서 hGALNS의 국재화(localization)에 영향을 미치는 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 hGALNS 발현 카세트는, 예를 들어, 상기 hGALNS 발현 카세트를 흡수한 세포를 검출하거나 선택하기 위해, 검출가능하거나 선택가능한 마커로서 사용될 수 있는 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 상기 hGALNS 발현 카세트는 하나 이상의 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하고, 이들 중 적어도 하나는 hGALNS를 암호화하거나, 또는 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터이다.
특정 구현예에서, 상기 프로모터는 간 특이적 프로모터이다.
상기 간 특이적 프로모터는 티록신 결합 글로불린(TBG) 프로모터일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다(예를 들어, Yan 등, 2012, Gene, 506(2): 289-94 참조, 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨).
특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 서열번호 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 서열번호 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 서열번호 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 서열번호 13이다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 서열번호 14이다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 서열번호 15이다.
특정 구현예에서, 상기 프로모터는 간 및 근육 특이적 프로모터이다.
특정 구현예에서, 상기 간 및 근육 프로모터는 서열번호 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 간 및 근육 프로모터는 서열번호 16이다.
특정 구현예에서, 상기 프로모터는 hGALNS 또는 융합 단백질의 발현을 향상시키는 하나 이상의 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 TATA 박스를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 프로모터 요소는 서로에 대해 역위될 수 있거나 이동될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터의 요소는 협동적으로 기능하도록 위치할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터의 요소는 독립적으로 기능하도록 위치할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 TBG 프로모터, 인간 CMV 즉시 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스(RS) 장 말단 반복체, 및 래트 인슐린 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 상기 hGALNS 발현 카세트는 하나 이상의 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조직 특이적 프로모터는 간 특이 적 프로모터이다. 특정 구현예에서, 상기 TBG 프로모터는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 인핸서를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 알파 mic/bik 인핸서), 억제자(repressor), 인트론 또는 키메라 인트론(예컨대, 닭 베타 액틴 유전자의 제1 인트론)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및/또는 폴리 A 부위(예를 들어, 토끼 글로빈 폴리 A 부위)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있는, 하나 이상의 추가 발현 제어 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 토끼 글로빈 폴리 A 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9의 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 인트론을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10의 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 알파 mic/bik 인핸서를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 11의 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 알파 mic/bik 인핸서, 인트론을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, TBG 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, hGALNS를 암호화하거나 또는 산성 올리고펩타이드(예컨대, D8)에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 토끼 글로빈 폴리 A 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 토끼 글로빈 폴리 A 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9의 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 인트론을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10의 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 알파 mic/bik 인핸서를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 11의 서열을 갖는다.
(d) 역위 말단 반복체
본 발명에 따르면, 본원에 기재된 hGALNS 발현 카세트에는 2개의 AAV 역위 말단 반복체(ITR)가 측면에 있다. ITR 서열은 재조합 유전자 발현 카세트를 비리 온으로 패키징하는데 사용될 수 있다(예를 들어, Yan 등, 2005, J. Virol., 79(1):364-379; 미국 특허 번호 7,282,199 B2, 미국 특허 번호 7,790,449 B2, 미국 특허 번호 8,318,480 B2, 미국 특허 번호 8,962,332 B2 및 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2014/076466 참조, 이들 각각은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨). 특정 구현예에서, 상기 측면에 있는 ITR은 AAV8 ITR이다. 특정 구현예에서, ITR 서열은 서열번호 7의 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, ITR 서열은 서열번호 8의 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 5' ITR은 서열번호 7의 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 3' ITR은 서열번호 8의 서열을 가질 수 있다.
(e) 비해독 영역
특정 구현예에서, 본원에 기재된 hGALNS 발현 카세트는 하나 이상의 비해독 영역(UTR), 예를 들어 3' 및/또는 5' UTR을 포함한다. 특정 구현예에서, UTR은 원하는 단백질 발현 수준에 대해 최적화된다. 특정 구현예에서, UTR은 hGALNS의 mRNA 반감기에 대해 최적화된다. 특정 구현예에서, UTR은 hGALNS의 mRNA의 안정성을 위해 최적화된다. 특정 구현예에서, UTR은 hGALNS의 mRNA의 2차 구조에 대해 최적화된다.
6.1.3 약학적 조성물 및 키트
특정 구현예에서, 본원에는, 본원에 제공된 rAAV 및 약학적 허용성 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 상기 약학적 조성물은 개별 단일 단위 투여 형태로서 제조될 수 있다. 본원에 제공된 약학적 조성물은, 예를 들어, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 비강내, 척수강내 또는 경피 투여를 위해 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 적절한 약학적 허용성 담체(예를 들어, 정맥내 투여 및 간 세포의 형질도입용)는 본 기술분야의 기술자에 의해 용이하게 선택될 것이다.
본원에는, 하나 이상의 용기에 함유된 본원에 기재된 약학적 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 약학적 조성물이 패키징될 수 있는 용기는 병, 패킷, 앰플, 튜브, 흡입기(inhaler), 백(bag), 바이알 및 용기를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 키트는 약학적 조성물을 투여하기 위한 지침서를 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 주사기, 무바늘 주사기, 드립 백(drip bag), 패치(patch) 및 흡입기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 약학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있는 장치를 포함한다.
또한, 유전자 요법에 의해 본원에 기재된 rAAV를 사용하여 MPS IVA를 치료할 때 사용될 수 있는 장치 및 혈액 순환 시스템이 제공된다. 이러한 장치 및 시스템은 본 기술분야의 기술자에 의해 쉽게 선택될 수 있다.
6.2 rAAVS의 제조
또한, 본원에는, 본원에 기재된 바와 같은 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 본원에 제공된 rAAV를 생성하는데 사용될 수 있는 플라스미드 및 세포, 및 본원에 제공된 rAAV를 제조하는 방법이 제공된다.
6.2.1 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드 및 세포
본원에는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
일 측면에서, 본원에는 AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 hGALNS 발현 카세트는 산성 올리고펩타이드(예컨대, D8)에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 전이유전자와 같은 전이유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 프로모터(예를 들어, TBG 프로모터)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 서열번호 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 서열번호 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 서열번호 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 서열번호 13이다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 서열번호 14이다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 서열번호 15이다.
다른 측면에서, 본원에는 AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 프로모터(예를 들어, TBG 프로모터)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다.
일 측면에서, 본원에는 AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 hGALNS 발현 카세트는 산성 올리고펩타이드(예컨대, D8)에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 전이유전자와 같은 전이유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 hGALNS 발현 카세트는 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터이다.
일 측면에서, 본원에는 AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 hGALNS 발현 카세트는 산성 올리고펩타이드(예컨대, D8)에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 전이유전자와 같은 전이유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터는 서열번호 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 16이다.
다른 측면에서, 본원에는 AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 hGALNS 발현 카세트는 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터이다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 13이다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 14이다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 15이다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 16이다.
상기 hGALNS 발현 카세트는 섹션 6.1.2에 설명된 바와 같은 것일 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 ssDNA의 형태인 것이다. 다른 특정 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 dsDNA의 형태인 것이다.
또한, 본원에는, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드(이하 "rAAV 플라스미드")가 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 rAAV 플라스미드는 ssDNA 플라스미드이다. 다른 특정 구현예에서, 상기 rAAV 플라스미드는 dsDNA 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 상기 rAAV 플라스미드는 원형 형태인 것이다. 다른 구현예에서, 상기 rAAV 플라스미드는 선형 형태인 것이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 다음 성분(LSPX1)을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV 역위 말단 반복체(ITR); (2) 제어 요소로서, a) 2개의 직렬 Mik/BikE 인핸서, b) ApoE 인핸서, c) 인간 AAT 프로모터, d) 폴리 A 신호, 및 e) 선택적으로 인트론을 포함하는 제어 요소; (3) hGALNS 또는 hGALNSco를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 다음 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV2 역위 말단 반복체; (2) 제어 요소로서, a) 2개의 직렬 Mik/BikE 인핸서, b) ApoE 인핸서, c) 인간 AAT 프로모터, d) 토끼 β-글로빈 폴리 A 신호 및 e) 선택적으로 인간 β-글로빈 및 Ig 중쇄에서 유래된 키메라 인트론을 포함하는 제어 요소; 및 (3) hGALNS 또는 hGALNSco를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 다음 성분(LSPX2)을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV 역위 말단 반복체(ITR); (2) 제어 요소로서, a) 2개의 직렬 ApoE 인핸서, b) 인간 AAT 프로모터, c) 폴리 A 신호; 및 d) 선택적으로 인트론을 포함하는 제어 요소; 및 (3) hGALNS 또는 hGALNSco를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 다음 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV2 역위 말단 반복체; (2) 제어 요소로서, a) 2개의 직렬 ApoE 인핸서, b) 인간 AAT 프로모터, c) 폴리 A 신호; 및 d) 선택적으로 인간 β-글로빈 및 Ig 중쇄로부터 유래된 키메라 인트론을 포함하는 제어 요소; 및 (3) hGALNS 또는 hGALNSco를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 다음 성분(LTP1)을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV 역위 말단 반복체(ITR); (2) 제어 요소로서, a) 2개의 직렬 Mik/BikE 인핸서, b) TBG 프로모터, c) 인간 AAT(ΔATG) 프로모터, d) 폴리 A 신호; 및 e) 선택적으로 인트론을 포함하는 제어 요소; 및 (3) hGALNS 또는 hGALNSco를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 다음 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV2 역위 말단 반복체; (2) 제어 요소로서, a) 2개의 직렬 Mik/BikE 인핸서, b) TBG 프로모터, c) 인간 AAT(ΔATG) 프로모터, d) 폴리 A 신호; 및 e) 선택적으로 인간 β-글로빈 및 Ig 중쇄로부터 유래된 키메라 인트론을 포함하는 제어 요소; 및 (3) hGALNS 또는 hGALNSco를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 다음 성분(LTP2)을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV 역위 말단 반복체(ITR); (2) 제어 요소로서, a) ApoE 인핸서, b) 2개의 직렬 Mik/BikE 인핸서, c) TBG 프로모터, d) 인간 AAT(ΔATG) 프로모터, e) 폴리 A 신호; 및 f) 선택적으로 인트론을 포함하는 제어 요소; 및 (3) hGALNS 또는 hGALNSco를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 다음 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV2 역위 말단 반복체; (2) 제어 요소로서, a) ApoE 인핸서, b) 2개의 직렬 MckE 인핸서, c) TBG 프로모터, d) 인간 AAT(ΔATG) 프로모터, e) 폴리 A 신호; 및 f) 선택적으로 인간 β-글로빈 및 Ig 중쇄로부터 유래된 키메라 인트론을 포함하는 제어 요소; 및 (3) hGALNS 또는 hGALNSco를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 다음 성분(LMTP6)을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV 역위 말단 반복체(ITR); (2) 제어 요소로서, a) ApoE 인핸서, b) 3개의 직렬 MckE 인핸서, c) CK 프로모터, d) 인간 AAT(ΔATG) 프로모터, e) 폴리 A 신호; 및 f) 선택적으로 인트론을 포함하는 제어 요소; 및 (3) hGALNS 또는 hGALNSco를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 다음 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV2 역위 말단 반복체; (2) 제어 요소로서, a) ApoE 인핸서, b) 3개의 직렬 MckE 인핸서, c) CK 프로모터, d) 인간 AAT(ΔATG) 프로모터, e) 폴리 A 신호; 및 f) 선택적으로 인간 β-글로빈 및 Ig 중쇄로부터 유래된 키메라 인트론을 포함하는 제어 요소; 및 (3) hGALNS 또는 hGALNSco를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
본원에는, 본원에 제공된 rAAV를 발현(예를 들어, 재조합적으로)하는 세포(바람직하게는 생체외 세포)가 추가로 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 세포(바람직하게는 생체외 세포)는 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 또는 본원에 제공된 rAAV 플라스미드를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포(바람직하게는, 생체외 세포)는 AAV Rep, Cap 및 Ad5 기능을 제공하는 헬퍼 폴리뉴클레오타이드(들) 또는 헬퍼 플라스미드를 추가로 포함한다. 세포(바람직하게는, 생체외 세포)는 포유류 숙주 세포, 예를 들어 HEK293, HEK293-T, A549, WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, 293, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, 원발성 섬유아세포, 간세포 및 근아세포일 수 있다. 포유류 숙주 세포는, 예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼 또는 햄스터로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 포유류 숙주 세포는 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포 또는 HEK293-T 세포이다.
6.2.2 rAAV를 제조하는 방법
본원에 제공된 rAAV를 제조하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 방법은 섹션 6.2.1에 제공된 rAAV 플라스미드 및 AAV Rep, Cap 및 Ad5 기능을 종합적으로 제공하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드에 의해 세포(바람직하게는 생체외 세포)를 형질감염시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 헬퍼 플라스미드는 AAV 유전자 Rep, Cap, VA, E2a 및 E4의 뉴클레오타이드 서열을 종합적으로 포함한다.
유전자 요법 응용을 위해 본원에 제공된 rAAV의 제조는, 예를 들어, 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는, Clement 등, 2016, Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 27: 16002에 기재된 바와 같이, 본 기술분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 플라스미드 DNA의 형질감염은 본 기술분야에 설명된 것과 같이, AAV Rep 및 Cap 기능 뿐만 아니라 Ad5 유전자(VA RNA, E2a, 및 E4)를 제공하는 헬퍼 플라스미드(들) 및 rAAV 플라스미드와 함께 인간 배아 신장 293 세포(HEK293) 또는 HEK293-T에 인산칼슘 플라스미드 침전을 사용하여 수행한다. 특정 구현예에서, 상기 Rep, Cap, 및 Ad5 유전자는 동일한 헬퍼 플라스미드 상에 있을 수 있다. 특정 구현예에서는 AAV Rep, Cap 및 Ad5 기능이 별도의 플라스미드로부터 제공되는 이중 헬퍼 방법(또는 삼중 형질감염)이 이용된다. 특정 구현예에서, HEK293 세포는 동물 성분 및 무 항생제 배지에서 현탁액으로 성장하도록 개조될 수 있다.
특정 구현예에서, rAAV는 패키징 및 생산 세포주를 사용하여 제조할 수 있다. 본원에 제공된 rAAV는 포유류 숙주 세포, 예를 들어 A549, WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, HEK293, HEK293-T, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, 원발성 섬유아세포, 간세포 및 근아세포를 사용하여 제조할 수 있다. 본원에 제공된 rAAV는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼 또는 햄스터 유래의 숙주 세포를 사용하여 제조할 수 있다. 특정 구현예에서, 안정한 세포주는 숙주 세포에서 바이러스를 생산하는 수단, 예를 들어 복제 및 캡시드 유전자(예를 들어, AAV의 rep 및 cap 유전자) 및 본원에 제공된 rAAV 플라스미드를 도입시킴으로써 조작될 수 있다. 특정 구현예에서, rAAV는 HEK293 세포를 사용하여 제조할 수 있다. 특정 구현예에서, rAAV는 rep 유전자, cap 유전자 및 rAAV 게놈을 암호화하는 유전자를 가진 3개의 재조합 바큘로바이러스 플라스미드를 공동감염시킴으로써 Sf9 곤충 세포에서 생산될 수 있다.
세포는 본 기술분야의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있는 적절한 프로토콜에 따라 배양, 형질감염 및 수확할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 송아지 태아 혈청, 글루코스, 페니실린, 스트렙토마이신 및 1-글루타민을 포함하나, 이에 제한되지 않는 표준 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)에서 배양될 수 있다(McClure 등, J Vis Exp. 2011,(57): 3348; Shin 등, Methods Mol Biol. 2012, 798: 267-284). 세포는 본 기술분야의 기술자가 쉽게 선택할 수 있는 성분에서 형질감염될 수 있다. 특정 구현예에서, 형질감염은 DMEM 및 Iscove의 변형 둘베코 배지(IMDM)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 배지 용액에서 일어날 수 있다. 특정 구현예에서, 형질감염 시간은 46시간, 47시간, 48시간, 49시간, 50시간, 51시간, 52시간, 53시간, 54시간, 55시간, 56시간, 57시간, 58시간, 59시간, 60시간, 61시간, 62시간, 63시간, 64시간, 65시간, 66시간, 67시간, 68시간, 69시간, 70시간, 50-55시간, 55-60시간, 60-65시간 또는 65-70시간이 걸릴 수 있다. 형질감염 후, 세포를 스크래핑하여 배양 웰에서 세포를 제거하고 웰을 세척하여 형질감염된 모든 세포를 수집함으로써 세포를 수확할 수 있다.
AAV8 캡시드를 포함하는 rAAV를 생산하는 방법에 대해서는 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,282,199 B2의 상세한 설명의 섹션 IV를 참조한다. 상기 벡터의 게놈 카피 역가는, 예를 들어, TAQMAN® 분석에 의해 결정될 수 있다. 비리온은, 예를 들어, CsCl2 침강에 의해 회수할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 rAAV는 단리되거나 정제된 rAAV이다.
다수의 AAV 혈청형이 식별되었다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 rAAV 또는 폴리뉴클레오타이드는 AAV의 하나 이상의 혈청형으로부터 유래된 하나 이상의 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 rAAV 또는 폴리뉴클레오타이드는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, 또는 AAV11 중 하나 이상으로부터 유래된 하나 이상의 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 rAAV 또는 폴리뉴클레오타이드는 AAV8, AAV9, AAV10, 또는 AAV11 혈청 형 중 하나 이상으로부터 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 rAAV 또는 폴리뉴클레오타이드는 AAV8 혈청형으로부터의 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. AAV 성분의 핵산 서열 및 재조합 AAV 및 AAV 캡시드의 제조 방법은, 예를 들어, 각각 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,282,199 B2, 미국 특허 번호 7,790,449 B2, 미국 특허 번호 8,318,480 B2, 미국 특허 번호 8,962,332 B2 및 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2014/076466에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 본원에는 hGALNS를 암호화하는 rAAV8이 제공된다.
특정 구현예에서는 (i) hGALNS 또는 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 조절 요소의 제어 하에 함유하고 ITR이 측면에 있는 발현 카세트를 포함하는 재조합 게놈; 및 (ii) AAV8 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 AAV8 캡시드 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일하지만, 바이러스 게놈을 패키징하는 AAV8 캡시드의 능력 및 바람직하게는 간 세포를 고 효율로 형질도입시키는 AAV8 캡시드의 능력도 유지하는 바이러스 캡시드를 포함하는 rAAV8이 기재된다. 특정 구현예에서, 상기 AAV8 캡시드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산 치환을 갖는 서열번호 1의 서열을 갖고 바이러스 게놈을 패키징하는 AAV8 캡시드의 능력 및 바람직하게는 간세포를 고효율로 형질도입시키는 AAV8 캡시드의 능력도 유지한다.
6.2.3 효능 평가
본원에 기재된 rAAV로부터 hGALNS 발현을 측정하여, 예를 들어 rAAV의 효력을 나타내기 위해, 세포 배양 검정과 같은 시험관내 검정을 사용할 수 있다. 검정에 사용되는 세포는 A549, WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, HEK293, HEK293-T, HuH7, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, 원발성 섬유아세포, 간세포 및 근아세포를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 세포 배양 검정에 사용되는 세포는 HuH7 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, rAAV에 의해 형질감염된 세포는 hGALNS 효소 활성에 대해 분석될 수 있다.
동물 모델은 또한 본원에 기재된 rAAV로부터 hGALNS의 발현 및 그 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. MPS IVA에 대한 마우스 모델은 설명된 바 있다(예를 들어, Tomatsu 등, 2003, Hum Mol Genet 12(24): 3349-3358 참조). MPS IVA에 대한 마우스 모델은 마우스 GALNS의 Exon 2가 표적 파괴된 것이다. 이 마우스는 검출가능한 GALNS 효소 활성이 없으며 증가된 수준의 GAG가 소변에서 검출된다. 2개월령에서, GAG의 증가된 저장이 망상내피 세포, 쿠퍼(Kupffer) 세포 및 비장 내막을 형성하는 동굴모양 세포(sinusoidal cell)에서 관찰된다. 12개월령에서, 액포 변화는 사구체의 내장 상피 세포 및 심장 판막의 기저에 있는 세포에서 관찰되지만, 간세포 및 신세뇨관 상피 세포와 같은 실질 세포에는 존재하지 않는다. GAG의 라이소좀 저장은 해마 및 신피질 뉴런, 수막 세포에서 관찰된다. 케라탄 설페이트(KS) 및 콘드로이틴-6-설페이트(C6S)는 야생형과 비교하여 상기 마우스 모델의 각막 상피 세포에서 증가하지만, 상기 마우스 모델에서 분명해지는 골격 징후는 없었다. 부가적으로, 인간 GALNS에 내성이 있는 MPS IVA 마우스 모델도 설명된 바 있다(예를 들어, Tomatsu 등, 2005, Hum Mol Genet 14(22):3321-3335 참조). 본원에 기술된 rAAV로부터 hGALNS 발현 및 그 효능을 평가하기 위한 예시적인 검정에 대해서는 섹션 7의 실시예를 참조한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 유전자 요법 벡터, 예컨대 기능적 hGALNS 단백질의 증가된 발현을 제공하는 조절 요소 및 전이유전자의 조합을 포함한다. 이러한 발현은 1) 샌드위치 ELISA, 웨스턴 블롯, 조직학적 염색 및 액체 크로마토그래피 직렬 질량 분광분석법(LC-MS/MS)에 제한되지 않는 본 기술분야의 기술자에게 알려진 몇몇 단백질(hGALNS) 결정 검정; 2) 효소 검정 또는 기능 검정과 같은 몇몇 단백질 활성 검정; 및/또는 3) 케라탄 설페이트(KS), 글리코사미노글리칸(CAG) 및/또는 콘드로이틴-6-설페이트(C6S) 검출에 제한되지 않는 몇몇 기질 검출 검정에 의해 측정될 수 있고, 인간 치료에 효과적이고 적합한 것으로 결정될 수 있다(Hintze, J.P. 등, Biomarker Insights 2011:6 69-78). 이러한 시험관내 및 생체내 세포, 혈액 및 조직 연구를 사용한 hGALNS의 정량적 및 기능적 특성 평가는 특정 치료법의 효능과 상관성이 있는 것으로 나타났으며(Hintze, J.P. 등, 2011, 상기 문헌 참조), 본원에 기재된 벡터를 사용한 MPS IVA의 유전자 요법 치료에 대한 반응을 평가하는데 이용되었다.
따라서, 본 발명은 대상체의 간, 근육, 백혈구, 신장, 폐, 비장 심장, 뼈, 또는 연골 세포와 같은 조직 세포에서의 세포내 hGALNS 효소 활성을 야생형 수준과 비교되는 수준으로 증가시키거나, 또는 세포내 hGALNS 효소 활성을, 예컨대 본원의 실시예 2, 3, 및 8에 기재된 바와 같은 검정 형식을 사용하거나, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하는 hGALNS 효소 활성 검정에 의해 측정했을 때, 약 2배 야생형 hGALNS 활성 수준, 또는 약 5배 야생형 hGALNS 활성 수준, 약 10배 야생형 hGALNS 활성 수준, 약 25배 야생형 hGALNS 활성 수준, 약 40배 야생형 hGALNS 활성 수준, 약 50배 야생형 hGALNS 활성 수준, 약 60배 야생형 hGALNS 활성 수준, 약 70배 야생형 hGALNS 활성 수준, 약 75배 야생형 hGALNS 활성 수준, 약 80배 야생형 hGALNS 활성 수준, 약 85배 야생형 hGALNS 활성 수준, 약 90배 야생형 hGALNS 활성 수준, 약 95배 야생형 hGALNS 활성 수준, 또는 약 100배 야생형 hGALNS 활성 수준으로 증가시키는 방법 및 유전자 요법 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 요법은 투여 전 수준 또는 미처리된 대상체의 평균 수준과 비교했을 때 상기 유전자 요법의 투여 2주 후 대상체에서 hGALNS 활성 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 유전자 요법은 이 유전자 요법의 투여 2주 후 대상체에서 hGALNS 활성 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 유전자 요법은 이 유전자 요법의 투여 2주 후 대상체의 간, 근육, 신장, 폐, 비장, 심장, 뼈, 또는 연골과 같은 조직 또는 혈액에서 hGALNS 활성 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 대상체에서 hGALNS 활성 수준의 증가는 상기 유전자 요법의 투여 10주 후에 측정된다.
본 발명은 또한 대상체에서 KS의 혈액(예컨대, 혈장 또는 혈청) 수준 또는 조직 수준을 미처리된 야생형 대상체에서의 KS 수준과 비교되는 수준으로 감소시키거나, 또는 KS 수준을, KS 검정, 예컨대 본원의 실시예 2, 3, 및 8에 기재된 것과 같은 검정 방식, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 측정했을 때, 약 1.1배 야생형 KS 수준, 약 1.2배 야생형 KS 수준, 약 1.3배 야생형 KS 수준, 약 1.4배 야생형 KS 수준, 약 1.5배 야생형 KS 수준, 약 1.6배 야생형 KS 수준, 약 1.7배 야생형 KS 수준, 약 1.8배 야생형 KS 수준, 약 1.9배 야생형 KS 수준, 약 2배 야생형 KS 수준, 약 2.5배 야생형 KS 수준, 약 3배 야생형 KS 수준, 약 3.5배 야생형 KS 수준, 또는 약 4배 야생형 KS 수준으로 감소시키는 방법 및 유전자 요법 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 유전자 요법은 이 유전자 요법의 투여 2주 후 대상체에서 KS 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 유전자 요법은 이 유전자 요법의 투여 2주 후 대상체에서 KS의 조직 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, KS 검정은 혈액 또는 조직에서 단일 황산화 KS의 측정을 포함하고, 유전자 요법은 이 유전자 요법의 투여 2주 후 대상체에서 단일 황산화 KS 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.
6.3 치료 방법
본원에는 MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
일 측면에서, 상기 방법은 본원에 기재된 rAAV 또는 본원에 기재된 약학적 조성물을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
다른 측면에서, 상기 방법은 본원에 제공된 rAAV를 인간 대상체에게 투여하여, 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 전이유전자와 같은 전이유전자의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달(예를 들어, 뼈 및/또는 연골로 전달)하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 hGALNS는 간 세포에서 생성되어 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된다.
다른 측면에서, 상기 방법은 본원에 제공된 rAAV를 인간 대상체에게 투여하여, 간 세포에서 생성되어 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 hGALNS의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달(예를 들어, 뼈 및/또는 연골로 전달)하는 것을 포함한다.
다른 측면에서, 상기 방법은 산성 올리고펩타이드(예컨대, D8과 같은, 섹션 6.1.2(b)에 기재된 산성 올리고펩타이드)에 융합된 hGALNS인 융합 단백질이되, rAAV 게놈으로부터 생성된 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 성장판, 반월판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달(예를 들어, 뼈 및/또는 연골로 전달)하는 것을 포함한다. rAAV 게놈은 섹션 6.1.2에 설명된 바와 같이 hGALNS 발현 카세트를 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 상기 방법은 산성 올리고펩타이드(예컨대, D8과 같은, 섹션 6.1.2(b)에 기재된 산성 올리고펩타이드)에 융합된 hGALNS인 융합 단백질이되, rAAV 게놈으로부터 생성되고 간 세포에서 생성되어 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 성장판, 반월판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달(예를 들어, 뼈 및/또는 연골로 전달)하는 것을 포함한다. 상기 rAAV 게놈은 섹션 6.1.2에 설명된 바와 같은 hGALNS 발현 카세트를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 rAAV 게놈은 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 TBG 프로모터이다. 특정 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 서열번호 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 간 특이적 프로모터는 서열번호 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 간 특이적 프로모터는 서열번호 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 간 특이적 프로모터는 서열번호 13이다. 특정 구현예에서, 간 특이적 프로모터는 서열번호 14이다. 특정 구현예에서, 간 특이적 프로모터는 서열번호 15이다.
다른 측면에서, 상기 방법은 산성 올리고펩타이드(예컨대, D8과 같은 섹션 6.1.2(b)에 기재된 산성 올리고펩타이드)에 융합된 hGALNS인 융합 단백질로서, rAAV 게놈으로부터 생성되고 간 세포에서 생성되어 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 성장판, 반월판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달(예를 들어, 뼈 및/또는 연골로 전달)하는 것을 포함한다. rAAV 게놈은 섹션 6.1.2에 설명된 바와 같은 hGALNS 발현 카세트를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, rAAV 게놈은 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 간 및 근육 프로모터는 서열번호 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 16이다.
다른 측면에서, 상기 방법은 산성 올리고펩타이드(예컨대, D8과 같은, 섹션 6.1.2(b)에 기재된 산성 올리고펩타이드)에 융합된 hGALNS인 융합 단백질로서, rAAV 게놈으로부터 생성되고 간 세포에서 생성되어 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 성장판, 반월판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달(예를 들어, 뼈 및/또는 연골로 전달)하는 것을 포함한다. rAAV 게놈은 섹션 6.1.2에 설명된 바와 같은 hGALNS 발현 카세트를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, rAAV 게놈은 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터이다.
다른 측면에서, 상기 방법은 rAAV 게놈으로부터 생성되고 간 세포에서 생성되어 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 hGALNS의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 성장판, 반월판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달(예를 들어, 뼈 및/또는 연골로 전달)하는 것을 포함한다. rAAV 게놈은 섹션 6.1.2에 설명된 바와 같은 hGALNS 발현 카세트를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, rAAV 게놈은 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 간 특이적 프로모터는 TBG 프로모터이다.
다른 측면에서, 상기 방법은 rAAV 게놈으로부터 생성되고 간 세포에서 생성되어 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 hGALNS의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 성장판, 반월판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달(예를 들어, 뼈 및/또는 연골로 전달)하는 것을 포함한다. rAAV 게놈은 섹션 6.1.2에 설명된 바와 같은 hGALNS 발현 카세트를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, rAAV 게놈은 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 13이다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 14이다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 15이다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 서열번호 16이다.
본원에 기재된 치료 방법의 다양한 구현예에서, rAAV 또는 rAAV 게놈은 AAV의 하나 이상의 혈청형으로부터 유래된 하나 이상의 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, rAAV 또는 rAAV 게놈은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, 또는 AAV11 중 하나 이상으로부터 유래된 하나 이상의 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, rAAV 또는 rAAV 게놈은 AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 혈청형 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 성분을 포함한다. 바람직한 구현예에서, rAAV 또는 rAAV 게놈은 AAV8 혈청형으로부터의 하나 이상의 성분을 포함한다. AAV 성분의 핵산 서열 및 재조합 AAV 및 AAV 캡시드를 제조하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,282,199 B2, 미국 특허 번호 7,790,449 B2, 미국 특허 번호 8,318,480 B2, 미국 특허 번호 8,962,332 B2 및 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2014/076466에 설명되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 치료 방법의 다양한 구현예에서, 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계는 (a) 뼈 및/또는 연골, 및 (b) 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계이다.
6.3.1 표적 환자 집단
본 발명에 따르면, 인간 대상체 또는 환자는 MPS IVA(모르키오 A 증후군)로 진단된 개체이다. 특정 구현예에서, 환자는 MPS IVA의 다음 증상 중 하나 이상을 갖는다: 비정상적인 심장 판막 형태, 우식 치아, 경부 골수증, 경부 부분탈구, 소변에 콘드로이틴 설페이트 배출, 거친 얼굴 특징, 수축된 장골 날개, 외반고(coxa valga), 불균형적인 짧은 몸통, 단신, 관상 뼈의 뼈끝 기형, 흉곽의 벌어짐, 외반슬, 칙칙한 법랑질, 청각 장애, 간비대, 과전만증, 치아돌기의 형성부전, 서혜부 탈장, 관절 이완, 청소년 발병, 소변 중 케라틴 설페이트 배출, 후만증, 큰 팔꿈치, 하악 전돌증, 골간단 확장, 각막 기질의 혼탁, 골다공증, 난형 척추체, 편평척축, 뾰족한 근위 제2 내지 제5 중수골, 돌출 흉골, 재발성 상기도염, 제한적 환기 결함, 척추측만증, 손목의 척골 편위, 넓은 입, 넓은 간격의 치아.
특정 구현예에서, 환자는 hGALNS에 의한 치료에 반응적인 것으로 식별되었다.
특정 구현예에서, 환자는 심각하고 급속 진행성 조기 발병 형태의 MPS IVA를 갖는다. 다른 특정 구현예에서, 환자는 서서히 진행하는 후기 발병 형태의 MPS IVA를 갖는다.
특정 구현예에서, 환자는 성인(적어도 16세)이다. 다른 특정 구현예에서, 환자는 청소년이다(12-15세). 다른 특정 구현예에서, 환자는 아동(12세 미만)이다.
특정 구현예에서, 환자는 6세 미만이다.
6.3.2 투여 및 투여량
본원에 기재된 rAAV의 투여 경로 및 인간 환자에게 투여되는 rAAV의 양은 질병의 중증도, 인간 환자의 상태 및 치료 의사의 지식에 기초하여 결정될 수 있다.
(a) 치료 투여량
바람직한 구현예에서, 인간 대상체에게 투여되는 rAAV의 양은 치료적 유효량의 hGALNS를 환부 조직(뼈, 연골, 인대, 반월판 및/또는 심장 판막)으로 공급하기에 충분하다.
특정 구현예에서, 투여량은 본원에 제공된 rAAV를 통해 인간 대상체에게 투여되는 게놈 카피의 수에 의해 측정된다. 특정 구현예에서, 1 x 1010 내지 1 x 1016 게놈 카피가 투여된다. 다른 특정 구현예에서, 1 x 1010 내지 1 x 1011 게놈 카피가 투여된다. 다른 특정 구현예에서, 1 x 1011 내지 1 x 1012 게놈 카피가 투여된다. 다른 특정 구현예에서, 1 x 1012 내지 1 x 1013 게놈 카피가 투여된다. 다른 특정 구현예에서, 1 x 1013 내지 1 x 1014 게놈 카피가 투여된다. 다른 특정 구현예에서, 1 x 1014 내지 1 x 1015 게놈 카피가 투여된다. 다른 특정 구현예에서, 1 x 1015 내지 1 x 1016 게놈 카피가 투여된다.
이론에 얽매임이 없이, 투여된 rAAV의 적어도 10%는 투여된 인간 대상체의 간을 감염시킨다. 특정 구현예에서, 투여된 rAAV의 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-35%, 30-40%, 35-45%, 40-50%, 45-55%, 50-60%, 55-65%, 60-70%, 65-75%, 70-80%, 75-85%, 80-90%, 85-95% 또는 90-100%는 인간 대상체의 간을 감염시킨다.
이론에 얽매임이 없이, rAAV 바이러스 게놈으로부터 발현된 hGALNS 효소의 적어도 10%는 간 세포에서 발현된다. 특정 구현예에서, rAAV 바이러스 게놈으로부터 발현된 hGALNS 효소의 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-35%, 30-40%, 35-45%, 40-50%, 45-55%, 50-60%, 55-65%, 60-70%, 65-75%, 70-80%, 75-85%, 80-90%, 85-95% 또는 90-100%는 간 세포에서 발현된다.
이론에 얽매임이 없이, rAAV 바이러스 게놈으로부터 발현된 hGALNS 효소의 적어도 10%는 인간 대상체의 환부 조직(예를 들어, 뼈)에 도달한다. 특정 구현예에서, rAAV 바이러스 게놈으로부터 발현된 hGALNS 효소의 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-35%, 30-40%, 35-45%, 40-50%, 45-55%, 50-60%, 55-65%, 60-70%, 65-75%, 70-80%, 75-85%, 80-90%, 85-95% 또는 90-100%는 인간 대상체의 환부 조직(예를 들어, 뼈)에 도달한다.
이론에 얽매임이 없이, rAAV 바이러스 게놈으로부터 발현된 hGALNS 효소의 적어도 10%는 간 세포에서 발현되고 그로부터 분비됨으로써 글리코실화된다. 특정 구현예에서, rAAV 바이러스 게놈으로부터 발현된 hGALNS 효소의 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-35%, 30-40%, 35-45%, 40-50%, 45-55%, 50-60%, 55-65%, 60-70%, 65-75%, 70-80%, 75-85%, 80-90%, 85-95% 또는 90-100%는 간세포에서 발현되고 그로부터 분비됨으로써 글리코실화된다.
이론에 얽매임이 없이, 간 세포 글리코실화된 hGALNS 효소의 적어도 10%는 인간 대상체의 환부 조직(예를 들어, 뼈)에 도달할 수 있다. 특정 구현예에서, 간 세포 글리코실화된 hGALNS 효소의 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-35%, 30-40%, 35-45%, 40-50%, 45-55%, 50-60%, 55-65%, 60-70%, 65-75%, 70-80%, 75-85%, 80-90%, 85-95% 또는 90-100%는 인간 대상체의 환부 조직(예를 들어, 뼈)에 도달할 수 있다.
(b) 투여 경로
특정 구현예에서, rAAV는 인간 대상체에게 투여되기 위해 약학적 조성물에 존재할 수 있다(섹션 6.1.3 참조).
rAAV는, 예를 들어, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 비강내, 척수강내 또는 경피 투여에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, rAAV는 정맥내 투여에 의해 투여된다.
6.4 조합 요법
6.4.1 면역 억제와 함께 공동요법
rAAV의 전달은 면역 반응을 최소화해야 하지만, 유전자 요법과 관련된 독성의 가장 분명한 잠재적 근원은 hGALNS가 유전적으로 결핍되어 상기 효소 또는 rAAV에 잠재적으로 내성이 없는 인간 대상체에서 상기 발현된 hGALNS 단백질에 대한 면역성을 생성하는 것이다. 따라서, 특정 구현예에서는 면역 억제 요법과 함께 환자를 공동치료하는 것이 권장되고, --특히 hGALNS 수준이 0에 가까운 중증 질환 환자를 치료하는 경우에 권장된다. 마이코페놀산과 조합으로 타크로리무스 또는 라파마이신(시롤리무스) 요법을 수반하는 면역 억제 요법, 또는 조직 이식 절차에 사용되는 기타 면역 억제 요법이 사용될 수 있다. 이러한 면역 억제 치료는 유전자 요법의 과정 동안 투여될 수 있으며, 특정 구현예에서 면역 억제 요법에 의한 사전치료가 바람직할 수 있다. 면역 억제 요법은 치료 의사의 판단에 따라 유전자 요법 치료 후에 계속될 수 있으며, 이후 면역 내성이 유도되면, 예컨대 180일 후에 중단할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 치료 방법은 프레드니솔론, 마이코페놀산 및 타크로리무스를 포함하는 면역 억제 요법을 인간 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 치료 방법은 프레드니솔론, 마이코페놀산 및 라파마이신(시롤리무스)을 포함하는 면역 억제 요법을 인간 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 치료 방법은 타크로리무스를 포함하지 않는 면역 억제 요법을 인간 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 치료 방법은 메틸프레드니솔론 및/또는 프레드니솔론과 같은 하나 이상의 코르티코스테로이드, 뿐만 아니라 타크로리무스 및/또는 시롤리무스를 포함하는 면역 억제 요법을 인간 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 억제 요법은 (a) 타크로리무스 및 마이코페놀산, 또는 (b) 라파마이신 및 마이코페놀산의 조합을 상기 대상체에게 hGALNS 치료 전 또는 동시에 및 그 후에 계속 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 억제 요법은 180일 후에 중단된다. 특정 구현예에서, 면역 억제 요법은 30, 60, 90, 120, 150 또는 180일 후에 중단된다.
6.4.2 다른 치료와의 공동요법
다른 이용가능한 치료의 투여와 동반하여 본원에 기재된 바와 같은 rAAV를 인간 대상체에게 투여하는 것을 수반하는 조합 요법은 방법의 기재된 구현예에 의해 포괄된다. 추가 치료는 유전자 요법 치료 전, 동시에 또는 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 유전자 요법과 조합될 수 있는 MPS IVA에 이용가능한 치료는 효소 대체 요법(ERT) 및/또는 HSCT 요법을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, ERT는 재조합 DNA 기술에 의해 인간 세포주에서 생성된 D8-hGALNS 효소를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 효소 생산에 사용될 수 있는 인간 세포주는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, ReNcell VM, 인간 배아 신장 293 세포(HEK293), HEK293-T, 섬유육종 HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7 및 망막 세포주, PER.C6 또는 RPE를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다(예를 들어, 전체 내용이 참조로 포함되는 Dumont 등, 2016, Critical Rev in Biotech 36(6): 1110-1122 "Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives" 참조).
6.5 질병 마커 및 치료 평가
특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법의 효능은 질병의 바이오마커(예컨대, GAG, KS 및 C6S 저장)의 감소 및/또는 뼈, 연골, 인대, 반월판, 심장 판막, 소변 및/또는 혈청에서 hGALNS 효소 활성의 증가를 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 염증 징후 및 기타 안전성 사건도 모니터링될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법의 효능은 환자에서 질병 바이오마커의 수준을 측정함으로써 모니터링된다. 특정 구현예에서, 질병 바이오마커의 수준은 환자의 혈청에서 측정된다. 특정 구현예에서, 질병 바이오마커의 수준은 환자의 소변에서 측정된다. 특정 구현예에서, 질병 바이오마커는 GAG이다. 특정 구현예에서, 질병 바이오마커는 KS이다. 특정 구현예에서, 질병 바이오마커는 C6S이다. 특정 구현예에서, 질병 바이오마커는 hGALNS 효소 활성이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 치료 방법의 효능은 환자의 라이소좀 저장 결핍과 관련된 신체적 특성을 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 저장 병변일 수 있다. 특정 구현예에서, 신체적 특징은 짧은 목과 몸통일 수 있다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 돌출흉일 수 있다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 관절의 이완일 수 있다. 특정 구현예에서, 신체적 특징은 척추 측만증일 수 있다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 기관 폐쇄일 수 있다. 특정 구현예에서, 신체적 특징은 척수 압박일 수 있다. 특정 구현예에서, 신체적 특징은 청각 장애일 수 있다. 특정 구현예에서, 신체적 특징은 각막 혼탁일 수 있다. 특정 구현예에서, 신체적 특징은 뼈 및 관절 기형일 수 있다. 특정 구현예에서, 신체적 특징은 심장 판막 질환일 수 있다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 제한적/폐색 성 기도일 수 있다. 이러한 신체적 특성은 본 기술분야의 기술자에게 알려진 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.
7. 실시예
본원에 제공된 특정 구현예는 다음의 비제한적 실시예에 의해 예시된다.
7.1 실시예 1. rAAV 게놈을 암호화하는 플라스미드 디자인 및 시험관내 형질감염 검정
AAV8 캡시드에 패키징되어야 하는 hGALNS 발현 카세트를 함유하는 재조합 AAV 게놈을 생성하기 위해, 재조합 AAV 게놈을 암호화하는 플라스미드를 디자인하였다. 4개의 플라스미드를 디자인하고 생성하였다: TBG-hGALNS (이 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 TBG 프로모터의 조절 하에 발현되는, hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유함), TBG-hGALNS CoOpt (이 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 TBG 프로모터의 조절 하에 발현되는, hGALNS를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 함유함), TBG-D8-hGALNS (이 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 TBG 프로모터의 조절 하에 조절되는, D8에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유함), 또는 TBG-D8-hGALNS CoOpt (이 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 TBG 프로모터의 조절 하에 조절되는, D8에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 함유함). 수득되는 rAAV는 2가지 범주에 속한다: (a) AAV-역위 말단 반복체(ITR)가 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 함유하되, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 TBG 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 hGALNS cDNA 서열 및 폴리 A 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 AAV 게놈을 포함하는 rAAV; 및 (b) AAV 역위 말단 반복체(ITR)가 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 함유하되, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 TBG 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 D8-hGALNS cDNA 서열 및 폴리 A 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 AAV 게놈을 포함하는 rAAV(도 1). D8은 뼈를 표적으로 하는 아스파르트산 옥타펩타이드이다.
다음으로, 인간 간세포 암종(HuH7) 세포를 Lipofectamine-3000 프로토콜을 사용하여 4개의 플라스미드 중 하나로 형질감염시켜 시험관내에서 hGALNS의 발현을 시험하였다. 48시간 항온배양 후, 형질감염된 HuH7 세포 및 상청액을 수집하고 세포 펠릿 및 배지에서 GALNS 효소 활성에 대해 분석하였다. GFP 플라스미드로 형질감염된 Huh7 세포는 대조군으로 사용하였다. 세포내 hGALNS 효소 활성은 TBG-hGALNS 또는 TBG-hGALNS CoOpt 플라스미드를 이용한 형질감염에 의해 동일하게 증가되었다(도 2a 및 2b). 세포내 효소 활성은 TBG-D8-hGALNS 또는 TBG-D8-hGALNS CoOpt 플라스미드를 이용한 형질감염 후에도 증가하였지만, 그 정도는 TBG-hGALNS 또는 TBG-hGALNS CoOpt 플라스미드를 사용한 형질감염보다 적었다(도 2a 및 2b). 세포 배지에서 검출된 효소 활성은 모든 플라스미드의 형질감염에 의해 증가되었다(도 2c 및 2d).
이와 유사하게, 인간 간 암종 세포(HepG2)를 Lipofectamine-3000 프로토콜을 사용하여 4개의 플라스미드 중 하나로 형질감염시켜 hGALNS의 발현을 시험관내에서 시험하였다(도 3). 72시간 항온배양 후, 형질감염된 HepG2 세포를 수집하고 세포 펠릿에서 hGALNS 효소 활성에 대해 분석하였다. 세포내 hGALNS 효소 활성은 대조군 플라스미드를 사용한 형질감염에 비해 TBG-hGALNS 또는 TBG-hGALNS CoOpt 플라스미드를 사용한 형질감염에 의해 증가되었다. TBG-D8-hGALNS 또는 TBG-D8-hGALNS CoOpt 플라스미드를 사용한 형질감염은 대조군 플라스미드에 비해 hGALNS 활성을 증가시키지 않았다.
7.2 실시예 2. MPS IVA 녹아웃(galns -/-) 마우스에 대한 rAAV의 생체내 투여
간 특이적 프로모터 TBG 하에 천연 인간 GALNS(hGALNS)를 발현할 수 있는 바이러스 게놈(AAV8-TBG-hGALNS, 일부 도면에서는 AAV8-hGALNS로도 표지됨), 또는 간 특이적 프로모터 하에 아스파르트산 옥타펩타이드(D8)와 함께 hGALNS를 발현할 수 있는 바이러스 게놈(AAV8-TBG-D8-hGALNS, 일부 도면에서는 AAV8-D8-hGALNS로도 표지됨)을 포함하는 rAAV8을 생성하였다. TBG-hGALNS CoOpt 및 TBG-D8-hGALNS CoOpt 플라스미드를 사용하여 각각 바이러스 게놈을 생성하였다. 두 유형의 바이러스를 각각 4주령 MPS IVA 녹아웃(KO) 마우스 및 Mtol 면역내성 마우스에게 5x1013 GC/kg체중의 용량으로 정맥내 투여하였다. KO 마우스는 mGALNS의 엑손 2가 표적 파괴되어, 검출가능한 GALNS 효소 활성을 갖지 않는다. Mtol 마우스는 인간 GALNS 단백질에 내성이 있다. 미처리된 KO 마우스 및 야생형(WT) 마우스는 대조군으로 제공하였다. 이들 마우스를 주사 후 14주 동안 모니터링하였다. 혈액을 격주로 수집하고 hGALNS 활성 및 케라탄 설페이트(KS)에 대해 검정하였다. rAAV 투여, 혈액 수집, GALNS 효소 검정 및 KS 검정의 일정은 도 4에 도시된다. 부검 시, 조직병리학적 분석으로 뼈 병리를 평가하였다.
도 5a에 도시된 바와 같이, hGALNS 효소 활성은 rAAV 처리된 마우스의 백혈구(WBC)에서 증가하였고, 치료 10주 후 WT 마우스 수준에 가깝게 도달하였다. rAAV 투여 2주 후, 모든 rAAV 처리된 마우스의 혈장에서 hGALNS 효소 활성은 WT 마우스의 수준에 비해 평균 20배 상승하였다(WT 마우스의 수준에 비해 5 내지 100배 범위)(도 5b). 이러한 증가는 14주의 모니터링 기간 동안 유지되었다(도 5b). 유사한 데이터가 도 22에 도시된다. AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스의 혈장 효소 활성 수준은 AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 마우스에서의 수준보다 유의적으로 높았지만(도 6), 두 처리군의 효소 활성 수준은 WT 수준 이상으로 상승하였다. 유사한 데이터가 도 23에 도시된다.
AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 KO(galns -/-) 마우스의 간에서 측정된 hGALNS 활성을 WT 마우스의 간 hGALNS 활성과 비교하였다(도 7a). AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 마우스는 WT 수준에 비해 간에서 hGALNS 활성 수준이 40배 더 높았고, 한편 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 마우스는 WT 수준보다 간 hGALNS 활성 수준이 8배 더 높았다. AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스의 간에서 hGALNS 활성은 미처리된 Mtol 마우스(PBS 처리) 이상으로 상승되었다(도 7b). AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 마우스는 미처리된 마우스에 비해 간에서 50배 더 높은 수준의 hGALNS 활성을 갖는 한편, AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 마우스는 미처리된 Mtol 마우스보다 8배 더 높은 간 hGALNS 활성을 가졌다. 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), 미처리된 Mtol 마우스 및 야생형 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 투여 후, MPS IVA KO 마우스(galns -/-) 및 Mtol 마우스의 간에서 각각 측정된 hGALNS 활성 수준에 관한 더 많은 데이터는 도 12a를 참조한다(n=3-8; 평균±SD).
hGALNS 활성은 또한 (a) WT 마우스, (b) 미처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, (c) AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, (d) AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, (e) 미처리된 Mtol 마우스, (f) AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스, 및 (g) AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스의 심장에서 측정하였다(도 7c). MPS IVA KO(galns -/-) 마우스 및 Mtol 마우스 둘 모두에서, AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 마우스 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 마우스는 둘 모두가 미처리된 마우스에 비해 심장에서 더 높은 수준의 hGALNS 활성을 가졌다. 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), 미처리된 Mtol 마우스 및 야생형 마우스에 비해, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 투여 후, MPS IVA KO 마우스(galns -/-) 및 Mtol 마우스의 심장에서 각각 측정된 hGALNS 활성 수준에 관한 더 많은 데이터는 도 13b를 참조한다(n=3-8; 평균±SD).
이와 유사하게, hGALNS 활성은 (a) WT 마우스, (b) 미처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, (c) AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, (d) AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, (e) 미처리된 Mtol 마우스, (f) AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스, 및 (g) AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 Mtol 마우스의 뼈에서 측정하였다(도 7d). MPS IVA KO(galns -/-) 마우스 및 Mtol 마우스 둘 모두에서, AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 마우스 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 마우스는 둘 모두가 미처리된 마우스에 비해 뼈에서 더 높은 수준의 hGALNS 활성을 가졌다. 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), 미처리된 Mtol 마우스 및 야생형 마우스에 비해, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 투여 후, MPS IVA KO 마우스(galns -/-) 및 Mtol 마우스의 뼈에서 각각 측정된 hGALNS 활성 수준에 관한 더 많은 데이터는 도 13a를 참조한다(n=3-8; 평균±SD).
MPS IVA KO(galns -/-) 마우스 및 Mtol 마우스 모두에서, 처리된 마우스의 간, 심장 및 뼈에서 hGALNS 활성 수준은 AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 벡터의 전달 후 상승하였다. 또한, 혈액 및 뼈에서 hGALNS 효소 활성 사이에 직접적인 상관성이 있었다.
hGALNS 효소 활성 수준은 또한 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), 미처리된 Mtol 마우스 및 야생형 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 투여 후, MPS IVA KO 마우스(galns -/-)의 비장 및 Mtol 마우스의 비장에서 각각 측정하였다(n=3-8; 평균±SD)(도 12b). MPS IVA KO(galns -/-) 마우스 및 Mtol 마우스 모두에서, AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 마우스 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 마우스가 모두 비장에서 미처리된 마우스에 비해 더 높은 수준의 hGALNS 활성을 가졌다.
또한, hGALNS 효소 활성 수준은 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), 미처리된 Mtol 마우스 및 야생형 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 투여 후, MPS IVA KO 마우스(galns -/-)의 폐 및 Mtol 마우스의 폐에서 각각 측정하였다(n=3-8; 평균±SD)(도 12c). MPS IVA KO(galns -/-) 마우스 및 Mtol 마우스 모두에서, AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 마우스 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 마우스가 모두 폐에서 미처리된 마우스에 비해 더 높은 수준의 hGALNS 활성을 가졌다.
혈중 케라탄 설페이트(KS) 수준을 측정하였다. KO(galns -/-) 마우스에서, 두 그룹에서의 rAAV 처리는 투여 2주 후 혈장 내 단일 황산화 케라탄 설페이트(KS) 수준을 WT 수준으로 감소시켰다(도 8 및 도 14). 두 rAAV 처리 그룹의 혈장에서 이러한 감소된 수준은 주사 후 12주째 부검할 때까지 유지되었다. 이와 대조적으로, 미처리된 KO 마우스의 혈장에서 KS 수준은 감소하지 않았고, 모니터링된 시간 기간 동안 상승된 채 유지되었다. Mtol 마우스에서 어느 한 rAAV의 투여는 처리 2주 후 WT 수준과 비교하여 혈장 내 단일 황산화 케라탄 설페이트(KS) 수준을 감소시켰고, 혈장 중 KS 수준은 미처리된 Mtol 마우스에 비해 유의적으로 감소되었다(도 9a-9b 및 도 15a-15b). 그러나, 혈액 diHS-0S 수준은 미처리군, AAV8-TBG-hGALNS-처리, AAV8-TBG-D8-hGALNS-처리 및 WT 마우스 그룹 사이에 차이가 없었다(도 10).
단일 황산화 KS 수준은 미처리된 MPS IVA KO 마우스 및 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된, MPS IVA KO 마우스의 간(galns -/-), Mtol 마우스의 간 및 MPS IVA KO 마우스(galns -/-)의 폐에서 각각 측정하였다(도 16a-16c). 어느 한 rAAV의 투여는 미처리된 마우스에 비해, 간에서 단일 황산화 KS의 유의적인 감소 및 폐에서 단일 황산화 KS의 유의적인 감소를 초래하였다. MPS IVA KO 마우스(galns -/-) 및 Mtol 마우스의 간 및 폐에서 KS 수준은 AAV 벡터 투여 후 거의 정상화되었다.
처리된 KO 마우스 유래의 간의 조직병리학적 평가는 동굴 내면 세포 및 쿠퍼 세포에서 GAG 저장의 완전한 제거를 보여주었다.
AAV8-TBG-hGALNS 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS의 투여는 모니터링 기간 동안 혈장 KO 및 Mtol 마우스 모델에서 높은 수준의 효소 활성을 유지시켰다. 이러한 순환 효소의 지속적인 존재는 혈장 내 KS를 WT 수준으로 감소시켰고, 이는 ERT에 의해 달성된 것보다 유의적인 개선이다(Tomatsu 등, Human Molecular Genetics, 2008, 17(6): 815-824). 혈장의 KS 수준은 두 마우스 모델 및 AAV8-TBG-hGALNS 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS 모두에서 rAAV 투여 2주 후에 정상화되었지만, KO 마우스를 ERT로 처리한 종래 연구에서 혈장 중의 KS 수준은 12주 동안 매주 주입한 후에도 정상화되지 않았다(Tomatsu 등, Human Molecular Genetics, 2008, 17(6): 815-824). 또한, 긴 순환 시간과 조합된 높은 효소 수준은 뼈 및 연골 요법으로의 침투를 증가시켜 상기 영역에서 저장을 개선한다.
rAAV 처리 12주 후에 마우스를 안락사시켰고 조직을 수집하고 글리코사미노글리칸(GAG)의 저장에 대해 평가하였다. 조직은 톨루이딘 블루로 염색하였다. 뼈 병리는 조직병리학적 분석에 의해 평가하였고 병리 점수는 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스에 대해 그래픽 묘사로 제시된다(도 11a). 도 11b는 무릎 관절(MPS IVA KO (galns -/-) 마우스)의 염색 이미지를 보여준다.
도 11c는 MPS IVA KO (galns-/-) 마우스에 대한 대퇴 관절 연골의 40배 확대된 염색 이미지를 보여준다. 미처리된 마우스(좌측 패널)에서 표면 세포는 붕괴되었고 연골 세포는 팽창하여 액포화되었다. 또한, 기둥 구조는 비틀리고 붕괴되었다. 이에 반해, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS에 의해 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스의 조직은 조직화된 표면 세포, 덜 액포화된 연골세포 및 기둥 구조의 유지(우측의 두 패널)를 보여주었다. 이러한 양상은 도 11d 내지 11f에서 더 자세하게 보여준다.
도 11g는 미처리된 또는 rAAV-처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스의 대퇴골 성장판의 40x 확대된 염색 이미지를 보여준다. 미처리된 마우스(좌측 패널)에서 연골세포는 액포화되었고 기둥 구조는 크게 붕괴되고 비틀어졌다. AAV8-TBG-hGALNS에 의해 처리된 마우스의 연골세포(중앙 패널) 역시 액포화되었으나, 기둥 구조는 중간 정도만 비틀어졌다. 이에 반해, AAV8-TBG-D8-hGALNS에 의해 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스(우측 패널)의 조직의 경우에는 연골세포가 중간 정도로 액포화되었고 기둥 구조는 더욱 조직화되었다. 이러한 양상은 도 11h 내지 11j에서 더 자세하게 보여준다. 도 17a-17e는 또한 (A) 야생형 마우스(모든 연골세포가 비-액포화되었고 기둥 구조가 잘 조직화됨), (B) 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-)(모든 연골세포가 액포화되었고 기둥 구조가 크게 붕괴되고 비틀어짐), (C) 미처리된 Mtol 마우스(모든 연골세포가 액포화되었고 기둥 구조가 크게 붕괴되고 비틀어짐), (D) AAV8-TBG-hGALNS 처리된 Mtol 마우스(연골세포가 중간 정도 액포화되었지만, 기둥 구조는 양호함), 및 (E) AAV-TBG-D8-hGALNS 처리된 Mtol 마우스(연골세포는 적당히 액포화되었지만, 기둥 구조는 부분적으로 회복됨)에서의 대퇴골 성장판의 40x 확대된 염색 이미지를 보여준다.
도 18a는 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), AAV8-TBG-hGALNS 처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-)의 대퇴골 및 경골 성장판에서 측정된 연골세포의 세포 크기를 보여준다. 도 18b는 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 Mtol 마우스, AAV8-TBG-hGALNS 처리된 Mtol 마우스, 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 처리된 Mtol 마우스의 대퇴골 성장판에서 측정된 연골세포의 세포 크기를 보여준다. 도 18c는 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), AAV8-TBG-hGALNS 처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-), 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 처리된 MPS IVA KO 마우스(galns -/-)의 경골 성장판에서 측정된 연골세포의 세포 크기를 보여준다. 도 18d는 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 Mtol 마우스, AAV8-TBG-hGALNS 처리된 Mtol 마우스, 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 처리된 Mtol 마우스의 경골 성장판에서 측정된 연골세포의 세포 크기를 보여준다.
MPS IVA KO 마우스 및 Mtol 마우스의 성장판에서 연골세포 크기 및 기둥 구조는 둘 모두 AAV 유전자 전이 후 실질적으로 개선되었다.
도 11k는 미처리된 또는 rAAV-처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스의 반월판의 40x 확대된 염색 이미지를 보여준다. 미처리된 마우스(좌측 패널)에서는 대부분의 세포가 팽창 및 액포화되었다. AAV8-TBG-hGALNS에 의해 처리된 마우스(중앙 패널)의 반월판에서는 일부 세포가 액포화되었다. AAV8-TBG-D8-hGALNS에 의해 처리된 마우스(우측 패널)의 조직에서는 대부분의 세포가 액포화되지 않았다.
도 11l은 미처리된 또는 rAAV-처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스의 경골 측에 있는 인대의 40x 확대된 염색 이미지를 보여준다. 미처리된 마우스(좌측 패널)에서는 대부분의 세포가 액포화되었다. AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS에 의해 처리된 마우스(우측 두 패널)의 인대 중 일부 세포는 액포화된 채 남아있었다.
도 11m은 미처리된 또는 rAAV-처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스의 심장 판막 기저부의 40x 확대된 염색 이미지를 보여준다. 미처리된 마우스(좌측 패널)의 승모판 기저부에 있는 많은 세포는 액포화되었고, 반면 AAV8-TBG-hGALNS(중앙 패널) 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS(우측 패널)에 의해 처리된 마우스의 승모판 조직의 기저부에서는 액포화된 세포가 관찰되지 않았다. 미처리된 마우스 조직의 이러한 양상은 도 11n에서 더 자세하게 보여준다. 유사한 결과가 심장 판막의 조직에서 관찰되었다(도 11o). Mtol 마우스에 대한 유사한 결과는 도 19(하부 패널)에서 도시된다. 미처리된 마우스(좌측 패널) 중의 많은 심장 판막 세포는 액포화된 반면, AAV8-TBG-hGALNS(중앙 패널) 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS(우측 패널)에 의해 처리된 마우스의 심장 판막 조직에서는 액포화된 세포가 전혀 관찰되지 않았다. 미처리된 마우스 조직의 이러한 양상은 도 11p에서 더 자세하게 보여준다.
도 20은 미처리된 Mtol 마우스와 비교한 것으로서, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS에 의해 처리된 Mtol 마우스의 심근(40x 확대)의 조직병리를 보여준다.
심장 판막 및 심근은 AAV 유전자 전이 후 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스 및 Mtol 마우스 모두에서 분명하게 액포화된 세포를 갖지 않았다.
도 21a는 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, AAV8-TBG-hGALNS에 의해 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS에 의해 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스의 심장 판막 조직의 병리 점수를 보여준다. 도 21b는 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 Mtol 마우스, AAV8-TBG-hGALNS에 의해 처리된 Mtol 마우스, 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS에 의해 처리된 Mtol 마우스의 심장 판막 조직의 병리 점수를 보여준다. 도 21c는 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, AAV8-TBG-hGALNS에 의해 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스, 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS에 의해 처리된 MPS IVA KO(galns -/-) 마우스의 심근 조직의 병리 점수를 보여준다. 도 21d는 미처리된 야생형 마우스, 미처리된 Mtol 마우스, AAV8-TBG-hGALNS에 의해 처리된 Mtol 마우스, 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS에 의해 처리된 Mtol 마우스의 심근 조직의 병리 점수를 보여준다.
뼈 병리는 또한 Mtol 마우스의 조직병리학적 분석에 의해 평가하였다. 독립표본 t-검정을 사용하여 미처리군과 각 처리군 사이의 병리 점수의 차이를 조사하였다(점수: 0(정상) - 3(심각)). 표 1 참조.
표 1. Mtol 마우스의 뼈 중의 병리 점수 (n=2-5, 평균 ±SD)
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두 바이러스 모두 관절 연골, 인대, 및 상기 관절 연골을 둘러싸고 있는 반월판 및 경골과 대퇴골의 성장판 영역에서 GAG 저장을 감소시켰다. 뼈와 연골에서 관찰된 GAG 저장 감소는 AAV-TBG-D8-hGALNS 처리된 마우스에서 비교적 더 컸다.
뼈, 성장판, 관절 연골, 반월판, 인대 및 심장 조직은 rAAV 처리된 마우스에서 실질적으로 개선되었다. 또한, 처리된 마우스는 심장 판막 및 심장 판막 기저부의 결함에 대해 거의 완전한 완화를 나타냈고, 심장 판막 기저부 및 심장 판막 둘 모두에서 분명히 액포화된 세포는 전혀 관찰되지 않았다. 이 결과는 ERT-처리된 마우스가 성장판의 액포화된 세포의 비-제거, 성장판에서 기둥 구조의 붕괴, 및 심장 판막에서 실질적으로 액포화된 세포를 갖고 있었으므로, ERT보다 유의적인 개선임을 보여준다(Tomatsu 등, Human Molecular Genetics, 2008, 17(6): 815-824).
치료 효과가 간(hGALNS 및 D8-hGALNS 단백질이 생산된 곳) 이외의 조직에서 관찰되었다는 사실은 만노스-6-포스페이트 수용체 매개의 교차 교정이 있었음을 암시한다.
7.3 실시예 3. 간 표적화된 AAV8 유전자 요법은 점액다당류증 IVA 뮤린 모델에서 골격 및 심혈관 병리를 개선한다
본 실시예는 실시예 1-2를 포함하여 본 명세서에 기재된 다른 실시예에서 기술되고 수행된 실험에 관한 것이며 실시예 1-2로부터의 추가 데이터를 제시한다. 본 실시예에서, 간 특이적 티록신 결합 글로불린(TBG) 프로모터의 제어 하에, 뼈 표적화 신호가 있거나 없이 hGALNS를 발현하는 AAV8 벡터가 평가되었고, MPS IVA 질병의 두 마우스 모델의 뼈 및 심장 병변에서 상기 재조합 AAV8 벡터의 치료 효능이 연구된다. 뼈 및 심장 둘 모두 이 장애에서 영향받는 주요 기관이다.
7.3.1. 결과
(a) 혈액 및 조직에서의 GALNS 효소 활성: AAV-hGALNS 전달은 MPS IVA 마우스 모델의 혈장 및 다양한 조직에서 GALNS 활성의 현저한 증가를 초래한다.
MPS IVA를 갖는 두 마우스 모델(MPS IVA KO 및 MTOL)은 hGALNS 활성의 결핍, 혈액 및 조직에서 KS의 증가된 수준, 및 연골세포, 반월판, 인대, 심근 및 판막을 비롯한 다양한 조직의 저장 물질(액포)의 측면에서 인간 질병을 요약한다. 이러한 바이오마커는 상기 마우스 모델에서 표현형의 강도 및 여러 접근법의 치료 효능을 평가하는데 널리 사용되었다(Tomatsu, S., 등, Hum. Mol. Genet., 2008, 17, 815-824; Tomatsu, S., 등, Hum. Mol. Genet., 2003, 12, 3349-3358; Tomatsu, S., 등, Hum. Mol. Genet., 2005, 14, 3321-3335; Tomatsu, S. 등, Mol. Ther., 2010, 18, 1094-1102). 이 연구를 위해, 본 발명자들은 4주령의 MPS IVA KO 및 MTOL 마우스에게 AAV8-TBG-hGALNSco 및 AAV8-TBG-D8-hGALNSco(도 24a)를 5x1013 GC/kg 체중의 균일한 용량으로 정맥내로 전달하였다. 주사 후 12주 동안 마우스를 모니터링하였고 효소 활성 및 KS 수준을 분석하기 위해 격주로 혈액 샘플을 수집하였다. 또한, 부검 시에, 조직병리학 분석을 위해 무릎 관절 및 심장 판막 뿐만 아니라 효소 활성 및 KS 수준을 위해 여러 기관에서 조직 샘플을 채취하였다.
MPS IVA KO 및 MTOL 마우스에서의 혈장 효소 활성은 도 24b-24c에 제시된다. 미처리된 MPS IVA 마우스에서는 혈장 hGALNS 활성이 검출되지 않았다. 주사 2주 후, AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 MPS IVA KO 마우스에서의 혈장 hGALNS 활성은 야생형 마우스에 비해 유의적으로 증가하였다. AAV8-TBG-D8-hGALNS로부터의 효소 활성은 주사 2주 후 AAV8-TBG-hGALNS로부터의 효소 활성보다 높았다; 하지만, 혈장 hGALNS 활성은 주사 12주 후에는 상기 두 AAV 벡터 사이에 차이가 없었다. 두 AAV 벡터로 처리된 MTOL 마우스에서, 혈장 hGALNS 활성은 주사 2주 후에 야생형 마우스에 비해 유의적으로 증가하였다. AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 마우스로부터의 효소 활성 수준은 전체 연구 기간 동안 AAV8-TBG-hGALNS로 처리된 마우스로부터의 효소 활성 수준보다 높았으며, 이는 뼈 표적화 신호가 있는 hGALNS가, 조직 내로의 흡수 감소 때문일 수 있는 천연 hGALNS에 비해 장기적인 혈액 순환을 나타냈음을 암시한다. 이러한 결과는 두 MPS IVA 마우스 모델에서 AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS의 단독 주사 후, 순환성 hGALNS 활성의 초생리학적 수준이 달성되었으며, 본 연구 동안 높은 수준의 효소 활성이 유지되었음을 입증하였다.
AAV 벡터의 IV 전달 12주 후, 간에서 hGALNS 활성 수준은 도 24j 및 도 24k에 제시된다. 모든 처리된 MPS IVA 마우스에서 hGALNS 활성 수준은 미처리된 MPS IVA 마우스에서보다 유의적으로 높았다. AAV8-TBG-hGALNS 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS에 의해 처리된 MPS IVA KO 마우스에서의 평균 효소 활성 수준은 야생형 마우스에서 관찰된 수준보다 각각 49배 및 9배 더 높았다. AAV8-TBG-hGALNS 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS에 의해 처리된 MTOL 마우스에서 hGALNS 활성은 야생형 마우스에서 발견된 수준보다 60배 및 9배 더 높았다. AAV8-TBG-D8-hGALNS에 의해 처리된 KO 및 MTOL 마우스의 간에서의 GALNS 활성은 AAV8-TBG-hGALNS에 의해 처리된 마우스에서보다 유의적으로 낮았다.
MPS IVA 마우스의 조직에서 조직 hGALNS 활성의 수준을 조사하여 hGALNS 결핍의 잠재적인 교차 교정을 평가하였다. hGALNS 활성은 AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 치료 후 두 KO 및 MTOL 마우스 모두에서 비장, 폐, 신장, 뼈(다리) 및 심장을 포함한 조사된 모든 조직에서 관찰되었다(도 24j-24k). 이 효소 활성은 비장과 심장에서는 야생형 수준과 비슷하거나 더 높았고, 폐와 신장에서는 약간 낮은 수준의 활성이 관찰되었다. 특히, AAV8-TBG-hGALNS 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 KO 마우스의 뼈에서는 각각 야생형 효소 활성의 37% 및 20%가 관찰되었다. 또한, 상기 두 AAV 벡터에 의해 처리된 MTOL 마우스에서도 야생형 효소 활성의 57% 및 43%가 관찰되었다. 이러한 결과는 안정한 초생리학적 수준의 hGALNS 효소가 AAV 유전자 전이 후 MPS IVA 마우스의 뼈를 포함한 다양한 조직으로 효소의 침투에 기여하였다는 것을 암시한다. 뼈에서 hGALNS 활성 수준은 AAV8-TBG-hGALNS와 AAV8-TBG-D8-hGALNS 사이에 통계적으로 차이가 없었다.
(b) 혈액 및 조직에서 단일 황산화 KS의 수준은 AAV-GALNS 전달의 결과로서 감소하였다
본 발명자들은 MPS IVA 마우스의 혈장 및 조직에서 KS의 주성분인 단일 황산화 KS를 측정하였다. KO 및 MTOL 마우스에서 혈장의 단일 황산화 KS의 수준은 도 25a 및 25b에 제시된다. AAV 벡터를 투여하기 전에, 미처리된 KO 마우스의 혈장 KS 수준은 야생형 마우스보다 유의적으로 더 높았다(평균: 41.8 vs. 16.3 ng/ml). 주사 2주 후, 혈장 내 단일 황산화 KS 수준은 두 AAV 벡터 모두에서 완전히 정상화되었고, 이 수준은 적어도 10주(부검 시) 동안 유지되었다. 단일 황산화 KS 수준은 4 주된 야생형 마우스와 미처리된 MTOL 마우스에서는 유사하였다. 야생형 마우스에서 단일 황산화 KS 수준은 연구 내내 일정한 수준으로 유지되었다; 그러나, 미처리된 MTOL 마우스에서 단일 황산화 KS의 수준은 나이가 들면서 점차 증가하였다. AAV 벡터 중 어느 하나로 처리된 MTOL 마우스는 전체 연구 기간 동안 정상 수준을 유지하였다. 16주째에 AAV 벡터에 의해 처리된 MTOL 마우스의 단일 황산화 KS 수준은 미처리된 MTOL 마우스와 비교했을 때 유의적으로 감소하였다.
MPS IVA 마우스의 조직에서 단일-KS 수준을 측정하였다. 부검 시에, GAG의 과도한 저장이 KO 및 MTOL 마우스 모두의 조직에서 존재하였다. KO 및 MTOL 마우스의 간 및 폐에서 단일 황산화 KS의 양은 AAV 벡터의 주사 후 12주째에 유의적으로 감소하였다(도 25c-25d). hGALNS를 발현하는 상기 AAV 벡터가 다른 GAG 수준에 미치는 영향을 평가하기 위해 MPS IVS 마우스의 혈액 및 조직에서 헤파란 설페이트(HS) 수준을 분석하였다. KO와 MTOL은 둘 모두 혈장에서 diHS-0S의 정상 수준을 가졌고, 그 수준은 AAV 벡터 주사 후 영향을 받지 않았다(도 30). 간 및 폐에서 조직 diHS-0S 수준도 역시 AAV 벡터 주사 후 12주째 모든 그룹 사이에서 변화가 없었다(도 31).
(c) AAV GALNS 벡터의 전달은 MPS IVA 마우스에서 뼈 및 연골 병리를 개선시켰다.
AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS의 주사 12주 후 MPS IVA 마우스로부터 뼈(대퇴골 및 경골) 및 심장(근육 및 판막)을 포함하는 조직을 평가하였다.
16주령의 미처리된 MPS IVA KO 및 MTOL 마우스는 대퇴골 및 경골의 성장판 (유리질 연골)(도 27a), 관절 원반(도 27b), 무릎 관절을 둘러싼 인대(도 32a), 및 반월판(도 32b)에서 GAG 저장 액포를 나타내었다. 또한, 성장판은 팽창 및 액포화된 연골 세포와 함께 붕괴된 기둥 구조도 나타내었다(도 27a-27b). AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS에 의해 처리된 KO 마우스에서는 무릎 관절의 성장판, 관절 연골, 인대 및 반월판에 저장 물질의 일부 감소를 보였고 연골세포의 기둥 구조는 개선되었지만, 붕괴되고 비틀어진 채로 남아 있었다. 상기 AAV 벡터에 의해 처리된 MTOL 마우스에서는 무릎 관절 중의 성장판, 관절 연골, 인대 및 반월판에서 더 큰 관찰가능한 저장 감소가 나타났고, 성장판 및 관절 연골의 기둥 구조에서 미처리된 MTOL 마우스보다 더 큰 회복을 나타내었다.
성장판의 연골 세포에서 액포화의 개선을 객관적으로 평가하기 위해 KO 및 MTOL 마우스(4C)의 성장판 병변에서 연골세포의 세포 크기를 정량하였다. 본 발명자들은 상기 성장판 병변에서 연골세포 크기의 중간 정도의 감소를 관찰하였고, 이는 MTOL 마우스에서 통계적 유의성에 도달한 것이었다. 미처리된 MPS IVA 마우스는 심장 판막과 근육에서 GAG 저장 액포를 나타내었다. AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS는 처리된 KO 및 MTOL 마우스의 상기 심장 병변에서 거의 완전한 제거를 제공하였다(도 27a-27b).
(d) 항-hGALNS 항체의 순환
전반적으로, KO 마우스에서 뼈 병리의 개선은 AAV8 벡터의 주사 후 12주째의 MTOL 마우스에 비해, 덜 현저하였다. hGALNS에 대한 체액 반응의 가능성을 조사하기 위해, hGALNS에 대한 항체 역가를 효소 면역흡착 검정(ELISA)으로 측정하였다. 간접 ELISA 방법은 평판 상에 코팅된 전체 길이의 rhGALNS를 사용하여 혈장 중의 항-hGALNS 항체를 검출하였다. AAV 벡터에 의해 처리된 KO 마우스의 혈장은 다른 그룹에 비해 순환성 항-hGALNS 항체의 수준이 유의적으로 더 높았다(AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS로 처리된 KO의 경우 0.50±0.38 또는 0.62±0.43 광학 밀도(OD) 단위)(도 28). 순환성 항-hGALNS 항체는 야생형, 미처리된 KO 및 MTOL 마우스에서는 검출되지 않았다.
7.3.2 재료 및 방법
(a) AAV hGALNS 발현 카세트의 개발
hGALNS를 가진 AAV8 벡터를 개발하기 위해, 본 발명자들은 hGALNS의 최적화된 코돈 서열을 결정하였다. 간 특이적 TBG 프로모터의 제어하에 526개 아미노산으로 해독된 최적화된 1569 bp 서열을 AAV8 캡시드에 패키징하였다. 뼈 표적화 신호가있는 벡터 플라스미드에서 hGALNS의 N-말단 신호 펩타이드 뒤에 아스파르트산 옥타펩타이드(D8) 서열을 삽입하여 주요 뼈 기질인 하이드록시아파타이트에 대해 높은 친화성을 갖는 뼈 표적화 hGALNS를 생산하였다(도 24a). 이러한 AAV 벡터 플라스미드에 의한 GALNS의 생산은 Huh-7 세포를 이용하여 형질감염 실험을 수행한 후 확인하였다. 코돈 최적화된 오픈 리딩 프레임으로부터의 세포내 및 세포외 hGALNS 활성 수준은 천연 hGALNS 암호 서열에 의해 생산된 것과 유사하였다(도 29a-29b).
(b) 발현 카세트 디자인 및 AAV 벡터 생산
천연 및 D8 함유 GALNS 전이유전자를 운반하는 발현 카세트를 AAV8 벡터에 패키징하기 위해 디자인하였다(도 28). 뼈 표적화 신호인 아스파르트산 옥타펩타이드(D8) 서열을 hGALNS의 N-말단 신호 펩타이드 뒤에 삽입하였다. 이 디자인에는 토끼 베타글로불린 폴리아데닐화 꼬리(폴리A)와 함께 간 특이적 티록신 결합 글로불린(TBG) 프로모터를 포함시켰다. 본 발명자들은 마우스 연구를 위한 두 벡터 모두에 대해 코돈 최적화된 hGALNS 서열을 사용하였다. 본 발명자들은 Huh-7 세포를 사용한 형질감염 실험에서 상기 발현 카세트 플라스미드의 GALNS 효소 활성을 확인하였다. 본 발명자들은 형질감염 48시간 후에 세포 용해물 및 상청액 모두에서 활성 수준을 결정하였다(도 29a-29b). 코돈 최적화된 작제물로부터의 GALNS 활성 수준은 천연 hGALNS 암호 서열에 의해 생성된 것과 유사하였다.
AAV8-TBG-hGALNS 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS 벡터는 REGENXBIO(메릴랜드 주 록빌 소재)에서 독점 GMP 벡터 생산 프로토콜의 축소판에 따라 생성하였다. 간단히 설명하면, HEK293 세포(RGX293)를 헬퍼 플라스미드, AAV8 캡시드 플라스미드 및 hGALNS/D8-hGALNS 플라스미드를 함유하는 전이유전자 플라스미드로 삼중-형질감염시켰다. 패키징된 벡터는 세포 배양 상청액으로부터 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하고 Digital Droplet PCR(BioRad,) 방법을 사용하여 적정하였다.
(c) 뮤린 모델 및 생체내 연구 디자인
본 발명자들은 2가지 MPS IVA 뮤린 모델을 사용하여 AAV8-TBG-hGALNS 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS의 치료 잠재력을 시험하였다(Tomatsu 등, Hum Mol Genet 2003; 12(24):3349-3358; Tomatsu 등, Hum. Mol. Genet. 2005; 14, 3321-3335). 제1 유형은 유전자 파괴가 있는 Galns 녹아웃 마우스 모델(KO: Galns-/-)이다((Tomatsu 등, Hum Mol Genet 2003; 12(24): 349-3358). 제2 유형은 인트론 1에 hGALNS를 발현하는 전이유전자 및 엑손 2에 인접한 활성 부위 돌연변이(C76S)를 모두 함유하는 인간 GALNS에 내성인 뮤린 모델(MTOL: Galnstm(hC79S.mC76S)slu)로서, 이에 의해 C79S 활성 부위 돌연변이를 가진 불활성 hGALNS 암호 서열 및 상기 C76S 돌연변이를 모두 표적화된 돌연변이유발(Tomatsu 등, Hum. Mol. Genet. 2005; 14, 3321-3335)에 의해 뮤린 Galns 유전자 내로 도입시켰다. 두 모델 모두 혈액과 조직에서 검출가능한 효소 활성은 없었고, 주로 망상내피계 쿠퍼(Kupffer) 세포, 심장 판막 심근, 및 성장판과 관절 연골을 포함한 연골세포 내에서 저장 물질의 축적을 나타내었다.
본 발명자들은 2가지 MPS IVA 뮤린 모델인 MPS IVA 녹아웃 마우스(Galns-/-)(Tomatsu 등, Hum Mol Genet 2003; 12(24): 3349-3358) 및 C57BL/6 배경에서 인간 GALNS 단백질(Galnstm(hC79S.mC76S)slu)에 내성인 MPS IVA 마우스(Tomatsu 등, Hum. Mol. Genet. 2005;14, 3321-3335)의 개발에 대해 이전에 설명한 바 있다. GALNS 녹아웃 마우스 모델(KO: Galns-/-)은 GALNS 유전자의 표적화된 파괴에 의해 개발되었다(Tomatsu 등, Hum Mol Genet 2003; 12(24):3349-3358). 인간 GALNS에 내성인 마우스 모델(MTOL: Galnstm(hC79S.mC76S)slu)은 인트론 1에 hGALNS를 발현하는 전이유전자와 엑손 2에 인접한 활성 부위 돌연변이(C76S)를 함유하여 C79S 활성 부위 돌연변이를 가진 불활성 hGALNS 암호 서열을 도입시킨다(Tomatsu 등, Hum. Mol. Genet. 2005;14, 3321-3335). 두 마우스 모델 모두 혈액과 조직에서 검출가능한 효소 활성은 없었고, 주로 망상내피계 쿠퍼 세포, 심장 판막 및 근육, 및 성장판과 관절 연골을 포함한 연골세포 내에서 저장 물질의 축적을 보여주었다.
실험 코호트에 대한 유전형분석(genotyping)은 14일째에 PCR에 의해 수행하였다. 4주령의 동형접합 MPS IVA 마우스에게 어느 한 AAV8 벡터를 5x1013 GC/kg의 균일한 용량으로 정맥내로 처리하였다. MPS IVA 마우스의 다른 코호트 및 환부가 없는 C57BL/6 한배새끼에게 인산염 완충 식염수(PBS)를 투여하였다. 총 투여 용량 부피는 마우스 당 약 100μl였다. 모든 동물 관리 및 실험은 Nemours/Alfred I. duPont 아동 병원의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다.
(d) 혈액 및 조직 수집
본 연구에서 모든 동물로부터 격주로 약 100 μl의 혈액을 EDTA(BD, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)가 있는 튜브에 수집하였다. 혈액을 8,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 분리된 혈장은 GALNS 효소 검정 및 GAG 검정을 수행할 때까지 -20℃에서 유지시켰다. 16주된 마우스를 CO2 챔버에서 안락사시키고 20ml의 0.9% 식염수를 관류시켰다. 간, 신장, 폐, 비장, 심장 및 무릎 관절을 수집하였고 GALNS 효소 검정 및 GAG 검정을 진행할 때까지 -80℃에 보관하였다. 또한, 다양한 조직 샘플을 수집하였고 조직병리학 분석을 위해 10% 중성 완충 포르말린에 보관하였다.
(e) GALNS 활성 검정
혈액 및 조직 GALNS 활성은 이전에 설명된 바와 같이 결정하였다(Toietta, G., 등 Hum. Gene Ther. 2001;12, 2007-2016). 동결된 조직을 25 mmol/l Tris-HCl, pH 7.2 및 1 mmol/l 페닐메틸설포닐 플루오라이드로 이루어진 균질화 완충액과 함께 균질화기를 사용하여 균질화하였다. 조직 용해물 또는 혈장, 및 22mM 4-메틸움벨리페릴-β-갈락토피라노사이드-6-설페이트(Research Products International, 미국 일리노이주 마운트 프로스펙트 소재)를 0.1M NaCl, 0.1M 아세트산 나트륨, pH 4.3에서 16시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 그 다음, 0.1M NaCl, 0.1M 아세트산 나트륨, pH 4.3 중의 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae)(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 유래의 10 mg/ml β-갈락토시다제를 반응 샘플에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 추가 항온처리하였다. 샘플을 정지 용액(1M 글리신, NaOH, pH 10.5)으로 이동시키고, 평판을 Perkin Elmer Victor X4 평판 판독기(PerkinElmer, 미국 매사츄세츠주 월섬 소재)에서 여기(excitation) 366nm 및 방출 450nm에서 판독하였다. 활성은 혈장 마이크로리터 또는 단백질 밀리그램 당 시간 당 방출된 4-메틸움벨리페론의 나노몰로서 표현하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 검정 키트(Thermo Fisher Scientific, 미국 매사츄세츠 월섬 소재)에 의해 결정하였다.
(f) 조직으로부터 GAG 추출
다양한 마우스 조직으로부터의 GAG 추출은 모치즈키 등(Mochizuki, H., 등 J. Biol. Chem. 2008; 283, 31237-31245)에 의해 개발된 것에서 변형시켰다. 간단히 설명하면, 절제된 조직을 액체 질소에서 동결시키고 균질기를 사용하여 아세톤과 함께 균질화시켰다. 수득된 분말을 진공 원심분리 하에 건조시켰다. 탈지된 조직 분말을 0.5M NaOH에 현탁시키고 50℃에서 2시간 동안 항온처리하여 그 핵심 단백질로부터 GAG 사슬을 제거하였다. 1M HCl로 중화 후, NaCl을 3M의 최종 농도로 첨가하였다. 불용성 물질은 원심분리로 제거하였고 상청액의 pH를 1M HCl로 1.0 이하로 조정하였다. 침전된 뉴클레오타이드는 원심분리에 의해 제거하고 상청액은 1M NaOH로 중화시켰다. 미정제 GAG는 1.3% 아세트산칼륨을 함유하는 에탄올 을 2배 부피로 첨가하여 침전시켰다. 원심분리 후, 침전물을 증류수에 용해시켰다.
(g) GAG 검정
혈액 및 조직 GAG 수준은 이전에 설명된 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 측정하였다(Oguma, T., 등 Biomed. Chromatogr. 2007; 21, 356-362; Oguma, T., 등 Anal. Biochem. 2007; 368, 79-86; Shimada, T., 등 JIMD. Rep. 2014; 16, 15-24; Shimada, T., 등 JIMD. Rep. 2015; 21, 1-13; Kubaski, F., 등 J. Inherit. Metab. Dis. 2017; 40, 151-158). 간단히 설명하면, 50mM Tris-HCl(pH 7.0) 및 샘플을 96웰 리시버 평판 상의 96웰 오메가 10K 필터 평판(Pall Corporation, 미국 뉴욕주 포트 워싱턴 소재)에 주입하였다. 샘플을 2,500g에서 15분 동안 원심분리하였다. 필터 평판을 새로운 리시버 평판으로 옮기고 필터 평판에 50mM Tris-HCl(pH 7.0), 내부 표준물질(IS)로서 5μg/mL 콘드로신, 1mU 헤파리티나제 및 1mU 케라타나제 II의 칵테일 혼합물을 첨가하였다. 샘플을 37℃ 수조에서 밤새 항온처리하였다. 그 다음, 샘플을 2,500g에서 15분 동안 원심분리하였다. 6460 트리플 쿼드 질량 분광분석기와 1290 Infinity LC 시스템(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)으로 장치를 구성하였다. 이당류는 60℃에서 온도조절된 Hypercarb 컬럼(2.0 mm i.d. 50 mm 길이; 5 μm 입자; Thermo Fisher Scientific, 미국 매사츄세츠주 월섬 소재) 상에서 분리하였다. 이동상은 5mM 아세트산암모늄, pH 11.0(용액 A)과 100% 아세토니트릴(용액 B)의 구배 용출액이었다. 유속은 0.7ml/분이고 구배는 다음과 같이 수행하였다: 100% 용액 A 0분, 70% 용액 A 1분, 70% 용액 A 2분, 0% 용액 A 2.20분, 0% 용액 A 2.60분, 100% 용액 A 2.61분, 100% 용액 A 5분. 질량 분광분석기는 음이온 방식의 전기분무 이온화(Agilent Jet Stream 기술)로 작동시켰다. 특정 전구체 및 생성물 이온, m/z를 사용하여 각 이당류를 각각 정량하였다(IS, 354.3 → 193.1; 단일 황산화 KS, 462 → 97; HS-0S 378.3 → 175.1). 주입 부피는 10μl였으며 샘플 당 진행 시간은 5분이었다.
(h) 톨루이딘 블루 염색 및 병리학적 평가
톨루이딘 블루 염색은 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다(Tomatsu, S., 등 Mol. Genet. 2005, 14, 3321-3335). 간단히 설명하면, 16주령의 MPS IVA 및 WT 마우스로부터 무릎 관절 및 승모판 심장 판막을 수집하여 광학 현미경으로 저장 과립의 수준을 평가하였다. 조직은 PBS 중의 2% 파라포름알데히드, 4% 글루타르알데하이드로 고정시키고 사산화 오스뮴에서 후고정시키고 Spurr 수지에 매립시켰다. 그 후, 톨루이딘 블루 염색된 0.5㎛ 두께의 절편을 조사하였다. 대퇴골 또는 경골의 성장판 중의 연골세포의 세포 크기(액포화)를 평가하기 위해 증식 영역 중의 약 300개 연골세포를 각 마우스에서 Image J 소프트웨어로 측정하였고, 결과는 야생형 군으로부터의 변화 배수로 나타내었다.
(i) 효소 면역흡착 검정(ELISA)에 의한 GALNS에 대한 항체 검출
처리된 마우스 및 미처리된 마우스의 혈장에서 GALNS에 대한 항체를 검출하기 위해 이전에 설명된 바와 같이 간접 ELISA 방법을 사용하였다(Tomatsu, S., 등 Hum. Mol. Genet. 2003; 12, 961-973). 간단히 설명하면, 96웰 마이크로역가 평판을 15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, 0.02% NaN3, pH 9.6 중의 2μg/ml 정제된 rhGALNS(R&D Systems, 미국 매사츄세츠주 미네아폴리스 소재)로 밤새 코팅하였다. 상기 웰을 TBS-T(10mM Tris, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.05% TWEEN 20)로 3회 세척한 다음, PBS 중의 3% 소 혈청 알부민(pH 7.2)으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. TBS-T로 3회 세척한 후, TBS-T에 100배 희석한 마우스 혈장을 상기 웰에 첨가하고 37℃에서 2.5시간 동안 항온처리하였다. 상기 웰을 TBS-T로 4회 세척한 다음, 1:1,000 희석율의 퍼옥시다제 접합된 염소 항-마우스 IgG(Thermo Fisher Scientific, 미국 매사츄세츠주 월섬 소재)를 함유하는 TBS-T를 상기 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 상기 웰을 TBS-T로 3회, 및 TBS(10mM Tris, pH7.5, 150mM NaCl)로 2회 세척하였다. 퍼옥시다제 기질(ABTS 용액, Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 첨가하였고(웰당 100μl), 평판을 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 반응은 1% SDS의 첨가로 중지시켰고, 평판을 Perkin Elmer Victor X4 평판 판독기(PerkinElmer, 미국 매사츄세츠주 월섬 소재)에서 410nm 광학 밀도를 판독하였다.
(j) 통계 분석
모든 데이터는 평균 및 표준 편차(SD)로 나타내었다. GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 사용하여 Bonferroni의 사후 시험과 일원 ANOVA에 의해 다중 비교 시험을 수행하였다. 차이의 통계적 유의성은 p<0.05로 간주하였다.
7.4 실시예 4. 뼈 병리에 대한 장기간 효소 노출의 효과 평가
뼈 병리에 대한 장기간 효소 노출의 효과를 평가하기 위해 다음 연구를 수행한다. 이 연구를 위해, 4주령의 MPSIVA KO 마우스에게 AAV8-TBG-hGALNSco를 5x1013 GC/kg 체중의 용량으로 투여한다. 대조군은 미처리된 MPS IVA KO 마우스 및 동일한 연령의 미처리된 야생형 마우스이다. 이 연구에는 그룹당 6-10 마리씩 3그룹의 마우스를 사용한다. 주사 후 24주 또는 48주 동안 마우스를 모니터링하고 혈액 샘플을 격주 내지 다른 주에 수집하여 효소 활성 및 KS 수준을 분석한다. 또한, 부검 시에, 조직병리학 분석을 위해 무릎 관절 및 심장 판막 뿐만 아니라 효소 활성 및 KS 수준을 위해 여러 기관으로부터 조직 샘플을 채취한다.
이와 유사하게, 4주령의 MTOL 마우스에게 AAV8-TBG-hGALNSco를 5x1013 GC/kg 체중의 용량으로 전달한다. 대조군은 미처리된 MTOL 마우스, 및 동일한 연령의 미처리된 야생형 마우스를 포함한다. 이 연구에는 그룹당 6-10마리씩 3그룹의 마우스를 사용한다. 마우스를 주사 후 24주 또는 48주 동안 모니터링하고 혈액 샘플을 격주 내지 다른 주에 수집하여 효소 활성 및 KS 수준을 분석한다. 또한, 부검 시, 조직병리학 분석을 위해 무릎 관절 및 심장 판막 뿐만 아니라 효소 활성 및 KS 수준을 위해 여러 기관으로부터 조직 샘플을 채취한다.
7.5 실시예 5. 신생아 연구: 뼈 병리에 대한 조기 개입의 효과 평가
뼈 병리에 대한 조기 개입의 효과를 평가하기 위해 신생 마우스에 대해 다음 연구를 수행한다. 이 연구를 위해, MPSIVA KO 신생 마우스에게 AAV8-TBG-hGALNSco를 5x1013 GC/kg 체중의 용량으로 투여한다. 대조군은 미처리된 MPS IVA KO 마우스, 및 동일한 연령의 미처리된 야생형 마우스를 포함한다. 마우스는 16주째에 희생시키고, 효소 활성과 KS 수준을 분석하기 위해 격주 내지 다른 주에 혈액 샘플을 수집한다. 또한, 부검 시, 조직병리학 분석을 위해 무릎 관절 및 심장 판막 뿐만 아니라 효소 활성 및 KS 수준을 위해 여러 기관으로부터 조직 샘플을 채취한다.
이와 유사하게, 본 발명자들은 신생 MTOL 마우스에게 AAV8-TBG-hGALNSco를 5x1013 GC/kg 체중의 용량으로 전달하였다. 대조군은 미처리된 MTOL 마우스 및 동일한 연령의 미처리된 야생형 마우스를 포함한다. 이 연구에는 그룹당 6마리씩 3그룹의 마우스가 사용된다. 마우스를 16주째 희생시키고, 효소 활성과 KS 수준을 분석하기 위해 격주 내지 다른 주에 혈액 샘플을 수집한다. 또한, 부검 시, 조직병리학 분석을 위해 무릎 관절 및 심장 판막 뿐만 아니라 효소 활성 및 KS 수준을 위해 여러 기관으로부터 조직 샘플을 채취한다.
7.6 실시예 6. 새로운 발현 카세트 평가
다음 연구는 개선된 효능을 위해 최적화된 프로모터 작제물을 평가하기 위해 수행한 것이다. 이 연구를 위해, 4주령 MPSIVA KO 마우스에게 AAV8-TBG-hGALNSco, AAV8-CAG-hGALNSco, AAV8-프로모터 1-hGALNSco, AAV8-프로모터 2-hGALNSco, AVV9- 프로모터 2-hGALNSco를 1x1013 GC/kg 체중(그룹 당 10마리 마우스)의 용량으로 투여한다. 대조군에는 미처리된 MPS IVA KO 마우스 및 동일한 연령의 미처리된 야생형 마우스가 포함된다. 마우스를 12주 또는 48주 동안 모니터링하고 효소 활성 및 KS 수준을 분석하기 위해 격주 내지 다른 주에 혈액 샘플을 수집한다. 또한, 부검 시, 조직병리학 분석을 위해 무릎 관절 및 심장 판막 뿐만 아니라 효소 활성 및 KS 수준을 위해 여러 기관으로부터 조직 샘플을 채취한다.
7.7 실시예 7. 후기 AAV 유전자 치료 연구
후기 AAV 유전자 치료 효능을 평가하기 위해 다음 연구가 수행된다. 이 연구를 위해, 8-10주령 MPSIVA KO 마우스(그룹 당 5마리 마우스)에게 AAV-TBG-hGALNSco, AAV-CAG-hGALNSco, AAV-Promoter 1-hGALNSco, AAV-Promoter 2-hGALNSco, AVV-Promoter 2-hGALNSco를 투여한다. 미처리된 MPS IVA KO 마우스는 대조군으로 사용된다. 마우스를 일정 기간 동안 모니터링하고 혈액 샘플을 격주 내지 다른 주에 수집하여 효소 활성 및 KS 수준을 분석한다. 또한, 부검 시, 조직병리학 분석을 위해 무릎 관절 및 심장 판막 뿐만 아니라 효소 활성 및 KS 수준을 위해 여러 기관으로부터 조직 샘플을 채취한다.
이와 유사하게, 8 내지 10주령의 MTOL 마우스(그룹 당 5마리 마우스)에게 AAV-TBG-hGALNSco, AAV-CAG-hGALNSco, AAV-프로모터 1-hGALNSco, AAV-프로모터 2-hGALNSco, AVV-프로모터 2-hGALNSco를 투여한다. 미처리된 MTOL 마우스는 대조군으로 사용된다. 마우스를 일정 기간 동안 모니터링하고 혈액 샘플을 격주 내지 다른 주에 수집하여 효소 활성 및 KS 수준을 분석한다. 또한, 부검 시, 조직병리학 분석을 위해 무릎 관절 및 심장 판막 뿐만 아니라 효소 활성 및 KS 수준을 위해 여러 기관으로부터 조직 샘플을 채취한다.
7.8 실시예 8. 고용량 및 저용량에서 AAV8-TBG-hGALNS, AAV8-TBG-D8-hGALNS AAV8-CAG-hGALNS 및 AAV8-CAG-D8-hGALNS의 효과에 대한 비교 연구
고용량 및 저용량에서 AAV8-TBG-hGALNS, AAV8-TBG-D8-hGALNS, AAV8-CAG-hGALNS 및 AAV8-CAG-D8-hGALNS의 효과를 평가하기 위해 다음 연구를 수행하였다.
이 연구를 위해, 본 발명자들은 4주령의 MPSIVA KO 마우스(그룹당 n≥4)에게 AAV8-TBG-hGALNS 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS를 고용량(2x1014 GC/kg 체중) 또는 저용량(5x1013 GC/kg 체중)으로 정맥내 전달하였다. 본 발명자들은 또한 4주령의 MPSIVA KO 마우스(그룹당 n≥4)에게 AAV8-CAG-hGALNS 및 AAV8-CAG-D8-hGALNS를 저용량(5x1013 GC/kg 체중)으로 정맥내 전달하였다. 대조군은 미처리된 MPS IVA KO 마우스 및 동일한 연령의 미처리된 야생형 마우스를 포함하였다. 마우스를 12주 동안 모니터링하고 혈액 샘플(혈장)을 격주로 수집하여 효소 활성 및 KS 수준을 분석하였다.
이와 유사하게, 본 발명자들은 4주령의 MTOL 마우스(그룹당 n≥4)에게 AAV8-TBG-hGALNS 및 AAV8-TBG-D8-hGALNS를 고용량(2x1014 GC/kg 체중) 또는 저용량(5x1013 GC/kg 체중)으로 정맥내 전달하였다. 본 발명자들은 또한 4주령 MTOL 마우스(그룹당 n≥4)에게 AAV8-CAG-hGALNS 및 AAV8-CAG-D8-hGALNS를 저용량(5x1013 GC/kg 체중)으로 정맥내 전달하였다. 미처리된 MTOL 마우스는 대조군으로 사용된다. 마우스를 12주 동안 모니터링하고 혈액 샘플을 격주로 수집하여 효소 활성 및 KS 수준을 분석하였다.
7.8.1 결과
(a) 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 5x1013 GC/kg 체중의 AAV8-CAG-hGALNS 또는 AAV8-CAG-D8-hGALNS가 투여된 MPS IVA KO 마우스 혈장 중의 hGALNS 효소 활성
5x1013 GC/kg 체중의 AAV8-CAG-hGALNS 또는 AAV8-CAG-D8-hGALNS가 투여된 MPS IVA KO 마우스 중의 혈장 hGALNS 효소 활성은 도 33 내지 35에 제시된다. 주사 2주 후, 미처리된 야생형 마우스에 비해, AAV8-D8-hGALNS 마우스에서는 증가된 혈장 hGALNS 활성이 검출되었다. AAV8-CAG-D8-hGALNS로부터의 효소 활성은 주사 2주 후 AAV8-CAG-hGALNS로부터의 효소 활성보다 더 높았다.
(b) 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 5x1013 GC/kg 체중의 AAV8-CAG-hGALNS 또는 AAV8-CAG-D8-hGALNS가 투여된 MPS IVA KO 마우스의 간에서의 hGALNS 효소 활성
5x1013 GC/kg 체중의 AAV8-CAG-hGALNS 또는 AAV8-CAG-D8-hGALNS가 투여된 MPS IVA KO 마우스의 간에서의 hGALNS 효소 활성은 도 36에 제시된다. 미처리된 야생형 마우스와 비교하여, 증가된 간 hGALNS 활성이 AAV8-D8-hGALNS 및 AAV8-hGALNS 처리된 마우스 모두에서 검출되었다.
(c) 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 5x1013 GC/kg 체중의 AAV8-CAG-hGALNS가 투여된 MTOL 마우스의 혈장에서의 hGALNS 효소 활성.
5x1013 GC/kg 체중의 AAV8-CAG-hGALNS가 투여된 MTOL 마우스의 혈장에서의 hGALNS 효소 활성은 도 37에 제시된다.
(d) 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 5x1013 GC/kg 체중의 AAV8-CAG-hGALNS가 투여된 MTOL 마우스의 간에서의 hGALNS 효소 활성.
5x1013 GC/kg 체중의 AAV8-CAG-hGALNS가 투여된 MTOL 마우스의 간에서의 GALNS 효소 활성은 도 38에 제시된다. 미처리된 야생형 마우스와 비교하여, 증가 된 간 hGALNS 활성이 AAV8-hGALNS 처리된 마우스에서 검출되었다.
(e) 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 2x1014 GC/kg 체중의 AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS가 투여된 MPS IVA KO 마우스의 혈장에서의 hGALNS 효소 활성.
2x1014 GC/kg 체중의 AAV8-TBG-hGALNS, 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS가 투여된 MPSIVA KO 마우스에서의 혈장 hGALNS 효소 활성은 도 39 및 40에 제시된다.
(f) 미처리된 야생형 마우스와 비교된 것으로서, 2x1014 GC/kg 체중의 AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS가 투여된 MPS IVA KO 마우스의 간에서의 hGALNS 효소 활성
2x1014 GC/kg 체중의 AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS가 투여된 MPSIVA KO 마우스의 간에서의 hGALNS 효소 활성은 도 41에 제시된다. 미처리된 야생형 마우스와 비교하여, 증가된 간 hGALNS 활성이 AAV8-TBG-hGALNS 또는 AAV8-TBG-D8-hGALNS 처리된 마우스 모두에서 검출되었다.
8. 서열 표
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
9. 등가물 및 참조 포함
본 발명은 특정 실시예를 참조하여 상세하게 설명되었지만, 기능적으로 동등한 변형이 본 발명의 범위 내임을 이해할 것이다. 실제로, 본원에 제시되고 설명된 것들 외에도 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 그러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 간주한다. 본 기술분야의 기술자는 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 또는 단지 일상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하의 청구범위에 포괄되는 것으로 간주한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 그 전체내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되었을 지라도 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENXBIO Inc. The Nemours Foundation <120> TREATMENT OF MUCOPOLYSACCHARIDOSIS IVA <130> 12656-116-228 <140> TBA <141> On even date herewith <150> 62/799,834 <151> 2019-02-01 <150> 62/756,880 <151> 2018-11-07 <150> 62/711,238 <151> 2018-07-27 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 738 <212> PRT <213> Adeno-associated Virus (AAV) <220> <223> AAV8 capsid protein <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 180 185 190 Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 210 215 220 Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp 260 265 270 Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285 Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365 Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380 Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400 Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr 405 410 415 Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 420 425 430 Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 435 440 445 Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly 450 455 460 Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp 465 470 475 480 Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly 485 490 495 Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His 500 505 510 Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr 515 520 525 His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile 530 535 540 Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val 545 550 555 560 Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 565 570 575 Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala 580 585 590 Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 595 600 605 Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 610 615 620 Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 625 630 635 640 Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 645 650 655 Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe 660 665 670 Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685 Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700 Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 705 710 715 720 Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 Asn Leu <210> 2 <211> 1569 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <223> Human GALNS (hGALNS) <400> 2 atggcggcgg ttgtcgcggc 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ggaatgggag cttctggtgc tccccagcct cctaacattc tgctgctgct catggacgac 120 atgggctggg gcgatctggg agtgtatggc gagcctagca gagagacacc caacctggat 180 agaatggccg ccgagggcct gctgttcccc aatttctaca gcgccaatcc tctgtgcagc 240 ccctctagag ctgctctgct gacaggcaga ctgcccatca gaaacggctt ctacaccacc 300 aacgctcacg cccggaatgc ctacacaccc caagagatcg ttggcggcat ccccgattct 360 gagcagctcc tgcctgagct gctgaagaag gccggctacg tcagcaagat cgtcggcaaa 420 tggcacctgg gccacagacc tcagtttcac cctctgaagc acggcttcga cgagtggttc 480 ggcagcccca attgtcactt cggcccctac gacaacaagg ccagacctaa catccccgtg 540 tacagagact gggagatggt cggacggtac tacgaggaat tccccatcaa cctgaaaacc 600 ggcgaggcca atctgaccca gatctacctg caagaggccc tggacttcat caagcggcag 660 gccagacacc atcctttctt tctgtactgg gccgtcgacg ccacacacgc ccctgtgtat 720 gccagcaagc cttttctggg caccagccag cgtggcagat atggcgacgc cgtgcgggaa 780 atcgatgaca gcatcggcaa gatcctggaa ctgctgcagg atctgcacgt ggccgacaac 840 accttcgtgt tcttcaccag cgacaacggc gctgccctga tttctgctcc tgagcaaggc 900 ggcagcaacg 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cccgcagccc 120 cccaacatcc tgctcctgct catggacgac atgggatggg gtgacctcgg ggtgtatgga 180 gagccctcca gagagacccc gaatttggac cggatggctg cagaagggct gcttttccca 240 aacttctatt ctgccaaccc tctgtgctcg ccatcgaggg cggcactgct cacaggacgg 300 ctacccatcc gcaatggctt ctacaccacc aacgcccatg ccagaaacgc ctacacaccg 360 caggagattg tgggcggcat cccagactcg gagcagctcc tgccggagct tctgaagaag 420 gccggctacg tcagcaagat tgtcggcaag tggcatctgg gtcacaggcc ccagttccac 480 cccctgaagc acggatttga tgagtggttt ggatccccca actgccactt tggaccttat 540 gacaacaagg ccaggcccaa catccctgtg tacagggact gggagatggt tggcagatat 600 tatgaagaat ttcctattaa tctgaagacg ggggaagcca acctcaccca gatctacctg 660 caggaagccc tggacttcat taagagacag gcacggcacc accccttttt cctctactgg 720 gctgtcgacg ccacgcacgc acccgtctat gcctccaaac ccttcttggg caccagtcag 780 cgagggcggt atggagacgc cgtccgggag attgatgaca gcattgggaa gatactggag 840 ctcctccaag acctgcacgt cgcggacaac accttcgtct tcttcacgtc ggacaacggc 900 gctgccctca tttccgcccc cgaacaaggt ggcagcaacg gcccctttct gtgtgggaag 960 cagaccacgt ttgaaggagg gatgagggag cctgccctcg catggtggcc agggcacgtc 1020 actgcaggcc aggtgagcca ccagctgggc agcatcatgg acctcttcac caccagcctg 1080 gcccttgcgg gcctgacgcc gcccagcgac agggccattg atggcctcaa cctcctcccc 1140 accctcctgc agggccggct gatggacagg cctatcttct attaccgtgg cgacacgctg 1200 atggcggcca ccctcgggca gcacaaggct cacttctgga cctggaccaa ctcctgggag 1260 aacttcagac agggcattga tttctgccct gggcagaacg tttcaggggt cacaactcac 1320 aatctggaag accacacgaa gctgcccctg atcttccacc tgggacggga cccaggggag 1380 aggttccccc tcagctttgc cagcgccgag taccaggagg ccctcagcag gatcacctcg 1440 gtcgtccagc agcaccagga ggccttggtc cccgcgcagc cccagctcaa cgtgtgcaac 1500 tgggcggtca tgaactgggc acctccgggc tgtgaaaagt tagggaagtg tctgacacct 1560 ccagaatcca ttcccaagaa gtgcctctgg tcccactagc tcga 1604 <210> 5 <211> 1593 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D8-GALNSco (codon optimized) <400> 5 atgagaggac catctggtgc tctgtggctg ctgctggctc tgagaacagt gctgggcagc 60 gacgacgatg atgacgatga cgacgccgag gctgaaacag gtgctcccca gcctcctaac 120 atcctgctgc tgctcatgga cgatatgggc tggggcgatc tgggagtgta tggcgagcct 180 agcagagaga cacccaacct ggatagaatg gccgccgagg gcctgctgtt ccccaatttc 240 tacagcgcca atcctctgtg cagcccctct agagctgctc tgctgacagg cagactgccc 300 atcagaaacg gcttctacac caccaacgct cacgcccgga atgcctacac accccaagag 360 atcgttggcg gcatccccga ttctgaacag ctgctgcctg agctgctgaa gaaggccggc 420 tacgtcagca agatcgtcgg caaatggcac ctgggccaca gacctcagtt tcaccctctg 480 aagcacggct tcgacgagtg gttcggcagc cccaattgtc acttcggccc ctacgacaac 540 aaggccagac caaacatccc cgtgtacaga gactgggaga tggtcggacg gtactacgag 600 gaattcccca tcaacctgaa aaccggcgag gccaatctga cccagatcta cctgcaagag 660 gccctggact tcatcaagcg gcaggccaga caccatcctt tctttctgta ctgggccgtc 720 gacgccacac acgcccctgt gtatgccagc aagccttttc tgggcaccag ccagcgtggc 780 agatatggcg acgccgtgcg ggaaatcgat gacagcatcg gcaagatcct ggaactgctg 840 caggatctgc acgtggccga caacaccttc gtgttcttca ccagcgacaa cggcgctgcc 900 ctgatttctg ctcctgagca aggcggcagc aacggcccat ttctgtgtgg caagcagacc 960 acctttgaag gcggcatgag agagcctgct ctggcttggt ggcctggaca tgtgacagcc 1020 ggacaagtgt ctcaccagct gggctccatc atggacctgt ttaccacctc tctggccctg 1080 gccggactga cacctccatc tgatagagcc atcgacggcc tgaacctgct gcctacactg 1140 cttcagggca gactgatgga cagacccatc ttctactacc ggggcgacac cctgatggcc 1200 gctacactgg gacagcacaa ggcccacttt tggacctgga ccaacagctg ggagaacttc 1260 cggcagggca tcgacttttg ccctggccag aatgtgtccg gcgtgaccac acacaatctg 1320 gaagatcaca ccaagctgcc cctgatcttt cacctgggca gagatcccgg cgagagattc 1380 cctctgtctt ttgccagcgc cgagtaccaa gaagccctga gcagaatcac cagcgtggtg 1440 cagcagcacc aagaggctct ggttccagct cagccccagc tgaacgtgtg taattgggcc 1500 gtgatgaact gggcccctcc tggatgtgaa aagctgggca agtgtctgac ccctcctgag 1560 agcatcccca agaaatgcct gtggtcccac tga 1593 <210> 6 <211> 460 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBG promoter <400> 6 gggctggaag ctacctttga catcatttcc tctgcgaatg catgtataat ttctacagaa 60 cctattagaa aggatcaccc agcctctgct tttgtacaac tttcccttaa aaaactgcca 120 attccactgc tgtttggccc aatagtgaga actttttcct gctgcctctt ggtgcttttg 180 cctatggccc ctattctgcc tgctgaagac actcttgcca gcatggactt aaacccctcc 240 agctctgaca atcctctttc tcttttgttt tacatgaagg gtctggcagc caaagcaatc 300 actcaaagtt caaaccttat cattttttgc tttgttcctc ttggccttgg ttttgtacat 360 cagctttgaa aataccatcc cagggttaat gctggggtta atttataact aagagtgctc 420 tagttttgca atacaggaca tgctataaaa atggaaagat 460 <210> 7 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-prime ITR <400> 7 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 130 <210> 8 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-prime ITR <400> 8 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag 130 <210> 9 <211> 127 <212> DNA <213> Rabbit <220> <223> Rabbit globin poly A <400> 9 gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60 tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120 tcactcg 127 <210> 10 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Intron_1 <400> 10 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120 tttctctcca cag 133 <210> 11 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha mic/bik enhancer <400> 11 aggttaattt ttaaaaagca gtcaaaagtc caagtggccc ttggcagcat ttactctctc 60 tgtttgctct ggttaataat ctcaggagca caaacattcc 100 <210> 12 <211> 1569 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GALNS (codon optimized and CpG depleted) <400> 12 atggctgctg tggtggctgc tacaagatgg tggcaactgc tgctggtgct gtctgcagct 60 ggaatgggag cttctggtgc ccctcagcct cctaatatcc tgctgctgct gatggatgac 120 atgggctggg gagatctggg agtgtatggg gagcctagca gagagacacc caacctggat 180 agaatggctg cagagggcct gctgttcccc aacttctact ctgccaatcc tctgtgcagc 240 ccctctagag ctgcactgct tacaggcaga ctgcccatca gaaatggctt ctacaccaca 300 aatgcccatg ccagaaatgc ctacacaccc caagagatag ttggaggcat ccctgactct 360 gaacagctgc tgcctgagct gctgaagaaa gctggctatg tgtccaagat agttggcaag 420 tggcacctgg gccacagacc tcagtttcac cctctgaaac atggctttga tgagtggttt 480 ggcagcccca actgccactt tggcccctat gataacaagg ccagacctaa catccctgtg 540 tacagagact gggagatggt tggaaggtac tatgaagagt tccccatcaa cctgaaaaca 600 ggggaagcca atctgaccca gatctacctg caagaggccc tggacttcat caagagacag 660 gccagacacc atcctttctt tctgtactgg gctgttgatg ccacacatgc ccctgtgtat 720 gccagcaagc cttttctggg caccagccag aggggcagat atggggatgc tgtcagagaa 780 attgatgaca gcattggcaa gatcctggaa ctgctgcagg acctgcatgt ggctgacaac 840 acctttgtgt tcttcacctc tgacaatggg gcagccctga tctctgcccc tgagcaaggt 900 ggcagcaatg gcccatttct gtgtggcaag cagaccacct ttgaaggtgg catgagagag 960 cctgctctgg cctggtggcc tggacatgtt acagctggac aagtgtctca ccagctgggc 1020 agcatcatgg acctgtttac cacatctctg gccctggctg gactgacccc tccatctgat 1080 agagccattg atggcctgaa cctgctgcct acacttctgc agggcagact gatggacaga 1140 cccatcttct actacagagg tgacaccctg atggctgcca cactgggaca gcacaaggcc 1200 cacttttgga cctggaccaa cagctgggag aacttcagac agggcattga tttctgccct 1260 ggccagaatg tgtctggggt caccactcac aacctggaag atcacaccaa gctgcccctc 1320 atcttccacc tgggaagaga tcctggggag agattccctc tgagctttgc ctctgctgag 1380 taccaagaag ccctgagcag aatcacatct gtggtgcagc agcatcaaga ggctctggtt 1440 ccagctcagc cccagctgaa tgtgtgcaac tgggcagtga tgaattgggc cccacctggc 1500 tgtgaaaagc tgggcaaatg tctgacccca cctgagagca tccctaaaaa gtgcctgtgg 1560 tcccactga 1569 <210> 13 <211> 969 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSPX1 Promoter <400> 13 aggttaattt ttaaaaagca gtcaaaagtc caagtggccc ttggcagcat ttactctctc 60 tgtttgctct ggttaataat ctcaggagca caaacattcc agatccaggt taatttttaa 120 aaagcagtca aaagtccaag tggcccttgg cagcatttac tctctctgtt tgctctggtt 180 aataatctca ggagcacaaa cattccagat ccggcgcgcc agggctggaa gctacctttg 240 tctagaaggc tcagaggcac acaggagttt ctgggctcac cctgccccct tccaacccct 300 cagttcccat cctccagcag ctgtttgtgt gctgcctctg aagtccacac tgaacaaact 360 tcagcctact catgtcccta aaatgggcaa acattgcaag cagcaaacag caaacacaca 420 gccctccctg cctgctgacc ttggagctgg ggcagaggtc agagacctct ctgggcccat 480 gccacctcca acatccactc gaccccttgg aatttcggtg gagaggagca gaggttgtcc 540 tggcgtggtt taggtagtgt gagaggggta cccggggatc ttgctaccag tggaacagcc 600 actaaggatt ctgcagtgag agcagagggc cagctaagtg gtactctccc agagactgtc 660 tgactcacgc caccccctcc accttggaca caggacgctg tggtttctga gccaggtaca 720 atgactcctt tcggtaagtg cagtggaagc tgtacactgc ccaggcaaag cgtccgggca 780 gcgtaggcgg gcgactcaga tcccagccag tggacttagc ccctgtttgc tcctccgata 840 actggggtga ccttggttaa tattcaccag cagcctcccc cgttgcccct ctggatccac 900 tgcttaaata cggacgagga cagggccctg tctcctcagc ttcaggcacc accactgacc 960 tgggacagt 969 <210> 14 <211> 1050 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSPX2 Promoter <400> 14 aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60 ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120 tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180 cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240 tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300 ggtttaggta gtgtgagagg gtctagaagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca 360 ccctgccccc ttccaacccc tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct 420 gaagtccaca ctgaacaaac ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa 480 gcagcaaaca gcaaacacac agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt 540 cagagacctc tctgggccca tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt 600 ggagaggagc agaggttgtc ctggcgtggt ttaggtagtg tgagaggggt acccggggat 660 cttgctacca gtggaacagc cactaaggat tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt 720 ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg ccaccccctc caccttggac acaggacgct 780 gtggtttctg agccaggtac aatgactcct ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg 840 cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg ggcgactcag atcccagcca gtggacttag 900 cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca gcagcctccc 960 ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct gtctcctcag 1020 cttcaggcac caccactgac ctgggacagt 1050 <210> 15 <211> 1089 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LTP1 Promoter <400> 15 aggttaattt ttaaaaagca gtcaaaagtc caagtggccc ttggcagcat ttactctctc 60 tgtttgctct ggttaataat ctcaggagca caaacattcc agatccaggt taatttttaa 120 aaagcagtca aaagtccaag tggcccttgg cagcatttac tctctctgtt tgctctggtt 180 aataatctca ggagcacaaa cattccagat ccggcgcgcc agggctggaa gctacctttg 240 acatcatttc ctctgcgaat gcatgtataa tttctacaga acctattaga aaggatcacc 300 cagcctctgc ttttgtacaa ctttccctta aaaaactgcc aattccactg ctgtttggcc 360 caatagtgag aactttttcc tgctgcctct tggtgctttt gcctatggcc cctattctgc 420 ctgctgaaga cactcttgcc agcatggact taaacccctc cagctctgac aatcctcttt 480 ctcttttgtt ttacatgaag ggtctggcag ccaaagcaat cactcaaagt tcaaacctta 540 tcattttttg ctttgttcct cttggccttg gttttgtaca tcagctttga aaataccatc 600 ccagggttaa tgctggggtt aatttataac taagagtgct ctagttttgc aatacaggac 660 atgctataaa aatggaaaga tgttgctttc tgagaggatc ttgctaccag tggaacagcc 720 actaaggatt ctgcagtgag agcagagggc cagctaagtg gtactctccc agagactgtc 780 tgactcacgc caccccctcc accttggaca caggacgctg tggtttctga gccaggtaca 840 gtgactcctt tcggtaagtg cagtggaagc tgtacactgc ccaggcaaag cgtccgggca 900 gcgtaggcgg gcgactcaga tcccagccag tggacttagc ccctgtttgc tcctccgata 960 actggggtga ccttggttaa tattcaccag cagcctcccc cgttgcccct ctggatccac 1020 tgcttaaata cggacgagga cagggccctg tctcctcagc ttcaggcacc accactgacc 1080 tgggacagt 1089 <210> 16 <211> 1579 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMTP6 Promoter <400> 16 aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60 ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120 tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180 cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240 tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300 ggtttaggta gtgtgagagg gccactacgg gtttaggctg cccatgtaag gaggcaaggc 360 ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taacccagac atgtggctgc cccccccccc 420 cccaacacct gctgcctcta aaaataaccc tgtccctggt ggatcccact acgggtttag 480 gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc 540 agacatgtgg ctgccccccc cccccccaac acctgctgcc tctaaaaata accctgtccc 600 tggtggatcc cactacgggt ttaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc 660 gagatgcctg gttataatta acccagacat gtggctgccc cccccccccc caacacctgc 720 tgcctctaaa aataaccctg tccctggtgg atcccctgca tgcgaagatc ttcgaacaag 780 gctgtggggg actgagggca ggctgtaaca ggcttggggg ccagggctta tacgtgcctg 840 ggactcccaa agtattactg ttccatgttc ccggcgaagg gccagctgtc ccccgccagc 900 tagactcagc acttagttta ggaaccagtg agcaagtcag cccttggggc agcccataca 960 aggccatggg gctgggcaag ctgcacgcct gggtccgggg tgggcacggt gcccgggcaa 1020 cgagctgaaa gctcatctgc tctcaggggc ccctccctgg ggacagcccc tcctggctag 1080 tcacaccctg taggctcctc tatataaccc aggggcacag gggctgccct cattctacca 1140 ccacctccac agcacagaca gacactcagg agccagccag cgtcgagatc ttgctaccag 1200 tggaacagcc actaaggatt ctgcagtgag agcagagggc cagctaagtg gtactctccc 1260 agagactgtc tgactcacgc caccccctcc accttggaca caggacgctg tggtttctga 1320 gccaggtaca gtgactcctt tcggtaagtg cagtggaagc tgtacactgc ccaggcaaag 1380 cgtccgggca gcgtaggcgg gcgactcaga tcccagccag tggacttagc ccctgtttgc 1440 tcctccgata actggggtga ccttggttaa tattcaccag cagcctcccc cgttgcccct 1500 ctggatccac tgcttaaata cggacgagga cagggccctg tctcctcagc ttcaggcacc 1560 accactgacc tgggacagt 1579

Claims (53)

  1. 하기를 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV):
    (a) AAV 캡시드; 및
    (b) AAV 역위 말단 반복체(ITR)가 측면에 있는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(hGALNS) 발현 카세트를 포함하고, 상기 hGALNS 발현 카세트가 전이유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 전이유전자는 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 것인 재조합 AAV 게놈.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산성 올리고펩타이드가 D8인, rAAV.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는, rAAV.
  4. 제3항에 있어서, 상기 간 특이적 프로모터는,
    (a) TBG 프로모터이거나; 또는
    (b) 서열번호 13과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (c) 서열번호 13과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (d) 서열번호 13과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (e) 서열번호 13과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (f) 서열번호 13과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (g) 서열번호 13과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (h) 서열번호 14와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (i) 서열번호 14와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (j) 서열번호 14와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (k) 서열번호 14와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (l) 서열번호 14와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (m) 서열번호 14와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (n) 서열번호 15와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (o) 서열번호 15와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (p) 서열번호 15와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (q) 서열번호 15와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (r) 서열번호 15와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (s) 서열번호 15와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
    rAAV.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는, rAAV.
  6. 제5항에 있어서, 상기 프로모터가 CAG 프로모터인 rAAV.
  7. 제5항에 있어서, 상기 프로모터가 간 및 근육 특이적 프로모터인 rAAV.
  8. 제7항에 있어서, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터가
    (a) 서열번호 16과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (b) 서열번호 16과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (c) 서열번호 16과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (d) 서열번호 16과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (e) 서열번호 16과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (f) 서열번호 16과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
    rAAV.
  9. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV가 AAV8인, rAAV.
  10. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV가 AAV9인, rAAV.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 코돈 최적화된 것인, rAAV.
  12. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 CpG 부위 결핍성인, rAAV.
  13. 하기를 포함하는 rAAV:
    (a) AAV 캡시드; 및
    (b) AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈으로서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 AAV 게놈.
  14. 제13항에 있어서, 상기 간 특이적 프로모터가
    (a) TBG 프로모터이거나; 또는
    (b) 서열번호 13과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (c) 서열번호 13과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (d) 서열번호 13과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (e) 서열번호 13과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (f) 서열번호 13과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (g) 서열번호 13과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (h) 서열번호 14와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (i) 서열번호 14와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (j) 서열번호 14와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (k) 서열번호 14와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (l) 서열번호 14와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (m) 서열번호 14와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (n) 서열번호 15와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (o) 서열번호 15와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (p) 서열번호 15와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (q) 서열번호 15와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (r) 서열번호 15와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (s) 서열번호 15와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
    rAAV.
  15. 하기를 포함하는 rAAV:
    (a) AAV 캡시드; 및
    (b) AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈으로서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 프로모터는 CAG 프로모터인 재조합 AAV 게놈.
  16. 하기를 포함하는 rAAV:
    (a) AAV 캡시드; 및
    (b) AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈으로서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터가
    (a) 서열번호 16과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (b) 서열번호 16과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (c) 서열번호 16과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (d) 서열번호 16과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (e) 서열번호 16과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (f) 서열번호 16과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 재조합 AAV 게놈.
  17. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV는 AAV8인, rAAV.
  18. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV는 AAV9인, rAAV.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 코돈 최적화된 것인, rAAV.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 CpG 부위 결핍성인 rAAV.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 rAAV 및 약학적 허용성 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  22. AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 전이유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 전이유전자는 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질을 암호화하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  23. 제22항에 있어서, 상기 산성 올리고펩타이드가 D8인 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는, 폴리뉴클레오타이드.
  25. 제24항에 있어서, 상기 간 특이적 프로모터가
    (a) TBG 프로모터이거나; 또는
    (b) 서열번호 13과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (c) 서열번호 13과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (d) 서열번호 13과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (e) 서열번호 13과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (f) 서열번호 13과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (g) 서열번호 13과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (h) 서열번호 14와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (i) 서열번호 14와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (j) 서열번호 14와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (k) 서열번호 14와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (l) 서열번호 14와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (m) 서열번호 14와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (n) 서열번호 15와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (o) 서열번호 15와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (p) 서열번호 15와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (q) 서열번호 15와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (r) 서열번호 15와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (s) 서열번호 15와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
    폴리뉴클레오타이드.
  26. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는, 폴리뉴클레오타이드.
  27. 제26항에 있어서, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터가
    (g) 서열번호 16과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (h) 서열번호 16과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (i) 서열번호 16과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (j) 서열번호 16과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (k) 서열번호 16과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (l) 서열번호 16과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
    폴리뉴클레오타이드.
  28. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는, 폴리뉴클레오타이드.
  29. 제28항에 있어서, 상기 프로모터가 CAG 프로모터인 폴리뉴클레오타이드.
  30. AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 간 특이적 프로모터가
    (a) TBG 프로모터이거나; 또는
    (b) 서열번호 13과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (c) 서열번호 13과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (d) 서열번호 13과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (e) 서열번호 13과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (f) 서열번호 13과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (g) 서열번호 13과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (h) 서열번호 14와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (i) 서열번호 14와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (j) 서열번호 14와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (k) 서열번호 14와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (l) 서열번호 14와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (m) 서열번호 14와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (n) 서열번호 15와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (o) 서열번호 15와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (p) 서열번호 15와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (q) 서열번호 15와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (r) 서열번호 15와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (s) 서열번호 15와 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
    폴리뉴클레오타이드.
  31. AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 hGALNS 발현 카세트가 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 프로모터가 CAG 프로모터인, 폴리뉴클레오타이드.
  32. AAV-ITR이 측면에 있는 hGALNS 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 간 및 근육 특이적 프로모터가
    (g) 서열번호 16과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (h) 서열번호 16과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (i) 서열번호 16과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (j) 서열번호 16과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (k) 서열번호 16과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    (l) 서열번호 16과 적어도 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
    폴리뉴클레오타이드.
  33. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV가 AAV8인, 폴리뉴클레오타이드.
  34. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV가 AAV9인, 폴리뉴클레오타이드.
  35. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 rAAV 플라스미드.
  36. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제35항의 rAAV 플라스미드를 포함하는 생체외 세포.
  37. 제35항의 rAAV 플라스미드 및 AAV 유전자 Rep, Cap, VA, E2a 및 E4의 뉴클레오타이드 서열을 종합적으로 포함하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드에 의해 생체외 세포를 형질감염시키는 것을 포함하는, rAAV의 제조 방법.
  38. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 rAAV 또는 제21항의 약학적 조성물을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 점액다당류증 IVA형(MPS IVA)으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법.
  39. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항의 rAAV를 상기 인간 대상체에게 투여함으로써, 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 hGALNS는 간 세포에서 생성되고 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 것인, 방법.
  41. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 제13항, 제14항 및 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 rAAV를 상기 인간 대상체에게 투여함으로써, 간 세포에서 생성되고 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 hGALNS의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
  42. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질로서, rAAV 게놈으로부터 생성된 hGALNS인 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
  43. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 산성 올리고펩타이드에 융합된 hGALNS인 융합 단백질로서, rAAV 게놈으로부터 생성되고 간 세포에서 생성되어 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 융합 단백질의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
  44. MPS IVA로 진단된 인간 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, rAAV 게놈으로부터 생성되고 간 세포에서 생성되어 그로부터 분비됨으로써 만노스-6-포스페이트에 의해 글리코실화된 hGALNS의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 것을 포함하는 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV가 AAV8인, 방법.
  46. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV가 AAV9인, 방법.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계가 상기 뼈 및/또는 연골로 전달하는 단계인 방법.
  48. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뼈, 연골, 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계가 (a) 상기 뼈 및/또는 연골, 및 (b) 인대, 반월판, 성장판, 간, 비장, 폐, 신장, 기관, 심근 및/또는 심장 판막으로 전달하는 단계인 방법.
  49. 하기를 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV):
    (a) AAV 캡시드; 및
    (b) AAV 역위 말단 반복체(ITR)가 측면에 있는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(hGALNS) 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 게놈으로서, 상기 hGALNS 발현 카세트는 전이유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 전이유전자가 hGALNS를 암호화하는 재조합 AAV 게놈.
  50. 제49항에 있어서, 상기 AAV가 AAV8인, rAAV.
  51. 제49항에 있어서, 상기 AAV가 AAV9인, rAAV.
  52. 제49항에 있어서, hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 코돈 최적화된 것인, rAAV.
  53. 제49항에 있어서, hGALNS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 CpG 부위 결핍성인, rAAV.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021021661A1 (en) * 2019-07-26 2021-02-04 Regenxbio Inc. Engineered nucleic acid regulatory element and methods of uses thereof
CA3168251A1 (en) * 2020-01-29 2021-08-05 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis iva
WO2023077092A1 (en) * 2021-10-28 2023-05-04 Regenxbio Inc. Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7972593B2 (en) * 2004-06-10 2011-07-05 Saint Louis University Delivery of therapeutic agents to the bone
US20070207139A1 (en) * 2004-06-10 2007-09-06 Saint Louis University, A Non-Profit Organization Enhancing the effect of therapeutic proteins on the central nervous system
US7863238B2 (en) * 2004-06-10 2011-01-04 Saint Louis University Proteins with an attached short peptide of acidic amino acids
CA2750811C (en) * 2009-01-30 2017-08-29 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. Alanine-glyoxylate aminotransferase therapeutics
US20140271550A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Constructs and Methods for Delivering Molecules via Viral Vectors with Blunted Innate Immune Responses
CA2927366A1 (en) * 2013-10-24 2015-04-30 Uniqure Ip B.V. Aav-5 pseudotyped vector for gene therapy for neurological diseases
EP3101125A1 (en) * 2015-06-05 2016-12-07 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Adenoassociated virus vectors for the treatment of mucopolysaccharidoses
US11117942B2 (en) * 2015-08-31 2021-09-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania AAV-EPO for treating companion animals
AU2019275969A1 (en) * 2018-05-30 2020-12-24 Esteve Pharmaceuticals, S.A. Adenoassociated virus vectors for the treatment of mucopolysaccharidoses type IV A

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