TW202219269A - 新型多殺性巴斯德氏菌株及具有hyaC與nanP缺失之疫苗 - Google Patents
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Abstract
本發明係提供一種新型減毒之多殺性巴斯德氏菌株,可以活性或死菌的形式用於配置疫苗,接種該疫苗之牛、其他哺乳類動物及鳥類對抗多殺性巴斯德氏菌具有高保護力。本發明亦證明nanP與hyaC基因突變之組合為提供此類疫苗的關鍵。可將數種其他牛病原體之抗原材料可與活性減毒多殺性巴斯德氏菌株組合,適當地配製以產生出更有效的混合疫苗。
Description
本發明係關於一種新型多殺性巴斯德氏菌株,其包含特定基因的改造,其可作為安全又有效的疫苗,並提供交叉保護,以防止牛隻被種類多樣的多殺性巴斯德氏菌株感染,與全球牛病相關。本發明係進一步關於產生減毒細菌之方法,及進一步確認與降低致病力相關之核酸變異。本發明係進一步關於一種具有前述特性之活性減毒多殺性巴斯德氏菌(
P.multocida),儘管在實行本發明時使用相應之不活化細菌亦有效。一般而言,本發明係關於一種配製合適疫苗組成物之方法,包含重組組裝及培養合適的細菌,及提供接種疫苗組成物,其包含對應於多種其他重要牛病原體之抗原。
多殺性巴斯德氏菌(
Pasteurella multocida)為巴斯德氏菌科中的革蘭氏陰性球桿菌,其為從感染肺炎牛的肺中取出之常見的細菌分離物,及為美國牛呼吸系統疾病 (BRD) 的主要原因之一(參見 D. Griffin,Bovine pasteurellosis and other bacterial infections of the respiratory tract. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract., 2010. 26:57-71)。
多殺性巴斯德氏菌經常自圈養場中致死的 BRD 病例中分離出,且通常是乳牛感染地方性肺炎中的組成物之一(參照D. Griffin, 2010, supra)。已證實多殺性巴斯德氏菌與此等症候群有所關聯,然而,此兩種疾病的起源均被認為是多因子的,其中傳染性因子與非傳染性因子結合致使此等疾病發生。舉例而言,與其他牛細菌及病毒呼吸道生物體及環境壓力源的並行感染即被認為導致此等複雜症候群(參見Yates WD. A review of infectious bovine rhinotracheitis, shipping fever pneumonia and viral-bacterial synergism in respiratory disease of cattle. Can J Comp Med. 1982;46(3):225-263)。
多殺性巴斯德氏菌依莢膜血清群及菌體(LPS)血清群分類,分別描述5種莢膜(A、B、D、E、F)及16種菌體類型(參見G. Carter, Pasteurellosis: Pasteurella multocida and Pasteurella hemolytica. Adv. Vet. Sci., 1967. 11:321-792; and Heddleston, et al., Fowl cholera: gel diffusion precipitin test for serotyping Pasteruella multocida from avian species. Avian Dis., 1972. Jul-Sep;16(4):925-36)。疾病具有普遍的特異性,其中多殺性巴斯德氏菌莢膜A型分離株為 BRD及地方性肺炎的主要致病因子。多殺性巴斯德氏菌莢膜B型與E型引起出血性敗血症,其為牛與水牛致命性疾病(參見,例如R. Verma and T. Jaiswal, Haemorrhagic septicaemia vaccines. Vaccine, 1998. 16:1184–1192)。多殺性巴斯德氏菌為斷奶小牛及圈飼牛的鼻咽與扁桃腺中長期攜帶的病原體(參見see J. Allen, et al., Changes in the bacterial flora of the upper and lower respiratory tracts and broncho-alveolar lavage differential cell counts in feedlot calves treated for respiratory diseases. Can. J. Vet. Res., 1992. 56:177-183),及兩種細菌的宿主可能為下呼吸道傳染的來源(亦參見 D Griffin, et al., Bacterial pathogens of the bovine respiratory tract. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract., 2010. 26:381-394)。
據統計臨床上多殺性巴斯德氏菌的分離率在小牛中介在20%~60%,而多殺性巴斯德氏菌的分離率在臨床上生病動物的鼻道中甚至更高(參見D. Griffin, D., Bovine pasteurellosis and other bacterial infections of the respiratory tract. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract., 2010. 26:57-71)。在 BRD 慢性病例中經常觀察到多殺性巴斯德氏菌,通常伴隨著其他細菌,且認為先前的肺部損傷有利於多殺性巴斯德氏菌的建立及影響疾病的嚴重程度。
已知多殺性巴斯德氏菌的致病因子包含莢膜及唾液酸結合LPS。參見,舉例而言,(1) K. Snipes, et al., Fate of Pasteurella multocida in the blood vascular system of turkeys following intravenous inoculation: comparison of an encapsulated, virulent strain with its avirulent, acapsular variant. Avian Dis., 1986. 31, 254–259、(2) J. Chung, et al., Role of capsule in the pathogenesis of fowl cholera caused by Pasteurella multocida serogroup A. Infect. Immun., Apr. 2001. 69(4):2487-92、(3) T. Fuller, et al., Identification of Pasteurella multocida virulence genes in a septicemic mouse model using signature-tagged mutagenesis. Microb. Pathog. 2000. 29:25-38及(4) F. Tatum, et al., Sialic acid uptake is necessary for virulence of
Pasteurella multocidain turkeys. Microb. Pathog., 2009. 46:337-344。
定義血清群A型莢膜之多殺性巴斯德氏菌成分之組成物(結構)主要為透明質酸,其為一種由 D-葡萄糖醛酸及 N-乙醯基-D-葡萄糖胺交替單元組成的聚合物。透明質酸生合成所需之基因編碼在含有hyaE、hyaD、hyaC及hyaB之操縱子內。已證實多殺性巴斯德氏菌血清群A型莢膜在抵抗補體介導的殺傷中扮演重要的角色(參見K. Snipes et al., Fate of Pasteurella multocida in the blood vascular system of turkeys following intravenous inoculation: comparison of an encapsulated, virulent strain with its avirulent, acapsular variant. Avian Dis. 1986. 31, 254–259)。A型莢膜缺失之多殺性巴斯德氏菌突變株在小鼠及禽類模型中毒性是減弱的(參見J. Chung, et al., Role of capsule in the pathogenesis of fowl cholera caused by Pasteurella multocida serogroup A. Infect Immun. 2001 Apr ;69(4):2487-92)。
唾液酸是神經胺酸的N-或O-取代衍生物之通稱,神經胺酸為具有9-碳骨架的單醣。革蘭氏陰性菌對唾液酸的修飾為其致病力的特徵之一且紀載完備(參見E. Vimr et al., To sialylate, or not to sialylate: that is the question. Trends Microbiol., June 2002. 10(6):254-7)。多種病原體與共生細菌無論是從頭合成唾液酸,抑或自宿主組織中獲取唾液酸,唾液酸均會被內化並結合至 LPS及莢膜中(參見S. Steenbergen, et al., Sialic acid metabolism and systemic pasteurellosis. Infect. Immun. March 2005. 73(3):1284-94)。已知超過20種微生物病原體使用表面唾液酸化作為分子擬態的型式之一。已知將唾液酸分子結合至細菌表面可使細菌具有隱身特性,從而能逃脫宿主的防衛機制(參見H. Smith et al., Sialylation of lipopolysaccharide: a major influence on pathogenicity. Microb. Path. Dec. 1995. 19(6):365-77)。
多殺性巴斯德氏菌A:3 (P1059) ΔnanP ΔnanU突變株先前被證明無法從生長培養基中吸收唾液酸,及當生長於含有放射性標記唾液酸的情況下亦無法吸取唾液酸(F. Tatum, et al. Sialic acid uptake is necessary for virulence of Pasteurella multocida in turkeys. Microb Pathog. 2009. 46:337-344)。
此外,該多殺性巴斯德氏菌突變株與其親本不同,其未表現放射性標記的唾液酸結合至細胞成分中,這代表該突變株無法使用外源性唾液酸以吸收及修飾細胞表面分子。相較於野生型親本,多殺巴斯德氏菌ΔnanP ΔnanU 突變株亦在火雞中表現出大為降低的致病力(F. Tatum, et al., 2009, supra)。
美國專利號7763262中記載yiaO (「nanP」)中的突變與減毒的多殺性巴斯德氏菌有關。然而,普遍認為提供減毒取決於兩個或複數個基因突變的細菌時,可使細菌失去更適當的致病力及提供額外的安全性。關於此,美國專利公告號2018/0015157揭露減毒的多殺性巴斯德氏菌具有hyaD與nanPU的基因缺失。
因此, 有潛力進一步開發改造多殺性巴斯德氏菌生物體,以作為有效的疫苗,其包含與其他病原體之抗原結合使用。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]美國專利號7763262
[專利文獻2]美國專利公告號2018/0015157
本發明提供一種分離及活性減毒之多殺性巴斯德氏菌(
P. multocida)細菌,該細菌由於hyaC基因突變導致透明質酸生合成有缺陷,及由於nanP基因突變導致表面唾液酸化有缺陷,其可用作疫苗。減毒突變係選自由整個基因的缺失、部分基因缺失、移碼突變、核苷酸***及導緻密碼子置換之核苷酸置換組成之群組。由hyaC基因或nanP基因表現合成之蛋白質是無活性的,或至少本質上無活性,其導致該生物體的致病力顯著降低。一般而言,減毒細菌理想為血清群A型,惟所得之細菌作為活性減毒疫苗亦提供對A、B、D、E、F 型莢膜生物體之保護力。
在一實施例中,在改良多殺性巴斯德氏菌之前,其包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO:9之野生型hyaC的DNA序列,或任何與該野生型hyaC的DNA序列至少80%相同之胺基酸序列;及在改良多殺性巴斯德氏菌之前,其包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO:2之野生型nanP的DNA序列,或任何與該野生型nanP的DNA序列至少80%相同之胺基酸序列。在一實施例中,減毒細菌包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO:4之nanP基因序列,及編碼胺基酸序列SEQ ID NO:11之hyaC基因序列。
在一更理想之實施例中,該突變在hyaC基因及/或nanP基因中係完全不活化的。
本發明主張於2020年9月30日提交之第63/085495號美國臨時專利申請案之優先權。該臨時申請案之內容全文併於此以供參考。
本發明之臨時申請案包含序列表,其已經透過EFS-Web以ASCII文字檔案格式(.txt)提交,在此藉由引用整體併入文中。該ASCII檔創建於2020年9月30日,其命名為SequenceListing,大小為28千位元組(KB)。本序列表作為37 C.F.R. § 1.821(c)要求之序列表的紙本複本,及37 C.F.R. § 1.821(e)要求之序列表的電腦可讀格式(CFR)。根據C.F.R. § 1.821(f) 發表聲明並非必要。
[簡單說明多核苷酸及多肽序列]
表A中列出本發明提供的各種多核苷酸與多肽序列,及其各自分配到之序列識別碼。
表A - 多核苷酸與多肽
識別號 | 物質 |
SEQ ID NO: 1 | 野生型(未改良) nanP核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 2 | 野生型(未改良) nanP胺基酸序列 |
SEQ ID NO: 3 | ΔnanP核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 4 | ΔnanP胺基酸序列 |
SEQ ID NO: 5 | 由 SEQ ID NO:13與SEQ ID NO:14 之引子擴增片段中包含的多核苷酸 |
SEQ ID NO: 6 | ΔhyaC與附近的操縱子之核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 7 | ΔnanP與附近的操縱子之核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 8 | 野生型(未改良) hyaC核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 9 | 野生型(未改良) hyaC胺基酸序列 |
SEQ ID NO: 10 | 野生型hyaC與附近的操縱子之核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 11 | ΔhyaC胺基酸序列 |
SEQ ID NO: 12 | ΔhyaC核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 13 | 引子1062 Bam-nanP-F核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 14 | 引子1062 Sal-nanP-R核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 15 | 引子1062 Bam-hyaC-F核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 16 | 引子1062 Pst-hyaC-R核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 17 | 引子1062 Pst-hyaC-F核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 18 | 引子1062 Sal-hyaC-R核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 19 | ΔnanP 缺失位點附近的核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 20 | ΔnanP 缺失位點附近的胺基酸序列 |
SEQ ID NO: 21 | ΔhyaC缺失位點附近的核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 22 | ΔhyaC缺失位點附近的胺基酸序列 |
所有在本實施例所使用科學或技術之術語一般而言皆與本領域具有通常知識者所知悉的意思相同,除非在此另有說明。且除非上下文另有要求,單數術語包含複數,複數術語包含單數。
本發明在此使用之術語「佐劑(adjuvant)」係指改良藥理學或免疫學之其他藥劑效果之藥劑,例如:藥物或免疫原性組成物。佐劑通常包含於免疫原性組成物中,以增強接受者對所供給抗原的免疫反應。參見下述對佐劑進一步的說明。
本發明在此使用之術語「抗體(antibody)」或「抗體(antibodies)」係指能夠藉由辨識表位而結合抗原之免疫球蛋白分子,免疫球蛋白是由「輕」及「重」多肽鏈組成之血清蛋白,其具有「可變區」及「穩定區」,並依據穩定區的組成分成五個種類(例如:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。當「特異的」抗體與給定的抗原作用,表示抗體的可變區專門識別並結合特定抗原。抗體可以是多株混合物,亦可以是單株,可以為源自天然或重組來源之完整免疫球蛋白,或可為完整免疫球蛋白之免疫反應的部分。抗體可以多種型式存在,包含 Fv、Fab’、F(ab’)2、Fc及單鏈。抗體可轉化為抗原結合蛋白,包含但不限於抗體片段。如本發明所使用,可互換使用之術語「抗原結合蛋白」、「抗體」等係指包含抗原結合位點的一或複數個多肽或其片段。術語「抗原結合蛋白」或「抗體」理想為係指單株抗體及其片段,及其可結合特定蛋白及片段的免疫結合等同物。如本發明所使用之術語,該術語不僅包含完整的多株或單株抗體,亦包含其片段。以本發明之目的而言,除非另有說明,「抗體」及「抗原結合蛋白」亦包含抗體片段。示例性抗體片段包涵 Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、dAb、雙抗體、其等抗原辨識片段、小型模組化免疫藥物(SMIPs) 奈米抗體等,所屬領域中具有通常知識者均認可的抗原結合蛋白或抗體片段,及任何如上所述之片段及其化學或基因操作的對應物,及其他抗體片段與突變體,包含抗體部分之融合蛋白,及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子中任何其他改良的構型。製造抗體及抗原結合蛋白可以藉由傳統的融合瘤技術(Kohler et al., Nature 256:495 499 (1975))、重組DNA的方式(美國專利號 4816567)或噬菌體展現抗體技術文庫(Clackson et al., Nature 352:624 628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 597 (1991))。其他製造抗體的技術,參見Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 及其他通常知識者所知悉的技術。
本發明所使用之術語「抗原(Antigen)」,係指含有一個或複數個表位(線性表位、構象表位或兩者都有)之分子,其在施予受試者時將誘導對該抗原特異的免疫反應。表位是與T細胞受體或特異性B細胞抗體結合之抗原特異性位點,通常包含約3至約20個胺基酸殘基。術語「抗原」亦可指次單位抗原,亦即抗原從整個生物體分離出的抗原,該抗原與自然界有關,亦可為被殺滅的、減毒或不活化的細菌、病毒、真菌、寄生蟲或其他微生物。術語「抗原」亦可指抗體,例如:抗獨特型抗體或其片段,及合成肽模擬表位,其可模擬抗原或抗原決定子(表位)。術語「抗原」亦可指在體內表現抗原或抗原決定子之寡核苷酸或多核苷酸,例如:在DNA免疫相關應用中。本發明所使用之術語「抗原」係能被抗體或抗原結合蛋白特異性結合的分子或分子的一部分。特別地,抗體或抗原結合蛋白將結合抗原之表位。本發明所使用之術語「表位」係指被抗體或抗原結合蛋白的可變區中之高度變異區或互補決定區(CDR)辨識的抗原決定子。
本發明所使用之術語「動物(animal)」係指易於被牛黴漿菌感染無論是馴養抑或野生的任何動物。理想地, 本發明所使用之術語「動物(animal)」係指牛。
本發明所使用之術語「減毒的(attenuated)」係指一種微生物菌株,其致病力已降低,因此通常會引發免疫反應但不會造成疾病產生。減毒株致病力低於其來源的親本株。可在體外或體內篩選減毒微生物,以確認它們的致病力低於其親本株。傳統用於引起減毒突變的方法,例如:體外繼代,及化學突變誘發。另一種減毒的方法包含使用定點突變進行預先決定的突變,其可引起一或複數個突變。本發明所使用之術語「更減毒的(more attenuated)」,係指經進一步改良而較其來源的減毒菌株更減毒之菌株,此種進一步的減毒可藉由額外的體外繼代或額外的化學或定點突變來達成。為了能作為活性疫苗,任何減毒生物體必須使宿主免疫系統誘發有效的免疫反應,其可能需要該生物體的部分生長。
本發明所使用之術語「細菌(bacteria)」、「細菌種(bacterial species)」、「細菌(bacterium)」等係指大的原核微生物域。
本發明所使用之術語「牛(bovine)」係指各種體型中型到大型之有蹄類動物,其通常具有偶蹄,及其中至少一個性別具有實際的角。牛包含但不限於家牛、野牛、非洲水牛、水牛、犛牛及四角或螺旋角羚羊。
本發明所使用之術語「化學突變誘發(chemical mutagenesis)」係指使用一種化合物以增加某些類型突變發生之頻率高於自然基準。所使用之化合物因其進入細胞的能力、與核酸作用之程度、普遍毒性及其引入核酸的化學變化類型被內源性修復系統修復之可能性不同,,導致化合物之效力可能有所不同。
本發明所使用之術語「免疫原性組成物(immunogenic composition)」或「免疫量(immunogenic amount)」係指當單獨施用或與藥學上可接受之載體一起施用於動物,組成物所產生有效的免疫反應(亦即,具有有效、及/或至少部分保護的免疫活性)。免疫反應可為主要由胞毒型T細胞介導的細胞免疫反應,或主要由輔助型T細胞介導的體液免疫反應,輔助性型T因而活化B細胞,使抗體產生。此外,可產生特異的 T淋巴細胞或抗體,以便將來保護免疫的宿主。
本發明所使用之術語「分離(isolated)」係指參考材料從其一般存在之環境中的一些成分中移除。因此,分離之生物材料可不含部分細胞成分,即發現或產生該材料之細胞成分。在核酸分子的情況下,分離之核酸包含如PCR產物、分離之mRNA、cDNA或限制性片段。在另一實施例中,分離之核酸理想為自可能發現之染色體上切除,且更理想為不再與非調控、非編碼區或位於在染色體發現該核酸分子之上游或下游的其他基因連接。又在另一實施例中,分離之核酸缺乏一或複數個內含子。分離之核酸分子包含***至質體、黏接質體、人工染色體等中之序列。因此,在一特定實施例中,重組核酸為分離之核酸。分離之蛋白質可與其他蛋白質或核酸或兩者相關,其在細胞中與之相關,或若其為膜相關蛋白質,則與細胞膜相關。分離之胞器、細胞或組織從其在生物體中發現之解剖部位移除。分離的材料可以為但不必為純化的。「分離的」或「純化的」多肽或多核苷酸,例如:「分離的多肽」或「分離的多核苷酸」,其被純化至超出其在自然界中存在的狀態。舉例而言,「分離的」或「純化的」多肽或多核苷酸,可基本上不含來自該蛋白或多核甘酸衍生之組織來源或細胞之細胞材料或其他受污染之蛋白,或在化學合成時基本上不含化學前驅物或其他化學品。製備具有少於約50%之非抗原結合蛋白(本文亦稱為「污染蛋白」)或化學前驅物之抗原結合蛋白被認為是「基本上不含有」。40%、30%、20%、10%及更理想為5%(按乾重計)之非抗原結合蛋白或化學前驅物被認為是基本上不含有的。
本發明所使用之術語「藥物(medicament)」係指促進從感染、創傷或疾病中恢復之藥劑;係一種藥物。
本發明所使用之術語「突變株(mutant)」係指由突變實例形成或產生之個體或生物體,突變是生物體之核酸或染色體內之鹼基對序列變化,及導致產生野生型個體或生物體中未發現之新特徵或性狀。
本發明所使用之術語「親本(parent)」或「親本株(parental strain)」係指衍生子代或後代之個體。如本發明所使用之術語「後代(progeny)」係指由一或複數個親本或親本株產生或衍生的。
本發明使用之術語「預防(prevent)」、「預防(preventing)」或「預防(prevention)」等係指抑制微生物複製、抑制微生物傳播或抑制微生物在宿主體內建立。此等術語亦可係指抑制或阻斷一或複數種感染之徵象或症狀。
本發明使用之術語「逆向工程(reverse engineer)」或「逆向致突變(reverse mutagenize)」係指藉由遺傳手段(例如:聚合酶鏈反應或PCR)重新引入在微生物基因組內特定位置處出現的原始核苷酸序列,其中該序列在之前已經改變。
本發明使用之術語「連續繼代(serial passage)」或「連續繼代(serial passaging)」係指藉由純化生物體,理想為微生物,以獲得選殖純群體之方法。該術語亦可指用於減弱或削弱生物體,理想為微生物致病力之技術。
本發明使用之術語「治療有效量(therapeutically effective amount)」(或「有效量(effective amount)」) 係指活性成分的量,例如:根據本發明之藥劑,無論是否有佐劑,視情形在適當的狀況下,提供適當的一劑或複數劑量,使施用於受試者或患者時足以產生有益或所期望之結果。有效量可以一或複數次施用藥物、應用或劑量給藥。根據本發明之組成物的治療有效量可由所屬領域中具有通常知識者輕易地決定,並為患者提供可測的效益,例如:保護動物免受類似病原體後續的攻擊。
本發明使用之術語「治療的(therapeutic)」或「治療(treatment)」包含對疾病或病症全方位的治療。舉例而言,本發明的「治療的」藥劑可以某種方式作用,或可產生預防性或預防效果之治療,包含結合識別針對動物處在的風險而設計出的程序(藥物遺傳學);或以改善或治療性質之方式;或可起到減緩所治療之疾病或病症的至少一種症狀進展速度或程度的作用。
本發明使用之術語「獸醫可接受之載體(veterinarily-acceptable carrier)」係指在合理的醫學判斷範圍內,適合與動物組織接觸使用,無異常毒性、刺激性、過敏反應等物質,與合理的收益風險比相稱,並對其預期用途有效。
[多殺性巴斯德氏菌hyaC與nanP基因的部分缺失]
以下實施例1~3呈現有hyaC與nanP特定雙缺失的構造。所屬領域中具有通常知識者將瞭解,此等基因編碼區內的任何缺失通常具有足夠長度,或包含其涉及編碼蛋白質特定結構或功能角色之特定胺基酸,應提供與本發明同樣有用之實施例。因此,完全無需刪除整個開放閱讀框,而參考生物資訊分析的標準方法,其將有hyaC與nanP中許多其他等效且有效突變之建議。因此,從野生型hyaC DNA序列(SEQ ID NO:8)及等效胺基酸序列(SEQ ID NO:9)開始,可以鑑定出許多合適的缺失片段。相似地,在此方面有用的是未修飾nanP之DNA序列(SEQ ID NO:1)及相對應的胺基酸序列(SEQ ID NO:2)。此外,甚至可提供nanP與hyaC 基因的全長拷貝,其中特定的胺基酸密碼子有變化,因此雖提供全長編碼序列,但實際上歸因於一或複數個關鍵胺基酸突變,所得之蛋白質不具功能,且生物體減毒。因此,一旦業者意識到此突變之整體價值,可進行突變以達到nanP/hyaC 衰減之範圍非常廣泛,構建技術亦種類繁多。
在本實施例中, 藉由從野生型nanP開放閱讀框去除708個核苷酸來產生ΔnanP。截斷部分nanP以達成可能同樣有效使多殺性巴斯德氏菌減毒的代表性例子包含去除額外核苷酸,或去除較少核苷酸,即,從nanP基因中去除從1到984任意數量之核苷酸以達成多殺性巴斯德氏菌的減毒。在本實施例中,藉由從野生型hyaC 開放閱讀框中移除500個核苷酸來產生ΔhyaC。截斷hyaC以達成可能同樣有效使多殺性巴斯德氏菌減毒的代表性例子包含去除額外核苷酸,或去除較少核苷酸,即,從hyaC基因中去除從1到1107任意數量之核苷酸以達成多殺性巴斯德氏菌的減毒
亦可將點突變引入nanP及/或hyaC之開放閱讀框中以達成多殺性巴斯德氏菌的減毒。可引入點突變類型的例子為所屬領域中具有通常知識者所習知。
除了hyaC、nanP基因突變之外,任選地,可在血清群A之多殺性巴斯德氏菌(
P.multocida )細菌中突變其他基因以獲得減毒細菌。任選突變之基因可是一或複數種Fis或白血球毒素A之致病基因。
關於本發明之此類等效實施例及係指任何此類最終基因組序列之構建與組裝,適用於以下所有定義及技術標準。
本發明之目的,第二多核苷酸分子(RNA或DNA)之核苷酸序列與第一多核苷酸分子之核苷酸序列「同源」,或與該第一多核苷酸分子具有「同一性」,其中根據遺傳密碼的簡併性,第二個多核苷酸分子之核苷酸序列編碼與第一個多核苷酸分子之核苷酸序列相同的多胺基酸,或當其編碼之多胺基酸與第一個多核苷酸分子之核苷酸序列編碼的多胺基酸足夠相似時,以可用於本發明。同源多核苷酸序列亦係指同義股及反義股,且在所有情況下均為任何此類型股之互補股。通常,根據BLASTN演算法若第二個多核苷酸分子之核苷酸序列與與第一多核苷酸分子的核苷酸序列具有約70%的核苷酸序列同一性,則第二個多核苷酸分子之核苷酸序列與第一個多核苷酸分子之核苷酸序列同源,(國家生物技術資訊中心,亦稱為NCBI,美國國家衛生研究所的(貝什斯達,馬利蘭,美國))。根據本發明進行計算之具體實施例中,參考 BLASTP 2.2.6 [Tatusova TA及TL Madden,「BLAST 2序列——用於比較蛋白質和核苷酸序列的新工具。」(1999) FEMS Microbiol Lett.174:247-250.]。簡言之,使用 10 的缺口開放罰分(gap opening penalty of 10)、0.1 的缺口延伸罰分(gap extension penalty of 0.1)及 Henikoff 與 Henikoff 的「blosum62」評分矩陣(Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:10915 10919. 1992)比對兩個胺基酸序列以最佳化比對得分。接著將同一性百分比計算為:相同匹配總數×100/除以較長序列之長度+引入較長序列以比對兩個序列的缺口數。
理想地,同源核苷酸序列具有至少約75%的核苷酸序列同一性,甚至更理想為至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%的核苷酸序列同一性。由於遺傳密碼是簡併的,同源核苷酸序列可包含任何數量之「沉默」鹼基變化,即編碼相同胺基酸之核苷酸取代。
同源核苷酸序列可進一步包含非沉默突變,即導致編碼的多胺基酸中胺基酸差異之鹼基置換、缺失或添加,只要該序列與第一核苷酸序列編碼的多胺基酸保持至少約 70% 的同一性,或其他可用於實踐本發明。就此而言,可進行特定一般認為不會使整體蛋白質功能失活之保守性胺基酸取代:例如:關於帶正電荷的胺基酸(反之亦然)、離胺酸、精胺酸及組胺酸;關於帶負電荷的胺基酸(反之亦然),天冬胺酸及麩胺酸;及關於某些帶中性電荷的胺基酸組(在所有情況下,反之亦然),(1)丙胺酸和絲胺酸、(2)天冬醯胺、麩醯胺酸及組胺酸、(3)半胱胺酸及絲胺酸、(4)甘胺酸及脯胺酸、(5)異白胺酸、白胺酸及纈胺酸、(6)甲硫胺酸、白胺酸及異白胺酸、(7)***酸、甲硫胺酸、白胺酸及酪胺酸、(8)絲胺酸及蘇胺酸、(9)色胺酸及酪胺酸、(10)及例如酪胺酸、色胺酸及***酸。胺基酸可以根據物理性質及對二級和三級蛋白質結構進行分類。保守性置換在所屬領域中被認為是一種胺基酸被具有相似特性的另一種胺基酸置換。示例性保守置換可在公開於1997年3月13日WO 97/09433中第10頁找到(PCT/GB96/02197, filed Sep. 6, 1996. Alternatively, conservative amino acids can be grouped as described in Lehninger, (Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp. 71-77),以下記載其他合適的保守性變化及其應用。
同源性核苷酸序列可藉由比較核苷酸序列來確定,例如:藉由使用如上所述之BLASTN。取代性地,同源核苷酸序列可藉由在選定條件下雜交來確定。舉例而言,若第二多核苷酸分子的核苷酸序列在中等嚴苛條件下與SEQ ID NO:1的互補序列雜交,則其與SEQ ID NO:1(或任何其他特定的多核苷酸序列)為同源,舉例而言,在65℃下使用0.5M NaHPO
4、7% 十二烷基硫酸鈉 (SDS)、1 mM EDTA 與濾紙結合DNA進行雜交反應,並在42℃下於0.2xSSC/0.1%之SDS中洗滌(參見Ausubel et al editors, Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1994, pp. 6.0.3 to 6.4.10),或在其他條件下使編碼以下所定義之PRRS病毒序列得以進行雜交。雜交條件之調整可根據經驗來決定,或根據探針中鳥嘌呤核苷/胞嘧啶 (GC) 鹼基配對之長度及百分比來精確計算。可依照Sambrook, et al., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47 to 9.51.來計算雜交條件。
在另一實施例中,若第二核苷酸序列在高度嚴苛條件下與SEQ ID NO:1(或其他適當序列)的互補序列雜交,則其與SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:8,或本發明之任何其他序列)為同源,舉例而言,在65℃下使用0.5M NaHPO
4、7% SDS、1 mM EDTA 與濾紙結合DNA進行雜交反應,並在68℃下於0.1xSSC/0.1% SDS中洗滌為所屬技術領域所習知(Ausebel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1989)。
亦應理解的是,本發明分離之多核苷酸分子及分離之RNA分子,均包含合成分子及藉由重組技術獲得之分子,例如:藉由體外選殖與轉錄。
可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知對多核苷酸分子進行遺傳突變之重組技術,如所屬技術領域所公知,包含藉由定點突變,或藉由隨機突變,例如習知藉由暴露於化學誘變劑或輻射。突變可藉由所屬技術領域已知之標準方法進行,舉例而言如定點突變(參見例如Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) 所述之感染性複本 (例如Meulenberg et al., Adv. Exp. Med. Biol., 1998, 440:199-206)。
〔本發明之疫苗組成物〕
本發明確認參與減毒多殺性巴斯德氏菌,及用於減毒細菌有用之重組構造且作為牛疫苗非常有用之基因及基因序列。從此等發現中獲得之指引,亦許可篩選及分離天然菌株或藉由例行的培養產生之菌株,可證明此等菌株具有類似的特性。此種減毒細菌特別適用於製備活病毒疫苗,其可進一步包含抗原成分(活的全細菌、菌苗、抗原性個體蛋白質或其他大分子,及活的與不活化的病毒)以提供組合疫苗。就此點而言,所屬技術領域中具有通常知識者將理解,任何此類組合製劑可包含多次瓶裝,最終稀釋、組合及混合,因為最佳儲存條件或與佐劑組合可能導致不相容性,舉例而言,對熟練的細菌成分有用之佐劑可能與含有的活病毒或細菌成分長期儲存不相容。
多殺性巴斯德氏菌在修飾前含有野生型hyaC DNA序列,該序列為SEQ ID NO:8或與其至少80%相同之任何DNA序列;及在修飾前含有野生型nanP DNA序列,該序列為SEQ ID NO:1或與其至少80%相同之任何DNA序列。在一個結果理想之實施例中,減毒細菌包含編碼SEQ ID NO:4多肽之nanP基因序列,及編碼SEQ ID NO:11多肽之hyaC基因序列。
本發明的減毒型多殺性巴斯德氏菌在牛體內引起強烈的免疫反應,使其對疾病具有保護力。如上所述,多殺性巴斯德氏菌按莢膜血清群及菌體(LPS)血清型分類,分別描述5個莢膜(A、B、D、E、F)及16個菌體類型,(參見G. Carter, Pasteurellosis: Pasteurella multocida and Pasteurella hemolytica. Adv. Vet. Sci., 1967. 11:321-792.)。雖然本發明之減毒菌株提供針對由多種多殺瘧原蟲血清群引起之疾病的保護力,但理想為針對莢膜血清型 A提供之保護力。
〔二成份組成物〕
另一種對牛有重大影響的細菌病原體是巴斯德氏(曼海姆氏菌)溶血菌。雖然許多病原體都被認為是導致牛呼吸道複合性疾病(BRDC)的原因,惟
M. haeomolytica被認為是導致嚴重形式的「飼養場牛隻運輸熱及小牛肺炎,包含在奶牛場」的主因。事實上,由於導致急性纖維性大葉胸膜肺炎,此種病原體實際上可能是與此種疾病條件下死亡有關之主要病原體。一個高效溶血菌疫苗的例子是One Shot®,由美國Zoetis公司生產,其對A-1型溶血菌感染提供極佳的保護力,其包含治療有效量之A-1型類白血球毒素、莢膜抗原、可溶性抗原及不活化細胞,只需一劑就可對牛提供保護力。在此理想的例子中,抗原成分由ATCC No.55318菌株提供,亦參見美國專利號5855894。
因此,在本發明的一理想實施例中,提供
M.Haemolytica抗原(如上所述)及
P.multocida減毒活菌之凍乾製劑,該製劑在疫苗使用前立即進行回溶,使用之稀釋劑成分包含一或多種佐劑,如氫氧化鋁凝膠及礦物油/卵磷脂乳劑。一種理想的佐劑組合為5% v/v礦物油/卵磷脂乳劑佐劑「愛菲金(AMPHIGEN®)」,提供12% v/v氫氧化鋁凝膠及生理鹽水作為佐劑/稀釋劑(參見以下關於佐劑製劑的內容)。此種疫苗可依所需以一劑、兩劑或多劑的方式施用,以下實施例提供關於劑量及時間的指引,其取決於實際使用的抗原組合。
所屬領域中具有通常知識者會認知到,根據本發明的做法,可立即得到許多雙劑量組成物(即提供對兩種病原體的保護)。此種組成物可從一個、兩個或三個獨立的小瓶中提供,在施用給動物前立即混合,此取決於相關成分穩定性的要求。因此,在一最典型的實施例中,細菌膜成分可被佐劑破壞(進一步取決於選擇何種佐劑),或活細菌及活病毒抗原成分可能會變質,抗原成分可從第一來源(例如:凍乾餅)提供,其中佐劑從稀釋劑瓶提供,在接種前立即進行混合。在此方面,合適的額外活性或殺死之病毒及細菌成分包含自牛腹瀉病毒(BVDV)、牛鼻氣管炎病毒(IBR)、副流行性感冒3病毒(PI3)及牛呼吸道融合病毒(BRSV)、牛冠狀病毒(BCV)、牛黴漿菌、昏睡嗜組織桿菌(somnus)及梭菌屬(A、B、C、D型產氣夾膜桿菌、破傷風梭菌(Tetani)、敗毒梭菌(Speticum)、索氏梭菌(Sordellii)、溶血芽胞梭菌(Haemolyticum)、諾維氏芽胞梭菌(Novyi)、氣腫疽梭菌(Chauvoi))提供。
〔多成份組成物〕
一種理想的多成份疫苗包含將減毒的
多殺性巴斯德氏菌成分與Zoetis公司之Bovishield Gold®結合使用,Zoetis公司亦提供牛腹瀉病毒(BVDV)、牛鼻氣管炎病毒(IBR)、副流行性感冒3病毒(PI3)及牛呼吸道融合病毒(BRSV),其具體病毒分離物如下所示。1965年,牛鼻氣管炎病毒(IBR)從Cutter實驗室獲得C-13繼代,在牛腎細胞上繼代(NL-BK-1A),於1971年被APHIS批准為製造之主病毒種;1969年,內布拉斯加大學分離副流行性感冒3病毒(PI3)「Reisinger」,在牛腎細胞上繼代(NL-BK-1A),1971年被APHIS批准為製造之主病毒種;牛呼吸道融合病毒(BRSV)分離自愛荷華州的爆發,由VMRD(位於Ames,IA愛荷華州)命名為「BRSV/375」,隨後在Norden實驗室中NL-BK及BT細胞中繼代,並於1982年被APHIS批准為製造之主病毒種;牛病毒腹瀉病毒(BVDV)1A型,1993年自Whitehall獲得,在Norden實驗室重新接種到NL-BK-6細胞中,重新命名為NADL MSVX+1菌株,1994年被APHIS批准為製造之主病毒種;及牛病毒腹瀉病毒(BVDV)2型,從圭爾夫大學獲得53637菌株,在NL-BT-2細胞中蝕斑純化,轉移至NL-BK-6細胞中,進一步減毒,2002年被APHIS批准為製造之主病毒種。
此製劑可進一步包含不活化之曼海姆氏溶血菌,如前所述,因此併入商品Bovishield Gold-One Shot®,Zoetis公司。
另一個配方是Bovishield GOLD FP5 VL5 HB®,Zoetis公司,再次以2個小瓶的形式提供,供其一起使用。首先是以下五種無佐劑之改良型活病毒凍乾製劑的製備:牛鼻氣管炎病毒(IBR)+副流行性感冒3病毒(PI3)+牛呼吸道融合病毒(BRSV)+牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)(包含1A及2型);(在最終產品使用時)與另一個小瓶混合,該小瓶含有水、佐劑,該佐劑為六(6)種不同被殺死的整個細菌病原體之組合,包含五(5)種鉤端螺旋體血清及一(1)種胎兒彎曲桿菌。細菌成分中提供的佐劑賦予對IBR與BVDV病毒之 「胎兒保護力」,見下文所述。下述抗原成分為病毒:1965年,牛鼻氣管炎病毒(IBR)從Cutter實驗室獲得之C-13繼代,在牛腎細胞上繼代(NL-BK-1A),1971年被APHIS批准為製造之主病毒種; 1969年,內布拉斯加大學分離副流行性感冒3病毒(PI3)「Reisinger」,在牛腎細胞上繼代(NL-BK-1A),1971年被APHIS批准為製造之主病毒種;牛呼吸道融合病毒(BRSV)分離自愛荷華州的爆發,由VMRD(位於Ames,IA愛荷華州)命名為「BRSV/375」,隨後在Norden實驗室中NL-BK及BT細胞中繼代,並於1982年被APHIS批准為製造之主病毒種;牛病毒腹瀉病毒(BVDV)1A型,1993年從Whitehall獲得,在Norden實驗室重新接種到NL-BK-6細胞中,重新命名為NADL MSVX+1菌株,1994年被APHIS批准為製造之主病毒種;及牛病毒腹瀉病毒(BVDV)2型,從圭爾夫大學獲得53637菌株,在NL-BT-2細胞中蝕斑純化,轉移至NL-BK-6細胞中,進一步減毒,2002年被APHIS批准為製造之主病毒種。細菌:L. interrogans s. canicola ,1974年7月建立的冷凍主病毒種批號10003,標記為Norden L-15,於1984年前經APHIS批准;L. interrogans s. grippotyphosa,冷凍主病毒種批號10005(Lepto grippo 1550),1974年7月建立,於1984年前經APHIS批准;L. borgpetersenii s. hardjo,1999年冷凍主病毒種批號H.MP11(來自澳大利亞Bairnsdale地區之獸醫實驗室),2001年由APHIS授予Biocor(CSL公司)之核準通知書;L. interrogans s.icterohaemorrhagiae,1975年10月建立的冷凍主病毒種批號10010,標記為Lepto ictero NADL,於1984年前經APHIS批准;及L. interrogans s. pomona,1974年7月建立的冷凍主病毒種批號10002,標記為L. Pomona T262,於1984年前經APHIS批准;胎兒彎曲桿菌,胎兒亞種,1965年從牛身上分離出來,被命名為14858菌株,1981年在Dellen實驗室的許可下被重新命名為17761菌株,並被CVB批准。
〔佐劑及賦形劑,一般情況下〕
在本發明中,疫苗及/或免疫原性組成物包含佐劑。在本說明書中,「佐劑 」係指一種本身不具有任何特定抗原作用之藥劑,其可刺激免疫系統,提高對抗原的反應。
本說明書所述組成物中採用佐劑之濃度將取決於佐劑的性質。佐劑通常以約1~50%(v/v)之最終濃度存在於本說明書所述之組成物中,更典型的是以約10%、15%、20%、25%或30%(v/v)之最終濃度存在。在包含SP-Oil之組成物中,例如:佐劑的含量通常在約1%至約25%(v/v)之間,更典型的是約5%至約15%(v/v),例如:約10%(v/v)。在包含丙烯酸聚合物及由一種或多種萜烯烴及聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物組成之可代謝油混合物之組成物中,例如:丙烯酸聚合物與可代謝油/聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物混合物的比例通常在約1:25與約1:50之間,最終濃度通常在約1%與約25%(v/v)之間。
在一實施例中,生物上可接受之佐劑包含SP-Oil。SP-Oil是一種流體化油乳液,包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic® L121,BASF公司)、角鯊烷、聚氧乙烯山梨醇單油酸酯(Tween® 80,ICI Americas)與緩衝鹽溶液。SP-Oil是一種有效的疫苗佐劑,給受試者服用後能夠誘導細胞介導的(CMI)與體液免疫反應(例如:參見美國專利案US 5709860)。
聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是界面活性劑,有助於懸浮固體及液體成分。此等界面活性劑作為聚合物在市場上有販售,商品名為Pluronic®。理想的界面活性劑是泊洛沙姆(Poloxamer) 401,其商品名稱為Pluronic® L121,在市場上有販售。一般而言, SP-Oil乳液是一種免疫刺激佐劑混合物,其包含約1至3% v/v之嵌段共聚物,約2至6% v/v之角鯊烷,特別是約3至6%之角鯊烷,及約0.1至0.5% v/v之聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯,其餘為緩衝鹽溶液。
在一實施例中,SP-Oil的濃度在約1%至約25% v/v之間。在一實施例中,SP-Oil的濃度在約5%至約15% v/v之間。在一實施例中,SP-Oil的濃度約為10% v/v。
在另一有效實施例中,佐劑可包含皂苷,例如:奎爾A (Quil A)、固醇,例如:膽固醇、季銨化合物,例如:二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA)、聚合物,例如:聚丙烯酸(Carbopol®。路博潤公司)、醣脂,例如:N-(2-去氧-2-L-白胺醯胺-b-D-葡萄吡喃糖苷基)-N-十八基癸醯基乙酸氫鹽,及一種免疫刺激寡核苷酸,包含基於DNA及RNA之寡核苷酸。
在部分實施例中,用於本發明之皂苷是奎爾A及/或其衍生物。奎爾A是一種從南美樹種南美洲智利皂莢樹(Quillaja saponaria Molina)中分離出來之皂苷製劑,Dalsgaard(1974)首次描述它具有佐劑活性,皂苷佐劑,Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, pp. 243-254。藉由HPLC分離出奎爾A的純化片段,此等片段保留佐劑活性,而無奎爾A之毒性(EP 0362278),例如:QS7及QS21(亦被稱為QA7及QA21)。QS21是一種從南美洲智利皂莢樹樹皮中萃取之天然皂苷,其可誘導CD8+細胞毒性T細胞(CTL)、Th1細胞及主要的IgG2a抗體反應,其為一種用於本發明之皂苷。其他適合用於佐劑之皂苷包含但不限於奎爾A之QH-A、QH-B及QH-C次組分,其等來自皂皮樹科以外的物種,例如:來自人參屬(人參)、黃蓍屬、牛膝屬、黃豆、相思樹屬及羊乳屬之物種。在部分實施例中,該皂苷是從皂皮樹科以外的物種中分離出。
在部分實施例中,佐劑可包含固醇。固醇有一個共同的化學核心,即具有羥基(OH)基團之類固醇環結構[s],通常連接在碳-3上。脂肪酸取代物之碳氫鏈長度不一,通常為16至20個碳原子,其可為飽和或不飽和。固醇在環狀結構中通常含有一或複數個雙鍵,亦有各種連接在環上之取代物。固醇及其等脂肪酸酯基本上不溶於水。鑒於此等化學上的相似性,因此,共享此一化學核心之固醇在用於本發明之疫苗組成物時,可能具有類似的特性。適合用於佐劑之固醇包含膽固醇、-植物固醇、豆固醇、麥角固醇及麥角骨化醇。此等固醇在所屬技術領域是習知的,可從商業上購買。例如:在《默克索引》,第12版,第369頁中揭露膽固醇。適合用於佐劑之固醇的數量取決於所使用的固醇之性質。然而,其等之使用量一般為每劑約1微克至約5000微克。其等之使用量亦為每劑約1微克至約4000微克,每劑約1微克至約3000微克,每劑約1微克至約2000微克,每劑約1微克至約1000微克。其等之使用量亦為每劑約5微克至約750微克,每劑約5微克至約500微克,每劑約5微克至約200微克,每劑約5微克至約100微克,每劑約15微克至約100微克,及每劑約30微克至約75微克。
在部分實施例中,佐劑可包含季胺化合物。此等化合物基於銨,具有四個碳氫化合物基團。事實上,碳氫化合物一般僅限於烷基或芳基。在一實施例中,該季胺化合物由四個烷基鏈組成,其中兩個是C10-C20烷基,其餘兩個是C1-C4烷基。在一實施例中,季胺是二甲基十八烷基溴化銨(DDA)、氯化物或藥學上可接受之相對離子。
在部分實施例中,佐劑可包含一或複數種免疫調節劑,例如:白細胞介素、干擾素或其他細胞因子。此等材料可從商業途徑購買而得。適合用於佐劑之免疫調節劑的量取決於所使用的免疫調節劑之性質與受試者。然而,其等之使用量一般為每劑約1微克至約5000微克。其等之使用量亦為每劑約1微克至約4000微克,每劑約1微克至約3000微克,每劑約1微克至約2000微克,以及每劑約1微克至約1000微克。
在部分實施例中,佐劑可包含一或複數種聚合物,例如:DEAE -聚葡萄醣、聚乙二醇、聚丙烯酸及聚甲基丙烯酸(如CARBOPOL®)。此等材料可從商業途徑購買而得。適合用於佐劑之聚合物數量取決於所用聚合物之性質。然而,其等使用量一般為約0.0001%體積比(v/v)至約75% v/v。在其他實施例中,其等使用量為約0.001% v/v至約50% v/v、約0.005% v/v至約25% v/v、約0.01% v/v至約10% v/v、約0.05% v/v至約2% v/v及約0.1% v/v至約0.75% v/v。在另一實施例中,其等使用量約為0.02% v/v至約0.4% v/v。DEAE-聚葡萄醣之分子大小可在50,000 Da至5,000,000 Da之範圍內,或可在500,000 Da至2,000,000 Da之範圍內。此種材料可從商業途徑購買而得或由聚葡萄醣製備而得。
在式I的結構中,R1是氫,或具有多達20個碳原子之飽和烷基;X是-CH2-、-O-或-NH-;R2是氫,或具有多達20個碳原子之飽和或不飽和烷基;R3、R4及R5獨立為氫、-SO42-、-PO42-、-COC1-10烷基;R6是L- 丙胺醯基、L-α-胺基丁基、L- 精胺醯基、L-天冬醯基、L-天冬胺基、L- 半胱胺醯基、L-麩胺醯基、L-甘胺醯基、L-組胺醯基、L-羥脯胺酸、L-異白胺醯基、L-白胺醯基、L-離胺醯基、L-甲硫胺醯基、L-鳥胺酸基、L-苯丙醯基、L-脯胺醯基、L-絲胺醯基、L-蘇胺醯基、L-酪胺醯基、L-色胺醯基及L-纈胺醯基或其D-異構體。
在一實施例中,合適的醣脂是N-(2-去氧-2-L-白胺醯胺-b-D-葡萄吡喃糖苷基)-N-十八基癸醯基乙酸氫鹽或其醋酸鹽,亦以商品名Bay R1005®而聞名。
在部分實施例中,佐劑可包含免疫刺激性寡核苷酸。合適的免疫刺激性寡核苷酸包含ODN(基於DNA)及ORN(基於RNA)寡核苷酸,此等寡核苷酸可有修飾骨架,包含但不限於硫代磷酸酯修飾、鹵化、烷基化(如乙基或甲基修飾)及磷酸二酯修飾。在部分實施例中,可使用聚肌苷酸-胞苷酸或其衍生物(聚I:C)。在一組實施例中,本發明的寡核苷酸含有迴文序列,理想為能形成由莖和環組成之髮夾狀二級結構。在特定實施例中,免疫刺激性寡核苷酸是單鏈的,儘管其等可能含有迴文結構,從而形成雙鏈,例如:莖環結構。 有數類免疫刺激性寡核苷酸為所述技術領域內已知。
在佐劑中使用的免疫刺激性寡核苷酸的數量取決於所使用的免疫刺激性寡核苷酸的性質與預期品種。然而,其等使用量一般為每劑約1微克至約20毫克。其等使用量亦為每劑約1微克至約10毫克,每劑約1微克至約5毫克,每劑約1微克至約4毫克,每劑約1微克至約3毫克,每劑約1微克至約2毫克,及每劑約1微克至約1毫克。
在部分實施例中,佐劑可包含鋁系成分。鋁是一種已知的佐劑或佐劑製劑之成分,以鋁膠(Brenntag;丹麥)或REHYDRAGEL®(Reheis, Inc;紐澤西)等形式在市場上販售。REHYDRAGEL®是一種結晶型氫氧化鋁,在礦物學上被稱為沸石。當必須結合帶負電荷的蛋白質時,其在疫苗中是有效的。根據等級,AI2O3的含量從2%到10%不等,其黏度為1000~1300cP。 一般而言,其可被描述為一種吸附性的氫氧化鋁凝膠。
在部分實施例中,本發明包含但不限於一種免疫原性組成物,其包含能夠在體外誘導產生針對多種HeV及/或NiV菌株交叉反應性中和抗血清之分離的HeV或NiV G蛋白,及由聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic® L121)、角鯊烷、聚氧乙烯山梨醇單油酸酯(Tween® 80)與緩衝鹽溶液組成的佐劑,例如:其中該組成物含有: 5、50、100或250微克之可溶性HeV或NiV G蛋白,及適量的佐劑成分。
在本發明的另一實施例中,疫苗及免疫原性組成物可為藥物組成物的一部分。 本發明之藥物組成物可包含合適的藥學上可接受之載體,該載體包含賦形劑與助劑,便於將活性化合物加工成可用於藥學上之製劑,以傳遞到作用部位。
〔賦形劑〕
本發明之免疫劑及疫苗組成物可進一步包含藥學上可接受的載體、賦形劑及/或穩定劑(參見例如Remington: The Science and practice of Pharmacy (2005) Lippincott Williams),以凍乾製劑或水溶液的形式。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在劑量和濃度下對接受者無毒,可包含緩衝溶液,例如磷酸鹽、檸檬酸及其他有機酸;抗氧化劑包含抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑(如汞((鄰羧基苯基)硫)乙基鈉鹽(THIOMERSAL)、十八烷基二甲基苄基氯化銨;六甲基氯化銨;氯化苄烷銨;氯化本索寧;酚、丁基或苄基乙醇;對羥基苯甲酸烷基酯,例如:甲基或丙基對羥苯甲酸酯;兒茶酚;間苯二酚;環已醇、3-戊醇;及間甲酚);蛋白質;例如:血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,例如:聚乙烯吡咯烷酮;胺基酸,例如:甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸;單醣、雙醣及其等碳水化合物,包含葡萄糖、甘露糖或聚葡萄醣;螫合劑,例如:EDTA;糖,例如:蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成鹽的相對離子,例如:鈉;金屬錯合物(如Zn-蛋白質錯合物);及/或非離子界面活性劑,例如:聚乙二醇(PEG)、TWEEN或PLURONICS。
本發明之組成物可為懸浮在任何適當的藥物載體(vehicle)或載體(carrier)中的劑量,其體積足以承載該劑量。
一般而言,最終體積,包含載體、佐劑等,通常至少為1.0毫升,其上限由實際給藥量來決定,一般不超過約0.5毫升至約2.0毫升。
[實施例]
用於實施例1~3,多殺性巴斯德氏菌(P1062)血清組A血清型3,一種特徵明顯的牛分離物(Abrahante, et al., Draft genome sequence of Pasteurella multocida isolate P1062, isolated from Bovine Respiratory Disease. Genome Announc. 2015. pii: e00058-12. doi: 10.1128/genomeA.00058-12) 被用來構建含有溫度敏感質體複製原點之突變多殺性巴斯德氏菌(參見Briggs and Tatum, Generation and molecular characterization of new temperature-sensitive plasmids intended for genetic engineering of Pasteurellaceae. Appl. Environ. Microbiol. 2005. 71:7187-7195)。藉由在編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的hyaC中引入一個缺失突變,產生一個無莢膜突變體。接著,藉由不活化nanP來產生第二個多殺性巴斯德氏菌之突變體,nanP的基因產物是吸收環境來源的唾液酸所必須的,此使得突變體沒有唾液酸修飾。構建的雙缺失多殺性巴斯德氏菌ΔhyaC ΔnanP突變體可作為候選減毒活疫苗,以減緩BRD。
多殺性巴斯德氏菌菌株P-1062是卡特-赫德勒斯頓A:3型之牛肺分離物。多殺性巴斯德氏菌在以哥倫比亞血瓊脂為基底之培養皿(Difco Lab., Detroit, MI)上生長。Invitrogen™ One Shot™ Top10化學勝任大腸桿菌(ThermoFischer Scientific, Waltham, MA)被用於質體繁殖及選殖,亦在以哥倫比亞血瓊脂為基底之培養皿上進行培養。
所有引子均由Integrated DNA Technologies, Inc.訂製合成。(Coralville, IA)。 在PCR反應中,使用ThermoFischer Scientific之EasyStart™ PCR Mix-in-a-Tube及製造商推薦的方案(Molecular BioProducts, San Diego, CA),將整個多殺性巴斯德氏菌P-1062細胞作為模板。使用GeneAmp 9600 PCR系統熱循環儀(Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT)生成所有PCR擴增產物。反應條件是根據表1中所列的各種引子對之熔點,在退火溫度下進行30個循環。表1中列出引子的名稱,及指定的SEQ ID Nos與相關的退火溫度(℃);隨後是實際核苷酸序列的描述,並以底線標有限制識別位點。
表1:引子特性
1062 Bam-nanP-F (SEQ ID NO:13),退火溫度 61 °C
5’-AAA
GGATCCGCGGATGTGATAGTTTTGACAT-3’ (BamH1)
1062 Sal-nanP-R (SEQ ID NO:14),退火溫度 60 °C
5’-AAA
GTCGACACTGTCGGTGAGCTTG-3’ (SalI)
1062 Bam-hyaC-F (SEQ ID NO:15),退火溫度 57 °C
5’-AAA
GGATCCATGTTGATAAGAATCATCTTACAC-3’ (BamH1)
1062 Pst-hyaC-R (SEQ ID NO:16),退火溫度 63 °C
5’-AAA
CTGCAGTGGCGTTGCGATGATGA-3’ (Pst1)
1062 Pst-hyaC-F (SEQ ID NO:17),退火溫度 57 °C
5’-AAA
CTGCAGCAAGTTTCGGCTATGGCG-3’ (Pst1)
1062 Sal-hyaC-R (SEQ ID NO:18),退火溫度 61 °C
5’-AAA
GTCGACCGCACGATAACGATATGTCTG-3’ (Sal1)
實施例1:構建多殺性巴斯德氏菌(P1062) ΔnanP
用於在多殺性巴斯德氏菌P-1062中產生突變的ΔnanP替換臂是藉由PCR使用引子1062 Bam-nanP-F(SEQ ID NO: 13)及1062 Sal-nanP-R(SEQ ID NO: 14)合成。參見表2,如上文。得到的PCR片段,包含在SEQ ID NO:5中,大約2850個鹼基對,使用QIAquick™核酸純化柱(Qiagen Inc., Valencia, CA)純化,用Applied Biosystems 373型DNA測序儀(Iowa State University, Ames, IA的DNA設施)進行循環測序,並使用螢光終止劑測序。純化之PCR產物經過BamH1與Sal I切割反應,苯酚氯仿萃取及乙醇沉澱。接著使用T7 DNA連接酶將回收的片段(包含在SEQ ID NO: 5內)***質體pBCSK(Stratagene Inc., LaJolla CA)之相應位點。將連接的產物引入One Shot™ Top10化學勝任大腸桿菌細胞(ThermoFischer Scientific, Waltham, MA),接著將其置於含有34微克氯黴素之哥倫比亞血瓊脂上,在37℃下培養過夜。藉由PCR分析評估菌落所需之產物,並在含有34微克氯黴素的哥倫比亞培養液中繁殖,表現出與預期nanP***一致之產物菌落。重組質體pBCSKnanP使用Qiaprep™ Spin Miniprep系統(Qiagen, Germantown, MD)進行純化。使用EcoR1切割,接著用T7連接酶連接,產生一個708bp的框內缺失,從而產生nanP的框內缺失(圖1)。SEQ ID NO: 7 為周圍的操縱子序列存在於 SEQ ID NO: 5 中的ΔnanP。ΔnanP之DNA序列如SEQ ID NO:3所示,ΔnanP之胺基酸序列如SEQ ID NO:4所示。未修飾之nanP DNA序列如SEQ ID NO:1所示,未修飾的胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示。 SEQ ID NO:19及20是ΔnanP圍繞序列缺失的位點的部分DNA及胺基酸之序列。
將帶有BamHI及SalI識別序列(包含在SEQ ID NO: 7中)之連接產物轉化為Invitrogen™ One Shot™ Top10化學勝任大腸桿菌(ThermoFischer Scientific, Waltham, MA),並在含有34微克氯黴素的哥倫比亞瓊脂培養皿上繁殖。質體pBC+ΔnanP按下文所述進行回收與純化,接著使用BamHI切割並與抗Tn903康黴素片段連接,產生質體pBC+ΔnanP+kan。多殺性巴斯德氏菌P1062(牛,血清組A:3)之基因替換突變體,是使用pCT109GA189的溫敏質體複製原點產生得之,如Briggs與Tatum(2005)所述。替代質體pTS+Kan+ΔnanP是藉由連接BssHII切割的質體pBC+ΔnanP+kan及pBC TSori(pBC含有來自pCT109GA189之溫度敏感複製原點)產生。替代質體pTS+Kan+ΔnanP之組成體如圖2所示。
接著,藉由一個逐步實驗程序,使用pTS+Kan+ΔnanP來產生多殺性巴斯德氏ΔnanP突變菌。首先,利用電穿孔技術,將替換質體pTS+Kan+ΔnanP放入多殺性巴斯德氏菌P-1062。在100毫升哥倫比亞培養液中,在37℃下輕輕搖動,將細胞培養至生長對數期,從而使細胞具有電穿孔勝任能力。藉由5000xG之離心力得到多殺性巴斯德氏菌沉澱物,並在0℃下用100ml 272mM蔗糖洗滌。將沉澱物懸浮在0℃等體積之272mM蔗糖中。將有勝任多殺性巴斯德氏菌(100微升)放入0.1釐米之比色管中,並與100奈克之替換質體DNA混合。在條件為電壓18000伏特/公分,電流800歐姆,時間常數介於11~12毫秒,進行細胞電穿孔(Gene Pulser, BioRad, Richmond, CA)。電穿孔後,立即將多殺性巴斯德氏菌細胞重新懸浮於0℃之1.0ml哥倫比亞培養液中。在30℃下恢復2小時。將懸浮液(100微升/板)塗抹到含有25微克/毫升康黴素之哥倫比亞瓊脂培養皿上。在篩選培養皿上出現轉化之多殺性巴斯德氏菌菌落,在條件溫度(30℃)下培養,進行自主質體複製。菌落在30℃篩選培養液(25微克/毫升康黴素)中各自擴增,接著將生長的菌落塗抹在篩選培養皿上,在40℃培養,其為自主溫敏性質體複製之非容許溫度。由於質體在此溫度下複製能力差,其必須整合進細菌染色體上才能生存,使細菌對康黴素產生抗性。主要是當細胞在高溫(40℃)下培養時,藉由同源重組的方式產生單次DNA交換之突變菌落。參見圖3。
將隨機選擇之推定單次交換之突變體菌落轉移到培養液中,不進行抗生素篩選,並在容許溫度(30℃)下培養,進行自主質體複製。在2毫升培養液中,在容許溫度(30℃)下進行三次連續繼代後,將一圈培養物塗抹至哥倫比亞血瓊脂培養皿上,並在37℃下培養。發現單次交換之突變體連續繼代後產生之大多數菌落沒有質體。在此步驟中,由染色體上含有的活性質體原點引起之不穩定性增加替換質體染色體上之分辨率,根據同源重組發生的位置,產生野生型或ΔnanP突變體子代。參見圖4。
接著,使用PCR技術來鑑定多殺性巴斯德氏菌ΔnanP缺失突變株,如圖5A所示。簡言之,nanP之特異性引子用以擴增預期表現ΔnanP之菌落DNA、ΔhyaCΔnanP之菌落DNA或野生型nanP之菌落DNA。在圖5A中,軌跡1與2是來自表現ΔnanP之菌落PCR產物,軌跡3與4是來自表現ΔhyaCΔnanP之菌落,軌跡5與6是來自表現野生型nanP之菌落。PCR分析顯示,篩選出擁有ΔnanP的菌落亦無抗Tn903康黴素片段及TS之複製起點。使用The QuantiChrom™ Sialic Acid Assay Kit (BioAssay Systems, Hayward, CA)對推定之多殺性巴斯德氏菌ΔnanP突變株進行唾液酸攝取評估,其等具有ΔnanP突變之菌落,與親代不同,其等無法從生長介質中攝取唾液酸。在親代多殺性巴斯德氏菌之培養物中,其對攝取遊離唾液酸的能力是快速且幾乎可完全攝取,而從突變株中沒有檢測到其有攝取唾液酸,結果顯示nanP基因產物對攝取遊離唾液酸而言是必要的。
實施例2:構建多殺性巴斯德氏菌(P1062) ΔhyaC
野生型hyaC之DNA序列如SEQ ID NO: 8所示,胺基酸序列如SEQ ID NO: 9所示。用於產生多殺性巴斯德氏菌P-1062中hyaC突變之ΔhyaC替換臂是藉由PCR合成而得,使用兩套引子(i)1062 Bam-hyaC-F(SEQ ID NO: 15)及1062 Pst-hyaC-R(SEQ ID NO: 16)及(ii)1062 Pst-hyaC-F(SEQ ID NO: 17) 及1062 Sal-hyaC-R(SEQ ID NO: 18)。參見表1,如上文所述。以5'臂引子對而言,引子1062 Bam-hyaC-F與SEQ ID NO: 10之41~64核苷酸結合,及引子1062 Pst-hyaC-R與SEQ ID NO: 10之1019~1035核苷酸結合。以3'臂引子對而言,引子1062 Pst-hyaC-F與SEQ ID NO: 10之1523~1540核苷酸結合,及引子1062 Sal-hyaC-R與SEQ ID NO: 10之2294~2314核苷酸結合。SEQ ID NO: 10包含野生型hyaC DNA序列及hyaC上游約786 bp及hyaC下游約544 bp。每一引子對都單獨與多殺性巴斯德氏菌之DNA雜交,並進行PCR以產生兩個擴增子,一個上游臂與一個下游臂。擴增子用QIAquick™核酸純化柱(Qiagen Inc., Valencia, CA)純化,並藉由Applied Biosystems 373型DNA測序儀(Iowa State University, Ames, IA的DNA設施)進行循環測序,使用螢光終止劑。純化後之上游臂擴增子使用BamH1及Pst I進行雙切割,及下游臂擴增子使用PstI及SalI進行雙切割。經過苯酚-氯仿萃取及乙醇沉澱,用T7 DNA連接酶將回收的擴增子依序***質體pBCSK(Stratagene Inc., LaJolla CA)之相應位點(BamH1及SalI),並在其PstI位點將擴增子之開口端連接起,產生pBC+ΔhyaC。突變之hyaC包含一個487 bp的缺失,及在兩個替換臂擴增子之交界處形成一識別PstI之位點。該缺失亦導致編碼序列之框移。SEQ ID NO: 12是ΔhyaC的核苷酸序列。當轉錄時,ΔhyaC編碼的非功能蛋白具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 6是ΔhyaC及周圍的核苷酸之DNA。SEQ ID NO:21及22是ΔhyaC中圍繞缺失位點的DNA及胺基酸序列。參見圖6。
將每一連接產物引入Invitrogen™ One Shot™ Top10化學勝任大腸桿菌(ThermoFischer Scientific, Waltham, MA)中,塗抹在含有34微克氯黴素之哥倫比亞血瓊脂上,並在37℃下培養過夜。藉由PCR分析評估菌落所需之產物,接著將擁有hyaC上游臂擴增子及下游臂擴增子之菌落在含有34微克氯黴素之哥倫比亞培養液中進行繁殖。重組質體pBC+ΔhyaC使用Qiaprep™ Spin Miniprep系統(Qiagen公司,Germantown, MD)進行純化,接著按照前述記載進行測序。
接著,使用BamHI切割pBC+ΔhyaC,用蝦鹼性磷酸酶(New England BioLabs Inc., Ipswich, MA)處理,苯酚氯仿萃取,並進行乙醇沉澱。將回收的BamHI切割之質體與同樣具有BamHI突出末端之Tn903抗康黴素性片段連接,產生pBC+ΔhyaC+kan。替代質體pTS+Kan+ΔhyaC,其用於產生多殺性巴斯德氏菌ΔhyaC突變株,其藉由連接BssHII切割質體pBC+ΔhyaC+kan及pBC TSori(pBCSK含有來自pCT109GA189之溫度敏感複製起點)構建而得。亦參見圖2。
使用pTS+Kan+ΔhyaC並藉由一個逐步實驗程序,產生多殺性巴斯德氏菌ΔhyaC突變體,該程序使用如前所述實施例1中所述之實驗準則。亦參見圖3及4。PCR分析用以鑑定圖5B中所示之多殺性巴斯德氏菌ΔhyaC缺失突變株。簡言之,使用hyaC之特異性引子用以擴增預期表現ΔhyaC之菌落DNA、ΔhyaCΔnanP之菌落DNA或野生型hyaC之菌落DNA。在圖5B中,軌跡1及2是來自表現野生型hyaC之菌落PCR產物,軌跡3及4是來自表現ΔhyaC之菌落,而軌跡5及6是來自表現ΔhyaCΔnanP之菌落。藉由PCR分析,篩選擁有ΔhyaC之菌落,亦證明其無抗Tn903康黴素片段及溫度敏感複製起點。多殺性巴斯德氏菌ΔhyaC菌落不產生莢膜,及在表型上與野生型親代差異很大。無莢膜突變株很容易從視覺上與野生型親代作區分,與親代不同的是,用白光觀察時,其等為非黏液及非虹彩的。
實施例3:構建多殺性巴斯德氏菌(P1062) ΔnanP ΔhyaC雙突變株
藉由將pTS+Kan+ΔhyaC轉化為上文所述之多殺性巴斯德氏菌 (P1062)ΔnanP突變株,使用上文所述之實驗準則,構建多殺性巴斯德氏菌(P1062)ΔnanP ΔhyaC雙突變株。構建多殺性巴斯德氏菌ΔnanPΔhyaC雙突變株之次序主要是因缺乏莢膜之ΔhyaC突變體在培養皿上之表型可被識別。
實施例4:ΔhyaC/nanP多殺性巴斯德氏菌疫苗在14日齡小牛鼻內注射之安全性評估
此研究之目的是評估兩種劑量水平的ΔhyaC/ΔnanP多殺性巴斯德氏菌(「PM」)對14日齡的小牛進行鼻內注射(一個鼻孔)時之安全性。 36頭雄性荷斯坦(Holstein)小牛被隨機分配到兩個治療組(T01和T02)或兩個NT組(NT1-NT2;無治療)之一。
T01以凍乾之ΔhyaC/ΔnanP PM形式提供,目標是:1 x 10
9CFU/劑量,實際上開始時為:1.1 x 10
9CFU/劑量,結束時為:1.1 x 10
9CFU/劑量。同樣地,T02以凍乾之ΔhyaC/nanP PM形式提供,目標是:1 x 10
5CFU/劑量,實際上開始時為:1.7 x 10
5CFU/劑量,結束時為:1.7 x 10
5CFU/劑量。動物被安置在獨立的圍欄裡,治療組T01及NT1安置在一起,T02及NT2安置在一起。T01及T02中各5頭小牛被分配到第3、7或14天進行屍體剖檢。所有NT動物都在第14天被安樂死。在第-2天收集直腸溫度,並在第-1至14天記錄兩種臨床觀察結果。在第-1、1~5、8、11及14天收集鼻腔拭子。在屍體剖檢時,對肺部的病變百分比進行評分,並從肺部、氣管、左耳及右耳內側收集拭子。亦收集關節液與支氣管肺泡灌洗液(BAL)樣本。
經由本研究,確定ΔhyaC/ΔnanP
多殺性巴斯德氏菌突變株在小牛體內鼻內給藥是安全的。無持續之臨床症狀,亦無從任何屍檢拭子中回收出多殺性巴斯德氏菌,此等均證明鼻內給藥的安全性。在此項研究中,沒有觀察到「下垂的耳朵」或陽性的耳部培養物,而此為先前測試分離物長期性的安全問題。 如下所示,在任何肺部或支氣管-肺泡灌洗(BAL)樣本中均無回收到多殺性巴斯德氏菌,參見表2及表3。
表2:肺部拭子培養物
肺部拭子 | 多殺性巴斯德氏菌 之出現率 | ||
治療處理編號 | 研究的天數 | (陽性 % ) | ( N ) |
NT1 | 14 | 0.0 | 3 |
NT2 | 14 | 0.0 | 3 |
T01 | 3 | 0.0 | 5 |
7 | 0.0 | 5 | |
14 | 0.0 | 5 | |
T02 | 3 | 0.0 | 5 |
7 | 0.0 | 5 | |
14 | 0.0 | 5 |
表3:支氣管-肺泡灌洗(BAL)培養物
BAL | 多殺性巴斯德氏菌 之出現率 | ||
治療處理編號 | 研究的天數 | (陽性 % ) | ( N ) |
NT1 | 14 | 0.0 | 3 |
NT2 | 14 | 0.0 | 3 |
T01 | 3 | 0.0 | 5 |
7 | 0.0 | 5 | |
14 | 0.0 | 5 | |
T02 | 3 | 0.0 | 5 |
7 | 0.0 | 5 | |
14 | 0.0 | 5 | |
T02 | 3 | 0.0 | 5 |
7 | 0.0 | 5 | |
14 | 0.0 | 5 |
實施例5:小牛皮下注射改良之多殺性巴斯德氏菌hyaC/nanP之傳播及棚舍擴散評估
本研究是根據獸醫服務備忘錄800.201(Veterinary Service Memorandum 800.201)進行,以證明改良之活化缺失突變株多殺性巴斯德氏菌主要病毒種(MSB)之鼻腔傳播,「在皮下給藥後,可能傳播給易感染的小牛」。 為了保存MSB,在本研究中準備一個額外多殺性巴斯德氏菌 1062途徑:hyaC/nanP MSB。
14頭五周大之荷斯坦公小牛,血清陰性,鼻腔內無多殺性巴斯德氏菌 菌落形成,其被隨機分配到治療組T01(n=7,皮下注射;多殺性巴斯德氏菌
hyaC/nanP),或NT1(n=7,無治療對照)。在研究期間,此等動物被混雜在一個生物安全2級的房間裡。在第-5天及第0天收集血樣,在第-5天和第0至21天收集鼻腔拭子與鼻咽拭子。在第-2至21天記錄直腸溫度與臨床觀察。
在研究期間,無從任何一個治療組之鼻腔或鼻咽拭子中分離出多殺性巴斯德氏菌。5隻T01及5隻NT1動物在第8至17天之間至少有一天溫度升高(≥104°F),1隻T01及1隻NT1動物在第2天溫度≥104°F。在研究期間,所有動物的鼻腔及耳朵下垂的評分均為正常。有極少數的小牛因態度溫和、咳嗽、跛行與呼吸困難而被記分。兩頭NT1小牛因態度溫和而被記分,一頭NT1小牛因輕微咳嗽與呼吸困難而被記分。在T01組別中,兩頭小牛因輕度或中度跛行而被記分,一頭T01小牛因輕度呼吸困難而被記分。接種後的小牛無因多殺性巴斯德氏菌 hyaC/nanP出現而被傳播,亦無擴散到未接種之接觸對照動物身上(例如參見表4與表5)。多殺性巴斯德氏菌
hyaC/nanP的安全性亦在5周大的小牛身上得到證明。
表4:多殺性巴斯德氏菌出現在鼻腔拭子
治療處理之編號 | 陽性 | 觀察總數 | |
編號 | % | 編號 | |
NT1 | 0 | 0.0 | 7 |
T01 | 0 | 0.0 | 7 |
表5:多殺性巴斯德氏菌出現在鼻咽拭子
治療處理之編號 | 陽性 | 觀察總數 | |
編號 | % | 編號 | |
NT1 | 0 | 0.0 | 7 |
T01 | 0 | 0.0 | 7 |
實施例6:小牛體內改良之多殺性巴斯德氏菌株hyaC/nanP之病毒回復性評估
如前所述,本發明之理想的實施例之一為在Bovishield Gold-One Shot®, Zoetis(牛鼻氣管炎-病毒性腹瀉-3型副流感-呼吸道合胞病毒疫苗,改良活病毒-溶血性曼氏菌類毒素)中添加改良之多殺性巴斯德氏菌ΔhyaC/ΔnanP缺失突變株。重組改良後之活多殺性巴斯德氏菌hyaC/nanP含有hyaC與nanP基因的缺失。獸醫生物製品中心(CVB)的獸醫服務備忘錄800.201要求進行毒性回復的研究,以評估新改良之活疫苗的安全性及穩定性。因此,本研究係為證明在易感染之小牛中連續逆繼代後,改良之多殺性巴斯德氏菌1062:ΔhyaC/ΔnanP細菌並無回復其毒性。
為評估多殺性巴斯德氏菌1062:ΔhyaC/ΔnanP主病毒種細菌+1(MSB+1)在易感染之小牛中之安全性,對其進行五次逆繼代。所有參加研究的動物均為五周大健康之荷斯坦小牛,鼻咽拭子對多殺性巴氏桿菌(多殺性巴斯德氏菌)檢測為陰性,及在第0天對多殺性巴氏桿菌外膜蛋白之抗體血清檢測為陰性(OMP,血清S/P比值<0.8)。在研究期間,小牛安置在獨立圍欄裡。於第-2至21天時,每天觀察動物之姿態、咳嗽、耳朵下垂、跛行、鼻腔分泌物及呼吸活動等臨床症狀,每天亦需記錄直腸溫度。在第-5天與第0天收集血清,在第-5天與第0至21天收集鼻咽拭子。在逆繼代#5時,對兩隻動物(一隻接種的動物與一隻未接種的動物作對照)持續進行臨床觀察及直腸測溫,直到第27天,並於第22天至第25天期間收集鼻咽拭子,以確定何時停止棚舍擴散。
在最初的逆繼代中,用2毫升濃度為2.56 x 10
9CFU/劑量之多殺性巴氏桿菌1062:ΔhyaC/ΔnanP MSB+1,對7頭小牛進行鼻內接種。三頭小牛作為未接種之對照組。在隨後的逆繼代(#2至#5)中,用前一逆繼代之集中鼻腔分泌物2毫升(每個鼻腔1毫升)對動物進行接種。7隻動物在逆繼代#2進行接種,2隻動物作為未接種之對照組。在逆繼代#3至5中接種10隻動物;及2至3隻動物作為未接種之對照動物。由於在對逆繼代#4進行PCR分析時發現唯一陽性樣本野生型多殺性巴斯德氏菌,故使用逆繼代#3中剩餘之鼻腔分泌物等分重複此逆繼代。之後藉由全基因組序列(WGS)確定野生型多殺性巴斯德氏菌是在PCR檢測中被用作陽性對照之疫苗親代株(多殺性巴斯德氏菌
1062),其之所以存在是因在PCR分析的菌落篩選過程中發生之實驗室污染。在每一逆繼代中,至少有一隻接種動物之鼻咽拭子呈多殺性巴斯德氏菌
1062: ΔhyaC/ΔnanP陽性。在逆繼代#1中,有4/7之接種動物之鼻咽拭子呈現陽性;在逆繼代#2中,有1/7之接種動物之鼻咽拭子呈現陽性;在逆繼代#3中,有6/10之接種動物之鼻咽拭子呈現陽性,在逆繼代#4(初次)、逆繼代#4(重複)及逆繼代#5有1/10動物之鼻咽拭子呈現陽性。多殺性巴斯德氏菌
1062:ΔhyaC/ΔnanP之接種量從最初逆繼代之2.56 x 10
9CFU/劑量下降到最後逆繼代之4.20 x 10
9CFU/劑量。
在研究期間,沒有在任何動物身上觀察到中度或嚴重之臨床症狀(得分=2或更高)。在所有的逆繼代中,至少有一頭小牛出現輕度異常臨床症狀(得分=1),體溫超過104.0°F;根據逆繼代的不同,未接種及/或接種的動物都受到影響。在被剝奪初乳的五周大小牛中觀察到的異常臨床症狀並不罕見。hyaC及nanP缺失之穩定性藉由PCR對每一逆繼代中每頭陽性小牛的第一天與最後一天之陽性多殺性巴斯德氏菌樣本菌落進行評估確認而得;所有陽性樣本皆被確認為疫苗菌株。具有異常臨床症狀和發燒之動物數量極少,及基因缺失的穩定性,證明多殺性巴斯德氏菌
1062:ΔhyaC/ΔnanP MSB+1之安全性,及多殺性巴斯德氏菌
1062:ΔhyaC/ΔnanP主病毒種無法恢復其毒性。
實施例7:評估小牛身上之ΔhyaC/ΔnanP多殺性巴斯德氏菌毒力回復之其他研究
此項研究係為證明根據獸醫服務備忘錄800.201及VICH指南41,在6~-7天大被剝奪初乳之小牛身上進行連續逆繼代後,改良之活ΔhyaC/ΔnanP多殺性巴斯德氏菌無回復其毒力。ΔhyaC/ΔnanP多殺性巴斯德氏菌Masterseed+1在易感染小牛中共進行四次逆繼代,評估其安全性。所有參加研究之動物均為6~7天大之被剝奪初乳的荷斯坦小牛,其等對多殺性巴斯德氏菌外膜蛋白(OMP)血清呈陰性,鼻腔分泌物中對多殺性巴斯德氏菌呈陰性。在研究期間,小牛被安置在獨立之圍欄裡。觀察動物的姿態、鼻腔分泌物、呼吸活動、跛行、咳嗽及耳朵下垂等臨床症狀,並從第-4天到第21天的每一逆繼代中收集直腸溫度。在第-5天及第0天收集血清,在第-5天及第0至21天收集鼻咽拭子,並對多殺性巴斯德氏菌進行定量計數。藉由PCR技術確認分離出任何多殺性巴斯德氏菌中存在之ΔhyaC/ΔnanP基因缺失。
在最初的逆繼代中,7頭小牛在一個鼻孔內接種2毫升之ΔhyaC/ΔnanP 多殺性巴斯德氏菌,其濃度為2.4 x 10
9至2.6 x 10
9CFU/劑量(分別於接種開始與結束進行計數)。後續的逆繼代接種2毫升來自前一逆繼代之集中鼻腔分泌物。在#1、#3及#4逆繼代對7隻動物進行接種;在#2逆繼代對10隻動物進行接種。每一逆繼代有三隻動物作為未接種之對照組。在#4逆繼代,兩隻接種小牛(T04)在接種後被發現有態度溫和及耳朵下垂。動物5460在第4天評分為態度溫和,在第5~7天及第9~11天評分為耳朵下垂,動物5463在第9、10、11天評分為態度溫和,在第11天評分為耳朵下垂。先前對其他鼻內給藥之候選多殺性巴斯德氏菌疫苗之安全性研究顯示,由於疫苗菌株在內/中耳道移植之能力,耳朵下垂可能表示其可能存在之安全問題。在所屬領域中,生產者亦認為耳朵下垂是不佳的。此兩隻動物在第11天被安樂死及解剖,隨後從這兩隻動物中的一隻(5463)身上取下之左內耳拭子之細菌培養,結果發現其含有多殺性巴斯德氏菌。自內耳分離出之多殺性巴斯德氏菌藉由PCR證實為ΔhyaC/ΔnanP疫苗菌株。由於此潛在之安全問題,本發明之疫苗理想為用於除鼻內注射疫苗以外之給藥途徑。
實施例8:ΔhyaC/nanP多殺性巴斯德氏菌疫苗在幼小牛群中鼻內注射之效果評估
此研究之目的係為確認兩劑凍乾之發酵劑培養疫苗抗原ΔhyaC/ΔnanP多殺性巴斯德氏菌在對約14日齡之小牛進行鼻內注射時之效果。
荷斯坦公牛小牛被隨機分配到以下治療處理組之一中:
T01(鹽水,鼻內注射,n=13);
T02 (ΔhyaC/ΔnanP 多殺性巴斯德氏菌,疫苗接種前:1.13 x 10
9CFU/劑量;疫苗接種後:1.14 x 10
9CFU/劑量,鼻內注射,n=20);
T03 (ΔhyaC/ΔnanP 多殺性巴斯德氏菌,疫苗接種前:0.87 x 10
9CFU/劑量;疫苗接種後:0.80 x 10
9CFU/劑量,皮下注射,n=20);
T04 (ΔyiaO 多殺性巴斯德氏菌 於1 x 10
9CFU/劑量,皮下注射,n=13);(yiaO與nanP是同一個基因,惟在此種情況下只刪除一個)。
小牛在第0天接種其指定之治療處理。在T01~T04組的第29~36天收集所有小牛之臨床觀察和直腸溫度。T01~T04組在第30天受到挑戰,並在第36天被人道安樂死及屍體剖檢。在屍體剖檢時,收集肺部拭子,並對肺部有病變處百分比進行評分。
與鹽水對照組(T01)相比,所有接種組(T02、T03及T04)的死亡率都明顯降低。鼻內接種組(T02)為接種ΔhyaC/ΔnanP多殺性巴斯德氏菌疫苗之兩組中死亡率下降幅度最大。雖然相較T02、T03及T04組,T01組之肺部病變數量較少,但各治療組間之病變差異無統計上意義。此等結果表明,死亡率可能是衡量該模型/疫苗療效之首選指標。已證實分離物之安全性,因在接種後只觀察到輕微與零星之臨床症狀。
實施例9:荷斯坦小牛體內多殺性巴斯德氏菌之挑戰模型評估
本研究之目的係為評估5周齡皮下注射(「SQ」)疫苗之小牛的多殺性巴斯德氏菌(50940菌株)兩種挑戰劑量及兩種挑戰方法之嚴重性及一致性。
64隻約5周大的荷斯坦公牛小牛被隨機分配至(見表6)以下治療處理組之一中進行研究:T01(鹽水,SQ,n=8);T02(0.8 ± 0.14 x 10
9CFU/劑量多殺性巴斯德氏菌ΔhyaC/ΔnanP,SQ,n=8);T03(鹽水,SQ,n=8);T04(0. 8 ± 0.14 x 10
9CFU/劑量多殺性巴斯德氏菌 ΔhyaC/ΔnanP,SQ,n=8);T05(鹽水,SQ,n=8);T06(0. 8 ± 0.14 x 10
9CFU/劑量多殺性巴斯德氏菌 ΔhyaC/ΔnanP,SQ,n=8);T07(鹽水,SQ,n=8);T08(0.8 ± 0.14 x 10
9CFU/劑量多殺性巴斯德氏菌
ΔhyaC/ΔnanP,SQ,n=8)。小牛在第0天接受指定治療處理之疫苗。在第-1天、第20天及第27天對所有小牛進行採血。在第-1天、第1~3天、第7天及第20天對所有小牛進行注射部位反應、臨床觀察及直腸溫度之記錄收集。此外,在第0天及第22~27天對所有小牛進行臨床觀察及直腸溫度之記錄收集。
T01~T08組在第21天藉由經氣管挑戰法受到挑戰。T01~T02組在該過程中是躺著的,並施用6.7 x 10
8CFU/劑量的多殺性巴斯德氏菌
50940菌株。T03~T04組在該過程中站立,並施用6.7 x 10
8CFU/劑量的多殺性巴斯德氏菌
50940菌株。T05~T06組在該過程躺著,並施用5.6 x 10
9CFU/劑量的多殺性巴斯德氏菌
50940菌株。T07~T08組在該過程中站立,並施用5.6 x 10
9CFU/劑量的多殺性巴斯德氏菌
50940菌株。小牛在第27天被人道安樂死及屍體剖檢。在屍體剖檢時,收集肺拭子,並對有病變的肺部百分比進行評分。
相較T03對照組,T04接種組之肺部病變明顯減少。其他治療處理間(T01與T02、T05與T06、T07與T08)均無明顯肺部病變的差異。相較其各自之對照組,任何一個接種組之死亡率均無明顯下降。此項研究結果表明,在5周大之小牛中,肺部病變可能是比死亡率為更好之療效指標。此外,本研究之數據亦表明,站立式挑戰方式(挑戰濃度約為6.7 x 10
8CFU/劑量)可對5周大的小牛產生最好之挑戰結果。
表6:研究設計
〔肺部病變結果〕
治療處理組 | 動物數量 | 處理條件 * | 挑戰方法 | 挑戰劑量 |
T01 | 8 | 鹽水 | 躺著 | 開始:6.7 x 10 8CFU/劑量 結束:7.1 x 10 8CFU/劑量 |
T02 | 8 | 0.8 ± 0.14 x 10 9CFU/劑量 多殺性巴斯德氏菌 ΔhyaC/ΔnanP | ||
T03 | 8 | 鹽水 | 站立 | |
T04 | 8 | 0.8 ± 0.14 x 10 9CFU/劑量 多殺性巴斯德氏菌 ΔhyaC/ΔnanP | ||
T05 | 8 | 鹽水 | 躺著 | Start: 5.6 x 10 9CFU/劑量 End: 6.4 x 10 9CFU/劑量 |
T06 | 8 | 0.8 ± 0.14 x 10 9CFU/劑量 多殺性巴斯德氏菌 ΔhyaC/ΔnanP | ||
T07 | 8 | Saline | 站立 | |
T08 | 8 | 0.8 ± 0.14 x 10 9CFU/劑量 多殺性巴斯德氏菌 ΔhyaC/ΔnanP |
T01~T08組之肺部病變如表7所示。在T01與T02、T05與T06、T07與T08組中,肺部病變無明顯減少;然而,對於T03與T04,肺部病變有顯著減少(P≤0.10;表8)。此外,T03與T04比較之減輕分率為0.63,90%之信賴區間為0.188、1.000。其他治療組間比較之90%下限均無大於零(表9)。
表7:肺部病變結果
治療處理編號 | 肺部病變 之逆轉換 LS 平均 % | 肺部病變之 標準誤差 % | 低於 90% 平均信賴界線 | 高於 90% 平均信賴界線 | 肺部病變 之範圍 % |
T01 | 30 | 7 | 18 | 43 | 14至73 |
T02 | 18 | 4 | 12 | 25 | 10至29 |
T03 | 32 | 5 | 25 | 40 | 15至71 |
T04 | 18 | 4 | 12 | 25 | 6至33 |
T05 | 38 | 5 | 31 | 46 | 18至58 |
T06 | 32 | 7 | 19 | 45 | 11至69 |
T07 | 45 | 5 | 37 | 53 | 28至67 |
T08 | 39 | 5 | 31 | 47 | 25至57 |
表8:肺部病變對比之最小平方法平均數之P值
對比組別 | P 值 |
T01 對 T02 | 0.1439 |
T03 對 T04 | 0.0234 |
T05 對 T06 | 0.4651 |
T07 對 T08 | 0.4015 |
表9:肺部病變之減輕分率(MF)估計值
對比組別 | MF 估計值 | 90% Bootstrap 下限 | 90% Bootstrap 上限 |
T01 對 T02 | 0.38 | -0.125 | 0.813 |
T03 對 T04 | 0.63 | 0.188 | 1.000 |
T05 對 T06 | 0.25 | -0.313 | 0.750 |
T07 對 T08 | 0.25 | -0.250 | 0.750 |
實施例10: IBR-BVD-PI3-BRSV-MH-PM組合疫苗之不同劑量之多殺性巴斯德氏菌分率對年輕小牛之療效
本研究之目的係為比較IBR-BVD-PI3-BRSV-MH-PM組合疫苗中不同劑量之多殺性巴斯德氏菌分率對年輕小牛的功效。
137頭被剝奪初乳之荷斯坦公牛小牛參與此研究。在第-8天,預先挑戰組(NT1至NT4)進行皮下注射2毫升指定之(參見表10)治療疫苗:IBR-BVD-PI3-BRSV-MH(NT1/NT3)或IBR-BVD-PI3-BRSV-MH-PM(NT2/NT4;2.41 x 10
9CFU/劑量多殺性巴斯德氏菌)。在第0天,治療組T01至T05進行皮下注射以下其中一種疫苗:T01(IBR-BVD-PI3-BRSV-MH,n = 24),T02(IBR-BVD-PI3-BRSV-MH,n = 23,8.27 x 10
5CFU/劑量多殺性巴斯德氏菌),T03(IBR-BVD-PI3-BRSV-MH,n = 23,8.30 x 10
6CFU/劑量多殺性巴斯德氏菌),T04(IBR-BVD-PI3-BRSV-MH,n = 24,1 x 10
8CFU/劑量多殺性巴斯德氏菌)或T05(IBR-BVD-PI3-BRSV-MH,n = 24,1.51 x 10
9CFU/劑量
多殺性巴斯德氏菌)。在接種疫苗前一天、接種後三天、約第7天及挑戰前一天收集注射部位反應。在第-2天、第21天及第28天(NT組為第-9天、第13天及第20天),及在挑戰階段安樂死前收集動物血液。在第-1、0及1~3天(NT組為第-9、-8及-7至-4)及第21至28天(NT組為13至20)記錄臨床觀察及直腸溫度。在第22天(NT組為14天),動物接受經氣管以毒性異種多殺性巴斯德氏菌株之挑戰。挑戰結束後,對任何被安樂死或在屍體剖檢日之前死亡之動物進行肺部病變百分比評分,並收集肺部拭子。在第28天(NT組為20天),所有剩餘之動物均被人道安樂死、對其肺部病變進行評分,並收集其肺部拭子。
此研究被認為是有效的,因均符合所有測試標準及結果標準。 相較於T01對照組,T03及T05治療組之死亡率明顯降低;任何治療處理組間之肺部病變均無差異。由於觀察到在T01及T05組中疫苗接種後立即出現過敏反應,因而發現一個潛在安全問題。此等反應從輕度(無需治療即可恢復)到嚴重(死亡)不等。 對疫苗LPS含量進行測試,所有疫苗LPS含量都在BoviShield GOLD One-Shot產品之生產許可範圍內(4X41.20;上限為42微克/劑量)。此研究證實,當使用IBR-BVD-PI3-BRSV-MH分率之全部組合劑量時,低至1 x 10
7CFU/劑量之多殺性巴斯德氏菌即可達到療效。 死亡率數據參見表11,肺部病變數據參見表12。
表10:研究設計
注1* NT1-NT4組在第-8天接種疫苗;T01~T05組在第0天接種疫苗。
注2**在此提及之計數分別來自疫苗接種與挑戰結束時。
治療處理編號 | N | 治療處理條件 | 多殺性巴斯德氏菌 CFU/ 劑量 ** | 挑戰 | 挑戰之 天數 |
T01 | 24 | IBR-BVD-PI3-BRSV-MH | N/A | 多殺性巴斯德氏菌 (6.5 x 10^9 CFU/ 劑量) | 22 |
T02 | 23 | IBR-BVD-PI3-BRSV-MH-PM | 8.27 x 10^5 | ||
T03 | 23 | IBR-BVD-PI3-BRSV-MH-PM | 8.30 x 10^6 | ||
T04 | 24 | IBR-BVD-PI3-BRSV-MH-PM | 1.00 x 10^8 | ||
T05 | 24 | IBR-BVD-PI3-BRSV-MH-PM | 1.51 x 10^9 | ||
NT1* | 5 | IBR-BVD-PI3-BRSV-MH | N/A | 多殺性巴斯德氏菌 (6.5 x 10^9 CFU/ 劑量) | 14 |
NT2* | 5 | IBR-BVD-PI3-BRSV-MH-PM | 2.41 x 10^9 | ||
NT3* | 4 | IBR-BVD-PI3-BRSV-MH | N/A | 多殺性巴斯德氏菌 (6.0 x 10^8 CFU/ 劑量) | |
NT4* | 5 | IBR-BVD-PI3-BRSV-MH-PM | 2.41 x 10^9 |
表11A:挑戰後之死亡率/安樂死率
治療處理組 | 死亡率/安樂死率 | |
數量 | % | |
T01 | 11 / 24 | 45.8 |
T02 | 10 / 22 | 45.5 |
T03 | 3 / 23 | 13.0 |
T04 | 6 / 23 | 26.1 |
T05 | 4 / 22 | 18.2 |
表11B:死亡率對照比較
對照組別 | P值 |
T01 對 T02 | 1.0000 |
T01 對 T03 | 0.0243* |
T01 對 T04 | 0.2270 |
T01 對 T05 | 0.0625* |
表11C:死亡率之預防分率(PF)估計值
對照組別 | PF 估計值 | 90% 確切下限 | 90% 確切上限 |
T01 對 T02 | 1. 0.8 | 2. -75.1 | 3. 46.7 |
T01 對 T03 | 4. 71.5 | 5. 29.4 | 6. 93.7 |
T01 對 T04 | 7. 43.1 | 8. -13.1 | 9. 77.2 |
T01 對 . T05 | 10. 60.3 | 11. 11.9 | 12. 85.9 |
前挑戰組(NT1~NT4)之肺部病變如表12所示,T01~T05之肺部病變如表13所示。藉由P值(P≤0.10;表7)或減輕分率(表14)分析,與對照組(表6)相比,各治療處理組之肺部病變均無明顯減少。
表12:NT1~NT4之肺部病變
治療處理組 | 動物數量 | 肺部病變 之逆轉換 LS 平均% | 肺部病變之範圍% |
NT1 | 5 | 39 | 26 至 62 |
NT2 | 5 | 24 | 6 至 46 |
NT3 | 3 | 31 | 24 至 43 |
NT4 | 5 | 15 | 10 至 21 |
表13:T01~T05之肺部病變
治療處理組 | 動物數量 | 肺部病變之逆轉換 LS 平均% | 低於90% 平均信賴界線 | 高於90% 平均信賴界線 | 肺部病變之範圍% |
T01 | 24 | 37 | 31 | 42 | 10 至 71 |
T02 | 22 | 39 | 33 | 45 | 15 至 81 |
T03 | 23 | 31 | 25 | 36 | 4 至 54 |
T04 | 23 | 31 | 26 | 37 | 9 至 69 |
T05 | 22 | 33 | 28 | 39 | 3 至 83 |
表14:肺部病變對照之P值
對照組別 | P值 |
T01 對 T02 | 0.6535 |
T01 對 T03 | 0.215 |
T01 對 T04 | 0.2965 |
T01 對 T05 | 0.5051 |
實施例11:小牛體內多殺性巴斯德氏菌ΔhyaC/ΔnanP之不同下游處理之安全性評估
本研究之目的係為評估不同下游處理方法之安全性,以用於製備多殺性巴斯德氏菌ΔhyaC/ΔnanP之活菌抗原,例如用於兩個月大之小牛。應注意的是,若無其他的配方步驟,混合多殺性巴斯德氏菌/溶血性曼氏菌(
Mannheimia haemolytica)組成物之LPS(細菌脂多醣)及內毒素負擔可能太高。根據多殺性巴斯德氏菌分率之具體處理方法,將45隻約兩個月大之荷斯坦公牛小牛隨機分配到六個處理治療組中的其中一組中(表15)。
表15:基於治療過程之治療處理組
治療處理編號 | #動物 | 處理條件 | 多殺性巴斯德氏菌 (CFU /劑量) | M. haemolytica ( RP /劑量 ) |
T01 | 8 | MH – PM (目前PM DSP處理方法) | 6.95 x 10^9 | 34.2 |
T02 | 9 | PM 單價 (離心/洗滌處理方法) | 4.56 x 10^9 | N/A |
T03 | 9 | PM單價 (透析/洗滌處理方法) | 3.85 x 10^9 | N/A |
T04 | 9 | MH – PM (離心/洗滌處理方法) | 5.32 x 10^9 | 33.4 |
T05 | 9 | MH – PM (透析/洗滌處理方法) | 5.43 x 10^9 | 34.6 |
NTX | 1 | N/A | N/A | N/A |
動物(除NTX動物外)在第0天用7毫升指定之治療處理藥物進行皮下接種,分成兩個3.5毫升劑量在頸部兩側注射。觀察動物在接種後30分鐘及2~4小時之不良反應。在第1天至第14天收集每日注射部位反應、臨床觀察及直腸溫度。T03組(透析/洗滌處理方法;PM單價)是唯一沒有觀察到接種後反應之治療處理組。T02組(離心/洗滌處理方法,PM單價)在接種後30分鐘觀察到只有一個不良反應(1 / 9);在使用***(dexmethasone)治療後,該動物在2~4小時檢查時恢復正常。T02及T03組的動物在第1天到第14天皆被標記為正常。T01、T04及T05組皆有至少兩隻動物在第0天出現接種後的反應,且至少有一隻動物在第1~14天出現臨床症狀。本研究結果顯示,目前對於改良ΔhyaC/ΔnanP 多殺性巴斯德氏菌活疫苗而言,理想為使用透析/洗滌處理方法,該處理方法的操作方式如下。
使用0.2um中空纖維過濾器(GE Healthcare Hollow Fiber Part #CFP-2-E-A)將多殺性巴斯德氏菌培養物濃縮至約10~15倍,並用4.5~7倍之連續流0.063% PBS Lepto Saline緩衝液(約8.5g/L氯化鈉、約0.55g/L二鹽基無水磷酸鈉及約0.08g/L單鹽基無水磷酸鉀)進行透析。用標準的細菌平板培養方法檢查最終洗淨培養物之存活率,並將其冷凍。
簡單說明多核苷酸及多肽序列。
表A中列出本發明提供的各種多核苷酸與多肽序列,及其各自分配到之序列識別碼。
表A:多核苷酸與多肽
識別碼 | 物質 |
SEQ ID NO: 1 | 野生型(未改良) nanP核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 2 | 野生型(未改良) nanP胺基酸序列 |
SEQ ID NO: 3 | ΔnanP核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 4 | ΔnanP胺基酸序列 |
SEQ ID NO: 5 | 由 SEQ ID NO:13與SEQ ID NO:14 之引子擴增片段中包含的多核苷酸 |
SEQ ID NO: 6 | ΔhyaC與附近的操縱子之核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 7 | ΔnanP與附近的操縱子之核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 8 | 野生型(未改良) hyaC核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 9 | 野生型(未改良) hyaC胺基酸序列 |
SEQ ID NO: 10 | 野生型hyaC與附近的操縱子之核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 11 | ΔhyaC胺基酸序列 |
SEQ ID NO: 12 | ΔhyaC核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 13 | 引子1062 Bam-nanP-F核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 14 | 引子1062 Sal-nanP-R核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 15 | 引子1062 Bam-hyaC-F核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 16 | 引子1062 Pst-hyaC-R核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 17 | 引子1062 Pst-hyaC-F核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 18 | 引子1062 Sal-hyaC-R核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 19 | ΔnanP 缺失位點附近的核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 20 | ΔnanP 缺失位點附近的胺基酸序列 |
SEQ ID NO: 21 | ΔhyaC缺失位點附近的核苷酸序列 |
SEQ ID NO: 22 | ΔhyaC缺失位點附近的胺基酸序列 |
無
〔圖1〕表示多殺性巴斯德氏菌中ΔnanP突變的一般構造。
〔圖2〕表示替換質體的一般構造包含溫度敏感之複製起點及多殺性巴斯德氏菌中的ΔnanP突變或ΔhyaC突變。
〔圖3〕表示替換質體整合進多殺性巴斯德氏菌的基因組中。
〔圖4〕表示從多殺性巴斯德氏菌的基因組中移除替換質體。
〔圖5〕5A表示以凝膠確認ΔnanP突變確實存在,軌跡1及2:ΔnanP多殺性巴斯德氏菌擴增產物、軌跡3及4:ΔnanPΔhyaC多殺性巴斯德氏菌擴增產物、軌跡5及6:野生型多殺性巴斯德氏菌1062擴增產物。5B表示以凝膠確認ΔhyaC突變確實存在,軌跡1及2:野生型多殺性巴斯德氏菌1062擴增產物、軌跡3及4:ΔhyaC多殺性巴斯德氏菌擴增產物、軌跡5及6:ΔnanPΔhyaC多殺性巴斯德氏菌擴增產物。
〔圖6〕表示多殺巴斯德氏菌中ΔhyaC突變的一般構造。
序列表 <![CDATA[<110> Briggs, Robert]]> Tatum, Fred <![CDATA[<120> 新型多殺性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)株及具有hyaC與nanP缺失之疫苗]]> <![CDATA[<130> 0041.18]]> <![CDATA[<140> 110134100]]> <![CDATA[<141> 2021-09-13]]> <![CDATA[<150> US 63085495]]> <![CDATA[<151> 2020-09-30]]> <![CDATA[<160> 22 ]]> <![CDATA[<170> PatentIn version 3.5]]> <![CDATA[<210> 1]]> <![CDATA[<211> 984]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> Pasteurella multocida]]> <![CDATA[<400> 1]]> atgaaattta aaaaactact acttgcatct ttatgtttag gtgtttcagc ttctgtattt 60 gcagcagatt acgatcttaa attcggtatg gttgcgggtc caagctcaaa cgaatataaa 120 gcagtagaat tctttgcgaa agaagtgaaa gaaaaatcca atggcaaaat tgatgtggct 180 attttcccta gctcacagtt aggtgatgac cgtgtgatga ttaaacaatt aaaagacggt 240 gcattagact ttacgttagg tgaatcagca cgtttccaaa tttacttccc agaagcagaa 300 gtatttgcgt tgccttatat gattcctaat tttgaaacct ctaaaaaagc gttgctcgac 360 acaaaatttg gtcaaggttt attgaaaaaa attgataaag agttaaacgt acaagtgtta 420 tctgtggcgt ataacggtac acgtcaaaca acttctaacc gtgcaatcaa cagcattgaa 480 gacatgaaag ggttaaaatt acgtgtacct aacgcggcaa ccaaccttgc ttatgcaaaa 540 tacgtgggtg cagcgccaac accaatggca ttctctgaag tttaccttgc gcttcaaaca 600 aactctgtgg atggtcaaga aaacccatta ccgacaatcc aagcacaaaa attctatgaa 660 gtacaaaaat acttagcgtt aactaaccac atcttaaatg accaacttta cttaatcagt 720 aacgatacgt tggcagattt accagaagat ttacaaaaag tggttaaaga tgcagcagcg 780 aaagccgctg aatatcacac taaactcttc gttgacggtg agaacagctt agttgaattc 840 ttcaaaagtc aaggtgtgac agtcacacaa ccagacttaa aaccatttaa agcagcactt 900 acaccatact atgatgaata tctcaagaaa aatggtgaag tcggtaaaat ggcgattgaa 960 gaaatttcta atctcgctaa ataa 984 <![CDATA[<210> 2]]> <![CDATA[<211> 327]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> Pasteurella multocida]]> <![CDATA[<400> 2]]> Met Lys Phe Lys Lys Leu Leu Leu Ala Ser Leu Cys Leu Gly Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser Val Phe Ala Ala Asp Tyr Asp Leu Lys Phe Gly Met Val Ala 20 25 30 Gly Pro Ser Ser Asn Glu Tyr Lys Ala Val Glu Phe Phe Ala Lys Glu 35 40 45 Val Lys Glu Lys Ser Asn Gly Lys Ile Asp Val Ala Ile Phe Pro Ser 50 55 60 Ser Gln Leu Gly Asp Asp Arg Val Met Ile Lys Gln Leu Lys Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Asp Phe Thr Leu Gly Glu Ser Ala Arg Phe Gln Ile Tyr Phe 85 90 95 Pro Glu Ala Glu Val Phe Ala Leu Pro Tyr Met Ile Pro Asn Phe Glu 100 105 110 Thr Ser Lys Lys Ala Leu Leu Asp Thr Lys Phe Gly Gln Gly Leu Leu 115 120 125 Lys Lys Ile Asp Lys Glu Leu Asn Val Gln Val Leu Ser Val Ala Tyr 130 135 140 Asn Gly Thr Arg Gln Thr Thr Ser Asn Arg Ala Ile Asn Ser Ile Glu 145 150 155 160 Asp Met Lys Gly Leu Lys Leu Arg Val Pro Asn Ala Ala Thr Asn Leu 165 170 175 Ala Tyr Ala Lys Tyr Val Gly Ala Ala Pro Thr Pro Met Ala Phe Ser 180 185 190 Glu Val Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asn Ser Val Asp Gly Gln Glu Asn 195 200 205 Pro Leu Pro Thr Ile Gln Ala Gln Lys Phe Tyr Glu Val Gln Lys Tyr 210 215 220 Leu Ala Leu Thr Asn His Ile Leu Asn Asp Gln Leu Tyr Leu Ile Ser 225 230 235 240 Asn Asp Thr Leu Ala Asp Leu Pro Glu Asp Leu Gln Lys Val Val Lys 245 250 255 Asp Ala Ala Ala Lys Ala Ala Glu Tyr His Thr Lys Leu Phe Val Asp 260 265 270 Gly Glu Asn Ser Leu Val Glu Phe Phe Lys Ser Gln Gly Val Thr Val 275 280 285 Thr Gln Pro Asp Leu Lys Pro Phe Lys Ala Ala Leu Thr Pro Tyr Tyr 290 295 300 Asp Glu Tyr Leu Lys Lys Asn Gly Glu Val Gly Lys Met Ala Ile Glu 305 310 315 320 Glu Ile Ser Asn Leu Ala Lys 325 <![CDATA[<210> 3]]> <![CDATA[<211> 276]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 化學合成]]> <![CDATA[<400> 3]]> atgaaattta aaaaactact acttgcatct ttatgtttag gtgtttcagc ttctgtattt 60 gcagcagatt acgatcttaa attcggtatg gttgcgggtc caagctcaaa cgaatataaa 120 gcagtagaat tcttcaaaag tcaaggtgtg acagtcacac aaccagactt aaaaccattt 180 aaagcagcac ttacaccata ctatgatgaa tatctcaaga aaaatggtga agtcggtaaa 240 atggcgattg aagaaatttc taatctcgct aaataa 276 <![CDATA[<210> 4]]> <![CDATA[<211> 90]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 化學合成]]> <![CDATA[<400> 4]]> Met Lys Phe Lys Lys Leu Leu Leu Ala Ser Leu Cys Leu Gly Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser Val Phe Ala Ala Asp Tyr Asp Leu Lys Phe Gly Met Val Ala 20 25 30 Gly Pro Ser Ser Asn Glu Tyr Lys Ala Val Glu Phe Lys Ser Gln Gly 35 40 45 Val Thr Val Thr Gln Pro Asp Leu Lys Pro Phe Lys Ala Ala Leu Thr 50 55 60 Pro Tyr Tyr Asp Glu Tyr Leu Lys Lys Asn Gly Glu Val Gly Lys Met 65 70 75 80 Ala Ile Glu Glu Ile Ser Asn Leu Ala Lys 85 90 <![CDATA[<210> 5]]> <![CDATA[<211> 2852]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 化學合成]]> <![CDATA[<400> 5]]> gcggatgtga tagttttgac atattaactc cagtctaaat ttatcaaaag aagattgact 60 ccaatttgca taggttaatc ttagaattaa aaaataacaa ccaaaataat aaaaatttga 120 gatctttgtc gcatatttat tcatagggaa tagacagctt aattttagtt atgatttgtc 180 aatccttgct attttttgtg tttgctggtt tgcgatacac tgttctaata ttgctttgag 240 cacttgataa ccttgctcat taaaatgtaa tccgtcggta caaaggcgta aatccagttc 300 accgttagaa tcacaaaagt atttttgtgt ttcaacgtaa gtcacgtctg acggacaatg 360 ttgttttaaa taggtattga gcctgtgaat ttgtgcgtta gtgaccgtat taatctgatt 420 gaccggtgtg gcttctaata aaaagtagtg ggacgtagga gaaatggtgt gtaggtgagt 480 cagaatgtca tttaactatc gcatgacttg cgccggtgaa tacgtttctt ccttacaaat 540 atcattgacg cctaaaaaaa gaaaaacaga ttgtccaagt tgttgaatcc gtttaggttt 600 aacgataaca tccaaatatt gtcgcgtact gacgccagaa agtcctaaat tggcgacggt 660 ttgtcccgct aattgaggtg tgcctgctac ctgttcgtcc cacatgtcaa aaagtgaatg 720 accaattaag ctgatattgg caggtttgga aaattccgcc attttgctct gatagcgttg 780 ataaatatcc tgatcactta gcatgtgtgg acctctattt tgaaataaaa cgctaagtat 840 tatataaaac ctgatatgcc ggtaaacagt aaacttatct tccgtagggg taaatattca 900 attttgtgac gaacctatca tttatgaaat aaaacttcat tttctatata aaaaatagtt 960 ttttcacttt agaatgccaa acgtgtgaaa tttatttcat catcatttta acgtaatccc 1020 aacgtaacca atagaggaga actcataatg aaatttaaaa aactactact tgcatcttta 1080 tgtttaggtg tttcagcttc tgtatttgca gcagattacg atcttaaatt cggtatggtt 1140 gcgggtccaa gctcaaacga atataaagca gtagaattct ttgcgaaaga agtgaaagaa 1200 aaatccaatg gcaaaattga tgtggctatt ttccctagct cacagttagg tgatgaccgt 1260 gtgatgatta aacaattaaa agacggtgca ttagacttta cgttaggtga atcagcacgt 1320 ttccaaattt acttcccaga agcagaagta tttgcgttgc cttatatgat tcctaatttt 1380 gaaacctcta aaaaagcgtt gctcgacaca aaatttggtc aaggtttatt gaaaaaaatt 1440 gataaagagt taaacgtaca agtgttatct gtggcgtata acggtacacg tcaaacaact 1500 tctaaccgtg caatcaacag cattgaagac atgaaagggt taaaattacg tgtacctaac 1560 gcggcaacca accttgctta tgcaaaatac gtgggtgcag cgccaacacc aatggcattc 1620 tctgaagttt accttgcgct tcaaacaaac tctgtggatg gtcaagaaaa cccattaccg 1680 acaatccaag cacaaaaatt ctatgaagta caaaaatact tagcgttaac taaccacatc 1740 ttaaatgacc aactttactt aatcagtaac gatacgttgg cagatttacc agaagattta 1800 caaaaagtgg ttaaagatgc agcagcgaaa gccgctgaat atcacactaa actcttcgtt 1860 gacggtgaga acagcttagt tgaattcttc aaaagtcaag gtgtgacagt cacacaacca 1920 gacttaaaac catttaaagc agcacttaca ccatactatg atgaatatct caagaaaaat 1980 ggtgaagtcg gtaaaatggc gattgaagaa atttctaatc tcgctaaata aatatagtaa 2040 ccttatccct gcgccttaag ggataaggtt cctttttatt gggttgtctt gaggtatcta 2100 tgaaaataat aaataaatta gaagagtgga ttggcggtgt gctattcatt ggaattttct 2160 taattctgtt agcacaaatc attgctcgtc aagtgtttca gtcaccgttt atttggagtg 2220 aagaactcgc aagattgcta tttatctatg tcgggctact tggtatcagc atgggtatcc 2280 gtagtcagca gcatgtttat attgattttt taactaactt tatgcccgag aaagtgagaa 2340 aggtgacaaa ctcctttgtt caagttctca tctttatttc catcattatt ttcattcatt 2400 taggctttaa agtttggatc gactccagtt ttaaaatgga agcgttaact gctttcgctt 2460 cagatttaat tgggcgcgag acgattgtgc ctgaaaaatg gatgtatgcg gcattgcctt 2520 ttatttcttg tttaatgtta ttccgctttt tccaagcgca agttgaaaat tatagaaata 2580 agttaagtta tattcctgtc acggcatttg tgattggtgc ggtcattatt tttgcgattt 2640 tattgattga gccagattgg tataaagtcc tccgtatttc aaattatgtg aaatttggtg 2700 gtgatgcagt gtatatcaca ttagtgattt ggcttgtcat tatgtttgtg ggaaccccgg 2760 taggttggtc attatttatt gcgacgttgc tttattttgc gatgacgcgt tggaatattg 2820 ttaactcggc atcaaccaag ctcaccgaca gt 2852 <![CDATA[<210> 6]]> <![CDATA[<211> 1793]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 化學合成]]> <![CDATA[<400> 6]]> atgttgataa gaatcatctt acaccagata tcaaaaaaga aatactagcc ttctatcata 60 aacatcaagt gaatatttta ctaaataatg atatctcata ttacacgagt aatagattaa 120 taaaaactga ggcgcattta agtaatatta ataaattaag tcagttaaat ctaaattgtg 180 aatacatcat ttttgataat catgacagcc tattcgttaa aaatgacagc tatgcttata 240 tgaaaaaata tgatgtcggc atgaatttct cagcattaac acatgattgg atcgagaaaa 300 tcaatgcgca tccaccattt aaaaagctca ttaaaactta ttttaatgac aatgacttaa 360 aaagtatgaa tgtgaaaggg gcatcacaag gtatgtttat gacgtatgcg ctagcgcatg 420 agcttctgac gattattaaa gaagtcatca catcttgcca gtcaattgat agtgtgccag 480 aatataacac tgaggatatt tggttccaat ttgcactttt aatcttagaa aagaaaaccg 540 gccatgtatt taataaaaca tcgaccctga cttatatgcc ttgggaacga aaattacaat 600 ggacaaatga acaaattgaa agtgcaaaaa gaggagaaaa tatacctgtt aacaagttca 660 ttattaatag tataactcta taaaacactt gcattttatt aaaaataaaa tcctataata 720 tttgcagttt aaataaagga taaaaaatga agaaaattac aattgctggg gctggctatg 780 ttggtttatc caatgcagta ttattagctc aacaccacaa tgtgatctta ttagatattg 840 atcaaaataa agttgattta attaataata aaaaatcgcc catcacagat aaagaaatcg 900 aagatttctt acaaaataaa tcactgacaa tgatggcaac aacagataaa gaagtggcat 960 taaaaaacgc agactttgtc atcatcgcaa cgccactgca gcaagtttcg gctatggcgg 1020 ttattgttta cccaaagaca ctaaacagtt actggctaac tatgctgacg tacctcaaaa 1080 tctcattgaa gccattgtca aatctaatga aaccagaaaa cgtttcatta ctcatgatgt 1140 attaaataag aaacctaaaa ctgttggtat ttatcgttta atcatgaagt caggttctga 1200 taacttcaga gcttctgcta ttctcgatat tatgccgcat ctcaaagaaa acggtgttga 1260 gattgtgatt tatgagccaa ccttaaatca acaggcattt gaggactacc ccgttattaa 1320 tcaactctct gaatttatta atcgctctga tgtcattctc gctaatcgtt ctgagccaga 1380 tttaaatcaa tgttcccata aaatctatac aagagatatt tttggcggtg atgcttaacc 1440 tgtttaaaat cataaaaaag tatgtgcata ttcaatcttt attacacaaa aaagaatatg 1500 ccttacttta tgctaaatac ataaaccagc tttctatcaa ccagcaggct tatgttattt 1560 gtcaactcaa actctatgat ctctttctga ttgatcctaa atggagccac tctgtttttt 1620 tccagttagg attaattgct cgtggacacg atcatgatag cgatgaagtg gtacgtcgtt 1680 tgatcacttg cactgatttt agcaaaaata agcagttaat cctttctcaa ttacttgctt 1740 attcacctca aattgcaaca acattatgtc cacagacata tcgttatcgt gcg 1793 <![CDATA[<210> 7]]> <![CDATA[<211> 2144]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 化學合成]]> <![CDATA[<400> 7]]> gcggatgtga tagttttgac atattaactc cagtctaaat ttatcaaaag aagattgact 60 ccaatttgca taggttaatc ttagaattaa aaaataacaa ccaaaataat aaaaatttga 120 gatctttgtc gcatatttat tcatagggaa tagacagctt aattttagtt atgatttgtc 180 aatccttgct attttttgtg tttgctggtt tgcgatacac tgttctaata ttgctttgag 240 cacttgataa ccttgctcat taaaatgtaa tccgtcggta caaaggcgta aatccagttc 300 accgttagaa tcacaaaagt atttttgtgt ttcaacgtaa gtcacgtctg acggacaatg 360 ttgttttaaa taggtattga gcctgtgaat ttgtgcgtta gtgaccgtat taatctgatt 420 gaccggtgtg gcttctaata aaaagtagtg ggacgtagga gaaatggtgt gtaggtgagt 480 cagaatgtca tttaactatc gcatgacttg cgccggtgaa tacgtttctt ccttacaaat 540 atcattgacg cctaaaaaaa gaaaaacaga ttgtccaagt tgttgaatcc gtttaggttt 600 aacgataaca tccaaatatt gtcgcgtact gacgccagaa agtcctaaat tggcgacggt 660 ttgtcccgct aattgaggtg tgcctgctac ctgttcgtcc cacatgtcaa aaagtgaatg 720 accaattaag ctgatattgg caggtttgga aaattccgcc attttgctct gatagcgttg 780 ataaatatcc tgatcactta gcatgtgtgg acctctattt tgaaataaaa cgctaagtat 840 tatataaaac ctgatatgcc ggtaaacagt aaacttatct tccgtagggg taaatattca 900 attttgtgac gaacctatca tttatgaaat aaaacttcat tttctatata aaaaatagtt 960 ttttcacttt agaatgccaa acgtgtgaaa tttatttcat catcatttta acgtaatccc 1020 aacgtaacca atagaggaga actcataatg aaatttaaaa aactactact tgcatcttta 1080 tgtttaggtg tttcagcttc tgtatttgca gcagattacg atcttaaatt cggtatggtt 1140 gcgggtccaa gctcaaacga atataaagca gtagaattct tcaaaagtca aggtgtgaca 1200 gtcacacaac cagacttaaa accatttaaa gcagcactta caccatacta tgatgaatat 1260 ctcaagaaaa atggtgaagt cggtaaaatg gcgattgaag aaatttctaa tctcgctaaa 1320 taaatatagt aaccttatcc ctgcgcctta agggataagg ttccttttta ttgggttgtc 1380 ttgaggtatc tatgaaaata ataaataaat tagaagagtg gattggcggt gtgctattca 1440 ttggaatttt cttaattctg ttagcacaaa tcattgctcg tcaagtgttt cagtcaccgt 1500 ttatttggag tgaagaactc gcaagattgc tatttatcta tgtcgggcta cttggtatca 1560 gcatgggtat ccgtagtcag cagcatgttt atattgattt tttaactaac tttatgcccg 1620 agaaagtgag aaaggtgaca aactcctttg ttcaagttct catctttatt tccatcatta 1680 ttttcattca tttaggcttt aaagtttgga tcgactccag ttttaaaatg gaagcgttaa 1740 ctgctttcgc ttcagattta attgggcgcg agacgattgt gcctgaaaaa tggatgtatg 1800 cggcattgcc ttttatttct tgtttaatgt tattccgctt tttccaagcg caagttgaaa 1860 attatagaaa taagttaagt tatattcctg tcacggcatt tgtgattggt gcggtcatta 1920 tttttgcgat tttattgatt gagccagatt ggtataaagt cctccgtatt tcaaattatg 1980 tgaaatttgg tggtgatgca gtgtatatca cattagtgat ttggcttgtc attatgtttg 2040 tgggaacccc ggtaggttgg tcattattta ttgcgacgtt gctttatttt gcgatgacgc 2100 gttggaatat tgttaactcg gcatcaacca agctcaccga cagt 2144 <![CDATA[<210> 8]]> <![CDATA[<211> 1170]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> Pasteurella multocida]]> <![CDATA[<400> 8]]> atgaagaaaa ttacaattgc tggggctggc tatgttggtt tatccaatgc agtattatta 60 gctcaacacc acaatgtgat cttattagat attgatcaaa ataaagttga tttaattaat 120 aataaaaaat cgcccatcac agataaagaa atcgaagatt tcttacaaaa taaatcactg 180 acaatgatgg caacaacaga taaagaagtg gcattaaaaa acgcagactt tgtcatcatc 240 gcaacgccaa cagactataa taccgaaaca ggttatttta atacatccac tgttgaagct 300 gtcattgaac aaaccctttc aatcaatcca caagcaacga ttattataaa atcaacgatt 360 cccgttggtt ttaccgaaaa aatgcgtgag aaatttaata ccccaaatct tatcttttca 420 cctgaatttc taagagaggg aaaagccctt tacgataatt tgtatccaag cagaattatt 480 gttggcagta cttcttatca agcaaaagta tttgccgata tgttaacaca gtgtgccaga 540 aaaaaagatg taactgtttt atttacacac aatactgagg ccgaagctgt taaattattt 600 gcaaatacgt atctcgcaat gcgagttgcc ttttttaatg aattagatac ttatgcgagt 660 cttcaccatt taaatacaaa agacattatc aatggtattt ctactgatcc tcgcattggt 720 acacactaca ataacccaag tttcggctat ggcggttatt gtttacccaa agacactaaa 780 cagttactgg ctaactatgc tgacgtacct caaaatctca ttgaagccat tgtcaaatct 840 aatgaaacca gaaaacgttt cattactcat gatgtattaa ataagaaacc taaaactgtt 900 ggtatttatc gtttaatcat gaagtcaggt tctgataact tcagagcttc tgctattctc 960 gatattatgc cgcatctcaa agaaaacggt gttgagattg tgatttatga gccaacctta 1020 aatcaacagg catttgagga ctaccccgtt attaatcaac tctctgaatt tattaatcgc 1080 tctgatgtca ttctcgctaa tcgttctgag ccagatttaa atcaatgttc ccataaaatc 1140 tatacaagag atatttttgg cggtgatgct 1170 <![CDATA[<210> 9]]> <![CDATA[<211> 390]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> Pasteurella multocida]]> <![CDATA[<400> 9]]> Met Lys Lys Ile Thr Ile Ala Gly Ala Gly Tyr Val Gly Leu Ser Asn 1 5 10 15 Ala Val Leu Leu Ala Gln His His Asn Val Ile Leu Leu Asp Ile Asp 20 25 30 Gln Asn Lys Val Asp Leu Ile Asn Asn Lys Lys Ser Pro Ile Thr Asp 35 40 45 Lys Glu Ile Glu Asp Phe Leu Gln Asn Lys Ser Leu Thr Met Met Ala 50 55 60 Thr Thr Asp Lys Glu Val Ala Leu Lys Asn Ala Asp Phe Val Ile Ile 65 70 75 80 Ala Thr Pro Thr Asp Tyr Asn Thr Glu Thr Gly Tyr Phe Asn Thr Ser 85 90 95 Thr Val Glu Ala Val Ile Glu Gln Thr Leu Ser Ile Asn Pro Gln Ala 100 105 110 Thr Ile Ile Ile Lys Ser Thr Ile Pro Val Gly Phe Thr Glu Lys Met 115 120 125 Arg 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Claims (16)
- 一種活性減毒多殺性巴斯德氏菌( P.multocida)細菌,其特徵係其包含一具有至少一個減毒突變之hyaC基因,及一具有至少一個減毒突變之nanP基因。
- 如請求項1所述之細菌,其中,該hyaC基因中的至少一個減毒突變係至少一個核苷酸的缺失、整個基因的缺失、移碼突變、核苷酸***或導致密碼子置換之核苷酸置換。
- 如請求項1所述之細菌,其中,該nanP基因中的至少一個減毒突變係整個基因的缺失、至少一個核苷酸的缺失、移碼突變、核苷酸***或導致密碼子置換之核苷酸置換。
- 如請求項1至3中任一項所述之細菌,其中,任何從該突變之hyaC基因或該突變之nanP基因所表現之多肽係不活化的。
- 如請求項1至4中任一項所述之細菌,其中,該細菌被分配至血清群A、B、D、E或F。
- 如請求項1至4中任一項所述之細菌,其中,經修飾的野生型hyaC之DNA序列編碼SEQ ID NO:9之胺基酸序列,或與其至少80%相同之胺基酸序列。
- 如請求項5所述之細菌,其中,經修飾的該野生型hyaC之DNA序列包含核甘酸序列SEQ ID NO:8,或與其至少80%相同之核甘酸序列。
- 如請求項1至4中任一項所述之細菌,其中,經修飾的該野生型nanP之DNA序列編碼胺基酸序列SEQ ID NO:2之,或與其至少80%相同之胺基酸序列。
- 如請求項7所述之細菌,其中,經修飾的該野生型nanP之DNA序列包含核甘酸序列SEQ ID NO:1,或與其至少80%相同之核甘酸序列。
- 如請求項1至8中任一項所述之細菌,其中,該突變nanP基因編碼胺基酸序列SEQ ID NO:4,或比胺基酸序列SEQ ID NO:2更短之多肽,其中,該多肽之胺基酸序列與該多肽相同長度的SEQ ID NO:4之胺基酸序列有至少80%是相同的。
- 如請求項1至8中任一項所述之細菌,其中,該突變hyaC基因編碼胺基酸序列SEQ ID NO:11,或比胺基酸序列SEQ ID NO:9更短之多肽,其中,該多肽之胺基酸序列與該多肽相同長度的SEQ ID NO:11之胺基酸序列有至少80%是相同的。
- 如請求項1至4中任一項所述之細菌,其中,該突變nanP具有核苷酸序列SEQ ID NO:3,或任何比SEQ ID NO:1更短之多核苷酸,其中,該多核苷酸之核苷酸序列與該多核苷酸相同長度的SEQ ID NO:3之核苷酸序列有至少80%是相同的。
- 如請求項1至4中任一項所述之細菌,其中,該突變hyaC具有核苷酸序列SEQ ID NO:11,或任何比SEQ ID NO:8更短之多核苷酸,其中,該多核苷酸之核苷酸序列與該多核苷酸相同長度的SEQ ID NO:11之核苷酸序列有至少80%是相同的。
- 如請求項1至4中任一項所述之細菌,其中,該突變在hyaC基因及/或nanP基因中係完全不活化的。
- 一種屬於血清群A之多殺性巴斯德氏菌( P.multocida)細菌,其特徵係修飾野生型hyaC、nanP及任選地一或複數種Fis或白血球毒素A之致病基因,使該細菌減毒。
- 一種分離並被殺滅之多殺性巴斯德氏菌( P.multocida)細菌或菌苗,其特徵係其由於hyaC基因突變導致生合成透明質酸缺陷,及由於nanP基因突變導致表面唾液酸化缺陷。
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