JP2014507154A - 組織特異性を改変し、ａａｖ９媒介遺伝子導入を改善するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

ＡＡＶ９細胞表面結合ドメインを含有するカプシドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターのターゲティングおよび／または細胞取り込み効率を改変する方法が記載される。この方法は、末端のシアル酸残基および末端から２番目のβ−ガラクトース残基を有するグリカンを含むクレードＦ細胞表面受容体を改変する工程を含む。この改変は、あるサブセットの細胞において、ＡＡＶ９結合を一時機能的に除去し、それによって別のサブセットの細胞にベクターを新たに向けることにより、ベクターを再ターゲティングさせることを含むことができる。あるいは、この改変は、ノイラミニダーゼで細胞を処理して、細胞表面β−ガラクトースを露出させることにより、細胞取り込み効率を向上させることを含むことができる。さらに、ＡＡＶ９ベクターおよびノイラミニダーゼを含有する組成物が提供される。さらに、固体担体に連結されたβ−ガラクトースを使用して、ＡＡＶ９を精製する方法が提供される。さらに、ガラクトース結合ドメインが変異した変異体ＡＡＶ９、およびＡＡＶ９ガラクトース結合ドメインが操作されたＡＡＶを含む、それらのターゲティング特異性が変化するように改変された変異体ベクターが提供される。

Description

連邦支援の研究または開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金ＮＨＬＢＩ Ｐ０１番号Ｐ０１−ＨＬ−０５９４０７の下で、政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

遺伝子治療のために評価された最初のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、血清型２（ＡＡＶ２）に基づくものであり、インビボ送達に伴い、種々の体細胞に形質導入することが示された［Ｚ．Ｗｕ，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１４：３１６−３２７］。遺伝子治療の最初の臨床的成功の１つは、ＡＡＶ２ベクターを使用して、遺伝的な失明に罹患した患者に対し、網膜下に注入して視覚状況の一部を回復させたことである［Ａ．Ｋｅｒｎ，ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７７：１１０７２−１１０８１；ＡＭ Ｍａｇｕｉｒｅ，ｅｔ ａｌ，（２００８）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３５８：２２４０−２２４８］。しかしながら、他の疾患の治療に対するＡＡＶ２ベクターの適用は、不十分な形質導入効率ならびにカプシドに対する既存の中和抗体およびＴ細胞活性化などの種々の免疫学的問題により、それほど成功していない［上記に引用のＷｕ，ｅｔ ａｌ］。ＡＡＶ２は、細胞認識のための一次受容体としてヘパラン硫酸（ＨＳ）プロテオグリカンを利用することが知られている［上記に引用のＫｅｒｎ ｅｔ ａｌ］。さらなるベクターが、ＡＡＶ１およびその近縁のＡＡＶ６などの他の既存の血清型に由来するＡＡＶカプシドに基づいて開発されており、これらは両方とも、シアル化された糖タンパク質を媒介とした、筋肉への形質導入および細胞結合の増強を示した［Ｚ．Ｗｕ
ｅｔ ａｌ，（２００６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ，８０：９０９３−９１０３；Ｗ．Ｘｉａｏ，ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７３：３９９４−４００３］。ＡＡＶ５に基づくベクターもまた、Ｎ−結合シアル酸（ＳＡ）への結合を必要とするが、脳への直接注入に伴うＣＮＳへの形質導入の増強を示す［ＲＷ Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ，（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６：２０６１０−２０６１６；ＢＬ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７：３４２８−３４３２］。ヒト遺伝子治療のためのＡＡＶベクターの可能性は、ヒトおよび非ヒト霊長類組織中の潜在ゲノムに由来する新規カプシドの大規模かつ多様なファミリーの発見を通して拡大した。これによって、ＡＡＶファミリーの数は、６つの抗原クレードにまたがる１２０を超えるゲノムに拡大した［Ｇ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１００：６０８１−６０８６；Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７８：６３８１−６３８８；Ｇ Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９９：１１８５４−１１８５９］。高解像度のＸ線結晶構造およびより低解像度の低温電子顕微鏡再構成像が、ＡＡＶカプシドの多くに対して決定され、表面に露出した合計９つの超可変領域を含む高度に保存されたコア領域が示された［ＨＪ Ｎａｍ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｊ Ｖｉｒｏｌ，８１：１２２６０−１２２７１］。これらの新規内在性カプシドに基づくベクターの評価は、免疫学的続発症の減少に加え、実質的に向上した形質導入効率の達成の点から、かなり有望なものになっている［上記に引用のＧ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ］。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型９に基づくベクターが、多くの器官に対するインビボ遺伝子送達の最有力候補として出現した。ＡＡＶ９は、心筋症治療のための心臓［ＬＴ Ｂｉｓｈ，ｅｔ ａｌ，（２００８）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９：１３５９
−１３６８］および脊髄性筋萎縮症などの疾患の治療ためのニューロン［Ｓ．Ｄｕｑｕｅ，ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１７：１１８７−１１９６；ＫＤ Ｆｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２７：５９−６５］のターゲティングにおいて極めて有望であることが示された。ＡＡＶ９はまた、体液性応答を誘発することなく肺の肺胞上皮細胞に極めて効率的に形質導入し、ベクターの効率的な再投与を可能にする［ＭＰ Ｌｉｍｂｅｒｉｓ ａｎｄ ＪＭ Ｗｉｌｓｏｎ，（２００６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：１２９９３−１２９９８］。しかしながら、これらの指向性を媒介する受容体はまだ明らかにされていない。

必要とされるのは、宿主内への導入遺伝子のＡＡＶ媒介ターゲティング送達のための安全で効率的な方法である。

本発明は、所望の標的細胞上のＡＡＶ９受容体のアベイラビリティを改変するための、かつベクター効力を改変するための薬理学的手法を提供する。この手法は、末端β−ガラクトースがＡＡＶ９の一次受容体であるという本発明者らの発見により可能になった。さらに、この手法は、ＡＡＶ９のβ−ガラクトース結合ドメインを含有する他のＡＡＶにも適用できることが予想される。

一態様では、本発明は、ＡＡＶ９由来のカプシドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターのターゲティングおよび／または細胞取り込み効率を改変する方法を提供する。本方法は、ベクターに結合するβ−ガラクトース細胞表面受容体のアベイラビリティを改変する組成物を被験体に送達する工程を含む。

一態様では、宿主の標的細胞の細胞表面は、末端のシアル酸残基および末端から２番目のβ−ガラクトース残基を有し、このβ−ガラクトース残基が露出するように本発明により改変されるグリカンを含有する。一実施形態では、本方法は、ノイラミニダーゼと組み合わせてＡＡＶウイルスベクターを被験体に送達する工程を含み、それによって、ノイラミニダーゼは、グリカン上の末端シアル酸を切断して、β−ガラクトシダーゼのアベイラビリティを増大させることによって細胞によるＡＡＶ取り込みの効率を増大させる。被験体は、ノイラミニダーゼで前処置されてもよい。一実施形態では、ノイラミニダーゼは、エキソノイラミニダーゼである（すなわち、それは、内部シアル酸とは対照的に、末端シアル酸を切断の標的にする）。

別の実施形態では、ＡＡＶ９ベクターは、ＡＡＶ９に対する受容体（例えば、末端β−ガラクトース残基を有する細胞表面グリカン）を有する第１サブセットの細胞上に露出した細胞表面の末端β−ガラクトース残基を機能的に除去することにより、末端β−ガラクトースを有する第１サブセットの細胞から他に向けられ、そのため、ＡＡＶは、末端β−ガラクトースを有する、被験体の第２サブセットの細胞を新たな標的にし、かつ／または第２サブセットの細胞に接触するＡＡＶの数が増加し、それによって、これらの細胞による取り込みが増加する。一実施形態では、第１サブセットの細胞を機能的に除去する成分が、第１サブセットの細胞に局所的に送達される。一実施形態では、β−ガラクトースは、ＡＡＶ９細胞表面受容体を有する第１サブセットの細胞において酵素的に除去され、それによって、前記サブセットの細胞によるＡＡＶ取り込みが低下または消失し、ＡＡＶ９受容体（末端β−ガラクトース）を有する、被験体の第２サブセットの細胞がＡＡＶの新たな標的になる。一実施形態では、β−ガラクトースは、ＡＡＶ９ベクターと組み合わせて、ガラクトシダーゼを第１サブセットの細胞に送達することにより酵素的に除去される。別の実施形態では、末端β−ガラクトース残基に結合するレクチンが被験体に送達され
て、これらの残基に結合することによりβ−ガラクトースが遮断される。

さらに別の態様では、本発明は、ノイラミニダーゼおよびＡＡＶ９ベクターを含む組合せ剤を被験体に送達することにより、末端シアル酸および末端から２番目のβ−ガラクトース残基を有する表面グリカンを有する細胞へのＡＡＶ９ベクターの遺伝子送達を増大させる方法であって、前記ベクターが、ＡＡＶ逆方向末端反復配列を有するミニ遺伝子および宿主細胞においてその発現を指示する調節配列に作動的に連結された異種遺伝子をさらに含む方法を提供する。

一態様では、組成物は、野生型（ｗｔ）ＡＡＶ９が誘導気道に形質導入する天然の能力は実質的に低下または消失するが、ｗｔＡＡＶ９と同様な肝臓および心臓の形質導入は保持される変異体ＡＡＶ９ベクターをさらに提供する。一実施形態では、変異体ＡＡＶは、位置４７０の天然アミノ酸（Ａｓｎ）が置換されているＡＡＶ９カプシドを有する。一例では、この置換はアラニンである。別の実施形態では、変異体ＡＡＶは、位置４４６の天然アミノ酸（Ｔｙｒ）が置換されているＡＡＶ９カプシドを有する。一例では、この置換はアラニンである。さらに別の実施形態では、変異体ＡＡＶは、位置２７１の天然アミノ酸（Ａｓｐ）が置換されているＡＡＶ９カプシドを有する。一例では、このアミノ酸はアラニンで置換されている。

別の態様では、本発明は、位置２７１、４４６、および４７０のアミノ酸の１つまたは複数をアラニンまたは別のアミノ酸、すなわち、好ましくは小さく非電荷の側鎖を有するアミノ酸に改変することにより、気道上皮へのＡＡＶ９ベクターのターゲティングは消失させるが、肝臓および心臓に形質導入するその能力は保持させる方法を提供する。別の実施形態では、アミノ酸は、結合部位のコンフォメーションに影響を及ぼさない、メチル基を伴う小さな側鎖を有する。

さらなる態様では、本発明は、ＡＡＶ９ガラクトース結合ドメインを含有するように操作されたＡＡＶカプシドを有するＡＡＶベクターを提供する。一実施形態では、操作されたＡＡＶカプシドは、親ＡＡＶ９の対応するアミノ酸位置に挿入された、ＡＡＶ９のＹ４４６、Ｎ４７０、Ａ４７２、およびＶ４７２ならびにＡＡＶ９のＤ２７１、Ｎ２７２、およびＷ５０３を含有する。

さらに別の実施形態では、本方法は、ＡＡＶ９由来のカプシドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターを単離するための方法を提供する。この方法は、（ａ）固体担体に連結されたβ−ガラクトースを含む分子に接触させるように、ＡＡＶ９由来のカプシドを有するＡＡＶウイルスベクターを含む試料を曝露して、それによってβ−ガラクトースに対する結合部位を有する精製標的を、その分子に選択的に結合させる工程と、（ｂ）固体担体を洗浄して、固体担体に非特異的に結合している物質を試料から除去する工程と、（ｃ）固体担体からウイルスベクターを分離する工程とを含む。

さらなる実施形態では、本発明は、（ａ）ノイラミニダーゼ、（ｂ）ＡＡＶ９カプシドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、および（ｃ）薬学的に許容可能な担体の組合せを含む組成物を提供する。このベクターは、ＡＡＶ逆方向末端反復配列を有するミニ遺伝子および宿主細胞においてその発現を指示する調節配列に作動的に連結された異種遺伝子さらに含む。

さらに別の実施形態では、本発明は、（ａ）レクチン、（ｂ）ＡＡＶ９カプシドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、および（ｃ）薬学的に許容可能な担体の組合せを含む組成物を提供する。

本発明のこれらの態様および他の態様は、本発明の以下の詳細な説明から容易に明らかになる。

シアル酸（ＳＡ）が欠失しているグリカンへのＡＡＶ結合に関する研究結果を示す。図１Ａは、各細胞型または酵素処理についてのＮおよびＯ−結合グリカンの概略図である。図１Ｂは、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）による処理によりＰｒｏ−５細胞の表面からＳＡを除去し、ベクターをＮＡ処理および未処理の細胞に適用して結合を評価したときの結果を示すグラフである。空のＡＡＶ９カプシドについて、平均相対蛍光単位（ＲＦＵで示される）に基づいて、４６５の種々のグリカンに対する結合をスクリーニングし、ＡＡＶ９に結合した上位５つのグリカンを同定した（図示せず）。図１Ｃは、上位５つのグリカンの構造およびそれらの概念図である。％ＣＶ：パーセントとして表現した変動係数（データの平均値に対する標準偏差の比）。 ＣＨＯ細胞の結合および形質導入についての、ガラクトースに対するＡＡＶ９の依存性に関する研究結果を示す。図２Ａは、ｆｆＬｕｃを発現するＡＡＶ２、６、または９を、Ｐｒｏ−５、Ｌｅｃ−２、またはＬｅｃ−８のいずれかに加えて４℃で１時間インキュベートし、全ＤＮＡを単離して、結合したゲノムコピーをｑＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。図２Ｂは、細胞を３７℃で４８時間インキュベートし、ｆｆＬｕｃ発現について分析した結果を示すグラフである。図２Ｃは、ＡＡＶ結合に対して競合する種々のレクチンの存在下で、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９をＮＡ処理Ｐｒｏ−５細胞に適用した結果のグラフを示す。図２Ｄは、ＡＡＶ形質導入に対して競合する種々のレクチンの存在下でＡＡＶ２およびＡＡＶ９をＮＡ処理Ｐｒｏ−５細胞に適用した結果を示すグラフである。ＲＣＡは細胞に対するその毒性のために形質導入研究には使用されなかった。図２Ｅは、ＮＡまたはＮＡおよびβ−ガラクトシダーゼの両方（ＮＡおよびβ−ｇａｌ）のいずれかで処理されたＰｒｏ−５細胞にＡＡＶ２およびＡＡＶ９を加えてＡＡＶ結合を評価した結果のグラフを示す。図２Ｆは、ＮＡまたはＮＡおよびβ−ガラクトシダーゼの両方（ＮＡおよびβ−ｇａｌ）のいずれかで処理されたＰｒｏ−５細胞にＡＡＶ２およびＡＡＶ９を加えてＡＡＶ形質導入を評価した結果を示すグラフである。ｆｆＬｕｃ、ホタルルシフェラーゼ；ＲＬＵ、相対光単位。 ガラクトース結合に必要とされるＡＡＶ９カプシドアミノ酸に関する研究結果を示す。図３Ａは、荷電または極性側鎖を含有する、ＡＡＶ９にユニークな特定のアミノ酸をアラニン（Ａ）に変異させて、ガラクトース結合を担うアミノ酸を同定した結果を示すグラフである。１４の変異体ベクターを構築し、天然アミノ酸とその特定位置ならびにその後の新たなアミノ酸−アラニン、Ａによって命名した。Ｐｒｏ−５、Ｌｅｃ−２、およびＬｅｃ−８細胞への結合について、ＡＡＶ９と比較して変異体を試験した。ベクターを各細胞株に加え（５×１０^９ＧＣ）、４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、全ＤＮＡを単離して、結合ベクターＧＣを定量ＰＣＲにより測定した。Ｎ４７０がＡＡＶ９ガラクトース結合に必要であることが判明した。図３Ｂは、次いで、Ｎ４７０に近接して位置する１９のアミノ酸を変異させて、ＡＡＶ９ガラクトース結合に対する効果を検討した結果を示すグラフである。さらに、セリンまたはアスパラギン酸のいずれかへの非極性アミノ酸Ａ４７２またはＶ４７３の変異を含有する４つの他の変異体も生成させた。次いで、上記に記載のように、これらの変異体ベクターの結合を評価した。Ａ４７２およびＶ４７３に加えて、Ｄ２７１、Ｎ２７２、Ｙ４４６およびＷ５０３も、ＡＡＶ９ガラクトース結合にとって重要であることが見出された。データは平均＋ＳＤとして示される。 変異体ベクターのインビトロ形質導入効率を示す。図４Ａは、すべてｆｆＬｕｃを発現する、ガラクトースに結合する能力を失った５つの変異体（Ｎ４７０Ａ、Ｄ２７１Ａ、Ｎ２７２Ａ、Ｙ４４６Ａ、およびＷ５０３Ａ）ならびにガラクトース結合を保持した２つの変異体（Ｓ４６９ＡおよびＥ５００Ａ）およびＡＡＶ９対照ベクターを、１０９ＧＣ／ウェル（ＭＯＩ＝１０４）でＬｅｃ−２細胞に加え、４８時間後にｆｆＬｕｃ発現を測定した結果を示すグラフである。図４Ｂは、すべてｆｆＬｕｃを発現する、ガラクトースに結合する能力を失った５つの変異体（Ｎ４７０Ａ、Ｄ２７１Ａ、Ｎ２７２Ａ、Ｙ４４６Ａ、およびＷ５０３Ａ）ならびにガラクトース結合を保持した２つの変異体（Ｓ４６９ＡおよびＥ５００Ａ）およびＡＡＶ９対照ベクターを、１０９ＧＣ／ウェル（ＭＯＩ＝１０４）でＰｒｏ−５細胞に加え、４８時間後にｆｆＬｕｃ発現を測定した結果を示すグラフである。データは平均＋ＳＤとして示される。ＲＬＵ、相対光単位。 ｒＡＡＶ２／９インストール後の鼻における導入遺伝子発現に対する、ノイラミニダーゼによる前処理の効果に関するインビボ研究の結果を示す線グラフである。１、３、７、１４、２１、および２８日目（感染後の日数（期間））に、鼻腔内でルシフェリンによりイメージングされたルシフェラーゼの全放射フラックス（１秒当たりの光子（ｐ／ｓ））として結果を示す。

標的細胞上のＡＡＶ９受容体のアベイラビリティを改変するための、かつベクター効力を改変するための薬理学的手法を説明する。この手法は、末端β−ガラクトースがＡＡＶ９に対する一次受容体であるという本発明者らの発見により可能になった。本明細書を通した便宜のために、ＡＡＶ９に言及する。しかしながら、細胞表面の末端β−ガラクトースに対するＡＡＶ９カプシド結合ドメインを含有する別のＡＡＶ、または細胞表面の末端β−ガラクトースに対する別のＡＡＶカプシド結合ドメインを含有するＡＡＶ、例えば、クレードＦ由来の別のＡＡＶに置き換えることができることは理解されよう。加えて、本明細書に記載の方法および組成物は、ウイルス粒子であるベクター（すなわち、ウイルスベクターの取り込みに続いて宿主細胞に送達されるゲノム配列を、その中にパッケージングしたＡＡＶカプシド）ならびに空のＡＡＶ９カプシド（その中にパッケージングされた配列を含まないインタクトＡＡＶカプシド）にとって有用である。さらに、本発明は、野生型カプシドおよび操作されたカプシドの両方に対して利用可能であると予想される。

一実施形態では、可変領域Ｉにより形成される、ＡＡＶカプシドの２回軸および５回軸に面する突起外表面のポケットを含むＡＡＶ９ガラクトース結合ドメインを含有するように操作されたＡＡＶカプシドを有するＡＡＶベクターが提供される。一実施形態では、操作されたＡＡＶカプシドは、親ＡＡＶ９の対応するアミノ酸位置に挿入されたＡＡＶ９のＹ４４６（可変領域（ＶＲ）ＩＶの直前の保存ドメイン）、Ｎ４７０（ＶＲ ＩＶ）、Ａ４７２（ＶＲ ＩＶ）、およびＶ４７３（ＶＲ ＩＶ）、ならびにＡＡＶ９のＤ２７１（ＶＲ Ｉ）、Ｎ２７２（ＶＲ Ｉ）、およびＷ５０３（ＶＲ Ｖ）を含有する。親ＡＡＶは、これらのアミノ酸の１つまたは複数を天然に有するが、ガラクトースを天然に結合することはなく、これらのアミノ酸のすべてを天然に含有することもない。例えば、Ｙ４４６、Ｄ２７１、およびＮ２７２は多くの血清型の間で保存される；一方、Ｎ４７０は保存されない。したがって、改変ＡＡＶカプシドは、Ｎ４７０（ＡＡＶ９の位置番号に基づいて）の操作を必要とするにすぎない可能性がある。しかしながら、そのようなＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９結合ドメインを提供するために上記のアミノ酸の１つまたは複数の操作を必要することがある。一実施形態では、操作されたＡＡＶ９は、その野生型においてシアル酸結合を有するＡＡＶに由来するが、ガラクトースへの操作のために、立体障害によりシアル酸結合を欠失している。

別の態様では、本発明は、位置２７１、４４６、および４７０（可変領域ＩＶ）のアミノ酸の１つまたは複数をアラニンまたは別のアミノ酸に改変することにより、気道上皮へのＡＡＶ９ベクターのターゲティングは消失させるが、肝臓および心臓に形質導入するその能力は保持させる方法を提供する。一実施形態では、野生型のアミノ酸と置換するアミノ酸は、小さく非電荷の側鎖を有するアミノ酸である。別の実施形態では、このアミノ酸は、メチル基がある小さな側鎖を有し、例えば、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、およびＬｅｕである。さらに別の実施形態では、ガラクトース結合機能を消失させるように結合部位のコンフォ
メーションに影響を及ぼすことがない別の適切なアミノ酸が選択される。例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｓｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐである。一実施形態では、このアミノ酸は、プロリン以外の群から選択される。

さらに、誘導気道細胞、心臓、および肝臓を標的とする、ｗｔＡＡＶ９とは異なるターゲティング効率を有する変異体ＡＡＶ９ベクターが提供される。一例では、そのような変異体ＡＡＶ９ベクターは、位置２７１、４４６、および４７０のアミノ酸の１つまたは複数を改変することにより、気道上皮へのターゲティングは消失するが、肝臓および心臓に形質導入するその能力は保持する。一実施形態では、野生型のアミノ酸と置換するアミノ酸は、小さく非電荷の側鎖を有するアミノ酸である。別の実施形態では、このアミノ酸は、メチル基がある小さな側鎖を有し、例えば、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、およびＬｅｕである。さらに別の実施形態では、ガラクトース結合機能を消失させるように結合部位のコンフォメーションに影響を及ぼすことがない別の適切なアミノ酸が選択される。例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐである。一実施形態では、このアミノ酸は、プロリン以外の群から選択される。

一実施形態では、本発明は、野生型（ｗｔ）ＡＡＶ９が誘導気道に形質導入する天然の能力は実質的に低下または消失するが、ｗｔＡＡＶ９と同様な肝臓および心臓の形質導入は保持される変異体ＡＡＶ９ベクターを提供する。一実施形態では、変異体ＡＡＶは、位置４７０の天然アミノ酸（Ａｓｎ）が置換されているＡＡＶ９カプシドを有する。一例では、この置換はアラニンである。別の実施形態では、変異体ＡＡＶは、位置４４６の天然アミノ酸（Ｔｙｒ）が置換されているＡＡＶ９カプシドを有する。一例では、この置換はアラニンである。さらに別の実施形態では、変異体ＡＡＶは、位置２７１の天然アミノ酸（Ａｓｐ）が置換されているＡＡＶ９カプシドを有する。一例では、このアミノ酸はアラニンで置換されている。

Ｉ．定義
クレードＦは、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアライメントに基づいて、（少なくとも１０００レプリケートの）少なくとも７５％のブートストラップ値および０．０５以下のポアソン補正距離尺度による近隣結合アルゴリズムを使用して決定された場合に、ＡＡＶ９、ｈｕ．１４／ＡＡＶ９［ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５７９］、ｈｕ．３１［ＡＹ５３０５９６］、およびｈｕ．３２［ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５９７］と系統発生的に関連するＡＡＶ群である。近隣結合アルゴリズムは、文献に広範囲に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照のこと。このアルゴリズムを実行するために使用することができるコンピュータプログラムが入手可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、改変Ｎｅｉ−Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実行する。これらの手法およびコンピュータプログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用すると、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で同定されたクレードの１つに含まれるか、他のクレードに含まれるか、またはこれらのクレードの外であるか容易に判定することができる。

クレードＦ ＡＡＶは天然のＡＡＶ ｖｐ１カプシドであってもよい。しかしながら、ＡＡＶは天然のＡＡＶに限定されない。このクレードは、限定はされないが、組換え、改変または変更、操作、キメラ、ハイブリッド、合成、人工等のＡＡＶを含む、非天然ＡＡＶを包含することができ、これらは、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアライメントに基づいて、（少なくとも１０００レプリケートの）少なくとも７５％および０．０５以下のポ
アソン補正距離尺度による近隣結合アルゴリズムを使用して決定された場合に、系統発生的に関連する。

別の実施形態では、組換えＡＡＶは、細胞表面の末端β−ガラクトースに結合するＡＡＶ９の結合ドメインを含有するように操作されたカプシドを有するクレードＦ ＡＡＶ以外のクレードに由来してもよい。

別の実施形態では、本発明で使用されるＡＡＶは、ＡＡＶ９のｖｐ３タンパク質（配列番号１のアミノ酸２０３〜７３６）と少なくとも９５％同一であり、ＡＡＶ９ ｖｐ２（配列番号１のほぼアミノ酸１３８〜７３６）と少なくとも９５％同一であり、かつ／または完全長ａａｖ９ ｖｐ１カプシド（配列番号１のアミノ酸１〜７３６または２〜７３６）と少なくとも９５％同一であるカプシドを含むＡＡＶベクターである。別の実施形態では、ＡＡＶは、野生型ＡＡＶ９（配列番号１）のｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３に対して、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％であり、β−ガラクトースに対するＡＡＶ９細胞表面結合ドメインを含有する。ｖｐ３ドメインが可変領域の大部分を含有するので、ＡＡＶが、ＡＡＶ９のｖｐ１上でＡＡＶ９と９５％の同一性を有する一方、ＡＡＶ９のｖｐ３とより高い同一性を有する可能性があることは、当業者により理解されよう。一実施形態では、ＡＡＶベクターを調製するために使用されるＡＡＶは、ＡＡＶ９のｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３と１００％同一であるカプシドを有する。さらに別の実施形態では、ＡＡＶベクターを調製するために使用されるＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシドを有する。ただし、それは本明細書で定義されるような１つまたは複数の変異を含有する。

用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、アミノ酸またはそれらの断片を指す場合には、適切なアミノ酸の挿入または欠失を入れて、別のアミノ酸（またはその相補鎖）と最適にアライメントされた場合、アライメントされた配列の少なくとも約９５〜９９％においてアミノ酸配列同一性があることを指す。好ましくは、相同性は、完全長配列、またはその１つのタンパク質、例えばｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、もしくは少なくとも８個以上のアミノ酸長、望ましくは少なくとも１５個のアミノ酸長であるそれらの断片にわたるものである。適切な断片の例が、本明細書に記載される。

用語「高度に保存された」により、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％超の同一性を意味する。同一性は、当業者に公知のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを使用して、当業者により容易に決定される。

一般に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を指す場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「アライメントされた」配列に関して決定される。「アライメントされた」配列または「アライメント」は、多くの場合、参照配列と比較して、欠失または追加の塩基またはアミノ酸に対する補正を含む、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。核酸配列の文脈における用語「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または「パーセント同一性」は、最大一致になるようにアライメントされた場合に同一である、２つの配列中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの完全長にわたるものでも、遺伝子コード配列の完全長にわたるものでもよく、または少なくとも約５００〜５０００ヌクレオチドの断片が望ましい。しかしながら、例えば少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０〜２４ヌクレオチド、少なくとも２８〜３２ヌクレオチド、少なくとも約３６以上のヌクレオチドのより小さな断片間の同一性が望ましいこともある。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質の完全長またはその断片にわたるアミノ酸配列について容易に決定することができる。適切には、断片は少なくとも約８アミノ酸長であり、最大約７００のアミ
ノ酸であってもよい。適切な断片の例が、本明細書に記載される。

アライメントは、種々の公的または市販の多重配列アラインメントプログラムのいずれかを使用して実施される。このようなプログラムの例としては、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」、および「ＭＥＭＥ」が挙げられ、これらはインターネット上のウェブサーバーを介してアクセス可能である。このようなプログラムの他の供給源は、当業者には公知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ
ＮＴＩユーティリティも使用される。上記のプログラムに含有されるものを含めて、ヌクレオチド配列同一性を評価するために使用できる、当技術分野で公知のいくつかのアリゴリズムもまた存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１の中のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を使用して比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、クエリー配列と検索配列との間の最良のオーバーラップ領域のアライメントおよびパーセント配列同一性を提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧバージョン６．１に提供されるように、そのデフォルトパラメーター（語長６およびスコアリングマトリックスについてはＮＯＰＡＭファクター）と共にＦａｓｔａ（商標）を使用して決定することができる。また、多重配列アラインメントプログラムは、アミノ酸配列についても利用可能であり、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、および「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムがある。一般に、これらのプログラムはいずれもデフォルト設定で使用される。ただし、当業者は必要に応じてこれらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、参照のアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるものと少なくとも同レベルの同一性またはアライメントを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、ＪＤ Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，”Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２−２６９０を参照のこと。

用語「血清型」は、他のＡＡＶ血清型とは血清学的に異なるカプシドを有するＡＡＶに対して区別するものである。血清学的弁別は、他のＡＡＶと比較した場合に、ＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。交差反応性は、典型的には、中和抗体アッセイで測定される。このアッセイのために、アデノ随伴ウイルスを使用して、ウサギまたは他の適切な動物モデルにおいて、特定のＡＡＶに対するポリクローナル血清が生成される。このアッセイでは、次いで、特定のＡＡＶに対して生成された血清が同じ（同種）または異種のＡＡＶのいずれかを中和するその能力が試験される。５０％の中和を達成する稀釈度が中和抗体力価と見なされる。２つのＡＡＶについて、異種の力価を同種の力価で除した商が、相反的に１６未満である場合、それら２つのベクターは同じ血清型と見なされる。逆に、同種の力価に対する異種の力価の比が、相反的に１６以上である場合、２つのＡＡＶは別々の血清型と見なされる。

本明細書で使用される場合、「末端」β−ガラクトースは、ＡＡＶ９ガラクトース結合ドメインへの結合に立体的にまたは他の方法で利用できるように露出される、野生型結合部位を有するＡＡＶ９に対する細胞表面受容体である。

他に指定がない限り、用語「約」は、数を修飾するために使用される場合、±１０％の変動を意味する。

本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、他の成分、要素、整数、工程等について包括的である。逆に、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および
その変形体は、他の成分、要素、整数、工程等について排他的である。

ＩＩ．治療レジメン
一態様では、本発明は、ＡＡＶ９カプシドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターのターゲティングおよび／または細胞取り込み効率を改変する方法を提供する。本方法は、ＡＡＶ９をベースとした送達ビヒクルに結合するようにβ−ガラクトースのアベイラビリティを改変する組成物を被験体に送達する工程を含む。一実施形態では、所望の標的細胞の表面は、末端のシアル酸残基および末端から２番目のβ−ガラクトース残基を有し、このβ−ガラクトース残基が露出するように本発明により改変されるグリカンを含有する。

一実施形態では、本方法は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）と組み合わせてＡＡＶウイルスベクターを被験体に送達する工程を含み、それによって、ノイラミニダーゼは、細胞表面上の末端シアル酸を切断して、細胞によるＡＡＶ取り込みの効率を増大させる。被験体は、ノイラミニダーゼで前処置されてもよい。

前処置により、その処置（例えば、ノイラミニダーゼ）が、ＡＡＶ９媒介治療の前に被験体に送達されることが意味される。典型的には、これは、ＡＡＶ９媒介治療の投与前に前処置の投与を含む。しかしながら、特定の実施形態では、ＡＡＶ９ベクターによりコードされた導入遺伝子が、前処置に伴い活性化される調節可能プロモーターの制御化にあることがある。そのような実施形態では、ＡＡＶ９ベクターは、前処置投与の前、または実質的にそれと同時に投与することができるが、構成的プロモーターのための活性化剤の投与は前処置の後である。

シアリダーゼとしても知られるノイラミニダーゼは、具体的にはシアル酸を切断の標的にするもので、種々の供給源から商業的に購入または入手することができる。一実施形態では、ノイラミニダーゼは、エキソノイラミニダーゼである。すなわち、それは、具体的には、内部シアル酸とは対照的に、末端シアル酸を切断の標的にする。一実施形態では、エキソノイラミニダーゼは、末端シアル酸残基のα−（２→３）−、α−（２→６）−、α−（２→８）−グリコシド結合の加水分解に機能する。本発明に有用なノイラミニダーゼの例としては、例えば、細菌ノイラミニダーゼ、ウイルスおよび哺乳動物のノイラミニダーゼが挙げられる。ノイラミニダーゼ（アシル−ノイラミニルヒドロラーゼ：ＥＣ３．２．１．１８）は、これらに限定されないが、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、または哺乳動物供給源を含む、いずれの供給源に由来するものであってもよい。一実施形態では、ノイラミニダーゼは、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のノイラミニダーゼＩＩＩ型（Ｓｉｇｍａ）などの細菌ノイラミニダーゼである。しかしながら、他のノイラミニダーゼ型が選択されてもよい。別の実施形態では、ウイルスノイラミニダーゼ、例えば、インフルエンザノイラミニダーゼを選択することができる。さらに別の実施形態では、哺乳動物ノイラミニダーゼを、例えば、ヒト、齧歯類、サル、または別の哺乳動物供給源の中から選択することができる。

ノイラミニダーゼは、液体としてまたは固体として製剤化することができ、例えば生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ）または生分解性（ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ）のマトリックスに埋め込まれたかまたは混合されたものを含めて、例えば、ノイラミニダーゼは従来の医薬賦形剤と混合される。マトリックスは除放性マトリックスであってもよい。これらのマトリックスは、当業者には周知である。ノイラミニダーゼは注射によりまたは舌下経路により投与することができる。一実施形態では、ビヒクルは、不活性容器内に含有される水溶液（例えば、緩衝生理食塩水を含む生理食塩水、または他の適切な液体担体）
である。別の変形形態では、組成物は坐薬形態である。液体形態の組成物は、静脈内、筋肉内、および皮下経路、舌下または鼻腔内経路を含む、標準的方法により投与することができる。一実施形態では、担体は、０．９％塩化ナトリウム中の０．１％〜０．４％のフェノールである（米国薬局方）。

ノイラミニダーゼは、例えば、約３００Ｕ〜約５０００Ｕのノイラミニダーゼ用量で、すなわち、１用量当たりノイラミニダーゼ約１５ｍｇ〜２５０ｍｇの相当量を投与することができる。あるいは、より低用量、例えば約０．０００１ｍｇ〜０．０１ｍｇの範囲で使用してもよい。あるいは、これら２つの範囲の間の量、例えば約０．０１ｍｇ〜約２５０ｍｇを使用してもよい。

一実施形態では、本発明は、ＡＡＶ９ウイルスベクター（またはＡＡＶ９細胞（ガラクトース）結合ドメインを有するクレードＦもしくはベクター）およびノイラミニダーゼを被験体に実質的に同時に送達するＡＡＶ媒介遺伝子送達を提供する。ノイラミニダーゼは、ＡＡＶベクターとは別個に製剤化し、かつ／または異なる経路であるが実質的に同時に送達することができる。あるいは、ＡＡＶウイルスベクターは、ノイラミニダーゼをさらに含む担体で被験体に送達される。

体内では、ノイラミニダーゼなどの酵素は、その効果がほんの一時的であるように天然に除去されることが期待されるが、一実施形態では、長引くいかなるノイラミニダーゼ作用も中和するためにノイラミニダーゼ阻害剤を送達することができる。適切なノイラミニダーゼ阻害剤が当技術分野では公知であり、市販の抗ウイルス薬、例えば、Ｏｓｅｌｔａｍｉｎｉｖｉｒ（タミフル）、ザナミビル（リレンザ）、Ｌａｎｉｍａｖｉｒ（イナビル）、およびペラミビルを挙げることができる。ｏｓｅｌｔａｍｉｎｉｖｉｒなどの全身性ノイラミニダーゼ阻害剤に対する典型的な投薬レジメンは、処方どおり、経口的に約７５ｍｇ、１日２回を５日間以上である。しかしながら、本発明での使用のためには、より短い投薬レジメン、例えば１〜２日、および／またはより低いかまたはより高い１日用量が所望されることがある。あるいは、ザナミビルなどの吸入ノイラミニダーゼ阻害剤が、肺に関連する適用のために所望されることがある。典型的には、処方どおり、この薬物の用量は、吸入による１０ｍｇ、１日２回を５日間以上である。しかしながら、本発明での使用のためには、より短い投薬レジメン、例えば１〜２日、および／またはより低いかまたはより高い１日用量が所望されることがある。あるいは、別のタイプのノイラミニダーゼ阻害剤が選択されてもよい。

別の態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９に対する受容体（例えば、β−ガラクトース残基を有する細胞表面グリカン）を有する第１サブセットの細胞上に露出した細胞表面β−ガラクトース残基を機能的に除去することにより、クレードＦ受容体を有する第１サブセットの細胞から他に向けられ、そのため、ＡＡＶは、クレードＦ受容体を有する、被験体の第２サブセットの細胞を新たな標的にし、かつ／または第２サブセットの細胞に接触するＡＡＶの数が増加し、それによって、これらの細胞による取り込みが増加する。一実施形態では、β−ガラクトースは、ＡＡＶ細胞表面受容体を有する第１サブセットの細胞において酵素的に除去され、それによって、前記サブセットの細胞によるＡＡＶ取り込みが低下または消失し、ＡＡＶ９受容体を有する、被験体の第２サブセットの細胞がＡＡＶの新たな標的になる。

一実施形態では、第１サブセットの細胞の表面上にある結合ドメインを機能的に遮断する成分が、第１サブセットの細胞に局所的に送達される。典型的には、この遮断効果は、送達部位近傍に位置する細胞に相対的に局在化したままである。例えば、局所送達は、例えば吸入、鼻腔内インストール、関節への直接注射、または眼への直接送達によって、また当技術分野で公知の種々の他の方法によって達成することができる。

ガラクトシダーゼ、レクチン、または他の遮断成分の効果を除去するために化合物を送達することができる。例えば、抗β−ガラクトシダーゼを被験体に送達することができる。例えば、ＧＴ−２５５８［米国特許第４，４９７，７９７号明細書］またはフェニルエチル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド［ＰＥＴＧ］などの化合物を利用することができる。あるいは、β−ガラクトシダーゼまたはレクチンのクリアランスを促進するために別の成分を送達することができる。しかしながら、その成分（例えば、ガラクトシダーゼ酵素）は被験体の体内で容易に除去されると予想される。

一実施形態では、β−ガラクトースは、ＡＡＶベクターと組み合わせて、ガラクトシダーゼを第１サブセットの細胞に送達することにより酵素的に除去される。種々のβ−ガラクトシダーゼを使用することができる。一実施形態では、アイソフォーム１、［ＧＬＢ１、ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿０００４０４；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１６２７８を使用することができる。適切なβ−ガラクトシダーゼはまた、市販品を、例えばＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、およびＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）供給源由来）から入手可能である。ノイラミニダーゼについて上記したように、この酵素を製剤化し送達することができる。１用量当たり約０．０００１ｍｇ〜約２５０ｍｇまたは１用量当たり約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲のβ−ガラクトシダーゼ用量を利用することができる。これらの用量は必要または所望に応じて調整することができる。β−ガラクトシダーゼは、ガラクトースを切断するように機能し、ガラクトースが切断された細胞によるＡＡＶ９取り込みを顕著に低下または実質的に消失させる。このようにして、ＡＡＶ９ベクターは、細胞表面ガラクトースを保持する他の細胞に新たに向けられる。

別の実施形態では、β−ガラクトース残基および特に末端β−ガラクトース残基に結合するレクチンが、本明細書に記載のように、ＡＡＶベクターと組み合わせて被験体に送達される。有用なレクチンの中には、ヒトスカベンジャー受容体Ｃ型レクチン（ＳＲＣＬ）およびヒトマクロファージカルシウム依存性（Ｃ型）レクチンなどのカルシウム依存性（Ｃ型）レクチンがある。他の有用なレクチンとしては、エリスリナ・クリスタガリ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ Ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ）レクチン（ＥＣＬ）およびマクロファージガラクトースレクチン（ＭＧＬ）が挙げられる。さらに他のレクチンとしては、レクチンピーナッツアグルチニンまたは小麦胚芽アグルチニンが挙げられる。これらのレクチンのいくつかは、文献に記載されており、かつ／または商業的供給源（例えば、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）を通して入手することができる。本明細書に記載のように、レクチンは適切な液体担体で製剤化することができ、２００〜１０，０００μｇ／ｍｌ、例えば２００〜５０００μｇ／ｍｌ、例えば２００〜３０００μｇ／ｍｌ、例えば２００〜２０００μｇ／ｍｌ、例えば２００〜１５００μｇ／ｍｌレクチンの範囲で含むことができる。

さらに別の実施形態では、抗末端ガラクトース抗体を被験体に送達することができる。

本明細書に記載のような、ＡＡＶ９ベースのベクターおよび他のＡＡＶベクターを調製する方法は公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０号明細書（２００７年２月１５日）を参照されたい。本発明は、ＡＡＶ９または他のクレードＦ ＡＡＶのアミノ酸配列の使用に限定されるものではないが、例えば化学合成、他の合成手法、または他の方法を含む、当技術分野で公知の他の方法により生成される末端β−ガラクトース結合を含有するペプチドおよび／またはタンパク質を包含する。本明細書に提供されるＡＡＶカプシドのいずれの配列も、種々の手法を使用して容易に生成することができる。適切な生成手法が当業者には周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。あるいは、ペプチドはまた、周知の固相ペプチド合成法により合成することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９６２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９；Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９）ｐｐ．２７−６２）。これらおよび他の適切な生成方法は、当業者の知識の範囲内であり、本発明を限定するものではない。

本明細書に記載のような、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、β−ガラクトースに対する細胞結合ドメインを有するＡＡＶ）を生成する方法は、公知である。そのような方法は、ＡＡＶカプシド；機能的なｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）および導入遺伝子で最低限構成されるミニ遺伝子；およびＡＡＶカプシドタンパク質へのミニ遺伝子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能をコードする核酸配列を含有する宿主細胞を培養する工程を含む。

ＡＡＶカプシドの中にＡＡＶミニ遺伝子をパッケージングするために宿主細胞で培養される必要な成分は、トランスで宿主細胞に提供されてもよい。あるいは、必要な成分（例えば、ミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）の任意の１つまたは複数は、当業者に公知の方法を使用して、必要な成分の１つまたは複数を含有するように操作された安定な宿主細胞により提供されてもよい。最適には、そのような安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下にある、必要な成分を含有することになる。しかしながら、必要な成分は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。適切な誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの例が、導入遺伝子との使用に適した調節エレメントの論述の中で本明細書に提示される。さらに別の代替形態では、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された成分および１つまたは複数の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された成分を含有することができる。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下にあるＥ１ヘルパー機能を含有する）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下にあるｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞を生成することができる。さらに他の安定な宿主細胞は、当業者により生成可能である。

本発明のｒＡＡＶを生成するのに必要なミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、その上に担持される配列を移入する任意の遺伝因子の形態でパッケージング宿主細胞に送達することができる。選択された遺伝因子は、本明細書に記載のものを含む任意の適切な方法によって送達することができる。本発明の任意の実施形態を構築するのに使用される方法は、核酸操作の技術者には公知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成手法を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、適切な方法の選択により、本発明が限定されることはない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２および米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照されたい。

他に指定がない限り、ＡＡＶ ＩＴＲ、および本明細書に記載の他の選択されたＡＡＶ成分は、任意のＡＡＶの中から容易に選択することができる。これらのＩＴＲまたは他のＡＡＶ成分は、当業者が利用可能な手法を使用して、ＡＡＶ配列から容易に単離することができる。そのようなＡＡＶは、学術的、商業的、または公的な供給源（例えば、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から単離または入手することができる。あるいは、ＡＡ
Ｖ配列は、文献または例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＰｕｂＭｅｄ（登録商標）等のデータベースから入手可能であるなどの公表された配列を参照して、合成または他の適切な手段によって得ることができる。

Ａ．ミニ遺伝子
ミニ遺伝子は、導入遺伝子およびその調節配列ならびに５’および３’ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）で最低限構成される。一実施形態では、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲが使用される。しかしながら、他の適切な供給源に由来するＩＴＲが選択されてもよい。カプシドタンパク質の中にパッケージングされ、選択された宿主細胞に送達されるのがこのミニ遺伝子である。

１．導入遺伝子
導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、または他の産物をコードする導入遺伝子に隣接するベクター配列に対して異種の核酸配列である。この核酸コード配列は、宿主細胞中での導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現が可能になるように調節成分に作動的に連結される。

導入遺伝子配列の組成は、得られるベクターが用いられる用途に依存することになる。例えば、あるタイプの導入遺伝子配列は、発現に際して検出可能なシグナルを生成するレポーター配列を含む。これらのコード配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントと結合する場合、酵素、Ｘ線検査、比色、蛍光、または他の分光光学アッセイ、蛍光活性化セルソーティングアッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および免疫組織化学を含む免疫アッセイを含む、従来の手段により検出可能なシグナルを提供する。しかしながら、望ましくは、導入遺伝子は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、ドミナントネガティブ変異体、または触媒ＲＮＡなど、生物学および医学で有用な産物をコードする非マーカー配列である。望ましいＲＮＡ分子には、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡが含まれる。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置された被験体において標的核酸配列の発現を阻害または消去する配列である。典型的には、適切な標的配列には、腫瘍標的およびウイルス疾患が含まれる。そのような標的の例については、免疫原に関するセクションで以下に同定された腫瘍標的およびウイルスを参照されたい。

導入遺伝子は遺伝子欠陥を是正または改善するのに使用することができ、この欠陥には、正常遺伝子が正常レベルより少なく発現される欠陥または機能的遺伝子産物が発現されない欠陥が含まれうる。あるいは、導入遺伝子は、その細胞型または宿主において天然には発現されない産物を細胞に提供することができる。好ましいタイプの導入遺伝子配列は、宿主細胞中で発現される治療用タンパク質またはポリペプチドをコードする。本発明はさらに、複数の導入遺伝子を使用することを含む。特定の状況では、別の導入遺伝子を、タンパク質の各サブユニットをコードするかまたは異なるペプチドまたはタンパク質をコードするために使用することができる。これは、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大きい場合、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子、またはジストロフィンタンパク質に対して望ましい。細胞にマルチサブユニットタンパク質を産生させるために、異なるサブユニットのそれぞれを含有する組換えウイルスに細胞を感染させる。あるいは、タンパク質の異なるサブユニットを同じ導入遺伝子にコードさせてもよい。この場合、単一導入遺伝子はサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを含み、各サブユニットに対するＤＮＡは配列内リボザイム進入部位（ＩＲＥＳ）により分離されている。これは、サブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡのサイズが小さい場合、例えばサブユニットおよびＩＲＥＳをコードするＤＮＡの合計サイズが５キロベース未満の場合に望ましい。ＩＲＥＳの代わりとして、ＤＮＡは、翻訳後事象で自己切断する２Ａペプチド
をコードする配列により分離されてもよい。例えば、ＭＬ Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ ａｌ，（Ｊａｎ １９９７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（Ｐｔ １）：１３−２１；Ｓ．Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ ｅｔ ａｌ，（Ｊｕｎｅ ２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４−８７３；Ｈ．Ｋｌｕｍｐ，ｅｔ ａｌ．，（Ｍａｙ ２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１０）：８１１−８１７を参照されたい。この２ＡペプチドはＩＲＥＳより著しく小さく、空間が制限因子となる場合に使用するのによく適合する。より多くの場合には、導入遺伝子が大きく、マルチサブユニットからなる場合、または２つの導入遺伝子が同時送達される場合、所望の導入遺伝子またはサブユニットを担持するｒＡＡＶは、それらが単一ベクターゲノムを形成するようにインビボでコンカテマー化することを可能にするために、同時投与される。そのような実施形態では、第１のＡＡＶは、単一導入遺伝子を発現する発現カセットを担持することができ、第２のＡＡＶは、宿主細胞中で共発現するための異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを担持することができる。しかしながら、選択された導入遺伝子は、任意の生物学的に活性な産物または他の産物、例えば、研究にとって望ましい産物をコードしてもよい。

適切な導入遺伝子は、当業者により容易に選択可能である。導入遺伝子の選択により、本発明が限定されるとは見なされない。

２．調節エレメント
ミニ遺伝子について上記に同定された主要なエレメントに加え、ベクターはまた、プラスミドベクターで形質移入されたかまたは本発明により作製されたウイルスに感染した細胞中でのその転写、翻訳、および／または発現を可能にするように導入遺伝子に作動的に連結される従来の調節領域を含む。本明細書で使用される場合、「作動的に連結される」配列は、目的の遺伝子に近接する発現制御配列および目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方を含む。

発現調節配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質のｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；および所望に応じてコードされた産物の分泌を高める配列を含む。天然、構成的、誘導性、および／または組織特異的プロモーターを含む、多数の発現制御配列が当技術分野で公知であり、かつ利用することができる。

構成的プロモーターの例としては、限定はされないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によっては、ＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によっては、ＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，（１９８５）Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０を参照のこと］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１プロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられる。誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因性に供給される化合物、温度などの環境因子、もしくは特定の生理学的状態の存在、例えば急性期、細胞の特定の分化状態により、または複製細胞においてのみ調節されうる。誘導性プロモーターおよび誘導系は、限定はされないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、およびＡｒｉａｄを含む、種々の商業的供給源から入手可能である。他の多くの系が記載されており、当業者により容易に選択可能である。外因性に供給される化合物により調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメサゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［国際公開第９８／１００８８号パンフレット］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ ｅ
ｔ ａｌ，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１］、テトラサイクリン抑制系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１］、テトラサイクリン誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９、さらにＨａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８も参照のこと］、ＲＵ４８６誘導系［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１］およびラパマイシン誘導系［Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２］が挙げられる。この文脈において有用となりうる他のタイプの誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、または複製細胞においてのみ調節されるものである。

別の実施形態では、導入遺伝子の天然のプロモーターを使用することになる。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣することが望ましい場合、天然のプロモーターが好ましいことがある。導入遺伝子の発現を、一時的にもしくは発生的に、または組織特異的に、または特定の転写刺激に応答して調節しなければならない場合、天然のプロモーターを使用することがある。さらなる実施形態では、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、またはコザックコンセンサス配列などの他の天然の発現調節エレメントを、天然の発現を模倣するために使用することもできる。

導入遺伝子の別の実施形態では、組織特異的プロモーターに作動的に連結された遺伝子が含まれる。例えば、骨格筋での発現が所望される場合、筋で活性なプロモーターが使用されるべきである。これらには、骨格β−アクチン、ミオシンＬ鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターおよび天然のプロモーターよりも高活性を有する合成の筋プロモーターが含まれる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５を参照のこと）。組織特異的なプロモーターの例は、とりわけ、肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４），骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６）；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４）、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５）、神経フィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５）、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４）などのニューロン性について知られている。

導入遺伝子、プロモーター／エンハンサー、ならびに５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲの組合せは、本明細書での言及を容易にするために「ミニ遺伝子」と呼ぶ。本発明の教示が与えられれば、そのようなミニ遺伝子の設計は、従来の手法により行うことができる。

３．パッケージング宿主細胞へのミニ遺伝子の送達
ミニ遺伝子は、宿主細胞に送達される任意の適切なベクター、例えばプラスミド上に担持することができる。本発明に有用なプラスミドは、複製、および場合によっては原核細
胞、哺乳動物細胞、またはその両方での組み込みに適するように操作することができる。これらのプラスミド（または５’ＡＡＶ ＩＴＲ−異種分子−３’ＡＡＶ ＩＴＲを担持する他のベクター）は、真核生物および／または原核生物におけるミニ遺伝子ならびにこれらの系の選択マーカーの複製を可能にする配列を含有する。選択可能マーカーまたはレポーター遺伝子としては、とりわけ、ジェネテシン、ハイグロマイシン、またはピューリマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）抵抗性をコードする配列を挙げることができる。プラスミドはまた、アンピシリン抵抗性など、細菌細胞中でベクターの存在を伝達するために使用できる特定の選択可能レポーターまたはマーカー遺伝子を含有することができる。プラスミドの他の成分としては、複製起点およびエプスタインバーウイルス核抗原を使用するアンプリコンシステムなどのアンプリコンを挙げることができる。このアンプリコンシステムまたは他の同様のアンプリコン成分は、細胞中での高コピーのエピソーム複製を可能にする。好ましくは、ミニ遺伝子を担持する分子は、細胞に形質移入され、そこでは一過性に存在することができる。あるいは、ミニ遺伝子（５’ＡＡＶ ＩＴＲ−異種分子−３’ＩＴＲを担持する）は、染色体性にまたはエピソームとしてのいずれかで、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれてもよい。特定の実施形態では、ミニ遺伝子は、複数コピーで、場合によっては、ヘッドトゥーヘッド、ヘッドトゥーテール、またはテールトゥーテールのコンカテマーで存在することができる。適切な形質移入手法は公知であり、宿主細胞にミニ遺伝子を送達するために容易に利用することができる。

一般に、形質移入によりミニ遺伝子を含むベクターを送達する場合、ベクターは、約５μｇ〜約１００μｇＤＮＡ、約１０μｇ〜約５０μｇＤＮＡの量で、約１×１０^４細胞〜約１×１０^１３細胞、または約１×１０^５細胞に送達される。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されたベクター、送達方法、および選択された宿主細胞などの因子を考慮に入れて調節することができる。

Ｂ．パッケージング宿主細胞
ミニ遺伝子に加えて、宿主細胞は、宿主細胞において本発明の新規ＡＡＶカプシドタンパク質（またはその断片を含むカプシドタンパク質）の発現を駆動する配列、およびミニ遺伝子に見出されるＡＡＶ ＩＴＲの供給源と同じ供給源のｒｅｐ配列または交差相補（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）供給源のｒｅｐ配列を含有する。パッケージング宿主細胞はまた、本発明のｒＡＡＶをパッケージングするためにヘルパー機能を必要とする。そのようなヘルパー機能は、当技術分野で周知であり、本明細書で繰り返されることはない。同様に、ＡＡＶカプシドを有する適切なベクターを生成する方法は公知である。［例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０号明細書を参照のこと］。

したがって、本発明は、本発明の新規ＡＡＶの核酸およびアミノ酸の配列を使用して生成されたベクターをさらに提供する。そのようなベクターは、治療用分子の送達のためおよびワクチンレジメンでの使用のためなど、種々の目的に有用である。治療用分子の送達に特に望ましいのは、本発明の新規ＡＡＶカプシドを含有する組換えＡＡＶである。本発明の新規ＡＡＶ配列を含有するこれらまたは他のベクターコンストラクトは、例えば、サイトカインの同時送達のためにまたは免疫原それ自体の送達のために、ワクチンレジメンで使用することができる。

したがって、公知の手法および当業者は、ＡＡＶクレードＦカプシドを有するｒＡＡＶ、ＡＡＶ９カプシド、および／またはＡＡＶ９のβ−ガラクトース結合ドメインを含むＡＡＶカプシドを有するベクターを生成することができる。一実施形態では、単一ＡＡＶ由来の完全長カプシド、例えばｈｕ．１４／ＡＡＶ９［配列番号１］を利用することができる。別の実施形態では、選択された別のＡＡＶに由来する、または同じＡＡＶの非対応（すなわち、近接していない）部分に由来する配列とインフレームで融合した、ＡＡＶ９カプシドの１つまたは複数の断片（例えば、ＡＡＶ９のβ−ガラクトース結合ドメインを含
む断片）を含有する完全長カプシドを生成することができる。さらに別の実施形態では、変異体ＡＡＶ９カプシドを有するベクターまたはＡＡＶ９ガラクトース結合ドメインを含有するように操作されたＡＡＶが、同様の手法を使用して組み立てられる。

上記の組換えベクターは、公表された方法に従って宿主細胞に送達することができる。好ましくは生理学的に適合する担体中に懸濁されたｒＡＡＶは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物患者に投与することができる。適切な担体は、導入ウイルスが目標とする適用を考慮して当業者により容易に選択可能である。例えば、ある適切な担体は、生理食塩水を含み、種々の緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）で製剤化することができる。他の代表的な担体は、無菌の生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水を含む。担体の選択により本発明が限定されることはない。

場合によっては、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体に加えて、防腐剤または化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含有することができる。適切な代表的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。

ベクターは、細胞に形質移入するのに十分な量で、かつ過度の有害作用がないか、または医学的に許容される生理的効果を伴う治療効果を提供するのに十分なレベルの遺伝子導入および発現を与えるのに十分な量で投与され、この量は、医療分野の技術者により決定可能である。従来のかつ医薬として許容される投与経路としては、これらに限定されないが、所望の器官（例えば、肺、心臓、または脳）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口投与経路が挙げられる。投与経路は、所望により組み合わせてもよい。

ウイルスベクターの投薬量は、主として、治療される症状、患者の年齢、体重、および健康状態などの因子に依存することになり、したがって、患者間で変動しうるものである。例えば、ウイルスベクターの治療上効果的なヒト投薬量は、一般に、約１×１０^９〜１×１０^１６ゲノムウイルスベクターの濃度を含有する溶液の約０．１ｍＬ〜約１００ｍＬの範囲である。大きな器官（例えば、肺、骨格筋、心臓、もしくは肺）または中枢神経系（例えば、脳）への送達のための好ましいヒト投薬量は、約１〜１００ｍＬの容量で、１ｋｇ当たり約５×１０^１０〜５×１０^１３ＡＡＶゲノムとすることができる。眼（例えば、網膜）への送達のための好ましい投薬量は、約０．１ｍＬ〜１ｍＬの容量で、約５×１０^９〜５×１０^１２ゲノムコピーである。投薬量は、いかなる副作用に対しても治療効果とのバランスを取るように調整されることになり、そのような投薬量は、組換えベクターが使用される治療用途に応じて変動しうるものである。導入遺伝子の発現レベルをモニターして、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクターをもたらす投薬回数を決定することができる。

ＡＡＶ９ベースのベクターの例で示されるように、末端ＳＡが酵素的に除去されると、細胞の形質導入が増加し、これにより、最もよく観察される、末端ＳＡから２番目の単糖であるガラクトースが、ＡＡＶ９形質導入を媒介することが示唆された。これは、末端シアル酸（ＳＡ）を有するグリカンを介する取り込みが一般的な進入様式であるいくつかの他のＡＡＶ血清型とは対照的である。末端ＳＡを介するＡＡＶ９ベースのベクターの取り込みは、糖タンパク質生合成に関与する酵素を欠損する細胞およびレクチン妨害試験で確認された。末端ガラクトースを有するグリカンへのＡＡＶ９の結合は、グリカン結合アッセイで実証された。肺指向遺伝子導入に対するこの経路の妥当性は、誘導気道上皮細胞の頂端膜側上での末端ガラクトースの露出と、嚢胞性繊維症に対する遺伝子治療に関連する
標的であるこれらの細胞のベクター媒介形質導入の実質的な増加とをもたらすノイラミニダーゼとＡＡＶ９ベクターとのマウス肺への同時注入により実証された。

本発明のＡＡＶ含有ベクターによる送達のための治療用産物および免疫原性産物の例を下記に示す。これらのベクターは、本明細書に記載のように、種々のレジメンに対して使用することができる。加えて、これらのベクターは、所望のレジメンにおいて、１つまたは複数の他のベクターまたは活性成分と組み合わせて送達することができる。

例えば、適切な導入遺伝子には、誘導気道上皮細胞を含む、肺を優先的に標的とするものを含むことができる。そのような導入遺伝子には、例えば１つまたは複数のミニＣＦＴＲ遺伝子など、例えば嚢胞性繊維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子を含む、嚢胞性繊維症を治療するために有用なものを含むことができる［Ｌ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ，（Ａｕｇ １８ １９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９５（１７）：１０１５８−６３］。同様に、例えば、ＣＯＰＤおよび他の肺障害の治療に有用な抗炎症性サイトカインまたは他の分子を含む、他の肺症状の治療のための遺伝子を使用することができる。

別の例では、例えば、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）（Ｌｅｉｂｅｒ先天性黒内障（ＬＣＡ）の治療用）、ｂＰＤＥおよびＡＩＰＬ１色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）（例えば、黄斑変性症および糖尿病性網膜症の治療用）、例えば抗血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む抗血管新生因子（例えば、湿潤加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療用）、ならびに色素性網膜炎およびＬＣＡと錐体桿体ジストロフィーに関連した他の遺伝子など、網膜および／または眼の障害を治療するために有用な導入遺伝子を含み、選択することができる。

さらに別の例では、関節障害、例えば関節リウマチの治療に有用な導入遺伝子を選択することができる。そのような導入遺伝子は、例えば抗ＴＮＦアルファモノクローナル抗体、可溶性ＴＮＦアルファ受容体、ＩＬ−１のＩＩ型可溶性受容体、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ１）など、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファまたはインターロイキン１（ＩＬ−１）の遮断薬であってもよい。そのようなアンタゴニストは、例えば、抗体もしくはＦａｂ、またはそれらの機能性断片、あるいは別の成分であってもよい。

さらに他の遺伝子には、とりわけ、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、および貯蔵障害を含む中枢神経系；先天性心疾患に関連した治療用遺伝子（例えば、ＳＥＲＣＡ２ａ、アンジオポエチン−１（Ａｎｇ１）、およびＡｎｇ２）、全身性リソソーム貯蔵障害に関連した遺伝子；ならびに筋消耗障害（例えば、ジストロフィン、ミニジストロフィン）に関連した種々の症状の治療に有用なものを含むことができる。

導入遺伝子によりコードされた、さらに他の有用な治療用産物は、所望の適用のために選択することができる。そのような導入遺伝子には、限定はされないが、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦα、アクチビン、インヒビン、または骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１〜１５のいずれかを含む形質転換増殖因子αスーパーファミリーのいずれか１つ、増殖因子のヘレグリン
／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ））、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのいずれか１つ、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、ならびにチロシンヒドロキシラーゼを含む、ホルモンならびに増殖因子および分化因子が含まれる。

他の有用な導入遺伝子産物には、限定はされないが、サイトカインおよびリンホカイン、例えば、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１〜ＩＬ−２５（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１８を含む）、単球化学走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、β、およびγ、幹細胞刺激因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドを含む、免疫系を調節するタンパク質が含まれる。免疫系により産生される遺伝子産物もまた、本発明に有用である。これらには、限定はされないが、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子、ならびに操作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子が含まれる。有用な遺伝子産物には、補体調節タンパク質、細胞膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、解離促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２、およびＣＤ５９などの調節タンパク質がさらに含まれる。

さらに他の有用な遺伝子産物には、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質、および免疫系タンパク質に対する受容体のいずれか１つが含まれる。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体、およびスカベンジャー受容体を含む、コレステロール調節および／または脂質調整のための受容体を包含する。本発明はまた、グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体、ならびに他の核受容体を含むステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーなどの遺伝子産物を包含する。加えて、有用な遺伝子産物には、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳ−ボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ−ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ−結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ−ボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３、ならびに翼状らせんタンパク質のフォークヘッドファミリーなどの転写因子が含まれる。

他の有用な遺伝子産物には、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１抗トリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータ−シンターゼ、側鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性繊維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィン遺伝子産物［例えば、ミニジストロフィンまたはミクロジストロフィン］が含まれる。さらに他の有用な遺伝子産物には、酵素活性の欠損から生じる種々の症状に有用な酵素補充療法に有用となり
うるような酵素が含まれる。例えば、マンノース−６−リン酸を含有する酵素は、リソソーム蓄積症の治療に利用することができる（例えば、適切な遺伝子としては、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（ＧＵＳＢ）が挙げられる）。

さらに他の有用な遺伝子産物には、血友病Ｂ（第ＩＸ因子を含む）および血友病Ａ（ヘテロダイマーの軽鎖および重鎖ならびにＢ−欠失ドメインなど、第ＶＩＩＩ因子およびその変異体を含む；米国特許第６，２００，５６０号明細書および米国特許第６，２２１，３４９号明細書）を含む、血友病の治療に使用されるものが含まれる。第ＶＩＩＩ因子遺伝子は２３５１個のアミノ酸をコードし、このタンパク質には６つのドメインがあり、アミノ末端からカルボキシ末端にかけてＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と命名されている［Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３３０；Ｖｅｈａｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３３７；およびＴｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３４２：３３７］。ヒト第ＶＩＩＩ因子は、細胞内でプロセシングされて、Ａ１、Ａ２および、Ｂドメインを含有する重鎖と、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２ドメインを含有する軽鎖とを主として含むヘテロダイマーを生じる。単一鎖ポリペプチドおよびヘテロダイマーの両方は、Ｂドメインを放出し、Ａ１およびＡ２のドメインからなる重鎖を生じる、Ａ２とＢのドメイン間のトロンビン切断による活性化まで、不活性前駆体として血漿中を循環する。Ｂドメインは、このタンパク質の活性化プロコアグラント形態には欠落している。加えて、天然タンパク質では、Ｂドメインを挟む２つのポリペプチド鎖（「ａ」および「ｂ」」）は、二価カルシウム陽イオンに結合している。

一部の実施形態では、ミニ遺伝子は、１０アミノ酸シグナル配列をコードする第ＶＩＩＩ因子重鎖の最初の５７塩基対およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列を含む。代替実施形態では、ミニ遺伝子は、Ａ１およびＡ２のドメインと、ＢドメインのＮ末端からの５アミノ酸および／またはＢドメインのＣ末端の８５アミノ酸と、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２のドメインとをさらに含む。さらに他の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子の重鎖および軽鎖をコードする核酸が、Ｂドメインの１４アミノ酸をコードする４２核酸により分離された単一ミニ遺伝子で提供される［米国特許第６，２００，５６０号明細書］。

本明細書で使用される場合、治療有効量は、被験体の血液が凝固するのに要する時間を短縮するのに十分な量の第ＶＩＩＩ因子を産生するＡＡＶベクターの量である。一般に、第ＶＩＩＩ因子が正常レベルの１％未満である重度の血友病患者は、非血友病患者の約１０分と比較して、全血凝固時間が６０分を超える。

本発明はいかなる特定の第ＶＩＩＩ因子配列にも限定されるものではない。第ＶＩＩＩ因子の多くの天然および組換え形態が単離および生成されている。第ＶＩＩ因子の天然および組換え形態の例は、以下のものを含む特許および科学文献に見出すことができる：米国特許第５，５６３，０４５号明細書、米国特許第５，４５１，５２１号明細書、米国特許第５，４２２，２６０号明細書、米国特許第５，００４，８０３号明細書、米国特許第４，７５７，００６号明細書、米国特許第５，６６１，００８号明細書、米国特許第５，７８９，２０３号明細書、米国特許第５，６８１，７４６号明細書、米国特許第５，５９５，８８６号明細書、米国特許第５，０４５，４５５号明細書、米国特許第５，６６８，１０８号明細書、米国特許第５，６３３，１５０号明細書、米国特許第５，６９３，４９９号明細書、米国特許第５，５８７，３１０号明細書、米国特許第５，１７１，８４４号明細書、米国特許第５，１４９，６３７号明細書、米国特許第５，１１２，９５０号明細書、米国特許第４，８８６，８７６号明細書；国際公開第９４／１１５０３号パンフレット、国際公開第８７／０７１４４号パンフレット、国際公開第９２／１６５５７号パンフレット、国際公開第９１／０９１２２号パンフレット、国際公開第９７／０３１９５号パンフレット、国際公開第９６／２１０３５号パンフレットおよび国際公開第９１／０７４９０号パンフレット；欧州特許第０ ６７２ １３８号明細書、欧州特許第０ ２７０
６１８号明細書、欧州特許第０ １８２ ４４８号明細書、欧州特許第０ １６２ ０６７号明細書、欧州特許第０ ７８６ ４７４号明細書、欧州特許第０ ５３３ ８６２号明細書、欧州特許第０ ５０６ ７５７号明細書、欧州特許第０ ８７４ ０５７号明細書、欧州特許第０ ７９５ ０２１号明細書、欧州特許第０ ６７０ ３３２号明細書、欧州特許第０ ５００ ７３４号明細書、欧州特許第０ ２３２ １１２号明細書、および欧州特許第０ １６０ ４５７号明細書；Ｓａｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＸＸｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｆｅｄ．Ｏｆ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ａｎｄ Ｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１９。

上記の第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配列は、組換え法を使用して、またはそれを含むことが公知のベクターから配列を取り出すことにより得ることができる。さらに、所望の配列は、フェノール抽出およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲなどの標準的手法を使用して、それを含有する細胞および組織から直接単離することができる［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを参照のこと］。ヌクレオチド配列はまた、クローニングではなく、合成的に生成することができる。完全な配列は、標準的方法により調製された重複するオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、完全なコード配列に組み立てることができる［例えば、Ｅｄｇｅ，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５７；Ｎａｍｂａｒｉ ｅｔ ａｌ，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１２９９；およびＪａｙ ｅｔ ａｌ，（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと］。

さらに、本発明は、ヒト第ＶＩＩＩ因子に限定されるものではない。実際、本発明は、これらに限定されないが、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ、およびウマ）、家畜（例えば、ウシ、ヤギ、およびヒツジ）、実験動物、海生哺乳動物、大型ネコ類等を含む、ヒト以外の動物に由来する第ＶＩＩＩ因子を包含することが意図される。

ＡＡＶベクターは、それ自体は生物学的に活性ではないが、被験体に投与されると、血液凝固時間を改善または回復する第ＶＩＩＩ因子の断片をコードする核酸を含有することができる。例えば、上記に論述されたように、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は２つのポリペプチド鎖、すなわちプロセシング中に切断されるＢ−ドメインにより分離された重鎖および軽鎖を含む。本発明により実証されたように、第ＶＩＩＩ因子の重鎖および軽鎖を受容細胞に同時形質導入すると、生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子の発現がもたらされる。ほとんどの血友病患者は、鎖（例えば、重鎖または軽鎖）の一方にのみ変異または欠失を含有するので、患者に欠けている鎖のみを投与して、他方の鎖を供給することが可能となりうる。

他の有用な遺伝子産物には、挿入、欠失、またはアミノ酸置換を含有する非天然アミノ酸配列を有するキメラポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドなどの非天然ポリペプチドが含まれる。例えば、操作された単一鎖免疫グロブリンは、特定の免疫無防備状態の患者に有用となりうる。他のタイプの非天然遺伝子配列には、アンチセンス分子およびリボザイムなどの触媒性核酸が含まれ、これらは標的の過剰発現を低下させるために使用することができよう。

遺伝子発現の低下および／または調節は、癌および乾癬のように、過剰増殖する細胞を特徴とする過剰増殖症状の治療に特に望ましい。標的ポリペプチドには、正常細胞と比較して、過剰増殖細胞において独占的にまたはより高レベルで産生されるポリペプチドが含まれる。標的抗原には、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎ、および転座遺伝子のｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ、ならびにＥＧＲＦなどの癌遺伝子によりコードされたポリペプチドが含まれる。標的抗原としての癌遺伝子産物に加えて、抗癌治療および予防レジメンのための標的ポリペプチドには、Ｂ細胞リンパ腫により作られる抗体の
可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域が含まれ、これらは、一部の実施形態では、自己免疫疾患に対する標的抗原としても使用される。モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるポリペプチドおよび葉酸結合ポリペプチドを含む、腫瘍細胞でより高レベルで見出されるポリペプチドなどの他の腫瘍関連ポリペプチドを、標的ポリペプチドとして使用することができる。

他の適切な治療用ポリペプチドおよびタンパク質には、細胞受容体および「自己」に向けた抗体を産生する細胞を含む、自己免疫と関連した標的に対する広範囲にわたる防御免疫応答を付与することにより、自己免疫疾患および障害に罹患した個体を治療するのに有用となりうるものが含まれる。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患としては、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ヴェグナー肉芽腫症、クローン病、および潰瘍性大腸炎が挙げられる。これらの疾患のそれぞれは、内因性抗原に結合し、自己免疫疾患に関連した炎症性カスケードを惹起するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特徴とする。

標的細胞に送達するためのさらに他の産物は、当業者には公知である。

ＩＩＩ．単離および精製の方法
本発明は、固体担体に結合したβ−ガラクトースを使用する、ＡＡＶ９の単離および検出のための方法を提供する。本発明はまた、β−ガラクトースに対する結合部位を有する別のクレードＦ ＡＡＶの精製、またはβ−ガラクトースに対する結合部位を含有する、いわゆる「空のＡＡＶ９カプシド」（その中にパッケージングされたゲノム配列を含まないインタクトカプシドタンパク質）に容易に適用することができる。例えば、キメラＡＡＶカプシドを含有するＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ９の一部、またはβ−ガラクトース結合部位を有する他のクレードＦカプシドタンパク質を含有するベクターは、本発明に従って検出、分離、および単離することができることは理解されよう。本明細書の全体にわたる便宜のために、本明細書に記載のβ−ガラクトースに特異的な結合部位を有するこれらのウイルスベクターおよび他のタンパク質は、「精製標的」と称される。前に指摘したように、このセクションでのＡＡＶ９との記載は簡潔表現のために使用するものであって、β−ガラクトースに対する結合部位を有する他のＡＡＶカプシドを排除するものではないことは理解されよう。

本明細書に記載の方法を使用して、高塩濃度溶液による溶出またはインキュベーションにより、特異的に結合したウイルス（または「空のカプシドタンパク質」）を取り出すと、ＣｓＣｌ_２沈降法で得られるよりも望ましい純度のＡＡＶ９が効率的に回収される。加えて、この手法は、迅速で、特殊な装置を必要とせず、容易にスケールアップすることができる。本発明はさらに、ウイルスベクターの精製および検出のために単一工程のアフィニティーカラムおよび場合によっては視覚的に検出可能なマーカー系を利用する本明細書に記載の方法を使用する、ＡＡＶ９カプシド（パッケージングされたウイルス粒子であっても「空の」であってもよい）の単離および検出に有用なキットを提供する。

一実施形態では、本方法は、精製標的を単離するための方法を提供する。この方法は、固体担体に連結されたβ−ガラクトースを含む分子に接触させるように精製標的を含む試料を曝露して、それによってβ−ガラクトースに対する結合部位を有する精製標的を、その分子に選択的に結合させる工程を含む。その後、固体担体を洗浄して、固体担体に非特異的に結合している物質を試料から除去する。次いで、精製標的を固体担体から分離することができる。場合によっては、固体担体から分離した精製標的を、さらなる使用のために濃縮する。一実施形態では、固体担体はアフィニティークロマトグラフィーカラムに充填される。

本発明は、クレードＦ ＡＡＶまたはＡＡＶ９細胞結合ドメインを有するＡＡＶに由来するカプシドを有するウイルスベクターを分離および単離するのに十分適している。これらのＡＡＶは、これらのウイルスがβ−ガラクトースに特異的に結合するそれらのカプシドの能力によって産生される、培養物中に見出される物質から分離することができる。そのような培養物中に見出されるアデノウイルス、ＡＡＶ１、および他のウイルスまたは細胞物質は、β−ガラクトースに特異的に結合しないので、本発明の方法は、ヘルパー依存産生培養物からの、クレードＦ ＡＡＶまたはＡＡＶ９細胞結合ドメインを有するＡＡＶの分離および単離に有用である。

本明細書に明示されているように、本発明での使用のために、１つまたは複数のβ−ガラクトース分子を、固体担体に直接的または間接的に（例えば、適切なリンカーを介して）結合させることができる。あるいは、β−ガラクトースは、固体担体に（直接的または間接的に）結合しうる、タンパク質性成分、糖成分、および化学成分を含む、種々の分子中に見出すことができる。ＡＡＶ９、他のクレードＦ、またはＡＡＶ９細胞結合ドメインを含有するキメラＡＡＶを効率的に結合するために、そのような分子は、末端（エキソ）ガラクトースを含有する。β−ガラクトースを含有する分子の一例は、末端β−ガラクトースを有するグリカンである。そのような分子は、商業的供給源から入手することも、または種々の天然、合成、組換え、もしくは他の適切な方法に従って調製することもできる。

β−ガラクトースの化学合成は、アルファアミノ基のＴＢＯＣまたはＦＭＯＣ保護など、当技術分野で公知である。（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，Ｕｎｉｔ ９を参照のこと）。あるいは、ペプチドもまた、周知の固相ペプチド合成法により合成することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６２）；Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９）ｐｐ．２７−６２）。あるいは、固体担体に結合するような、１つまたは複数のβ−ガラクトース成分を含有する化学分子を利用することができる。さらに別の代替形態では、精製に使用する固体担体を、１つおよび好ましくは２つ以上のβ−ガラクトース成分を含有するように、化学的にまたは別の方法で改変することができる。そのようなβ−ガラクトース成分は、例えば、共有結合により、または精製標的へのβ−ガラクトースの結合および非特異的に結合した物質の除去に耐える他の適切な結合により、固体担体に直接連結させることができる。あるいは、β−ガラクトース成分は、例えば、担体へのβ−ガラクトースの結合を容易にする成分により、固体担体に間接的に連結させることができる。そのような成分は、タンパク質、化学成分、または別の適切なリンカーであってもよい。β−ガラクトースまたは末端β−ガラクトース含有成分を連結するのに適した方法は、当技術分野で公知であり、固体担体の製造業者から入手可能でもある。

本明細書で使用される場合、用語「固体担体」は、固体担体に結合したβ−ガラクトース分子が、精製標的へのβ−ガラクトースの結合および非特異的に結合した物質の除去に耐えるように、β−ガラクトースまたは末端β−ガラクトースを含有する分子が結合することができる、ゲル、樹脂、ビーズ、粉末、および他の固体を含む、任意の物質を指す。適切な固体担体の例としては、セファロース、アガロース、架橋アガロース、混合アガロース−ポリアクリルアミド、またはポリアクリレイン（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｅｉｎ）で構成される樹脂；ビーズ（マイクロビーズを含む）；シリコン；ガラス；マイクロセル；マイクロカプセル；マイクロタイタープレート；およびバイオチップが挙げられる。有用な担体には、とりわけ、１９９９年６月３日に公表された国際公開第９９／２７３５１号パ
ンフレット；１９９９年６月３日に公表された国際公開第９９／２７１４０号パンフレット；米国特許第６，０９６，２７３号明細書；２０００年３月１６日に公表された国際公開第００／１４１９７号パンフレットに記載されたものが含まれる。

種々のマイクロビーズが、米国特許第６，０７４，８８４号明細書、同第５，９４５，２９３号明細書；および同第５，６５８，７４１号明細書に記載のアミノデキストランビーズを含めて、公知である。磁性フェライト［米国特許第５，２４０，６４０第］；金属［米国特許第５，２４８，７７２号明細書］；ポリスチレン［米国特許第５，４６６，６０９号明細書；米国特許第５，７０７，８７７号明細書；米国特許第５，６３９，６２０号明細書；米国特許第５，７７６，７０６号明細書］、およびポリスチレン−金属［米国特許第５，５５２，０８６号明細書；米国特許第５，５２７，７１３号明細書］粒子のアミノデキストランコーティング単分散コロイド分散も本発明の固体担体として使用することができる。別のタイプの固体担体は、コロイドサイズの金属性固体を覆うアミノデキストランコーティングの層を有する上記コーティング基材を含有することができる。金／銀コロイドコーティングのポリスチレン−アミノデキストランビーズ、それらの調製、特性評価、および全血中の白血球のサブポピュレーション分析での使用が記載されている。例えば、米国特許第５，２４８，７７２号明細書；米国特許第５，５５２，０８６号明細書；米国特許第５，９４５，２９３号明細書；Ｏ．Ｓｉｉｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｂｕｒｓｈｔｅｙｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，１０４：９７９５−９８１０（２０００）；およびＯ．Ｓｉｉｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，４１：２９８−３０７（２０００）を参照されたい。このコーティングされた基材の代替として、米国特許第５，６３９，６２０号明細書に記載のように、ＥＤＡＣカップリングによりアミノデキストランでコーティングされる、カルボキシ官能基を付与された、コア基材としてのポリスチレン粒子を使用する。これらおよび他の固体担体は当業者には公知であり、限定はされないが、とりわけ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓｕｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｐｉｅｒｃｅ；Ｂｉｏｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）、およびＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒを含む、種々の商業的供給源から入手可能である。

一実施形態では、固体担体は、活性化セファロースで構成される。ＣｎＢｒ−活性化セファロースは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入することができる。しかしながら、活性化の方法および活性化化合物が公知であるように、セファロースおよび活性化セファロースの他の供給源が公知である。適切な活性化セファロースの例としては、ＣｎＢｒ−、カルボニルジイミダゾール−、グルタルアルデヒド−、ヒドロキシスクシンイミド、および塩化トシル−活性化セファロースが挙げられる。

β−ガラクトースまたはβ−ガラクトースを含む分子を固体担体に結合させる方法は、公知の方法の中から選択することができる。そのような方法はまた、固体担体の製造業者から提供される。一実施形態では、β−ガラクトース連結固体担体は、標的の分離、単離、および／または精製のためのアフィニティーカラムに充填される。この実施形態では、精製標的を含有する試料（例えば、ＡＡＶ産生培養物由来の溶解物）をカラムに流して、精製標的をβ−ガラクトース連結固体担体に特異的に結合させる。その後、カラムを洗浄して、非特異的に結合した物質を除去する一方、特異的に結合した精製標的を保持する。望ましくは、洗浄試薬は、生理食塩水または生理的なｐＨに緩衝化された別の適切な試薬（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）である。次いで、精製標的を取り出す条件下で、さらなる洗浄工程にカラムを供する。適切には、溶出試薬は高濃度の塩を含有する溶液である。一適切例では、少なくとも約０．１Ｍ濃度のＮａＣｌを含有するリン酸緩衝生理食塩水である。別の適切な溶液は、リン酸緩衝生理食塩水および少なくとも約０．４ＭのＮａＣｌを含有する。この情報があれば、当業者は、同様の作用が得られる代わりの塩溶液を容易に選択することができる。あるいは、溶出試薬は、任意の適切な酸性試薬またはその塩（例えば、約１〜約５の範囲の低ｐＨの試薬）であってもよい。そのような試薬の例とし
ては、当業者に容易に明らかになるものの中では、酢酸（例えば、１ｍＭ）および酢酸ナトリウムなどのその塩、ならびに０．１Ｍグリシン（ｐＨ３）が挙げられる。精製標的（例えば、ＡＡＶ９細胞結合ドメインを有する）の溶出に続いて、ＡＡＶを従来の手法による濃縮に供することができる。

別の実施形態では、β−ガラクトース連結固体担体を、精製標的を含有する試料と共にインキュベートすることができる。そのような実施形態では、試料は、単離するタンパク質が産生された細胞培養物に由来する溶解物を含有する溶液であってもよい。あるいは、試料は、被験体由来の生体試料であっても、適切な希釈剤との混合物中の被験体由来の生体試料であってもよい。本発明の「被験体由来の生体試料」は、液体の中ではとりわけ、全血、血漿、または血清を含む任意の試料を含むことができ、ここで、形成体（ｆｏｒｍｅｄ ｂｏｄｉｅｓ）は、細胞、特に血液細胞である。そのような試料は、そのタイプの他の試料を取り扱うための従来の方法、例えば、遠心分離等によって精製することができる。これらの「被験体由来の生体試料」は、試料濃度の調整、またはそうでなければ分析用試料の調製のために、標識化合物との混合および／または場合によっては緩衝液または希釈剤との混合を行うことができる。さらに別の代替形態では、生体試料は組織試料であってもよく、β−ガラクトース連結固体担体は、組織試料とのインキュベーションのために、適切な緩衝液または他の希釈剤と混合することができる。

別の実施形態では、本発明は精製標的を分離するために有用なキットを提供する。このキットは、ウイルスベクター（例えば、クレードＦ、またはそのカプシド中にＡＡＶ９細胞結合ドメインを含有するＡＡＶベクター）の生産における使用に特によく適合する。

典型的には、そのようなキットは、β−ガラクトースまたは固体担体に連結されるβ−ガラクトース含有分子を有する固体担体を含有する。そのような固体担体は、上記の担体の中から選択することができる。望ましい一実施形態では、固体担体は、試料とのインキュベーションのためのビーズまたはゲルである。別の望ましい実施形態では、固体担体を、アフィニティーカラム（例えば、液体クロマトグラフィーカラム）に充填し、試料をそのカラムに通す。

加えて、本発明のキットはまた、洗浄試薬、溶出試薬、および濃縮試薬を含む、所望の試薬を含有することができる。そのような試薬は、本明細書に記載の試薬の中から、また従来の濃縮試薬の中から容易に選択することができる。望ましい一実施形態では、洗浄試薬は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）など、生理的ｐＨに緩衝化された等張生理食塩水であり；溶出試薬は０．４Ｍ ＮａＣｌを含有するＰＢＳであり、濃縮試薬およびデバイスである。例えば、当業者は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはＮＨ_４ＳＯ_４などの試薬またはろ過装置などの装置が有用となりうることを認識していよう。例えば、１００Ｋ膜のろ過装置により、ｒＡＡＶが濃縮されるであろう。

これらのキットは、加えて、試料を維持または保存するために必要な試薬を含有することができる。より重要なことは、キットには、競合アッセイの実施および対照の調製のための説明書が含有される。さらにキットの中に、試料に適した希釈剤および緩衝剤、シグナル比較のための表示図、使い捨て手袋、汚染除去説明書、アプリケータースティックまたは容器、および試料調製カップを提供することができる。キットはまた、好ましくは、必要な緩衝物質または培地を必要に応じて含有する。当業者は、患者に関して、いずれの特定の受容体および標的細胞についても、必要な情報および成分を含有する任意の数のキットを集め、その方法を実施して、その結果をその結合部位についての基準と比較することができよう。

さらに別の実施形態では、本発明は、試料中の精製標的（例えば、ＡＡＶ９）の存在を
検出するために有用なキットを提供する。上記の成分を含有することに加えて、そのようなキットは、分子への精製標的の結合を視覚的に検出することを可能にするマーカー試薬も含有することができる。このキットは、被験体からの生体試料、例えば血液の中の精製標的の検出に特によく適合する。このタイプのキットは、上記のβ−ガラクトース連結担体および試薬を含有することに加えて、視覚的に検出可能なマーカーをさらに含むことができる。

用語「マーカー」は、一般には、分子、好ましくはタンパク質性の分子であるが、低化学分子、好ましくは視覚的に検出可能な分子も指す。一例では、これらのマーカーは、レーザーによる励起で特定の波長の検出可能なシグナルを発光することにより検出を可能にする。フィコビリンタンパク質、タンデム色素、特定の蛍光タンパク質、低化学分子、および他の手段により検出可能な特定の分子はすべて、これらの分析のためのマーカーと見なすことができる。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，６ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ（１９９６）に収戴のマーカーを参照されたい。

本発明に有用なフィコビリンタンパク質の例は、フィコシアニン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アロフィコシアニンＢ、フィコエリトリン（ＰＥ）、および好ましくはＲ−フィコエリトリンである。ＰＥは、現在利用可能な最も明るい蛍光色素の１つである。ＰＥは、抗体に結合させて、蛍光プレートアッセイおよび（ＭＣ Ｃｕｓｔｅｒ ａｎｄ ＭＴ Ｌｏｔｚｅ，（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１２８，１０９−１１７）においてインターロイキン−４の検出に使用され、十分なシグナルを生成した唯一の試験フルオロフォアであることが見出されている。タンデム色素は、フィコビリンタンパク質および別の色素から形成されうる非天然分子である。例えば、米国特許第４，５４２，１０４号明細書および米国特許第５，２７２，２５７号明細書を参照されたい。本発明に有用なタンデム色素の例は、フィコエリトロシアニンまたはＰＣ５（ＰＥ−Ｃｙ５、フィコエリトリン−シアニン５．１；励起、４８６〜５８０ｎｍ、発光、６６０〜６８０ｎｍ）［Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６７７：１８５−１９３および米国特許第５，１７１，８４６号明細書］およびＥＣＤ（フィコエリトリン−テキサスレッド；励起、４８６〜５７５ｎｍ、発光、６１０〜６３５ｎｍ）［米国特許第４，５４２，１０４号明細書および米国特許第５，２７２，２５７号明細書］である。他の公知のタンデム色素は、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｃｙ５、およびＡＰＣ−Ｃｙ７［Ｍ．Ｒｏｅｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２４：１９１−１９７］である。タンデム色素のＰＣ５およびＥＣＤついては、色素のイミノチオラン活性化を含む、いくつかの方法によりモノクローナル抗体に直接結合させるのに成功している。この方法にさらなる数のマーカー（標識リガンド）を加えるために、リガンドに直接結合し、本発明のフィコビリンタンパク質またはタンデム色素と共に使用できるさらに他のマーカーには、励起されると５５０ｎｍ未満の波長を発光する低分子が含まれる。そのような分子はフィコビリンタンパク質の発光と重複しない。そのようなマーカーの一例は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。他のものは、上記に引用のハンドブックに収載されている。さらなる色を提供するために、本方法で使用できるさらに他のマーカーは、緑色蛍光タンパク質および青色蛍光タンパク質として知られているタンパク質であり；紫外線による励起で発光する有用なマーカーにもなりうる。ビリタンパク質およびタンデム色素は、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ ａｎｄ Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡを含む種々の供給源から市販されている。上記に論述された他のマーカーまたは標識は、公知の供給源から商業的に入手可能である。

これらのマーカーの利用法は、当業者には容易に明らかであり、β−ガラクトース連結固体担体に接触させる前に、マーカーの存在下で試料をインキュベートする工程を含むことがある。あるいは、マーカーは固体担体に結合していることもある。さらに別の代替形態では、マーカーは、固体担体から特異的に結合した精製標的を取り出す洗浄工程後の精製標的含有溶出液中でインキュベートしてもよい。マーカーの選択および検出系により、本発明が限定されることはない。本発明により提供されるキットは、本明細書に記載の方法を実施するために有用である。

以下の実施例は、例示のみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１−細胞結合および形質導入アッセイ
Ａ．結合アッセイ
結合アッセイについては、細胞を１５０ｃｍ^２フラスコから掻き集め、１００μｌの冷無血清（ＳＦ）培地中にて、５×１０^５細胞／ウェルで９６ウェルプレート上に播種した。Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｇｔｐ／−ｖｅｃｔｏｒ＿ｃｏｒｅ．ｓｈｔｍｌ）により以前に記載されたように、ＡＡＶベクターを生産し、１００μｌの冷ＳＦ培地中に５×１０^９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｗｅｌｌで加え、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＳＦ培地で３回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。全ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出した。細胞に結合したＧＣをリアルタイムＰＣＲにより定量した。使用したプライマーおよびプローブは、ベクターゲノムのＳＶ４０ポリＡ配列に相補的にした。Ｆプライマー：ＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡ［配列番号２］；Ｒプライマー：ＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴ［配列番号３］；ＴａｑＭａｎプローブ：６ＦＡＭ−ＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣ［配列番号４］−ＴＡＭＲＡ。細胞形質導入アッセイについては、細胞を、黒壁透明底９６ウェルプレートに１０^５細胞／ウェルで一晩播種した。次いで、プレートを４℃で１５分間静置し、ｆｆＬｕｃを発現するＡＡＶベクターの１０^９ＧＣを１００μｌの冷ＳＦ培地に加え、４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＳＦ培地で３回洗浄した。血清含有温培地を補充し、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。１ウェル当たり１５０μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン基質を加え、ルミノメーターを使用して相対光単位／秒（ＲＬＵ／ｓ）を測定することにより、ｆｆＬｕｃ発現をモニターした。

Ｂ．細胞形質導入アッセイ
細胞形質導入アッセイについては、細胞を１５０ｃｍ^２フラスコから掻き集め、黒壁透明底９６ウェルプレートに５×ｓ１０^５細胞／ウェルで一晩播種した。次いで、プレートを４℃で１５分間静置し、ｆｆＬｕｃを発現するＡＡＶベクターの１０^９ＧＣを１００μｌの冷ＳＦ培地に加え、４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＳＦ培地で３回洗浄した。血清含有温培地を補充し、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。１ウェル当たり１５０μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン基質を加え、ルミノメーターを使用して相対光単位／秒（ＲＬＵ／ｓ）を測定することにより、ｆｆＬｕｃ発現をモニターした。

Ｃ．インビボ実験
５０μｌのＰＢＳ中で１００ｍＵのＮＡ含有または非含有のＡＡＶ。ベクター注入の１時間前またはそれと同時のいずれかでＮＡを投与した。肺におけるｎＬａｃＺ遺伝子発現を、以前に記載の方法［Ｂｅｌｌ，ｅｔ ａｌ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１２４（６）：２４２７−３５（２００５）］により、投与２１日後に検討した。肺
切片を、倍率１００倍および２００倍の両方で検査した。誘導気道のＬａｃＺ陽性細胞を、倍率２００倍の視野当たりの陽性細胞をカウントすることにより定量した。マウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、３０μｌのＰＢＳ中の１００ｍＵ ＮＡまたは対照としてＰＢＳ単独を鼻腔内注入した。以前に記載の方法（上記に引用のＢｅｌｌ，２００５）により、１時間後に肺を採取し、切片を冷（−２０℃）アセトン中で５分間固定した。次いで、肺切片を、Ｃａｒｂｏ−ｆｒｅｅ（商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でブロッキングし、１５μｇ／ｍｌのローダミン標識トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｓ）アグルチニンＩ（ＲＣＡ Ｉ）および７．５μｇ／ｍｌのフルオレセイン標識セイヨウニワトコレクチン（Ｓａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａ）（ＳＮＡ）と共に室温で３０分間インキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳ中で２回洗浄し、ＤＡＰＩと共にＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中に封入した。画像を、広視野（２００倍）および共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０共焦点顕微鏡）の両方により取得した。筋肉、心臓、肝臓、および脳のＲＣＡ染色については、未処置マウスから器官を取り出し、上記のように切片を染色した。脳のＣＤ３１染色については、スライド４８をラット抗ＣＤ３１一次抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とインキュベートし、次いでフルオレセイン標識抗ラット二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびローダミン標識ＲＣＡとインキュベートした。肺のα−チューブリン染色については、スライドを上記のように処理した。ただし、切片は、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、マウス抗α−チューブリン一次抗体（Ｓｉｇｍａ）で染色し、次いでフルオレセイン標識ウマ抗マウス二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびローダミン標識ＲＣＡで染色した。画像を倍率４００倍で取得した。統計的有意性をスチューデントの２テイルｔ検定を使用して判定した。０．００１未満のＰ値を、有意であると見なした。データは、平均値±ＳＤとして示した。

実施例２−グリコシダーゼ処理およびレクチン競合。
Ｐｒｏ−５細胞を、１００μｌのＳＦ培地中で、５０ｍＵ／ｍｌのコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来ＮＡＩＩＩ型（Ｓｉｇｍａ）を用いて、または対照細胞を培地のみで３７℃で２時間処理した。次いで、一部の細胞を、５０μｌの反応緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中で、６０ｍＵ／ｍｌのβ−（１，４）−ガラクトシダーゼを用いて、または対照細胞を反応緩衝液のみで３７℃で３時間さらに処理した。次いで、細胞を３回洗浄した後、上記のように、結合および形質導入試験を行った。レクチン競合試験については、Ｐｒｏ−５細胞を、最初にＮＡで処理してシアル酸を除去した。細胞を冷ＳＦ培地で洗浄し、１００μｌのＳＦ培地中で５０μｇ／ｍｌのレクチンを、または対照として培地のみを加え、４℃で１５分間インキュベートした。次いで、レクチン溶液を除去し、ＡＡＶベクター（結合に対して５×１０^９ＧＣ、そして形質導入アッセイに対して１０^９ＧＣ）と５０μｇ／ｍｌのレクチンの混合物または対照としてベクターのみを加え、４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、上記のように、ＡＡＶの結合または形質導入について分析した。この試験に使用したレクチンには、ガラクトシル（β−１，４）Ｎ‐アセチルグルコサミンに結合するエリスリナ・クリスタガリ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ Ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ）レクチン（ＥＣＬ）、末端ガラクトース残基に結合するトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｓ）アグルチニンＩ（ＲＣＡ Ｉ）、Ｎ‐アセチルグルコサミンに結合し、シアル酸を介して相互作用もする小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）、（α−１，３））および（α−１，６）マンノースに結合するアマリリス（Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ）ハイブリッドレクチン（ＨＨＬ）、α−ガラクトースに結合するグリフォニア・シンプリシフォリア（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）レクチンＩ イソレクチンＢ４（ＧＳＬ Ｂ４）、およびα結合フコースに結合するロータス・テトラゴノロブス（Ｌｏｔｕｓ Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）レクチン（ＬＴＬ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が含まれる。

実施例３−ＡＡＶ９のグリカン結合特異性のスクリーニング
グリカンマイクロアレイ（ＧＭＡ）結合試験については、ＡＡＶ９のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、以前に記載のように［Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ｅｔ ａｌ，２００４，ＰＬｏＳ
Ｂｉｏｌ ２（８）：Ｅ２３４］、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系／Ｓｆ９発現系を使用して調製し、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（ＣＦＧ；ＮＩＨ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）のＣｏｒｅｓ ＤおよびＨにより開発されたハイスループットグリカンマイクロアレイでスクリーニングした。プリントアレイ（ｐｒｉｎｔｅｄ ａｒｒａｙ）（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｉｎｔｅｄ Ａｒｒａｙ［ＰＡ］Ｖ４．１、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ−ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｃｏｒｅｈ１４．ｓｈｔｍｌ）は、４６５種の異なる天然および合成の哺乳動物グリカンで構成され、これらには、共有結合アミン官能性を付与されたグリカンへのアミンカップリングまたはアミン反応性のＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化スライドガラスへのグリカン結合を使用して生成された異なる結合および修飾を有するシアル酸付加糖が含まれる。グリカンまたは複合糖質当たり６つのレプリケートを含有するプリントスライド（ｐｒｉｎｔｅｄ ｓｌｉｄｅ）を、２００μｇ／ｍｌのＡＡＶ９ ＶＬＰとインキュベートし、次いで、カプシドモノクローナル抗体であるＡＤＫ９（Ｊｕｒｇｅｎ Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙにより提供）を、結合したカプシドの上に載せ、続いて検出のためにＦＩＴＣ標識二次抗体（５μｇ／ｍｌで）を載せた。ＳｃａｎＡｒｒａｙ ５０００共焦点スキャナ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）を使用して、蛍光強度を検出した。ＩＭＡＧＥＮＥ画像解析ソフトウェア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｅｌ Ｓｅｇｕｎｄｏ，ＣＡ）を利用して画像を分析した。各グリカンについての相対的結合は、最高値および最低値を使用せずに計算した、６つのレプリケートのうちの４つについての平均相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表した。結合データは以下の２つの選択基準を使用して解析した：（Ｉ）最高ＲＦＵ値を有するグリカンの平均値の３標準偏差以内にあったグリカン、および（ＩＩ）平均ＲＦＵ値を計算するために使用した４つのレプリケートのＲＦＵ間の変動係数（％ＣＶ）が２０％未満のグリカン（％ＣＶ＝データの標準偏差と平均値との比をパーセントとして表現して定義した変動係数）。グリカンアレイデータの生成に関連する情報は、以下のＵＲＬ／アクセッションサイトのオープンアクセスウェブサイトから入手可能である：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ／ＨＳｅｒｖｌｅｔ？ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝ｖｉｅｗ＆ｓｉｄｅＭｅｎｕ＝ｎｏ＆ｐｓＩｄ＝ｐｒｉｍｓｃｒｅｅｎ＿３５２８。このデータセットに含まれるものは、生データ、標準化データ、試料アノテーション、実験デザイン、グリカンアレイのアノテーション、および実験プロトコール（アクセッションｉｄ ｐｒｉｍｓｃｒｅｅｎ＿３５２８）である。

結果
本明細書に記載のように、以前に記載された、いくつかのＡＡＶ（血清型１、２、５、および６）および新規ＡＡＶ血清型７、８、９、およびｒｈ３２．３３を、糖鎖付加の遺伝学および生化学を研究するために使用されるＣＨＯ細胞株Ｐｒｏ−５に対する結合について、エキソ−β−シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ、ＮＡ）により処理して、また処理せずにスクリーニングした。第一世代ＡＡＶに関する結果は、ＮＡ前処理（図１Ａ）がＡＡＶ２の結合に影響を及ぼさず、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ６の結合を少なくとも２ログ低下させるという点で予想通りであった（図１Ｂ）。新規ＡＡＶに関する試験では、ＡＡＶ７、８、およびｒｈ３２．３３の結合にはＮＡ処理の影響は示されなかったが、ＡＡＶ９では、予想外にも結合が２．５ログ上昇することが示された（図１Ｂ）。

本発明者らは、オリゴ糖上に末端ＳＡが存在すると、ＡＡＶ９への結合が阻害されるこ
と、またはＳＡを除去すると結合が増強した分子が露出されることのいずれかを推測した。最も可能性の高い候補は、ＳＡに富んだほとんどのグリカン上の末端から２番目にあるβ−１，３またはβ−１，４ガラクトースであろうと考えられた（図１Ａ）。これらの仮説は、最初に、糖鎖付加に関与した種々の酵素が欠損した、親ＣＨＯ細胞株であるＰｒｏ−５の体細胞変異体を使用して、レクチン抵抗性に基づき探究した［ＳＫ Ｐａｔｎａｉｋ ａｎｄ Ｐ．Ｓｔａｎｌｅｙ（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４１６：１５９−１８２］。Ｌｅｃ−２は、ＣＭＰ−ＳＡゴルジトランスポーターが欠損しており、末端ＳＡを欠くＮおよびＯ−グリカンの完全補完体を有しているはずである（図１Ａ）。Ｌｅｃ−８は、ＵＤＰ−Ｇａｌゴルジトランスポーターが欠損しており、ＳＡとガラクトース糖の両方を欠くＮ−およびＯ−グリカンを産生するはずである（図１Ａ）。ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）を発現する、ＡＡＶ２、６、および９に基づくベクターを、Ｐｒｏ−５、Ｌｅｃ−２、およびＬｅｃ−８細胞とインキュベートし、結合および形質導入について分析した（図２Ａ、Ｂ）。ＡＡＶ２の結合および形質導入は、３つの細胞株すべてにおいて同じであり、ＡＡＶ６に関しては、Ｐｒｏ−５細胞に対してＬｅｃ−２およびＬｅｃ−８細胞で低下した。これは、ＡＡＶ６進入の促進においてＳＡが重要であることを実証する以前の研究に基づいて予測されるものである。ＡＡＶ９については、結合および形質導入は、Ｌｅｃ−２において実質的に増加したが、Ｌｅｃ−８細胞ではベースラインレベルに低下した。これは、末端β−ガラクトースに対する結合が、ＳＡの取り込み阻害よりも取り込みを促進するという仮説とより一致している。結合と形質導入との一致は、末端ガラクトースに対する結合がＡＡＶ９形質導入の律速段階であることを示唆する。シアル酸除去の影響は、形質導入に対してよりも結合に対しての方が大きく、進入後の段階も形質導入を制限する可能性が示唆される。

ＡＡＶ９結合における末端ガラクトースの役割を、ＮＡで前処理し、次いで種々の特異性のレクチンと共培養したＰｒｏ−５細胞でさらに研究した（図２Ｃ、結合；図２Ｄ、形質導入）。ＡＡＶ９の結合を遮断したレクチンは、β−１，４ガラクトースを認識するエリスリナ・クリスタガリ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ Ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ）レクチン（ＥＣＬ）、およびいくつかのタイプのβ−ガラクトース結合を認識し、β−１，４ガラクトースに最も高い親和性を示すトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｓ）アグルチニンＩ（ＲＣＡ Ｉ）のみである。両方ともＡＡＶ２の結合には影響を及ぼさなかった。α−ガラクトース［グリフォニア・シンプリシフォリア（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）レクチンＩ イソレクチンＢ_４（ＧＳＬ Ｂ_４）］、α−１，３およびα−１，６マンノース［アマリリス（Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ）ハイブリッドレクチン（ＨＨＬ）］、およびα−フコース［ロータス・テトラゴノロブス（Ｌｏｔｕｓ Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）レクチン（ＬＴＬ）］を認識するレクチンは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ９の結合を妨害しなかった。小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）は、恐らく、ガラクトースによく結合しているＮ‐アセチルグルコサミンとのその相互作用により、ＡＡＶ９結合に対してわずかな影響を及ぼした。ＡＡＶ２およびＡＡＶ９の形質導入に対するレクチンの阻害は、それが細胞に有毒であったため情報価値がないＲＣＡを除いて、結合の結果を確認するものであった。

ＡＡＶ９取り込みのグリカン特異性の最終確認は、末端ＳＡを切断するＮＡで、またはＮＡおよびβ−ガラクトース糖の両方を除去するＮＡおよびβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）で前処理されたＰｒｏ−５細胞で実施した（図１Ａ）。ＡＡＶ２による結合および形質導入は、酵素前処理によって影響を受けなかったが、ＮＡは、以前に記載されたように、ＡＡＶ９の形質導入を増強した。この効果はβ−ｇａｌによるその後の処理により元に戻った（図２Ｅ、Ｆ）。

ＡＡＶ９のグリカン−カプシド相互作用は、４６５種の異なる天然および合成の哺乳動物グリカンで構成され、各グリカン当たり６つのレプリケートを含有するグリカンマイク
ロアレイを使用して、さらに検討した。生化学的および分子的手法により決定された、シアル酸付加されたグリカンに対するＡＡＶ１の結合（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ
Ｖｉｒｏｌ，８０：９０９３−９１０３）を、同様の戦略を使用して確認した。我々の分析では、各グリカンについて、アレイ±１ＳＤ内の４つのレプリケートの平均値による相対蛍光単位（ＲＦＵ）を尺度として結合を評価した（６つのレプリケート内の最高および最低の結合を除去した）。４つのレプリケート内の変動は、％ＣＶとして評価し、それが２０未満の場合、低いと見なした。ＡＡＶ９カプシドに対して特異的結合親和性を有するグリカンの選択は、以下の２つの独立した基準に基づくものであった；ＲＦＵを尺度とした高い全体的な結合量および％ＣＶによる評価に基づく４つのレプリケート間の低い変動。最も高い結合量のグリカンとは、最も高い結合量のグリカン４１５の３Ｓ．Ｄ．以内に入る平均ＲＦＵ値を有するものとして、任意に定義された。高い結合親和性の基準を満たした４つのグリカンのうち３つが、２０未満の％ＣＶによる評価によれば、高い特異性を示した。これら３つのグリカンである４１５、２９７、および３９９は、ＡＡＶ９結合に対する潜在的な受容体と見なすのに十分な親和性および特異性を示した。全結合量および結合特異性に基づいて、ＡＡＶ９への結合特異性があるとして選択された３つのグリカンはすべて、β−１，４結合（４１５および３９９）またはβ−１，３結合（２９７）のいずれかを有する末端ガラクトース（Ｇａｌ）を有することが示された。各グリカンは、それらの構造中に、ＧａｌＮＡｃにβ１−３またはβ１−６結合したＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃを含有し、ＡＡＶ９への結合には、シアル酸を欠損するグリカンが構造的に関連することが示唆される。細胞ベースの結合／形質導入実験と結合データをまとめると、ＡＡＶ９の親和性における末端β−ガラクトース結合の役割が確認される。

本明細書に記載のように、ＡＡＶ９による誘導気道の形質導入がＮＡを含有する製剤でマウス気道を前処置することによって増強されうるか否かを判定するために、マウスで試験を実施した。以前の研究で誘導気道の効率的なインビボ形質導入を示したＡＡＶ６が投与されたマウスとの比較がなされた［ＭＰ Ｌｉｍｂｅｒｉｓ，ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：２９４−３０１］。この形質導入は、細胞株によるインビトロ研究に基づくと、ＳＡへの結合に依存する可能性がある［Ｚ．Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０：９０９３−９１０３］。ＮＡ非存在下でのＡＡＶ９の肺送達は、予測されるように、肺胞の限定的な形質導入パターンを示した；ＡＡＶ９投与の１時間前またはその時間にＮＡを投与すると、肺胞と誘導気道上皮細胞の両方に高レベルの形質導入を示す極めて異なるパターンが生じた。ＡＡＶ６で得られた誘導気道の高レベルの形質導入は、動物がＮＡで処置されると、完全に消失し、インビボ形質導入がＳＡへの結合に依存することが確認された。グリカン構造の存在量および分布に対するＮＡの気管送達の影響を、末端ガラクトース残基（ＲＣＡ）または末端ＳＡ残基（ＳＮＡ）に結合する蛍光標識レクチンで肺切片を染色ことにより、直接研究した。ＮＡ処置の前では、ＲＣＡ染色は、肺胞細胞および誘導気道の基底側腹部に限定された。ＳＮＡについては、誘導気道の頂端膜側も染色されたが、同様のパターンが観察される。ＮＡによる処置は、誘導気道上皮細胞の染色に最も劇的な結果をもたらし、その染色はＲＣＡに対して実質的に増加し、ＳＮＡに対して中程度に減少した。ＲＣＡ結合が細胞膜またはそれを覆う粘液層に局在化しているか否かを判定するために、高解像度顕微鏡研究を実施した。ＮＡで前処置された動物からの肺切片について、気道上皮細胞の頂端膜側由来の繊毛を描写するα−チューブリンの免疫局在性とＲＣＡ染色との同時局在性を評価した。これらの研究により、ＮＡ前処置肺の誘導気道の上皮細胞表面にＲＣＡが結合していることが実証された。

ＡＡＶベクターの血管内（ＩＶ）投与に伴う形質導入にとって主要な障害は、微小循環の連続した内皮および基底層の物理的障壁である。１つの例外は、血中のベクターが肝細胞に直接到達することを可能にする有窓内皮を含有する肝臓である。ＡＡＶ９は、この障壁を部分的に克服して、骨格筋および心筋ならびにより少ない程度に中枢神経系の細胞の
ターゲティングを可能にするという点でユニークである（Ｉｎａｇａｋｉ，Ｋ．，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４（１）：４５−５３．；Ｄｕｑｕｅ，ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：１１８７−１１９６；Ｋ．Ｄ．Ｆｏｕｓｔ，ｅｔ ａｌ，（２００９），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７：５９−６５）。１０^１１および１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／マウスの用量でＡＡＶ９ベクターをＩＶ投与した後のｌａｃＺの形質導入が分析された。これは、ＲＣＡ染色による末端β−ガラクトースの存在と相関した。記載されているように、肝臓は、低用量のベクターでも効率的に形質導入され［Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅ，ｅｔ ａｌ，２００７，Ｊ
Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ５（１）：１６−２４）］；より高用量のベクターでは、心臓および骨格筋に効率的に形質導入することが可能である。［上記に引用のＩｎａｇａｋｉ，２００６］。骨格および心臓の組織に由来する筋繊維の表面には、ＲＣＡへの結合により証明されるように、高レベルの末端β−ガラクトースが示された。肝血管の内皮表面は明るく染色されたが、肝細胞にはより低レベルのＲＣＡ結合が示された。

脳組織のレクチン結合研究では、内皮細胞に対するＳＮＡではなくＲＣＡの実質的な結合が注目すべきことであった。このことは、ＡＡＶ９とＡＡＶ５の両方では脳に直接注入された場合に効率的な形質導入が達成されるが、ＡＡＶ９には、静脈内注射の後に、ＣＮＳ細胞をターゲティングするユニークな性質があるため、興味をそそる［Ｂ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：３４２８−３４３２；Ｓ．］。全身投与による治療のＣＮＳ送達にとって主要な障害は、内皮細胞のユニークな密着ネットワークから形成される血液脳関門である。内皮を横切る、受容体および吸収媒介性経細胞輸送経路がこの障害を克服するために利用された。脳の微小循環上に見出された高レベルのＡＡＶ９受容体は、経細胞輸送経路を介してＣＮＳをターゲティングするその能力においてある役割を果たしている可能性がある。

ＡＡＶ９形質導入の媒介におけるグリカンの潜在的な役割は、それらが、従来、構成成分の単糖に対する精密な特異性を伴うウイルス感染の受容体として機能することが多いため、この研究の焦点であった。末端シアル酸を含有するグリカンとの特異的な相互作用は、他のいくつかのＡＡＶ血清型を含む多くのウイルスに対して記載されている。ＡＡＶ９による結合および形質導入が末端β−ガラクトース結合を介して起こるという我々の発見は、公知のＡＡＶを含む他のいずれのウイルスに対しても記載されていない。ただし、ノロウイルスはα−ガラクトース結合を有するグリカンに結合する（Ｚａｋｈｏｕｒ，Ｍ．，（２００９）．Ｔｈｅ ａｌｐｈａＧａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ａｎｔｉｇｅｎ ｆａｍｉｌｙ ｉｓ ａ ｌｉｇａｎｄ
ｆｏｒ ｂｏｖｉｎｅ ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ Ｎｅｗｂｕｒｙ２ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ５（７）：ｅ１０００５０４．）。

グリカンアレイ研究により、３つのグリカンに対するＡＡＶ９の特異的結合が実証され、それらはすべて、末端β−ガラクトース結合を含有しており、３つの独立した手法（すなわち、グリコシダーゼ前処置、レクチン競合、および体細胞変異体）を使用して、複数の細胞株で描写されたように、形質導入におけるこの糖の重要性が確認された。これらのグリカンはすべて、それらの構造中に、ＧａｌＮＡｃにβ１−３またはβ１−６結合したＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃを含有し、ＧａｌＮＡｃによってスレオニンを介して結合されており、Ｏ−結合ガラクトース含有グリカンがＡＡＶ９に結合できることが示された。ただし、他のタイプの結合を伴うグリカンとの機能的な相互作用を除外することはできない（Ｍａｒｔｈ，Ｊ．Ｄ．１９９９．Ｏ−Ｇｌｙｃａｎｓ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ａ．Ｖａｒｋｉ，Ｒ．Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｊ．Ｅｓｋｏｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：ｐ．１０１−１１
３）。結合データに関する重要な注意は、結合親和性が、形質導入を媒介するグリコシル化受容体における機能的な重要性と必ずしも相関しないことである。重要な遺伝子治療ベクターに対する受容体は、インビトロで十分特徴づけられているが、インビボ形質導入に対するこれらの受容体の重要性はほとんど確認されていない。インビトロとインビボの形質導入間の不一致の一例は、ヒトアデノウイルス５（Ａｄ５）である。コクサッキーウイルスおよびアデノウイルスの受容体（ＣＡＲ）が、インビトロ研究に基づいて、Ａｄ５に対する受容体として単離され、インビボ遺伝子導入に伴うＣＡＲの重要性を確認する試みでは、ＣＡＲ結合性を除去されたＡｄ５が利用された。静脈内投与後における、ＣＡＲ結合性を除去されたＡｄ５ベクターの形質導入レベルおよび肝選択的プロフィールは、Ａｄ５と同様であり、インビボでは潜在的な重複した取り込み経路が示唆された。インビボでのＡｄ５形質導入の機序研究により、血液凝固因子の存在によって、非ＣＡＲ依存性経路を通して形質導入が媒介されうることが判明した。これと比較して、ＮＡと組み合わせた、ＡＡＶ９ベクターによる肺指向遺伝子導入に関する我々の研究は、ＡＡＶ９による誘導気道上皮細胞の形質導入におけるβ−ガラクトース結合の重要性を直接確認した。

インビボでの遺伝子導入に伴う肺以外の組織の細胞の形質導入におけるβ−ガラクトース結合の役割を評価することは、上皮細胞に直接到達することが可能である気道にベクターを送達する場合には存在しない送達の障壁のために、より複雑である。遺伝子治療の多くの臨床応用で検討される投与経路である、ＡＡＶ９のＩＶ投与に伴う形質導入が、この点を説明する。ほとんどのＡＡＶ血清型に基づくベクターのＩＶ点滴は、肝シヌソイドの窓が血管の障壁を除去するので、主として肝細胞に限定された形質導入をもたらす。我々の研究では、β−ガラクトースのレベルが限定されているにもかかわらす、ＡＡＶ９は肝細胞に効率的に形質導入する。より高用量のＡＡＶ９は、血管障壁を乗り越えて、高レベルの細胞表面β−ガラクトースグリカンを含有する心臓および骨格の筋線維に効率的に形質導入することができる。いくつかのグループが指摘するように、ＡＡＶ９は、より一層強化された血液脳関門でもユニークに通過し、ニューロンの限定された形質導入を可能にする。一部の血管構造物の内皮細胞表面上における、β−ガラクトース結合を有するグリカンの存在は、我々が脳で示したように、おそらく経細胞輸送の過程を通してこの放出を容易にすることに関与する可能性があると推測される。多様な構造のＯ−結合グリカンへのＡＡＶ９結合が実証されたことにより、血液または粘膜表面などにおける非細胞媒介性糖タンパク質との相互作用が、ベクターの生体分布および形質導入プロフィールを変える可能性があることが示唆される。

ＡＡＶ９に対する一次受容体の同定はまた、肺の誘導気道におけるその形質導入を増強するための薬理学的手法を開発するのに有用であった。特に、ＮＡ製剤化ベクターを、網膜などの組織または関節などの閉鎖空間の中に直接投与することができる場合に、ＡＡＶ９の他の標的に対して効果が達成されると期待される。

実施例５−ＡＡＶ９カプシドのガラクトース結合ドメインの同定
この研究では、我々は、ガラクトースに結合するために必要なＡＡＶ９カプシドの特定のアミノ酸を同定することを目的とした。部位特異的突然変異誘発および細胞結合アッセイに加え、コンピュータリガンドドッキング研究によって、我々は、２０面体の３回対称軸周りの突起の基底部にポケットを形成する、ガラクトース結合に必要な５つのアミノ酸を発見した。これらのアミノ酸の重要性はまた、マウス肺におけるインビボ研究により確認された。ガラクトースへのＡＡＶ９結合に必要な相互作用の同定は、ベクター工学の進歩をもたらしうる。

この研究では、我々は、ＡＡＶ９カプシド上のガラクトース結合モチーフの同定に努めた。我々は、インビトロおよびインビボの両方において、ガラクトース結合に対する特定のアミノ酸の必要性を判定するために、一連のアラニン変異体を生成した。これにより、
ＡＡＶ９カプシドの３回対称軸周りの突起の基底部にガラクトース結合ポケットが発見された。このことは、分子ドッキング研究によっても確認された。

Ａ．材料および方法
１．細胞株
細胞株はすべて、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手した。親細胞株Ｐｒｏ−５、シアル酸欠損細胞株Ｌｅｃ−２、およびガラクトース欠損細胞株Ｌｅｃ−８を含む、３つの異なるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を、結合および形質導入の実験に使用した。これらの細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンに加え、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを添加したα−最小必須培地（α−ＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。

２．動物
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにあるＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの動物施設に収容した。動物処置はすべて、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから承認を受けた。

３．ＡＡＶ９突然変異誘発および小規模ベクター調製
ＡＡＶ９カプシド配列の特定の荷電アミノ酸または極性アミノ酸を、図３Ａ〜３Ｂに示すように、非極性アラニンへの変異のために選択した。突然変異誘発は、Ａｇｉｌｅｎｔ
ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して実施した。その後、インビトロでの結合および形質導入のアッセイに使用するための変異体ベクターを小規模生産するために、６ウェルプレート（９．６ｃｍ^２）におけるＨＥＫ２９３細胞の３重の形質移入を、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子および変異体ＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子を発現するプラスミド、ならびにＡＡＶ２逆方向末端反復配列に隣接し、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから発現されるｆｆＬｕｃ導入遺伝子を発現するプラスミドおよびアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＡｄΔＦ６）を使用して実施した。合計２ｍｌの培地中で７２時間後、細胞および上清を回収し、３回の凍結／解凍サイクルに付した後、３５００×ｇで３０分間遠心分離して細胞片を除去した。ベクター（ＧＣ／ｍｌ）の力価は、定量ＰＣＲにより決定した。

４．インビボ研究のためのベクター生産および精製
インビボで使用するためのＡＡＶベクターは、以下に記載のＰｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒによって生産および精製された：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｇｔｐ／ｖｅｃｔｏｒ＿ｃｏｒｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ｓｈｔｍｌ。ニワトリβ−アクチンプロモーター由来で、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列に隣接したｎＬａｃＺを発現するプラスミドを、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９または変異体のｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドおよびアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＡｄΔＦ６）を有するＨＥＫ２９３細胞の３重の形質移入によりパッケージングした。イオジキサノール勾配遠心分離によりベクターを精製し、定量ＰＣＲにより力価を決定した。

５．細胞結合および形質導入アッセイ
結合アッセイについては、Ｐｒｏ−５、Ｌｅｃ−２、およびＬｅｃ−８細胞を１５０ｃｍ^２フラスコから掻き取り、１００μｌの冷無血清α−ＭＥＭ中にて、５ｘ１０^５細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。ベクターを１００μｌの冷α−ＭＥＭ中に５ｘ
１０^９ＧＣ／ウェルで加え、４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を、２００μｌのα−ＭＥＭで３回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。全ＤＮＡをＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出し、細胞に結合したベクターＧＣを定量ＰＣＲにより測定した。形質導入アッセイについては、１０^５細胞／ウェルを、黒壁透明底９６ウェルプレートに一晩播種した。培地を除去後、ｆｆＬｕｃ（１０^９ＧＣ）を発現するＡＡＶベクターを、１００μｌの完全培地中で細胞に加え、３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、１００μｌのα−ＭＥＭ中で、ウェル当たり１５０μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン基質を加え、ルミノメーターを使用して、相対光単位／秒（ＲＬＵ／ｓ）を測定することにより、ｆｆＬｕｃ発現を決定した。変異体ベクターのインビトロ形質導入効率を図４Ａおよび４Ｂに示す。

６．マウス肺の形質導入
実施例３に記載のように、マウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、３０μｌのＰＢＳ中の１００ｍＵのＮＡを鼻腔内注入した。１時間後に、ｎＬａｃＺを発現するＡＡＶ９または変異体ベクターの１０^１１ＧＣを、５０μｌのＰＢＳで鼻腔内に送達した。投与２１日後、肺でのβ−ｇａｌ発現を以前に記載の方法（上記に引用のＢｅｌｌ，２００５）により検討した。肺切片を倍率１００倍で検査した。

７．分子ドッキング研究による、ＡＡＶ９カプシド上のガラクトース結合部位の予測
ＡＡＶ９カプシド上のガラクトース結合部位を予測するために、分子ドッキングウェブサーバーＰａｔｃｈＤｏｃｋ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ３ｄ．ｃｓ．ｔａｕ．ａｃ．ｉｌ／ＰａｔｃｈＤｏｃｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）（Ｓｃｈｎｅｉｄｍａｎ−Ｄｕｈｏｖｎｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３６３−７ ２００５）を使用して、分子ドッキングを実施した。ヒトガレクチン−３に結合したガラクトースのＸ線結晶構造、ＰＤＢ登録番号１Ａ３Ｋを利用して、ガラクトースの座標を準備した（Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７３（２１）：１３０４７−５２（１９９８）。ＡＡＶ９のＸ線結晶構造の座標（未公表データ）を用い、ＶＩＰＥＲｄｂ Ｏｌｉｇｏｍｅｒジェネレータ（ｈｔｔｐ：／／ｖｉｐｅｒｄｂ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｏｌｉｇｏｍｅｒ＿ｍｕｌｔｉ．ｐｈｐ）（Ｃａｒｒｉｌｌｏ−Ｔｒｉｐｐ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ，３７ （Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４３６−４２（２００９）を使用して、三量体を構築した。ＡＡＶ９三量体に対する出力ＰＤＢファイルを、表面到達可能で、ウイルスカプシドの表面ループの構造的完全性を維持するアミノ酸を含むように短縮した。分子ドッキングの入力ファイルとしての短縮したＡＡＶ９三量体ＰＤＢファイルに含まれるアミノ酸は、Ｎ２６２−Ｙ２７７、Ｌ４３５−Ｇ４７５、およびＦ５０１−Ｍ５５９であった。分子ドッキングを、方向を指定しない形式で実施して、ガラクトースと相互作用する可能性のある、ＡＡＶ９カプシド上の部位を評価した。ドッキングはまた、短縮したＡＡＶ９三量体およびシアル酸を使用して実施した。ウマ鼻炎ウイルスとそのシアル酸受容体との複合体のＸ線結晶構造、ＰＤＢ登録番号２ＸＢＯを利用して、シアル酸の座標を準備した（Ｆｒｙ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，９１（Ｐｔ８）：１９７１−７（２０１０）。

Ｂ．結果
１．Ｎ４７０は、ＡＡＶ９ガラクトース結合に必要である
ガラクトース結合に関与しうる、ＡＡＶ９カプシドの潜在的なアミノ酸を同定するために、ＡＡＶ９のカプシドアミノ酸配列を、ＡＡＶ１、２、６、７、および８など、ガラクトースに結合しない他の血清型の配列にアライメントし、いずれのアミノ酸がＡＡＶ９にユニークであるか判定した。このアライメントに基づいて、極性または荷電側鎖のいずれかを有する１４個のアミノ酸を選択し、非極性のアラニンに変異させて、ＡＡＶ９結合に対する影響を検討した（図３Ａ）。これらの変異体カプシドコンストラクトを使用して、
小規模調製法によりベクターを作製し、野生型ＡＡＶ９と比較して同様の力価を得た。

次いで、変異体ベクターを３つの異なるＣＨＯ細胞株に加え、それらの結合能を評価した。親ＣＨＯ細胞株Ｐｒｏ−５、ならびにこの細胞株の体細胞糖鎖付加変異体であるＬｅｃ−２およびＬｅｃ−８をこれらの実験に使用した。Ｌｅｃ−２細胞は、シチジン一リン酸−シアル酸ゴルジトランスポーターが欠損しており、したがって、それらの表面グリカン上のシアル酸残基が欠損し、末端から２番目に最も一般に見られる糖であるガラクトースの露出が可能になる。Ｌｅｃ−８細胞は、ウリジン二リン酸−ガラクトースゴルジトランスポーターが欠損しており、その結果、それらの表面グリカン構造上にガラクトース糖が欠けている。これらのＣＨＯ細胞株に対するベクター結合を検討すると、ＡＡＶ９について予想された結果が観察された。Ｐｒｏ−５細胞上では低レベルの結合が観察されたが、ＡＡＶ９結合に自由な末端ガラクトース残基を有するＬｅｃ−２細胞上では１００倍の増加が示された。Ｌｅｃ−８細胞への結合は、細胞表面ガラクトースの欠如により、ベースラインレベルに戻るように低下した。変異体ベクターの１４個のうち１３個は、Ｌｅｃ−２細胞上の結合が増加するこの傾向を示し、それらがガラクトースに結合する能力を保持することが示唆された。しかしながら、位置４７０のアスパラギン残基をアラニンに変異させると（Ｎ４７０Ａ）、Ｌｅｃ−２への結合がＰｒｏ−５およびＬｅｃ−８細胞上で観察されたレベルに低下した。これにより、ガラクトースに対するＡＡＶ９結合にＮ４７０が必要であることが示された。

２．Ｎ４７０に近接して位置するさらなるアミノ酸がＡＡＶ９ガラクトース結合に必要である
さらなるＡＡＶ９変異体を生成させて、構造的にＮ４７０周辺にあるアミノ酸のいずれがまたガラクトース結合に寄与するかを決定した。この第２セットの変異体は、ＶＲ Ｉ、ＩＶ、Ｖ、およびＶＩＩを含む、カプシドの多重確定可変領域（ＶＲ）の全体にわたるアミノ酸を標的とし、これらは、ビリオンの構築された２０面体構造では、互いに近接している。Ｎ４７０近辺の１９個のアミノ酸をアラニンへの変異のために選択し（図３Ｂ）、ベクターを小規模法により生産した。以前のように、変異体はすべて、ＡＡＶ９対照と同様の高力価ベクターであり、変異はいずれも、カプシド集合体に対して負の効果を及ぼさなかった。次いで、変異体ベクターについて、Ｐｒｏ−５、Ｌｅｃ−２、およびＬｅｃ−８細胞に対する結合能を試験した（図３Ｂ）。再び、ＡＡＶ９は、Ｐｒｏ−５およびＬｅｃ−８細胞と比較して、Ｌｅｃ−２細胞への結合が１００倍増加する予想された結果を示した。試験された変異体のほとんどもまたこの表現型を示したが、４つの変異体はＬｅｃ−２細胞への結合が消失することが示された。Ｄ２７１、Ｎ２７２、Ｙ４４６、またはＷ５０３の変異はすべて、ＡＡＶ９のガラクトース結合能を消失させた。

これら１９のアラニン変異体に加えて、４つの他のＡＡＶ９部位特異的突然変異を実施した。非極性アミノ酸のＡ４７２およびＶ４７３は、Ｎ４７０の直ぐ隣に位置し、ガラクトース結合にある役割を果たす可能性があろう。この考えを試験するために、Ａ４７２およびＶ４７３の両方を極性アミノ酸のセリンまたは荷電アミノ酸のアスパラギン酸のいずれかに変異させた。小規模法によるこれらのベクターの構築は成功し、野生型ＡＡＶ９と同様の力価が得られた。ＣＨＯ細胞へのこれらのベクターの結合を検討すると、これらの変異体（Ａ４７２Ｓ、Ａ４７２Ｄ、Ｖ４７３Ｓ、およびＶ４７３Ｄ）の４つすべてが、Ｌｅｃ−２細胞への結合能を消失することが観察された。これにより、この領域に極性または電荷のいずれかを加えると、ガラクトースとの相互作用が破壊されるので、これらの非極性残基がガラクトース結合領域の形成に必要であることが示唆される。

３．ＡＡＶ９変異体のガラクトース結合はインビトロ形質導入効率を指し示す
インビトロでのＡＡＶ９変異体の形質導入を評価するために、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）を発現するベクターを、Ｐｒｏ−５およびＬｅｃ−２細胞に加えた。ガラク
トース結合を失った５つの変異体（Ｎ４７０Ａ、Ｄ２７１Ａ、Ｎ２７２Ａ、Ｙ４４６Ａ、Ｗ５０３Ａ）、ならびにガラクトース結合を保持する２つの変異体（Ｓ４６９ＡおよびＥ５００Ａ）およびＡＡＶ９対照ベクターを細胞に加え（ＭＯＩ＝１０４）、４８時間後にｆｆＬｕｃ発現を評価した。予想通り、ガラクトース結合能を欠く変異体では、ＡＡＶ９、Ｓ４６９Ａ、およびＥ５００Ａと比較して、Ｌｅｃ−２細胞の形質導入が３倍以上低下することが示された。Ｗ５０３ＡおよびＮ２７２Ａは、バックグラウンドのほんの少し上の最低の形質導入レベルを示した。Ｐｒｏ−５細胞に関しては、この細胞が結合のための豊富な末端ガラクトース残基を欠いているので、全体的な形質導入は２〜５倍低下した。しかしながら、それでも、Ｌｅｃ−２細胞について測定されたものと同様の形質導入の傾向が観察された。ガラクトース結合が欠損した変異体は、最低の形質導入を示し、ガラクトース結合を保持する２つの変異体（Ｓ４６９ＡおよびＥ５００Ａ）およびＡＡＶ９対照ベクターは、より高レベルの形質導入を示した。しかしながら、Ｅ５００Ａは、Ｐｒｏ−５細胞上で、ＡＡＶ９よりもほぼ２倍高い発現を示し、このベクターが好ましい細胞内相互作用を有しうることが示唆された。

４．ガラクトース結合が欠損した変異体ベクターは、誘導気道上皮に形質導入しない
ＡＡＶ９ベクターの鼻腔内投与の前に、マウスにノイラミニダーゼ（ＮＡ）を鼻腔内送達すると、肺の誘導気道上皮の効率的なＡＡＶ９形質導入が可能になる。このようになる理由は、ＮＡが気道細胞の表面グリカンから末端シアル酸残基を切断し、これにより、内在するガラクトース残基が露出し、ＡＡＶ９結合および形質導入が可能になるためである。ガラクトース結合が欠損した変異体ベクターが、インビボで誘導気道上皮に形質導入することができるか否かを試験した。核標的化ＬａｃＺ（ｎＬａｃＺ）を発現するベクター（１０^１１ＧＣ）を、１００ｍＵ ＮＡの注入の１時間後、マウスに鼻腔内送達し、次いで、２１日後に肺を取り出し、β−ｇａｌ発現に対して染色した。ＡＡＶ９対照ベクターは、我々の以前の結果に基づいて予想されるように、効率的な誘導気道形質導入を示した。ガラクトースへの結合能を失った５つの変異体（Ｎ４７０Ａ、Ｄ２７１Ａ、Ｎ２７２Ａ、Ｙ４４６Ａ、およびＷ５０３Ａ）は、誘導気道上皮に形質導入することができず、インビボでもガラクトース結合能がないことが実証された。ガラクトース結合を保持する、Ｓ４６９ＡおよびＥ５００Ａの変異体は、ＡＡＶ９と同様に、効率的な誘導気道形質導入を示した。

５．結合に必要なアミノ酸は、ガラクトースとの相互作用を支援するポケットをＡＡＶ９カプシド上に形成する
ＡＡＶ９の構造についての知識を使用して、カプシド表面上のガラクトース結合にとって重要なアミノ酸の位置を決定した。分子ドッキング手法を使用して、ＡＡＶ９ ＶＰ三量体上のガラクトース結合部位を同定した。上位１００のドッキング結果を評価し、カプシドの内部表面上にガラクトースを置いたドッキング解は廃棄した。残りの１３個の解はすべて、Ｎ４７０と近接してガラクトースをドッキングし、１３個の解のうちの１２個は、Ｎ４７０とＷ５０３の間にガラクトースをドッキングする。Ｎ４７０、Ｄ２７１、Ｎ２７２、Ｙ４４６、およびＷ５０３は、３回対称軸周りの突起の基底部にポケットを形成する。このポケットは、２回軸および５回軸に面する突起の外側表面およびＶＲ Ｉにより形成される、２回軸と５回軸の間の小さな表面突起によって形成される。ＡＡＶ９は、ガラクトース残基がこの領域の中でどのように適合しているかをさらに説明する結合ポケットを含有する。ガラクトース結合にとって重要であることが見出された非極性のＡ４７２およびＶ４７３のアミノ酸は、結合ポケットの底部に位置しており、したがって、ガラクトース糖がうまく挿入されることを可能にするように見える。ガラクトース結合部位の興味深い特徴は、結合にとって重要であることが示されたアミノ酸が２つの異なるモノマーに由来することであり、そこでは、Ｙ４４６、Ｎ４７０、Ａ４７２、およびＶ４７３が結合ポケットの底を形成し、結合ポケットの蓋を形成するアミノ酸であるＤ２７１、Ｎ２７２、およびＷ５０３が別の担当モノマーに由来する。これにより、適切に集合したカプシ
ドのみが受容体に結合できることを保証する機序が提供されうる。意味あることには、ガラクトース結合ポケットの同定に続いて、同じカプシド領域へのシアル酸分子のドッキングを試みたところ、このグリカンは立体障害によりポケットに収容することができないことがわかった。この観察はＡＡＶ９によるシアル酸結合の欠如と一致している。

Ｃ．考察
ＡＡＶ９の細胞表面グリカンとの相互作用を研究するこれまでの実験により、このベクターが細胞受容体としてガラクトースを使用することが実証された。Ｐｒｏ−５、ＨＥＫ２９３、およびＨｕｈ−７を含む、複数の細胞株のＡＡＶ９結合および形質導入の分析により、ＮＡを使用して、細胞表面グリカンから末端シアル酸残基を酵素的に除去すると、ＡＡＶ９結合の顕著な増加がもたらされることが明らかとなった。この増加は、ＡＡＶ９結合および形質導入を容易にする、内在するガラクトース糖の露出によるものである。ＣＨＯ糖鎖付加変異細胞株であるＬｅｃ−２およびＬｅｃ−８ならびにレクチン競合アッセイを使用するさらなる研究により、ガラクトースのこの役割が確認された。加えて、マウスに鼻腔内送達されたＮＡは、気道細胞の表面上にある末端ガラクトース残基の増加、したがってＡＡＶ９形質導入の増加をもたらした。

この研究の目標は、ガラクトース結合に必要なＡＡＶ９カプシドのアミノ酸を同定することであり、それらには、Ｎ４７０、Ｄ２７１、Ｎ２７２、Ｙ４４６、およびＷ５０３が含まれることを我々は確定した。ＡＡＶ９のガラクトース結合部位を他のガラクトース結合タンパク質と比較すると、アミノ酸組成に関して類似性が発見された。芳香族残基と糖の相互作用は、炭水化物−結合タンパク質の結合部位では一般的であり、ガラクトース−特異タンパク質について観察されている（Ｅｌｇａｖｉｓｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２２（１２）：４６２−７．；Ｓｕｊａｔｈａ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４（２３）：８５５４−６２）。これらの残基は、糖と疎水的相互作用を形成し、グルコースなどの他の糖からガラクトースを識別するのにも関与している（Ｅｌｇａｖｉｓｈ，１９９７；Ｓｕｊａｔｈａ，２００５）。これは、２つの芳香族残基、Ｙ４４６およびＷ５０３を含有する、ＡＡＶ９について我々がマッピングした結合部位と一致する。加えて、多くのガラクトース結合タンパク質は、アスパラギン、アスパラギン酸、およびグルタミンを含む、極性および荷電のアミノ酸を含有し、これらは、糖のヒドロキシル基と水素結合を形成することによりガラクトース結合に寄与することが示されている。（Ｍｏｎｔｆｏｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２（１１）：５３９８−４０３；Ｅｌｇａｖｉｓｈ，１９９７）。ＡＡＶ９カプシドのＮ４７０、Ｄ２７１、およびＮ２７２は、同様の相互作用をガラクトースと形成するように見える。他のＡＡＶ血清型の受容体結合ドメインの場所も決定されている。ＡＡＶ２のＨＳ結合部位には、以下の５つのアミノ酸がマッピングされた：Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｒ５８５、Ｒ５８８、およびＫ５３２（Ｋｅｒｎ，２００３ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７（２０）：１１０７２−８１．；Ｏｐｉｅ，２００３，Ｊ
Ｖｉｒｏｌ ７７（１２）：６９９５−７００６）。これらのアミノ酸は、カプシドの３回対称に関連した突起それぞれの内面上に塩基性パッチを形成する。ＨＳに結合することが示されたＡＡＶ６も、ＡＡＶ２について観察されたものと類似の位置に、Ｒ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８、およびＫ５３３を含むアミノ酸の同様の塩基性ストレッチを含有する（Ｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４（２４）：１２９４５−５７）。加えて、突然変異誘発研究により、Ｋ４９３、Ｋ４５９、Ｒ５７６、およびＫ５３１はすべて、ＡＡＶ６のＨＳ結合に必要であることが示され、近隣に位置している。３回軸周りの突起の基底部に位置するＡＡＶ９のガラクトース結合ドメインは、３回軸に面する内面上に位置するＡＡＶ２のＨＳ結合領域と比較すると、この構造の反対側にある。ＡＡＶ６のＨＳ結合残基はまた、ＡＡＶ９ガラクトース結合残基と比較すると、突起の外壁上に位置するが、ＶＲ ＩＩＩおよび２０面体の２回軸により近い対壁に位置する。これらの観察は、３回軸周りの突起を構築するアミノ酸および構造の重要性ならびに異なるＡＡ
Ｖ血清型に対する受容体認識におけるこの領域に隣接する残基の重要性をさらに説明する。それはまた、ＡＡＶカプシド、特に表面に露出した突起によく見られる構造可変性は、感染を成功させるために、異なる表面分子の利用を可能にするように進化してきたものであり、それぞれの形質導入表現型の重要な決定要素となるという提案を支持する。

ＡＡＶ９は、受容体相互作用により説明することができる可能性のあるユニークな特性を示す。例えば、静脈内注射の後、ＡＡＶ９は血液脳関門を越えて、成熟および新生のマウスおよびネコの脊髄の運動性ニューロンならびに新生マウスの脳のニューロンおよび成熟マウスの脳の星状細胞に形質導入することができる。さらに、非ヒト霊長類で試験した場合、ＡＡＶ９は、脊髄の運動性ニューロンおよび脳の主としてグリア細胞に形質導入した。蛍光レクチン染色により、我々は、マウス脳の血管表面に豊富なガラクトース発現を以前観察した。ＡＡＶ９は、おそらく、ガラクトースを使用して、血管を横切る経細胞輸送を容易にし、中枢神経系への進入を可能にしているのであろう。他のＡＡＶ血清型のカプシド上にガラクトース結合ドメインを工作すると、ＡＡＶ９の魅力的な表現型の移植および遺伝子治療用の新規ベクターの開発を可能にし得る。

実施例６−ＮＡ前処置は、マウス鼻気道における、ＡＡＶ媒介のｆｆＬｕｃ発現を改善する。
Ｃ５７ＢＬ６マウス（６〜８週齢、体重２０〜２５ｇ、雄性）を、ケタミン／キシラジンの混合物で麻酔した。次いで、マウスに対し、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｎ７８８５）を５μｌ、それぞれの鼻孔に投与した（ＮＡを合計８０〜１００ｍＵ）。ＮＡ前処置の１０分以内に、ニワトリβ−アクチンプロモーターの転写制御下にあるホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）を発現するＡＡＶ９ベクター（合計用量１０^１１ＧＣ）を、ＰＢＳで希釈した１５μｌアリコートとして注入した（鼻孔当たり１５μｌ）。マウスを回復させて、導入遺伝子発現（ｆｆＬｕｃ）を、ベクター接種の２４時間後という早期にモニターした。

ルミネセンスイメージングの時点で、マウスを麻酔し、ルシフェリン［両方の鼻孔に鼻孔当たり１５ｍｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン溶液（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）１５μｌ］を投与し、ルシフェリン適用の５分以内に発現に対してイメージングした。３、７、１４、２１、および２８日目でのその後のイメージング検査のために、マウスを回復させた。

図５の棒グラフに、これらの結果を図示する。これらのデータから、ノイラミニダーゼによる前処置に伴って、鼻気道でのホタルルシフェラーゼ遺伝子発現が約２倍改善することがわかる。この差は、２回にわたって観察された。さらに、ノイラミニダーゼの添加は、遺伝子発現の迅速な開始をもたらし、ＡＡＶ９ベクターインストールの２４時間以内に最も高い遺伝子発現が観察された。この発現は一週間以内に定常状態レベルに減弱した。

本明細書で引用したすべての刊行物、特許文献、およびＧｅｎＢａｎｋ配列は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。本発明は、特に好ましい実施形態に関連して記載されているが、本発明の精神から逸脱することなく、修正がなされうることは認識されるであろう。

Claims (33)

1. クレードＦ ＡＡＶ由来のカプシドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのターゲティングおよび／または細胞取り込み効率を改変する方法であって、前記方法が、クレードＦ ＡＡＶに結合するβ−ガラクトース残基を含む細胞の能力を改変する組成物を被験体に送達する工程を含む方法。
2. 前記方法が、末端のシアル酸および末端から２番目のβ−ガラクトースを有する細胞表面グリカンを含む細胞を有する被験体に、ノイラミニダーゼと組み合わせて、前記ＡＡＶウイルスベクターを送達する工程を含み、それによって、前記ノイラミニダーゼが、末端シアル酸を切断し、最後から二番目のβ−ガラクトースを末端β−ガラクトースに変換する、請求項１に記載の方法。
3. 前記方法が、前記ノイラミニダーゼで前記被験体を前処置する工程を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記方法が、前記ＡＡＶウイルスベクターおよびノイラミニダーゼを、実質的に同時に前記被験体に送達する工程を含む、請求項２に記載の方法。
5. 前記ＡＡＶウイルスベクターが、前記ノイラミニダーゼをさらに含む担体で前記被験体に送達される、請求項４に記載の方法。
6. 前記ノイラミニダーゼが、細菌ノイラミニダーゼまたはヒトノイラミニダーゼからなる群から選択される、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記末端近傍のβ−ガラクトース残基が、前記被験体において、ＡＡＶ細胞表面受容体を有する第１サブセットの細胞で機能的に除去され、それによって、前記サブセットの細胞によるＡＡＶ取り込みが低下または消失し、ＡＡＶクレードＦ受容体を有する、前記被験体の第２サブセットの細胞がＡＡＶの新たな標的になる、請求項１に記載の方法。
8. 前記β−ガラクトースが酵素的に除去される、請求項１に記載の方法。
9. 前記β−ガラクトースが、前記ＡＡＶベクターと組み合わせて、ガラクトシダーゼを前記第１サブセットの細胞に送達することにより酵素的に除去される、請求項８に記載の方法。
10. 末端β−ガラクトース残基に結合するレクチンが、前記ＡＡＶベクターと組み合わせて、ＡＡＶクレードＦ受容体を天然に有する、被験体の第１サブセットの細胞に送達され、その結果、前記ＡＡＶベクターに結合する前記受容体の能力が、前記第１サブセットの細胞において機能的に除去され、前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶクレードＦ受容体を天然に有する、前記被験体の第２サブセットの細胞にターゲティングされる、請求項７に記載の方法。
11. 前記レクチンが、カルシウム依存性レクチン、エリスリナ・クリスタガリ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ Ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ）レクチン（ＥＣＬ）、マクロファージガラクトースレクチン（ＭＧＬ）、ヒトスカベンジャー受容体Ｃ型レクチン（ＳＲＣＬ）、およびヒトマクロファージカルシウム依存性（Ｃ型）レクチンからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＭＧＬがヒトまたはラットのＭＧＬから選択される、請求項１に記載の方法。
13. 前記ＡＡＶベクターならびに末端シアル酸残基および末端近傍のβ−ガラクトース残基を有するグリカンを改変するための組成物が肺の中に注入される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記カプシドがＡＡＶクレードＦカプシドから選択され、前記ＡＡＶクレードが、１０００単離物当たり少なくとも７５％のブートストラップ値および０．０５以下のポアソン補正距離尺度による近隣結合ヒューリスティックを使用して決定された場合に、ＡＡＶ９に系統発生的に関連する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記クレードが、少なくともＡＡＶ ｈｕ．１４／ＡＡＶ９、ｈｕ．３１、およびｈｕ．３２を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記クレードが、ＡＡＶ９またはその受容体結合ドメインを含有するＡＡＶを含む、請求項１４に記載の方法。
17. 末端シアル酸残基および末端近傍のβ−ガラクトース残基を有するグリカンを含む細胞表面受容体を有する細胞において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの遺伝子送達を増加させる方法であって、前記方法が、ノイラミニダーゼおよびＡＡＶ９細胞結合ドメインを含むカプシドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組合せ剤を被験体に送達する工程を含み、前記ベクターが、ＡＡＶ逆方向末端反復配列を有するミニ遺伝子および宿主細胞においてその発現を指示する調節配列に作動的に連結された異種遺伝子をさらに含む方法。
18. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ９カプシドを含み、前記ＡＡＶ９カプシドがアミノ酸２０３〜７３６を有するＡＡＶ９ ｖｐ３と少なくとも９５％同一である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ノイラミニダーゼが前記ＡＡＶの送達前に前記被験体に送達される、請求項１７に記載の方法。
20. クレードＦ ＡＡＶ由来のカプシドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターを単離するための方法であって、前記方法が、
    固体担体に連結されたβ−ガラクトースを含む分子に接触させるように、クレードＦ ＡＡＶ由来のカプシドを有する前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターを含む試料を曝露して、それによってβ−ガラクトースに対する結合部位を有する精製標的を、その分子に選択的に結合させる工程と、
    前記固体担体を洗浄して、前記固体担体に非特異的に結合している物質を前記試料から除去する工程と、
    前記固体担体から前記ウイルスベクターを分離する工程と
    を含む方法。
21. 前記分離されたウイルスベクターを濃縮する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記固体担体がアフィニティークロマトグラフィーカラムに充填される、請求項２０または２１に記載の方法。
23. （ａ）ノイラミニダーゼ、（ｂ）ＡＡＶクレードＦカプシドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記ベクターが、ＡＡＶ逆方向末端反復配列を有するミ
    ニ遺伝子および宿主細胞においてその発現を指示する調節配列に作動的に連結された異種遺伝子をさらに含むベクター、および（ｃ）薬学的に許容可能な担体の組合せを含む組成物。
24. （ａ）レクチン、（ｂ）ＡＡＶクレードＦカプシドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記ベクターが、ＡＡＶ逆方向末端反復配列を有するミニ遺伝子および宿主細胞においてその発現を指示する調節配列に作動的に連結された異種遺伝子をさらに含むベクター、および（ｃ）薬学的に許容可能な担体の組合せを含む組成物。
25. 前記クレードＦカプシドがＡＡＶ９細胞結合ドメインを含む、請求項２３または２４に記載の組成物。
26. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ９カプシドを含み、前記ＡＡＶ９カプシドがアミノ酸２０３〜７３６にわたる配列番号１２３のアミノ酸と少なくとも９５％同一である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
27. 前記ＡＡＶが、１０００単離物当たり少なくとも７５％のブートストラップ値および０．０５以下のポアソン補正距離尺度による近隣結合ヒューリスティックを使用して決定された場合に、ＡＡＶ９に系統発生的に関連する、請求項２６に記載の組成物。
28. 前記ＡＡＶが、ｈｕ．３１およびｈｕ．３２のカプシドから選択される、請求項２７に記載の組成物。
29. 前記ノイラミニダーゼが、細菌ノイラミニダーゼまたはヒトノイラミニダーゼからなる群から選択される、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
30. 操作されたＡＡＶ９細胞結合ドメインを含むＡＡＶカプシドを有する組換えＡＡＶベクターであって、前記ＡＡＶ９細胞結合ドメインが、ＡＡＶ９、配列番号１の番号付けに基づいた位置で、ガラクトース結合ドメインを形成するアミノ酸Ｙ４４６、Ｎ４７０、Ａ４７２、Ｖ４７３、Ｄ２７１、Ｎ２７２、およびＷ５０３を含み、これらのアミノ酸の１つまたは複数が、ＡＡＶ９細胞結合ドメインが操作されたＡＡＶカプシドにとって天然である別のアミノ酸に置換されている、組換えＡＡＶベクター。
31. 誘導気道に形質導入する野生型（ｗｔ）ＡＡＶ９の天然の能力を実質的に低下または除去するように改変された組換えＡＡＶ９ベクターであって、前記ベクターが、配列番号１の位置に基づく位置２７１、４４６、および４７０からなる群から選択される天然ＡＡＶ９アミノ酸が置換されているＡＡＶ９カプシドを有する、組換えＡＡＶ９ベクター。
32. 前記天然ＡＡＶ９アミノ酸がアラニンに置換される、請求項３１に記載の組換えＡＡＶ９ベクター。
33. 肝臓および心臓に形質導入する能力を保持させながら、気道上皮へのＡＡＶ９ベクターのターゲティングを消失させる方法であって、前記方法が、配列番号１の位置に基づく位置２７１、４４６、および４７０からなる群から選択される天然ＡＡＶ９アミノ酸を別のアミノ酸に置換する工程を含む方法。

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