MX2013001632A - Ensayo de enlace objetivo in vitro de funcion doble para la deteccion de anticuerpos neutralizantes contra anticuerpos objetivo. - Google Patents

Abstract

Se describe un método de ensayo in vitro. Este ensayo de enlace objetivo de función doble no basado en células es útil para detectar tanto un anticuerpo objetivo IgG, tal como un fármaco biológico, en una muestra biológica (por ejemplo, una muestra de suero) así como la presencia de anticuerpos neutralizantes (NAb) contra el anticuerpo objetivo IgG.

Description

ENSAYO DE ENLACE OBJETIVO IN VITRO DE FUNCIÓN DOBLE PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES CONTRA ANTICUERPOS OBJETIVO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de, anticuerpos terapéuticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La Citotoxicidad Mediada por Células Dependiente de Anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) es uno de los mecanismos de la . respuesta inmunitaria humoral. En una respuesta de ADCC, ¦ una célula efectora del sistema inmunitario, típicamente una célula exterminádora natural (NK, por sus siglas en inglés), activamente lisa una célula objetivo que se ha enlazado por anticuerpos específicos que tienen enlace a una protéína objetivo en la superficie de la célula objetivo. Los neutrófilos y eosinófilos también pueden mediar . la ADCC. : Por ejemplo, los eosinófilos pueden exterminar ciertos gusanos parasitarios conocidos como helmintos a través de la ADCC.

Los anticuerpos de varios isotipos IgG se han reportado para tener alguna- actividad de ADCC, pero típicamente, los isotipos IgGl e IgG3. se caracterizan por tener actividad importante de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En un estudio, tantos los anticuerpos IgGl como IgG3 se reportaron para ser igualmente efectivos al mediar la ACDD de célula U937 de monocito o activada; IgGl fue más activo que IgG3 en ADCC- mediada ¦ por célula NK. (Rozsnyay et al., Distinctive role of IgGl and IgG3 isotypes in Fe gamma R-mediated functions, Immunology 66(4): 491-498 (1989)). Los eritrocitos, sensibilizados por IgG3 inhiben de forma reportada la. lisis inducida por . IgGl, implicando que cada subclase engancha el mismo receptor R gamma Fe pero que la lisis requiere una. ^señal' adicional . que la' molécula IgG3 no puede suministrar. (Rozsnyay et al., ibid.). FcyRIIIa (CD16a) se ha identificado como el receptor relevante para la función efectora de la ADCC.

Los estudios han revelado que la eliminación de fucosa de los oligosacáridos de anticuerpos IgGl humanos resulta en una mejora importante de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). por medio de enlace IgGl mejorado a FcYRIIIa, y puede . reducir la densidad, del antigeno requerida para la inducción de ADCC por medio de ' reclutamiento eficiente y activación de células NK. (Niwa et al., Enhanced Natural Killer Cell Binding and Activatiori by Low-Fucose IgGl Antibody Results in. Potent Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Induction at Lower Antigen Density, Clinical Cáncer Research 11: 2327 (2005); Satoh e.t al., Non-fucosylated therapeutic antibodi.es as next-gen ration therapeutic antibodies, Expert Opinión on Biological Therapy 6(11): 1161-1173 (2006)).-. Este fenómeno. puede ser particularmente útil en un anticuerpo terapéutico. Los anticuerpos monoclonales terapéuticos, tales como rituximab (Rituxan®) y trastuzumab (Herceptin®) se usan ampliamente en el tratamiento ¦¦ . de neoplasmas y/o enfermedades autoinmunitarias . (Stavenhagen et al., Fe Optimization of Therapeutic Antibodies . Enhances Their Ability to Kill Tumor Cells In vitro and, .Controls Tumor Expansión In vivo via Low-Affinity Activating Fcy Receptors, Cáncer . Research 67 (18) : 8882-90 (2007); Clynes, RA et al, Inhibitory Fe receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets, Nat Med 6 (4): 443-46 (2000); Hauser et al., B-cell . dépletion with rituximab in relapsing-remitting múltiple sclerosis, NEJM 358:676-88 (2008) )..

El KW-0761 (también conocido como "mogamulizumab" o "AMG 761") que se desarrolla para el tratamiento de pacientes con linfoma de células T cutáneo (CTCL, por sus siglas en' inglés) o linfoma de células T periférico (PTCL, por sus siglas en inglés). El KW-076L es un anticuerpo monoclonal humanizado de la inmunoglobulina G, de isotipo kappa de subclase 1 (IgGl) que direcciona las células que expresan el receptor 4 de quimiocina CC (CCR4). y ha mostrado; una capacidad para suprimir CCR4 que expresa linfocitos T por medio de la ADCC . El KW-0761 tiene; actividad dé ADCC aumentada debido a la desfucosilación del oligosacárido tipo complejo en la región constante (Fe). (Ishii et al., Defucosylated Humanized Anti-CCR4 Monoclonal Antibody KW-0761 as a Novel Immunotherapeutic Agent for Adult T-c.ell Leukemia/Lymphoma, Clinical Cáncer Research 16: 1520-31 . (2010 ) ; Shitara et al., Human CDR-grafted antibody and antibody fragment thereof, Patente de E.U.A. No. 7,504,104) Un anticuerpo neutralizante, o NAb, es una molécula de inmunoglobulina que reacciona con un antigeno especifico,, que típicamente induce su síntesis in vivo, y con moléculas similares. Los anticuerpos neutralizantes se clasifican de acuerdo al modo de. acción como aglutinina, bacteriolisina, hemolisina, opsonina,. o precipitina. Los anticuerpos se sintetizan por linfocitos B que se. han activado por el enlace de un antígeno, a un receptor de la superficie celular, y los anticuerpos neutralizantes son capaces de eliminar o "neutralizar" el efecto biológico del antígeno, que puede estar, por ejemplo en la superficie de un patógeno. Desafortunadamente, los anticuerpos terapéuticos también pueden algunas veces . inducir la producción de NAbs en algunos pacientes, y es importante para el bien de, la seguridad clínica para ser capaz de vigilar la apariencia de NAbs dirigidos contra el anticuerpo terapéutico en el suero de un paciente que recibe un fármaco de anticuerpo terapéutico.

Un método de ensayo in vitro confiable, no basado en células para detectar . tales anticuerpos IgG terapéuticos que pueden inducir ADCC, y también, para detectar NAbs contra tales anticuerpos terapéuticos en el suero de un paciente son beneficios deseados que la presente invención proporciona.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a un ensayo de. enlace objetivo de función doble' in vitro, que es útil, para detectar tanto un anticuerpo objetivo IgG, tal como un fármaco biológico, en una muestra biológica (por ejemplo, una muestra de suero) como la presencia de anticuerpos neutralizantes (NAb) contra el anticuerpo objetivo IgG.

En una modalidad, el método de ensayo in vitro inventivo comprende detectar en un pozo recubierto con avidina, al medir una señal, en la presencia de un volumen . fresco de una solución amortiguadora que permite la. detección bajo condiciones fisiológicas, cualquiera de un anticuerpo que específicamente enlaza la polihistidina, que ha enlazado un polipéptido CD16a . humano recombinante etiquetado con polihistidina, en donde el pozo recubierto con avidina se bloqueó previamente y posteriormente una mezcla de reacción pre-incubada se ha incubado en el pozo recubierto con avidina bloqueado, bajo condiciones fisiológicas, en donde la mezcla de reacción pre-incubada se suspendió durante su pire-incubación en una solución amortiguadora de ensayo que contiene suero acuoso, y la mezcla, de reacción pre-incubada comprende: (i) una proteina enlazada al antigeno objetivo que comprende un dominio Fe con un sitio enlazado a CDl6a; y (ii) una porción de polipéptido biotirtilado de una proteina objetivo de interés, a la cual la porción de polipéptido la .proteina enlazada al antigeno objetivo se enlaza específicamente; y en donde, posterior a la incubación de la mezcla de reacción pre-incubada en el pozo recubierto con avidina, un polipéptido CD16a humano recombinante etiquetado . con polihistidina suspendido en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo se incubó bajo condiciones fisiológicas, junto con cualquier proteína' enlazada al antígeno objetivo que se enlazó a la porción de polipéptido biotinilada que se enlazó a la avidina del pozo recubierto con avidina; y en donde, antes de. detectar al medir la señal, el anticuerpo que específicamente enlaza a la polihistidina, suspendido en un volumen fresco de la solución, amortiguadora de ensayo, se incubó en el pozo bajo condiciones fisiológicas, junto con cualquier polipéptido C.D16a humano recombinante etiquetado cón polihistidina que se enlazó a la proteína enlazada al antígeno objetivo.

Algunas modalidades del método incluyen además,, antes de detectar el. anticuerpo que específicamente enlaza a la polihistidina, la etapa de incubar . en el pozo, bajo condiciones fisiológicas, un anticuerpo que comprende una etiqueta que produce la señal conjugada, suspendido en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo, en donde el anticuerpo enlaza específicamente el anticuerpo que específicamente enlaza a la polihistidina.

En una modalidad particular, el método de ensayo in vitro inventivo involucra las etapas de (a) incubar en un pozo recubierto con avidina bloqueado, bajo condiciones fisiológicas, una mezcla de reacción pre-incubada suspendida en' una solución amortiguadora de ensayo que contiene suero acuoso, la mezcla de reacción pré-incúbada comprende: (i) un anticuerpo objetivo IgG que comprende un dominio Fe con un sitio enlazado a CD16a; y (ii) una porción, de polipéptido. biotinilado de una proteína objetivo, de interés, a . la cual, la porción de polipéptido enlaza específicamente el anticuerpo objetivo IgG; (b) incubar en el pozo, bajo condiciones fisiológicas, un polipéptido CD16a humano recombinante etiquetado con polihistidina suspendido en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo, junto con cualquier anticuerpo objetivo IgG que se ¦ enlazó a la porción de polipéptido biotinilada que se enlazó a la avidina en (a) ; (c) incubar en el pozo, bajo condiciones fisiológicas, un anticuerpo que específicamente enlaza a la polihistidina, el anticuerpo suspendido en un volumen ; fresco de la solución amortiguadora de ensayo, junto, con cualquier polipéptido CD16a humano recombinante dirigido a la . olihistidina que se enlazó al anticuerpo objetivo IgG en (b) ; y (d) detectar, en el pozo, en la presencia de un volumen fresco de una solución amortiguadora que permite la detección bajo condiciones fisiológicas, cualquiera del anticuerpo que específicamente enlaza a- la polihistidina que.' se enlazó al polipéptido CD16a humano recombinante etiquetado con polihistidina en (c) al medir una señal.

En algunas modalidades de la invención, el método comprende además, antes de la etapa (d) la etapa de incubar en el pozo, bajo condiciones fisiológicas, un anticuerpo¦ que comprende una etiqueta que produce la señal Conjugada, suspendido en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo, en donde el anticuerpo enlaza específicamente el anticuerpo que. específicamente enlaza a la polihistidina en (c) .

En otra modalidad útil/ el método, de ensayo in vitro involucra las etapas de: (a) incubar en un pozo recubierto con avidina bloqueado, bajo condiciones fisiológicas, una mezcla de reacción pre-incubada suspendida en una solución amortiguadora de' ensayo que contiene suero acuoso, la mezcla de reacción pre-incubada comprende : (i) un anticuerpo objetivo IgG contra CCR4 humano que comprende un dominio Fe con un sitio enlazado a CD16a; (ii) muestra de suero para probarse para la presencia de anticuerpos neutralizantes; y (iii) una porción de polipéptido biotinilado de CCR4 humano, a la cual la porción de polipéptido enlaza específicamente el anticuerpo objetivo IgG; (b) incubar en el pozo, bajo condiciones fisiológicas, un polipéptido . CD16a humano recombinante etiquetado con polihistidina suspendido en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo, junto con cualquier anticuerpo objetivo IgG que se enlazó a la porción de polipéptido biotinilada de CCR humano que se enlazó a la avidina en (a) ; (c) incubar en el pozo, bajo condiciones fisiológicas, un anticuerpo que específicamente enlaza a la polihistidina, el anticuerpo suspendido en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo, junto con cualquier polipéptido CD16a humano recombinante dirigido a la ' polihistidina que se enlazó al anticuerpo objetivo IgG en (b) ; (d) incubar en el pozo, bajo, condiciones fisiológicas, un anticuerpo qué comprende una etiqueta que produce la señal conjugada, suspendido en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo, en donde el anticuerpo enlaza específicamente el anticuerpo que específicamente enlaza a la polihistidina en (c) ; y (e) detectar en el pozo, en la presencia de un volumen fresco de una solución amortiguadora que permite la detección bajo condiciones fisiológicas, cualquier señal producida.

En las varias modalidades de la invención, la señal puede producirse . por un' sistema de etiquetado de electroquimioluminiscencia sensible. (ECL, . por sus siglas en inglés), pero los sistemas de etiquetado de etiqueta fluorescente (por ejemplo, fluoresceína, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, proteína fluorescente verde [GFP] , GFP aumentada [eGFP] , proteína fluorescente amarilla [YFP] , proteína, fluorescente cían [CFP] , etc.),. etiqueta isotópica (por ejemplo, 125I, 1 C, 13C, 5S, 3H, 2H, 13N, : 15N, 180, 170, etc.), o ligada a la enzima (por ejemplo, con base en peroxidasa de raíz de rábano, beta-galactosidasa, o luciferasa) también son. modalidades útiles. ¦ La. señal se detecta usando un. instrumento adecuado.

Si las muestras biológicas contienen anticuerpos neutralizantes contra el anticuerpo objetivo IgGl, el anticuerpo objetivo no será capaz de enlazar al péptido objetivo biotinilado de interés que se captura en el sustrato sólido recubierto con avidina. Por lo tanto, una señal baja (por ejemplo, ECL) se' genera en presencia de NAb. En ausencia de NAb, una señal .alta (por ejemplo, ECL) se genera debido a que el anticuerpo objetivo IgGl es capaz de construir un puente entre el péptido .objetivo biotinilado y el FCYRIIIa humano recombinante dirigido a la . polihistidina (CD16a) . .

Numerosos aspectos' y ventajas adicionales de la presente invención se volverán aparentes bajo la consideración de las figuras y descripción detallada de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1· muestra una representación esquemática de una modalidad del .ensayo de función doble inventivo, ya que se configura para detectar un anticuerpo objetivo IgGl (por ejemplo, K -0761, también conocido como "mogamulizumab" o "AMG 761") que específicamente enlaza una proteína objetivo biotinilada ("B"). de 'interés (por ejemplo, CCR4 ) , y para detectar anticuerpos neutralizantes en una muestra de suero. En esta modalidad, la placa recubierta con avidina se representa por "placa MSD 6000" (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) recubierta con estreptavidina. ("SA") , y se emplea un sistema de etiquetado de anticuerpo de electroquimioluminiscencia (ECL) del conjugado de proteína SULFO-.TAG™ (Meso Scale Discovery, Gaithersburg., MD)' para propósitos de detección. Se empleó un lector de. placa SECTOR® Imager 6000 ( "MSD 6000" ) en la detección.

La Figura. 2 muestra un diagrama de flujo de las etapas de una modalidad del ensayo in vitro inventivo para detectar anticuerpos neutralizantes contra un anticuerpo objetivo IgGl.

La Figura 3 muestra una respuesta de dosis representativa . para . KW-0761 (también ' conocida como "mogamulizumab" o "AMG 761") en el ensayo inventivo en presencia de solución . amortiguadora de ensayo (PHS al 0%) o suero humano agrupado ("PHS": PHS al 5% o PHS al 20%; (,v/v) ) .

La Figura 4 demuestra que el enlace de KW-0761 (también conocido como "mogamulizumab" o "AMG 761") al péptido CCR4 biotinilado se inhibe por presencia de anticuerpos neutralizantes anti-KW-0761 ·. policlonales en. una manera dependiente de dosis.

La Figura 5 demuestra que rituximab enlaza a péptidos CD20 biotinilados en una manera dependiente de dosis en el mismo formato de ensayo representado esquemáticamente en la Figura 1 y Figura .2, como se describe y modifica en el Ejemplo 3. "MBT4736" se refiere a la SEQ ID NO: 7; "MBT4737" se refiere a la SEQ ID NO: 8.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La sección de encabezados usada en la presente es para propósitos organizacionales únicamente y no son para construirse como que limiten la materia objeto descrita.

Definiciones A menos que se defina de otra manera en la presente, los términos científicos y técnicos usados en conexión con la solicitud actual tendrán los significados que se . entienden comúnmente por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos, plurales incluirán, el singular. De esta manera, como se usa en esta especificación y. las reivindicaciones anexas, las formas, singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Por ejemplo, con referencia a "una proteína" incluye una pluralidad de proteínas; con referencia a "una célula" incluye . poblaciones de una .'. pluralidad, de células .

"Polipéptido" y ."proteína" se usan intercambiablemente en la presente e incluyen una cadena molecular de dos o más aminoácidos ligados covalentemente a .través de enlaces de péptido. Los términos no se refieren a una longitud específica del producto. De esta manera, "péptidos," y "oligopéptidos, " se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Los términos incluyen modificaciones post-traduccionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones , acetilaciones , fosforilaciones y similares. . Además, los fragmentos de proteína, análogos, proteínas de variante o mutadas, proteínas de . fusión y similares se incluyen dentro del significado de polipéptido. Los términos también incluyen moléculas en las cuales uno . o más análogos de aminoácido o aminoácidos no canónicos o no naturales se incluyen ya que pueden expresarse, recombinantemente usando . técnicas de preparación por ingeniería de proteína conocidas. Además, las proteínas de fusión pueden derivarse como se describe en la presente por técnicas de química orgánica bien conocidas.

El término "proteína aislada" referido significa que una proteína objeto (1) está libre de al menos .algunas otras proteínas con las cuales debe normalmente encontrarse- en la naturaleza, (2) está libre esencialmente de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especia, (3) se expresa recombinantemente por una célula de un tipo o especie heterólogo, (4) sé ha separado de al menos alrededor' de 50 por ciento de polinucleótidos , lipidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales se asocia en la naturaleza, (5) se asocia operablemente (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el cual no se .asocia en la naturaleza, y/o (6) no ocurre en- la naturaleza. Típicamente, una "proteína aislada" constituye al menos alrededor de 5%, al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 25%, o al menos alrededor de 50% de una muestra dada. El ADN genómico, cADN, mARN u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de . los mismos puede codificar . tal proteína aislada. Preferiblemente, la proteína aislada está libre sustancialmente de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que deben interferir . con su uso terapéutico, de .diagnostico, profiláctico, de búsqueda u otro uso.

Al describir además . cualquiera de los polipéptidos o proteínas en la presente, así como variantes, un sistema de abreviatura de una letra se aplica frecuentemente para designar las identidades de los veinte residuos de aminoácido "canónico" generalmente incorporados en péptidos y proteínas que se presentan naturalmente (Tabla 1) . Tales abreviaturas de una letra son. completamente intercambiables en significado con abreviaturas de tres letras, o nombres de aminoácido no abreviados.

Tabla 1. Abreviaturas' de una letra para los aminoácidos canónicos . Abreviaturas de tres letras están en paréntesis .

Alanina (Ala) A Glutamina (Gin)- Q Leucina (Leu) L Serina (Ser) S Arginina (Arg) R Ácido glutámico (Glu) E Lisina (Lys) K Treonina (Thr) ¦ T Asparagina (Asn) N Glicina (Gly)' G Metionina (Met) M Triptofano (Trp) W Ácido aspártico (Asp) D Histidina (His) H Fenilalanina (Phe) F Tirosina (Tyr) Y Cisteina (Cys) C Isoleucina (He) · I Prolina (Pro) P Valina (Val) V Una sustitución de aminoácido .en una secuencia de aminoácidos se designa típicamente en la presente con una abreviatura de una. letra para el residuo de aminoácido . en una posición particular, seguida por la posición de aminoácido numérica con relación a una secuencia original de interés, que luego es seguida por el símbolo de una letra para el residuo de aminoácido sustituido dentro Por ejemplo, "T30D" simboliza una. sustitución de un residuo de treonina por un residuo de aspartato en la posición del aminoácido 30, con relación a la secuencia original de interés. Otro ejemplo, "W101F" simboliza una sustitución de un- residuo de triptofano por un residuo de fenilalanina . en la posición del aminoácido 101, con relación, a la secuencia original de interés. Los residuos de aminoácido no canónicos pueden incorporarse en un péptido dentro . del alcance de la invención al emplear técnicas conocidas . de la preparación por ingeniería de la proteína que usa células expresadas recómbinantemente . (Ver, por ejemplo, Link et al, Non-canonical amino acids in protein engineering, Current Opinión in Biotechnology, 14(6): 603-609 (2003) ) . El término "residuo de aminoácido no. canónico" se refiere a residuos- de aminoácido en la forma D o L que no están entre los 20 aminoácidos canónicos generalmente incorporados en las proteínas que. se presentan naturalmente, por ejemplo, aminoácidos ß, homoaminoácidos , aminoácidos cíclicos y aminoácidos con cadenas laterales derivadas. Los ejemplos incluyen (en la forma L o forma D) ß-alanina, ácido ß-aminopropiónico, ácido piperidínico, ácido aminocaprioico, ácido aminoheptanoico, ácido aminopimélico, desmosina, ácido diaminopimélico, . .Na-etilglicina, Na-etilaspargina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, isodesmosina, alo-isoleucina, ?-metilarginina, Na-metilglicina, Na-metilisoleucina, Na-metilvalina, ?-carboxiglutamato, e-?,?,?-trimetilisina, ¦ e-?.-acetilisina, O-fosfoserina, - Na-acetilserina, Na-fo milmetioniria,. 3-métilhistidina, 5-hidroxilisina, y otros aminoácidos similares, y aquellos enlistados en la Tabla 2 a continuación, y formas derivadas de cualquiera de estos como se describe en la presente. La Tabla 2 contiene algunos residuos de aminoácido no canónicos ejemplares que son útiles de acuerdo con la presente invención y abreviaturas asociadas típicamente como se usa en la presente, aunque el médico experimentado entenderá que las diferentes abreviaturas y nomenclaturas pueden aplicarse a la misma sustancia y ¦ aparecen intercambiablemente en la presente.

Tabla 2. Aminoácidos no canónicos útiles para adición, inserción, o sustitución de aminoácido en las secuencias de péptido de acuerdo con la presente invención. En el caso una abreviatura enlistada en la Tabla '. 2 difiere de . otra abreviatura por la misma sustancia descrita en otro lugar en la presente, ambas abreviaturas se entienden para ser aplicables. Los aminoácidos enlistados en la Tabla 2 pueden estar en la forma L o forma D.

Aminoácido Abreviaturas Acetamidometil Acm Acetilarginina acetilarg Ácido a-aminoadipico Aad Ácido aminobutitico Abu Ácido 6-aminohexanoico . Ahx; e??? 3-amino-6-hidroxi-2-piperidona . Ahp Ácido 2-aminoindan-2-carboxílico Aic Ácido a-amino-isobutírico' Aib Ácido 3-amino-2-naftoico . Anc Acido 2-aminotetralin-2-carboxilico . Ate Aminofenilalanina Aminophe; Amino-Phe 4 -amino-fenilalanina 4AmP 4 -amidino-fenilalanina 4AmPhe Ácido 2-amino carbamimidoilpiperidin-4-il) acético 4AmPig Enlace de amida reducido con arg ? (CH2NH) rArg ß-homoarginiha bhArg ß-homolisina bhomoK ß-homo Tic BhTic ß-homofenilalanina . BhPhe ß-homoprolina BhPro ß-homotriptofano BhTrp 4, 4' -bifenilalanina Bip ß, ß-difenil-alanina BiPhA ß-fenilalanina BPhe p-carboxil-fenilalanina Cpa citrulina Cit ciclohexilalanina Cha ciclohexilglicina Chg ciclopentilglicina Cpg ácido 2-amino-3-guanidinopropanoico 3G-Dpr ácido a, ?-diaminobutírico Dab ácido 2 , 4-diaminobutirico Dbu ácido diaminopropiónico Dap ácido , ß-diaminopropionoico (o ácido 2, 3-diaminopropiónico) Dpr 3, 3-difenilalanina .Dip 4-guanidino fenilalanina Guf 4-guanidino prolina 4GuaPr Homoarginina hArg; hR Homocitrulina hCit Homoglutamina hQ Homolisina hLys ; hK; homoLys Homofenilalanina hPhe; homoPhe 4 -hidroxiprolina (o hidroxiprolina) Hyp 2-indanilglicina (o indanilglicina) igi Ácido indolin-2-carboxílico Idc Yodotirosina I-Tyr Enlace amida reducido por Lys ?(????) rLys Óxido de metionina. Met[0] Metionina sulfona Met[0]2 Na-metilarginina NMeR Glicina sustituida con Na- [ (CH2) 3NHCH (NH) NH2] N-Arg Na-metilcitrulina NMeCit N -metilglutamina NMeQ Na-metilhomocitrulina Na-MeHoCit Na-metilhomolisina NMeHoK ¦ N -metileucina Na-MeL; NMeL; NMe NMe-Leu .

Na-metilisina NMe-Lys ?e-metil-lisina N-eMe-K ?e-etil-lisina N-eEt-K ' e-isopropil-lisina, N-eIPr-K Na-metilnorleucina NMeNle; NMe-Nle Na-metilornitina Na-MeOrn; NMeOrn Na-metilfenilalanina NMe-Phe -metil-fenilalanina MePhe a-metilfenialanina ¦ ¦ A eF Na-metiltreonina NMé-Thr; NMeThr Na-metilvalina NMeVal; N e-Val ?e- (O- (aminoetil) -O' - ( 2-propanoil )¦ undecaetilenglicol ) -Lisina K(NPegll) ?e- (O- (aminoetil) -O' - (2-propanoil)¦ (etilenglicol) 27-Lisina K(N.Peg27) 3- (1-naftil) alanina 1-Nal; INal 3- (2-naftil) alanina 2-Nal; 2Nal Ácido nipecótico Nip Nitrofenilalanina nitrophe Norleucina Nle Norvalina Nva o Nvl O-metiltirosina Ome-Tyr Ácido octahidroindol-2-carboxilico Oic Ornitina Orn Enlace de amida reducido por Orn ?(0?2??) rOrn 4-piperidinilalanina 4PipA 4 -piridinilalanina 4 Pal 3-piridinilalanina 3Pal 2 -piridinilalanina 2Pal para-aminofenila1aniña 4'AmP; 4-Amino-para-yodofenilalanina (o 4-yodofenilalanina) pl-Phe fenilglicina Phg 4 -feni1-fenilalanina (o bifenilalanina) 4Bip 4,4'-bifenil alanina Bip Ácido pipecólico Pip Ácido 4-amino-l-piperidin-4-carboxilico 4Pip sarcosina Sar 1,2,3, 4-tetrahidroisoquinolina Tic Ácido 1,2,3, 4-tetrahidroisoquinolin 1-carboxilico Tiq Ácido 1,2,3, 4-tetrahidroisoquinolin' 7 -hidroxi-3-carboxílico Hidroxil-Tic Ácido 1,2,3, 4-tetrahidronorharman-3 Carboxilico Tpi Ácido tiazolidin-4-carboxílico Thz 3-tienilalanina Thi nomenclatura y simbolismo para Aminoácidos y Péptido por la UPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) se han publicado en los siguientes documentos: Biochem. J. , 1984, 219, 345-373; Eur. J. Biochem. , 1984, 138, 9-37; 1985, 152, 1; 1993, 213, 2; Internat. J. Pept . Prot . Res., 1984, 24, después p 84; J. Biol. Chem. , 1985, 260, 14-42; Puré Appl. Chem., 1984, 56, 595-624; Amino Acids and Pepetides, 1985, 16, 387-410; Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2a edición, Portland Press, 1992, páginas 39-69.

Una variante polipéptido (por ejemplo proteína enlazada al antígeno, o un' anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácido en donde uno o más residuos de aminoácido se insertan en, eliminan de y/o sustituyen en la secuencia de aminoácido con relación a otra secuencia de polipéptido. Las variantes incluyen proteínas de fusión.

El término "proteína de fusión" indica que la proteína es una quimera que incluye componentes de polipéptido derivados de más de una proteína o polipéptido precursor, o de la misma proteíha pero posicionada dentro de una molécula de fusión sencilla en un orden diferente que no se encuentra naturalmente juntos en las misma molécula de proteina. Típicamente, una proteína de fusión se expresa de un gen de fusión en el cual una secuencia de nucleótido gue codifica una secuencia de polipéptido de una proteína se anexa en el cuadro con, y opcionalmente separado por una ligadura de, una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de polipéptido de una proteína diferente. El gen de fusión, luego puede expresarse por una célula hospedera recombinante como una proteina sencilla. · Una proteína "secretada" se refiere a aquellas proteínas capaces de dirigirse al ER, vesículas secretoras, o el espacio extracelular como un resultado de una secuencia de péptido de señal secretora, así como aquellas proteínas liberadas en el espacio extracelular sin .necesariamente contener una señal de secuencia. Si la proteína secretada se libera en el espacio, extracelular, la proteína secretada puede experimentar procesamiento extracelular para producir una proteína "madura". La liberación en el espacio extracelular puede ocurrir por muchos mecanismos, incluyendo exocitosis y desdoblamiento proteolítico . En algunas otras modalidades de la composición inventiva, el polipéptido puede sintetizarse por la célula hospedera como una proteína secretada, que luego puede purificarse, además del medio y/o espacio extracelular.

En varias etapas del método de ensayo in ' vitro inventivo, una molécula o una mezcla de moléculas se "suspende" en un liquido acuoso, por ejemplo, en una solución amortiguadora de ensayo que contiene suero, o en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo. El término "suspendido" significa que la molécula o mezcla se disuelve en, entremezcla en, flota dentro,, se mueve dentro, o mezcla en el liquido.

Como se usa en la presente "soluble", cuando hace referencia a . una . proteína producida por tecnología de ADN recornbinante en una célula hospedera es una proteína que existe en solución acuosa; si la proteína contiene una secuencia de aminoácido de señal de . arginina idéntica la proteína soluble se exporta al espacio periplásmico en hospederos bacterianos gram negativo, o se secreta en él medio de cultivo por células hospederas, eucarióticas capaces de secreción, o por procesamiento de hospedero bacteriano de los genes apropiados (por ejemplo, el gen kil) De esta manera, . una proteína soluble es una : proteína que no se encuentra en un cuerpo de inclusión dentro · de la célula hospedera. Alternativamente, dependiendo del contexto, una proteína soluble es una proteína que no se encuentra integrada en las membranas celulares, o, in vitro, se disuelve, o es capaz de disolverse en una solución amortiguadora acuosa bajo, condiciones fisiológicas sin formar cantidades importantes de agregados insolubles (esto es, forma agregados menores que 10%, y típicamente menores que alrededor de 5%, de proteína total) cuando se suspende sin otras proteínas en una solución amortiguadora acuosa de interés bajo condiciones fisiológicas, tal solución amortiguadora no contiene un detergente o agente eaotrópico, tal como urea, clorhidrato de guanidinio,. o perclorato de litio. En contraste, una proteína insoluble es una que. existe en forma desnaturalizada dentro de los gránulos. cit'oplásmicos (nombrados un cuerpo de inclusión) en la célula hospedera, o de nuevo dependiendo del contexto, una proteína insoluble es una que está presente en membranas celulares, incluyendo pero no limitadas a, membranas citoplásmicas , membranas mitocondriales , membranas de cloroplasto, membranas de retículo endoplásmico, etc., o en una solución amortiguadora acuosa in vitro bajo condiciones fisiológicas forman cantidades importantes de agregados insolubles (esto es, forma agregados iguales a o mayores que alrededor de.10% de proteína total) cuando se suspende sin otras proteínas (a temperatura fisiológicamente compatible) en una solución amortiguadora acuosa de interés. bajo condiciones fisiológicas, tal solución amortiguadora no contiene un detergente agente eaotrópico, tal como urea, clorhidrato de guanidinio, o perclorato de litio.

El término "recombinante" indica que el material (por ejemplo, un ácido nucleico o un polipéptido) se ha alterado artificialmente o sintéticamente (esto es, no naturalmente) por la intervención humana. La alteración puede realizarse en el material dentro de, o removerse de, su estado o ambiente natural. Por ejemplo, un "ácido nucleico recombinante" es uno que se hace al recombinar ácidos nucleicos, por. ejemplo, durante la clonación, . transposición de ADN u . otros procedimientos biológicos moleculares, bien conocidos. Los ejemplos de tales procedimientos biológicos moleculares se encuentran en Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual.. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y(1982). Una "molécula de ADN recombinante," está compuesta de segmentos de ADN unidos juntos por' medio de tales técnicas biológicas moleculares. El término . "proteína recombinante" o "polipéptido recombinante" como se usa en la presente se refiere a una proteína molécula que se expresa usando una molécula de. ADN recombinante. Una "célula hospedera recombinante" es una . célula que contiene y/o expresa un ácido nucleico recombinante.

El término "polinucleótido" o "ácido nucleico" incluye tanto polímeros de nucleótido de hebra sencilla como hebra doble que contienen dos ' o más residuos de nucleótido... Los residuos de nucleótido que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Las modificaciones incluyen modificaciones base tales como derivados de bromouridina e inosina, modificaciones de ribosa tales como 2' , 3' -didesoxiribosa, y modificaciones de ligadura de internucleótido tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, ' fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato .

El término "oligonucleótido" significa un polinucleótido que comprende 200 o menos residuos de nucleótido. En algunas modalidades, los oligonucleótidos . tienen de 10 hasta 60 bases de longitud. En otras .· modalidades, los oligonucleótidos tienen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 hasta .40 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser de hebra sencilla o hebra doble, por ejemplo, para uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos de sentido o antisentido. Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta, que incluye una etiqueta isotópica (por ejemplo, 125I, 14C, 13G, 5S, 3H, 2H, 13N, 15N, 180, 170, etc. ) , para facilidad de cuantificación o detección, una etiqueta fluorescente, un hapteno o una etiqueta antigénica, para ensayos de detección. Los oligonucleótidos pueden usarse, por ejemplo, ..como cebadores PCR, cebadores de clonación o sondas de hibridación.

Una "secuencia de polinucleótido" o "secuencia de nucleótido" o "secuencia de ácido nucleico", como se usa intercambiablemente en la ' presente, es la secuencia primaria de los residuos de nucleótido en un polinucleótido, incluyendo de un oligonucleótido, un ADN, y ARN, un ácido nucleico, o una cadena de caracteres que representa la secuencia primaria de residuos de nucleótido, dependiendo del contexto. De cualquier secuencia de polinucleótido especifica, ya sea el ácido nucleico dado o la secuencia de polinucleótido complementaria puede determinarse. Incluidos son ADN o ARN de origen genómico o sintético que puede ser de hebra sencilla o doble, y representa la hebra de . sentido o antisentido. A menos que se especifique de otra manera, el extremo del lado izquierdo de cualquier secuencia de polinucleótido de hebra sencilla discutido en la presente es el extremo 5' ; la dirección del lado izquierdo- de secuencias de polinucleótido de · hebra doble, está referida como la dirección 5'. La. dirección de adición 5' hasta 3' de los transcriptos de ARN naciente está . referida como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tiene la misma secuencia como el transcripto de ARN que son 5' para el extremo 5' del transcripto de ARN . están referidas como "secuencias corriente arriba;'" regiones de secuencia en la hebra de ADN que tiene la misma secuencia como el transcripto de ARN que son 3' para el extremo 3' del transcripto de ARN están referidas como "secuencias corriente abajo." Como se usa en la presente, una "molécula de. ácido nucleico aislado" o "secuencia de ácido nucleico aislado" es una molécula de ácido nucleico que es ya sea (1) identificada y separada de al menos una molécula de ácido, nucleico contaminante con la cual se' asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico o (2) clonada, amplificada, etiquetada, o de otra manera distinguida de los ácidos nucleicos de fondo de manera que la secuencia del ácido nucleico de interés puede determinarse. Una molécula de ácido nucleico aislado es diferente en .la forma o ajuste en el cual se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislado¦ incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que expresan ordinariamente un polipéptido (por ejemplo, un oligopéptido o anticuerpo) donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosomal diferente de aquella de las ' células naturales .

Como se usa en la presente, los términos "codificación de la molécula de ácido nucleico," "codificación de la secuencia de ADN," y "codificación de ADN" se refieren al orden o secuencia ' de los desoxiribonucleótidos a lo largo de una hebra de ácido desoxiribonucleico . El orden de estos desoxiribonucleótidos determina el orden de los ribonucleótidos a lo largo de la cadena mARN, y también determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena de polipéptido (proteina) . La secuencia de ADN , de esta manera se codifica para la secuencia de ARN y para la secuencia de aminoácido. .

El término "gen" se usa ampliamente para referir a cualquier ácido nucleico asociado, con una función biológica. Los genes típicamente incluyen secuencias de codificación y/o las secuencias reguladoras requeridas para expresión de tales secuencias de codificación. El término "gen" aplica a una secuencia recombinante o genómica específica, así como a un cADN o mARN codificado por tal secuencia. Un "gen de fusión" contiene una región . de codificación que codifica un polipéptido con porciones de diferentes proteínas que. no se encuentran naturalmente juntas, p no se encuentran naturalmente juntas en .la misma secuencia ya que están presentes en la proteína de fusión codificada (esto es, una proteína quimérica). Los genes también incluyen segmentos de ácido nucleico no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Las secuencias reguladoras no expresadas incluyen elementos de control transcripcionales para las cuales las proteínas reguladoras, tales como factores de transcripción, enlace, resultan en la transcripción de secuencias adyacentes . o próximas.

"Expresión de un gen" o "expresión de un ácido nucleico" significa transcripción de ADN en ARN ( opc.ionalmente incluyendo modificación del ARN, . por ejemplo, . empalme) , traducción de ARN en un polipéptido (posiblemente incluyendo modificación post-traduccional posterior del polipéptido) , o tanto transcripción como traducción, como se indica por el contexto.

Como se usa en . la presente el término "región de codificación" o "secuencia de codificación" cuando se usa en referencia a un gen estructural se refiere a las secuencias de nucleótido que codifican los aminoácidos encontrados en el polipéptido naciente como un resultado de traducción de una molécula de mARM. La región de codificación se enlaza, en eucariotas, en el lado 5' por el triplete de nucleótido "ATG" que codifica la metionina iniciadora y en el lado 3' por uno de los tres tripletes que especifica codones de paro (esto es, TAA, TAG, TGA) . ¦ El término "secuencia de control" o . "señal de control" se refiere a una secuencia de polinucleótido que puede, en una célula hospedera particular, afectar la expresión y procesamiento de secuencias de codificación a las cuales se liga. La naturaleza de tales secuencias de control puede depender del organismo hospedero. En modalidades particulares, las secuencias de control para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de enlace ribosomal, y una secuencia de terminación de transcripción. Las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para los factores de transcripción, elementos o secuencias potenciadores de transcripción, sitios de poliadenilación, y secuencias de terminación de transcripción. Las secuencias de control pueden incluir secuencias líderes y/o secuencias compañeras de fusión. Los promotores y potenciadores consisten de configuraciones cortas de ADN que interactúan específicamente con proteínas celulares involucradas en la transcripción (Maniatis, et al., Science 236: 1237 (1987)). Los elementos promotor-es y potenciadores se han aislado de una variedad de fuentes eucariotas incluyendo genes en células de levadura, insecto y mamíferas y virus (elementos de control análogos, esto es, promotores, también se encuentran en procariotas) . La selección de un potenciador y promotor particular depende de qué tipo celular es para usarse para expresar la proteína de. interés. Algunos potenciadores y promotores eucariotas tienen un intervalo hospedero amplio mientras que otros son funcionales en un subconjunto limitado de tipos celulares (para revisión ver Voss, et al, Trends . Biochem. Sci., 11:287 (1986) y Maniatis, ' et al, Science 236: 1237 (1987)).

El término "vector" significa cualquier molécula , o entidad (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) usado para transferir la información de codificación de proteina en una . célula hospedera.

El término "vector de expresión" o "constructo de expresión" como se usa en la presente se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de codificación deseada y secuencias de control de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de .la secuencia de codificación ligada operablemente en una célula hospedera particular. Un vector de expresión puede incluir, pero no se limita a, secuencias que afectan o controlan la transcripción, traducción, y, si se presentan intrones, afectar el empalme de ARN de una región de codificación ligada operablemente a. esta. Las secuencias de ácido nucleico necesarias para expresión en procariotas incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio enlazado a ribosoma y posiblemente otras secuencias. Las células eucariotas se conocen para utilizar promotores, potenciadores , y señales de terminación y poliadenilación .

Una secuencia de péptido de señal secretora también puede, opcionalmente , codificarse por el vector de expresión, ligado operablemente a la secuencia de codificación de interés, de manera que el polipéptido expresado puede secretarse por la célula hospedera recombinante, para . aislamiento más fácil del polipéptido de interés de la célula, . si se desea. Tales técnicas son bien conocidas en el arte. (Por ejemplo, Goodey, Andrew R. ; et al, Peptide and DNA sequences, Patente de E.U.A. No. 5,302,697; einer et al, Compositions and methods for protein secretion, Patente de. E.U.A. No.. 6,022,952 y Patente de E.U.A. No. 6,335,178; Uemura et. al, Protein expression vector and utilization thereof, Patente de E.U.A. No. 7,029,909; Rubén et al, 27 human secreted proteins, US 2003/0104400 Al) . · Los términos "en combinación operable", . "en orden operable" y "ligado operablemente" como se usa en la presente se refiere a la ligadura de secuencias de ácido nucleico de tal manera que una molécula de ácido nucleico . capaz de dirigir la transcripción de un gen dado y/o la síntesis de una molécula de proteína desea se produce. El término también se refiere a la ligadura de secuencia de aminoácidos de tal manera que una proteína funcional se produce. Por ejemplo, una secuencia de · control en un vector que se "liga operablemente" a una secuencia de codificación de proteína se liga a esta de manera que la expresión de la secuencia de codificación proteina se logra bajo condiciones compatibles con la actividad transcripcional . de las secuencias de control .

El término "célula hospedera" significa una célula que ha sido transformada, o es capaz de transformarse, con un ácido nucleico y por ello expresa un gen de interés. El término incluye la progenie de la. célula precursora, si o rio la progenie es idéntica en morfología, o en fabricación genética para la célula precursora original, siempre que el gen de . interés esté presénte. Cualquiera de un¦ número ·. grande de células hospederas bien conocidas y disponibles puede usarse .en la práctica de esta invención. La selección de un hospedero particular es dependiente de un número de factores reconocidos por la técnica; Estos incluyen, , por ejemplo, compatibilidad con el vector de expresión elegido, toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de. ADN, tasa de transformación, facilidad de recuperación de los péptidos, características de expresión, bio-seguridad y costos. Un equilibrio de estos factores debe atacarse con el entendimiento de que no todos los hospederos pueden ser igualmente efectivos para la expresión de una secuencia de ADN particular. Dentro de estos lineamientos generales, las células hospederas microbianas útiles en el cultivo incluyen bacterias (tales como especie Escherichia coli),- levadura (tal como especie Saccharomyces ) y otras células de hongos, células de insecto, células de planta, células mamiferas (incluyendo humanas) , por ejemplo, células CHO y células HEK-293. Las modificaciones pueden hacerse en el nivel de ADN, también. La secuencia de ADN que codifica el péptido puede cambiarse a codones más compatibles con la célula hospedera elegida. Para E. coli, los codones. optimizados se conocen en el arte. Los codones pueden sustituirse para . eliminar los sitios de restricción o para incluir sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar en el procesamiento del ADN en la célula hospedera seleccionada. Después, el hospedero transformado se cultiva y purifica. Las células hospederas pueden cultivarse bajo condiciones de fermentación convencionales de manera que los compuestos deseados se expresan. Tales condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica.

El término "transíección" significa la absorción de ADN exterior o exógeno por una célula, y una célula se ha "transíectado" cuando el ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Un número de técnicas de transfección son bien conocidas en la técnica y se describen en la presente. Ver, por ejemplo, Graham et al, 1973, Virology 52:456; Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13:197.. Tales técnicas pueden usarse para introducir una o más porciones de AD exógeno en células hospederas adecuadas.

El término "transformación" se refiere a¦ un cambio en las características genéticas de la célula, y üna célula se ha transformado cuando se ha modificado para contener nuevo ADN o ARN . Por ejemplo, una célula se transforma donde se modifica genéticamente de su estado nativo al introducir nuevo material genético por medio de transfección, transducción, u otras técnicas. Después de la transfección o transducción, el ADN transformado .puede recombinarse con aquel de la célula al integrarse físicamente en un cromosoma de la célula, o puede mantenerse transitoriamente como un elemento episomal sin replicarse, . o puede replicarse independientemente como un plásmido. Una célula se. considera que se ha "transformado establemente" cuando el ADN transformado se replica con 1.a división , de la célula.

Un "dominio" o "región" (usado intercambiablemente en la presente) de una proteína es cualquier porción de la proteína completa, hasta e incluyendo la proteína completa, pero típicamente que comprende menos de. la proteína completa. Un dominio puede, pero' no necesariamente, plegarse independientemente del resto .de la. cadena de, proteína y/o correlacionarse con una ubicación o función biológica, bioquímica, o estructural particular (por ejemplo, un dominio enlazado al ligando, o un dominio citosólico, de transmembrana o extracelular ) .

"Mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y de zoológico, de deportes, o animales de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, ratas, ratones, monos, etc.

El término "que se presenta naturalmente" como se usa a lo largo de la especificación en conexión con materiales biológicos tales como polipéptidos , ácido nucleicos, células hospederas, y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza.

El término "anticuerpo", o intercambiablemente "Ab", se usa en el sentido ¦ más amplio e incluye anticuerpos completamente ensamblados, anticuerpos monóclonales (incluyendo anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos) , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos ) , y fragmentos de anticuerpo que pueden enlazar el antígeno (por ejemplo, Fab, Fab' , . F(ab')2, Fv, anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos), que comprenden regiones que determinan la complementariedad (CDRs) de los anteriores siempre y . cuando exhiban la actividad biológica deseada. Los multímeros o agregados de moléculas intactas y/o fragmentos, que incluyen anticuerpos químicamente derivados, se contemplan.. Los anticuerpos de cualquier clase o subclase de isotipo, que incluyen IgG, IgM, IgD, IgA, e IgE, ' IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2, o cualquier alotipo, se contemplan. Los isotipos diferentes tienen funciones efectoras diferentes; por ejemplo, isotipos IgGl e IgG3 tienen actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . De esta manera en algunas modalidades del ensayo el método inventivo in vitro, el anticuerpo objetivo IgG es un anticuerpo IgGl (por ejemplo, KW-0761 (también conocido como "mogamulizumab" o "AMG 761"), rituximab, o trastuzumab) o IgG3.

El término "proteína enlazada al antígeno" (ABP) incluye anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, como se define arriba, y pép.tidós recombinantes ü otros compuestos que contienen secuencias derivadas de CDRs que tienen las propiedades de enlace al antígeno deseadas.

Las interacciones de anticuerpo-antígeno pueden caracterizarse por la constante de tasa de asociación en _1s~ 1 (ka), o la constante de tasa de disociación en s"1 (kd), .o alternativamente la constante de equilibrio de disociación en M (KD) . En general, una proteína enlazada al antígeno, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, "enlaza específicamente" a un antígeno cuando tiene una afinidad de enlace significativamente superior para, y por consiguiente ¦ es capaz de distinguir, que el antígeno, comparado con su afinidad para otras proteínas no relacionadas, .' bajo condiciones de ensayo de enlace similares. Son características deseables- tales como afinidad de enlace como se mide por KD (constante de equilibrio de disociación) en el intervalo de 1CT9 M o inferior, en el intervalo: que va. hasta 10"12 M o inferior (valores inferiores que indican afinidad de enlace superior) , o avidez como se mide por kd (constante de tasa de disociación) en el intervalo de 10~4 s_1.o inferior, o en el intervalo que va hasta 10~10 s"1 o inferior. Típicamente, una proteína enlazada al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) es decir que "enlaza específicamente" su antígeno objetivo cuando la constante de equilibrio de disociación (KD) es. <10~8 . La proteína enlazada al antígeno (por ejemplo, anticuerpo ..o frágmento -de anticuerpo) enlaza específicamente al antígeno con "afinidad alta" cuando la KD es <5x 1-0"9 M, y con "afinidad muy alta" cuando la KD es <5x 10"10 M. En. una modalidad, la proteína enlazada al antígeno (por ejemplo, anticuerpos) . se enlazará a una KD de entre alrededor de 10~8 M y 10"10 M, y aún en otra modalidad los anticuerpos se enlazarán a una KD=5X 10~9 . las constantes de tasa de asociación, constantes de tasa de disociación, o constantes de equilibrio dé disociación pueden determinarse fácilmente usando técnicas de análisis cinético tales como resonancia de plasmón de superficie (BIAcore®; por ejemplo, Fischer et al, A peptide-immunoglobulin-eonjugate, O 2007/045463 Al, Ejemplo 10, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) , o KinExA usando procedimientos generales resumidos por el fabricante u otros métodos conocidos en la técnica. Los datos cinéticos obtenidos por BIAcore®. o KinExA pueden analizarse por métodos descritos por el fabricante.

"Región enlazada al antigeno" o "sitio enlazado al antigeno" significa una porción de una proteina enlazada al antigeno (por ejemplo, proteina de anticuerpo o fragmento de anticuerpo) , que específicamente enlaza un antígeno específico. Por ejemplo, tal porción de un anticuerpo que contiene los residuos de aminoácido que interactúan con un antígeno y confieren en el anticuerpo su especificidad y afinidad para el antígeno está referida como "región enlazada al antigeno." Una región enlazada al antígeno típicamente incluye una o más "regiones enlazadas complementarias" ("CDRs") . Ciertas regiones enlazadas al antígeno también incluyen una o más. regiones de "estructura" ("FRs") . Una "CDR" es una secuencia de aminoácido que contribuye a la afinidad y especificidad de enlace al antigeno. Las regiones de "estructura" pueden ayudar al . mantenimiento de la conformación apropiada, de las CDRs para promover el .enlace entre la región enlazada al antigeno y un antigeno.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado de uno o más componentes de su ambiente natural o de un medio de cultivo en el cual se ha secretado por una célula producida. Los componentes "contaminantes" dé su medio o ambiente natural son materiales que. deben interferir con usos terapéuticos o de diagnóstico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otras soluciones prote.ináceas o no proteináceas . En algunas modalidades, el anticuerpo se purificará (1) a mayor que 95% en peso, de anticuerpo., y lo más preferiblemente más de 99% en peso, o (2) para homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reducidas o no reducidas, opcionalmente usando una cepa, por ejemplo, tinción de plata o azul Coomassie. El anticuerpo que se presenta naturalmente aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no se presentará. Típicamente, sin embargo,- el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación..

El término "anticuerpo monoclonal" como se .usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para mutaciones que se presentan naturalmente posibles que pueden presentarse en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, que se dirigen contra un epítopo o sitio antigénico individual, en contraste a las preparaciones de anticuerpo policlonal que típicamente incluyen . diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopos. Los ejemplos no limitantes de anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos de murino, conejo, rata, pollo, quiméricos, humanizados, o humanos, anticuerpos ¦ completamente ensamblados, anticuerpos multiespecíficos (que incluyen anticuerpos biespecí fieos ) , fragmentos de anticuerpo, que pueden enlazar un antígeno (que incluyen, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos), maxicuerpos, nanocuerpos, y péptidos recombinantes que comprenden CDRs de los anteriores siempre y cuando exhiben la actividad biológica deseada, o variantes o derivados de los mismos.

El modificador, "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo ya que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no es para construirse como producción requerida del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usarse de acuerdo con . la presente invención pueden hacerse por el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., Nature, 256:495

[1975], o pueden, hacerse por métodos de ADN recombinantes (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de las colecciones de anticuerpo de fago usando las técnicas descritas en Clackson et al, Nature, 352 : 624-628

[1991] y Marks et al, ÜV Mol. Biol, .222:581-597 (1991), por ejemplo.

El término "inmunoglobulina" abarca anticuerpos completos que comprenden dos cadenas pesadas dimerizadas (HC) , cada una ligada covalentemente a una cadena ligera (LC) ; una cadena pesada de inmunoglobulina no dimerizada sencilla y cadena ligera ligada covalentemente (HC + LC) , o una inmunoglobulina quimérica (cadena ligera + cadena pesada) -heterotrimero Fe (un "hemicuerpo" asi llamado).

Un "anticuerpo" es una glicoproteína tetramérica. En un anticuerpo que se presenta naturalmente, cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada par que tiene una cadena "ligera" de alrededor de 220 aminoácidos (alrededor de 25 kDa) y una cadena "pesada" de alrededor de 440. aminoácidos (alrededor de 50-70. kDa). La porción de terminal amino de cada cadena incluye una región "variable" ("V") de alrededor de 100 hasta 110 o más aminoácidos principalmente responsables para . el reconocimiento de antigeno. La porción de terminal carboxi de cada cadena define una región constante principalmente responsable para función efectora. La región variable difiere entre anticuerpos diferentes. La región constante es la misma entre anticuerpos diferentes. Dentro de la región variable de cada cadena ligera o pesada, existen tres, subregiones hipervariables que ayudan a determinar la especificidad del anticuerpo para el antigeno. Los residuos de dominio variable entre las regiones hipervariables se nombran los residuos de estructura y generalmente son algo homólogos entre los anticuerpos diferentes. Las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases dependiendo de la secuencia de aminoácido del dominio constante de sus cadenas pesadas. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa. (?) y lambda (?) . Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de alrededor de 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada también incluye una región "D" de alrededor de 10 o más aminoácidos. Ver generalmente, Fundamental Immunology, Capitulo 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, ?.?·. (1989)). Dentro del alcance de la invención,¦ un "anticuerpo" también abarca un anticuerpo hecho recombinantemente, y anticuerpos que son carentes de glicosilación .

El término "cadena ligera" o "cadena, ligera de inmunoglobulina" incluyen una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de . la misma que tienen secuencia de región variable suficiente para conferir la especificidad de enlace. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable, VL, y un dominio de región constante, CL. El. dominio de región variable de la cadena ligera está en la terminal amino del polipéptido. Las cadenas ligeras incluyen cadenas kappa y cadenas lambda.

El término "cadena pesada" o "cadena pesada de inmunoglobulina" incluyen cadena pesada de longitud completa y fragmentos de la misma que tienen secuencia, de región variable suficiente para conferir la especificidad de enlace. Una cadena pesada de longitud completa, incluye un dominio de región variable, VH, y tres dominios dé región constante, CH1, CH2, y CH3. El VH dominio está en la terminal amino del polipéptido, y los dominios CH están en la terminal carboxilo, con la CH3 que está más cercana a la terminal carboxi del polipéptido. Las cadenas pesadas se clasifican como mu (µ) , delta . (?), gamma (?) , alfa (a), y epsilon (e), y definen el isotipo de. anticuerpo . como IgM, IgD, IgG, IgA, y IgE, respectivamente. En modalidades separadas de la invención, las cadenas pesadas pueden ser . de cualquier isotipo, incluyendo IgG (incluyendo subtipos IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluyendo subtipos IgAl e IgA2.) , IgM e IgE. Varias de estas pueden dividirse además en subclases o isotipos, por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Los isotipos IgG diferentes pueden tener diferentes funciones efectoras (mediadas por la región Fe) , tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente' del complemento (CDC). En la ADCC, la región Fe de un anticuerpo enlaza a los receptores Fe (FcyRs) en la superficie de las células efectoras inmunitarias tales como macrófagos' y exterminadores naturales, llevando a la fagocitosis o lisis de las células dirigidas. En la CDC, los anticuerpos exterminan las células dirigidas al desencadenar la cascada de complemento en la superficie celular.

Una "región Fe", o usado ' intercambiablemente en la presente, "dominio Fe" o "dominio Fe de inmunoglobulina" , contiene dos fragmentos de cadena pesada, que en un anticuerpo completo comprende, los dominios CR1 y CH2 del anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos por dos o más enlaces de disulfuro y por interacciones hidrofóbicas de los dominios CH3.

El término "epitopo enlazado al receptor recuperado" se refiere a un epitopo de la región Fe de una molécula IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable para incrementar la vida , media del suero in vivo de la molécula IgG.

Los "alotipos". son variaciones en las secuencias de anticuerpo, a menudo en la región ' constante, que pueden ser inmunogénicas y se codifican por alelos específicos en humanos. Los alotipos se han identificado por cinco de los genes IGHC humanos, los genes IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHA2 e IGHE, y se designan como alotipos Glm, G2m, G3m, A2m, y Em, respectivamente. Al menos 18 alotipos Gm se conocen: nGlm(l), nGlm(2), Glm (1, 2, 3, 17) o Glm (a, x, f, z) , G2m (23) o G2m (n) , G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24,.26, 27, 28) o G3m (bl, c3, b5, bO, b3, b4, s, t, gl, c5, u, v, g5) . Existen dos alotipos A2m A2m(l) y A2m(2).

Para una descripción detallada de la estructura y generación de anticuerpos, ver Roth, D.B., and Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998), en la presente incorporada como referencia en su totalidad. Brevemente, el proceso para generar ADN que codifica las secuencias de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada ocurre principalmente al desarrollar células B. Antes de la reconfiguración y unión de varios segmentos del gen de inmunoglobulina, los segmentos' del gen V, D, J y constantes (C) se encuentran generalmente en proximidad relativamente cercana en un cromosoma sencillo. Durante la diferenciación de célula B, uno de cada uno de los miembros de la familia apropiados de los segmentos del . gen, V, D, J (o sólo V y J en el cado de genes de cadena ligera) se recombinan para formar regiones variables funcionalmente reconfiguradas de los genes de inmunoglobulina ligeros y pesados. Este proceso de reconfiguración del segmento de gen parece ser secuencial. Primero, se hacen uniones de cadena pesada D hasta J, seguido por uniones de cadena pesada V hasta DJ y uniones de cadena ligera V hasta J. además de la reconfiguración de los segmentos V, D y J, la diversidad adicional se genera en el repertorio primario de las cadena ligeras y pesadas de inmunoglobulina a manera de recombinación variable. en las ubicaciones donde los segmentos V y J en la cadena ligera se unen y donde los segmentos D y J de la cadena pesada se unen. Tal variación en la cadena ligera típicamente ocurre ¦ dentro del último codón del segmento de gen V y el primer codón del segmento J. la imprecisión similar en la unión ocurre en el cromosoma de cadena pesada entre los segmentos D y JH y puede extenderse sobre tanto como 10 nucleótidos. Adicionalmente, varios nucleótidos pueden insertarse entre los segmentos del gen D y JH y entre el VH y¦ D que no se codifican por ADN genómico. La adición de estos nucleótidos se conoce como diversidad de región N. El efecto puro de tales .reconfiguraciones en los segmentos del gen de región variable y la recombinación variable que puede ocurrir durante tal unión es la producción de un repertorio de anticuerpo primario.

El término región "hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables para enlace al antigeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácido de una región que determina la complementariedad o CDR [esto es, residuos 24-34 (LI), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (HI), 50-65. (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada como se describe por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. . Public , Health Service, National Institutes of . Health, Bethesda, Md. (1991)]. Aún una CDR sencilla puede reconocer y enlazar el antigeno, aunque con una afinidad inferior que el sitio enlazado al antigeno completo que contiene todas de las CDRs. En un anticuerpo típico, las CDRs se incrustan dentro de una estructura en la región variable de cadena ligera y pesada donde constituyen las regiones responsables . para el reconocimiento y enlace del antígeno. Una región variable comprende al menos tres CDRs de cadena ligera y pesada, ver, supra (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; ver también Chothia and. Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al, 1989, Nature 342 : 877-883) , dentro de una región de estructura . (designada regiones de estructura 1-4, FR1, FR2, FR3, y FR , por Kabat et al., 1991, supra; también ver Chothia and Lesk, 1987, supra) .

Una definición, alternativa de. residuos de un "rizo" hipervariable se describe por Chothia et al, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) como residuos 26-32 (LI), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (HI), 53-55 (H2) y 96-101 ,(H3) en el dominio variable de cadena pesada.

Residuos de "Estructura" o "FR" son aquellos residuos de región variable diferentes de los residuos de región hipervariable.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa intacta, preferiblemente la región variable o enlace al antígeno del anticuerpo intacto. Los ejemplos, de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos .Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos ; anticuerpos lineales (Zapata et al, . Protein Eng. ,8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas . de anticuerpo de cadena, sencilla; y anticuerpos multiespecificos formados ¦ de fragmentos de anticuerpo.

La digestión de papaina de los anticuerpos produce dos fragmentos enlazados al antígeno idénticos, nombrados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio enlazado al antígeno sencillo, y un fragmento "Fe" residual que contiene, la región constante. El fragmento Fab contiene todo del dominio variable, asi como el dominio constante de la cadena ligera. y el primer dominio constante (CH.l) de la cadena pesada. El fragmento Fe exhibe carbohidratos y es responsable de muchas funciones efectoras del anticuerpo (tales como receptores celulares y complemento de enlace), que distingue una clase de anticuerpo de otro.

El tratamiento de pepsina proporciona un fragmento F(ab')2 que tiene dos fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" que comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios se presentan en una cadena de polipéptido sencilla. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la inclusión de unos pocos residuos adicionales en la terminal carboxi del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteinas de la región de bisagra del anticuerpo. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende además una ligadura de polipéptido entre los dominios VH y VL.que permiten él F para formar la estructura deseada para el enlace al antigeno. Para una revisión de scFv ver Pluckthun in The Pharmacology of onoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds . , Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) .

Un "fragmento Fab" está compuesto de una cadena ligera y las regiones CH1. y variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede forma un enlacé dé disulfuro con otra molécula de cadena pesada.

Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio CH1 y también la región entre los dominios CH1 y CH2, de manera que un enlace de disulfuro de intercadená puede formarse entre las dos . cadenas pesadas de dos fraqmentos Fab' para formar una molécula F(ab')2- Un "fragmento F(ab' ) 2" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios CH1 y CH2, de manera que un enlace de disulfuro de intercadená se forma entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab' ) 2 de esta manera está compuesto de dos fragmentos Fab' que se mantienen juntos por un enlace de disulfuro entre las dos cadenas pesadas.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de enlace y reconocimiento del antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena ligera y pesada en asociación no covalente, hermética. Es en esta configuración que las tres CDRs de; cada dominio variable interactúan para definir un sitio enlazado al antígeno en la superficie del dímero VH VL.. Un dominio variable sencillo " (ó la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs especificas para un antigeno) tiene la capacidad de reconocer y enlazar el antigeno, aunque en una afinidad inferior que el sitio de enlace completo.

Los "anticuerpos de cadena sencilla" son moléculas Fv en las cuales las regiones variables de cadena ligera y pesada se han conectado por una ligadura, flexible para formar una cadena de polipéptido sencillo, que forma una región enlazada al antigeno. Los anticuerpos de cadena sencilla se discuten en detalle en la Publicación de Solicitud de Patente International No. WO 88/01649 y Patente de E.U.Á. No. 4,946,778 y No. 5,260,203, las descripciones de las cuales se incorporan como referencia en sus totalidades.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios se presentan en una cadena de polipéptido sencillo, y opcionalmente comprenden una ligadura de polipéptido entre los dominios VH y VL que permiten el Fv para formar la estructura . deseada para el enlace al antigeno (Bird et al, Science '242:243-426, 1988, and Huston et al, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 85:5879-5883, 1988). Un . fragmento "Fd" consiste de los dominios VH y CH1 · El término . "diacuerpos" se refiere a .fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios enlazados al antigeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH VL) . Al usar una ligadura que es demasiado corta para permitir el apareamiento entre los dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los. dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios enlazados al antigeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene sólo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones VH se unen covalentemente 'con una ligadura de péptido para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones VH de un anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigir los mismos o diferentes antigenos'.

El término "antigeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de enlazarse por un agente de enlace selectivo, tal como una proteina enlazada al antigeno (incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo), y adic'ionalmente capaz de usarse en un animal . para producir anticuerpos capaces de enlace a tal antigeno. Un antigeno puede poseer uno o más epítopos que son capaces de interactuar con diferentes proteínas enlazadas al antigeno, por ejemplo, anticuerpos .

El término "epítopo" es la porción de una molécula que se enlaza por una proteína enlazada al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) . El término incluye cualquier determinante capaz de enlazar específicamente a una proteína enlazada al antígeno, por ejemplo, un anticuerpo. Un epítopo puede ser contiguo o no contiguo (por ejemplo, en un polipéptido de cadena sencilla, residuos de aminoácido que no- son . contiguos uno con el otro en la secuencia de polipéptido pero que dentro del contexto de la molécula se enlazan por el anticuerpo. En ciertas modalidades, los epítopos pueden ser miméticos en que comprenden una estructura tridimensional que es similar a un epítopo usado para generar la proteína enlazada al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo), aún comprende ninguno o sólo algunos de los. residuos de aminoácido encontrados en tal epítopo usado para generar la proteína enlazada al antígeno. Más a menudo, los epítopos residen en proteínas, pero en algunos casos pueden residir en otros tipos de moléculas, tales como ácidos nucleicos. Los determinantes de epítopo pueden incluir agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos de fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensaionales específicas, y/o características de carga específicas. Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno objetivo particular preferencialmente reconocerán un epítopo en el antígeno objetivo en una mezcla de complejo de las proteínas y/o macromoléculas .

El término "identidad" se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptido o dos o más moléculas de ácido nucleico, como se determina por la alineación en sus pares base y comparación de las secuencias. "Porcentaje de identidad" significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula con base en el tamaño de las más pequeñas de las moléculas que se comparan. Para estos cálculos, los espacios en- las alineaciones (si hubiera) deben dirigirse por un programa de computadora o modelo matemático particular (esto es, un "algoritmo") . Los métodos que pueden usarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados en sus pares bases incluyen aquellos descritos en Compútational Molecular Biology, (Lesk, A. . M. , ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W. , ed. ) , 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence. Data, Parte .1, (Griffin, A. M . , y Griffin, H. G., eds . ) , 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: . Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. y Deveréux, J., eds..), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48: 1073. Por ejemplo, la identidad de secuencia puede determinarse por métodos estándares que se usan comúnmente para compara la similitud en la posición de los aminoácidos dé dos polipéptidos . Usando un programa de computadora tal como BLAST o FASTA, dos polipéptido o dos secuencias de polinucleótido se alinean en sus pares base para coincidencia óptima de sus residuos respectivos (ya sea a lo largo de la longitud completa .de una o ambas secuencias, o a lo largo de una porción pre-determinada de una o ambas secuencias) . Los programas proporcionan una penalización de abertura por omisión · y una penalización de espacio por omisión, y una matriz de registro tal como PAM . 250 [una matriz de registro estándar; ver Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, sup. 3 (1978)] puede usarse en conjunto con el programa de computadora. Por ejemplo, el porcentaje de identidad luego puede calcularse como: el número total de coincidencias idénticas multiplicados por 100 y luego divididos por la suma de la longitud de la secuencia más larga dentro del intervalo de coincidencia y el número, de espacios introducidos en las secuencias más largas con objeto de alinear las dos secuencias. Al calcular el porcentaje de identidad, las secuencias que se comparan se alinean en sus pares de bases en una forma que da la coincidencia más larga entre las secuencias .

El paquete de programa GCG es un programa de computadora que puede usarse para determinar el porcentaje de identidad, cuyo paquete incluye GAP. (Devereux et al, 1984, Nucí. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) . El GAP del algoritmo de computadora se usa para alinear los dos polipéptidos o dos polinucleótidos para los cuales el porcentaje de . identidad de secuencia es para determinarse. Las secuencias se alinean en sus pares de bases para coincidencia óptima de sus aminoácidos o nucleótidos respectivos (el "intervalo de coincidencia", como se determina . por el algoritmo) . Una penalización de abertura de espacio (que se calcula como 3x la diagonal promedio, en- donde la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la "diagonal" es el registro o número asignado a cada coincidencia de aminoácido perfecto por la matriz de comparación particular) y una penalización de extensión de espacio (que es üsualmente 1/10 veces la penalización de abertura del espacio) , . asi como una matriz de comparación tal como PA 250 o BLOSUM 62 se usan en conjunto con el algoritmo. En ciertas modalidades, una matriz de comparación estándar (ver, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Nati.. Acad. Sci. U.S. A. 89: 10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrix) también se usa por el algoritmo.

Los parámetros . recomendados para determinar el porcentaje de identidad para los polipéptidos o secuencias de nucleótido usando el programa GAP incluyen los siguientes: Algoritmo:. Needleman et al, 1970, J. Mol. Biol. 48:443- 453; Matriz de comparación: BLOSUM- 62 de Henikoff et al, 1992, supra; Penalización de espacio: 12 (pero sin penalización para espacios finales) Penalización de longitud de espacio: 4 Umbral de similitud: 0 Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencia de aminoácidos pueden resultar en la coincidencia de sólo una región corta de las dos secuencias, y esta región alineada pequeña puede tener muy alta identidad de secuencia aunque no existe relación importante entre las dos secuencias de longitud completa. En consecuencia, el método de alineación seleccionado (programa GAP) puede ajustarse si asi se desea para resultar en una alineación que abarca al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido. objetivo.

El término "modificación" cuando se usa en. conexión con los polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, uno o más cambios de aminoácido (incluyendo sustituciones, inserciones o eliminaciones); modificaciones químicas; modificación covalente por conjugación a agentes terapéuticos o de diagnóstico; etiquetado' (por ejemplo, con etiqueta fluorescente, etiqueta electroquimioluminiscente , radionúclido u otra etiqueta isotópica, o varias, enzimas); unión del polímero covalente tal como PEGilación (derivación con polietilen glicol) 'e inserción o sustitución por síntesis química de aminoácidos no naturales. Los . polipéptidos modificados deben mantener las propiedades de enlace de moléculas no identificadas como se usa en el método inventivo.

"Conjugado" significa que al menos dos . porciones químicas se ligan covalentemente, o. enlazan una con la otra, ya sea directamente, . u opcionalmente, por medio de una porción de ligadura de p.eptidilo o no peptidilo que por sí misma se liga covalentemente a ambas de .las porciones. Por ejemplo, la ligadura 'covalente puede ser por medio de un residuo de aminoácido de un péptido o proteína, incluyendo por medio de un grupo amino alfa, o por medio de una cadena lateral.

"Bajo condiciones fisiológicas" con respecto a las soluciones amortiguadoras incubadas o reactivos del método de ensayo inventivo significa incubación bajo condiciones de temperatura, pH, y resistencia iónica, que permite una reacción bioquímica, tal como una reacción de enlace no covalente, para ocurrir. Típicamente, la temperatura es a temperatura ambiente o normal hasta alrededor de 37 °C y en pH 6.5-7.5.

"Bloqueado" significa pre-incubado con solución amortiguadora de ensayo, por ejemplo, para el propósito de minimizar enlace no específico para las superficies del pozo por los componentes de la mezcla de reacción cuándo la mezcla de reacción se agrega después.

Una "mezcla de reacción" es una mezcla acuosa que contiene todos los reactivos y factores necesarios, que bajo condiciones fisiológicas de ' incubación, permite que ocurra una reacción bioquímica in vitro de interés, tal como uña reacción enlazada no covalente.

"Avidina" es una proteína enlazada a biotina tetramérica, producida naturalmente en los oviductos de aves, reptiles y anfibios y típicamente depositados en el blanco de sus huevos, o una versión producida sintéticamente o recombinantemente de la misma, y/o una forma, monomérica o multimérica (por ejemplo, dimérica, trimérica, etc.) de los mismos. En su forma glicosilada, tetramérica, la avidina se estima para estar entre 66-69 kDa de tamaño y puede enlazar hasta cuatro moléculas de biotina . simultáneamente con. un grado alto de afinidad y especificidad. (Korpel.a, J., Avidin, a high affinity biotin-binding protein as a tool and subject of biological research. Med. Bio. 62:5-26 (1984)). Para propósitos de la presente invención, "avidina" puede glicosilarse , desglicosilarse, o no glicosilarse , derivarse, o modificar, siempre y cuando la avidina mantenga una afinidad alta para biotina (constante de equilibrio de disociación KD en el orden de 10"14 M hasta 10"16 M) . Incluidos dentro del significado de "avidina" son neutravidina ..(o NeutrAvidin) y estreptavidina.. "Estreptavidina", naturalmente producida por la bacteria Streptomyces avidinii como una proteína enlazada a la biotina tetramérica de 52,800 Da, e incluye una versión purificada o producida sintéticamente o recombinantenmente de la misma, y/o una forma monomérica o multimérica (por. ejemplo, dimérica, trimérica, etc.) de la misma. Las formas monovalente o multivalentes recombinantemente preparadas por ingeniería de avidina (o estreptavidina) también se incluyen dentro de "avidina". (Por ejemplo, Laitinen et al.. Genetically engineered avidins and streptavidins, Cell Mol Life Sci. 63 (24): 2992-30177 (2006); Howarth et al., A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site, Nat Methods 3(4): 267-73 (2006) ) . "Recubierto con avidina" significa que una superficie sólida, por ejemplo, una superficie del pozo de una placa de poliestireno, se conjuga con porciones de avidina de manera que . las porciones de avidina todavía son capaces de enlazar, a la biotina no covalentemente con afinidad alta bajo condiciones fisiológicas, por ejemplo, con una constante de equilibrio de disociación KD en el orden de 10"14 hasta 10"16 M. En algunas modalidades del pozo recubierto con avidina en el ensayo in vitro inventivo, la avidina empleada es estreptavidina o neutravidina.

Un "pozo" es una cámara capaz de recibir, a través de una abertura recuperable, y que contiene un líquido acuoso. Por ejemplo, cada compartimiento individual de una placa de microtitulación (por ejemplo, placa de microtitulación de 96 o 384 pozos) es un "pozo"; un recipiente de compartimiento sencillo, tal como una placa de cultivo, plato Petri, tubo de prueba, tubo cónico, o la depresión de un portaobjetos de depresión también es un "pozo". Las aberturas de los pozos pueden cubrirse o no cubrirse separadamente por. coberturas individuales removibles, o colectivamente por una cubierta remo\rible sencilla.

"Biotina" es una vitamina de complejo B soluble en agua, esto es, vitamina B7, que está compuesta de un anillo de ureido (tetrahidroimidizalona) fusionado con un anillo de tetrahidrotiofeno (Ver, Fórmula I). Fórmula I: Un sustituyente de ácido valérico se une. a uno de los átomos de carbono del anillo de tetrahidrotiofeno . En la naturaleza, la biotina es una coenzima en el metabolismo de ácidos grasos y leucina, y juega un papel in vivo en gluconeogénesis . La. biotina enlaza muy herméticamente a la avidina de proteina tetramérica (por ejemplo, avidina de pollo, estreptavidina bacteriana, y neutravidina) , con una constante de equilibrio de disociación KD en el orden de 10~14 M hasta 10"16 M, que es una de las interacciones de proteína-ligando conocidas, más fuertes, que se acerca al enlace cóvalente en resistencia. (Laitinen . et al. Genetically engineered avidins and streptavidins, Cell Mol Life Sci. 63 (24): 2992-30177 (2006)). La interacción no cóvalente de biotina-avidina se usa a menudo en diferentes aplicaciones biotecnológicas . (Ver, Laitinen et al., Genetically engineered avidins. and streptavidins, Cell Mol . Life Sci. 63 (24): 2992-30177 (2006)).

"Biotinilado" significa que una sustancia se conjuga a una o más porciones de biotina. Los péptidos biotinilados útiles al practicar la invención pueden. adquirirse comercialmente (por ejemplo, Midwest Bio-Tech Inc.) o pueden sintetizarse y biotinilarse fácilmente. La biotinilación de los compuestos, tales como péptidos, puede ser por cualquier técnica química conocida. Estas incluyen biotinilación de amina primaria, biotinilación de sulfhidrilo, y biotinilación de carboxilo. Por, ejemplo, los grupos amina en el péptido, que se presentan como examinas de terminal N y aminas de épsilon de cadena lateral de Usina, soñ objetivos comunes para la biotinilación de la amina primaria. Los reactivos de biotinilación reactivos de amina pueden dividirse en dos grupos con base en solubilidad de' agua. 1) N-hidroxisuceinimida (NHS) -esteres de biotina tienen solubilidad pobre en soluciones acuosas. Para reacciones en solución acuosa, debe primero disolverse en un solvente orgánico, luego diluirse en la mezcla de reacción acuosa. Los solventes orgánicos más comúnmente usados para este propósito son sulfóxido de dimetilo (DMSO) y formamida de dimetilo (DMF) , que son compatibles con la mayoría de proteínas en concentraciones bajas. 2) Sulfo-NHS^ésteres de biotina son más solubles en característica. Cuando la biotina, en la forma de proteína biotinilada u otra molécula, se introduce, desplaza el pigmento, resultando en un cambio en absorbancia en 500 nm. El cambio en absorbancia es directamente proporcional al nivel de biotina en la muestra.

"FCYRIIIa", también conocido como "CD16a" o "FCGR3' "IGFR3", cuyas designaciones se usan intercambiablemente en la presente, significa receptor III de inmunoglobulina G Fe. El CD16a humano (Acceso al GenBank AAH17865) comprende la secuencia de aminoácido: 1 mwqlllptal lllvsagmrt edlpkawfl epqwyrvlek dsvtlk|cqga yspednstqw 61 fhnesllssq . assyfidaat vddsgeyrcq tnlstl|sdpv qlevhigwll lqaprwvfke 121 edpihlrchs wkntalhkvt ylqngkgrky fhhnsd'fyip katlkdsgsy fcrglvgs.kn 181 vssetvniti . tqglavstis sffppgyqvs fclvmvjLlfa vdtglyfsvk tnirsstrdw. 241 kdhkfkwrkd pqdk//- SEQ ID NO : 11.

Sin embargo, las secuencias polimórficas de CD16a, también se abarcan por el término "CD16a". Tales polimorfismos incluyen 176V (forma de enlace alta) y 176F (forma de enlace baja). La secuencia del residuo, de aminoácido 254 de GDI 6a (SEQ ID NO: 11). incluye una, secuencia de señal del residuo 16; un dominio extracelular (ECD' del residuo 191; y un dominio de transmembrana del residuo |22 y un dominio citoplásmico de terminal C del residuo 25|. Un 'polipéptido CD16a humano, recombinante" es un fragmento de la SEQ ID NO: 11 (o una variante polimórfica del mismo producido por técnicas de ADN recombinantes que es soluble Un ejemplo de tal fragmento soluble es el fragmento G17-}Q208 de SEQ ID NO: 11, que comprende el ECD supuesto: 17 gmrt edlpkawfl epqwyrvlek dsvtlkcqga yspednstqw 61 fhneslissq assyfidaat vddsgeyrcq tnlstljsdpv qlevhigwll lqaprwvfke 121 edpihlrchs wkntalhkvt ylqngkgrky fhhnsdfyip katlkdsgsy fcrglvgskn 181 vssetvniti tqglavstis. sffppgyq//SEQ ID. NO: 12. Otras modalidades de "polipéptido CD16a humano recombinante incluye fragmentos, más pequeños de la. SEQ ID NO: 12 que mantienen la capacidad de enlazar a IgG humano con uji KD estimado menor que 50 nM.

"Etiquetado con polihistidina" significa que el polipéptido CD16a humano recombinante se conjuga, ya sea por técnicas sintéticas (por ejemplo, Péterson, Patente de E. U.A. No. 5,840,834, Technique for joining amino acid sequences | and novel compositioñ useful in immunoassays ) , o por técnicaá de ADN recombinantes,. como una extensión de la . terminal |N .. o terminal C del polipéptido CDl'6a. humano recombinante] que comprende al menos cinco,' pero típicamente, seis ("etiqueta hexa. histidina" o "6xHis-etiqueta") hasta 18 residuos de histidina contiguos. El polipéptido CD16a humano recombinante etiquetado con polihistidina también está comercialmente disponible (por ejemplo, R&D Systems Catálogo #4325-FC) . Los anticuerpos que enlazan específicamente a polihistidina y métodos para hacerlos son bien conocidos en la técnica, y tales anticuerpos .están comercialmente disponibles, (por ejemplo, Zentgraf et al., Antibodies active against a. fusión polipeptide comprising a histidirie portion, Patente U.A.

No. 6, 790, 940 y Patente - de E.U.A. No. 7,713,712; Silgma-Aldrich Producto #H1029; R&D Systems Catálogo #MAB050)1 En algunas modalidades del método de ensayo in vitro inventivo, el anticuerpo que específicamente enlaza a la polihistidina, o, en otras modalidades, el anticuerpo que específicamente enlaza el anticuerpo que específicamente enlaza a la polihistidina, comprende además, conjugado para el anticuerpo, una etiqueta que produce señal, tal como pero no limitado a, una etiqueta fluorescente, una etiqueta isotópica, una etiqueta electroquimiolumiscente , o- una enzima que puede catalizar una reacción que convierte un sustrato en un reactivo que es fácilmente detectable por instrumentos espectrofotométicos, colorimétricos , fluorométricos , luminométricos u otros instrumentos (por ejemplo, sistemas de detección con base en peroxidasa de raíz de rábano, beta galactosidasa, o luciferasa) .

"Electroquimioluminiscencia" (ECL) , intercambiablemente "quimioluminiscencia electrogenerada'', es un tipo de luminiscencia generada durante las reacciones electroquímicas en soluciones. En ECL, los intermediarios generados electroquímicamente experimentan una reacción altamente exergónica para producir un estado excitado electrónicamente que luego emite luz. (Forster et al., Electrogenerated Chemiluminescence, Annual .' Review of Analytical Chemistr 2: 359-385 (2009)). La excitación EGL se provoca por reacciones de transferencia de electrones energéticas (redox) de especies electrogeneradas . Estas reacciones de tansferencia de electrones son suficientemente exergónicas para permitie los estados excitados de luminóforos, incluyendo hidrocarburos aromáticos policíclicos y complejos de metal, para crearse sin fotoexcitación . Por ejemplo, oxidación de [Ru (bpy) 3] 2+ en presencia de tripropilamina resulta en emisión de luz que es análoga a la emisión producida por fotoexcitación . Tales complejos de rutenio pueden emplearse útilmente como . etiquetas quimioluminiscentes para propósitos de la invención. Por ejemplo, el sistema de detección de Descubrimiento de Meso Escala (MSD; Gaithersburg, D) Sulfo-Tag™ ECL que depende de una etiqueta electroquimioluminiscente que contiene un complejo rutenio. En el sistema Sulfo-Tag™, un éster de N hidroxisucccinimida activado que tiene la . . siguiente estructura química (II) se usa para formar la etiqueta: Siguiendo las instrucciones de fabricante (MSD Sulfo-Tag™ NHS-Ester, 17794-v2-Mayo 2008, (2008)), el éster de N-hidroxisuccinimida activado se hace reaccionar con un polipéptido para etiquetarse, tal como un anticuerpo. Como se menciona previamente, las reacciones químicas de NHS y stlfo-NHS-ésteres son esencialmente las mismas: un enlace de amida se forma y NHS o sulfo-NHS se convierten en grupos de partida. Debido a que los objetivos para el éster son aminas primarias desprotonadas, la reacción está prevalente arriba de pH 7. Las condiciones para conjugar NHS-ésteres a aminas primarias de péptidos incluyen temperaturas de incubación en el intervalo de 4-37 °C, valores pH de reacción en el intervalo de 7-9, y tiempos de incubación .de unos pocos minutos hasta alrededor de 12 horas. Las soluciones amortiguadoras que contienen aminas (tales como Tris o glicina) deben evitarse debido' a que compiten cor la reacción. El producto de polipéptido etiquetado de la reacción etiquetada incluye ¦ la etiqueta electroquimioluminiscente que comprende un complejo de rutenio que tiene la siguiente fórmula (III),. en dond la linea dibujada del grupo carbonilo muestra la unión al resto de la molécula: (III) En algunas modalidades del método de ensayo i vitro inventivo, la mezcla de reacción pre-incubada contiene además una muestra de suero para probarse para la presencia de anticuerpos neutralizantes. Los "anticuerpos neutralizantes (NAb) son anticuerpos que son capaces de reducir la titulación de suero de un antigeno de interés, por ejemplo, un anticuerpo objetivo IgG, al enlazar específicamente a esto, in vivo o. en una muestra in vitro. Los NAbs, in vivo bloquean la actividad biológica de la molécula terapéutica ya sea al enlazar directamente a los epítopos que están dentro del sitio activo de . la molécula terapéutica o al bloquear su sitio activo por obstáculo estético debido al enlace a epítopos que puede estar en proximidad cercana al sitio activo Mientras que, en ciertos casos la presencia de NAb no puede resultar en . un efecto clínico, en niveles NAb suficiente en otros casos, una disminución en eficacia puede observarse que puede requerir la administración de dosis superiores del producto de fármaco con objeto de alcanzar eficacia similar. (Ver, por ejemplo, Gupta et al, Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biolocical therapeutics , Journal of Immunological Methods 321(1-2): 1—18 (2007) . ) En otros casos, una disminución en eficacia puede observarse que puede requerir la administración .' de dosis superiores del producto de fármaco con objeto de alcanzar eficacia similar.

La "proteína objetivo" de interés es cualquier proteína, tal como pero no limitada a una proteína humana, que es de interés científico, médico, clínico, o terapéutico como el objetivo específico para un anticuerpo. Un ejemplo de una proteína objetivo de interés, es el. receptor de quimiocina tipo 4 (CCR4) . La secuencia de aminoácido de CCR4 humano es la siguiente (Acceso al Genbank P51679):. 1 mnptdiadtt ldesiysnyy lyesipkpct kegikafgel flpplyslvf vfgllgnsvv 61 vlvlfkykrl rsmtdvylln laisdllfvf slpfwgyyaa dqwvfglglc kmiswmylvg 121 fysgiffvml msidrylaiv twsvavfasi pgflfstcyt 1.81 ernhtyckt k yslnsttwkv cysmiirtlq hcknekknka 241 vkmifavvvl flgfwtpyni yldyaiqate tlafvhccln 301 piiyfflgek frkyilqlfk dtpsssytqs tmdhdlhdal // SEQ ID NO: Otro ejemplo de una proteína objetivo de interés es antígeno CD20 de B-linfocito. La secuencia de aminoácido de CD20 humano es la siguiente (Acceso al Genbank NP 690605) : 1 mttprnsvng tfpaepmkgp iamqsgpkpl frrmsslvgp tqsffmresk tlgavqimng 61 lfhialggll mipagiyapi ' cvtvwyplwg gimyijisgsl laateknsrk. clvkgkmimn 121 slslfaaisg milsimdiln ikishflkme slnfibahtp yiniyncepa npseknspst 181 qycysiqslf lgilsvmlif affqelviag ivenewkrtc srpksnivll saeekkeqti 241 keevvglt etssqpknee dieiipiqee eeeetet'nfp eppqdqessp iendssp// SEQ ID N0:2.

Otro ejemplo de una proteina objetivo de interés es HER2. La secuencia- de aminoácido de HER2 humano' (también conocido como oncogén ERBB2, tirosina-cinasa de proteina erbB-2, oncogén NGL, NEU, o TKR1) es la siguiente (Acceso al Genbank P04626) : 1 melaalcrwg lllallppga astqvctgtd mklrlpaspe thldmfLrhly qgcqvvqgnl 61 eltylptnas lsflqdiqev qgyvliahnq vrqvplqrlr ivrgtqlfed nyalavldng ¦ 121 dplnnttpvt gaspgglrel qlrslteilk ggvligrnpq lcyqdtilwk difhknnqla 181 ltlidtnrsr achpcspmck gsrcwgesse dcqsl|:rtvc aggcarckgp lptdccheqc 241 aagctgpkhs dclaclhfhh sgicelhcpa . lvtyntdtfe smpnpegryt fgascvtacp 301 ynylstdvgs ctlvcplhnq evtaedgtqr kpcar vcyglgmehl revravtsan 361 iqefagckki fgslaflpes fdgdpasnta plqpeqlqvf etleeitgyl yisawpdslp 421 dlsvfqnlqv irgrilhnga ysltlqglgi swlglrslre lgsglalihh nthlcfvhtv 481 pwdqlfrnph qallhtanrp edecvgegla chqlcarghc wgpgptqcvn csqflrgqec 541 veecrvlqgl preyvnarhc lpchpecqpq ngsvtcfgpe adqcvacahy kdppfcvarc 60.1 psgvkpdlsy mpiwkfpdee gacqpcpinc thscvdlddk gcpaeqrasp ltsiisavvg 661 illvvvlgvv fgilikrrqq kirkytmrrl lqete vepl tpsgampnqa qmrilketel 721 rkvkvlgsga fgtvykgiwi pdgenvkipv aikvlrents pkankeilde ayvmagvgsp 781 yvsrllgicl tstvqlvtql mpygclldhv renrgrlgsq dllnwcmqia kgmsyledvr 841 lvhrdlaarn vlvkspnhvk itdfglarll dideteyhad ggkvpikwma lesilrrrft 901 hqsdvwsygv tvwelmtfga . kpydgipare ipdllekger lpqppictid vymimvkcwm 961 idsecrprfr elvsefsrma rdpqrfvviq nedlgpaspl dstfyrslle dddmgdlvda 1021 eeylvpqqgf . fcpdpapgag gmvhhrhrss strsgggdlt lglepseeea prsplapseg 1081 agsdvfdgdl gmgaakglqs lpthdpsplq rysedptvpl psetdgyvap ltcspqpeyv 1141 nqpdvrpqpp spregplpaa rpagatlerp ktlsp<jjkngv vkdvfafgga venpeyltpq. 1201 ggaapqphpp pafspafdnl yywdqdpper gappstfkgt ptaenpeylg ldvpv/V SEQ ID NO: 13.

Una "porción de polipéptido" es un subconjunto dé una proteina objetivo de interés que comprende una porción de peptidilo antigénico de la proteina objetivo. Típicamente, tal "porción de polipéptido" comprende al menos 5 hasjtta 6 residuos de aminoácido contiguos y puede ser tan grande como la proteína completa de interés. Más típicamente, la "porción de polipéptido" es 10 hasta 40 residuos de aminoácido de longitud. La "porción de polipéptido" incluye los residuos de aminoácido de la proteina objetivo a la cual al menos una CDR, o en otra modalidad al menos dos CDRs, o todavía en otra modalidad al menos tres CDRs, de la proteína enlazada al antígeno objetivo ', o anticuerpo objetivo IgG se enlaza específicamente. · La "proteína enlazada al antígeno objetivo" es 1 una proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza |a la porción de polipéptido de la proteína objetivo de interéjs, y también incluye un dominio Fe con un sitio enlazado a C316a, Un anticuerpo objetivo IgG es un ejemplo de una "proteína enlazada al antigeno objetivo." "Anticuerpo objetivo IgG" es un anticuerpo que específicamente enlaza a la porción de polipéptido de la proteína objetivo de interés,- y también incluye' un dominio Fe con un sitio enlazado a CD16a.

Producción de Anticuerpos Anticuerpos policlonales . Los anticuerpos policlonales son preferiblemente formulados en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) | del antígeno relevante y un adyuvante. Alternativamente,! el antígeno puede inyectarse directamente en el ganglio linfático del animal (ver Kilpatrick et al, Hybridoma, 16:381-389, 1997). Una respuesta de anticuerpo mejorada puede obtenerse al conjugar el antígeno relevante a una proteína que es' inmunogénica en la especie para inmunizarse, por ejemplo, hemocianina de lapa, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de soya usando un agente derivado o bifuncional, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de los residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico u otros agentes conocidos en la técnica.

Los animales se inmunizan contra el antigeno, conjugados inmunogénicos , o derivados al combinar, por ejemplo, 100 g de la proteína o conjugado (para ratón) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes después, los animales se estimularon con 1/5 hasta 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completa de Freund por inyección subcutánea en sitios múltiples. En los días 7-14 después de la inyección de estimulo, los aninales se sangraron y el suero se coloca en ensayo para la titulación del anticuerpo. Los animales se estimulan hasta la titulación se estabiliza. Preferiblemente, el animal, se estimula con el conjugado del mismo antigeno, pero se conjuga a una proteína diferente y/o a través de un. reactivo de entrecruzamiento diferente. Los conjugados también pueden hacerse en cultivo- celular recombinante como fusiones de proteína. También, los agentes agregados tales como alumbre se -usan adecuadamente para potenciar la. respuesta inmunitaria.

Anticuerpos monoclonales . Los anticuerpos monocloríales pueden producirse usando, cualquier técnica conocida en el arte, por ejemplo, al inmortalizar células de bazo cosechadas del animal transgénico 'después de la terminación del programa de inmunización. Las células de bazo pueden inmortalizarse usando cualquier técnica conocida en él arte, por ejemplo, al fusionarlas con células de mieloma para producir hibridomas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden hacerse usando primero el método de hibridoma descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o puede hacerse por métodos de ADN recombinante (por ejemplo, Cabilly et al, Methods of producing immunoglobulins , vectors and transformed hots cells for use therein, Patente de E.U.A. No. 6,331,415), incluyendo métodos, tales como el método "DHFR dividido",' que facilita la producción generalmente equimolar de luz y cadenas pesadas, opcionalmente . usando lineas células mamiferas (por ejemplo, células GHO) que pueden glicosilar el anticuerpo (Ver, por ejemplo, Page, Antibody production, EP0481790 A2 y Patente de E.U.A. No. 5,545,403).

Monoclonal . En el método de hibridoma, un ratón u otro mamífero hospedero apropiado, tales como ratas, hámster o mono macaco, se inmuniza en la presente como se describe para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que específicamente enlazarán a la proteína usada para inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos luego se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma, una vez preparadas, se siembran y hacer crecer en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o sobrevivencia de las células de ¦ mieloma precursoras, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la transferasa de hipoxantina guanina fosforibosil de enzima (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), cuyas sustancias previenen el crecimiento de células deficientes de HGPRT.

Las células de mieloma preferidas, son aquellas | que fusionan eficientemente, soportan producción de anticuerpo de nivel alto estable por las células que producen anticuerpo seleccionado, y . son sensibles a un medio. Las líneas celulares de heteromieloma de ratón-humanas y mieloma humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)) . Las células de mieloma para uso en los procedimientos de fusión que producen hibridoma preferiblemente no | son productores de anticuerpo, tienen eficiencia de fusión alta, y deficiencias de enzima que las vuelve incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que soportan el crecimiento de sólo las células fusionadas deseadas (hibridomas) . Los ejemplos de lineas celulares adecuadas para uso en fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 \, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XXO Bui; los ejemplos de lineas celulares usadas en fusiones de rata incluyen R2Í0.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras lineas celulares útiles para las funciones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma se hacen crecer se coloca en ensayo para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno. Preferiblemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabso.rbente ligado a la enzima (ELISA) . La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por análisis BIAcore® o Scatchard (Munson et al., Anal. Biochem. , 107:220 (1980); Fischer et al, A peptide-immunoglobulin-conj ugate , WO 2007/045463 Al, Ejemplo 10, que se incorpora en · la presente como, referencia en su totalidad) . péptidos de fusión, o proteínas enlazadas al antígeno, tales como anticuerpos (policlonales y monoclonales) , e incluyendo fragmentos de anticuerpo, de la invención descritos en la presente, opcionalmente ligados de manera operable a las secuencias de control reconocidas por una célula hospedera, vectores y células hospederas que comprenden os ácidos nucleicos, y técnicas recombinantes para la producción de los anticuerpos, que pueden comprender cultivo de la célula hospedera de manera que. el ácido nucleico se expresa y, opcionalmente, recupera el anticuerpo del cultivo de célula hospedera o medio de' cultivo. Los métodos y materiales similares aplican a la producción de otros polipéptidos .

Las secuencias de aminoácidos relevantes de una inmunoglobulina o polipéptido de interés pueden determinarse por procesamiento de secuencia de proteína directa, y las secuencias de nucleótido codificadas adecuadas pueden diseñarse de acuerdo a una tabla de codón universal, Alternativamente, lós anticuerpos monoclonales codificados por cADN o genómicos pueden aislarse y procesarse por secuencia de células que producen tales anticuerpos usando procedimientos convencionales (por ejemplo, al usar sondas de oligonucleótido que son capaces de enlazar específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas los anticuerpos monoclonales).

La clonación de ADN se lleva a cabo usando, técnicas estándares (ver, ' por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Press, que se incorpora en la presente como referencia) . Por ejemplo, una colección de cADN puede construirse por transcripción inversa de polyA+ mARN, preferiblemente mARN asociada a la membrana, y la colección seleccionada usando sondas especificas para secuencias! del gen de polipéptido de inmunoglobulina humana. En una modalidad, sin embargo, la reacción de cadena de polimérasa (PCR) se usa. para .amplificar cADNs (o porciones de cADNs de longitud completa) que codifica un segmento del gen de inmunoglobulina de interés (por ejemplo, un segmento variable de cadena pesada o ligera). Las secuencias amplificadas pueden clonarse fácilmente en cualquier vector adecuado, por ejemplo, vectores, de expresión, vectores de. minigen, o vectores de despliegue de fagos.- Se apreciará que el método particular de clonación usado no es critico, de manera que es posible determinar la secuencia de alguna porción del polipéptido de inmunoglobulina de interés.

Una fuente para los ácidos nucleicos de anticuerpos es un hibridoma producido al obtener una célula B de un animal inmunizado con el . antigeno de interés y fusionar a una célula inmortal. Alternativamente, el ácido nucleico puede aislarse células B (o bazo completo) del animal inmunizado Aún otra fuente de anticuerpos que codifican los ácidos nucleicos es una colección de tales ácidos nucleicos generados, por ejemplo, a través de la tecnología de despliegue de fagos. Los polinucleótidós que codifican péptidos de interés, por ejemplo, péptidos de región variable con características de enlace deseadas, pueden identificarse por técnicas estándares tales como inmunoadsorción {panning) .

La secuencia que codifica una región variable completa del polipéptido. de inmunoglobulina puede determinarse; sin embargo, algunas veces es adecuado secuenciar sólo una porción de una región variable, por ejemplo, la porción que codifica la CDR. El procesamiento por secuencia se lleva a cabo usando técnicas estándares (ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Press, and Sanger, F. et al. (1977) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 74: 5463-5467, que se incorpora en la presente como referencia) . Al comparar la secuencia del ácido nucleico clonado con secuencias publicadas de genes de inmunoglobulina' húmanos y cADNs, alguien de experiencia fácilmente será capaz de determinar, dependiendo de la región secuenciada, (i) el uso del segmento de línea germinal . del polipéptido. de inmunoglobulina. de hibridoma (incluyendo el isotipo de la . cadena pesada) y |(ii) la secuencia de las regiones variables de cadena ligera y pesada, que incluyen secuencias que resultan de la adición de la región N y el proceso de mutación somática. Una . fuente de la información de secuencia del gen de inmunoglobulina es el National Center . for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md. operablemente significa que las secuencias de ADN que se ligan son contiguas, y, en el caso de un líder secretorio, contiguo y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La ligadura se realiza por ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios . no existen, las ligaduras o adaptadores del oligonucleótido sintéticos se usan de acuerdo con la práctica convencional.

Muchos vectores se conocen en el arte. Los componentes del vector pueden incluir uno o más de los siguientes: una secuencia de señal (que puede, por ejemplo, secreción- 'directa del anticuerpo; por ejemplo, ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGT GCGCGCTGT// SEQ ID NO : 9, que codifica la señal de péptido de señal VK-1 MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC// SEQ ID NO: 10), J un origine de replicación, uno o más genes marcadores selectivos i (que pueden, por ejemplo, conferir resistencia antibiótica o a otro fármaco, deficiencias auxotrópicas del complemento, o los nutrientes críticos de suministro no están disponibles en los medios) , un elemente potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción, todos de los cuales son bien conocidos en el arte.

Célula, línea celular, y cultivo celular se usan a menudo intercambiablemente y todas las designaciones en la Serratia marcescans, y Shigella, asi como Bacillus tales icomo B. subtilis y B.. licheniformis , Pseudomonas, y Streptomyces . s microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o vadura son hospederos de expresión o clonación adecuados ra polipéptidos o anticuerpos recombinantes . Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es el usado más comúnmente entre microorganismos . hospederos . eucariotas inferiores. Sin embargo, un número de otro género, especie, , y cepas están comercialmente disponibles y son útiles . en la presente, tales como Pichia, por ejemplo P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces , Yarrowia; Candida; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis ; y hongos filamentosos tales como,. por ejemplo, hospederos Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y Asperqillus tales como A. nidulans |y A . nige ..

Las células hospederas para la expresión de anticuerpos glicosilados pueden derivarse de organismos multicelulares Los ejemplos de . células de invertebrados incluyen células de planta e insecto. Numerosas cepas baculoviricas y variantes y células hospederas de insecto permisivo correspondientes de hospederos tales como Spodoptera frugiperda ( Caterpillar) , Aedes aegypti (mosquito) , . Aedes albopictus. . (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de fruta) , y Bombvx mori se han identificado. Una variedad de cepas víricas para la transfección de tales células están públicamente disponibles, por ejemplo, la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombvx mori NPV.

Las células hospederas de vertebrados también | son hospederos adecuados, y la producción recombinantel de polipéptidos (incluyendo proteínas enlazada al antígeno,| por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo) . de tlales células se ha vuelto un procedimiento de rutina. Los ejemplos de lineas celulares hospederas mamiferas son células de ovario de hámster Chino, incluyendo células CH0K1 (ATCC CCL61), DXB-11, DG-44, y células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); linea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL.1651); linea de riñon embriónico humano (293 o 293 células subclonadas para crecimiento en el cultivo de suspensión, [Graham et al, J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]; células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células Sertoli de ratón' (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); cé ulas de riñon de mono verde Africano. (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino ( DCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo . (BRL 3A, ATCC CRL 1442);. células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hepatoma . humano (Hep G2, HB 8065) ; . tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al, Annals N.Y Acad.. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5 o células FS4; o células de mielorna mamiferas.

Las células hospederas se transforman o transfectan con los ácidos nucleicos o vectores descritos arriba para la producción de polipéptidos (incluyendo proteínas enlazadas al antígeno, tales como anticuerpos) y se cultivan en medias de nutriente convencionales modificados como sea apropiado para inducir los promotores, transformantes seleccionados, o amplificar los genes que codifican ' las secuencias' deseadas. Además, los vectores novedosos y lineas celulares transfectadas con múltiples copias . de unidades de transcripción separadas por un marcador selectivo son particularmente útiles para la expresión de polipéptidos , tales como anticuerpos.' Las células hospederas usadas para producir | los polipéptidos útiles en la invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como Ham' s FIO (Sigma), Medio Esencial Mínimo ( (MEM) , (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células hospederas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.. 102: .255 (1980), Patente de E.U.A. Nos. 4, 767, 704; 4,657,866; ' 4, 927,762; 4, 560,655; o 5,122,469; WO90103430; O 87/00195; o Patente Re. de E.U.A. No. 30,985 puede usarse como medio de cultivo para las células hospederas. Cualquiera de estos medios puede complementarse como sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), .soluciones amortiguadoras (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como fármaco Gentamycin™) , elementos de rastro (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar ) ,¦ y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquiera de otros complementos necesarios también puede incluirse en concentraciones apropiadas que pueden conocerse para aquellos experimentados en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y similares, son aquellas usadas previamente con la célula hospedera seleccionada para expresión, y serán aparentes para el técnico ordinariamente experimentado.

Durante el cultivo de las células hospederas, el polipéptido recombinante puede producirse intracelularmente , en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si el polipéptido, tal como una proteína enlazada al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) , se produce intracelularmente, . como una primera etapa, los desechos en partículas, ya sea células hospederas o fragmentos lisados, se remueve, por ejemplo, por centrifugación! o ultrafiltración .

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de intercambio de cationes o aniones, o preferiblemente cromatografía por afinidad, usando el antígeno de interés o proteína A o proteína G como un ligando de afinidad. La proteína A puede usarse para purificar proteínas que incluyen polipéptidos se basan en cadena, pesadas ??, ?2, o ?4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol . Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ?3 humano (Guss et al, EMBO J. 5:, 15671575 (1986)). La matriz a la cual el ligando de afinidad se une es más a menudo agarosa, pero otras matrices están disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil) benceno se permiten para tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que pueden alcanzarse con agarosa. Donde la proteína comprende un dominio CH 3, la resina Bakerbond ABX™ (J.. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de .proteína tales como precipitación de etanol, HPLC de' Fase Inversa, cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio también son posibles dependiendo del anticuerpo a recuperarse.

Anticuerpos . quiméricos, humanizados, EngineelredT humanos , monoclonales Xenomouse®. Los anticuerpos monoclonales quiméricos, en los cuales los dominios Ig variables de un anticuerpo monoclonal de roedor se fusionan a los dominios Ig constantes humanos, pueden generarse usando procedimientos estándares conocidos en el arte (Ver- Morrison, S. L., et al. (1984) Chimeric Human' antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human. Constant Región Domains, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81, 6841-6855; y, Boulianne, G. L., . et al, Nature 312, 643-646. (1984)). Un numeró de técnicas se han descrito para humanizar o modifica:: .la secuencia de anticuerpo para ser más tipo humano, por ejemplo, al (1) injertar las regiones que determinan la complementariedad (CDRs) no humanas en una estructura humana y región constante (un proceso referido en el arte como humanización a través de "injerto de CDR") o (2) trasplántar los dominios variables no humanos completos, pero "cubrirlos" con una superficie tipo humana por reemplazo de los residuos de superficie (un proceso referido en el arte "revestimiento") o (3) modificar residuos de aminoácido no humanos seleccionados para ser más humanos, con base en cada probabilidad del residuo de participar en la estructura del anticuerpo o enlace al antígeno y su probabilidad inmunogenicidad . Ver, por ejemplo, Jones et al, Nature 321: 522 525 (1986); Morrison et al, Proc. Nati. Acad. S!ci., E.U.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison and Oi, . Adv. Immu ol, 44:65 92 ( 1988 ) ; . Verhoeyer et al, Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Pajdlan, Molec. Immunol. 31(3) : 169 217 (1994); y Kett leborough, | C . A . et al, Protein Eng. 4(7) :773 83 (1991); Co, M. S., et al . (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976); Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994);' cada una de la cual se incorpora en la presente como referencia en su .totalidad Un número de técnicas se han descrito para humanizar o modificar la secuencia de anticuerpos para ser más tipo humana, . por ejemplo, al (1) injertar las regiones que determinan la complementariedad (CDRs) no humanas en una región constante y estructura humana (un proceso referido en el arte como humanización a través de "injerto COR") o (2) trasplantar los dominios variables no humanos completos, pero "cubriéndolos" con una superficie tipo humana por reemplazo de los residuos de superficie (un proceso referido en el arte como "revestimiento") o- (3) modificar los residuos de aminoácido no humanos seleccionados para ser más humanos, con base en cada probabilidad del residuo de participar en la estructura de anticuerpo o enlace '. del antigeno y su probabilidad para inmunogenicidad. Ver, por ejemplo, Jones et al, Nature 321: 522.525 ( 1986) ; Morrison et al, Proc. Nati.

Acad. Sci., E.U.A., 81: 6851 6855 (1984); Morrison andl Oi, Adv. Immunol, 44:65.92 (1988); Verhoeyer et al, Science 239: 1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1|991); Padlan, Molec. .Immunol. 31(3): 169 217 (1994); y Kettleborough, C.A. et al, Protein Eng. 4(7):773 83 (1991); Co, M .. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976); Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994); cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad Los anticuerpos también pueden producirse usando animales transgénicos que no tienen producción de inmunoglobülina endógena y se preparan por ingeniería para contener la ubicación de inmunoglobülina humana. (Ver, por ejemplo, Méndez et al,. Nat . Genet . 15: 146-156 (1997)) Por ejemplo, la WO 98/24893 describe animales transgénicos' que tienen . una ubicación Ig humana en donde los. animales no producen inmunoglobulinas endógenas funcionales debido a la inactivación de ubicación de cadena ligera y pesada endógena.

La WO 91/10741 también describe hospederos mamíferos no primates transgénicos capaces de montar una respuesta inmunitaria a un inmunógeno, en donde los anticuerpos tienen regiones constantes y/o variables de primates, y en donde las ubicaciones que . codifican la inmunoglobülina endógena se sustituyen o inactivan. La WO 96/30498 describe el uso del sistema Cre/Lox para modificar la ubicación d inmunoglobijlina en un mamífero, tal como para reemplazar toda o una porción de la región constante o variable para formar una molécula de anticuerpo modificado. La WO 94/02602 describe hospederos mamíferos no humanos que tienen ubicación Ig endógena inactivada y ubicación Ig humana funcional. La Patent.e de E.U.A. No. 5,939,598 describe métodos para hacer ratones transgénicos en los cuales los ratones carecen de cadenas pesadas endógenas, y expresan un ubicación de inmunoglobulina exógena que comprende una o más regiones constantes xenogénicas.

Usando un animal transgénico descrito. arriba, ] una respuesta inmunitaria' puede producirse a una molécula antigénica seleccionada, y las células que producen el anticuerpo pueden removerse del animal y usarse para producir hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales derivados de humanos. Los protocolos de inmunización, adyuvantes, y similares se conocen en el arte, y se usan en la inmunización de, por ejemplo, un ratón transgénico como se describe en la WO 96/33735. Los anticuerpos monoclonales pueden probarse para la capacidad de inhibir o neutralizar la actividad biológica o efecto · fisiológico de la proteína correspondiente. Ver también Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362 : 255-258 (1993) ; Bruggermann et al, Year in lmmuno., 7:33 (1993); Méndez . et al., Nat . Genet. 15:146-156 (1997).1; y Patente de E.U.A.. No. 5, 591,669, Patente de E.U.A.I No. 5,589,369, Patente de .E.U.A. No. 5,545,807; y Solicitud de Patente de E.U.A. No. 20020199213. La Solicitud de Patente de E.U.A.. No. y 20030092125 describe métodos para polarizar la respuesta inmunitaria de un animal al epitopo deseado. Los anticuerpos humanos también pueden generarse por . células B activadas in vitro (ver Patentes de E.U.A. Nos. 5,567,610 y 5,229,275) .

Producción de anticuerpo por técnicas de despliegue .de fagos El desarrollo de . tecnologías para hacer repertorios de genes de anticuerpo humano recombinante, y el despliegue de los fragmentos de anticuerpo codificados en la superficie de bacteriófago filamentoso, ha proporcionado otros medios para generar, anticuerpos derivados de humanos. El despliegue de fagos se describe en por ejemplo, Dower et al, WO 91/17271, McCafferty et al, WO 92/01047, y Catón and Koprowski, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA, 87:6450-6454 (1990), cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Los anticuerpos producidos por tecnología de fagos se producen usualmente como fragmentos de enlacé al antígeno, por ejemplo fragmentos Fv o Fab, en bacterias y de esta manera carecen de funciones efectores. Las func: ones efectoras pueden . introducirse por una de las dos estrategias por ello proporciona una plantilla para guiar la selección Posteriormente, las cadenas ligeras humanas seleccionadas se combinan con una . colección del fragmento Fd humano. La selección de la . colección resultante proporciona | Fab completamente humano.

Una variedad de procedimientos se han descrito para derivar anticuerpos humanos de las bibliotecas de despliegue de fagos (Ver, por ejemplo, Hoogenboom et al, J. Mol. Biol, 227:381 ( 1991) ; Marks et al, J. Mol. Biol, 222:58:.-597 (1991); Patenté de E.U.A. Nos. 5,565,332 y 5,573,905; Clackson, T., y Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). En particular, la evolución y selección in vitro de los anticuerpos derivada de las bibliotecas de despliegue de fagos se han vuelto una herramienta poderosa (Ver Burton, D. R., y Barbas III, C. F., Adv. Immunol . 57, 191-280 (1994); y, Winter, G., et al, Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); Solicitud de Patente de E.U.A. No. 20020004215 y WO92/01047; Solicitud de Patente de E.U.A. No. 20030190317 publicada el 9 de octubre de 2003 y. Patente de E.U.A. No. 6,054,287; Patente de E.U.A. No. 5 , 877 , 293. Watkins , "Screening of Phage-Expressed Antibody Librarles by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193, y la Publicación de la Solicitud de Patente.de E.U.A. No. 20030044772 publicada el 6 de marzo de 2003 describe métodos para seleccionar bibliotecas de anticuerpo expresadas por fago u otras moléculas de enlace por captura de levantamiento, un método que invo!lucra inmovilización de las moléculas de enlace candidatas ¿n un soporte sólido.

Otras modalidades.de las Proteínas enlazadas al antigeno Como se señala arriba, los fragmentos de. anticuerpo comprenden una porción dé un anticuerpo de longitud completa intacta, preferiblemente una región variable o de enlace al antígeno del anticuerpo intacto, . e incluye anticuerpos lineales y anticuerpos multiespecífieos formados de los fragmentos de anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de los fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab' , F(ab' ) 2/ Fv Fd, anticuerpo de dominio (dAb) , fragmentos . de la región que determina la complementariedad (CDR) , anticuerpos de cadena sencilla (scFv) , fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla, maxicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracue::pos , minicuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos recombinantes quelantes, tricuerpos o bicuerpos, intracuerpos, nanocuerpos, inumunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIPs) , una proteina de fusión de inmunoglobulina de dominio de enlace al antígeno, un anticuerpo camelizado, un anticuerpo que contiene VH'H, o muteínas o derivados de los mismos, y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir enlace al antigeno especifico para el polipéptido, tal como una secuencia CDR, siempre y cuando el anticuerpo mantenga la actividad biológica deseada. Tales fragmentos de antigeno pueden producirse por la modificación de anticuerpos completos o sintetizados de novo usando tecnologías de ADN recombinantes o síntesis de péptido.

. Los fragmentos de anticuerpo adicionales incluyén un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb) (Ward et al, Njature 341 : 544-546, 1989) que consiste de un dominio VH.

Los "anticuerpos lineales" comprenden un par de segmentos Fd tándem (VH-CH1-VH-CH1 ) que forman un par de regiones enlazadas al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecífieos o monoespecíficos (Zapata . e.tj al, Proteína Eng. 8: 1057-62 (1995)). .

Un "minicuerpo" que consiste de scFv fusionado a CH3 por medio una ligadura de péptido (sin bisagra) o por medio de una .bisagra IgG se ha descrito en Olafsen, et al, Protein Eng Des Sel. Abril de 2004; 17 (4) : 315-23.

El término "maxicuerpo" se refiere un scFvs bivalente unido covalentemente a la región Fe de una inmunoglobulina, ver, por ejemplo, Fredericks et al, Protein Engineering, Design & Selection, 17:95-106 (2004) and P.owers etl al, Journal of Immunological Methods, 251 : 123-135 ( 2001 ) .

Los anticuerpos de cadena pesada funcionales desprovistos de cadenas ligeras se presentan naturalmente en ciertas especies de animales, tales como tiburón nodriza, tiburones wobbegong y Camélidos, tales como camellos, dromedarios, alpacas y llamas. El sitio enlazado al antígeno se reduce a un dominio sencillo, el dominio VHH, ' en estos animales. Estos anticuerpos forman regiones enlazadas al antigeno usando sólo región variable de cadena pesada, esto es, estos anticuerpos funcionales son homodímeros de cadenas pesadas que sólo : tienen la estructura H2L2 (referida como "anticuerpos de cadena pesada" o "HCAbs") . El VHH cameli.zada de forma reportada se recombina con regiones constantes IgG2 e IgG3 que contienen bisagra, dominios CH2, y CH3 y cai:ecen de un dominio CH1. Los fragmentos con sólo VH clásicos son difíciles de producir en forma soluble, pero las mejoras en solubilidad y enlace específico pueden obtenerse . cuando los residuos de estructura se alteran para ser más tipo VHH. (Ver, por ejemplo,. Reichman, etal., J Immunol Methods 1999, 231 : 25-38.) Los dominios VHH camelizados se han encontrado para .enlazar. al antígeno con afinidad alta (Desmyter et al., J. Biol. Chem. 27,6:26285-90, 2001) y posee alta estabilidad en solución (Ewert et al., Biochemistry 41: 3628-36, 2002). Los métodos para generar anticuerpos que tienen cadenas pesadas camelizadas se describen en, por ejemplo, en la Publicación de Patentes de E.U.A.. Nos. 2005/0136049 y 2005/0037421. Los andamiajes alternativos pueden hacerse de dominios tipo variables humanos que están más estrechamente emparejados con el andamiaje V-NAR de tiburón y pueden proporcionar una estructura para una estructura de I rizo penetrante largo.

Debido a que el dominio variable de los anticuerpos de cadena pesada es el fragmento enlazado al ; antigeno completamente funcional más pequeño con una masa molecular de sólo 15 kDa, esta entidad se refiere como un nanocuerpo (Cortez-Retamozo et al., Cáncer Research 64:2853-57, 2004). Una biblioteca de. nanocuerpos puede generarse de un dromedario inmunizado como se describe en Conrath et al., (Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001).

Los ejemplos adicionales de métodos recombinantes apropiados y constructos de. ADN . ejemplares útiles para la expresión recombinante de las modalidades de las proteínas enlazadas al antígeno por células de mamífero, incluyendo proteínas de fusión Fe diméricas ( "pepticuerpos" ) o heterotrimeros Fe de inmunoglobulina quimérica (cadena ligera + cadena pesada) ( "hemicuerpos" ) , conjugados para análogos de péptido de toxina farmacológicamente activos de la invenbión, encuentran en, por ejemplo, Sullivan et al, Toxin Pepetide Therapeutic Agents, US2007/0071764 and Sullivan et al, |Toxin Peptide Therapeutie. Agents, PCT/US2007/022831 , publicada como la WO 2008/088422, que son ambas incorporadas en la presente como referencia en sus totalidades.

Péptidos Las composiciones de péptido, o polipéptido para uso en la presente invención pueden hacerse usando tecnologías de ADN recombinantes, como se describe previamente en la presente, o por síntesis de péptido química. La síntesis de fase sólida es la técnica preferida para hacer péptidos individuales ya que es el método más efectivo-costoso de hacer péptidos pequeños. Por ejemplo, las. técnicas de síntesis de fase sólida bien conocidas incluyen el uso de grupos de protección, -ligaduras, y soportes de fase sólida, así como condiciones de reacción de protección y desprotección específicas, condiciones de desdoblamiento de ligadura, uso de depredadores, y otros aspectos de la síntesis de péptido de fase sólida. Las técnicas adecuadas son bien conocidas en el arte. (Por ejemplo, Merrifield (1973), Chem. Polipeptides , pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds . ) ;. Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Youn.g (1969), Solid Phase Pepetide . Synthesis; Patente de E.U.A. No. 3, 941, 763; Finn et al. (1976) ' The Proteins (3a ed. ) 2: 105-253; and Erickson et al. (1976) , The Proteins (3a ed.) 2: 257-527; "Protecting Groups in Organic Synthesis," 3a Edición, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3ds . , John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog, 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide," G. A. Grant, Ed. , W.H. Freeman & Company, New York, N.Y., 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Ohemisljry, . D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M Peterson, M. R. Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principies of Peptide Synthesis, 2a ed.," M.

Bodanszky, Ed. , Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Péptido Synthesis, 2a- ed.," M. Bodanszky y A. Bodanszky, Eds., Springer- Verlag, 1994; "Protecting Groups," P. J. Kocienski, Ed. , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1994; "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach," . C. Chan and P. D. White, Eds., Oxford Press, 2000, G. B. Fields et al, Synthetic Peptides: A User's Guide, 1990, 77-183). Para ejemplos adicionales de métodos sintéticos y de purificación conocidos en el arte, que son aplicables para hacer las composicione inventivas de la materia, ver, por ejemplo, Sullivan et al, Toxin Peptide Therapeutic Agents, US2007/0071764 and Sullivan et al, Toxin Peptide Therapeutic Agents, PCT/US2007/022831 , publicado ¿orno la WO 2008/088422 A2 , que ambas se incorporan en la presente como referencia en sus totalidades.

Ligaduras .

Una "ligadura" o "porción de ligadura", como se usa intercambiablemente en la presente, se refiere a un grupo orgánico de peptidilo o no peptidilo biológicamente aceptable que se enlaza coval.entemente a un residuo de aminoácido de una cadena de polipéptido (por ejemplo, un dominio de inmunoglobulina HC o inmunoglobulina LC ó inmunoglobulina Fe) contenida en la composición inventiva, cuya porción de ligadura une o conjuga . covalentemente la cadena de polipéptido a otra molécula o porción química. Muchas ligaduras de peptidilo. y no peptidilo útiles se conocen en el arte,, y muchas se describen en detalle en Sullivan et al, Toxin Peptide Therapeutic Agents, US 2007/0071764 Al I. La presencia de cualquier porción de ligadura en los componentes o reactivos empleados en la presente invención es opcional Cuando se presenta, la estructura química de la ligadura no es crítica, ya que sirve principalmente como un espaciador de la posición, unión, conexión, u optimiza la presentación o posición de una porción funcional en relación a una o más de otras porciones funcionales.

La invención se ilustra por los . siguientes ej emplos ,[ que no se pretenden para ser limitantes de ninguna manera.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Ensayo de Selección para Anticuerpos Neutralizantes contra KW-0761 El fármaco terapéutico KW-0761 (también conocido como "mogamulizumab" o "AMG 761") en desarrollo es un anticuerpo anti-CCR4 IgGl humanizado que funciona a través del mecanismo de citotoxicidad mediada por célula dependiente del anticuerpo (ADCC) in vivo. (Ishii et al., Defucosylated Humanized Anti-CCR4 Mo'noclonal Antibody. KW-0761 as a Novel Immunotherapeutic Agent for Adult T-cell Leukemia/Lymphoma, Clinical Cáncer Research 16: 1520-31 (2010); Shitara et al., Human CDR-grafted antibody and antibody fragment thereof, Patente EUA No. 7,504,104). Los fármacos enlazados al receptor de quimiocina CCR4 humana en la célula objetivo y FCyRIIIa humano- . (CD 16a) en . la ' célula efectora, Como resultado, la célula efectora es capaz de eliminar. la célula objetivo. Hemos desarrollado una modalidad del ensayo de enlace objetivo de función doble para la detección de anticuerpos neutralizantes (NAb) contra . KW-0761 al utilizar el método de detección de electroluminiscencia (ECL) MSD! La Figura 1 muestra una representación esquemática de una modalidad de un ensayo inventivo, como se configura para detectar un anticuerpo objetivo IgGl (por ejemplo, KW-01761) que enlaza específicamente una proteíná objetivo biotinilada de interés (por ejemplo, CCR4), y para detectar anticuerpos neutralizantes en una muestra de suero.

Brevemente, en esta modalidad de la presente invención, se agrega una muestra de reacción que contiene, el anticuerpo objetivo IgG (el fármaco terapéutico,, por ejemplo, KW 0761; Ishii et al, Defucosylated Humanized Anti-CCR4 Monoc lonal Antibody K -0761 as a Novel Immunotherapeutic Agent fo.r ¾dult T-cell Leukemia/Lymphoma, · Clinical Cáncer Research 16: 1520 31 (2010); Shitara. et al., Human CDR-grafted antibody and antibody fragment thereof, Patente EUA No. 7,504,104), una muestra de suero a probarse, y una porción de polipéptido de una proteina objetivo (por ejemplo, péptido biotina-CCR4 conjugado) a pozos cubiertos con estreptavidina en una placa (por ejemplo, una placa cubierta con estreptavidina de 96 pozos, catálogo MSD # L11SA-1, Meso Scale Discovery [MSD] , Gaithersburg, MD) . Después de que la. mezcla de reacción se incuba en la placa, la placa se lava antes de la adición de FCyRIIIa humano recombinante etiquetado con polihistidina (CD 16a) , seguido por incubación con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-polihistidina; el anticuerpo monoclonal ¿.nti-polihistidina de una especie animal diferente también puede usarse, si es conveniente. Finalmente, se genera la señal electroquimioluminiscente (ECL) con la adición del anticuerpo anti-ratón de cabra etiquetado con Sulfo-TAG™ (catálogo MSD # R32AC-1; también . puede usarse anticuerpo etiquetado de especies animales diferentes, si es conveniente, en tanto el anticuerpo reaccione específicamente con el anticuerpo anti-polihistidina que se usa) y la Solución Amortiguadora de Lectura T obtenida de MSD (catálogo MSD # R92TC-1) . La . Figura 2 muestra un diagrama de flujo de. las etapas del método de ensayo en esta modalidad de la invención. Si la muestra de suero contiene anticuerpos neutralizantes contra el anticuerpo objetivo IgG, el anticuerpo objetivo IgG no sera capaz de enlazarse al péptido biotina-CCR4 que se captura en las superficies . del pozo cubiertas con estreptavidina . En consecuencia, se genera una señal ECL baja en presencia de NAb. En ausencia de NAb, una señal ECL alta se genera debido a que el fármaco es capaz de construir un puente- entre el péptido biotina-GCR4 y el FCYRIIIa humano recombinante etiquetado con histidina (CD16a)'. ..Si el ensayo de selección indica la presencia de NAbs, entonces se. recomienda un ensayo de confirmación, tal como el descrito en el Ejemplo 2 en la presente. · Protocolo de Ensayo de Selección. Se llevó a cabo el siguiente protocolo de. ensayo detallado: 1. Pozos cubiertos con estreptavidina . en una placa de 96 pozos (catálogo MSD catalog # L11SA-1, Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) cada uno se bloquearon con 150 µL de solución amortiguadora de ensayo (Solución Salina Amortiguada en Fosfato de Dulbecco [pH 7.1 ± 0.1; "DPBS"; obtenida de Invitrogen]' + albúmina de suero de bovino al 1% (v/v) ["BSA"] ) . para cada pozo por al menos 1 hora a temperatura ambiente . para asegurar el bloqueo adecuado de los pozos. El bloqueo puede darse por más de una hora, si es conveniente, siempre que los pozos bloqueados se usen en el ensayo inventivo en el mismo dia. Se lavaron los pozos una vez con 200 µ??/???? de DPBS después de. bloquear. La solución amortiguadora de ensayo elegida fue mínima en dicationes de calcio o magnesio, sin embargo estos dicatjiones no se consideran que interfieren con el ensayo inventivo, 2. Se preparó la mezcla de reacción (50pL/pozo) que contiene anticuerpo objetivo IgG KW-0761 (20 ng/mL conc final), muestra de suero (10% (v/v) .conc. final), y conjugado biotina-péptido CCR4 (80 ng/mL conc. final) en solución amortiguadora de ensayo, . con volúmenes .' ajustado» a suficiencia para el¦ número deseado de pozos a ' los cuales la mezcla de reacción se necesita transferir en la etapa 3 enseguida. (a) La muestra de suero: 10 µL de muestra de suero al 50% (v/v) + 30 ^L de 34 ng/mL-KW-0761 diluida en solución amortiguadora de ensayo. (b) También se hicieron las siguientes muestras de control : control "N": 10 uL de suero humano agrupado 50% |(v/v) [de donadores normales] '("PHS"; obtenido de Bioreclamaition Inc., Long Island, NY) +¦ 30 yL de solución amortiguadora de ensayo; o control "D": 10 pL de PHS al 50% , (v/v) + 30, pL, cjle 34 ng/mL de KW-0761 diluido en solución amortiguadora de ensayo, control "P": 10 pL, de 50% (v/v). PHS formo picos con anticuerpo anti-K -0761 (solución madre policlonal ant:.-KW-0761 de conejo en una concentración de 1.02 mg/mL almacenada a -70°C) + 30 \iL de 34 ng/mL KW-0761 diluida en solución amortiguadora de ensayo.

La dilución a, 50%> (v/v) .de PHS. en estos controles o la muestra de suero se logró combinando con un volumen igual de solución amortiguadora de ensayo. Las muestras en #2 (.a) o #2 (b) de arriba se incubaron en una placa de polipropileno de fondo U- o V- con agitado moderado por 1 hora (±15 minutos) a temperatura ambiente., después de lo cual: (c) El conjugado de péptido biotina-CCR4 (10 iL, de 400 ng/mL péptido biotina-CCR4 se diluyó en una solución amortiguadora de ensayo preparada de . una solución madre 1 mg/mL-almacenada a -70°C; una vez descongelada, la solución madre se mantuvo a 4°C por no más de 1 mes) se colocó en alícuota en las muestras en #2 (a) o #2 (b) arriba para formar la mezcla de reacción. La porción de polipéptido biotillinado de CCR4 tuvo la secuencia de secuencia de aminoácido: MNPTDIADTTLDESIYSNYYLYESIPKP (BIOTIN) -OH// SEQ ID NO: 3 (comprada de Midwest Bio-Tech Inc., catálogo # MBT389£j); o alternativamente, MNPTDIADTTLDESIYSNYYLYESIPKPCTK (Biotin) -OH// SEQ I ID NO: 4, que se sintetizó y biotiniló por técnicas, químicas convencionales 3. La mezcla de reacción (incluyendo muestra de suero o la muestra (s) de control) de la etapa #2 arriba, se transfirió a cada pozo designado en la placa recubierta de streptavidina de la etapa #1 arriba ( SD catálogo # LI lSA-1, Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) . Cada pozo recibió 50 ^L, de la mezcla de reacción. La placa recubierta de estreptavldina entonces se incubó con agitación moderada a temperatura ambiente por 1 hora ( +15 minutos), después de lo. cual los pozos se lavaron tres veces con DPBS, 200 L, por. pozcj por lavado . 4. 50 de 80 ng/mL de FCyRIII recombinante etiquetado de polihistidiná (obtenido de Sistemas R&D, catálogo #4325 FC) diluidos en solución amortiguadora de ensayo se agregaron cada pozo designado en la placa recubiertal de estreptavidina, sé incubaron a temperatura ambiente I con agitación moderada por 1 .hora (±15 minutos), después, de lo PHS; (v/v) ) se muestra en la Figura 3.

La Figura A demuestra que el enlace KW-07.61 al péptido CCR4 biotinilado se inhibe por la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-KW-0761 policlonales en una manera dependiente de dosis.

Ejemplo 2: Protocolo de eliminación G/L de prqteina general para ensayo confirmatorio Si el ensayo de selección inventiva, por ejemplo,! como se describe en el Ejemplo 1 en la presenté, indica la presencia de anticuerpos neutralizantes en una muestra de suero, entonces se recomienda un ensayo de confirmación sensible. El siguiente protocolo de ensayo de confirmación emplea filtro de. muestra de suero de una incubación de Proteina G/L en el protocolo de ensayo de selección desjcrito en el Ejemplo 1 en la presente: 1. La resina agarosa de proteina G (Pierce catálogo # 20520) y la resina de agarosa . de proteina L (Pierce catálogo # 22851) se mezclaron en porciones iguales y entonces la mezcla de resina se . diluyó con salina amortiguadora de fosfato de Dulbecco (pH 7.1 + 0.1; . "DPBS"; obtenida de Invitrogen) para crear un .50% de mezcla espesa de Lecho ("Proteina G/L"). (Un volumen grande de.50%> mezcla espesa de lecho puede prepararse de antemano como un reactivo, dado a 50%> (v/v) combinando un volumen de cada muestra de suero con un volumen igual de solución amortiguadora de ensayo (Salina amortiguada de fosfato de Dulbecco [pH 7.1 ± 0.1; "DPBS"; obtenida de Invitrogen] + 1% (v/v) albúmina de suero bovino ["BSA"] ) . 6. Cada muestra diluida de suero se agregó a un peletizado de Próteina G/L correspondiente y a un peletizado Sefarosa 6B. Los pozos de placa de filtro se cubrieron con una tapa o sello superior. 7. Una placa de 96 pozos en un recipiente fresco se colocó debajo de la placa de filtro como una placa de recipiente, y la combinación de la placa receptora/placa de filtro se mezcló vigorosamente usando un agitador de placa o un dispositivo similar por al menos 30 minutos. Después de 30 minutos de mezcla, la combinación de placa receptora/placa de filtro se centrifugó a 1000-2000 RPM para recolectar lo filtrado en la placa receptora. 8. El filtrado recolectado en #7 arriba como se usa directamente en el ensayo de conformación, las etapas las cuales fueron las mismas como aquellas en los procedimientos de ensayo de selección descritos en el Ejemplo 1 e:i la presente. Para cada mezcla de reacción, ??µ?, de lo filtrado del tratamiento de la proteina G/L (o control, de filtro de Sefarosa 6B) deben de agregarse a 30 yL, of 34 ng/mL de KW-0761 (también conocido como "mogamulizumab" o "AMG ¡761' diluidos en solución amortiguadora de ensayo. Después dé que la muestra de suero filtrada y la mezcla de fármaco se incuban (como en el Ejemplo 1, etapa #2 (a) anteriormente en la presente) , 10 de 400 ng/mL de biotina-CCR4 se agregan para completar la mezcla de reacción (como en el Ejemplo 1, etapa #2 (c) anteriormente en la presente) . El resto de, las etapas #3-7 en el Ejemplo 1 se llevaron a cabo.

Ejemplo 3 : Ensayo de enlace de objetivo rituximab Rituximab (disponible de Genentech, un miembro del grupo Roche, . como Rituxan®). es un anticuerpo terapéutico IgGI monoclonal que selectivamente tiene como objetivo células CD20+B. (Hauser et al., B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting. múltiple sclerosis, NEJM 358:676-88 (2008)) . Uno de los mecanismos de acción propuestos de rituximab es ADCC. El, formato de ensayo de enlace de objetivo desarrollado para W-0761 como se describe in Ejemplo 1 en la presente, puede adaptarse para rituximab, que tiene un sitio de enlace CD 16a en su dominio Fe, al: ( i ) , remplazar KW-0761 en el Ejemplo 1, etapa #2 (a) -(b) anteriormente en la presente con cantidades similares de rituximab; |. (ii¡ remplazar el anticuerpo anti-KW-0761 de conejo en el Ejemplo 1, etapa #2 (b) con cantidades similares, de anticuerpo anti-rituximab de conejo; y (iii) remplazar el conjugado de péptido biotinilado-CCR4 en el Ejemplo 1, etapa #2 (c) anteriormente en la presente con cantidades similares «He un conjugado de péptido biotina-CD20 (por ejemplo, MBT|4736: (Biotina)- [ Ah JKGGYNCEPA NPSEKNSPST QYCYS IQSL 7/ SEQ ID N0:7; o MBT4737: YNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLK [Ahx] K(Biotina) NH2 // SEQ ID NO: 8; ambos comprados de idwest Bio-Tech [Incoen otras modalidades, (Biotin) KGGYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSL// SEQ ID NO: 5 o YNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLKK (Biotina)// SEQ ID N0:6 se usaron en lugar de las otras secuencias, que se sintetizaron y biotinilaron por medio de técnicas químicas convencionales) . Todas las otras . etapas en el Ejemplo 1 (#3-7) | son directamente adaptables sin modificación sustancial.

•Se ejecutó un experimento en el mismo formato de ehsayo descrito en el Ejemplo 1, pero se modificó en que una muestra de suero humano estuvo ausente y cualquier PHS, solicitado se remplazó por solución amortiguadora de ensayo (DPBS [pH 7.1 ± 0.1] + 1% [v/v] albúmina de suero bovino), el control "N que contiene PHS diluido en solución amortiguadora de ensayo estuvo ausente, el . ontrol "P" con anticuerpo anti-rituximab estuvo ausente, y el control "D" se ejecutó en concentraciones múltiples de rituximab para permitir la valoración del rituximab en el método de ensayo, (ver, Figura agregó, FCYRIIIa/CD16a. polihistidina humana recombinante etiquetada para enlazar al péptido biotina1 -CD20 (SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8) / complejo de rituximab qlue se capturó en la placa recubierta de estreptavidina |(ver, Ejemplo 1, etapa #1) . El ensayo de selección inventiva además fue conducido en todos los otros respectos como en él Ejemplo 1 en la presente. Brevemente, se generó la señal ECL con la adición de un anticuerpo monoclonal anti-polihistidina, seguido por el anticuerpo anti-ratón de cabra etiquetado con Sulfo-TAG™- y Solución amortiguadora T Read y y la señal se detectó con un lector SECTOR® Imager 6000 ( "MSD 6000"; Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) . , como se describe en el Ejemplo 1. La Figura 5 muestra datos representativos del experimento, demostrando que el enlace rituximab al conjugado de péptido CD20 biotihilizado fue detectado de una manera dependiente de dosis en el mismo formato de ensayo descrito en el Ejemplo 1, pero modificado como se describe en leste Ejemplo 3.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se. reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un método de ensayo in vitro, caracterizado porque comprende: detectar en un pozo recubierto con avidina al medir una señal, en la presencia de un volumen fresco de una solución amortiguadora que . permite la detección bajo condiciones fisiológicas, cualquiera de un anticuerpo que específicamente enlaza a la polihistidina, que ha enlazado un polipéptido CD16a humano recombinante etiquetado a polihistidina, en donde el pozo recubierto con avidina se ^bloqueó, previamente y posteriormente una mezcla de reacción pre-incubada se ha incubado en el pozo recubierto con avidina bloqueado, .bajo condiciones fisiológicas, en donde la mezcla de reacción pre-incubada se suspendió durante su pre-incubación en una solución amortiguadora de ensayo que contiene suero acuoso, y la mezcla de reacción, pre-incubada comprende : (i) una proteína, enlazada al antígeno objetivo que comprende un dominio Fe con un sitio enlazado a CD16a; y (i.i) una porción de polipéptido biotinilado de una prcteina objetivo de interés, a la cual la porción de polipéptido de la .proteína enlazada al antígeno objetivo se enlaza específicamente; y en donde, posterior a la incubación de la mezcla de reacción pre-incubada en el pozo recubierto con avidina, un polipéptido CD16a humano recombinante etiquetado a polihistidina suspendido en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo se incubó bajo condiciones fisiológicas, junto con cualquier proteína enlazada al antígeno objetivo que se enlazó a la porción de polipéptido biotinilada que se enlazó avia avidina del pozo recubierto con "avidina; y en donde, antes de detectar al medir la señal, el anticuerpo que específicamente enlaza a la polihistidina, suspendido en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo, se . incubó en el pozo bajo condiciones fisiológicas, junto con cualquier polipéptido CDl6a humano recombinante etiquetado a polihistidina que se enlazó a la proteína enlazada del antígeno objetivo. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende antes de detectar el anticuerpo que específicamente enlaza a la polihistidina, la etapa de incubar en el pozo, bajo condiciones fisiológicas, un anticuerpo que comprende una etiqueta que produce la señal conjugada, suspendido en un volumen fresco de la solución comprende una etiqueta fluorescente, una etiqueta isotópica, una etiqueta electroquimioluminiscente, o una enzima. 11. Un método de ensayo in vitro, caracterizado jorque comprende: (a) incubar en un pozo recubierto con avidina bloqueado, bajo condiciones fisiológicas, una mezcla de reacción pre-incubada suspendida en una solución amortiguadora- de ensayo que contiene suero acuoso, la mezcla de reacción pre-incubada comprende: (iii) un anticuerpo objetivo IgG que comprende un dominio Fe con un sitio enlazado a CD16a; y (iv) una porción de polipéptido biotinilado dé una proteína objetivo de interés, a la cual la porción de polipéptido enlaza específicamente el anticuerpo objetivo IgG; (b) incubar en el pozo, bajo condiciones fisiológicas, un polipéptido CD16a. humano recombinante etiquetado a polihistidina suspendido en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo, junto cón cualquier anticuerpo objetivo IgG que se enlazó a la porción de polipeptido biotinilada que se enlazó a la avidina en (a) ; (c) incubar en el pozo, bajo condiciones fisiológicas, un anticuerpo que enlaza específicamente polihistidina, el anticuerpo suspendido en un-, volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo, junto con cualquier polipeptido CD16a humano reoombinahte etiquetado a polihistidina que se enlazó al anticuerpo ' objetivo IgG en (b) ; y (d) detectar en el pozo, en la presencia de un ??l.'umen fresco de una solución amortiguadora que permite la detecccion bajo condiciones fisiológicas, cualquiera del anticuerpo que enlaza específicamente- polihistidina que se enlazó al polipéptido CD16a humano recombinante etiquetado a polihistidina en (c) al medir una señal. 12. El método de conformidad con la reivindicacióih 11, caracterizado porque la mezcla de reacción pre-incubada contiene además una muestra de suero para probarse para la presencia de anticuerpos neutralizantes. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo objetivo IgG es un anticuerpo IgGl o IgG3. 14. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la proteína objetivo de interés es CCR4 15. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la proteina objetivo de interés es CD20. 16. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la proteina objetivo de interés es EER2. 17. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la avidina es' estreptavidina . 18. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo que enlaza específicamente polihistidina comprende además una etiqueta que produce la señal conjugada 19. El método de conformidad con la. reivindicación 18, caracterizado porque la etiqueta que produce la Iseñal comprende una etiqueta fluorescente, una etiqueta isotópica, una etiqueta electroquimioluminiscente, o una enzima 20. El método de conformidad con la reivindicacióh 11, caracterizado además porque comprende antes de la etapa (d) la etapa de incubar en el pozó, bajo condic iones fisiológicas, 'un anticuerpo que comprende una etiqueta que produce la señal conjugada, suspendido en un volumen fresco de la solución amortiguadora , de ensayo, en donde el anticuerpo enlaza específicamente él anticuerpo que específicamente enlaza a la polihistidina en (c) . 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la etiqueta que produce la Iseñal comprende una etiqueta electroquimioluminiscente. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la etiqueta electroquimioluminis!cente comprende un complejo de rutenio. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la etiqueta . electroquimioluminiscenjte se forma a partir de un éster de N-hidroxisuccinimida 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el éster de N-hidroxisuccinimida tiene la estructura química: 25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la etiqueta electroquimioluminis cente comprende un complejo de rutenio que tiene . la siguiente fórmula, en donde la línea, trazada del grupo carbonilo muestra el enlace al resto de la molécula: método, de conformidad con la reivindicacióln 20, caracterizado porque la etiqueta que produce la señal comprende una etiqueta fluorescente, una etiqueta isotópica, o una enzima, 27. El método, de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el anticuerpo objetivo IgG es ' mogamuli zumab . 28. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo objetivo IgG es rituximab.. 29. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque. el anticuerpo objetivo IgG es trastuzumab . 30. Un método de ensayo in vitro, caracterizado jorque comprende : (a) incubar e un pozo recubierto con avidina bloqueado, bajo condiciones fisiológicas, una mezcla . de reacción pre- incubada suspendida en una solución amortiguadora . de ensayo que contiene suero acuoso, la mezcla de reacción pre-inqubada que comprende (i) un anticuerpo objetivo IgG contra CCR4 humanó que comprende un dominio Fe con un sitio enlazado a CD16a; (ii) muestra de suero para probarse para la presencia de anticuerpo neutralizantes; y (iii) una porción de polipéptido. biotinilado del CCR4 humano, a la cual la porción de polipéptido nlaza específicamente el anticuerpo objetivo IgG; (b) incubar en el pozo, bajo condiciones fisiológicas, un polipéptido CD16a humano recombinante etiquetado a polihistidina suspendido en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo, junto con cualquier anticuerpo objetivo IgG que se enlazó a la porción de polipéptido biotinilada de CCR4 humano que se enlazó a la avidina en (a); (e) incubar en el pozo, bajo condiciones . fisiológicas , un anticuerpo que enlaza específicamente polihistidina, el anticuerpo suspendido en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo, junto con cualquier polipéptido CD16a humano recombinante etiquetado a polihistidina que se enlazó al anticuerpo objetivo IgG en (b) ; (d) incubar en el pózo, bajo condiciones fisiológicas, un anticuerpo que comprende una etiqueta que produce la señal conjugada, se suspende en un volumen fresco de la solución amortiguadora de ensayo, en donde el anticuerpo enlaza específicamente el anticuerpo que específicamente enlaza] a la polihistidina en (c) ; y (e) detectar en el pozo, en la presencia de un vólumen fresco de una solución amortiguadora que permite la detección bajo condiciones fisiológicas, cualquier señal producida 31. El método de conformidad con la reivindicación 3.0, caracterizado porque la etiqueta que produce la Iseñal comprende una etiqueta electroquimioluminiscente . 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la etiqueta electroquimioluminisjcente comprende un complejo de rutenio. 33. El método de conformidad con la reivindicació 32, caracterizado . porque, la etiqueta electroquimioluminiscen|te se forma a partir de un éster de N-hidroxisuccinimida . 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el éster dé N-hidroxisuccinimida tiene la estructura química: 35. El método, de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la etiqueta electroquimioluminiscente comprende un complejo de rutenio. que tiene la siguiente fórmula, en donde la línea trazada del grupo carbonilo muestra el enlace al resto de la molécula: 36. El método de conformidad con la reivindicació! |n 30, caracterizado porque . la etiqueta que produce la señal comprende una etiqueta fluorescente, una etiqueta isotóópica, o una enzima 37. El método de conformidad con la reivindicaciqn 30, caracterizado porque la avidina es estreptavidina . 38. El método .de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado' porque . el anticuerpo objetivo IgG¦. es mogamulizumab .