MX2013006255A - Composicion para inmunizacion contra streptococcus pneumoniae. - Google Patents

Abstract

Esta descripción se relaciona con un método para prevenir o tratar una recurrencia de otitis media aguda en un sujeto en riesgo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición, al menos una vez al sujeto. La composición administrada comprende al menos un polipéptido inmunogénico seleccionado del grupo que consiste de Streptococcus pneumoniae PhtD, PhtE, PcpA, LytB y pneumólisis destoxificada.

Description

COMPOSICIÓN PARA INMUNIZACIÓN CONTRA STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad a de los Estados Unidos No. de Serie 61/419,635 presentada el 3 de diciembre de 2010 y de de los Estados Unidos No. de Serie 61/510,620 presentada el 22 de julio de 2011 y los contenidos de cada una se incorporan en la presente como referencia en sus totalidades.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Este descripción se relaciona con el campo de la inmunología y, en particular, con los métodos de inmunización contra Streptococcus pneumoniae .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La otitis media es una enfermedad común en niños. El término "otitis media" abarca una serie de trastornos clínicos entre los que se incluyen miringitis, otitis media con efusión (OME) , otitis media supurativa crónica y otitis media aguda (OMA) (24). La otitis media aguda (OMA) es una enfermedad sintomática asociada con síntomas del tracto respiratorio superior, dolor, fiebre y otorrea. Es la enfermedad infecciosa más común en todo el mundo, lo que lleva al consumo excesivo de antibióticos en los niños en la mayoría de los países y para una carga sustancial de sordera y otras complicaciones en los países en desarrollo (1-3) . La OMA es bastante común y aproximadamente 60-70% de los niños experimentan al menos un episodio de OMA durante los primeros 3 años de su vida (4,5). Una subpoblación de niños experimenta otitis media recurrente. Aquellos que experimentan 3 o más episodios de OMA en un término de 6 meses o 4 infecciones en un término de un año son considerados propensos a la otitis, y representan el 10-30% de la población total de niños (4;5). La colonización nasofaríngea (NP) con uno o más microorganismos óticos es un precedente necesario para el desarrollo de la OMA. Streptococcus pneumoniae (Spn), Haemophilus influenzas no tipi fi cable (NTHi) y Moraxella catarrhalis son los microorganismos óticos más comunes que provocan OMA, y de estos tres, predomina Spn (6). Se ha observado una relación directa entre la frecuencia de colonización con NTHi y la frecuencia de OMA (J. Infect Dis 170:862-866).

La OMA recurrente se trata actualmente con diferentes antibióticos de una resistencia intensificada en la presunción de que las infecciones recurrentes son provocadas por bacterias cada vez más resistentes a antibióticos. Cuando se presentan las recurrencias a una frecuencia de 3 en 6 meses o 4 en 12 meses, entonces con frecuencia se realiza una cirugía de conducto por timpanos tomí a, con o sin adenoidectomía y/o amigdalec tomía concurrente.

Con respecto a las medidas profilácticas, en la actualidad, existen dos tipos de vacunas neumocócicas disponibles. La primera incluye polisacáridos capsulares de 23 tipos de S . pneumoniae , que en conjunto representan los tipos capsulares de aproximadamente el 90% de las cepas que provocan una infección neumocócica. Sin embargo, esta vacuna no es muy inmunogénica en niños pequeños (Fcdson, y Musher 2004, "Pneumococcal Polysacchar ide Vaccine" , pp .529-588; In Vaccines. S.A. Plotikin and W.A. Orenstein (eds.), W.B. Saunders and Co ., Philadelphi , PA; Shapiro et. al., N. Engl. J. Med. 325: 1453-1460 (1991)), ya que no generan una buena respuesta inmunitaria a los antígenos de polisacáridos antes de 2 años de edad. Esta vacuna no está recomendada para la prevención de la otitis media. Las vacunas conjugadas representan el segundo tipo disponible de vacuna neumocócica. Estas vacunas, que incluyen antígenos de polisacáridos capsulares serotipo específicos conjugados a un portador proteínico, provocan una protección serotipo específica. Actualmente están disponibles vacunas conjugadas 7-valentes y 13-valentes: la 7-valente incluye 7 antígenos de polisacáridos (derivados de las cápsulas de los serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F) y el conjugado 13-valente incluye 13 antígenos de polisacáridos (derivados de las cápsulas de los serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F, y 9A, más aquellos cubiertos por la 7-valente) . También se han desarrollado vacunas conjugadas 9-valentes y 11-valentes y cada una incluye polisacáridos serotipo específicos, además de aquellas en las 7-valentes (es decir, los serotipos 1 y 5 en las 9-valentes y los tipos 3 y 7F en las 11-valentes) .

Sin embargo, existen limitaciones para las vacunas conjugadas. Por ejemplo, ya que estas vacunas provocan una protección serotipo específica, para proteger contra los serotipos adicionales de Streptococcus pneumoniae que incluyen aquellos que predominan en el mundo en desarrollo, se deben incluir los polisacáridos serotipo específicos adicionales lo que aumenta la dificultad de fabricación (Di Fabio et al., Pediatr. Infect. Dis.

J. 20:959-967 (2001); Mulholland, Trop . Med. Int.

Health 10:497-500 (2005)). El uso de la vacuna conjugada 7-valente también ha dado lugar a un aumento en la colonización y la enfermedad con las cepas de tipos capsulares que no están cubiertas por los poli sacáridos incluidos en la vacuna (Bogaert et al., Lancet Infect. Dis. 4: 144-154 (2004); Eskola et al., N. Engl . J. Med. 344-403-409 (2001); Mbelle et al., J. Infect. Dis. 180: 1171-1176 (1999)). En cuanto a la otitis media neumocócica, las vacunas conjugadas disponibles no funcionan tan bien en la protección contra la enfermedad ya que lo hacen para una enfermedad invasiva. Además, las recurrencias de OMA todavía son posibles después de la vacunación; por ejemplo, la subpoblación de niños que son particularmente propensos a episodios recurrentes de OMA, experimentan varias recurrencias y se harán propensos a la otitis, a pesar de la inmunización con con jugados .

Por lo tanto, hay una necesidad continua por composiciones y los métodos para utilizarse en la prevención o tratamiento de la OMA neumocócica recurrente .

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Se describen métodos para prevenir o tratar una recurrencia de la OMA que resulta de una infección por s . pneumoniae en un sujeto en riesgo. Un sujeto en riesgo incluye, por ejemplo, bebés y niños que tienen episodios recurrentes de OMA (por ejemplo, propensos a otitis) y aquellos que han tenido fracaso en el tratamiento de la OMA. Por ejemplo, se proporcionan los métodos para la prevención o tratamiento de una recurrencia de la OMA que resultan de una infección por Streptococcus pneumoniae en un sujeto en riesgo de desarrollar una recurrencia de OMA neumocócica, el método comprende administrar al menos una vez al sujeto, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende al menos un polipéptido in unogénico aislado y purificado seleccionado del grupo que consiste en Streptococcus pneumoniae PhtD, PhtE, PcpA, LytB y pneumolisina des toxificada , o un fragmento inmunogénico del mismo. En ciertas modalidades, el sujeto puede haber experimentado con anterioridad al menos un episodio de otitis media aguda. En algunas modalidades, el sujeto puede haber sufrido 3 o más episodios de otitis media aguda en un período de seis meses o ha experimentado 4 o más episodios de otitis media aguda en un período de 12 meses. En algunas modalidades, el sujeto puede tener otitis media aguda.

También se describen las composiciones para utilizarse en estos métodos, para prevenir o tratar una recurrencia de OMA. Las composiciones comprenden al menos un polipéptido inmunogénico de S. pneumoniae seleccionado del grupo que consiste de PhtD, PhtE, PcpA, LytB, y pneumolisina destoxif icada, o fragmentos inmunogénicos de los mismos. La materia descrita en la presente proporciona diversas ventajas. Por ejemplo, los métodos descritos en la presente se pueden utilizar para producir o reforzar la producción de linfocitos T CD4+ antígeno específicos .

Otras características y ventajas serán evidentes a partir de la siguiente Descripción Detallada, los Dibujos y las Reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La descripción se podrá comprender mejor a partir de la siguiente descripción haciendo referenc ia a los dibujos.

Figura 1. Es una representación gráfica que muestra las frecuencias porcentuales de los ( subconjuntos de linfocitos T CD4+ con memoria CD4 5RALow + que producen diversas citoquinas contra seis antígenos neumocócicos (a) IRN-g, (b) IL-4, (c) i IL-2 y (d) IL- 17a, en la circulación de niños no 5 propensos a otitis y propensos a otitis contra diversos antígenos neumocócicos. Las gráficas de barras representan los valores porcentuales promedio de los linfocitos T CD69+ CD4+, después de las estimulaciones con antígenos. Las barras de error 0 representan el SEM, los valores P se calcularon utilizando la prueba de Mann-Whitncy . * P <0.05; **P <0.005.

Figura 2. Es una representación gráfica que muestra la comparación de las respuestas IgG contra 5 cinco antígenos de proteínas neu ocócicas (PhtD, LytB, PcpA, PhtE y Ply) en muestras séricas de dos cohortes de niños que no son propensos a otitis y los propensos a otitis. *P <0.05; **P <0.005; ***p <0.0005. El eje Y representa los títulos medios 0 geométricos y las barras de error son intervalos de confianza superiores al 95%.

Figura 3. Es una representación gráfica que muestra respuesta de los linfocitos T CD4+ a SEB. muestras PBMC provenientes de niños no propensos a 5 otitis y propensos a otitis se estimularon con SEB y i se observó una producción de citoquinas en la población de linfocitos T CD4+ con CD45RALow.

Figura 4. Es una representación gráfica que muestra la comparación del anticuerpo IgG en las 5 muestras séricas de niños a su visita aguda de OMA en 35 niños propensos a otitis, 25 a AOMTF y 34 no propensos a otitis. Nota: Todas las concentraciones de anticuerpos contra cinco proteínas están en los títulos de punto final. Se muestran las líneas para lo indicar una diferencia significa iva observada entre los dos grupos. *** Significa valor de p <0.0001, ** significa valor de p <0.001, y * significa valor de p <0.05.

Figura 5. Es una representación gráfica que 15 muestra la comparación del nivel del anticuerpo IgG con la edad (6-24 meses) contra cinco proteínas de 3. pneumoniae en niños no propensos a otitis y propensos a otitis. Los números de sueros incluidos en los puntos de tiempo 6, 9, 12, 15, 18 y 24 meses fueron 20 17, 88, 65, 61, 55 y 44, respectivamente para los niños no propensos a otitis 10, 10, 9, 10, 10 y 4, respectivamente para los niños propensos a otitis. Se encontró una diferencia significativa para la totalidad de las cinco proteínas excepto LytB 25 (p<0.07) , comparando el aumento relativo de los anticuerpo en suero IgG a través del tiempo en niños no propensos a otitis mientras que la diferencia no fue significativa en niños propensos a otitis (p = 0.40 para la proteína PhtD, p = 0.39 para LytB, p = 5 0.11 para PcpA, p = 0.09 para PhtE y p = 0.42 para Ply ).

Figura 6. Son representaciones gráficas que consisten de los paneles A, B y C: la Figura 6A muestra las frecuencias porcentuales de linfocitos B 0 con memoria antígeno específicos; la Figura 6B muestra una comparación de las respuestas de IgG a cinco antígenos neumocócicos en las muestras séricas de niños no propensos a otitis y propensos a otitis ¡ (el eje Y representa los títulos de la media 5 geométrica y las barras de error son intervalos de , confianza superior al 95%) la Figura 6C muestra la correlación entre el porcentaje de linfocitos B con memoria PhtD- espec íf icos en circulación ( ej e x) con \ la concentración de IgG PhtD específ ico en suero (ej e 0 y) .

DE SCRI PC IÓN DETALLADA DE LA INVENCI ÓN Se describen métodos para prevenir y/o tratar una recurrencia de OMA que resultan de una infección 25 por 3 , pneumcaia en un sujeto en riesgo (por ejemplo, un niño). También se describen las composiciones para utilizarse en estos métodos, para prevenir y/o tratar una recurrencia de OMA . Las composiciones comprenden al menos un polipéptido inmunogénico de S . pneumoniae seleccionado del grupo que consiste de PhtD, PhtE, PcpA, LytB, y neumolisina des toxificada , o los fragmentos inmunogénicos de los mismos. Más adelante se describen adicionalmente estos métodos y composiciones Los métodos profilácticos y terapéuticos proporcionados comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica), al menos una vez, que comprende al menos un polipéptido inmunogénico aislado y purificado de S . pneumoniae seleccionado del grupo que consiste de PhtD, PhtE, PcpA, LytB, y pneumolisina destoxif icada , o un fragmento inmunogénico de los mismos, a sujetos en riesgo de desarrollar una recurrencia de OMA neumocócica (es decir, una infección por S. pneumoniae sintomática que da por resultado en una recurrencia de OMA).

La población de sujetos en riesgo incluyen, por ejemplo, bebés y niños que hayan tenido al menos uno, dos, tres, cuatro o más episodios de OMA en su vida, bebés y niños que sean propensos a otitis (es decir, que hayan tenido 3 o más episodios de OMA en 6 meses o 4 o más episodios de OMA en un año), y bebés y niños que tengan o hayan tenido un fracaso en el tratamiento de la OMA {es decir, aquellos con OMA que hayan fracasado en alcanzar la erradicación bacteriana y/o resolución de los síntomas después de al menos 48 horas de una terapia adecuada con antibióticos, o bebés y niños cuyas señales y síntomas de OMA regresaron en un término de 14 días de haber completado un curso de tratamiento con antibióticos) . La población de sujetos en riesgo también incluye, por ejemplo, bebés y niños: con una propensión genética para la OMA recurrente (Casselbrant ML et al JAMA 1999; 282:2 125-2130), que asisten a guarderías infantiles fuera del hogar, que asisten a guarderías familiares, con uno o más padres/cuidadores que fuman, utilizando un chupón, fórmula en lugar de amamantar, y que hayan experimentado una infección de OMA en los primeros 6 meses de vida (Bentdal et al Int . J. Ped. Otorhinolaryngol . 2007; 71:125 1-1259) . A medida que los niños crecen, se vuelven menos propensos a la OMA debido a los cambios anatómicos en la trompa de Eustaquio. Por lo general, el niño propenso a otitis "crece más" su propensión alrededor de los 3 a 5 años (40, 48-51) . En ciertas modalidades, el sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar OMA neumocócica.

Como se analiza en los Ejemplos en la presente, los niños propensos a otitis (es decir, una población de sujetos en riesgo) en comparación con los niños no propensos a otitis exhiben hiposensibilidad inmunológica contra los antígenos Spn (por ejemplo, PhtD, PhtE, PcpA, LytB, Ply) . Por ejemplo, en comparación con niños no propensos a otitis, los niños propensos a otitis tienen una falta o reducción de linfocitos T CD4+ con memoria funcional antígeno específicos neumocócicos (por ejemplo, los linfocitos T CD4+ con memoria funcional específicos para PhtD, PhtE, PcpA, LytB, o Ply) y niveles reducidos de IgG en suero contra antígenos neumocócicos (por ejemplo, para PhtD, PhtE, PcpA, LytB, Ply) . Sin embargo, estos niños no tienen una deficiencia de linfocitos T con memoria funcional total o para provocar respuestas de anticuerpos proporcionadas por linfocitos B contra antígenos vacunados. Los niños con fracaso en el tratamiento de OMA (AOMTF) se comportan inmunológicament e similares a los niños propensos a otitis. Los sujetos en riesgo son aquellos que exhiben esta hiposensibilidad inmunológica contra los antígenos Spn, tal como por ejemplo, PhtD, PhtE, PcpA, LytB y/o Ply .

En el sentido en que se utiliza en la presente, prevenir una recurrencia de OMA en un sujeto se debe entender como la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición descrita en la presente a un sujeto para proteger al sujeto del desarrollo de una recurrencia de Otitis media aguda neumocócica.

En el sentido en que se utiliza en la presente, tratar una recurrencia de OMA (o un sujeto propenso a otitis o un sujeto con OMA recurrente) se debe entender como la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición descrita en la presente a un sujeto que está afligido con otitis media aguda provocada por S . pneumoniae o se haya expuesto a S. pneumoniae , y estuvo afligido anteriormente con OMA, donde el objetivo es curar, sanar, mitigar, aliviar, alterar, remediar, disminuir, mejorar o afectar la condición (por ejemplo, OMA) o los síntomas de la enfermedad (es decir , OMA).

Una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad que proporcione un efecto | terapéutico para una condición determinada y un régimen de administración. Una cantidad 5 terapéuticamente eficaz se puede determinar por el trabajador médico con experiencia normal con base en las características del paciente (edad, peso, sexo, condición, complicaciones de otras enfermedades, etc) . La cantidad terapéuticamente eficaz se 10 influirá adicionalmente por la vía de administración de la composición.

En ciertos ejemplos, la administración de la composición provoca o aumenta la producción de linfocitos T CD4+ antígeno específicos. Los 15 linfocitos T CD4+ antígeno específicos cuya producción se provoca o mejora pueden ser por ejemplo aquellos que producen las citoquinas LFN-g, IL-4, IL-2 y/o IL-17a. Por ejemplo, en una modalidad, la administración de la composición provoca o mejora la 20 producción de linfocitos T CD4+ antígeno específicos que producen IFN-g. En el sentido en que se utiliza en la presente, "provoca o mejora la producción de linfocitos T CD4+ antigeno específicos" se debe entender que se aumenta la cantidad o porcentaje (%) 25 de los linfocitos T CD4+ antígeno específicos. La cantidad de células puede aumentar, por ejemplo, 25%, 30%, 35%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o más con respecto a la cantidad de células existentes inmediatamente antes de la administración de la composición .

En una modalidad, la administración de la composición provoca o mejora la producción de anticuerpos antígeno específicos (por ejemplo, IgG). Al provocar o mejorar la producción de anticuerpos, la concentración total (título) de IgG total antígeno específico se aumenta en relación con la concentración (titulo) existente inmediatamente antes de la administración. El título de dilución de punto final puede aumentar, por ejemplo, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200% o más en el título existente inmediatamente antes de la administración de la composición. En una modalidad, se aumenta el título de IgG antígeno específico, por ejemplo, 2, 3, o 4 veces en relación con el título existente inmediat mente antes de la administración de la composición .

También se describe un método para reducir el riesgo de una recurrencia de otitis media aguda en un sujeto en riesgo (por ejemplo, un niño) qquuee comprende administrar al sujeto una composición que comprende uno o más de los polipéptidos inmunogénicos descritos. El riesgo de esta recurrencia puede ser reducido mediante los métodos descritos en la presente .

En modalidades particulares, se proporciona un método para prevenir o tratar la condición de propensión a otitis en un sujeto en riesgo (es decir, un sujeto que haya tenido al menos uno o más episodios recurrentes de OMA).

La presente descripción también proporciona métodos para producir una respuesta inmunitaria en un sujeto en riesgo al administrar las composiciones descritas en la presente. Esto se puede alcanzar mediante la administración de una formulación farmacéuticamente aceptable de la composición al sujeto para efectuar la exposición de al menos un polipéptido inmunogénico al sistema inmunitario del su jeto.

Esta descripción también proporciona el uso de uno o más polipéptidos inmunogénicos de S. pneumoniae en composiciones tales como, por ejemplo, composiciones de vacuna. Esta composición después de la administración a un sujeto (por ejemplo, un mamífero), induce o mejora una respuesta inmunitaria dirigida contra el polipéptido inmunogénico (es decir, el antígeno) incluido en la composición. Esta respuesta puede incluir la generación de anticuerpos (por ejemplo, a través de la estimulación de linfocitos B) o una respuesta con base en linfocitos T (por ejemplo, una respuesta citolítica) . Estas respuestas pueden ser o no protectoras o neutralizantes. Una respuesta inmunitaria protectora o neutralizante es una que sea perjudicial para el organismo infeccioso correspondiente al antígeno (por ejemplo, del cual se deriva el antígeno) y benéfica para el sujeto (por ejemplo, al reducir o prevenir una infección) . En el sentido en que se utiliza en la presente, los anticuerpos protectores o neutralizantes pueden ser reactivos para el polipéptido de S. pneumoniae tipo silvestre correspondiente y pueden reducir o inhibir la letalidad del organismo S . pneumoniae tipo silvestre correspondiente o del polipéptido de S . pneumoniae correspondiente cuando se prueba en sujetos (por ejemplo, mamíferos) . Una composición inmunológica que, con la administración a un sujeto, da por resultado en una respuesta inmunitaria protectora o neutralizante se puede considerar como una vacuna.

Las composiciones descritas en la presente son de utilidad en los métodos para prevenir o tratar una recurrencia de OMA en un sujeto en riesgo, el, como se definió anteriormente está en riesgo de ser infectado con S . pneumoniae y desarrollar una recurrencia de OMA. La composición también es de utilidad en los métodos para prevenir o tratar la OMA recurrente .

Las composiciones descritas en la presente se pueden administrar mediante una vía adecuada tal como, por ejemplo, percutánea (por ejemplo, intramuscular, intravenosa, intraper itoneal o subcutánea), transdérmica, mucosa (por ejemplo, intranasal) o tópica, en las cantidades y los regímenes determinados que sean adecuados por un experto en la téenica. Por ejemplo, 10Ong -50O/xg, 1-240/g, 10-100pg, 5-5(^g, o 10-25/ig del polipéptido inmunogénico se pueden administrar por dosis. Para los fines de profilaxis o terapia, la vacuna se puede administrar una vez o múltiples veces. Por ejemplo, la vacuna se puede administrar 1, 2, 3, o 4 veces, por ejemplo. En un ejemplo, una o más administraciones se pueden presentar como parte de un denominado protocolo de "primer refuerzo" . Cuando se administran múltiples dosis, las dosis pueden estar separadas entre sí por, por ejemplo, una semana, un mes o varios meses.

Los polipéptidos inmunogénicos descritos en la presente tienen actividad inmunogénica . El término "actividad inmunogénica" se refiere a la capacidad de un polipéptido para provocar una respuesta inmunológica en un sujeto (por ejemplo, un mamífero) . Una respuesta inmunológica a un polipéptido es el desarrollo en un animal de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos al polipéptido. Por lo general, una respuesta inmunológica incluye, pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T auxiliares, linfocitos T supresores y/o linfocitos T citotóxicos, dirigidos a un epítope o epítopes del polipéptido. El término "epítope" se refiere al sitio en un antígeno al cual los linfocitos B y/o linfocitos T específicos responden de tal forma que se produzca el anticuerpo . La actividad inmunogénica puede ser protectora . El término "actividad inmunogénica protectora" se refiere a la capacidad de un polipéptido para provocar una respuesta inmunológica en un sujeto que previene o inhibe la infección por S . pneumoniae (por ejemplo, inhibe una infección por dando por resultado en una recurrencia de OMA).

En ciertas modalidades, se puede formular una composición de múltiples componentes que comprende dos, tres, cuatro o más polipéptidos inmunogénicos para proteger contra una recurrencia de OMA que resulte de una infección por v. pneumoniae . Una modalidad preferida de esta composición comprende polipéptidos inmunogénicos de PhtD y PcpA. Una composición preferida adicional comprende polipéptidos inmunogénicos de PhtD, PcpA y neumólisis desintoxicada. Ciertas composiciones de múltiples componentes preferidas para utilizarse como se describe en la presente se exponen en la W02011/ 075823 (presentada el 20.12.2010 y titulada, Immunogenic Compos itions) .

Los componentes de una composición de múltiples componentes de preferencia son compatibles y se combinan en proporciones adecuadas para evitar una interferencia antigénica y optimizar cualesquiera posibles sinergias. Por ejemplo, las cantidades de cada componente pueden estar en la variación entre aproximadamente 5 mg y 500 mg por dosis, 5 mg hasta aproximadamente 10 mg por dosis, 25 mg hasta aproximadamente 50 mg por dosis o 50 mg y 100 m por dosis. De mayor preferencia, la variación puede ser entre aproximadamente 10 mg y 50 mg por componente antigénico por dosis.

Polipéptidos inmunogénicos Los ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos inmunogénicos se pueden aislar por ejemplo, pero sin limitación de células de s . pneumoniae tipo silvestre o mutantes o alternativamente, se pueden obtener directamente del ADN de una cepa de a . pneumoniae que porte la secuencia génica de ADN aplicable (por ejemplo, PcpA o phtD) , mediante el uso de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) o mediante el uso de téenicas estándar alternativas que son reconocidas por un experto en la técnica. Las posibles cepas de uso incluyen, por ejemplo, cepas de S . pneumoniae TIGR4 y 14453. En modalidades preferidas, los polipéptidos son recombinantes derivados de la cepa de S. pneumoniae 14453.

Los polipéptidos descritos en la presente se pueden producir utilizando técnicas estándar de biología molecular y sistemas de expresión (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Tercera edición por Sambrook et, al, Coid Spring Harbor Press, 2001) . Por ejemplo, se puede aislar un fragmento de un gen que codifica para un polipéptido inmunogénico y el polinucleótido que codifica para el polipéptido inmunogénico se puede clonar en cualquier vector de expresión disponible comercialmente (tal como, por ejemplo, los vectores pBR322 y pUC (New England Biolabs, Inc ., Ipswich, MA) ) o los vectores de expresión/purificación (tales como por ejemplo, los vectores de fusión GST (Pfizer, Inc., Piscataway, N.J.)) y luego se expresa en un hospedero procariota, viral o eucariota adecuado. La purificación luego se puede alcanzar por medios convencionales, o en el caso de un sistema de expresión/purificación comercial, de acuerdo con las instrucciones del fabricante .

Alternativamente, los polipéptidos inmunogénicos descritos en la presente, entre los que se incluyen las variantes, se pueden obtener a través de síntesis química utilizando procedimientos automatizados comerciales, tales como, por ejemplo, métodos de síntesis en fase sólida exclusiva, en fase sólida parcial, condensación de fragmentos o síntesis en solución.

Los polipéptidos de PcpA inmunogénicos comprenden la secuencia de aminoácidos de PcpA de longitud total (en presencia o ausencia de la secuencia de señal) , fragmentos de la misma, y variantes de la misma. Los polipéptidos de PcpA adecuados para utilizarse en las composiciones descritas en la presente incluyen, por ejemplo, aquellas con los números de acceso GenBank CAB04758, YP817353, AAK76194, NP359536, ZP01835022, y ZP01833419, y aquellas descritas en la presente y en los Ejemplos más adelante, entre otros. En una modalidad, el PcpA tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NOs: 1 ó 2.

La secuencia de aminoácidos de PcpA de longitud total en el genoma 14453 de S . pneumoniae es la SEQ ID NO. 1. Los polipéptidos de PcpA preferidos pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tenga 50% o mayor identidad (por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5% o más) con la SEQ ID NO: 1, 2 ó 3. Los polipéptidos preferidos pueden comprender un fragmento de al menos 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más, por ejemplo, aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs: 1, 2 ó 3. Los fragmentos preferidos comprenden un epítope de las SEQ ID NOs. 1, 2 ó 3.

Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos del término N de las SEQ ID NOs: 1 ó 2 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) y/o uno o más aminoácidos del término C de las SEQ ID NOs: 1 ó 2 mientras que conserven al menos un epítope de las SEQ ID NOs: 1 ó 2. Los fragmentos preferidos adicionales carecen de la secuencia de señal del término N de las SEQ ID NOs: 1 ó 2. Un polipéptido de PcpA preferido es la SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 1 (PcpA, cepa Spn 14453) MKKTTILSLTTAAVILAAYVPNEPILADTPSSEVIKETKVGSI IQQN IKYKVLTVEGNIRTVQV GNGVTPVEFEAGQDGKPFTIPTKITVGDKVFTVTEVASQAFSYYPDETGRIVYYPSSITIPSSIK KIQKKGFHGSKAKTIIFDKGSQLEKIEDRAFDFSELEEIELPASLEYIGTSAFSFSQKLKKLTFS SSSKLELISHEAFANLSNLEKLTLPKSVKTLGSNLFRLTTSLKHVDVEEGNESFASVDGVLFSKD KTQLIYYPSQKNDESYKTPKETKELASYSFNKNSYLKKLELNEGLEKIGTFAFADAIKLEEISLP NSLETIERLAFYGNLELKELILPDNVKNFGKHVMNGLPKLKSLTIGNNINSLPSFFLSGVLDSLK E1HIKNKSTEFSVKKDT FAIPETVKFYVTSEHIKDVLKSNLSTSNDI IVEKVDN IKQETDVAKPK KNSNQGWGWVKDKGLWYYLNESGSMATGWVKDKGLWYYLNESGSMATGWVKDKGLWYYLNESGS MATGWVKDKGLWYYLNESGSMATGWVKDKGLWYYLNESGSMATGWVKDKGLWYYLNESGSMATGW VKDKGLWYYLNESGS¾ATGWFTVSGKWYYTYNSGDLLVNTTTPDGYRVNANGEWVG SEQ ID NO: 2 (PcpA) MKKTTILSLTTAAVILAAYVPNEPILAAYVPNEPILADTPSSEVIKETKVGSI IQQNNIK YKVLTVEGNIGTVQVGNGVTPVEFEAGQDGKPFTIPTKITVGDKVFTVTEVASQAFSYYP DETGRIVYYPSSITIPSSIKKIQKKGFHGSKAKTIIFDKGSQLEKIEDRAFDFSELEEIE LPASLEYIGTSAFSFSQKLKKLTFSSSSKLEL1SHEAFANLSNLEKLTLPKSVKTLGSNL FRLTTSLNMLMLRGMIVASVDGVSFQSKTQLIYYPSQKNDESYKTPKETKELASYSFNKN SYLKKLELNEGLQKIGTFAFADATKLEEISLPNSLETIERLAFYGNLELKELILPDNVKN FGKHVMNGLPKFLTLSGNNINSLPSFFLSGVLDSLKE1HIKNKSTEFSVKKDTFAIPETV KFYVTSEHIKDVLKSNLSTSNDIIVEKVDNIKQETDVAKPKKNSNQGWGWVKDKGLWYY LNESGSMATGWVKDKGLWYYLNESGSMATGWVKDKGLWYYLNESGSMATGWVKDKGLWYY LNESGSMATGWVKDKGLWYYLNESGSMATGWVKDKGLWYYLNESGSMATGWVKDKGLWYY LNESGSMATGWVKDKGLWYYLNESGSMATGWVKDKGLWYYLNESGSMATGWVKDKGLWYY LNESGSMATGWVKDKGLWYYLNESGSMATGWFKVSGKWYYTYNSGDFI SEQ ID NO: 3 (estructura PcpA) MADTPSSEVIKETKVGSI IQQNNIKYKVLTVEGNIGTVQVGNGVTPVEFEAGQDGKPFTIPTKIT VGDKVFTVTEVASQAFSYYPDETGRIVYYPSSITIPSSIKKIQKKGFHGSKAKTIIFDKGSQLEK IEDRAFDFSELEEIELPASLEYIGTSAFSFSQKLKKLTFSSSSKLELISHEAFANLSNLEKLTLP KSVKTLGSNLFRLTTSLKHVDVEEGNESFASVDGVLFSKDKTQLI YYPSQKNDESYKTPKETKEL ASYSFNKNSYLKKLELNEGLEKIGTFAFADAIKLEEISLPNSLETIERLAFYGNLELKELILPDN VKNFGKHVMNGLPKLKSLTIGNNINSLPSFFLSGVLDSLKE1HIKNKSTEFSVKKDTFAIPETVK FYVTSEHIKDVLKSNLSTSND11VEKVDNIKQETDVAKPKKNSNQGWGWVKDKG Un polipéptido inmunogénico de PcpA carece opcionalmente de la secuencia de anclaje del dominio de unión a colina presente típicamente en la proteína de PcpA madura de origen natural . La secuencia de origen natural del anclaje de unión a colina de la proteína de PcpA madura se describe en la WO 2008/022302 como la SEQ ID NO:52. Más particularmente, un polipéptido inmunogénico comprende una región N-terminal de PcpA de origen natural con una o más sustituciones de aminoácidos y entre aproximadamente 60 y 99% de identidad de secuencia o cualquier identidad entre, por ejemplo, 80, 85, 90 y 95% de identidad, con el PcpA de origen natural. La región N-terminal puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1 ó 2 (o las SEQ ID NOs : 1, 2, 3, 4, 41 ó 45 de la W02 008/022 302), en presencia o ausencia de una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos y en presencia o ausencia de la secuencia de señal. La región N-terminal puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga entre aproximadamente 60 y 99% de identidad de secuencia (o cualquier identidad entre 80 a 99% de identidad) con las SEQ ID NOs: 1, 2 ó 3 (expuestas en el Listado de Secuencias en la presente) o las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, o 41 de la W02008/022302 .

Los fragmentos inmunogénicos de las SEQ ID NOs: 1, 2 ó 3 pueden comprender, por ejemplo, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 y 191 residuos de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1, 2 ó 3 o cualquier número de residuos de aminoácidos entre 5 y 191. Los ejemplos de fragmentos inmunogénicos de PcpA se describen en la WO 2008/022302.

Las variantes de los polipéptidos inmunogénicos descritos en la presente pueden comprender una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las variantes de los polipéptidos de PcpA inmunogénicos incluyen la secuencia de aminoácidos que tenga entre aproximadamente 50 y 99% de identidad de secuencia (o cualquier identidad entre 50 y 99% de identidad) con las SEQ ID NOs: 1, 2 ó 3 o cualquier fragmento de las mismas. Las variantes se seleccionan por su capacidad inmunogénica utilizando métodos bien conocidos en la téenica .

Los polipéptidos de PhtX inmunogénicos adecuados para las composiciones descritas en la presente incluyen, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de PhtD o PhtE de longitud total (en presencia o ausencia de la secuencia de señal), los fragmentos inmunogénicos de la misma, las variantes de la misma y las proteínas de fusión de la misma. Los polipéptidos de PhtD adecuados para utilizarse en las composiciones descritas en la presente incluyen, por ejemplo, aquellas con los Nos. de acceso GenBank AAK06760, YP816370 y NP35851, entre otras. La secuencia de aminoácidos de PhtD de longitud total en el genoma de S . pneumoniae 14453 es la SEQ ID NO: 4 y el que proviene de la cepa TIGR4 es la SEQ ID NO: 5. Un polipéptido preferido de PhtD (derivado del genoma 14453 de S. pneumoniae) es la SEQ ID NO :6. Los polipéptidos de PhtE adecuados para utilizarse en la composición descrita en la presente incluyen, por ejemplo, aquellos con los números de acceso GenBank AAK06761, YP816371 y NP358502, entre otros. La secuencia de aminoácidos de PhtE de longitud total en el genoma 14453 de S . pneumoniae es la SEQ ID NO: 7.

Un polipéptido preferido de PhtE (derivado del genoma 14453 de S . pneumoniae ) es la SEQ ID NO.8.

SEQ ID NO:4 (cepa 14453 de PhtD Spn) MKINKKYLAGSVAVLALSVCSYELGRHQAGQVKKESNRVSYIDGDQAGQKAENLTPDEVSKREGI NAEQIVIKITDQGYVTSHGDHYHYYNGKVPYDAIISEELLMKDPNYQLKDSDIVNEIKGGYVIKV DGKYYVYLKDAAHADNIRTKEEIKRQKQEHSHNHNSRADNAVAAARAQGRYTTDDGYIFNASDII EDTGDAYIVPHGDHYHYIPKNELSASELAAAEAYWNGKQGSRPSSSSSYNANPVQPRLSENHNLT VTPTYHQNQGENISSLLRELYAKPLSERHVESDGLIFDPAQITSRTARGVAVPHGNHYHFIPYEQ MSELEKRIARIIPLRYRSNHWVPDSRPEQPSPQSTPEPSPSLQPAPNPQPAPSNPIDEKLVKEAV RKVGDGYVFEENGVSRYIPAKDLSAETAAGIDSKLAKQESLSHKLGAKKTDLPSSDREFYNKAYD LLAR1HQDLLDNKGRQVDFEVLDNLLERLKDVSSDKVKLVDDILAFLAPIRHPERLGKPNAQITY TDDEIQVAKLAGKYTTEDGYIFDPRDITSDEGDAYVTPHMTHSHWIKKDSLSEAERAAAQAYAKE KGLTPPSTDHQDSGNTEAKGAEAIYNRVKAAKKVPLDRMPYNLQYTVEVKNGSLI IPHYDHYHNI KFEWFDEGLYEAPKGYSLEDLLATVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKADQDSKPDEDKE HDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIAD AEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ SEQ ID NO:5 (cepa TIGR4 de PhtD Spn) MKINKKYLAGSVAVLALSVCSYELGRHQAGQVKKESNRVSYIDGDQAGQKAENLTPDEVS KREGINAEQIVIKITDQGYVTSHGDHYHYYNGKVPYDAIISEELLMKDPNYQLKDSDIVN EIKGGYV IKVDGKYYVYLKDAAHADNIRTKEEIKRQKQEHSHNHGGGSNDQAWAARAQG RYTTDDGYIFNASDI IEDTGDAYIVPHGDHYHYIPKNELSASELAAAEAYWNGKQGSRPS SSSSYNANPAQPRLSENHNLTVTPTYHQNQGENISSLLRELYAKPLSERHVESDGLIFDP AQITSRTARGVAVPHGNHYHFIPYEQMSELEKRIARI IPLRYRSNHWVPDSRPEQPSPQS TPEPSPSPQPAPNPQPAPSNPIDEKLVKEAVRKVGDGYVFEENGVSRYIPAKDLSAETAA GIDSKLAKQESLSHKLGAKKTDLPSSDREFYNKAYDLLAR1HQDLLDNKGRQVDFEALDN LLERLKDVPSDKVKLVDDILAFLAPIRHPERLGKPNAQITYTDDEIQVAKLAGKYTTEDG YlFDPRDITSDEGDAYVTPHMTHSHWIKKDSLSEAERAAAQAYAKEKGLTPPSTDHQDSG NTEAKGAEAIYNRVKAAKKVPLDRMPYNLQYTVEVKNGS LIIPHYDHYHNIKFEWFDEGL YEAPKGYTLEDLLATVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKVDQDSKPDEDKEHDEV SEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAE IPQVENSVINAKIA DAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ SEQ ID NO:6 (estructura de PhtD derivada de la cepa 14453 de Spn) MGSYELGRHQAGQVKKESNRVSYIDGDQAGQKAENLTPDEVSKREGINAEQIVIKITDQGYVTSH GDHYHYYNGKVPYDAIISEELLMKDPNYQLKDSDIVNEIKGGYVIKVDGKYYVYLKDAAHADNIR TKEEIKRQKQEHSHNHNSRADNAVAAARAQGRYTTDDGYIFNASDIIEDTGDAYIVPHGDHYHYI PKNELSASELAAAEAYWNGKQGSRPSSSSSYNANPVQPRLSENHNLTVTPTYHQNQGENISSLLR ELYAKPLSERHVESDGLIFDPAQITSRTARGVAVPHGNHYHFIPYEQMSELEKRI ARIIPLRYRS NHWVPDSRPEQPSPQSTPEPSPSLQPAPNPQPAPSNPIDEKLVKEAVRKVGDGYVFEENGVSRYI PAKDLSAETAAGIDSKLAKQESLSHKLGAKKTDLPSSDREFYNKAYDLLAR1HQDLLDNKGRQVD FEVLDNLLERLKDVSSDKVKLVDDILAFLAPIRHPERLGKPNAQITYTDDEIQVAKLAGKYTTED GYIFDPRDITSDEGDAYVTPHMTHSHWIKKDSLSEAERAAAQAYAKEKGLTPPSTDHQDSGNTEA KGAEAIYNRVKAAKKVPLDRMPYNLQYTVEVKNGSLI IPHYDHYHNIKFEWFDEGLYEAPKGYSL EDLLATVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKADQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENH AGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAE IPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPS IRQNAM ETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ SEQ ID NO:7 (PhtE) MKFSKKYIAAGSAVIVSLSLCAYALNQHRSQENKDNNRVSYVDGSQSSQKSENLTPDQVS QKEGI QAEQ I VI KI TDQGYVTSHGDHYHYYNGKVP YDAL FS EELLMKDPNYQLKDAD I VN EVKGGYI IKVDGKYYVYLKDAAHADNVRTKDEINRQKQEHVKDNEKVNSNVAVARSQGRY TT DGYVFNPADI IEDTGNAYIVPHGGHYHYI PKSDLSASELAAAKAHLAGKNMQPSQLS YSSTASDNNTQSVAKGSTSKPANKSENLQSLLKELYDSPSAQRYSESDGLVFDPAKI I SR TPNGVAIPHGDHYHFIPYSKLSALEEKIARMVPISGTGSTVSTNAKPNEWSSLGSLSSN PSSLTTSKELSSASDGYI FNPKDI VEETATAYI VRHGDHFHYI PKSNQIGQPTLPNNSLA TPSPSLPINPGTSHEKHEEDGYGFDANRI IAEDESGFVMSHGDHNHYFFKKDLTEEQIKA AQKHLEEVKTSHNGLDSI SSHEQDYPSNAKEMKDLDKKIEEKI AGIMKQYGVKRESIWN KEKNAIIYPHGDHHHADPIDEHKPVGIGHSHSNYELFKPEEGVAKKEGNKVYTGEELTNV VNLLKNSTFNNQNFTLANGQKRVSFSFPPELEKKLGINMLVKIJITPDGKVLEKVSGKVFG EGVGNIANFELDQPYLPGQTFKYTIASKDYPEVSYDGTFTVPTSLAYKMASQTIFYPFHA GDTYLRVNPQFAVPKGTDAL VRVFDE FHGNAYLENNYKVGE IKLPI PKLNQGTTRTAGNK IPVTFMANAYLDNQSTYIVEVPILEKENQTDKPSILPQFKRNKAQENLKLDEKVEEPKTS EKVEKEKLSETGNSTSNSTLEEVPTVDPVQEKVAKFAESYGMKLENVLFNMDGTIELYLP SGEVIKKNMADFTGEAPQGNGENKPSENGKVSTGTVENQPTENKPADSLPEAPNEKPVKP ENSTDNGMLNPEGNVGSDPMLDPALEEAPAVDPVQEKLEKFTASYGLGLDSVIFNMDGTI ELRLPSGEVIKKNLSDLIA SEQ ID NO: 8 (estructura de PhtE derivada de la cepa 14453 de Spn) MGKNMQPSQLSYSSTASDNNTQSVAKGSTSKPANKSENLQSLLKELYDSPSAQRYSESDGLVFDP AKI ISRTPNGVAI PHGDHYHFI PYSKLSALEEKIARMVPISGTGSTVSTNAKPNEWSSLGSLSS NPSSLTTSKELSSASDGYIFNPKDIVEETATAYIVRHGDHFHYIPKSNQIGQPTLPNNSLATPSP SLPINPGTSHEKHEEDGYGFDANRI IAEDESGFVMSHGDHNHYFFKKDLTEEQIKAAQKHLEEVK TSHNGLDSLSSHEQDYPGNAKEMKDLDKKIEEKIAGIMKQYGVKRESIWNKEKNAIIYPHGDHH HADPIDEHKPVGIGHSHSNYELFKPEEGVAKKEGNKVYTGEELTNWNLLKNSTFNNQNFTLANG OKRV S FS FP FE LEKK LG I NML V K L I TPDG K/ LE V SGK V FG£G VGN I AN FE LOOP Y L PG yT FKYT IASKDYPEVSYDGTFTVPTSLAYKMASQTIFYPFHAGDTYLRVNPQFAVPKGTDALVRVFDEFHG NAYLENN YKVGE IRL PI PKLNQGTTRTAGNKI PVTFMANAY LDNQSTY IVEVP I LEKENQT DKPS ILPQFKRNKAQENSKLDEKVEEPKTSEKVEKEKLSETGNSTSNSTLEEVPTVDPVQEKVAKFAES YGMKLENVLFNMDGTIELYLPSGEVIKKNMADFTGEAPQGNGENKPSENGKVSTGTVENQPTENK PADSLPEAPNEKPVKPENSTDNGMLNPEGNVGSDP LDPALEEAPAVDPVQEKLEKFTASYGLGL DSVI FNMDGTI ELRLPSGEVI KKNLSDFI A Los polipéptidos de PhtX inmunogénicos (por ejemplo, PhtD o PhtE) pueden incluir la proteína de longitud total con la secuencia de señal unida, la proteína de longitud total madura con el péptido señal (por ejemplo, aproximadamente 20 aminoácidos en el N-terminal) eliminados, las variantes de PhtX (de origen natural o de otra manera, por ejemplo, derivadas sintéticamente) y los fragmentos inmunogénicos de PhtX (por ejemplo, los fragmentos que comprenden al menos 15 ó 20 aminoácidos contiguos presentes en la proteína de PhtX madura de origen natural) . Los fragmentos inmunogénicos y las variantes de los polipéptidos de PhtX son capaces de provocar una respuesta inmunitaria específica para la secuencia de aminoácidos de longitud total madura correspondiente. Los ejemplos de fragmentos inmunogénicos de PhtD se describen en la publicación del PCT W02009/012588 .

Los polipéptidos de PhtD preferidos para utilizarse pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tenga 50% o mayor identidad (por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5% o más) con las SEQ ID NOs :4, 5 ó 6. Los polipéptidos preferidos para utilizarse pueden comprender un fragmento de al menos 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos consecutivos de las SEQ ID N0s:4, 5 ó 6. Los fragmentos preferidos comprenden un epítope de las SEQ ID NOs :4, 5 ó 6. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos provenientes del término N de las SEQ ID NOs:4, 5 ó 6 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) y/o uno o más aminoácidos provenientes del término C de las SEQ ID NOs:4, 5 ó 6, mientras que conserven al menos un epítope de las SEQ ID NOs :4, 5 ó 6. Los fragmentos preferidos adicionales carecen de la secuencia de señal proveniente del término N de las SEQ ID NOs:4 ó 5. Un polipéptido de PhtD preferido es la SEQ ID NO:6.

Los polipéptidos de PhtE preferidos para utilizarse pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tenga 50% o mayor identidad (por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5% o más) con la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO:8. Los polipéptidos preferidos para utilizarse pueden comprender un fragmento de al menos 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs :7 ú 8.

Los fragmentos preferidos comprenden un epítope proveniente de la SEQ ID NO.7 o para la SEQ ID NO:8. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos provenientes del término N de las SEQ ID NOs. 7 ú 8 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) y/o uno o más aminoácidos del término C de las SEQ ID NOs: 7 ú 8, mientras que conserven al menos un epítope de las SEQ ID NOs. 7 ú 8. Los fragmentos preferidos adicionales carecen de la secuencia de señal del término N de la SEQ ID NO :7. Un polipéptido de PhtE preferido es la SEQ ID NO :8.

Los polipéptidos de LytB inmunogénicos incluyen la proteína de longitud total con la secuencia de señal unida, la proteína madura de longitud total con el péptido señal eliminado, las variantes de LytB (de origen natural o de otra manera, por ejemplo, derivadas sintéticamente) y los fragmentos de LytB inmunogénicos (por ejemplo, los fragmentos que comprenden al menos 15 ó 20 aminoácidos contiguos presentes en la proteína LytB madura de origen natural) . Las variantes y fragmentos inmunogénicos de los polipéptidos de LytB inmunogénicos descritos en la presente pueden ser capaces de provocar una respuesta inmunitaria específica para la secuencia de aminoácidos madura de longitud total correspondiente. Los polipéptidos de LytB adecuados para utilizarse en las composiciones descritas en la presente incluyen, por ejemplo, aquellos con los Nos. de Acceso GenBank CAA09078, YP816335, AB J55408, AA19156, NP358461, y AAK75086, entre otros.

Los polipéptidos de LytB preferidos para utilizarse pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tenga 50% o mayor identidad (por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5% o más) con las SEQ ID NOs :9, 10 u 11. Los polipéptidos preferidos para utilizarse pueden comprender un fragmento de al menos, por ejemplo, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 O más aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs:9, 10 u 11. Los fragmentos preferidos comprenden un epítope de las SEQ ID N0s:9, 10 u 11. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos del término N de las SEQ ID NOs:9, 10 u 11 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) y/o uno o más aminoácidos del término C de las SEQ ID NOs:9 ó 10, mientras que conserven al menos un epítope de las SEQ ID NO:9 ó 10. Los fragmentos preferidos adicionales carecen de la secuencia de señal del término N de la SEQ ID NO: 10.

Un polipéptido de LytB preferido es la SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO : 9 (LytB) MKKVRFI FLALLFFLAS PEGAMASDGTWQGKQYLKEDGSQAANEWVFDTHYQSWFYIKAD ANYAENEWLKQGDDYFYLKSGGYMAKSEWVEDKGAFYYLDQDGKMKRNAWVGTSYVGATG AK VIEDWVYDSQYDAWFYIKADGQHAEKE WLQ 1 KGKD YYFKSGGYLLTSQWINQAYVNAS GAKVQQGWLFDKQYQSWFY IKENGNYADKEWI FENGHYYYLKSGGYMAANEWIWDKESWF YLKFDGKIAEKEWVYDSHSQAWYYFKSGGYMAANEWIWDKESWFYLKFDGKMAEKEWVYD SHSQAWYYFKSGGYMTANEWTWDKESWFYLKSDGKIAEKEWVYDSHSQAWYYFKSGGYMT ANEWIWDKESWFYLKSDGKMAEKEWVY DSHSQAWYYFKSGGYMAKNETVDGYQLGSDGKW LGGKATNKNAAYY QWPVTANVYDSDGEKLSYI SQGSWWLDKDRKSDDKRLAIT I SGLS GYMKTEDLQALDASKDFI PYYES DGHRFYHYVAQNASI PVASHLS DMEVGKKYYSADGLH t'ÜGFKLENPt'LFKÜLTEA'i'NYSAEELEa VFSLLNiNNSLLENKGA'rFKEAEEHYHINALy LLAHSALESNWGRSKIAKDKNNFFGITAYDTTPYLSAKTFDDVDKGI LGATK WKENY I D RGRTFLGNKASGMNVEYAS DPYWGEKIASVMMKINEKLGGKD SEQ ID NO : 10 ( LytB ) MNLGEFWYNKINKNRGRRLMKKVRFIFLALLFFLASPEGAMASDGTWQGKQYLKEDGSQA ANEWVF DTHYQSWFYIKADANYAENEWLKQGDDYFYLKSGGYMAKSEWVEDKGAFYYLDQ DGKMKRNAWV GT S YVGAT GAKVIED WVYDSQYDAWFYIKADGQHAEKE WLQIKGKD YYFK SGGYLLTSQWINQAYVNASGAKVQQGWLFDKQYQSWFYIKENGNYADKEWI FENGHYYYL KSGGYMAANEWIWDKESWFYLKFDGKMAEKEWVYDSHSQAWYYFKSGGYMTANEWIWDKE SWFYLKSDGKIAEKEWVYDSHSQAWYYFKSGGYMTANEWIWDKESWFYLKSDGKIAEKEW VYDSHSQAWYYFKSGGYMAKNETVDGYQLGSDGKWLGGKTTNENAAYYQWPVTANVYDS DGEKLS YI SQGSWWLDKDRKSDDKRLAITI SGLSGYMKTEDLQALDASKDFI PYYESDG HRFYHYVAQNASI PVASHL SDME V GKKYY S ADGLHFDGFKLENPFLFKDLTE ATNY S AEE LDKVFSLLN INNS LLENKGATFKEAEEHYH I NALYLLAHSALESNWGRSKI AKEKNNFFG I TAYDTTPYLSAKTFDDVDKGI LGATKWIKENY IDRGRTFLGNKASGMNVEYASDPYWGE KIASVMMKINEKLGGKD SEQ ID NO: 11 (estructura LytB derivada de la cepa 14453 de Spn; que carece de la secuencia de señal y las regiones de unión a colina; la secuencia derivada del vector está subrayada) MGKATNENAAYY QWPVTANVYDSDGEKLS YI SQGSVVWLDKDRKSDDKRLAIT I SGLSGYMKTE DLQALDASKDFI PYYESDGHRFYHYVAQNAS I PVA SHLSDMAV GKKYYS ADGLHFDGFKLENPFL FKDLTEATNY S AEELDKVFSLLN INNSLLENKGATFKEAEEHYHINALYLLAHSALESNWGRSKI AKDKNNFFG IT AYDTTPYL S AKTFDD VDKGI LGATKWIKENY I DRGRTFLGNKASGMNVE Y A S DP YWGEKIAS-VMMKINEKLGGKD Pneumolisina (Ply) es una toxina de act ivación citolítica implicada en múltiples pasos de la patogénesis neumocócica, incluyendo la inhibición del movimiento ciliar y la interrupción de las uniones estrechas entre las células epiteliales (Hi rst et al. Clinical and Experimental Immunology (20 04). Se conocen diversas pneumolisinas y (después de la desintoxicación) podrían ser adecuadas para utilizarse en las composiciones descritas en la presente, incluyendo, por ejemplo, los números de acceso GenBank Q04IN8, P0C2J9, Q7ZAK5, y AB021381, entre otros. En una modalidad, Ply tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 12. Los polipéptidos inmunogénicos de neumolisina pueden incluir la proteína de longitud total con la secuencia de señal unida, la proteína madura de longitud total con el péptido señal eliminado, las variantes de neumolisina (de origen natural o de otra manera, por ejemplo, derivadas sintéticamente) y los fragmentos inmunogénicos de neumolisina (por ejemplo, los fragmentos que comprenden al menos 15 ó 20 aminoácidos contiguos presentes en la proteína madura de neumolisina de origen natural). Las variantes y fragmentos inmunogénicos de los polipéptidos inmunogénicos de neumolisina pueden ser capaces de provocar una respuesta inmunitaria específica para la secuencia de aminoácidos madura de longitud total correspondiente. Los polipéptidos inmunogénicos de neumolisina típicamente están destoxi ficados , es decir, carecen o tienen toxicidad reducida en comparación con la proteína de neumolisina tipo silvestre madura producida y liberada por S. pneumoniae . Los polipéptidos inmunogénicos de neumolisina pueden ser destoxif icados por ejemplo, químicamente (por ejemplo, utilizando tratamiento con formaldehí do ) o genéticamente (por ejemplo, producidos recombinantemente en una forma mutada) . Los ejemplos preferidos de neumolisina des toxificada inmunogénica se describen en la publicación del PCT No. WO 2010/071986. En una modalidad, la neumolisina inmunogénica destoxif icada tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13.

Los polipéptidos de neumolisina preferidos pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tenga 50% o mayor identidad (por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5% o más) con la SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 13. Los polipéptidos preferidos pueden comprender un fragmento de al menos 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs: 12 ó 13. Los fragmentos preferidos pueden comprender un epítope de la SEQ ID NO: 12 o para la SEQ ID NO: 13. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos del término N de las SEQ ID NOs. 12 ó 13 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) y/o uno o más aminoácidos del término C de las SEQ ID NOs: 12 ó 13 mientras que conserven al menos un epítope de las SEQ ID NOs: 12 ó 13. LOS fragmentos preferidos adicionales carecen de la secuencia de señal del término N de la SEQ ID NO: 12.

Un polipéptido de neumolisina destoxi ficada inmunogénico preferido es la SEQ ID NO: 13.

SEQ ID NO: 12 (PLY) MANKAVNDF ILAMNYDKKKLLTHQGESIENRF1KEGNQLPDEFW IERKKRSLSTH'i'SDI SVTATNDSRLYPGALLWDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSN SSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDF NSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSV AYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGA RWTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNWAT FQNSTDYVETKVTAYRN GDLLLDHSGAYVAQYYITWDELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRN LSVKtRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRnSIWGTTLYPQVEDKVEND SEQ ID NO: 13 (estructura PlyD derivada de la cepa 14453 de Spn) ¡ NRAVNDFI LA2VWYDKKKLLTHQGES IENRFIKEGNQLPDEFWIERKKRSLSTNTSDI SVTACNDSRLYPGALLWDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSI DLPGLASSDSFLQVEDPSN SSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNYPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDF NSVHSGEKQIQrVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGI S AERPLVYI SSV AYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILCGDPSSGA RWTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPI SYTTSFLRDNWATFQNSTDYVETKVTAYRN GDLLLDHSGAYVAQYYITWDELSYDHQGKE VLTPKAWDRNGQDLTAHFTTS P LKGNVRN LSVKIREATGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTB IWGTTLYPQVEDKVEND Las variantes de los polipéptidos inmunogénicos descritos en la presente se seleccionan por su capacidad in unogénica utilizando métodos bien conocidos en la téenica. Estas variantes pueden comprender modificaciones de aminoácidos. Por ejemplo, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos incluyen cambios de sustitución, de inserción o de supresión. Las sustituciones, supresiones, inserciones o cualquier combinación de las mismas se pueden combinar en una sola variante siempre y cuando la variante sea un polipéptido inmunogénico . Las inserciones incluyen fusiones terminales amino y/o carboxilo así como inserciones intrasecuenc ia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Las inserciones normalmente serán inserciones más pequeñas que aquellas de las fusiones terminales amino o carboxilo, por ejemplo, en el orden de uno a cuatro residuos. Las supresiones se caracterizan por la eliminación de uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia proteínica. Típicamente no más de aproximadamente 2 a 6 residuos se eliminan en cualquier sitio en dentro de la molécula de proteína. Estas variantes normalmente se preparan mediante mutagénesis sitio específica de los nucleótidos en el ADN que codifica para la proteína, produciendo así un ADN que codifica para la variante, y después de esto expresar el ADN en un cultivo de células recombinantes. Las téenicas para realizar mutaciones de sustitución en los sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas e incluyen, de manera enunciativa, mutagénesis del cebador M13 y mutagénesis mediante PCR . Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, aunque se pueden presentar en diversas ubicaciones diferentes a la vez. Las variantes de sustitución son aquellas en las cuales al menos un residuo se ha eliminado y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Estas sustituciones en general se realizan de acuerdo con la siguiente Tabla y se denominan como sustituciones conservadoras. Otras son bien conocidas por aquellos expertos en la téenica.

En el sentido en que se utiliza en la presente, la sustitución de aminoácidos puede ser conservadora o no conservadora. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo por un residuo no nativo de tal forma que exista poco o ningún efecto sobre el tamaño, polaridad, carga, hidrof obic idad, o hidrof ilicidad del residuo de aminoácido en esa posición y, en particular, no dé por resultado en una inmunogenicidad disminuida. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras adecuadas se muestran en la Tabla 1 a continuación.

TABLA 1 Un experto en la téenica será capaz de determinar las variantes adecuadas de los polipéptidos y/o fragmentos proporcionados en la presente utilizando técnicas bien conocidas.

Los análogos pueden diferir de los polipéptidos de S . pneumoniae de origen natural en la secuencia de aminoácidos y/o en virtud de las modificaciones sin secuencia. Las modificaciones sin secuencia incluyen cambios en la acetilación, met ilación , fosforilación carboxi lación , o glucosilación. Una "modificación" de un polipéptido puede incluir polipéptidos (o análogos de los mismos, tales como, por ejemplo, fragmentos de los mismos) que se derivan química o enzimáticamente en uno o más aminoácidos constituyentes. Estas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de cadena lateral, modificaciones estructurales, y modificaciones N y C terminales tales como, por ejemplo, acetilación, hidroxilación, metilación, amidación, y la unión de porciones de carbohidratos o lípidos, cofactores, y lo semejante, y combinaciones de los mismos. Los polipéptidos modificados descritos en la presente pueden conservar la actividad biológica de los polipéptidos sin modificar o pueden exhibir una actividad biológica reducida o aumentada .

La similitud estructural de dos polipéptidos se puede determinar al alinear los residuos de los dos polipéptidos (por ejemplo, un polipéptido candidato y el polipéptido de, por ejemplo la SEQ ID NO: 2) para optimizar el número de aminoácidos idénticos a lo largo de la longitud de sus secuencias; están permitidas brechas en una o ambas secuencias para realizar la alineación para optimizar el número de aminoácidos idénticos, aunque los aminoácidos en cada secuencia debe seguir permaneciendo, no obstante, en su orden correcto. Un polipéptido candidato es el polipéptido que se comparará con el polipéptido de referencia. Un polipéptido candidato puede estar aislado, por ejemplo, de un microbio, o se puede producir utilizando una de las téenicas recombinantes, o se puede sintetizar química o enzimát icamente .

Un análisis de comparación por pares de la secuencias de aminoácidos se puede llevar a cabo utilizando un algoritmo global, por ejemplo, Nccdlcman-Wunsch . Alternativamente, los polipéptidos se pueden comparar utilizando un algoritmo de alineación local tal como el programa Blastp del algoritmo de búsqueda BLAST 2, como se describe por Tatiana et al., (FEMS Microbiol . Lett, 174 247-250 (1999), y está disponible en el sitio web National Centre for Biotechnology Information (NCBI) . Se pueden utilizar los valores por defecto para todos los parámetros de búsqueda BLAST 2, incluyendo la matriz = BLOSUM62; penalización por brecha abierta = 11, penalización por brecha de extensión = 1, brecha x disminuir x = 50, espera 10, tamaño de una palabra = 3, y filtrar. El algoritmo de Smith y Waterman es otra herramienta de alineación local que se puede utilizar (1988).

En la comparación de dos secuencias de aminoácidos, la similitud estructural se puede consultar por la "identidad" porcentual o se puede por la "similitud" porcentual. "Identidad" se refiere a la presencia de aminoácidos idénticos. "Similitud" se refiere a las presencias no sólo de aminoácidos idénticos, sino que también a la presencia de sustituciones conservadoras . Una sustitución conservadora de un aminoácido en un polipéptido descrito en la presente se puede seleccionar de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido, que se muestra en la Tala 1.

Composiciones Las composiciones (por ejemplo, las composiciones de vacuna) se pueden administrar en presencia o ausencia de un adyuvante. Los adyuvantes en general son sustancias que pueden intensificar la inmunogenicidad de los antígenos. Los adyuvantes pueden desempeñar una función en la inmunidad tanto adquirida como innata (por ejemplo, los receptores similares a tañido) y pueden funcionar en una variedad de formas, no todas se comprenden.

Muchas sustancias, tanto naturales como sintéticos, han demostrado que funcionan como adyuvantes. Por ejemplo, los adyuvantes pueden incluir, aunque no se limitan a sales minerales, mezclas escualeno, péptido de muramilo, derivados de saponina, preparaciones en la pared celular micobacteriana , ciertas emulsiones, lípido A de monofosf orilo, derivados de ácido micólico, tens ioactivos no iónicos de copolímeros en bloque, Quil A, subunidad B de la toxina de cólera, polifosf aceno y derivados, complejos inmunoest imulantes (ISCOMs), adyuvantes de citoquinas, adyuvante MF59, adyuvantes lipidíeos, adyuvantes mucosos, ciertas exotoxinas bacterianas y otros componentes, ciertos oligonucleót idos , PLG, y otros. Estos adyuvantes se pueden utilizar en las composiciones y métodos descritos en la presente.

En ciertas modalidades, la composición se administra en presencia de un adyuvante que comprende una emulsión de aceite-en-agua que comprende al menos escualeno, un solvente acuoso, un tensioactivo no iónico de polioxietileno alquiléter hidrófilo, un tensioactivo no iónico hidrófobo, en donde la emulsión aceite-en-agua se puede obtener mediante un proceso de temperatura por inversión de fase y en donde el 90% de la población en volumen de las gotas de aceite tiene un tamaño menor de 200 nm, y opcionalmente menor de 150 n . Este adyuvante se describe en la W02007006939 (Vaccine Composition Comprising a Thermoinversable Emulsión) que se incorpora en la presente en su totalidad. La composición también puede incluir el producto E6020 (que tiene el Número CAS 287 180-63-6), además de, o en lugar de la emulsión aceite -en-agua de escualeno descrita. El producto E6020 se describe en la US2007/0082875 (que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) .

En ciertas modalidades, la composición incluye un agonista de TLR (por ejemplo, el agonista de TLR4 ) solo o conjuntamente en combinación con un adyuvante. Por ejemplo, el adyuvante puede comprender un agonista de TLR4 (por ejemplo, TLA4 ), escualeno, un solvente acuoso, un tensioactivo hidrófilo no iónico que pertenece al grupo químico de alquiléter de polioxietileno , un tensioactivo hidrófobo no iónico y que sea termorevers ible . Los ejemplos de estos adyuvantes se describen en la W02 007080308 (Thermoreversible Oil-in-Water Emulsión) que se incorpora en la presente en su totalidad. En una modalidad, la composición se potencia con una combinación de CpG y un adyuvante de sal de aluminio (por ejemplo, Alumbre) .

Los adyuvantes de sales de aluminio (o compuestos) se muestran entre los adyuvantes para utilizarse en la práctica descrita en la presente. Los ejemplos de adyuvantes de sales de aluminio para utilizarse incluyen hidróxido de aluminio (por ejemplo, oxihidróxido de aluminio cristalino AIO(OH), e hidróxido de aluminio Al(OH)3. El hidróxido de aluminio es un compuesto de aluminio que comprende iones AIJ+ y grupos hidroxilo (-OH) . También se pueden utilizar mezclas de hidróxido de aluminio con otros compuestos de aluminio (por ejemplo, hidroxif osfato o hidroxisulfato) donde la mezcla resultante es un compuesto de aluminio que comprende grupos hidroxilo. En modalidades particulares, el adyuvante de aluminio es oxihidróxido de aluminio (por ejemplo, Alhidrogel). Es bien sabido en la téenica que las composiciones con adyuvantes de sales de aluminio no deben ser expuestas a temperaturas extremas, es decir, por debajo de la congelación (0°C) o calor extremo (por ejemplo, ³70°C) ya que esta exposición puede afectar adversamente la estabilidad y la inmunogenicidad tanto del antígeno como el adyuvante adsorbidos .

En una modalidad particular, el compuesto de aluminio (por ejemplo, el adyuvante de hidróxido de aluminio) se trata con fosfato.

En una modalidad preferida, se agrega fosfato al adyuvante de hidróxido de aluminio en la forma de una sal. De preferencia, se proporcionan iones fosfato mediante una solución tampón que comprende fosfato disódico monosódico.

En una práctica preferida, como se ejemplifica en la presente, el compuesto de aluminio (por ejemplo, oxihidróxido de aluminio) se trata con fosfato (por ejemplo, mediante un proceso como se describe en la WO2011/075822 (presentada el 20.12.2010 y titulada, Immunogenic Compositions and Related Methods) . En este proceso, se mezcla una suspensión acuosa de oxihidróxido de aluminio (aproximadamente 20 mg/mL) con una solución tampón de fosfato (por ejemplo, aproximadamente 400 mol/L). Se prefiere una concentración final de fosfato entre aproximadamente 2M hasta 20 mM . La mezcla luego se diluye con un tampón (por ejemplo, Tris-HCl, Tris-HCl con solución salina, HEPES) para preparar una suspensión de oxihidróxido de aluminio y fosfato (P04). De preferencia, el tampón es Tris-HCl 10 mM y NaCl 150 mM a un pH de aproximadamente 7.4. La suspensión luego se mezcla durante aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente. De preferencia, la concentración de aluminio elemental en la suspensión final está en una variación entre aproximadamente 0.28 mg/mL a 1.68 mg mL . De mayor preferencia, la concentración de aluminio elemental es de aproximadamente 0.56 mg/ml .

Los polipéptidos inmunogénicos (por ejemplo, PcpA, PhtD), individualmente o en combinación luego se pueden adsorber al hidróxido de aluminio tratado.

Las composiciones de preferencia pueden estar en forma líquida, aunque pueden estar liofilizadas (tal como mediante métodos estándar) o en espuma deshidratada (como se describe en la W02 009012 601, Antigen-Adjuvant Compositions and Methods) . Una composición de acuerdo con una modalidad está en forma líquida. Una dosis de inmunización se puede formular en un volumen entre 0.5 y 1.0 mi. Las formulaciones líquidas pueden estar en cualquier forma adecuada para administración incluyendo, por ejemplo, una solución, o suspensión. De esta forma, las composiciones pueden incluir un medio líquido (por ejemplo, solución salina o agua) , que pueden estar amortiguado.

El pH de la formulación (y la composición) de preferencia puede estar entre aproximadamente 6.4 y 8.4. De mayor preferencia, el pH es aproximadamente 7.4. Una variación de pH ilustrativa de las composiciones es 5-10, por ejemplo, 5-9, 5-8, 5.5-9, 6-7.5, o 6.5-7. El pH se puede mantener mediante el uso de un tampón.

Las formulaciones farmacéuticas de las composiciones inmunogénicas también pueden incluir opcionalmente uno o más excipientes (por ejemplo, diluyentes, espesantes, tampones, conservadores, agentes tensioact ivos, adyuvantes, detergentes y/o inmunoest imulantes ) que son bien conocidos en la téenica. Los excipientes adecuados serán compatibles con el antígeno o antígenos y con el adyuvante como se sabe en la técnica. Los ejemplos de diluyentes incluyen aglutinantes, desintegrantes, o dispersantes tales como almidón, derivados de celulosa, fenol, polietilenglicol , propilenglicol o glicerina. Las formulaciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más ingredientes activos tales como agentes antimicrobianos, agentes anti inflamator ios y anestésicos. Los ejemplos de detergentes incluyen un Tween (polisorbato) , tal como Tween 80. Se conocen en la téenica los excipientes adecuados para inclusión en la composición.

En una modalidad de inmunización potenciada, por ejemplo, los polipéptidos inmunogénicos y/o fragmentos de los mismos pueden estar acoplados covalentemente a polisacáridos bacterianos para formar conjugados de polisacáridos. Estos conjugados pueden ser útiles como inmunógenos para provocar una respuesta inmunogénica dependiente de linfocitos T dirigida contra el polisacárido bacteriano conjugado para los polipéptidos y/o fragmentos de los mismos.

Las composiciones inmunogénicas se pueden presentar en forma de kit que comprende la composición inmunogénica y un adyuvante o una solución para reconstitución que comprende uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables para facilitar la reconstitución de la composición para administración a un mamífero utilizando dispositivos convencionales o de otro tipo. Este kit podría incluir opcionalmente el dispositivo para administración de la forma líquida de la composición (por ejemplo, jeringa hipodérmica, matriz de microagujas) y/o las instrucciones de uso.

EJEMPLOS La descripción anterior describe en general ciertas modalidades de esta materia. Se puede obtener una comprensión más completa haciendo referencia a los siguientes Ejemplos específicos. Estos Ejemplos se describen únicamente con fines de ilustración y no se pretende limitar el alcance de esta descripción. Se contemplan cambios en la forma y sustitución de equivalentes según las circunstancias puedan sugerir o juzgar convenientes. Aunque se han empleado términos específicos en la presente, se pretende que estos términos tengan un sentido descriptivo y no para fines de limitaciones.

Los métodos de genética molecular, bioquímica de proteínas e inmunología utilizados, aunque no descritos explícitamente en esta descripción y estos Ejemplos, se reportan ampliamente en la bibliografía científica y quedan dentro de la capacidad de aquellos expertos en la téenica.

Respuestas inmunirarias Los linfocitos T CD4+ se consideran de importancia primordial contra patógenos extracelulares, tales como por ejemplo, S. pneumonaie . Tras la estimulación con células resentadoras de antígenos (APCs) cargadas con antígenos en el contexto de moléculas de MHC clase II, los linfocitos T CD4+ nativos se pueden diferenciar en subconjuntos T-auxiliares (Th) diferentes funcionalmente. El compromiso de los diferentes subconjuntos Th depende de una compleja interacción con las APCs en un ambiente permisivo, incluyendo el tipo y carga antigénicos, las moléculas co-estimuladoras y la señalización de citoquinas (7-9). Por ejemplo, las células Thl, caracterizadas por interleucina (IL)-2, interf eron-gamma (IFN-g) y el factor de necrosis tumoral beta (TNF-b) , la producción son de importancia primordial para erradicar los patógenos intracelulares . Las células Th2 , esenciales en la eliminación de patógenos extracelulares, expresan IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, e IL-25. Las células Thl 7 descubiertas recientemente secretan IL-17, IL-21, e IL-22 (10).

Las respuestas de linfocitos T con memoria se generan ya sea durante la respuesta efectora (modelo lineal o división asimétrica) o son el remanente de una gran reserva de clonotipos efectores que se contraen y persisten después de la eliminación de patógenos (11). La memoria inmunológica , con sus respuestas rápidas de recuerdos y la alta producción de citoquinas representa un mecanismo muy eficaz para asegurar una rápida protección contra una infección prevalente, y sirve como una defensa principal contra el reencuentro con patógenos en los puntos de entrada portal tales como la mucosa respiratoria (12; 13).

Las respuestas fuertes de los linfocitos T y B con memoria se generan durante tanto al inicio de una infección natural, así como después de la vacunación, con linfocitos con memoria que pueblan los sitios linfoides y no linfoides (14-16). Una vez generados, los linfocitos T con memoria pueden ser detectados en la circulación sanguínea durante un período de tiempo (15; 17; 18). Los conceptos actuales para generar inmunidad contra Spn han evolucionado a partir de estudios en ratones que definen una función principal para los subconjuntos con memoria CD4+ Th (auxiliar) (Th-1, Th-2 y Th-17) (19-21) . En modelos animales la inmunidad de los linfocitos T CD4+ desempeña una función significativa en la protección contra microorganismos óticos y también puede impartir una inmunidad independiente de anticuerpo (20;22;23). Sin embargo, no existen datos para apoyar una función protectora de los subconjuntos con memoria auxiliar de T entre seres humanos que experimentan OMA.

La función central de los linfocitos T CD4+ antígeno específicos en la respuesta inmunitaria adaptativa es proporcionar ayuda a los linfocitos B en la producción de anticuerpos por un lado y como sus propios efectores de la función inmune por el otro (7;9 ;23;27) . Además, en el entorno constante de citoquinas proporcionado por las células Th y en respuesta a la estimulación antigénica, los linfocitos B específicos experimentan expansión clonal, una hiper mutación de cambio de clase y somática que conduce a la selección de anticuerpos con mayor afinidad (28;29). Los linfocitos . B expandidos se diferencian en células plasmáticas que secretan anticuerpos a alto índice y persisten en nichos como la médula ósea, mientras que algunos se diferencian en los linfocitos B con memoria (29;30) . Los linfocitos B con memoria pueden responder rápidamente a la re-estimulación antigénica y pueden contribuir a mantener la reserva de células en plasma y por lo tanto los niveles de anticuerpos en suero durante períodos prolongados de tiempo con la ayuda constante de los linfocitos T CD4+ (31).

EJEMPLO 1 Para evaluar la condición propensa a otitis en niños, utilizando antígenos de proteínas neumocócicas , se enumeraron los subconjuntos de células Th CD4+ con memoria funcional específica de Spn en la sangre periférica de un grupo de niños no propensos a otitis y los propensos a otitis. Las respuestas de IgG a linfocitos B también se midieron para los mismos antígenos en el suero de los niños de estos grupos .

Los sujetos fueron participantes de un estudio longitudinal prospectivo de OMA de 5 años financiado por el US N1H (26) . Los niños que tuvieron tres episodios de OMA en 6 meses o 4 episodios en un año se consideraron como propensos a otitis mientras que otros que tuvieron menos episodios se colocaron en el grupo no propenso a otitis. Los niños inscritos fueron de una población socio-demográfica suburbana de clase media en Rochester NY . Niños sanos en edad de 6 meses sin OMA anterior se inscribieron y tuvieron cultivos nasofaríngeos (NP) y orofaringeos (OP) en suero, obtenidos siete veces, a la edad de 6, 9, 12, 15, 18, 24 y 30 meses, y ambos grupos tuvieron niños de diferentes edades menores de 2 años. Se obtuvo líquido del oído medio mediante timpanocentesis durante los episodios de OMA. La evaluación de la colonización NP/OP por Streptococcus pneumoniae y Haemophil us influenzae ) se obtuvo habitualmente | :5 mediante pruebas microbiológicas de la superficie NP ! y OP cultivada y los líquidos del oído medio. Las PBMC provenientes de la sangre recolectada se aislaron y se congelaron en nitrógeno líquido hasta su utilización. Las muestras utilizadas en este 10 estudio se tomaron en el momento de los reconocimientos de OMA de niños propensos a otitis, y durante la colonización o reconocimientos de OMA del grupo no propenso a otitis. Los niños habían sido inmunizados contra S . pneumoniae de acuerdo con el 15 programa aplicable con dosis adecuadas para la edad de una vacuna conjugada disponible.

Antígenos i Los antígenos de proteínas neumocócicas '20 utilizados fueron PhtD (SEQ ID NO:6), PhtE (SEQ ID NO:8), LytB (SEQ ID NO: 11), PcpA (SEQ ID NO :3), y PlyDl (SEQ ID NO: 13), un derivado destoxif icado de neumolisina. Como un control, también se utilizó PspA . Cada una de las proteínas se clonaron a partir 25 de una cepa del serotipo 6B de S. pneumoniae y se expresaron recombinant emente en E. coli como proteínas solubles y luego se purificaron con combinaciones de cromatografía de intercambio iónico. Cada una de las proteínas tuvo ³90% de pureza después de la purificación según se analizó mediante SDS-PAGE y RP-HPLC.

Se determinó una dosis óptima para estimulación por ausencia de toxicidad celular detectable, mediante el uso de tinción con triptano azul y/o análisis por citometría de flujo después de tinción con yoduro de propidio (datos no mostrados).

Estimulación de linfocitos T Las PBMCs provenientes de niños propensos a otitis y no propensos otitis quienes se colonizaron con NP o se infectaron con OMA con Spn se estimularon con los seis antígenos neumocócicos , mientras que los niños que fueron colonizados con NP o infectados con OMA con NTHi se estimularon con los tres antígenos NTHi. Antes de la estimulación, las PBMC congeladas se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37°C seguido por adición lenta de medio de cultivo completo (RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS , L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 0.1 mM, aminoácidos no esenciales. lOOU/mL de penicilina, 100mg/mL de estreptomicina) . Las células luego se lavaron y dejaron descansar durante la noche en medio de cultivo completo en placas de 24 cavidades. Las PBMC se estimularon utilizando un protocolo estandarizado adaptado a partir de reportes anteriores (35;36). En resumen, las células se contaron y se colocaron en una placa para cultivo de fondo plano de 96 cavidades y se estimularon con ya sea 1/xg/ml de diversos antlgenos de proteína o con l^g/ml de enterotoxina B estaf ilocócica (SEB) . Al cultivo celular se agregaron concentraciones de ^ g/ml de anticuerpos anti-CD28 y anti-CD49d (clones L293 y L25, respectivamente; BD Biosciences) para proporcionar co-estimulación y mejorar la detección de las respuestas antígeno específicas. Los anticuerpos anti-CD28 y CD49d se han utilizado ampliamente para co-estimulación sin afectar a los niveles antecedentes (18;37). Las células luego se incubaron durante 2h a 37°C en presencia de C02 al 5% para el procesamiento de antígenos. Después de 2 horas, se agregaron inhibidores de transporte Golgi (BD Biosciences) para preservar las citoquinas intracelular ente y luego se continuó la incubación durante otras 4 horas.

Perfilado de citoquinas Se utilizó un procedimiento de citometría de flujo de múltiples parámetros para detectar las respuestas de los linfocitos T CD4+ específicas a las proteínas Spn en la circulación después de la colonización de OMA o NP en los grupos de estudio. Se utilizó un análisis de tinción de citoquinas intracelulares (ICCS) para evaluar los subconjuntos de linfocitos T CD4+ antígeno específicos (TLi-1, Th-2 y Th-17). Después de la estimulación, las células se transfirieron a placas de fondo en V de 96 cavidades y se lavaron una vez con tampón FACS (PBS con FBS al 5%) y se tiñeron con los anticuerpos contra diversos marcadores de superficie celular. Los anticuerpos utilizados fueron anti-CD4 APC Alexafluor 750 (clon RPA T4, cBiosciences ) , PE-Tcxas Red anti-CD45RA (clon MEM56, Invitrogen) , conjugado ant i-CCR7 PcrCP/ Cy5.5 (clon TG8/CCR7, Biolegend) . Las células luego se permeabilizaron con solución de fijación y permeabilización (BD Biosciences) durante 20-minutos y se lavaron tres veces con tampón de permeabilización Ix (BD Biosciences) . Se utilizó un cóctel de diversos anticuerpos citoquina específicos para teñir las citoquinas capturadas intracelularmente como resultado de la estimulación.

Los anticuerpos utilizados fueron anti -IFN-g conjugado con PE-Cy7 (clon B27, BD Biosciences ), anti IL17A conjugado con Pacific blue (clon BL16S, Biolegend) , Alcxa Fluor 700 anti-IL-2 (clon MQ1-17H12, Biolegcnd), anti-IL-4 conjugado con PE (clon 8D4-8, BD Biosciences), TNF-ci, anti-CD3 Qdot 605 conjugado con AF 488 (clon UCHT1, Invitrogen) y PE-Cy5 anti-CD69 (clon FN50, BD Biosciences). Después de la tinción intrace lular, las células se lavaron adicionalmente 3 veces con tampón de permeabilización lx y un lavado final con tampón FACS antes de resuspenderlas en tubos FACS. Se utilizó un citomómetro de flujo BD LSR II habitual equipado para la detección de 12 parámetros fluorescentes para recopilar 2-5 x 105 eventos para cada muestra y los datos se analizaron utilizando el software FLOW JO (Tree Star) . Para excluir los desechos y terrones celulares, las células primero se desconectaron con base de sus propiedades de dispersión directa y lateral, seguida por desconexión secuencial en los linfocitos T CD4+ seguida de CD45RALow y luego a células positivas de citoquinas CD69+.

Alternativamente, las células también se desconectaron en TNF-a contra otras citoquinas para confirmación. Se confirmaron respondedores de baja frecuencia mediante retro desconexión excesiva. Como se informó anteriormente, para ayudar en la detección de anticuerpos anti -CD28/CD4 9d de células antígeno específicas en conjunción con tinción de múltiples parámetros se utilizó para ayudar a evitar un antecedente irrelevante (37). El análisis completo se estandarizó y se comparó con una serie de perlas multiplex (CBA, BD Biosciences) para la detección del perfil de citoquinas.

Respuestas humorales Para medir los niveles de anticuerpos IgG en las muestras, se realizó ELISA como se describió anteriormente (26;38 ). En resumen, se recubrieron placas de 96 cavidades (Nunc-lmmulon) con 0.25 mg mi de antígenos individuales (100 ml/cavidad) en tampón de recubrimiento (bicarbonato, (pH 9.4) y se incubaron durante la noche a 4°C. Después de lavar, las placas se bloquearon con leche descremada al 3% a 37°C durante 1 hora (200 ml por cavidad). Después de cinco lavados, 100 m? de suero a una dilución de partida de 1:100 (en PBS-leche descremada 3%) se agregaron a las cavidades y se diluyeron en serie 2 veces. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora seguida por la adición del anticuerpo IgG anti-humano de cabra purificado por afinidad conjugado a peroxidasa de rábano picante (Bethyl Laboratories, Inc ., Montgomery, TX) como un anticuerpo secundario. Los productos de reacción se desarrollaron con TMB Microwell Peroxidase Substrate System (KPL, Gai thersburg , MD) , se inactivaron mediante la adición de ácido fosfórico 1.0 molar y se lcyeron mediante un lector ELISA automatizado utilizando un filtro de 450 nm . Para proporcionar resultados cuantitativos sobre las concentraciones de anticuerpos, se determinó el nivel del anticuerpo específico presente en la muestra desconocida mediante comparación con un suero de referencia interno (agrupación de suero humano con altos niveles de anticuerpos antígeno específicos) . Los niveles de IgG en el suero de referencia se midieron cuantitativamente al utilizar un kit de cuantif icación ELISA de IgG humano (Bethyl Laboratories). Se utilizó una función de logaritmo logístico de cuatro parámetros para formar las curvas de referencia y muestra. Este ELISA se validó totalmente de acuerdo con la Guía ICH. Todos los datos se analizaron estadísticamente utilizando el software Graph Pad Prism. Se calcularon dos valores P agregados para los datos utilizando una Prueba Mann Whi tncy .

Resultados Los niños en el grupo propenso a otitis fueron de una edad similar a la de los niños no propensos a otitis. La distribución de género, la asistencia en guarderías, la exposición pasiva al humo de tabaco en el hogar, el número de hermanos menores de 8 años de edad y la alimentación con leche materna fueron similares en los dos grupos de estudio .

Las frecuencias de circulación de diversos subconjuntos de células Th con memoria antígeno específicas de Spn se compararon entre los niños no propensos a otitis y los propensos a otitis al estimular sus PBMCs con antígenos específicos. Para ello, los porcentajes de linfocitos T CD4+ con memoria de CD45RALow que producen IFN-g, IL-4, IL-2 o IL-17 se calcularon mediante desconexión en linfocitos T CD69+ activados recientemente. Las respuestas antígeno específicas se normalizaron con las PBMC control dejadas sin estimular o estimuladas con un antígeno no específico (hemocianina de lapa calif orniana) .

La Figura 1, que establece un resumen de los resultados, demuestra las frecuencias detectables de los diversos subconjuntos de linfocitos T CD4+ con memoria CD45RALow para todos los antígenos Spn utilizados para la estimulación en niños no propensos a otitis (n = 15) después de la OMA (n = 6) o la colonización de NP (n = 9) con Spn. En marcado contraste, los niños propensos a otitis (n = 13) tuvieron una deficiencia marcada de linfocitos T CD4+ con memoria específica de Spn en circulación después de la OMA (n = 10) y la colonización de NP (n = 3).

En particular, hubo una ausencia total de linfocitos T CD4+ con memoria que produjeron lFN-g contra LytB, PhtE y Ply mientras que se produjeron niveles significativamente menores de IFN-g en respuesta a PhtD, PcpA y PspA (P<0.02) (Fig. la). Se observó una disminución significativa en IL-4 que producen los linfocitos T CD4+ con memoria contra PhtD y LytB (P<0.02) en niños propensos a otitis (Fig. Ib). Las respuestas IL-2 a PhtD (P<0.05), PcpA (P<0.005), PhtE (P <0.05). Ply (P<0 .005) y PspA (0.02) fueron significativamente menores en niños propensos a otitis (Fig. le) y se encontró una reducción significativa en las células que producen IL-17A en niños propensos a otitis en respuesta a PhtD, PcpA y PhtE ( P<0.05) (Fig. Id).

Ya que la ausencia de células Th con memoria antígeno específicas puede dar por resultado en respuestas deterioradas de los linfocitos B antígeno específicos (9), se evaluaron los títulos de IgG antígeno específicos en niños no propensos a otitis y propensos a otitis. En la Figura 2 se muestran los niveles IgG en suero contra los antígenos neumocócicos en los grupos respectivos. Como era de esperar, con las frecuencias de linfocitos T con memoria aumentada, los títulos IgG para PhtD, LytB, PhtE, Ply fueron significativamente mayores en el grupo no propenso a otitis en comparación con el grupo de propensos a otitis (P<0.05; 0.0005; 0.0005; 0.005, respectivamente) (Fig. 2) . También hubo un aumento en el título IgG para el antígeno PcpA, aunque la diferencia no fue significativa (Fig. 3).

Debido a que el sistema inmunológico en niños pequeños no está totalmente maduro en el contexto de las respuestas de los linfocitos T y B (39;40), las respuestas mediadas por linfocitos B y T se probaron para evaluar si las respuestas de los linfocitos T con memoria deteriorada entre los niños propensos a otitis se debieron a defectos intrínsecos de los linfocitos T o B . Las PBMC se estimularon con SEB, un antígeno que estimula una respuesta de linfocitos T independiente de la participación de APC (41). La Figura 3 muestra el porcentaje de linfocitos T CD4+ con memoria que producen IFN-g, IL-4, IL-2 o IL-17a es la misma para niños propensos a otitis y no propensos a otitis. Dado que todos los niños habían recibido una vacuna DTPa, los títulos IgG contra los antígenos de la vacuna contra la difteria, tétanos y tos ferina se determinaron para evaluar si el niño propenso a otitis tuvo una deficiencia inmunitaria generalizada. No se encontraron diferencias significativas en las concentraciones de anticuerpos IgG para el toxoide de difteria, el toxoide de tétanos, la toxina de tos ferina, hemaglutinina filamentosa o pertactina entre los grupos (datos no mostrados).

En resumen, estos datos muestran que los niños propensos a otitis por Spn tienen una falta o reducción de linfocitos T CD4+ con memoria funcionales específicos del antígeno neumocócico en comparación con los niños no propensos a otitis. Este efecto está asociado con respuestas de IgG reducidas a los antígenos estudiados. Como muestran los datos, los niños propensos a otitis fracasan en generar respuestas Th con memoria funcional CD45RALow antígeno específico a SPN y provocan respuestas de anticuerpos reducidas a los antígenos proteicos de Spn . Sin embargo estos niños no tienen deficiencia en linfocitos T con memoria funcional total o para provocar respuestas de anticuerpos mediadas por los linfocitos B (por ejemplo, IgG) contra antígenos vacunados .

A pesar del hecho de que las células Th CD4+ ayudan a luchar contra las infecciones provocadas por Spn y NTHi, no ha habido ningún reporte anterior que demuestre una función directa de las células Th CD4+ específicas asociadas con la OMA mediada por Spn o NTHi en niños. Claramente, la generación deficiente de linfocitos T CD4+ con memoria en los niños podría conducir a posteriores respuestas disminuidas de anticuerpos mediadas por los linfocitos B. La falta de memoria inmunológica de esta forma podría dar por resultado en la susceptibilidad repetida a infecciones recurrentes del oído. Aquí, por primera vez se demuestra que los niños propensos a otitis tienen una ausencia/reducción en la memoria específica de un microorganismo ótico (por ejemplo, S . pneumoniae) entre las células Th en la circulación sanguínea después de la colonización por OMA y/o NP. En contraste, los niños no propensos a otitis generan linfocitos T CD4+ antígeno específicos con memoria después de la colonización por OMA y/o NP por microorganismos óticos.

Parece que el niño propenso a otitis desarrolla una respuesta de linfocitos B de corta duración, debido a que algunos anticuerpos son detectables entre estos niños después de la colonización por OMA y NP con S . pneumoniae . Sin embargo, en ausencia de la memoria de linfocitos T, después de que el nivel de anticuerpos disminuye, el niño se convierte rápidamente en susceptible a infecciones adicionales por OMA. De esta forma, el déficit inmunológico fundamental parece estar en la generación de la memoria de los linfocitos T entre los niños propensos a otitis. Debido a que los niños propensos a otitis respondieron de manera similar a un antígeno que no requiere procesamiento de APC (SEB) y de manera similar a una inyección parenteral del antígeno en la forma de una vacuna DTPa, puede ser que el problema entre los niños propensos a otitis continúa incluso inmunológicamente aguas arriba en el procesamiento y presentación reales de los antígenos de Spn y NTHi mediante las APC presentes en la mucosa nasal.

Trabajos anteriores han demostrado la función de los antígenos de Spn y NTHi en las respuestas prolif erativas de los linfocitos T CD4+ (durante 5-7 días) entre niños y adultos (42;43) . Un estudio anterior evaluó la proliferación de los linfocitos T CD4+ provenientes de las células recolectadas de los adenoides y amígdalas de los niños propensos a otitis y no se encontró proliferación en respuesta a la proteína NTHi P6 (44). Estudios de esta naturaleza evalúan la proliferación de linfocitos T antígeno específicos, aunque no informan sobre la aparición de linfocitos T CD4+ con memoria antígeno específicos.

Mientras que las células CD4+Th-2 estimulan la mayor parte de las respuestas de anticuerpos que ayudan en la eliminación de patógenos bacterianos provenientes del hospedero, estudios recientes en modelos de ratón han mostrado inmunidad independiente de los anticuerpos a la colonización de Spn NP mediada por IL-17A que producen linfocitos T CD4+ (células Th-17) (20).

Aquí, por primera vez, en seres humanos, se detectaron frecuencias aumentadas de IL-17a Spn-específico que produce células Th con memoria en la circulación de niños no propensos a otitis, en comparación con niños propensos a otitis. De esta forma, IL-17a Spn-especí f ico que produce células Th con memoria puede proteger contra la condición propensa a otitis.

La fenotipif icación celular en el sitio de infección durante la OMA (mucosa en el oído medio y líquido en el oído medio) sugiere una gran migración de linfocitos T CD4+ con memoria CD45ROHigh/CD45RALow con la pérdida de receptores de alojamiento L-selectina (45) . Otros estudios revelan la acumulación de linfocitos T CD4+ con memoria principalmente en el fluido del oído medio durante la OMA (45-47). Órganos linfoides secundarios locales tales como las adenoides son los sitios principales para el cebado de linfocitos T durante las infecciones del tracto respiratorio superior tal como la colonización bacteriana. Una vez que una APC cargada con antígenos migra a órganos linfoides locales (adenoides) , se lleva a cabo la diferenciación de linfocitos (véase, linfocitos T CD4 +). Después de ingresar a la circulación sanguínea, los linfocitos T GD4+ con el tiempo migran a la mucosa del oído medio (en el caso de OMA) y/o al tracto respiratorio superior (durante la colonización de NP).

Sin estar vinculados por la teoría, la maduración inmunológica retrasada probablemente sea responsable de la falta de linfocitos T funcionales entre los niños propensos a otitis (48) . A medida 5 que los niños crecen, se tornan menos propensos a OMA debido a los cambios anatómicos en la trompa de Eustaquio aunque también cuando se produce la maduración del sistema inmunitario. Una respuesta robusta en la memoria de los linfocitos T en general 10 se desarrolla alrededor de los 3 a 5 años de edad (40:48-1), y por lo general el niño propenso a otitis "crece más" su propensión durante este período de tiempo de edad.

En seres humanos, los linfocitos T CD4+ con 15 memoria pueden desempeñar una función clave en la lucha contra la OMA. Por lo tanto, la memoria de los linfocitos T CD4+ específicos de Spn, si es que se ha generado, podría ser útil en la prevención de la incidencia de OMA recurrente. 20 EJEMPLO 2 En este estudio, se comparó el desarrollo de anticuerpos IgG en suero contra PhtD, PhtE, LytB, PcpA y Ply entre tres grupos de niños de 6 a 36 meses 25 de edad con OMA: 1) un grupo propenso a otitis que incluyó a niños que tuvieron tres o más episodios de OMA en seis meses o cuatro o más episodios en un período de 12 meses, 2) un grupo de fracaso del tratamiento de OMA (AOMTF) que incluyó a niños que no pudieron alcanzar la erradicación bacteriana y/o resolución de los síntomas después de al menos 48 horas con una terapia adecuada con antibióticos (70; 71) y niños cuyas señales y síntomas de OMA regresaron en un término de 14 días de completar un curso de tratamiento con antibióticos, y 3) un grupo no propenso a otitis que incluyó a niños que tuvieron sólo uno o dos episodios de OMA.

Las muestras recolectadas y analizadas se obtuvieron durante el estudio prospectivo al que se hizo referencia en el Ejemplo 1. Niños sanos sin OMA con anterioridad se inscribieron a la edad de 6 meses y se les dio un seguimiento prospectivo hasta los 30 meses de edad. Se obtuvieron cultivos de suero, N? y orofaríngeo (OP) siete veces durante el período de estudio a los 6, 9, 12, 15, 18, 24 y 30 meses de edad. Sin embargo, las muestras para el punto de tiempo de 30 meses se excluyeron de este análisis ya que muy pocos sujetos habían llegado al reconocimiento de 30 meses. Durante el período de estudio, cada vez que un niño experimentó una OMA, se obtuvieron cultivos de suero, NP y OP junto con el líquido del oído medio (MEF) mediante timpanocentesis . Tres semanas más tarde se recolectaron muestras de convalecencia. La mayoría de estos niños no desarrolló OMA (aproximadamente 70%) y se incluyeron en el grupo 3 (niños no propensos a otitis). A algunos niños se les dieron a conocer las definiciones de propensos a otitis (aproximadamente 5%) y se incluyeron en el grupo 1 o tuvieron AOMTF (aproximadamente 5%) y se incluyeron como el grupo 2 para análisis. Para aumentar el tamaño de las grupos propensos a otitis y AOMTF, se inscribieron niños adicionales siempre que cumplieran con las definiciones de un término del lapso de tiempo de 6 a 36 meses de edad. En el momento de un caso de OMA, se recolectaron muestras de suero, NP, OP y MEF; y muestras de convalecientes 3 semanas más tarde .

Para asegurar el diagnóstico de OMA, los niños fueron examinados por pediatras con otoscopio validados utilizando las directrices para diagnóstico de OMA de la American Academy of Pediatrics. Se realizó una timpanocentesis para confirmar la presencia de un microorganismo ótico en MEF. Las muestras de MEF, HP, y OP se inocularon en caldo de tripticasa soya, agar de tripticasa soya con 5% de sangre de oveja, y placas de agar de chocolate. Las bacterias se aislaron de acuerdo con los procedimientos para cultivo estándar CLSI.

Análisis ELISA: Las proteínas PhtD, LytB, PcpA, PhtE y PlyDl de S. pneumoniae utilizadas en el Ejemplo 1 también se utilizaron en este estudio. Los títulos del anticuerpo proteína específico se determinaron mediante ELISA utilizando proteínas recombinantes purificadas. Placas Nunc-lmmulon 4 de 96 cavidades se recubrieron con 0.5mg/ml de proteínas individuales ([100m1/ cavidades ) en tampón con recubrimiento de bicarbonato (pH 9.4) y se incubaron durante la noche a 4°C. Después de lavar las placas, se bloquearon con leche descremada al 3% a 37°C durante lh (200 ml por cavidad) . Después de cinco lavados, se agregaron a las cavidades 100 ml de suero a una dilución de partida de 1:100 (en PBS-leche descremada al 3%) y se diluyeron en serie 2 veces. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante lh seguida por la adición del anticuerpo IgG anti-humano de cabra purificado por afinidad conjugado con peroxidasa de rábano picante (Bcthyl Laboratories, Inc ., Montgomery, TX) como un anticuerpo secundario. Los productos de reacción se desarrollaron con Sistema de Sustrato de Peroxidasa TMB Microwell (KPL, Gai thcrsburg , MD), se inactivaron mediante la adición de ácido fosfórico 1.0 molar y las placas se analizaron a 450 nm en un lector de placas Spectra max (Molecular Devices, Sunnyvale, California) utilizando el protocolo de dilución de punto final Sof tmax .

Se realizó un análisis estadístico en GraphPad Prism 5. Se utilizó una prueba t no pareada para comparar la diferencia entre tres grupos para el análisis de anticuerpos IgG. Se aplicó una prueba t pareada para comparar muestras séricas agudas vs convalecencia. Se utilizó ANOVA unidireccional para evaluar el aumento de anticuerpos a través del tiempo. Los valores P<0.05 se consideraron signi ficativos .

Títulos de anticuerpos IgG específicos contra PhtD, LytB, PcpA PhtE y Ply en tres grupos de niños en el momento de una OMA Los títulos de anticuerpos IgG contra las proteínas PhtD, LytB, PcpA, PhtE y Ply de Spn se midieron en el momento de una OMA aguda en 35 niños propensos a otitis, 25 niños con AOMTF y 34 niños con su primera o segunda OMA como un grupo no propenso a otitis (Figura 4) .

Los títulos IgG contra la proteína PhtD en niños propensos a otitis fueron significativamente menores en comparación con los niños no propensos a otitis (p <0.05) . Los niveles de anticuerpos IgG contra PhtD en niños con AOMTF también fueron menores en comparación con los niños no propensos a otitis, aunque la diferencia no fue significativa. Los títulos IgG contra LytB en niños propensos a otitis y niños con AOMTF fueron significativamente menores en comparación con los niños no propensos a otitis (p <0.001 para ambas comparaciones) . Los GMT de IgG contra la proteína PcpA en niños propensos a otitis y de AOMTF fueron casi 3 veces menores en comparación con los niños no propensos a otitis, aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa entre los 3 grupos de niños debido a la amplia variación en los niveles de anticuerpos. Los títulos IgG para la proteína PhtE en los niños propensos a otitis y los niños con AOMTF fueron significativamente menores en comparación con los niños no propensos a otitis (p <0.001) . Los títulos IgG para la proteína PlyDl fueron significativamente inferiores en los niños propensos a otitis (p = 0.006) y los niños con AOMTF (p 0.02) en comparación con los niños no propensos a otitis .

Los niveles de anticuerpos de OMA aguda y convaleciente contra PhtD, LytB, PcpA, PhtE y Ply de S . pneumoniae en los tres grupos de niños.

Veintidós niños propensos a otitiss, 13 con AOMTF y 20 no propensos a otitis tuvieron muestras séricas pareadas obtenidas en la fase aguda (en el momento de la OMA) y de convalecencia (3 semanas más tarde) . En los tres grupos de niños, los niveles de anticuerpos IgG contra 4 de las 5 proteínas en la fase aguda vs convalecencia no mostraron aumento significativo en los anticuerpos (la excepción fue la proteína PhtE en niños con AOMTF donde se encontró una diferencia significativa, p = 0.04) (Tabla 1).

Sin embargo, fueron notables amplias variaciones individuales de los niveles de anticuerpos en los sueros de fase aguda y convaleciente, con algunos niños en todos los 3 grupos que mostraron elevaciones dobles en los anticuerpos contra uno o más antígenos (Tabla 2).

Nivel de anticuerpos en niños no propensos a otitis y propensos a otitis con la edad La Figura 5 muestra los niveles de anticuerpos IgG contra PhtD, LytB, PcpA, PhtE y Ply en el momento de los reconocimientos rutinarios sin OMA seguido prospectivamente por niños no propensos a otitis y propensos a otitis a los 6-24 meses de edad. Los datos mostrados son de 150 niños no propensos a otitis y 10 niños propensos a otitis. En los niños no propensos a otitis, los niveles de anticuerpos IgG aumentaron significativamente (p <0.001) a través del tiempo para todas las proteínas excepto LytB (p = 0.075) . En comparación, los niños propensos a otitis no aumentaron a cambios significativos en el nivel de anticuerpos IgG a través del tiempo para cualquiera de las cinco proteínas (p = 0.40 para la proteína PhtD, p = 0.39 para LytB, p = 0.11 para PcpA, p = 0.09 para PhtE y p = 0.42 para Ply).

Estos datos muestran qué los niños propensos a otitis y los niños con AOMTF tuvieron niveles de anticuerpos significativamente menores contra las proteínas de Spn en el inicio de la OMA en comparación con los niños no propensos a otitis, lo que sugiere que las exposiciones anteriores a Spn no provocan o provocaron una respuesta inmunitaria adaptativa menos fuertes como se refleja en los niveles de anticuerpos en suero. Este hallazgo sugiere que inmunológicamente , los niños propensos a otitis y con AOMTF son similares, aunque sus respuestas fueron diferentes en comparación con los niños no propensos a otitis. También, la cantidad de anticuerpos en suero de los 5 antígenos Spn estudiados aumentaron significativamente más lentamente en los niños propensos a otitis que en los niños no propensos a otitis. Una obtención más lenta de anticuerpos después de la exposición natural mediante la colonización de NP entre los niños propensos a otitis es consistente con la observación de una respuesta inmunitaria deteriorada entre los niños propensos a otitis después de la exposición al microorganismo ótico. Estos datos también muestran que los niños propensos a otitis y los niños con AOMTF no difieren de los niños no propensos a otitis en su respuesta de anticuerpos en suero de OMA. Parece que la OMA no es un caso de inmunización para la mayoría de los niños en cualquiera de las tres agrupaciones, al menos en el rango de edad de hasta 3 años de edad (como se estudiaron en la presente) .

Las respuestas inmunitarias antígeno específicas observadas contra Spn confirman y amplían las observaciones de otros para los niños propensos a otitis, contradicen algunos reportes anteriores y proporcionar muchos datos nuevos. Freijd et al (72) describieron un anticuerpo del polisacárido anti-Spn en suero contra los serotipos 3, 6A y 23 en 15 niños propensos a otitis a los 30 meses de edad en comparación con la edad que coincide con los niños control y adultos. Encontraron anticuerpos significativamente menores para los serotipos 6A y 23 entre los niños propensos a otitis. Prellner et al (73) midieron el anticuerpo del polisacárido anti-Spn en suero para los serotipos 6A, 19 y 23 en 15 niños propensos a otitis y se encontró que el 60% de los niños no tuvieron ningún anticuerpo detectable. Incluso a los 6 años de edad, los niveles de anticuerpos para el polisacárido 6A en niños propensos a otitis fueron menores que en los niños no propensos a otitis. Hotomi et al(74) evaluaron 36 niños propensos a otitis (edad media de 18 meses de edad) y 20 niños no propensos a otitis para respuestas de anticuerpos en suero contra el polisacárido de NTHi OMP P6 y de Spn (utilizando la vacuna 23 valente Spn como antígeno) . 55% de los niños propensos a otitis tuvieron menores respuestas de anticuerpos para P6 y 48% tuvieron menores respuestas al polisacárido de Spn. Yamanaka y Faden en sus estudios de 1993 (75;76) y Bernstein et al(77) encontraron niveles de anticuerpos en suero y/o mucosas similares disminuidos para otro microorganismo ótico, NTHi , en niños propensos a otitis. Para conocimiento propio, éste es el primer reporte de las respuestas de anticuerpos en suero para las proteínas de Spn en niños propensos a otitis y en AOMTF.

Estas observaciones relacionadas con las respuestas de anticuerpos anti-PhtD, LytB, PcpA, PhtE y Ply en niños propensos a otitis asociados con OMA apoya la explicación generalizada para el estado propenso a otitis: Estos niños tienen una deficiencia inmunológica específica en la respuesta de anticuerpos a Spn y otros microorganismos óticos cuando la exposición se produjo vía la ruta natural NP .

Como se observó en el Ejemplo 1, los niños propensos a otitis tuvieron una deficiencia en los linfocitos T funcionales auxiliares y los linfocitos T con memoria en respuesta a los antígenos de Spn y NTHi (resultados no publicados) (82). Las respuestas de anticuerpos en estos niños para vacunación parenteral con difteria, tétanos y tos ferina no se redujeron, y estos hallazgos son consistentes con las observaciones de Prellner et al (83) y Wiertsma et al (84) quienes también encontraron que los niños propensos a otitis montaron respuestas normales de anticuerpos en suero para vacunación contra el sarampión y otras vacunas pediátricas. Por lo tanto, la disfunción inmunitaria en los niños propensos a otitis se produjo con la exposición natural a microorganismos óticos y no con la vacunación parenteral .

Las respuestas inmunitarias adecuadas a las vacunas conjugadas de Spn observado para producirse en niños propensos a otitis apoyan esta conclusión. (85 ;86) La comparación de los niveles de anticuerpos agudos y convalecientes con las proteínas de Spn estudiadas, los GMT generales no mostraron un aumento significativo en niños propensos a otitis, con AOMTF o no propensos a otitis. Esto se debe en gran medida a una gran variación en las respuestas inmunitarias de niños individuales. De hecho, algunos niños mostraron mayores títulos de convalecencia, mientras que otros mostraron títulos menores y algunos permanecieron igual. Lo más probable es que estos resultados son debido a las diferencias en la longitud de transporte NP de Spn antes de que se produjera la infección de OMA. Aquellos con mayor transporte pueden alcanzar un pico en la respuesta de anticuerpos antes de la aparición de la OMA y pueden mostrar niveles de anticuerpos estables o decrecientes en sueros agudos para convalecientes. Otros niños pueden tener un breve tiempo de transporte de NP antes de la aparición de la OMA y muestran el aumento de los niveles de anticuerpos agudos para convalecientes. Estos resultados indican que los diferentes antígenos provocaron diferentes perfiles de respuesta de anticuerpos, posiblemente a que reflejan su diferente antigenicidad en niños pequeños cuando la proteína se presenta al hospedero niño de una forma natural mediante la colonización asintomática o la infección por la OMA. Se realizaron observaciones similares cuando se evaluaron las respuestas de anticuerpos a las proteínas NTHi y otros grupos también habían observado esta variabilidad en los niveles de anticuerpos agudos a convalecientes que rodean un caso de OMA (87-89). Sointnen et al estudiaron el desarrollo natural de anticuerpos para los tipos de pol isacár idos de Spn 1, 6B, 11A, 14, 19F y 23F asociados con la colonización de NP y OMA en un grupo de 329 niños seguidos durante sus primeros 2 años de vida. (90) Los anticuerpos aumentaron ligeramente, aunque significativamente a través del tiempo; los serotipos 11A y 14 fueron más inmunogénicos a una edad menor. Encontraron que los niveles de anticuerpos fueron iguales después de la colonización de NP u OMA. Sin embargo, en un estudio posterior que implica los mismos niños Soininen et al describieron los hallazgos como una indicación de que el anticuerpo aumentó >2 veces fueron relativamente infrecuentes después de la OMA con una variación que se puede atribuir a la edad del niño y el serotipo de Spn. (89) En un estudio correspondiente, se observó la obtención gradual a través del tiempo del anticuerpo para las mismas cinco proteínas de Spn estudiada en la presente, así como para las tres proteínas de NTHi (proteína D, P6 y OMP26) en niños sanos. (69;87) En este estudio, los niños propensos a otitis fracasaron en demostrar o tuvieron un aumento relacionado significativamente más lento con la edad en el anticuerpo para todas las cinco proteínas de Spn.

En conclusión, estos resultados proporcionan información adicional sobre la respuesta inmunológica de los niños propensos a otitis. Se observó una hiposensibilidad inmunológica en niños propensos a otitis contra los antígenos de Spn. También se mostró que los niños con AOMTF se comportan inmunológicamente similar a los niños propensos a otitis. La administración de una composición de vacuna que comprende al menos uno o más de PhtD, PhtE, PcpA , LytB y neumolisina destoxif icada (por ejemplo, PlyDl) por la vía parenteral (opcionalmente, con un adyuvante) se pueden utilizar para mitigar la hiposensibilidad inmunológica observada después de las exposición natural a S . pneumoniae .

EJEMPLO 3 Se evaluaron y compararon las frecuencias en circulación de linfocitos B con memoria antígeno específicos de Spn en muestras séricas obtenidas a partir de una serie de niños propensos a otitis y no propensos a otitis a partir del estudio al que se hizo referencia en el Ejemplo 1. A partir de la población total del estudio de aproximadamente 387 niños, en la presente se estudiaron 22 niños: en la presente se identificaron 10 niños propensos a otitis para el estudio (con base en la disponibilidad de suficientes muestras de PBMC) y se seleccionaron aleatoriamente 12 niños no propensos a otitis, con 1 ó 2 OMAs y de una edad similar a los niños propensos a otitis para servir como controles, Las características clínicas de los niños se exponen en la Tabla 3.

Se cuantif icaron células secretoras de IgG total antígeno específicas (PhtD, PhtE, LytB, PcpA, Ply) mediante un análisis ELISPOT (estandarizado en casa) en el cual los linfocitos B con memoria se estimularon in vi tro para diferenciarse en células secretoras de anticuerpos (ASC). En resumen, se colocaron un millón de PBMC descongeladas en cada cavidad de una placa de 24 cavidades que contuvo 1 mi de medio completo solo o medio completo que contuvo de mitógeno pokeweek. Las células se mantuvieron a 37°C durante 3 días para diferenciación, se lavaron con medio completo, se contaron y distribuyeron sobre placas ELISPOT de 96 cavidades (Millipore) recubiertas con antígeno (10/ig/ml) toda la noche. La diferenciación celular en plasma se optimizó con la ayuda de una evaluación citométrica de flujo de las células diferenciadas (datos no mostrados) . Para la detección de células secretoras de IgG total, las cavidades se pre recubrieron con IgG anti-humano monoclonal (MT91/145; Mabtech) a 10^g/ml en PBS . Como control negativo, las cavidades se dejaron sin tratar o se recubrieron con misma cantidad de albúmina de suero bovino (BSA). Las placas se bloquearon con 10% de SFB en RPMI 1640 durante 30 minutos a 37°C. Las PBMC estimuladas se contaron y 5xl05 células se resuspendieron en 200m1 de medio RPMI completo recién preparado antes de distribuirlas en las cavidades control y las recubiertas con antígeno. Las placas luego se incubaron a 37°C en una incubadora con 5% de CO2 durante la noche y luego se lavaron con PBS al menos 5 veces. Después, se agregaron a las cavidades 100 ml de l/¿g/ml de anticuerpos IgG anti-humanos biotinilados (MT78/145; Mabtech) y se incubaron durante una hora. Después del lavado se agregó a las cavidades un conjugado de fosfatasa alcalina con estreptavidina (1:1000) y se incubaron durante una hora a 37°C. Las placas luego se lavaron 5 veces con PBS antes del desarrollo con sustrato (BC1P NBT; Mabtech) . Debido a las bajas frecuencias de las ASC antígeno específicas, las manchas desarrolladas se contaron manualmente con la ayuda de un microscopio de disección. Los datos antígeno específicos se expresan como un porcentaje de los linfocitos B con memoria antígeno específicos y se calcularon por millón de PBMC como sigue: % de MBC Ag-específico = (No. de manchas antígeno específ icas/No . de manchas de Ig total) x 100.

Los títulos de IgG antígeno específicos en el suero de estos dos grupos de niños se midieron mediante ELISA realizada sustancialmente similar a la descrita en el Ejemplo 1, aunque las placas se recubrieron con 0.5mg/ml de antígeno y el anticuerpo TgG, TgM o IgA anti-humano de cabra purificado por afinidad conjugado para peroxidasa de rábano picante (Bethyl Laboratories, inc ., Montgomery, TX) se utilizaron como anticuerpos secundarios.

Todos los datos se analizaron estadís icamente utilizando el software Graph Pad Prism. Dos valores P agregados a los datos se calcularon utilizando la Prueba Mann Whitncy.

Un resumen de los resultados se expone en la Figura 6 (A, B, C). Los porcentajes de linfocitos B con memoria específicos para los 5 antígenos de Spn (PhtD, PhtE, LytB, PcpA, Ply) presentes en las muestras provenientes de los niños propensos a otitis y los niños no propenso a otitis se muestran en la Figura 6A. En contraste definido con el grupo no propenso a otitis, los niños propensos a otitis tuvieron una marcada disminución de linfocitos B con memoria específica de Spn en circulación después de una colonización de OMA o NP (Fig. 6A) . En particular, se observaron porcentajes significativamente menores de IgG antígeno específico que produce linfocitos B con memoria contra los antígenos PhtD, PhtE y PlyDl (PO.02). Los niños propensos a otitis también mostraron un porcentaje global inferior de linfocitos B con memoria específicos para LytB, aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa (p=0.1) . No se encontró una diferencia estadísticamente significativa en el porcentaje de linfocitos B con memoria PcpA específicos en las muestras provenientes de los grupos propensos a otitis y los no propensas a otitis (Fig. 6A) . Similarmente, no mostró diferencias el número total de células secretoras de IgG presentes en los dos grupos (datos no mostrados).

Los niveles de IgG en suero contra antígenos de Spn en los grupos respectivos se muestran en la Figura 6B. En comparación con los sueros provenientes de los niños en el grupo propenso a otitis, los títulos IgG para PhtD, PcpA y PhtE fueron significativamente mayores en los sueros provenientes de los niños en el grupo no propenso a otitis (P<0.05) . Los niveles Ply fueron menores y no difirieron de manera estadísticamente significativa entre los grupos (Fig. 6B) . Los títulos de anticuerpos LytB fueron los más bajos entre todos los antígenos probados en ambos grupos (Fig. 6B).

En este estudio, se observó un porcentaje reducido de linfocitos B con memoria que circulan en la sangre de niños propensos a otitis después de la colonización de OMA y/o NP (Fig. 6A). Después del encuentro del antígeno con los linfocitos B que no han recibido tratamiento previo, los linfocitos B con memoria antígeno específicos y las células secretoras de anticuerpos se generan en las estructuras linfoides secundarias que transitan a través de la sangre hacia la médula ósea, bazo, o tejidos blanco tales como el tracto respiratorio (16). Debido a que los niveles de anticuerpos en suero se mantienen por los linfocitos B con memoria (31), mediante el análisis de los porcentajes de los linfocitos B con memoria antígeno específicos generados, se proporcionada una explicación inmunológica más precisa para los menores niveles de anticuerpos en niños propensos a otitis. Para confirmar la asociación de las frecuencias menores de los linfocitos B con memoria con los niveles de anticuerpos en suero, se midieron los títulos de anticuerpos Spn específicos y se encontró que serán significativamente menores en niños propensos a otitis (Fig. 6B) , similares a los resultados obtenidos en el estudio expuesto en el Ejemplo 1 utilizando muestras séricas provenientes de un grupo diferente de niños no propensos a otitis (n = 15) y niños propensos a otitis (n = 13) después de la colonización de OMA o NP. En general, la tendencia de los resultados de títulos antígeno específicos DE Spn mayores observada aquí en niños no propensos a otitis es consistente con la observada en el grupo evaluado en el Ejemplo 1, aunque los resultados exactos en los términos de diferencias estadísticamente significativas entre los grupos para respuestas antígeno específicas son diferentes en algunos casos. Por ejemplo, el pequeño grupo de niños evaluados en la presente no mostró diferencias en los títulos de anticuerpos Ply específicos. Mientras que las respuestas de anticuerpos y la generación de linfocitos B para un antígeno de proteína particular después de la colonización bacteriana y/u OMA pueden variar entre niños individuales, con la vacunación se espera un menor grado de variación.

Como se muestra en el Ejemplo 1, los niños propensos a otitis tienen respuestas de linfocitos T CD4+ con memoria antígeno específicos neumocócicps subóptimas (96). Los hallazgos de este estudio confirman aquellos de los ejemplos anteriores (es decir, que los niños propensos a otitis pueden desarrollar algunas respuestas de anticuerpos) debido a que los anticuerpos y los linfocitos B con memoria fueron detectables entre estos niños después de la colonización de OMA y NP cpm microorganismos óticos (Fig. 6A-B) . Sin embargo, en ausencia de la generación de linfocitos B con memoria antígeno específicos y/o la generación de linfocitos T CD4+ con memoria, los niveles de anticuerpos disminuyeron y los niños propensos a otitis fueron incapaces de mantener niveles adecuados de anticuerpos en suero y se tornaron susceptibles a infecciones repetidas de OMA .

La vacunación con el conjugado de polisacárido neu ocócico es útil para reforzar los niveles de protección de los anticuerpos anti-polisacárido (86), sin embargo, la variación de serotipos limita la eficacia protectora de los anticuerpos anti -polisacárido cepa específicos (95). Además, a pesar del hecho de que los niños propensos a otitis pueden inducir anticuerpos serotipo específicos para vacunas conjugadas, son comunes infecciones repetidas entre este grupo vulnerable (86), lo que indica que la inmunidad serotipo-neutralizante es breve e incompleta.

De manera interesante, el porcentaje de linfocitos B con memoria específica de PhtD en circulación se correlaciona con los niveles de PhtD em suero (Fig. 6C) . Se observó una diferencia en los porcentajes de linfocitos B antígeno específicos y los niveles de anticuerpos en suero para PcpA y PlyDl (Fig. 6A-B) .

En conclusión, con respecto a los antígenos evaluados en la presente, los niños propensos a otitis tuvieron una generación de linfocitos B con memoria significativamente menor que se pueden diferenciar en células secretoras de anticuerpos. Es clara la relevancia clínica de este hallazgo. Los linfocitos B con memoria antígeno específicos actúan como depósitos para el mantenimiento de anticuerpos en suero que con el reencuentro con el antígeno pueden proliferar en las ASC lo que conduce a un aumento en los niveles de anticuerpos en suero. Se encontró que los niños propensos a otitis no carecen de células secretoras de IgG totales. Además, los resultados de la citometría de flujo mostraron que, en respuesta a la estimulación policlonal, los niños propensos a otitis no tuvieron disfunción mecánica en la transformación de los linfocitos B con memoria (CD 19÷IgD-) para las células en plasma secretoras de anticuerpos (CD27+CD38+CD138+) (datos no mostrados).

Estos datos muestran que las respuestas antígeno específicas de Spn se observan tanto en niños propensos a otitis como en los no propensos a otitis después de la colonización de OMA o NP. Aunque se observaron respuestas disminuidas en niños propensos a otitis, no obstante, se observaron respuestas en estos niños después de una infección o colonización natural que apoya la administración de una composición de vacuna que comprende al menos uno o más de PhtD, PhtE, PcpA, LytB y pneumolisina des toxificada (por ejemplo, PlyDl) como se describió anteriormente (p.ej. en el Ejemplo 2) para mitigar la hiposensibilidad inmunológica observada después de la exposición natural a S. pneumoniae .

Mientas que se han descrito métodos ilustrativos, proteínas, composiciones y otras características, no es la intención de los solicitantes restringir o limitar en modo alguno el alcance de esta invención, descripción o aplicación. Serán fácilmente evidentes para los expertos en la téenica modificaciones, alteraciones y variaciones.

Por lo tanto, esta descripción no se limita a los detalles específicos, el aparato representativo y los ejemplos mostrados y descritos en la presente. Se ha presentado conjuntamente un listado de secuencias y se considera parte de esta descripción.

Los contenidos de todas las referencias citadas anteriormente se incorporan en la presente como referencia. El uso de formas singulares en la presente, tales como "uno" y "el", no excluye la indicación de la forma plural correspondiente, a menos que el contexto indique lo contrario. De esta forma, por ejemplo, si una reivindicación indica que el uso de "a" X o Y, también se puede interpretar que abarca el uso de un X o Y a menos que se indique lo contrario. En la medida en que el término (o) se utiliza en la descripción o las reivindicaciones (por ejemplo, A o B) se debe entender que significa "A o B o ambos" . En circunstancias donde la intención es indicar "sólo A o B, pero no ambos", entonces se empleará el término "sólo A o B, pero no ambos". De esta forma, el término "o" se utiliza en la presente en el sentido incluyente y no excluyente .

Otras modalidades quedan dentro de las siguientes reivindicaciones.

Aumento >2 veces en el Aguda Convalescencia anticuerpo en la etapa Grupo (#) de Proteínas de convalescencia niños Títulos IgG (95% de intervalo de confianza % de niños superior e inferior) .

. PcpA 5.1x10s 6.9x105 AOMTF (3.9x104-1.1 x107) (8.7x104-2.3x107) 36% 4.8x10s 4.6x105 No propensos a otitis 25% (1.2x10s-1.9x10s) (1.2x105-1.7x106) «1.3x10* a1.4x10* Propensos a otitis (3315-5.8x10*) 32% (3474-6.3x10*) PhtE b-c1.8x10* AOMTF <=2.2x10* (3974-8.6x1011) (3374-1.4x105) 23% ®- No propensos a otitis b1 ,5x10s 111.1x105 (5.2x10*4.5x105) 19% (3.2x10114.3x105) a1.6x10* Propensos a otitis 8578 40% (5861-4.4x1011) (1852-3.9x10*) PlyD1 1.1x10* 8534 AOMTF (2140-6.0x1011) 18% (1675-4.3x1011) a6.4x10* No propensos a otitis 5.46x1011 (3.4x10*4.2x105) 0% (3.0x10*-9.6x10'i) * Comparación del título medio geométrico del anticuerpo IgG en las muestras séricas de 22 niños propensos a otitis, 13 con AOMTF y 20 no propensos a otitis en su etapa aguda contra convalescencia. Diferencia significativa encontrada (valor p<0.05): a: Propensos a otitis contra no propensos a otitis; b: AOMTF contra no propensos a otitis; c: suero agudo contra convalescencia TABLA 3 Características de los sujetos de estudio REFERENCIAS Pichichero ME. Recurrent and persistent otitis media. Pediatr .Infect.Dis .J .2000 ; 19(9):91 1-6.

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Claims (38)

REIVINDICACIONES

1. Un método para prevenir o tratar una recurrencia de OMA que resulta de una infección por Streptococcus pneumoniae en un sujeto en riesgo de 5 desarrollar una recurrencia de otitis media aguda neumocócica que comprende administrar al menos una vez al sujeto, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende al menos un polipéptido inmunogénico aislado y purificado ÍO seleccionado del grupo que consiste de PhtD, PhtE, PcpA, LytB de Streptococcus pneumoniae y neumólisis destoxif icada o un fragmento inmunogénico de los mismos . 15

2. El método según la reivindicación 1, en donde e1 sujeto ha experimentado con anterioridad al menos un episodio de otitis media aguda.

3 . El método según la reivindicación 2 , en 20 donde el sujeto ha tenido 3 o más episodios de OMA en un período de seis meses o ha experimentado 4 o más episodios de otitis media aguda en un período de 12 meses

4. El método según la reivindicación 1, en donde el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar otitis media aguda.

5. El método según la reivindicación 4, en donde el sujeto tiene otitis media aguda.

6. El método según la reivindicación 1, en donde la administración de la composición matriz provoca o mejora la producción de linfocitos T CD4+ antígeno específicos.

7. El método según la reivindicación 6, en donde la administración de la composición provoca o mejora la producción de linfocitos T CD4+ antígeno específicos que producen IFN-g, IL-4, IL-2 y/o IL-17a.

8. El método según la reivindicación 7, en donde porcentaje de linfocitos T CD4+ antígeno específicos que producen IFN-g , IL-4, IL-2 y/o IL-17a aumenta en relación con el porcentaje existente inmediatamente antes de la administración de la composición .

9. El método según la reivindicación 1, en donde la administración estimula la producción de citoquinas IFN-g, IL-2, IL-4 y/o IL-17a.

10. El método según la reivindicación 1, en donde la composición comprende además un adyuvante.

11. Una composición que comprende al menos un polipéptido inmunogénico aislado y sustancialmente purificado seleccionado del grupo que consiste de PhtD, PhtE, PcpA, LytB de Streptococcue pneumoniae y pneumolisina destoxif icada para utilizarse para prevenir o tratar una recurrencia de otitis media aguda que resulta de una infección por Streptococcue pneumoniae en un sujeto.

12 . La composición según la reivindicación 11, en donde el sujeto ha experimentado con anterioridad al menos un episodio de otitis media aguda .

13 La composición según la reivindicación 11 en donde e1 sujeto ha experimentado 3 o más episodios de otitis media aguda en un período de seis meses o ha experimentado 4 o más episodios de otitis media aguda en un período de 12 meses.

14. La composición según la reivindicación 11, en donde el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar otitis media aguda.

15. La composición según la reivindicación 14, en donde el sujeto tiene otitis media aguda.

16. La composición según la reivindicación 11, en donde la administración de la composición provoca la producción de linfocitos T CD4+ antígeno específicos .

17. La composición según la reivindicación 16, en donde la administración de la composición provoca la producción de linfocitos T CD4+ antígeno específicos que producen lFN-g, IL-4, IL-2 y/o IL-I7a.

18. La composición según la reivindicación 16, en donde la administración de una composición aumenta el porcentaje de linfocitos T CD4+ antígeno específicos que producen IFN-g, IL-4, IL-2 y/o IL-17a con relación a la administración de una composición que carece de al menos un polipéptido inmunogénico aislado y purificado.

19. La composición según la reivindicación 11, en donde la administración estimula la producción citoquinas IFN-g, IL-2, IL-4 y/o IL-17a.

20. La composición según la reivindicación 11, en donde la composición comprende además un adyuvante .

21. El método según la reivindicación 1 en donde la composición comprende al menos dos polipéptidos inmunogénicos aislados y purificados seleccionados del grupo que consiste de PhtD, PhtE, PcpA , LytB de Streptococcna pneumoniae y pneumolisina des toxificada , o un fragmento inmunogénico de los mismos .

22. El método según la reivindicación 1, en donde la composición comprende al menos tres polipéptidos inmunogénicos aislados y purificados seleccionados del grupo que consiste de PhtD, PhtE, PcpA, LytB de Streptococcus pneumoniae y pneumolisina des toxificada , o un fragmento inmunogénico de los mismos .

23. El método según la reivindicación l, en donde la composición comprende al menos cuatro polipéptidos inmunogénicos aislados y purificados seleccionados del grupo que consiste de PhtD, PhtE, PcpA, LytB de Streptococcus pneumoniae y pneumolisina destoxif icada, o un fragmento inmunogénico de los mismos .

24 . El método según la reivindicación 1 en donde la composición comprende al menos cinco polipéptidos inmunogénicos aislados y purificados seleccionados del grupo que consiste de PhtD, PhtE, PcpA, LytB de Streptococcue pneumoniae y neumólisis des toxificada o un fragmento inmunogénico de los mismos .

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 21, 22, 23 y 24, en donde la pneumolisina des toxificada es una protelna de pneumolisina mutante que comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 65, 293 y 428 de la secuencia tipo silvestre .

26. El método según la reivindicación 25, en donde las tres sustituciones de aminoácidos comprenden T6s->C, G293->C, y C428->A.

27. La composición según la reivindicación 11, en donde la composición comprende al menos dos polipéptidos inmunogénicos aislados y purificados seleccionados del grupo que consiste de PhtD, PhtE, PcpA, LytB de Streptococcus pneumoniae y neumólisis des toxificada o un fragmento inmunogénico de los mismos .

28. La composición según la reivindicación 11, en donde la composición comprende al menos tres polipéptidos inmunogénicos aislados y purificados seleccionados del grupo que consiste de PhtD, PhtE, PcpA, LytB de Streptococcus pneumoniae y pneumolisina des toxificada , o un fragmento inmunogénico de los mismos .

29. La composición según la reivindicación 11, en donde la composición comprende al menos cuatro polipéptidos inmunogénicos aislados y purificados seleccionados del grupo que consiste de PhtD, PhtE, PcpA, LytB de Streptococcus pneumoniae y pneumolisina des toxificada , o un fragmento inmunogénico de los 5 mismos .

30. La composición según la reivindicación 11, en donde la composición comprende al menos cinco polipéptidos inmunogénicos aislados y purificados 0 seleccionados del grupo que consiste de PhtD, PhtE,

PcpA, LytB de Streptococcus pneumoniae y pneumolisina des toxificada , o un fragmento inmunogénico de los mismos . 5 31. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, \ 20, 27, 28, 29 y 30, en donde la pneumolisina des toxificada es una proteína de neumolisina mutante que comprende sustituciones de aminoácidos en las 0 posiciones 65, 293 y 428 de la secuencia tipo silvestre.

32. La composición según la reivindicación 31, en donde las tres sustituciones de aminoácidos 5 comprenden T65 - >C , G293 - >C y C428 - >A .

33. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 27, 28, 29, 30, 31 y 32 en donde la composición es una vacuna.

34. El método según la reivindicación 1, en donde el sujeto ha experimentado un episodio de otitis media aguda que resulta de una infección por S . pneumoniae y fracasa en alcanzar la erradicación bacteriana y/o resolución de síntomas después de al menos 48 horas de una terapia adecuada con antibióticos .

35. El método según la reivindicación 1, en donde el sujeto ha experimentado un episodio de otitis media aguda (OMA) que resulta de una infección por S . pneumoniae y en un término de 14 días de completar un curso de tratamiento con antibióticos para la otitis media aguda, los síntomas de otitis media aguda regresaron.

36. La composición según la reivindicación 10, en donde el sujeto ha experimentado un episodio de otitis media aguda que resulta de una infección por S . pneumoniae y fracasó en alcanzar la eradicación bacteriana y/o resolución de los síntomas después de al menos 48 horas de una terapia adecuada con antibióticos.

37. La composición según la reivindicación 10, en donde el sujeto ha experimentado un episodio de otitis media aguda (OMA) que resulta de una infección por S. pneumoaiae y en un término de 14 días de completar un curso de tratamiento con antibióticos para la otitis media aguda, los síntomas de la otitis media aguda regresaron.

38. Un método para reducir el riesgo de una recurrencia de otitis media aguda (OMA) que resulta de una infección por S. pneumoniae en un sujeto en riesgo de desarrollar una recurrencia de otitis media aguda neumocócica que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica que comprende al menos un polipéptido inmunogénico aislado y sustancialmente purificado seleccionado del grupo que consiste de PhtD, PhtE, PcpA, LytB de S . pneumoaiae y neumolisina destoxif icada, o un fragmento inmunogénico de los mismos .