CN107646038B

CN107646038B - 用于检测抗cd3同二聚体的基于细胞的测定

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Publication number: CN107646038B
Application number: CN201680030308.8A
Authority: CN
Inventors: K·卡里
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2036-05-27
Also published as: EP3303400A1; SI3303400T1; HRP20201779T1; EP3795679A1; HK1250045A1; US12007398B2; WO2016191750A1; ES2823033T3; EP3303400B1; US20200378987A1; MX2017015011A; SG10201911335TA; US10690678B2; KR20180013986A; AU2016267691B2; CN107646038A; IL255696B; JP6810058B2; US20180267055A1; AU2016267691A1

Abstract

本发明提供了一种用于鉴定和/或定量包含T细胞依赖性双特异性抗体(TDB)的组合物中抗CD3同二聚体的基于细胞的测定。在一些方面，将包含T细胞活化响应报告基因的本发明T细胞与所述TDB接触以检测抗CD3同二聚体的存在。还涵盖报告基因T细胞的组合物和试剂盒。

Description

用于检测抗CD3同二聚体的基于细胞的测定

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年5月28日提交的美国临时专利申请号62/167,761的权益，所述申请的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。

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发明领域

本发明提供了用于分析多特异性抗体的制剂的方法，其中所述多特异性抗体的至少一个抗原结合片段结合CD3。在一些实施方案中，本发明提供了用于确定一种或多种多特异性抗体的组合物中抗CD3同二聚体的存在的方法，其中多特异性抗体的至少一个抗原结合片段结合CD3。

发明背景

T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体被设计成结合在细胞上表达的靶抗原，并且通常通过结合T细胞受体的CD3e亚基而结合T细胞。双特异性抗体与靶抗原的胞外结构域和T细胞的CD3的结合导致T细胞募集至靶细胞，从而导致T细胞活化和靶细胞消减。在不存在靶细胞的情况下，单一抗CD3臂不能交联TCR以诱导T细胞活化和靶细胞杀死。抗CD3同二聚体是在TDB抗体的制造过程期间形成的与产物相关杂质，并且能够在存在或不存在靶细胞的情况下交联TCR并诱导低水平的T细胞活化。如果以高水平存在可能导致体外TDB生物学效能降低，则抗CD3同二聚体也可能影响治疗功效。抗CD3同二聚体可在不存在靶细胞的情况下通过诱导低水平的T细胞活化并且诱导T细胞产生炎症性细胞因子而具有脱靶效应。因此，需要控制TDB制造过程中存在的T细胞活化产物相关变体的水平，并且需要灵敏、可重复和定量的杂质测定方法以检测可能存在于纯化产物中的抗CD3同二聚体以支持安全且有效的临床药物候选物的发展。

杂质测定需要能够区分产物/过程相关的杂质和所需的产物。用于中国仓鼠卵巢细胞蛋白(CHOP)杂质检测的许多传统方法使用结合测定形式方法，其中可在产物中敏感地检测与过程相关的CHO蛋白的存在以评估产物纯度和安全性。这些CHOP抗体对CHOP蛋白是特异性的，但不能识别产物，因此在最终产物存在下一般对灵敏地检测杂质没有影响。类似的方法可用于双特异性抗体，前提条件是抗体可被鉴定，从而区分最终产物和杂质。可用的抗CD3同二聚体结合测定形式的实施将需要开发高度特化的抗体，一般来讲这对于此抗原或其他双特异性抗体可能是不可能的。还可使用可替代的基于生理化学的方法(RP-HPLC、质谱)来检测产物相关杂质，并且依靠从产物充分分离产物相关杂质，从而检测杂质存在量的能力。相对于材料中存在的其他物质，或者通过在变体标准品中掺料(spiking)并且比较存在的材料与掺料标准品的百分比来检测杂质的量。然而，这些方法中的许多可涉及另外的样品处理和处理步骤，以便将变体与所需产物材料分离，并且这些步骤可能改变材料或限制方法的灵敏度和准确度。此外，还期望知道可能存在于双特异性测试物品(纯化产物、DS、DP、稳定性样品、应激样品)中的任何抗CD3同二聚体产物相关杂质的结构同种型或其他潜在的T细胞活化杂质具有生物活性，以便将适当的风险归于杂质。本文所述的新型抗CD3同二聚体测定方法使用基于细胞的方法来检测生物活性抗CD3同二聚体杂质，从而避免使用结合测定或基于生理化学的形式在双特异性制剂中检测同二聚体杂质的挑战和限制。

本文所引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)均以引用的方式整体并入。

概要

本发明提供了用于检测包含T细胞依赖性双特异性抗体(TDB)的组合物中抗CD3同二聚体的方法，其中双特异性抗体包含靶抗原结合片段和CD3结合片段，所述方法包括使T细胞群体与组合物接触，其中T细胞包含编码可操作地连接至响应于T细胞活化的响应元件的报告基因的核酸，并且其中T细胞群体不包含靶抗原，其中报告基因的表达指示存在抗CD3同二聚体。

在以上实施方案的一些实施方案中，报告基因是萤光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。在另外的实施方案中，萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾(Renilla)荧光素酶或纳米荧光素酶。在一些实施方案中，响应于T细胞活化的响应元件是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。在一些实施方案中，响应于T细胞活化的响应元件包括来自NFAT、AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任何一者或多者的T细胞活化响应元件。

在以上实施方案的一些实施方案中，T细胞群体是CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞的群体。在一些实施方案中，T细胞群体是Jurkat T细胞或CTLL-2T细胞的群体。

在以上实施方案的一些实施方案中，T细胞群体与包含浓度范围为0.01ng/mL至50ng/mL的双特异性抗体的组合物接触。在一些实施方案中，在使细胞与组合物接触后1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20或24小时中的任何一者或多者之后检测报告基因。

在一些方面，本发明提供了用于定量包含TDB的组合物中抗CD3同二聚体抗体的量的方法，其中TDB包含靶抗原结合片段和CD3结合片段，所述方法包括使T细胞群体与组合物在一种或多种TDB浓度下接触，其中T细胞包含编码可操作地连接至响应于T细胞活化的启动子的报告基因的核酸，并且其中T细胞群体不包含靶抗原；将作为抗体浓度函数的报告基因的表达与通过使T细胞与不同浓度的纯化抗CD3同二聚体接触产生的标准曲线关联。

在以上定量组合物中抗CD3同二聚体抗体的量的一些实施方案中，报告基因是萤光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。在另外的实施方案中，萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。

在以上定量组合物中抗CD3同二聚体抗体的量的一些实施方案中，报告基因是萤光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。在另外的实施方案中，萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾(Renilla)荧光素酶或纳米荧光素酶。在一些实施方案中，响应于T细胞活化的响应元件是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。在一些实施方案中，响应于T细胞活化的响应元件包括来自NFAT、AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任何一者或多者的T细胞活化响应元件。

在一些方面，本发明提供了一种用于检测包含双特异性抗体的组合物中抗CD3同二聚体的工程化T细胞，其中双特异性抗体包含靶抗原结合片段和CD3结合片段，其中T细胞包含可操作地连接至响应于T细胞活化的响应元件的报告基因。

在以上方面的一些实施方案中，T细胞包含报告基因，其中报告基因是萤光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。在另外的实施方案中，萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。

在以上实施方案的一些实施方案中，T细胞包含报告基因，其中报告基因是萤光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。在另外的实施方案中，萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾(Renilla)荧光素酶或纳米荧光素酶。在一些实施方案中，响应于T细胞活化的响应元件是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。在一些实施方案中，响应于T细胞活化的响应元件包括来自NFAT、AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任何一者或多者的T细胞活化响应元件。

在一些方面，本发明提供了一种用于检测包含双特异性抗体的组合物中抗CD3同二聚体的试剂盒，其中双特异性抗体包含靶抗原结合片段和CD3结合片段，其中试剂盒包括工程化T细胞，所述工程化T细胞包含可操作地连接至响应于T细胞活化的响应元件的报告基因。在一些实施方案中，试剂盒还包括抗CD3同二聚体测定标准品和/或抗CD3同二聚体对照。

在以上试剂盒的一些实施方案中，报告基因是萤光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。在另外的实施方案中，萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。

在以上试剂盒的一些实施方案中，报告基因是萤光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。在另外的实施方案中，萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾(Renilla)荧光素酶或纳米荧光素酶。在一些实施方案中，响应于T细胞活化的响应元件是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。在一些实施方案中，响应于T细胞活化的响应元件包括来自NFAT、AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任何一者或多者的T细胞活化响应元件。

在以上试剂盒的一些实施方案中，T细胞群体是CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞的群体。在一些实施方案中，T细胞群体是Jurkat T细胞或CTLL-2T细胞的群体。

附图简述

图1A和1B示出CD20TDB(αCD20(Mab2；VH SEQ ID NO:31/VL SEQ ID NO:32)/αCD3(Mab1；VH SEQ ID NO:19/VL SEQ ID NO:20))需要抗原CD20表达靶细胞诱导T细胞活化和靶细胞杀死。图1A示出如通过CD69和CD25的表达所测量的CD8⁺细胞的活化。圆圈表示包括靶细胞的样品，并且正方形表示含有T细胞但没有靶细胞的样品。图1B示出在T细胞存在下(圆圈)或在CD3+T细胞从PBMC池中消减的样品中(正方形)杀死靶细胞。

图2示出抗CD3同二聚体可活化人供体T细胞。用增加量的纯化抗CD3同二聚体(三角形)或CD20TDB(圆圈)处理来自两个不同供体的人PBMC。通过人CD8⁺细胞群中的CD69⁺细胞％测量T细胞活化。对于来自供体1的细胞CD20TDB的EC₅₀是5.5ng/ml，并且对于来自供体2的细胞EC₅₀是4.4ng/ml。对于来自供体1的细胞抗CD3同二聚体的EC₅₀是526ng/ml，并且对于来自供体2的细胞EC₅₀是169ng/ml。

图3A示出抗CD3同二聚体可降低CD20TDB效能。使CD20TDB掺有不同量的抗CD3同二聚体并且测量和靶细胞(正方形)和T细胞(菱形)响应。图3B示出，掺到CD20TDB中的低水平抗CD3同二聚体不显著降低CD8⁺T细胞活化(左图)或CD4⁺T细胞活化(右图)。由圆圈表示CHOTDB，由正方形表示CHO TBD+2.5％HD和由三角形表示CHO TBD+5％HD。

图4A示出，抗CD3同二聚体可在不存在靶细胞的情况下弱活化来自各种人供体的人CD8^-T细胞。图4B-4E示出，人T细胞的抗CD3同二聚体活化显示一些代表性细胞因子增加的剂量依赖性趋势。对平均细胞因子水平响应均值进行绘图。

图5A示出使用报告基因测定可监测抗CD3同二聚体的T细胞活化。人Jurkat CD4⁺T细胞系被遗传工程化以稳定表达由各种T细胞受体(TCR)响应性转录响应元件(AP-1、NFAT和NFκB)驱动的萤火虫萤光素酶报告基因，选择稳定的细胞池，并且评估池对于用1010μg/mL纯化的抗CD3同二聚体处理4小时的响应。对荧光响应(萤光素酶报告基因活性)进行绘图，从Jurkat/NFκB荧光素酶稳定池中观察到最高响应。图5B示出Jurkat/NFκB荧光素酶稳定克隆。

图6A和6B示出，纯化的抗CD3同二聚体可在存在或不存在靶细胞的情况下活化T细胞。图6A示出对纯化的CD20TDB和纯化的抗CD3同二聚体活化T细胞的潜能的比较。表达NFκB荧光素酶报告基因的Jurkat T细胞在靶抗原表达细胞存在下由CD20TDB剂量依赖性地活化。CD20TDB在靶抗原表达细胞系存在下活化Jurkat/NFκB-萤火虫荧光素酶细胞。在共刺激性表达靶抗原的细胞存在下，纯化的CD20TDB比纯化的抗CD3同二聚体活性高1000倍。图6B示出，在不存在表达靶抗原的细胞的情况下(正方形)，CD20TDB不活化Jurkat/NFκB荧光素酶细胞，但纯化的抗CD3同二聚体剂量依赖性地诱导NFκB依赖性荧光素酶活性(菱形)。

图7示出CD20TDB样品中存在的抗CD3同二聚体的计算。将如由荧光读板仪(RLU)测量的从Jurkat/NFκBLuc样品处理的细胞观察到的荧光素酶活性与由已知量的抗CD3同二聚体产生的T细胞活化响应进行比较。使用从拟合到同二聚体标准响应的曲线导出的方程式来求解样品中存在的抗CD3同二聚体的浓度。然后根据样品中检测到的同二聚体除以样品中存在的CD20TDB的总量的比率来确定样品中存在的抗CD3同二聚体的百分比。

图8示出，抗CD3T细胞活化测定对于0.25％至35％的CD20TDB测试样品是准确的。抗CD3同二聚体的掺料回收率表明，分析方法在所述方法范围内是线性的，其中R²为0.99，斜率为1.05且y-int为0.078，并且示出最小偏差。

图9示出，T细胞活化测定能够检测其他的产物相关杂质。存在于CD20TDB材料中的HMWS水平影响同二聚体测定中的T细胞活化。

发明详述

本发明提供了用于检测包含T细胞依赖性双特异性抗体(TDB)的组合物中抗CD3同二聚体的方法，其中双特异性抗体包含靶抗原结合片段和CD3结合片段，所述方法包括使T细胞群体与组合物接触，其中T细胞包含编码可操作地连接至响应于T细胞活化的启动子的报告基因的核酸，并且其中T细胞群体不包含靶抗原，其中报告基因的表达指示存在抗CD3同二聚体。

在其他方面，本发明提供了用于检测包含TDB的组合物中抗CD3同二聚体的工程化T细胞，其中TDB包含靶抗原结合片段和CD3结合片段，其中T细胞包含可操作地连接至响应于T细胞活化的启动子的报告基因。

在其他方面，本发明提供了用于检测包含TDB的组合物中抗CD3同二聚体的试剂盒，其中TDB包含靶抗原结合片段和CD3结合片段，其中试剂盒包括工程化T细胞，所述工程化T细胞包含可操作地连接至响应于T细胞活化的启动子的报告基因。

I.定义

术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换用于指代任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可为直链型或分支型，其可包含经过修饰的氨基酸，并且其可由非氨基酸中断。所述术语还涵盖已经天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化，或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分或毒素缀合。在所述定义内还包括，例如，含有氨基酸的一种或多种类似物(包括，例如，非天然氨基酸，等等)的多肽、以及本领域已知的其他修饰。如本文所用的术语“多肽”和“蛋白质”具体地包括抗体。

“纯化的”多肽(例如，抗体或免疫粘附素)意指所述多肽的纯度已经提高，使得它以比其天然环境中存在和/或当在实验室条件下最初合成和/或扩增时的纯度更高的形式存在。纯度是一个相对的术语，并且不一定意味着绝对的纯度。

术语“拮抗剂”以最广义使用，并且包括部分或完全阻断、抑制或中和天然多肽的生物活性的任何分子。在类似的方式中，术语“激动剂”以最广义使用，并且包括模拟天然多肽的生物活性的任何分子。适合激动剂或拮抗剂分子明确包括天然多肽等的激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段、片段或氨基酸序列变体。用于鉴定多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括使多肽与候选激动剂或拮抗剂分子接触以及测量一种或多种通常与多肽相关的生物活性的可检测变化。

“结合”感兴趣的抗原(例如，肿瘤相关的多肽抗原靶标)的多肽是以足够的亲和力结合抗原，使得所述多肽可用作靶向表达所述抗原的细胞或组织的诊断剂和/或治疗剂，并且不与其他多肽显著地交叉反应。在此类实施方案中，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀法(RIA)测定，多肽与“非靶”多肽结合的程度将小于多肽与其特定靶多肽结合的约10％。

关于多肽与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性地结合”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位意指与非特异性相互作用有可测量的不同的结合。特异性结合可例如通过测定分子的结合相较于对照分子的结合来测量，所述对照分子一般为不具有结合活性的结构类似分子。例如，特异性结合可通过与类似于标靶(例如，过量未标记靶标)的对照分子的竞争来测定。就此而言，若标记靶标对探针的结合受到过量未标记靶标的竞争抑制，则指示为特异性结合。

本文中的术语“抗体”以最广义使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体(例如，包括TDB的双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文可与抗体互换使用。

抗体是天然存在的免疫球蛋白分子，其具有不同的结构，全部基于免疫球蛋白折叠。例如，IgG抗体具有进行二硫键结合以形成形成功能性抗体的两个“重”链和两个“轻”链。每个重链和轻链本身包含“恒定”(C)区和“可变”(V)区。V区确定抗体的抗原结合特异性，而C区在与免疫效应物的非抗原特异性相互作用中提供结构支持和功能。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体特异性结合特定抗原的能力。

抗体的抗原结合特异性由V区的结构特征决定。可变性在可变结构域的110个氨基酸跨度上不均匀分布。实际上，V区由具有15-30个氨基酸的称为框架区(FR)的相对不变伸长区组成，所述伸长区通过各自为9-12个氨基酸长的称为“高变区”(HVR)的极具可变性的较短区分开。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，主要采用由形成环连接的三个高变区连接的β-折叠构型，并且在一些情况下，形成β-折叠结构的一部分。各链的高变区由FR紧密靠近地结合在一起，并且与来自其他链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。虽然恒定结构域并不直接参与抗体与抗原结合，但表现各种效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

每个V区通常包含三个HVR，例如，互补决定区(“CDR”，各自含有“高变环”)和四个框架区。因此，抗体结合位点(以实质性亲和力结合特定的所需抗原需要的最小结构单位)通常将包括三个CDR，并且其间散布有至少三个，优选四个框架区以保持和呈现为适当构象的CDR。经典的四链抗体具有由V_H和V_L结构域协作定义的抗原结合位点。某些抗体，诸如骆驼和鲨鱼抗体缺乏轻链，并且仅依赖于由重链形成的结合位点。可制备单结构域工程化的免疫球蛋白，其中结合位点仅由重链或轻链形成，而不存在V_H与V_L之间的协作。

术语“可变”是指这样的事实，可变结构域的某些部分在抗体间的序列上广泛不同，并且用于各特定抗体对它的特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并非在抗体的整个可变结构域中均匀分布。在轻链与重链可变结构域中，所述可变性集中在三个称为高变区的片段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，主要采用由形成环连接的三个高变区连接的β-折叠构型，并且在一些情况下，形成β-折叠结构的一部分。各链的高变区由FR紧密靠近地结合在一起，并且与来自其他链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。虽然恒定结构域并不直接参与抗体与抗原结合，但表现各种效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

术语“高变区”(HVR)当在本文中使用时是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区可包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，V_L中的大约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及V_H中的31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，V_L中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及V_H中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。

“框架”或“FR”残基是除如本文所定义的高变区残基以外的那些可变结构域残基。

如本文所用，“T细胞依赖性双特异性”抗体或“TDB”是被设计为结合在细胞上表达的靶抗原，并且通常通过结合T细胞受体的CD3e亚基而结合T细胞的双特异性抗体。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双体；串联双体(taDb)、线性抗体(例如，美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体、单一可变结构域抗体、微型抗体、单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体(例如，包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFV)4-Fc、二-scFv、双-scFv或串联(二、三)-scFv)；以及双特异性T细胞衔接器(BiTE)。

木瓜蛋白酶消化抗体产生两个称为“Fab”片段的相同抗原结合片段，各自具有单个抗原结合位点和残余“Fc”片段，其名称反映其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')₂片段，其具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是含有完全抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区由一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域紧密、非共价缔合形成的二聚体构成。在此构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用以将抗原结合位点限定在V_H-V_L二聚体的表面上。总之，六个高变区赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单一可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个高变区的一半Fv)具有识别和结合抗原的能力，尽管与整个结合位点相比，处于较低的亲和力下。

Fab片段也含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab片段。Fab'-SH在本文中表示恒定域的半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab'。F(ab')₂抗体片段最初以之间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对形式产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。

来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可基于其恒定域的氨基酸序列指定为两种明显不同类型(称为卡帕(κ)和拉姆达(λ))中的一者。

取决于其重链的恒定域的氨基酸序列，抗体可归属于不同的类别。存在五种主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，并且这些类别中的几种可进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA以及IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ以及μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽进一步在V_H结构域与V_L结构域之间包含使得scFv能够形成为抗原结合所需的结构的多肽连接子。关于scFv的综述，参见Plückthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg and Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。

术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含于同一多肽链(V_H-V_L)中与轻链可变结构域(V_L)连接的重链可变结构域(V_H)。通过使用太短而不允许在相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。微型双功能抗体更充分描述于例如EP404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)中。

术语“多特异性抗体”以最广义使用，并且具体涵盖具有多表位特异性的抗体。此类多特异性抗体包括但不限于包含重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)的抗体(其中V_HV_L单元具有多表位特异性)、具有两个或更多个V_L和V_H结构域的抗体(其中每个V_HV_L单元结合不同的表位)、具有两个或更多个单一可变结构域的抗体(其中每个单一可变结构域结合不同的表位)、全长抗体、抗体片段(诸如Fab、Fv、dsFv、scFv)、双体、双特异性双抗体、三体、三功能抗体、共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”是指特异性结合至相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位的能力。“单特异性”是指结合仅一个表位的能力。根据一个实施方案，多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合每个表位的IgG抗体。

在一些实例中，多特异性抗体是双特异性抗体(例如，结合CD3和另一个表位的双特异性抗体)。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段。

制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链(参见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983)；WO 93/08829及Traunecker等，EMBO J.10：3655(1991))及“孔中钮(knob-in-hole)”工程化(参见例如美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可通过以下方式来制备：工程化用于制备抗体Fc杂二聚分子的静电牵引效应(WO 2009/089004A1)；交联两个或两个以上抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980及Brennan等，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等，J.Immunol.，148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术来制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等，J.Immunol.，152:5368(1994))；及如例如Tutt等J.Immunol.147：60(1991)中所述制备三特异性抗体。

措辞“单结构域抗体”(sdAb)或“单一可变结构域(SVD)抗体”通常是指其中单一可变结构域(VH或VL)可赋予抗原结合的抗体。换句话说，单一可变区不需要与另一可变区相互作用以识别靶抗原。单结构域抗体的实例包括衍生自骆驼(美洲驼和骆驼)和软骨鱼(例如，护士鲨)的那些和衍生自人和小鼠抗体的重组方法的那些(Ward，ES等，Nature(1989)341:544-546；Dooley，H.等，Dev Comp Immunol(2006)30:43-56；Muyldemans S等，TrendBiochem Sci(2001)26:230-235；Holt，LJ等，Trends Biotechnol(2003):21:484-490；WO2005/035572；WO 03/035694；Davies，J等，Febs Lett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO 02/051870)。

本文所用的术语“单克隆抗体”是指由实质上均质抗体的群体获得的抗体，即除可在产生单克隆抗体期间出现的可能变体(所述变体一般以少量存在)之外，构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。除特异性外，单克隆抗体的优势在于它们不会受到其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体是从实质上均质的抗体群体获得的特性，且不应解释为需要通过任何特定方法来产生所述抗体。例如，待根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等，Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)制备。“单克隆抗体”也可使用例如Clackson等，Nature 352:624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库分离。

本文中的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源；以及所述抗体的片段，只要其展现所需生物活性即可(美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(例如旧世界猴(诸如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体(美国专利号5,693,780)。

“人源化”形式的非人(例如鼠类)抗体是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体大部分是人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的高变区的残基经来自如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的非人类物种(供体抗体)的高变区的具有所需特异性、亲和力和能力的残基替换。在有些情况下，所述人免疫球蛋白的构架区(FR)残基由相应非人残基替换。另外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有见到的残基。进行这些改性以进一步精制抗体性能。通常，所述人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的基本全部，其中全部或基本全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环且全部或基本全部的FR是除了如上所述的FR取代之外的人免疫球蛋白序列的那些FR。所述人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常人类免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区的至少一部分。更多细节参见Jones等，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332:323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。

出于本文的目的，“完整抗体”是包含重链和轻链可变结构域以及Fc区的抗体。恒定域可为天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应功能。

“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，包含两条相同轻(L)链和两条相同重(H)链。每一轻链都借助一个共价二硫键连接到一个重链，但不同免疫球蛋白同种型的重链中二硫键的数量不同。各重链和轻链还具有规律间隔的链内二硫桥键。各重链在一端具有可变结构域(V_H)，继而为多个恒定结构域。各轻链在一端具有可变结构域(V_L)且在它的另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对准，且轻链可变结构域与重链的可变结构域对准。据悉，具体的氨基酸残基形成了轻链可变结构域与重链可变结构域之间的界面。

“裸抗体”是未与异源分子(诸如，细胞毒性部分或放射性标记物)缀合的抗体(如本文所定义的)。

在一些实施方案中，抗体“效应功能”是指可归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变异Fc区)并且随着抗体同种型而变化的那些生物活性。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀手(Natural Killer，NK)细胞、嗜中性白细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体且随后导致靶细胞裂解。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)的第464页上的表3中。为了评估感兴趣的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。用于此类测定的有用效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或另外地，感兴趣的分子的ADCC活性可例如在动物模型，诸如Clynes等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中进行体内评估。

“人效应细胞”是表达一个或多个FcR并且执行效应功能的白细胞。在一些实施方案中，所述细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMC和NK细胞是优选的。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体存在下裂解靶标的能力。补体活化途径通过使补体***的第一成分(C1q)结合与同源抗原复合的分子(例如多肽(例如抗体))而启动。为了评估补体活化，可执行CDC测定，例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202:163(1996)中描述。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合于抗体Fc区的受体。在一些实施方案中，FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，所述受体具有主要在其细胞质域方面不同的类似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其细胞质域中含有免疫受体酪氨酸基活化基元(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质域中含有免疫受体酪氨酸基抑制基元(ITIM)。(参见

Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR综述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等，Immunomethods 4:25-34(1994)；以及deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来待鉴定的FcR。所述术语也包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)及Kim等，J.Immunol.24:249(1994))。

“杂质”是指与所需多肽产物不同的物质。在本发明的一些实施方案中，杂质包括多肽的电荷变体。在本发明的一些实施方案中，杂质包括抗体或抗体片段的电荷变体。在本发明的其他实施方案中，所述杂质包括但不限于：宿主细胞材料，诸如CHOP；浸出蛋白A；核酸；所需多肽的变体、片段、聚集体或衍生物；另一种多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基组分等。在一些实例中，杂质可以是来自例如但不限于细菌细胞(诸如大肠杆菌细胞)、昆虫细胞、原核细胞、真核细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽细胞、真菌细胞等的宿主细胞蛋白(HCP)。在一些实例中，杂质是同二聚体(例如，抗CD3同二聚体)。

如本文所用，术语“免疫粘附素”指代将异源多肽的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能组合的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包含不同于抗体的抗原识别和结合位点(即，是“异源的”)的具有所需结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可从诸如以下各项的任何免疫球蛋白获得：IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。

如本说明书中使用的“报告分子”意指通过其化学性质提供可分析鉴定信号的分子，所述信号允许检测抗原结合的抗体。这种类型测定中最常用的报告分子是酶、荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。

如本文所用，“基本上相同”表示值或参数没有显著效果的改变。例如，如果离子强度没有显著变化，则色谱流动相在柱出口处的离子强度基本上与流动相的初始离子强度相同。例如，柱出口处的在初始离子强度的10％、5％或1％内的离子强度基本上与初始离子强度相同。

本文中包括对“约”某一个值或参数的提及包括(以及描述)针对所述值或参数本身的变量。例如，关于“约X”的描述包括“X”的描述。

除非上下文另有明确规定，否则在本文和附加的权利要求书中使用的单数形式“一个”、“或”和“所述”包括复数指示物。应理解，本文中描述的本发明的方面和变型包括“由方面和变型组成”和/或“主要由方面和方面组成”。

II.基于细胞的报告基因测定

本发明提供基于细胞的测定以检测存在于包含TDB的组合物中的抗CD3同二聚体，其中TDB的一个抗原结合片段结合CD3并且活化T细胞。

A.T细胞活化

TDB的作用机制是特异性地消减靶抗原表达细胞。TDB与T细胞受体(TCR)的CD3e亚基和靶细胞表面上表达的靶抗原的同时结合导致TCR簇集，从而引起T细胞活化和靶细胞的细胞毒性消减。在临床中已经存在许多TDB(αCD3/αCD19、αCD3/αCD20、αCD3/αHER2；de GastGC等，1995，Cancer Immunol Immunother.40(6):390-396；Buhmann R等，2009Bone MarrowTransplant.43(5):383-397；Chan JK等，2006，Clin Cancer Res.12(6):1859-1867)，并且正在评估新型式的TDB样双特异性以改善临床疗效(Chames，P.和Baty，D.2009，MAbs 1(6):539-547；Fournier，P.和Schirrmacher，V.，2013，BioDrugs 27(1):35-53)。TDB双特异性能够活化CD4⁺和CD8⁺T细胞谱系，前提条件是存在正确靶表达细胞。CD4⁺T细胞的活化将导致诱导细胞因子基因表达(IL-2等)，从而引起其他免疫细胞的募集和活化，包括CD8⁺T细胞的扩增和增殖。由通过TDB介导的细胞桥接与靶细胞形成免疫突触样结构所产生的CD8⁺CTL活化引起CTL活化、诱导穿孔素和颗粒酶(A、B、C；取决于CTL亚型)的转录、脱颗粒(degranulization)，以及穿孔素和颗粒酶在靶标与效应细胞之间的‘免疫突触’样界面上的局部释放，从而导致靶细胞的杀死(Pores-Fernando，Pores-Fernando AT，Zweifach A，2009，Immunol Rev.，231(1):160-173；Pipkin，ME等，2010，Immunol Rev.，235(1):55-72)。效应细胞介导的细胞杀死是一个相对缓慢的过程，需要将突触稳定几个小时，并且需要转录依赖性活化prf1基因和颗粒酶基因以确保完全细胞杀死。另选地，CTL介导的靶细胞杀死也已被证实通过Fas介导的细胞凋亡发生(Pardo，J等，2003，Int Immunol.，15(12):1441-1450)。prf1、grB和Fas介导的细胞杀死机制的转录调控取决于位于介导B细胞消减所需的基因启动子内的NFAT、NFκB和STAT增强子元件(Pipkin，ME等，2010，Immunol Rev.，235(1):55-72；Pardo，J等，2003，Int Immunol.，15(12):1441-1450)。靶标与效应细胞(免疫突触)之间的相互作用的强度取决于来自其的信号传导也是稳定和维持靶标与效应细胞之间的相互作用所必需的其他共刺激分子(Krogsgaard M等，2003，Semin Immunol.15(6):307-315；Pattu V等，2013，Front Immunol.，4:411；Klieger Y等，2014，Eur J Immunol.44(1):58-68；Schwartz JC等，2002，Nat Immunol.3(5):427-434)。因此，通过使用报告基因测定来监测靶基因的转录诱导是用于观察TDB对T细胞的活化的MOA反射性另选测定***。

T细胞活化需要细胞表面蛋白质和信号分子在抗原呈递细胞的接触位点处的空间和动力学重组，以形成免疫突触。T细胞受体(TCR)和共刺激受体(CD28、CD40、ICOS等)以及配体的活化和信号传导的协调调控T细胞活化所需的持续时间和信号传导。抗原呈递细胞(APC)表面上的通过MHC进行的抗原呈递被T细胞表面上的TCR识别。MHC和TCR簇集启动可引起T细胞活化的信号传导途径的募集和活化，这取决于在调节T细胞活化中起关键作用的共刺激和免疫调节受体的表达。针对TCR亚基的抗体，诸如CD3e(OKT3；Brown，WM，2006，CurrOpin Investig Drugs 7:381-388；Ferran，C等，1993Exp Nephrol 1:83-89)可通过交联TCR诱导T细胞活化，从而模拟TCR在免疫突触处的簇集，并且已经在临床上使用，并且作为代用活化剂用于体外研究TCR信号传导使用多年。通过抗CD3抗体而非共刺激进行的TCR簇集弱活化T细胞，但仍然引起T细胞活化和有限的细胞因子转录和释放。已显示抗CD3介导的信号传导活化几种转录因子，包括NFAT、AP1和NFκB(MF等，1995，J.Leukoc.Biol.57:767-773；Shapiro VS等，1998，J.Immunol.161(12)6455-6458；Pardo，J等，2003，Int Immunol.，15(12):1441-1450)。共刺激通过调节影响细胞因子表达的转录调控的信号传导来调控细胞因子释放的水平和类型，这影响T细胞活化响应的性质(Shannon，MF等，1995，J.Leukoc.Biol.57:767-773)。T细胞的细胞表面上的TDB双特异性簇TCR作为T细胞与靶抗原表达细胞之间形成的桥的结果。在T细胞系中测试驱动由T细胞活化诱导、可以是转录性的报告基因表达的转录调控元件，以确定哪些事件在存在和不存在靶细胞的情况下由TDB活化。

B.报告分子

报告基因测定是通过监测细胞中报告基因表达的诱导实现刺激的生物学表征的分析方法。刺激引起细胞内信号传导途径的诱导，其导致通常包括调节基因转录的细胞响应。在一些实例中，细胞信号传导途径的刺激通过调控和募集转录因子至引起蛋白质产生的RNA转录起始所需的DNA的上游非编码区导致基因表达的调节。需要控制响应于刺激的基因转录和翻译，以引发大部分生物反应，诸如细胞增殖、分化、存活和免疫响应。DNA的这些非编码区(还称为增强子)含有是用于转录因子的识别元件的特定序列，所述特定序列调控基因转录的效率，并且因此调控细胞响应于刺激所产生的蛋白质的量和类型。在报告基因测定中，响应于刺激的增强子元件和最小启动子被工程化以使用标准分子生物学方法驱动报告基因的表达。然后将DNA转染到含有特异性响应于刺激的所有机制的细胞中，并且测量报告基因转录、翻译或活性的水平以作为生物响应的代用量度。

在一些方面，本发明提供了通过使T细胞群体与组合物接触来检测包含TDB的组合物中的抗CD3同二聚体的方法，其中T细胞包含编码报告基因的核酸，所述报告基因可操作地连接至响应于CD3活化的启动子使得报告基因的表达指示抗CD3同二聚体的存在。报告分子可以是可针对其开发测定法以测量由细胞响应于刺激所产生的分子的量的任何分子。例如，报告分子可以是由响应于刺激(例如，T细胞活化)的报告基因编码的报告蛋白。报告分子的常用实例包括但不限于发光蛋白(诸如萤光素酶)，其发出作为底物催化的副产物的光，所述光可通过实验测量。萤光素酶是一类衍生自许多来源的发光蛋白质，包括萤火虫荧光素酶(来自物种北美萤火虫(Photinus pyralis))、来自海洋三色堇(Renillareniformis)的海肾萤光素酶、叩头虫萤光素酶(来自Pyrearinus termitilluminans)、海洋桡足类Gaussia萤光素酶(来自Gaussia princeps)以及深海虾纳米萤光素酶(来自细角刺虫下(Oplophorus gracilirostris))。萤火虫萤光素酶催化萤光素氧化成氧化萤光素从而导致发射光光子，而其他萤光素酶(诸如海肾)通过催化腔肠素发出光。可使用不同的过滤***来读取由不同荧光素酶形式和变体发出的光的波长，这有利于多路复用。荧光的量与细胞中表达的萤光素酶的量成比例，并且萤光素酶基因已经被用作敏感的报告基因来评估刺激引发生物响应的影响。报告基因测定已经用于广泛范围的目的多年，包括基础研究、HTS筛选和关于效能(Brogan J等，2012，Radiat Res.177(4):508-513；Miraglia LJ等，2011，Comb Chem High Throughput Screen.14(8):648-657；Nakajima Y和OhmiyaY.2010，Expert Opin Drug Discovery，5(9):835-849；Parekh BS等，2012，Mabs，4(3):310-318；Svobodova K和Cajtham L T.，2010，Appl Microbiol Biotechnol.，88(4)：839-847)。

在一些实施方案中，本发明提供了基于细胞的测定来检测TDB组合物中的抗CD3同二聚体，其中T细胞编码响应于T细胞活化的报告基因构建体。在一些实施方案中，报告基因构建体包含萤光素酶。在一些实施方案中，萤光素酶是萤火虫荧光素酶(例如，来自物种北美萤火虫)、来自海洋三色堇的海肾萤光素酶(例如，来自物种Renilla reniformis)、叩头虫萤光素酶(例如，来自物种Pyrearinus termitilluminans)、海洋桡足类Gaussia萤光素酶(例如，来自物种Gaussia princeps)以及深海虾纳米萤光素酶(例如，来自物种细角刺虫下)。在一些实施方案中，萤光素酶在工程化T细胞中的表达表明TDB组合物中存在抗CD3同二聚体。在其他方面，报告基因构建体编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)；荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)及其变体等；氯霉素乙酰转移酶(CAT)；β-半乳糖苷酶；β-内酰胺酶；或分泌的碱性磷酸酶(SEAP)。

在本发明的一些方面，编码报告分子(例如，报告蛋白)的核酸可操作地连接至响应于T细胞活化的启动子和/或增强子。在一些实施方案中，响应于T细胞活化的启动子和/或增强子是表达控制序列。表达和克隆载体通常含有由宿主生物识别，并且可操作地连接至编码多肽(例如，报告多肽)的核酸的启动子。适当地，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞(例如，T细胞)的载体中的真核启动子***。一旦已经将载体并入适当宿主中，就将宿主保持在适于在T细胞活化后高水平表达核苷酸序列的条件下。

启动子序列对于真核生物是已知的。事实上所有的真核基因均具有富含AT的区，所述区位于转录起始位点的上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录开始的上游70至80个碱基处发现的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'末端的是AATAAA序列，其可以是用于将poly A尾添加到编码序列的3'末端的信号。所有这些序列适当地***真核表达载体中。

在本发明的一些方面，本发明提供了包含编码报告分子的核酸的T细胞，所述报告分子在响应于T细胞活化的启动子的控制下。响应于T细胞活化的启动子是本领域已知的。

在其他实施方案中，本发明提供了包含编码报告分子的核酸的T细胞，所述报告分子在可操作地连接至响应于T细胞活化的增强子元件的最小启动子的控制下。在一些实施方案中，最小启动子是胸苷激酶(TK)最小启动子、来自巨细胞病毒(CMV)的最小启动子、SV40衍生的启动子或最小延伸因子1α(EF1α)启动子。在一些实施方案中，编码报告分子的核酸在由T细胞活化响应性DNA识别元件调控的最小TK启动子的控制下。在一些实施方案中，T细胞活化响应性DNA识别元件是NFAT(活化T细胞的核因子)增强子、AP-1(Fos/Jun)增强子、NFAT/AP1增强子、NFκB增强子、FOXO增强子、STAT3增强子、STAT5增强子以及IRF增强子。增强子可在多肽编码序列的5'或3’位置处拼接到载体中，但在一些实施方案中，位于启动子的5’位点处。在一些实施方案中，本发明提供了T细胞，其中荧光素酶基因可操作地连接至最小TK启动子，所述TK启动子又可操作地连接至NFκB响应增强子元件。

在本发明的一些实施方案中，用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物的有核细胞)中的表达报告载体也将含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’和偶尔3'非翻译区中获得。一种可用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026和在其中公开的表达载体。

在一些实施方案中，本发明提供了用于在T细胞中表达报告分子的载体。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、含有用于许多限制性核酸内切酶的识别序列的多克隆位点、增强子元件、启动子(例如，响应于T细胞活化的增强子元件和/或启动子)以及转录终止序列。在一些实施方案中，载体是质粒。在其他实施方案中，载体是重组病毒基因组；例如，重组慢病毒基因组、重组逆转录病毒基因组、重组腺相关的病毒基因组。含有多核苷酸序列的载体(例如，可操作地连接至T细胞响应启动子/增强子的报告基因)可通过公知的方法转移到宿主T细胞中。例如，可使用磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、基因枪或基于病毒的转染。(一般参见Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,第2版，1989)。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。

C.细胞

在一些方面，本发明提供了一种基于细胞的测定以通过接触包含响应于T细胞活化的报告复合物的T细胞群体来检测包含TDB的组合物中的抗CD3同二聚体。在一些实施方案中，所述群体的T细胞是CD4⁺T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8⁺T细胞。在其他实施方案中，T细胞是CD4⁺/CD8⁺T细胞。在一些实施方案中，CD4⁺和/或CD8⁺T细胞表现出选自由IFN-γ、TNF-α和白介素组成的组的细胞因子的释放增加。在一些实施方案中，T细胞群体是永生化T细胞群体(例如，永生化T细胞系)。在一些实施方案中，T细胞群体是表达TCR/CD3e的永生化CD4⁺和/或CD8⁺细胞群体。在一些实施方案中，T细胞是Jurkat细胞。在一些实施方案中，T细胞是CTLL-2T细胞。

在一些实施方案中，本发明的T细胞包含T细胞受体。T细胞受体作为几种蛋白质的复合物存在。T细胞受体本身由通过独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因编码的两条独立肽链组成。复合物中的其他蛋白质包括CD3蛋白质：CD3ε(也称为CD3e)、CD3γ、CD3δ和CD3ζ。CD3蛋白被发现为CD3εγ和CD3εδ异二聚体和CD3ζ同二聚体。CD3ζ同二聚体允许信号复合物在这些蛋白质周围聚集。在一些实施方案中，TDB的一个臂结合T细胞受体复合物。在一些实施方案中，TDB结合CD3。在一些实施方案中，TDB结合CD3ε(CD3e)蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供了包含T细胞的组合物，其在基于细胞的测定中使用以检测和/或定量TDB组合物中的抗CD3同二聚体。在一些实施方案中，组合物的T细胞是CD4⁺T细胞。在一些实施方案中，组合物的T细胞是CD8⁺T细胞。在其他实施方案中，组合物的T细胞是CD4⁺/CD8⁺T细胞。在一些实施方案中，组合物的T细胞是永生化T细胞。在一些实施方案中，组合物的T细胞是Jurkat细胞。在一些实施方案中，组合物的T细胞是CTLL-2T细胞。在一些实施方案中，组合物的T细胞包含响应于T细胞活化的报告复合物。在一些实施方案中，报告复合物包含编码萤光素酶的多核苷酸。在一些实施方案中，萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。在一些实施方案中，编码报告基因(例如，萤光素酶)的多核苷酸可操作地连接至T细胞活化响应性调控元件(例如，T细胞活化响应性启动子和/或增强子)。在一些实施方案中，响应于T细胞活化的启动子是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。

在一些实施方案中，筛选其中已经引入了T细胞活化响应性报告基因构建体的T细胞(报告基因T细胞)用于抗CD3同二聚体的活化。例如，可通过有限稀释来分离稳定的克隆，并且针对它们对纯化的抗CD3同二聚体的响应进行筛选。在一些实施方案中，用大于约1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL或10μg/mL中的任何一者的纯化抗CD3同二聚体筛选稳定的报告基因T细胞。

在一些实施方案中，本发明提供了用T细胞活化报告复合物工程化的T细胞的组合物。在一些实施方案中，报告基因是萤光素酶、荧光蛋白(例如GFP、YFP等)、碱性磷酸酶或β半乳糖苷酶。在一些实施方案中，萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。在一些实施方案中，响应于T细胞活化的启动子是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。在一些实施方案中，响应于T细胞活化的启动子包括来自NFAT、AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任何一者或多者的T细胞响应元件。在一些实施方案中，T细胞的组合物包含CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞。在一些实施方案中，T细胞是Jurkat细胞或CTLL-2细胞。在一些实施方案中，T细胞是包含编码可操作地连接至NFκB启动子的荧光素酶的多核苷酸的Jurkat细胞。

D.鉴定CD3同二聚体的方法

在一些方面，本发明提供了用于检测包含TDB的组合物中抗CD3同二聚体的方法，其中TDB抗体包含靶抗原结合片段和CD3结合片段，所述方法包括使T细胞群体与组合物接触，其中T细胞包含编码可操作地连接至响应于T细胞活化的启动子的报告基因的核酸，并且其中T细胞群体不包含靶抗原，其中报告基因的表达指示存在抗CD3同二聚体。在一些实施方案中，T细胞群体不包含表达TDB的靶抗原(非T细胞抗原)的细胞。

在一些实施方案中，使T细胞群体与包含浓度范围为以下各项中的任何一者的TDB的组合物接触：约0.01ng/mL至约50ng/mL、约0.05ng/mL至约50ng/mL、约0.1ng/mL至约50ng/mL、约0.5ng/mL至约50ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、约5ng/mL至约50ng/mL、约10ng/mL至约50ng/mL、约0.01ng/mL至约40ng/mL、约0.01ng/mL至约30ng/mL、约0.01ng/mL至约20ng/mL、约0.01ng/mL至约10ng/mL、约0.01ng/mL至约5ng/mL、约0.01ng/mL至约1ng/mL、约0.01ng/mL至约0.5ng/mL、约0.01ng/mL至约0.1ng/mL、约0.01ng/mL至约0.05ng/mL、约0.1ng/mL至约10ng/mL、约0.5ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL或约5ng/mL至约50ng/mL。

在一些实施方案中，在使细胞与组合物接触大于约1h、约2h、约3h、约4h、约5h、约6h、约7h、约8h、约9h、约10h、约12h、约16h、约20h或约24h中任何一者后检测报告基因。在一些实施方案中，在使细胞与组合物接触约1h与约24h、约1h与约12h、约1h与约8h、约1h与约6h、约1h与约4h、约1h与约2h、约4h与约24h、约4h与约12h、约4h与约8h、约8h与约24h、约8h与约12h、约16h与约24h、约16h与约20h或约20h与约24h中任何一者之间后检测报告基因。

在一些方面，本发明提供了用于定量包含TDB的组合物中抗CD3同二聚体抗体的量的方法，其中TDB包含靶抗原结合片段和CD3结合片段，所述方法包括使T细胞群体与组合物在一种或多种TDB浓度下接触，其中T细胞包含编码可操作地连接至响应于T细胞活化的启动子的报告基因的核酸，并且其中T细胞群体不包含靶抗原；将作为抗体浓度函数的报告基因的表达与通过使T细胞与不同浓度的纯化抗CD3同二聚体接触产生的标准曲线关联。制备抗CD3同二聚体测定标准品(已知浓度的纯化的抗CD3同二聚体)、抗CD3同二聚体对照和TDB测试样品的稀释液，并且加入到报告基因T细胞中。在定时孵育后，测量由同二聚体测定标准品、同二聚体对照和TDB测试样品诱导的报告基因活性的量。根据由抗CD3同二聚体测定标准品产生的标准曲线确定TDB测试样品中生物活性抗CD3同二聚体的数量。通过存在的抗CD3同二聚体的数量相对于测试样品中存在的TDB总量的比率来确定存在于测试样品中的抗CD3同二聚体的百分比。

在一些实施方案中，通过使报告基因T细胞与范围为约0.01ng/mL至约50ng/mL中任何一者的多个浓度的抗CD3同二聚体接触产生抗CD3同二聚体测定标准品的标准曲线。在一些实施方案中，抗CD3同二聚体标准品的多个浓度包括100/mL ng、150ng/mL、200ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、750ng/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL或500μg/mL中的任何一者。在一些实施方案中，抗CD3同二聚体标准品的多个浓度是约3、4、5、6、7、8、9、10个或超过10个的浓度。

通过将已知数量的纯化量的抗CD3同二聚体掺到TDB制剂中并且测量抗CD3同二聚体的回收百分比来评估所述方法的准确度。在一些实施方案中，通过将大于约100ng、150ng、200ng、250ng、500ng、750ng、1μg、2.5μg、5μg、10μg、25μg、50μg、100μg、250μg或500μg中任何一者的纯化抗CD3同二聚体加入到约1mg/mL的αCD20/αCD3 TDB原液中来产生抗CD3同二聚体和TDB的一种或多种混合物。

E.测定开展

以下是开发基于细胞的测定以检测TDB制剂中的抗CD3同二聚体的示例性但非限制性的方法。

DNA构建体：使用慢病毒来产生用于评估TDB双特异性抗体纯度的稳定细胞系。构建慢病毒载体，其在由NFAT(活化T细胞的核因子)、AP-1(Fos/Jun)、NFAT/AP1、NFκB、FOXO、STAT3,5和IRF的DNA识别元件调控的最小TK启动子的控制下表达报告基因萤火虫萤光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。用于产生稳定报告基因细胞系的慢病毒表达盒可以是第三代自灭活双顺反子载体，其在组成型启动子/增强子(EF1α或SV40)的控制下表达各种抗生素选择标记以使得能够产生稳定的细胞系。所使用的报告基因慢病毒载体是由可商购获得的载体pCDH.MCS.EF1a.Puro(SBI biosciences；目录号CD510B-1)修饰的。启动子修饰包括去除CMV最小启动子和用各种增强子元件(NFAT、NFκB等)取代、添加来自pRK5.CMV.荧光素酶的最小核心RNA聚合酶启动子(TATA盒)(Osaka，G等，1996J Pharm Sci.1996，85:612-618)以及取代来自内部DNA的不同的选择盒(来自pRK5.tk.neo的新霉素抗性基因、来自pRK5.tk.hygro的潮霉素抗性基因；和来自pRK5.tk.杀稻瘟菌素的杀稻瘟菌素抗性基因)。用于选择的组成型启动子对增强子元件的活化的影响是极小的，这归因于掺入了设计为使启动子/增强子串扰最小化的DNA的非编码伸长区。将来自pRK5.CMV.荧光素酶(Osaka，1996)的萤火虫萤光素酶克隆到修饰的慢病毒亲本载体的HindIII-NotI位点中。包括海肾荧光素酶和纳米萤光素酶的其他发光蛋白也可被亚克隆到HindIII-NotI位点中。可获得(pCMV.VSV-G)或产生(pCMV.HIVΔ、pCMV.REV)用于从293s(293悬浮液适应的细胞系)细胞的瞬时转染产生病毒原液的慢病毒包装构建体(pCMV.HIVΔ、pCMC.VSV-G和pCMV.Rev)。HIV菌株MN(Nakamura，GR等，1993，J.Virol.67(10):6179-6191)可用于产生pCMV.HIVΔ包装载体并且含有内部EcoRI部分消化缺失以通过缺失使HIV病毒包膜失活，并且出于安全目的含有对5'和3'LTR的修饰。通过RT-PCR从pCMV.HIVΔ转染的293s细胞RNA克隆HIV Rev，并且将其引入pRK5.tk.neo的ClaI-Xho位点中。使用VSV-G来假型化慢病毒报告基因(用VSV-G取代HIV env)能够感染任何细胞类型。在Stbl2感受态细胞(Life Technologies，目录号10268-019)中扩增慢病毒表达质粒和包装构建体，并且使用Qiagen Maxi Prep试剂盒(目录号12662)纯化DNA。所有DNA构建体均由DNA测序来确认。

报告基因测定细胞系开展：使用Jurkat CD4+T细胞系(DSMZ，目录号ACC 282)和CTLL-2CD8⁺T细胞系(Life Technologies，目录号K1653)来评估报告基因测定监测由TDB活化T细胞的可行性。构建慢病毒载体，其在由NFAT(活化T细胞的核因子)、AP-1(Fos/Jun)、NFAT/AP1、NFκB、FOXO、STAT3,5和IRF的DNA识别元件调控的最小TK启动子的控制下表达报告基因萤火虫萤光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。通过瞬时转染293s细胞产生报告基因病毒原液，并且将其用VSV-G假型化、浓缩、并使用标准方法滴定(Naldini，L.等，1996Science，272:263-267)。通过离心接种(spinoculation)以10的MOI用慢病毒报告基因病毒原液感染Jurkat CTLL-2细胞，并且在3天后针对抗生素抗性对感染细胞进行选择。在2周后，产生稳定池并且评估其对纯化的TDB的响应。使用评估拷贝数和整合的qPCR方法来证明所有稳定池稳定地被报告基因构建体感染。纯化的抗CD3同二聚体能够活化NFAT和NFκBJurkat报告基因池。其他TDB也观察到类似的响应。在这些实验的基础上，建立Jurkat/NFκB-萤光素酶和Jurkat/NFAT-萤光素酶的有限稀释以实现单细胞克隆和单个稳定报告细胞系的产生。

T细胞活化杂质测定的开展和评估：抗CD3同二聚体是在靶细胞不存在的情况下可活化T细胞的产物相关杂质，并且因此代表与TDB的分开活性。在TDB纯化制剂中作为杂质存在的抗CD3同二聚体物质可共价或非共价连接，并且因此可采用使所述变体交联从而活化T细胞表面上的TCR的构象。由于TDB仅具有一个抗CD3臂，所以TDB不能交联TCR，并且当与T细胞单独孵育时没有活性。在体内，TDB可能够通过由效应细胞(单核细胞、巨噬细胞、NK细胞)介导的FcgR介导的交联来交联T细胞上的TCR。

为了定量存在的aCD3同二聚体变体的量，根据当已知浓度的纯化aCD3同二聚体标准品与Jurkat/NFκB-萤火虫萤光素酶克隆2细胞系孵育时观察到的萤光素酶活性的最佳拟合曲线计算在TDB样品中观察到的萤光素酶活性的量(图7)。为了评估每个样品中的基质效应和杂质浓度的影响，制备系列稀释液，并且在终点测定中评估稀释线性。存在的同二聚体的总量由存在于TDB总质量中的杂质质量确定，并且表示为抗CD3同二聚体％。所述方法能够在纯化的TDB制剂中定量检测低至0.1微克(0.1ppm)纯化的抗CD3同二聚体。所述测定形式还显示出能够检测在当前工艺的初始纯化步骤之后还没有被纯化的TDB材料中的杂质活性，并且已经被用于评估用于TDB去除杂质的纯化方法。在掺入纯化的抗CD3同二聚体的情况下，所述测定形式显示TDB测试材料中低至0.5％同二聚体掺入物质的准确回收率(图7)。所述方法已经与其他正交试验结合使用，以证明TDB的当前纯化过程将同二聚体和其他T细胞活化物质去除至测定的定量限以下。然而，在过程开展期间，各种样品显示在测定中具有T细胞活化活性，这与抗CD3同二聚体质谱测定不相关。与其他正交分析方法的相互关联表明，这些其他物种可能是某种形式的聚集体或HMWS(图9)。TDB的聚集体将诱导TCR簇集和活性。已经观察到，低至1.5％的HMWS可在测定中诱导显著的活性，如在各种制剂研究的评估期间所观察到的。这些其他物种的纯化和评估使得能够使用各种杂质参考标准开展杂质测定以评估TDB的纯度和安全性。使用不同的报告基因细胞系可允许对存在的不同物种进行分类。因此，由于这些努力，当前报道的抗CD3同二聚体％的值可被修改为另一个值。报告基因测定方法检测生物活性杂质的灵敏度是用于对产品变体进行分类和评估可存在于治疗剂中的可接受水平的有用通用方法。

III.试剂盒

在本发明的一些方面中，提供了包括容纳组合物的容器的试剂盒或制品，所述组合物包含如本文所述的含有响应于T细胞活化的报告复合物的工程化T细胞，并且任选地提供使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒提供抗CD3同二聚体测定标准品(已知浓度的纯化的抗CD3同二聚体)和/或抗CD3同二聚体对照。容器容纳制剂，并且容器上或与其相关联的标签可以指示使用指导。制品还可包括从商业和用户角度期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、培养皿、用于检测报告分子的试剂以及带有使用说明的包装插页。

IV.多肽

通常使用重组技术产生待使用本文所述的方法分析的多肽。用于产生重组蛋白的方法描述于例如，美国专利号5,534,615和4,816,567中，所述专利特定地以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白质在CHO细胞中产生(参见，例如WO 94/11026)。在一些实施方案中，感兴趣的多肽在大肠杆菌细胞中产生。参见，例如，美国专利号5,648,237；美国专利号5,789,199和美国专利号5,840,523，其描述了用于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列。还参见Charlton，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press，Totowa，N.J.，2003)，第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。当使用重组技术时，多肽可在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。

可从培养基或从宿主细胞裂解液回收多肽。可通过各种物理或化学手段(诸如冻-融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂)来破坏表达多肽中采用的细胞。如果多肽在细胞内产生，那么作为第一个步骤，例如通过离心或超滤去除微粒状碎片(宿主细胞或裂解的片段)。Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的多肽的程序。简而言之，在约30分钟内将细胞浆在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下解冻。可通过离心去除细胞碎片。当多肽被分泌至培养基中时，通常首先使用可商购获得的多肽浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自此类表达***的上清液。可在任何前述步骤中纳入蛋白酶抑制剂(如PMSF)以抑制蛋白水解并且可纳入抗生素以防止外来污染物的生长。

在一些实施方案中，包含多肽和一种或多种污染物的组合物中的所述多肽在通过本发明方法分析之前已经纯化或部分纯化。例如，所述方法的多肽在来自亲和色谱法、阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、混合模式色谱法和疏水作用色谱法的洗脱液中。在一些实施方案中，多肽在来自蛋白质A色谱法的洗脱液中。

可通过本发明的方法分析的多肽的实例包括但不限于免疫球蛋白、免疫粘附素、抗体、酶、激素、融合蛋白、含Fc的蛋白、免疫缀合物、细胞因子和白细胞介素。

(A)抗体

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，在通过本文所述的方法分析多肽和包含所述多肽的制剂的任何方法中使用的多肽是抗体。在一些实施方案中，所述多肽是T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体。

抗体的分子靶标包括CD蛋白及其配体，诸如但不限于：(i)CD3、CD4、CD8、CD19、CD11a、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79α(CD79a)和CD79β(CD79b)；(ii)ErbB受体家族成员，诸如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；(iii)细胞粘附分子，诸如LFA-1、Mac1、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；(iv)生长因子，诸如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C、BR3、c-met、组织因子、β7等；(v)细胞表面和跨膜肿瘤相关抗原(TAA)，诸如美国专利号7,521,541中所述的那些，以及(vi)其他靶标，诸如FcRH5、LyPD1、TenB2。在一些实施方案中，所述抗体是抗CD20/抗CD3抗体。示例性双特异性抗体提供于表1中。

表1.示例性抗体

其他示例性抗体包括选自但不限于以下各项的那些：抗***受体抗体、抗孕酮受体抗体、抗p53抗体、抗HER-2/neu抗体、抗EGFR抗体、抗组织蛋白酶D抗体、抗Bcl-2抗体、抗E-钙粘蛋白抗体、抗CA125抗体、抗CA15-3抗体、抗CA19-9抗体、抗c-erbB-2抗体、抗P-糖蛋白抗体、抗CEA抗体、抗成视网膜细胞瘤蛋白抗体、抗ras癌蛋白抗体、抗路易斯X抗体、抗Ki-67抗体、抗PCNA抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD7抗体、抗CD8抗体、抗CD9/p24抗体、抗CD10抗体、抗CD11a抗体、抗CD11c抗体、抗CD13抗体、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD23抗体、抗CD30抗体、抗CD31抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD35抗体、抗CD38抗体、抗CD41抗体、抗LCA/CD45抗体、抗CD45RO抗体、抗CD45RA抗体、抗CD39抗体、抗CD100抗体、抗CD95/Fas抗体、抗CD99抗体、抗CD106抗体、抗泛素抗体、抗CD71抗体、抗c-myc抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗HPV蛋白抗体、抗κ轻链抗体、抗λ轻链抗体、抗黑素体抗体、抗***特异性抗原抗体、抗S-100抗体、抗tau抗原抗体、抗纤维蛋白抗体、抗角蛋白抗体和抗Tn-抗原抗体。

(i)单克隆抗体

在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体是从大致上均质抗体群体获得的抗体，即除在产生单克隆抗体期间出现的可能变体(此类变体一般以少量存在)之外，构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同表位。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特征不是离散或多克隆抗体的混合物。

例如，单克隆抗体可使用最初由Kohler等，Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制备。

在杂交瘤方法中，使小鼠或其他适当的宿主动物(诸如仓鼠)如本文所述那样免疫以得到产生或能够产生将特异性结合用于免疫的多肽的抗体的淋巴细胞。另选地，可体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。

接种所制备的杂交瘤细胞，并使之在优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质的合适的培养基中生长。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。

在一些实施方案中，骨髓瘤细胞是那些有效融合，支持通过所选择的抗体产生细胞的稳定高水平抗体产生，且对培养基(诸如HAT培养基)敏感的骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，在这些细胞系中，骨髓瘤细胞细胞系是鼠类骨髓瘤细胞系，诸如源自可以从SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California USA获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系和可以从American Type Culture Collection，Rockville，Maryland USA获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系还被描述用于人单克隆抗体的产生(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications第51-63页(MarcelDekker，Inc.，New York，1987))。

测定杂交瘤细胞生长所处的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。在一些实施方案中，通过免疫沉淀法或通过体外结合测定(如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。

单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Munson等，Anal.Biochem.107:220(1980)的斯卡查德分析来确定。

在鉴定产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可通过限制稀释程序对克隆进行亚克隆并且通过标准方法(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))进行培养。适用于这个目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可作为动物体内的腹水肿瘤在体内生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规免疫球蛋白纯化程序(例如像多肽A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法)从培养基、腹水或血清适当地分离。

编码单克隆抗体的DNA容易分离并且使用常规程序(例如，使用能够特异性结合至编码鼠科抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来测序。在一些实施方案中，杂交瘤细胞充当这种DNA的来源。一旦分离，DNA可安置于表达载体中，然后转染至否则不产生免疫球蛋白多肽的宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.，130:151-188(1992)。

在另一个实施方案中，抗体或抗体片段可从使用McCafferty等，Nature 348:552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库分离。Clackson等，Nature 352:624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的出版物描述通过链替换(chain shuffling)(Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))生成高亲和性(nM范围)的人抗体。因此，这些技术为用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的适宜供选方案。

还可修饰DNA，例如通过取代人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠科序列(美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 81:6851(1984))，或将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价连接至免疫球蛋白编码序列。

通常，此类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或者它们取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体，其包括具有针对抗原的特异性的一个抗原结合位点和具有针对不同抗原的特异性的另一个抗原结合位点。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些实施方案中，抗体是IgG单克隆抗体。

(ii)人源化抗体

在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。人源化非人抗体的方法已在本领域中描述。在一些实施方案中，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可基本上按照Winter和合作者的方法(Jones等，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science239:1534-1536(1988))，通过用高变区序列取代人抗体的对应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中显著小于完整的人可变结构域已被来自非人物种的对应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。

用于制备人源化抗体的人可变结构域轻链与重链的选择对降低抗原性来说是非常重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后接受与啮齿动物的序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等，J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一种方法使用衍生自轻链或重链可变区的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同的构架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151:2623(1993))。

还重要的是，抗体被人源化成保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物特性。为了实现这一目标，在所述方法的一些实施方案中，使用亲本序列和人源化序列的三维模型通过亲本序列和各种概念上人源化的产物的分析方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可用的并且是本领域技术人员熟悉的。可用计算机程序来说明和展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可从接受者和输入序列中选择并并入FR残基，从而实现所需的抗体特征，诸如增加的对靶抗原的亲和力。通常，高变区残基直接且最实质上地涉及影响抗原结合。

(iii)人抗体

在一些实施方案中，抗体是人抗体。作为人源化的替代方案，可产生人抗体。例如，现在有可能产生在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下在免疫之后能够产生人抗体的全谱的转基因动物(例如，小鼠)。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J_H)基因的纯合子缺失导致完全抑制内源性抗体产生。人种系免疫球蛋白基因阵列在这种种系突变小鼠中的转移将导致在抗原激发后产生人抗体。参见例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等，Nature 362:255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.7:33(1993)；和美国专利号5,591,669；5,589,369；和5,545,807。

另选地，噬菌体展示技术((McCafferty等，Nature 348:552-553(1990))可用于从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库中体外产生人抗体和抗体片段。根据此技术，将抗体V结构域基因框内克隆到丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳多肽基因中，并且在噬菌体颗粒的表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能特性进行选择也导致选择编码呈现所述特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。可在各种形式下进行噬菌体展示，对于它们的综述，参见例如，Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion inStructural Biology 3:564-571(1993)。V基因片段的几个来源可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352:624-628(1991)从衍生自免疫小鼠脾脏的V基因小随机组合文库中分离了一系列不同的抗噁唑酮抗体。可构建来自未免疫的人供体的V基因库，并且可基本上按照由Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12:725-734(1993)描述的技术分离针对一系列不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利号5,565,332和5,573,905。

还可由体外活化的B细胞来产生人抗体(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。

(iv)抗体片段

在一些实施方案中，抗体是抗体片段。已经开发了各种技术用于产生抗体片段。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化而产生(参见例如，Morimoto等，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan等，Science 229:81(1985))。然而，现在可由重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可从上面讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。另选地，Fab'-SH片段可直接从大肠杆菌中回收并且化学连接以便形成F(ab)₂片段(Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，F(ab')₂片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练从业人员将为明显的。在其他实施方案中，所选择的抗体为单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。例如，抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如美国专利5,641,870中所述。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

在一些实施方案中，提供了本文所述抗体的片段。在一些实施方案中，抗体片段是抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段选自由以下各项组成的组：Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、scFv、Fv和双体。

(v)双特异性抗体

在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体。双特异性抗体是具有针对至少两个不同表位的结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可结合两个不同表位。另选地，双特异性抗体结合臂可与结合白细胞上的触发分子(诸如T细胞受体分子(例如CD2或CD3))或IgG的Fc受体(FcγR)(诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))的臂组合，从而将细胞防御机制集中到细胞。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')₂双特异性抗体)。在一些实施方案中，抗体是T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体。在一些实施方案中，TDB包含靶抗原结合片段和T细胞受体结合片段。在一些实施方案中，TDB包含靶抗原结合片段和CD3结合片段。在一些实施方案中，TDB包含靶抗原结合片段和CD3e结合片段。

制备双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。全长双特异性抗体的传统生产是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共同表达，其中两个链具有不同特异性(Millstein等，Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四价体瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。通常由亲和色谱法步骤完成的正确分子的纯化是相当麻烦的，并且产物产率低。WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.，10:3655-3659(1991)中公开了类似的程序。

根据不同的方法，具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。在一些实施方案中，所述融合是与包含铰链区、CH2区和CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域。在一些实施方案中，含有轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于融合体的至少一种中。将编码免疫球蛋白重链融合和(如果需要的话)免疫球蛋白轻链的DNA***单独表达载体，并且共同转染至合适的宿主生物中。当在构建中使用的三条多肽链的不等比率提供最佳产率时，这在实施方案中提供了调节三种多肽片段的相互比例的大的灵活性。然而，当相等比率的至少两个多肽链的表达导致高产率或当所述比率没有特定意义时，可将两个或所有三个多肽链的编码序列***一个表达载体中。

在此方法的一些实施方案中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。据发现这种不对称结构有利于从不需要的免疫球蛋白链组合中分离所需的双特异性化合物，因为免疫球蛋白轻链在仅一半双特异性分子中的存在提供了容易的分离方式。这种方法在WO 94/04690中公开。关于产生双特异性抗体的更多细节，参见例如，Suresh等，Methods in Enzymology121:210(1986)。

根据在美国专利号5,731,168中描述的另一种方法，一对抗体分子之间的界面可经过工程化以便将从重组细胞培养物回收的异二聚体的比例最大化。在一些实施方案中，界面包含抗体恒定结构域的C_H3结构域的至少一部分。在此方法中，第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链用更大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)来替换。在第二抗体分子的界面上通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)来替换而产生具有与大侧链相同或相似的尺寸的补偿性“腔穴”。这提供了增加异二聚体的产率超过其他不需要的最终产物如同二聚体的机制。

双特异性抗体包括交联或“异源偶联物”抗体。举例来说，异源偶联物中的一个抗体可连接至抗生物素蛋白，另一个抗体可连接至生物素。例如，此类抗体已经被提出用于将免疫***细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，并且用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO 92/200373和EP 0308936)。异源偶联物抗体可使用任何便利的交联方法来制成。合适交联剂在本领域中是熟知的，并且与许多交联技术一起在美国专利号4,676,980中公开。

用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已经在文献中描述。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science229：81(1985)描述了一种方法，其中完整抗体被蛋白水解裂解以产生F(ab')₂片段。在二硫醇络合剂***的存在下，这些片段被还原，以稳定邻近的二硫醇并且防止分子间二硫化物形成。然后将产生的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将Fab'-TNB衍生物中的一种再转化为Fab'-硫醇，并且将其与等摩尔量的其他Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。

也已描述直接自重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。举例而言，已使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接至两种不同抗体的Fab'部分。抗体同二聚体在铰链区被还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异二聚体。此方法也可以用于产生抗体同二聚体。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)描述的“双体”技术已经提供了制备双特异性抗体片段的另选机制。这些片段包括通过接头连接至轻链可变结构域(V_L)的重链可变结构域(V_H)，所述接头太短而不允许同一链上的两个域之间配对。因此，一个片段的V_H和V_L结构域被迫与另一个片段的互补V_L和V_H结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。也已报道通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略。参见Gruber等，J.Immunol.152:5368(1994)。

涵盖具有超过两个价态的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。

(v)多价抗体

在一些实施方案中，抗体是多价抗体。与二价抗体相比，多价抗体可由表达抗体所结合的抗原的细胞来更快地内在化(和/或异化)。本文提供的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如，四价抗体)(不同于IgM类)，其可通过重组表达编码抗体的多肽链的核酸容易地产生。多价抗体可包含二聚化域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚化结构域包括Fc区或铰链区(或由所述区组成)。在这种情况下，抗体将包含Fc区和在Fc区的氨基末端的三个或更多个抗原结合位点。本文优选的多价抗体包含三个至约八个(但优选四个)抗原结合位点(或由所述抗原结合位点组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(并且优选两条多肽链)，其中多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，多肽链可包括VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，并且n是0或1。例如，多肽链可包括：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选地还包含至少两个(并且优选四个)轻链可变结构域多肽。本文的多价抗体可例如包含约2至约8个轻链可变结构域多肽。本文涵盖的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并且任选地还包含CL结构域。在一些实施方案中，多价抗体包含T细胞结合片段。在一些实施方案中，多价抗体包含T细胞受体结合片段。在一些实施方案中，多价抗体包含CD3结合片段。在一些实施方案中，多价抗体包含CD3e结合片段。

在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体。多特异性抗体的实例包括但不限于包含重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)的抗体(其中V_HV_L单元具有多表位特异性)、具有两个或更多个V_L和V_H结构域的抗体(其中每个V_HV_L单元结合不同的表位)、具有两个或更多个单个可变结构域的抗体(其中每个单个可变结构域结合不同的表位)、全长抗体、抗体片段(诸如Fab、Fv、dsFv、scFv)、双体、双特异性双抗体、三体、三功能抗体、共价或非共价连接的抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体具有多表位特异性；例如，特异性结合相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位的能力。在一些实施方案中，抗体是单特异性的；例如，仅结合一个表位的抗体。根据一个实施方案，多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合每个表位的IgG抗体。

(vi)其他的抗体修饰

就效应子功能而言，可能需要修饰本文提供的抗体，例如，以便增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。另选地或除此之外，可将半胱氨酸残基引入Fc区中，从而允许在这个区中形成链间二硫键。由此产生的同二聚抗体可具有提高的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀死性和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.ExpMed.176:1191-1195(1992)和Shopes，B.J.，Immunol.148:2918-2922(1992)。如Wolff等，Cancer Research 53:2560-2565(1993)中所述，还可使用异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体。另选地，可工程化具有双Fc区的抗体且因此其可具有增强的补体介导的裂解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。

为了增加抗体的血清半衰期，可如US 2006/0067930中所述在抗体中进行氨基酸改变，该文献以引用的方式整体并入本文。

(B)多肽变体和修饰

本文所述的多肽(包括抗体)的氨基酸序列修饰可在纯化本文所述的多肽(例如，抗体)的方法中使用。

(i)变体多肽

“多肽变体”意指一种多肽，优选如本文所定义与多肽的全长天然序列、缺少信号肽的多肽序列、具有或不具有信号肽的多肽的胞外域具有至少约80％氨基酸序列同一性的活性多肽。此类多肽变体包括例如其中在全长天然氨基酸序列的N端或C端处添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，TAT多肽变体将与全长天然序列多肽序列、缺少信号肽的多肽序列、具有或不具有信号肽的多肽的胞外域具有至少约80％氨基酸序列同一性，或者至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任何一者的氨基酸序列同一性。任选地，变体多肽与天然多肽序列相比具有不超过一个的保守性氨基酸取代，或者与天然多肽序列相比具有不超过约2、3、4、5、6、7、8、9或10个中任何一者的保守性氨基酸取代。

例如，当与全长天然多肽相比时，变体多肽可在N端或C端处被截短，或者可缺少内部残基。某些变体多肽可缺少对于所需生物活性不是必需的氨基酸残基。具有截短、缺失和***的这些变体多肽可通过许多常规技术中的任一种来制备。所需的变体多肽可以是化学合成的。另一种合适的技术涉及通过聚合酶链反应(PCR)分离和扩增编码所需变体多肽的核酸片段。定义核酸片段所需末端的寡核苷酸在PCR中的5'和3'引物处采用。优选地，变体多肽与本文公开的天然多肽共享至少一种生物学和/或免疫学活性。

氨基酸序列***包括长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基末端和/或羧基末端融合，以及具有单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体或融合至细胞毒性多肽的抗体。抗体分子的其他***变体包括抗体的N末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶或多肽的融合。

例如，可能需要改善多肽的结合亲和力和/或其他生物特性。通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成制备多肽的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如多肽的氨基酸序列内的残基的缺失和/或***和/或取代。可以进行缺失、***和取代的任何组合以得到最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征。氨基酸变化还可改变多肽(例如，抗体)的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。

通过比较多肽序列与同源已知多肽分子的序列并且使在高度同源性区中产生的氨基酸序列变化的数目最小化，可发现对于确定可***、取代或缺失哪个氨基酸残基而不会不利地影响所需活性的指导。

可用于鉴定多肽(例如，抗体)中作为诱变优选位置的某些残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells，Science 244:1081-1085(1989)所描述。在此，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电荷残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并且替换为中性或带负电荷氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在取代位点处或针对取代位点引入另外或其他变体来推敲对取代展示出功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，虽然用于引入氨基酸序列变异的位点是预先确定的，但突变本身的性质不需要预先确定。例如，为了分析给定位点处的突变的性能，在靶密码子或区域处进行ala扫描或随机诱变，并且针对所需活性筛选表达的抗体变体。

另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基被不同的残基替换。取代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也涵盖FR改变。保守性取代示于下表2中的标题“示例性取代”下。如果此类取代导致生物活性改变，则可以引入表2中命名为“取代”的或者如下文关于氨基酸类别进一步描述的更实质性改变，并且筛选产物。

表2.

对多肽的生物学特性的实质性改变可通过选择在对维持以下方面的作用上显著不同的取代来实现：(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如，呈折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。氨基酸可根据其侧链特性的相似性进行分组(在A.L.Lehninger，Biochemistry second编，第73-75页，Worth Publishers，New York(1975)中)：

(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)

(2)不带电荷极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)

(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)

(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)

另选地，天然存在的残基可基于常见的侧链特性分成组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守性取代将需要将这些类别中的一类的成员更换成另一类别。

通常还可用丝氨酸取代不参与维持抗体正确构象的任何半胱氨酸残基，以改善分子的氧化稳定性并且防止异常交联。相反地，可将半胱氨酸键加入到多肽中以改善其稳定性(特别是在抗体为抗体片段(诸如Fv片段)的情况下)。

特别优选类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体)的一个或多个高变区残基。一般来讲，为进一步开发所选择的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改善的生物学特性。产生此类取代变体的便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，使几个高变区位点(例如，6-7个位点)突变以在每个位点处产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示，作为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合体。然后针对如本文所公开的生物活性(例如，结合亲和力)筛选噬菌体展示的变体。为了鉴定待修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。另选地或另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与靶标之间的接触点可能是有益的。此类接触残基和相邻残基是根据本文阐述的技术进行取代的候选者。一旦产生此类变体，则如本文所述对所述变体组进行筛选，并且可选择在一个或多个相关测定中具有优异特性的抗体用于进一步开发。

多肽的另一种类型的氨基酸变体改变抗体的原始糖基化模式。多肽可包含非氨基酸部分。例如，多肽可以是糖基化的。这种糖基化可在多肽在宿主细胞或宿主生物中表达期间自然发生，或者可以是由人工干预产生的有意的修饰。通过改变意指缺失多肽中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加多肽中不存在的一个或多个糖基化位点。

多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰氨酸-X-丝氨酸和天冬酰氨酸-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸)是用于碳水化合物部分至天冬酰氨酸侧链的酶连接的辨别序列。因此，在多肽中存在这些三肽序列的任何一个产生一个潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟氨基酸连接，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

向多肽添加糖基化位点通过改变氨基酸序列以使其含有上述三肽序列中的一个或多个来方便地实现(对于N-连接的糖基化位点)。改变还可通过向原始抗体的序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或者用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来进行(对于O-连接的糖基化位点)。

去除存在于多肽上的碳水化合物部分可通过化学或酶促方式或通过编码作为糖基化靶标的氨基酸残基的密码子的突变取代来实现。多肽上的碳水化合物部分的酶促裂解可通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现。

其他修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别至对应的谷氨酰和天冬氨酰残基的脱酰胺化；脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化；N末端胺的乙酰化和任何C末端羧基的酰胺化。

(ii)嵌合多肽

本文所述的多肽可以形成包含融合至另一种异源多肽或氨基酸序列的多肽的嵌合分子的方式被修饰。在一些实施方案中，嵌合分子包括多肽与提供抗标签抗体可选择性结合的表位的标签多肽的融合体。表位标签通常位于多肽的氨基末端或羧基末端处。此类表位标签形式的多肽的存在可使用针对标签多肽的抗体来检测。另外，提供表位标签使得能够使用抗标签抗体或结合至表位标签的另一种类型的亲和基质通过亲和纯化容易地纯化多肽。

在另选实施方案中，嵌合分子可包括多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区的融合体。嵌合分子的二价形式被称为“免疫粘附素”。

Ig融合优选地包括在Ig分子内的至少一个可变区的位置中取代可溶(跨膜结构域缺失或失活)形式的多肽。在特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合体包含IgG1分子的铰链、CH₂和CH₃或铰链、CH₁、CH₂和CH₃区。

(iii)多肽缀合物

在多肽制剂中使用的多肽可缀合至细胞毒性剂(诸如化学治疗剂)、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射缀合物)。

可使用适用于产生此类缀合物的化学治疗剂。此外，可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂吉菌素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(tricothecene)。多种放射性核素可用于产生放射缀合的多肽。实例包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。多肽和细胞毒性剂的缀合物可使用多种双官能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲酯HCL)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双-迭氮基化合物(诸如双(对迭氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)来制备。例如，可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述的那样制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与多肽缀合的示例性螯合剂。

本文还涵盖多肽与一种或多种小分子毒素(诸如卡里奇霉素、美登木素、单端孢菌烯(trichothene)和CC1065)以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物。

美登木素是通过抑制微管蛋白聚合来起作用的有丝***抑制剂。美登素最初是从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离。随后，发现某些微生物也产生美登木素，诸如美登醇和C-3美登醇酯。还涵盖合成美登醇及其衍生物和类似物。本领域已知许多用于制备多肽-美登木素缀合物的连接基团，包括例如美国专利号5,208,020中公开的那些。连接基团包括如上所述专利中公开的二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，优选二硫化物基团和硫醚基团。

接头可连接至美登木素分子的不同位置处，这取决于连接的类型。例如，可通过使用常规偶联技术与羟基反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置处。在优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置处形成键。

另一种感兴趣的缀合物包含缀合至一个或多个卡奇霉素分子的多肽。卡奇霉素家族的抗生素能够在低于皮摩尔的浓度下产生双链DNA断裂。对于卡奇霉素家族的缀合物的制备，参见例如，美国专利号5,712,374。可使用的卡奇霉素的结构类似物包括但不限于γ₁ ^I、α₂ ^I、α₃ ^I、N-乙酰基-γ₁ ^I、PSAG和θ₁ ^I。可以缀合抗体的另一种抗肿瘤药物是为抗叶酸剂的QFA。卡奇霉素与QFA均具有细胞内作用位点，并且不容易穿过质膜。因此，通过多肽(例如，抗体)介导的内化来细胞摄取这些试剂极大地提高了它们的细胞毒性效应。

可缀合至本文所述的多肽的其他抗肿瘤剂包括：BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱和5-氟尿嘧啶、统称为LL-E33288复合物的试剂家族以及埃斯波霉素。

在一些实施方案中，多肽可以是多肽与具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间的缀合物。

在另一实施方案中，多肽(例如，抗体)可缀合至“受体”(诸如链霉亲和素)以用于肿瘤预靶向中，其中向患者施用多肽受体缀合物，随后使用清除剂从循环除去未结合的缀合物且接着施用缀合至细胞毒性剂(例如放射性核苷酸)的“配体”(例如抗生蛋白)。

在一些实施方案中，多肽可缀合至将前药(例如，肽基化学治疗剂)转化成活性抗癌药物的前药活化酶。免疫缀合物的酶组分包括能够以这样的方式作用于前药以便将其转化成更具活性的细胞毒性形式的任何酶。

可用的酶包括但不限于：可用于将含磷酸酯前药转化成游离药物的碱性磷酸酶；可用于将含硫酸酯前药转化成游离药物的芳基硫酸酯酶；可用于将无毒5-氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可用于将含肽前药转化成游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧基肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可用于转化含有D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰基羧基肽酶；可用于将糖基化前药转化成游离药物的碳水化合物裂解酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可用于将经β-内酰胺衍生化的药物转化成游离药物的β-内酰胺酶；和可用于将在胺氮处分别经苯氧乙酰基或苯基乙酰基衍生化的药物转化成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。另选地，可使用具有酶活性的抗体(本领域中也称为“抗体酶”)将前药转化成游离的活性药物。

(iv)其他

多肽的另一种类型的共价修饰包括将多肽连接至多种非蛋白质聚合物(例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物)中的一种。多肽还可被俘获在例如通过凝聚技术或通过界面聚合(分别为例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)制备的微胶囊中，胶态药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或粗乳液中。此类技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版，Gennaro，A.R编，(1990)。

V.获得在制剂和方法中使用的多肽

在本文所述的分析方法中使用的多肽可使用本领域熟知的方法(包括重组方法)获得。以下部分提供有关这些方法的指导。

(A)多核苷酸

如本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指具有任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。

编码多肽的多核苷酸可从任何来源获得，包括但不限于从认为拥有多肽mRNA并且以可检测的水平表达的组织制备的cDNA文库。因此，编码多肽的多核苷酸可方便地从由人组织制备的cDNA文库中获得。编码多肽的基因还可从基因组文库或通过已知的合成程序(例如，自动核酸合成)获得。

例如，多核苷酸可编码整个免疫球蛋白分子链，诸如轻链或重链。完整的重链不仅包含重链可变区(V_H)，而且还包含重链恒定区(C_H)，其通常将包含三个恒定结构域：C_H1、C_H2和C_H3；和“铰链”区。在某些情况下，恒定区的存在是所需的。在一些实施方案中，多核苷酸编码TDB的一个或多个免疫球蛋白分子链。

可由多核苷酸编码的其他多肽包括抗原结合抗体片段，诸如单结构域抗体(“dAb”)、Fv、scFv、Fab’和F(ab')₂以及“微型抗体”。微型抗体(通常)是C_H1和C_K或C_L结构域已被切除的二价抗体片段。由于微型抗体小于常规抗体，它们应该在临床/诊断用途中实现更好的组织渗透性，但它们是二价的，因此应该比单价抗体片段(诸如dAb)保留更高的结合亲和力。因此，除非上下文另外指出，否则本文使用的术语“抗体”不仅涵盖整个抗体分子，还涵盖上面讨论类型的抗原结合抗体片段。优选地，编码多肽中存在的每个框架区相对于对应的人受体框架将包含至少一个氨基酸取代。因此，例如，相对于受体框架区，所述框架区可总共包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代。

本说明书中公开的所有特征可以任何组合结合。本说明书中公开的每个特征可被替换为用于相同、等同或相似目的的特征。因此，除非另有明确规定，否则所公开的每个特征仅是一系列通用等效或类似特征的一个实例。

本发明的更多详情由以下非限定性实施例说明。本说明书中所有参考文献的公开内容以引用的方式明确地并入本文。

实施例

以下实施例仅意图例示本发明，并且因此不应视为以任何方式限制本发明。提供以下实施例和详述是用以说明而非用以限制。

实施例1.抗CD3同二聚体活化T细胞

T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体(αCD20/αCD3 TDB、抗CD20(Mab2；VH SEQ ID NO:31/VL SEQ ID NO:32)/抗CD3(Mab1；VH SEQ ID NO:19/VL SEQ ID NO:20))需要表达CD20抗原的细胞以便诱导T细胞活化和抗原细胞杀死。如图1A所示，从人外周血分离CD8⁺T细胞，以1:1的比率与抗原表达靶细胞系一起孵育，并且用增加浓度的纯化的αCD20/αCD3 TDB抗体刺激。在向细胞加入TDB后的定时孵育24小时后，通过流式细胞术针对在T细胞表面上诱导的CD69(C型凝集素蛋白)和CD25(IL-2受体)的量来评估T细胞，CD69和CD25是T细胞活化的标记物(Shipkova M，2012，Clin.Chim.Acta.413:1338-49和Ziegler SF等，1994，StemCells 12(5)：465-465)。在用αCD20/αCD3 TDB刺激后，CD69和CD25细胞表面表达呈剂量依赖性增加。如CD69和CD25细胞表面表达没有增加所证明，在不存在靶细胞(蓝色矩形)的情况下，没有T细胞活化。如图1B所示，需要T细胞介导αCD20/αCD3 TDB进行靶细胞杀死。将PBMC或通过阴性选择(Milteny Biotec)得到的消减CD3+(T细胞受体/CD3e亚基)的PBMC与表达CD20的靶细胞系以1:1的比率孵育，并且然后用增加浓度的αCD20/αCD3 TDB刺激。在24小时后，通过流式细胞术，PBMC显示靶细胞数量的剂量依赖性降低(红色圆圈)。然而，当将CD3+T细胞从PBMC池消减时没有检测到靶细胞的损失(蓝色矩形)。因此，通过αCD20/αCD3TDB进行的表达CD20的靶细胞消减需要CD3+T细胞的活化，并且αCD20/αCD3 TDB不能单独诱导靶细胞杀死。

纯化的抗CD3同二聚体活化人供体T细胞。用增加浓度的纯化的抗CD3同二聚体或αCD20/αCD3 TDB双特异性抗体处理来自两个不同供体的人供体PBMC，并且如上所述24小时后通过FACS测试T细胞活化水平。用抗CD8抗体、抗CD69和抗CD25抗体染色供体1(图2，左图)和供体2(图2，右图)。对T细胞活化标记物CD69和CD25呈阳性的CD8⁺T细胞的百分比相对于抗CD3同二聚体或αCD20/αCD3 TDB处理的量绘图。在靶细胞的存在下，抗CD3和αCD20/αCD3TDB剂量依赖性地活化T细胞，但与抗CD3同二聚体(EC50：169-526ng/mL)相比，αCD20/αCD3TDB(EC50：4-6ng/mL)是更强的T细胞活化剂。尽管存在供体可变性，抗CD3同二聚体可活化人T细胞。

抗CD3同二聚体可降低双特异性抗体效能。将αCD20/αCD3TDB用不同浓度的纯化抗CD3同二聚体加标，对响应进行测量。在高于20％的抗CD3同二聚体水平下，抗CD3同二聚体在T细胞活化水平上和在靶细胞响应水平上剂量依赖性地显著降低αCD20/αCD3TDB效能(图3A和表3)。使用PBMC，加标至αCD20/αCD3 TDB中的低水平的抗CD3同二聚体(HD)未显著地降低T细胞活化(CD8⁺，图3B左图；CD4⁺，图3B右图)。用已经用恒定量(2.5％或5％)的纯化抗CD3同二聚体固定的增加水平的TDB来刺激PBMC，并且通过流式细胞术(FACS)分析以评估T细胞活化(针对T细胞活化标记物CD69和CD25进行染色)。低于5％水平的抗CD3同二聚体不影响CD8⁺或CD4⁺T细胞的αCD20/αCD3 TDB T细胞活化潜力。

表3

抗CD3同二聚体可在不存在靶细胞的情况下弱活化来自各种人供体的人CD8⁺T细胞。在靶细胞存在下，αCD20/αCD3 TDB能够强烈活化来自从6个人供体分离的PBMC的大部分CD8⁺T细胞，并且低水平的抗CD3同二聚体(2.5％或5％)不能显著活化TDB的平均T细胞活化潜力(图4A；B+条件)。在不存在靶细胞的情况下(图4A；B-条件)，抗CD3同二聚体可弱活化CD8⁺T细胞(平均活化潜力略微增加)。人T细胞的抗CD3同二聚体活化显示一些代表性细胞因子增加的剂量依赖性趋势。在靶细胞存在(B+条件)或不存在(B-条件)、用或不用2.5％或5％的纯化抗CD3同二聚体加标的情况下，用1mg/mLαCD20/αCD3 TDB刺激从6个人供体分离的PBMC，并且通过测试分泌的作为T细胞活化指示的细胞因子来评估T细胞活化潜力。在24小时后，收集条件培养基并且使用Luminex细胞因子检测试剂盒测试细胞因子的存在。在不存在靶细胞的情况下，抗CD3同二聚体处理显示一些供体PBMC的某些细胞因子水平(IL-10和MCP-1)显著地剂量依赖性增加(图4B-4E；B-条件)。对平均细胞因子水平响应均值进行绘图。

实施例2.抗CD3同二聚体杂质测定

已经开发了生物学杂质测定法来检测在T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体存在下T细胞活化杂质的存在。由于抗CD3同二聚体是二价的，因此杂质的每个臂可潜在地交联TCR，从而引起T细胞活化。通过抗CD3二价抗体(诸如OKT3)的TCR介导的交联活化T细胞信号转导级联，引起转录因子(包括NFAT和NFκB)的磷酸化和核定位，从而导致靶基因诸如细胞因子或细胞杀死剂(诸如Fas、颗粒酶B和穿孔素)的转录诱导(Brown，WM，2006，Curr OpinInvestig Drugs 7:381-388；Ferran，C等，1993Exp Nephrol 1:83-89；Shannon，MF等，1995，J.Leukoc.Biol.57:767-773；Shapiro，1998；Pardo，J等，2003，Int Immunol.，15(12):1441-1450)。在AP1、NFAT或NFκB的转录控制下，诸如萤火虫萤光素酶的报告基因已被用于监测信号传导途径的TCR活化和T细胞活化(Shannon，MF等，1995，J.Leukoc.Biol.57:767-773；Shapiro，1998)。由于TDB在不存在靶细胞的情况下不活化T细胞(图1A和1B)，所以报告基因测定方法被评价为用于在TDB存在下检测抗CD3同二聚体的潜在测定策略。为了初步评估抗CD3同二聚体是否能够在体外活化T细胞，用重组TCR响应性报告基因慢病毒原液(AP1-荧光素酶、NFAT-荧光素酶或NFκB-荧光素酶)感染Jurkat T细胞(DSMZ，ACC 282)，并且用10μg/mL纯化的抗CD3同二聚体处理稳定池4小时。Jurkat/AP1荧光素酶、Jurkat/NFAT荧光素酶和Jurkat/NFκB荧光素酶稳定池在用纯化的抗CD3同二聚体刺激后显示出荧光素酶的剂量依赖性诱导。对荧光响应(萤光素酶报告基因活性)进行绘图，从Jurkat/NFκB荧光素酶稳定池中观察到最高响应。(图5A)。针对其对10μg/mL纯化的抗CD3同二聚体的响应，筛选通过有限稀释分离的Jurkat/NFκB荧光素酶稳定克隆。与其他TCR响应元件相比，JurkatT细胞NFκB荧光素酶池对抗CD3同二聚体展示出最高的响应，但其他响应元件也可能潜在地用于检测抗CD3同二聚体。(图5B)。

为了确定此克隆对αCD20/αCD3 TDB或抗CD3同二聚体的相对响应，在表达CD20的靶细胞系存在下将Jurkat/NFκB荧光素酶克隆2细胞系用增加浓度的αCD20/αCD3 TDB或抗CD3同二聚体处理，并且对荧光素酶活性进行绘图(图6A)。在补充有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中用αCD20/αCD3 TDB或CD3同二聚体刺激细胞4小时。在共刺激性靶细胞存在下，纯化的比纯化的抗CD3同二聚体活性高1000倍。由抗CD3同二聚体导致的T细胞活化水平低于由αCD20/αCD3 TDB导致的T细胞活化水平，但是在靶细胞存在下可检测到的。如通过荧光素酶转录的NFκB依赖性活化所测量的，在不存在靶细胞的情况下，甚至在高水平的TDB下，在此细胞系中αCD20/αCD3 TDB未导致T细胞活化，但即使在低水平的产物相关杂质下，抗CD3同二聚体能够诱发荧光素酶诱导(图6B)。使用其他T细胞活化量度，对于工程化的Jurkat/NFκB荧光素酶克隆2报告基因细胞系观察到的这些T细胞活化响应与从供体外周血单核细胞(PBMC)分离的人T细胞所观察到的T细胞活化响应相当，这表明使用报告基因监测T细胞活化响应是能与之相比的(表4)。使用Jurkat/NFκB荧光素酶克隆2细胞系(Jurkat-NFκBLuc)来开发和优化用于检测αCD20/αCD3 TDB中的抗CD3同二聚体杂质的基于细胞的测定方法。总之，这些数据表明工程化T细胞报告基因细胞系可用于检测TDB中的生物活性抗CD3同二聚体产物相关杂质。

表4

实施例3.检测抗CD3同二聚体的定量方法

已经开发了一种灵敏且定量的分析方法来检测在αCD20/αCD3 TDB存在下存在的生物活性杂质。αCD20/αCD3 TDB T细胞活化测定通过以下方式检测存在于TDB测试样品中的抗CD3同二聚体：使用工程化T细胞报告基因细胞系Jurkat-NFκBLuc测量CD3e/TCR交联诱导的Rel/NFκB信号传导途径活化。由于测定中不存在靶细胞，因此仅抗CD3同二聚体可活化T细胞报告细胞系。活化的NFκB易位至细胞核，结合至合成启动子中的驱动萤光素酶转录的8个NFκB响应元件。在此测定中，制备抗CD3同二聚体测定标准品、抗CD3同二聚体对照和αCD20/αCD3 TDB测试样品的稀释液，并且将其加入到96孔测定板中的培养的Jurkat-NFκBLuc报告基因细胞中。aCD3同二聚体标准品是从αCD20/αCD3 TDB纯化方法中分离的纯化的一批aCD3同二聚体。aCD3同二聚体对照是用纯化的aCD3同二聚体加标的αCD20/αCD3 TDB，并且用作测定中的***适用性标准。在所述测定中使用aCD3同二聚体对照对于用于杂质测定运行的方法是特异性的。在定时孵育4小时后，使用荧光读板仪测量由同二聚体测定标准品、同二聚体对照和αCD20/αCD3 TDB测试样品诱导的萤光素酶活性的量。αCD20/αCD3 TDB测试样品中的生物活性抗CD3同二聚体的量根据从单独的一组板孔中抗CD3同二聚体测定标准品产生的荧光标准曲线确定(图7)。通过存在的抗CD3同二聚体的数量相对于测试样品中存在的αCD20/αCD3 TDB总量的比率来确定存在于测试样品中的抗CD3同二聚体的百分比。通过将已知量的纯化的抗CD3同二聚体加标到αCD20/αCD3 TDB制剂中并且测量抗CD3同二聚体的回收百分比来评估所述方法的精确度。所述方法显示良好的总体线性(图8)，并且具有6.8％的总体精度(表5)。在1mg/mL的αCD20/αCD3 TDB原液中，所述方法能够重现性地检测低至150纳克或0.02％的抗CD3同二聚体的加标水平。基于所进行的回收研究，所述优化的方法能够从存在于各种TDB制剂中的0.25％至35％抗CD3同二聚体可靠地定量抗CD3同二聚体水平，并且具有6.8％的总体精度。精度被确定为在每个加标水平下回收率的平均CV％。

表5

αCD20/αCD3 TDB T细胞活化测定还对另一种产物相关杂质，抗CD3聚集体和αCD20/αCD3 TDB高分子量物质的存在敏感。如使用SEC检测的含有2％以上的HWMS的样品可导致Jurkat/NFκB-Luc细胞系的T细胞活化。由HMWS进行的这种活化被定量为来自T细胞活化测定的同二聚体％(图9)。

序列表

<110> K·卡里（CARY, Kendall）

<120> 用于检测抗CD3同二聚体的基于细胞的测定

<130> 146392022940

<140> 尚未转让

<141> 与本申请同时

<150> US 62/167,761

<151> 2015-05-28

<160> 40

<170> 用于Windows版本4.0的FastSEQ

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 1

Asn Tyr Tyr Ile His

1 5

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<211> 17

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 2

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1 5 10 15

Gly

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<211> 10

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

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1 5 10

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<211> 17

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 4

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1 5 10 15

Ala

<210> 5

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<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 5

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1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 6

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1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 7

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1 5

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<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 8

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1 5 10 15

Asp

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 9

Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 10

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

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Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 12

Lys Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 13

Gly Tyr Thr Met Asn

1 5

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<211> 17

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 14

Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 15

Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 16

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 17

Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 18

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 19

<211> 119

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 112

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 20

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln

85 90 95

Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 119

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 112

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 22

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 23

<211> 122

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 25

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His

1 5 10

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 26

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 27

Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 28

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 29

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 30

Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 31

<211> 122

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 31

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 33

<211> 5

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 33

Asp Thr Tyr Ile His

1 5

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 34

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 35

Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 36

<211> 11

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 36

Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 37

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 38

<211> 9

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 38

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 39

<211> 120

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 39

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 40

<211> 107

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种用于检测包含T细胞依赖性双特异性抗体(TDB)的组合物中抗CD3同二聚体的方法，其中所述双特异性抗体包含靶抗原结合片段和CD3结合片段，所述方法包括

使T细胞群体与所述组合物接触，其中所述T细胞包含编码可操作地连接至响应于T细胞活化的响应元件的报告基因的核酸，并且其中所述T细胞群体不包含所述靶抗原，

其中所述报告基因的表达指示存在抗CD3同二聚体。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述报告基因是萤光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述响应于T细胞活化的响应元件是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述响应于T细胞活化的响应元件是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。

6.如权利要求3所述的方法，其中所述响应于T细胞活化的响应元件是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。

7.如权利要求4所述的方法，其中所述响应于T细胞活化的响应元件包括来自NFAT、AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任何一者或多者的T细胞活化响应元件。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述响应于T细胞活化的响应元件包括来自NFAT、AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任何一者或多者的T细胞活化响应元件。

9.如权利要求6所述的方法，其中所述响应于T细胞活化的响应元件包括来自NFAT、AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任何一者或多者的T细胞活化响应元件。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述T细胞群体是CD4⁺ T细胞或CD8⁺ T细胞的群体。

11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述T细胞群体是Jurkat T细胞或CTLL-2 T细胞的群体。

12.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中T细胞群体与包含浓度范围为0.01 ng/mL至50 ng/mL的所述双特异性抗体的组合物接触。

13.如权利要求10所述的方法，其中T细胞群体与包含浓度范围为0.01 ng/mL至50 ng/mL的所述双特异性抗体的组合物接触。

14.如权利要求11所述的方法，其中T细胞群体与包含浓度范围为0.01 ng/mL至50 ng/mL的所述双特异性抗体的组合物接触。

15.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述报告基因在使所述细胞与所述组合物接触后1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20或24小时中的任何一者或多者之后检测。

16.如权利要求10所述的方法，其中所述报告基因在使所述细胞与所述组合物接触后1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20或24小时中的任何一者或多者之后检测。

17.如权利要求11所述的方法，其中所述报告基因在使所述细胞与所述组合物接触后1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20或24小时中的任何一者或多者之后检测。

18.如权利要求12所述的方法，其中所述报告基因在使所述细胞与所述组合物接触后1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20或24小时中的任何一者或多者之后检测。

19.如权利要求13所述的方法，其中所述报告基因在使所述细胞与所述组合物接触后1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20或24小时中的任何一者或多者之后检测。

20.如权利要求14所述的方法，其中所述报告基因在使所述细胞与所述组合物接触后1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20或24小时中的任何一者或多者之后检测。

21.用于定量包含TDB的组合物中抗CD3同二聚体抗体的量的方法，其中所述TDB包含靶抗原结合片段和CD3结合片段，所述方法包括

使T细胞群体与所述组合物在一种或多种所述TDB浓度下接触，其中所述T细胞包含编码可操作地连接至响应于T细胞活化的启动子的报告基因的核酸，并且其中所述T细胞群体不包含所述靶抗原，

将作为抗体浓度函数的所述报告基因的所述表达与通过使所述T细胞与不同浓度的纯化抗CD3同二聚体接触产生的标准曲线关联。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述报告基因是萤光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。

24.如权利要求21所述的方法，其中所述响应于T细胞活化的响应元件是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。

25.如权利要求22所述的方法，其中所述响应于T细胞活化的响应元件是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。

26.如权利要求23所述的方法，其中所述响应于T细胞活化的响应元件是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述响应于T细胞活化的响应元件包括来自NFAT、AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任何一者或多者的T细胞活化响应元件。

28.如权利要求25所述的方法，其中所述响应于T细胞活化的响应元件包括来自NFAT、AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任何一者或多者的T细胞活化响应元件。

29.如权利要求26所述的方法，其中所述响应于T细胞活化的响应元件包括来自NFAT、AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任何一者或多者的T细胞活化响应元件。

30.如权利要求21-29中任一项所述的方法，其中所述T细胞群体是CD4⁺ T细胞或CD8⁺ T细胞的群体。

31.如权利要求21-29中任一项所述的方法，其中所述T细胞群体是Jurkat T细胞或CTLL-2 T细胞的群体。

32.如权利要求21-29中任一项所述的方法，其中T细胞群体与包含浓度范围为0.01ng/mL至50 ng/mL的所述双特异性抗体的组合物接触。

33.如权利要求30所述的方法，其中T细胞群体与包含浓度范围为0.01 ng/mL至50 ng/mL的所述双特异性抗体的组合物接触。

34.如权利要求31所述的方法，其中T细胞群体与包含浓度范围为0.01 ng/mL至50 ng/mL的所述双特异性抗体的组合物接触。

35.如权利要求21-29中任一项所述的方法，其中所述标准曲线通过使所述T细胞与范围为0.01 ng/mL至50 ng/mL的不同浓度的纯化抗CD3抗体接触产生。

36.如权利要求30所述的方法，其中所述标准曲线通过使所述T细胞与范围为0.01 ng/mL至50 ng/mL的不同浓度的纯化抗CD3抗体接触产生。

37.如权利要求31所述的方法，其中所述标准曲线通过使所述T细胞与范围为0.01 ng/mL至50 ng/mL的不同浓度的纯化抗CD3抗体接触产生。

38.如权利要求32所述的方法，其中所述标准曲线通过使所述T细胞与范围为0.01 ng/mL至50 ng/mL的不同浓度的纯化抗CD3抗体接触产生。

39.如权利要求33所述的方法，其中所述标准曲线通过使所述T细胞与范围为0.01 ng/mL至50 ng/mL的不同浓度的纯化抗CD3抗体接触产生。

40.如权利要求34所述的方法，其中所述标准曲线通过使所述T细胞与范围为0.01 ng/mL至50 ng/mL的不同浓度的纯化抗CD3抗体接触产生。

41.如权利要求21-29中任一项所述的方法，其中所述报告基因在使所述细胞与所述组合物接触后1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20或24小时中的任何一者或多者之后检测。

42.如权利要求30所述的方法，其中所述报告基因在使所述细胞与所述组合物接触后1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20或24小时中的任何一者或多者之后检测。

43.如权利要求31所述的方法，其中所述报告基因在使所述细胞与所述组合物接触后1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20或24小时中的任何一者或多者之后检测。

44.如权利要求32所述的方法，其中所述报告基因在使所述细胞与所述组合物接触后1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20或24小时中的任何一者或多者之后检测。

45.如权利要求35所述的方法，其中所述报告基因在使所述细胞与所述组合物接触后1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20或24小时中的任何一者或多者之后检测。

46.如权利要求33、34和36-40任一项所述的方法，其中所述报告基因在使所述细胞与所述组合物接触后1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20或24小时中的任何一者或多者之后检测。

47.一种用于检测包含双特异性抗体的组合物中抗CD3同二聚体的工程化T细胞，其中所述双特异性抗体包含靶抗原结合片段和CD3结合片段，其中所述T细胞包含可操作地连接至响应于T细胞活化的响应元件的报告基因，其中所述响应于T细胞活化的响应元件包括来自AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任何一者或多者的T细胞活化响应元件。

48.如权利要求47所述的工程化T细胞，其中所述报告基因是萤光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。

49.如权利要求48所述的工程化T细胞，其中所述萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。

50.如权利要求47所述的工程化T细胞，其中所述响应于T细胞活化的响应元件是AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。

51.如权利要求48所述的工程化T细胞，其中所述响应于T细胞活化的响应元件是AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。

52.如权利要求49所述的工程化T细胞，其中所述响应于T细胞活化的响应元件是AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。

53.如权利要求47-52中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞群体是CD4⁺ T细胞或CD8⁺ T细胞的群体。

54.如权利要求47-52中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞群体是Jurkat T细胞或CTLL-2 T细胞的群体。

55.一种用于检测包含双特异性抗体的组合物中抗CD3同二聚体的试剂盒，其中所述双特异性抗体包含靶抗原结合片段和CD3结合片段，其中所述试剂盒包括工程化T细胞，所述工程化T细胞包含可操作地连接至响应于T细胞活化的响应元件的报告基因，其中所述响应于T细胞活化的响应元件包括来自AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任何一者或多者的T细胞活化响应元件。

56.如权利要求55所述的试剂盒，其还包括抗CD3同二聚体测定标准品和/或抗CD3同二聚体对照。

57.如权利要求55所述的试剂盒，其中所述报告基因是萤光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。

58.如权利要求56所述的试剂盒，其中所述报告基因是萤光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。

59.如权利要求57所述的试剂盒，其中所述萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。

60.如权利要求58所述的试剂盒，其中所述萤光素酶是萤火虫萤光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。

61.如权利要求55-60中任一项所述的试剂盒，其中所述响应于T细胞活化的响应元件是AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。

62.如权利要求55-60中任一项所述的试剂盒，其中所述T细胞群体是CD4⁺ T细胞或CD8⁺T细胞的群体。

63.如权利要求61所述的试剂盒，其中所述T细胞群体是CD4⁺ T细胞或CD8⁺ T细胞的群体。

64.如权利要求55-60中任一项所述的试剂盒，其中所述T细胞群体是Jurkat T细胞或CTLL-2 T细胞的群体。

65.如权利要求61所述的试剂盒，其中所述T细胞群体是Jurkat T细胞或CTLL-2 T细胞的群体。