JP2022528804A - 抗体力価試験 - Google Patents

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アレクシス デヘイブン ダンクル，
チョンサプ シム，
サヒム ザビエル ウォレス，
リンダ ギットモン チャン，
キャサリン クルス，
マイケル トーマス エビー，
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ジェネンテック， インコーポレイテッド
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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Abstract

本発明は、抗体の力価を測定するための細胞ベースの試験を提供するものである。表面に結合した抗原を抗体と接触させ、それをレポーター細胞と接触させる。組成物及びキットも企図される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
［０００１］ 本願は、２０１９年４月１８日に出願された米国仮出願第６２／８３５，９６０号（参照によりその全内容が本明細書に援用される）の利益を主張するものである。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
［０００２］ ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によりその全内容が本明細書に援用される：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０４６７４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０２０年４月１７日、サイズ：１，１１２バイト）。
［０００３］ 本発明は、ポリペプチド（例：抗体又イムノアドヘシン）の力価を分析するための方法を提供する。組成物及びキットも企図される。
［０００４］ 最適な抗体力価試験は、正確で精密、且つ使い勝手がよく、所要時間が短く、自動化とハイスループットスケーリングに適したものである必要がある。分泌サイトカイン用のＥＬＩＳＡ、ＰＢＭＣベースの方法、及びＦＡＣＳベースの方法など、ＡＤＣＰ及び関連する作用機序を反映する従来のバイオ試験がいくつか利用可能である。残念ながら、これらの試験の多くは、結果が大きく変動し、且つ／又は時間がかかる。本明細書に記載されている新規の力価試験は、ＡＤＣＰ活性を反映する、レポーター細胞を用いた細胞ベースのアプローチを使用しており、抗体と抗原の結合相互作用の検出に使用することができる。
［０００５］ 特許出願及び特許公開を含む本明細書に引用されるすべての参考文献は、参照によりその全文が援用される。
［０００６］ いくつかの態様において、本発明は、標的抗原に結合し且つＦｃ受容体結合ドメインを含むポリペプチドの活性を決定する方法であって、ａ）固定化された標的抗原をポリペプチド調製物と接触させて、抗原－ポリペプチド複合体を形成すること、ｂ）抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させることであって、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含む、接触させることを含み；レポーターの発現がポリペプチドの活性を示す、ポリペプチドの活性を決定する方法を提供する。
［０００７］ いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドが標的抗原と結合するポリペプチド調製物の力価を定量化する方法であって、ａ）固定化された標的抗原の複数の集団を異なる濃度のポリペプチド調製物と接触させて、抗原－ポリペプチド複合体を形成すること、ｂ）これらの抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させることであって、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含む、接触させること、ｃ）レポーターの発現を測定すること、及びｄ）ポリペプチド調製物のＥＣ５０を決定し、ポリペプチド調製物のＥＣ５０と、力価が既知のポリペプチドの標準試料のＥＣ５０とを比較することを含む、ポリペプチド調製物の力価を定量化する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は、標準試料に対するマルチパラメーター・ロジスティックフィットを使用して、ポリペプチド調製物のＥＣ５０に基づく力価を計算することを更に含む。いくつかの実施態様において、マルチパラメーター・ロジスティックフィットは、３パラメーター、４パラメーター又は５パラメーター・ロジスティックフィットである。いくつかの実施態様において、標準試料のＥＣ５０は、ポリペプチド調製物のＥＣ５０と同時に決定される。
［０００８］ 上記態様のいくつかの実施態様において、レポーターは、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質である。いくつかの実施態様において、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ又はナノルシフェラーゼである。いくつかの実施態様において、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列は、ＮＦκＢ応答配列、ＮＦＡＴ応答配列、ＡＰ－１応答配列又はＥＲＫ応答性転写因子（例：Ｅｌｋ１）である。
［０００９］ 上記態様のいくつかの実施態様において、食細胞は、単球である。いくつかの実施態様において、食細胞は、細胞株からのものである。いくつかの実施態様において、細胞株は、ＴＨＰ－１細胞株又はＵ－９３７細胞株である。いくつかの実施態様において、Ｆｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）又はＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）又はＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。いくつかの実施態様において、食細胞は、Ｆｃγ受容体を過剰発現させるように操作される。いくつかの実施態様において、食細胞は、ＦｃγＲＩＩａを過剰発現させるように操作される。いくつかの実施態様において、食細胞は、ＦｃγＲＩＩＩを発現させない。
［００１０］ 上記態様のいくつかの実施態様において、標的抗原は、ベータアミロイド（Ａβ）又はＣＤ２０である。いくつかの実施態様において、標的抗原は、ベータアミロイド（Ａβ）である。いくつかの実施態様において、Ａβは、ヒトＡβである。いくつかの実施態様において、Ａβは、モノマー及び／又はオリゴマーのＡβを含む。いくつかの実施態様において、ヒトＡβは、Ａβ１－４０又はＡβ１－４２である。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、全長Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインのＦｃＲ結合断片を含む。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、Ａβに特異的に結合する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、抗体又はイムノアドヘシンである。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、クレネズマブである。
［００１１］ 上記態様のいくつかの実施態様において、標的抗原は、表面に固定化される。いくつかの実施態様において、表面は、プレートである。いくつかの実施態様において、プレートは、マルチウェルプレートである。いくつかの実施態様において、抗原は、Ｎ末端若しくはその近傍で、Ｃ末端若しくはその近傍で、又はＮ末端若しくはその近傍とＣ末端若しくはその近傍で表面に固定化される。いくつかの実施態様において、標的抗原は、ビオチン－ストレプトアビジンシステムを用いて表面に固定化される。いくつかの実施態様において、標的抗原はビオチンに結合しており、表面は結合されたストレプトアビジンを含む。いくつかの実施態様において、標的抗原は、Ｎ末端若しくはその近傍で、Ｃ末端若しくはその近傍で、又はＮ末端若しくはその近傍とＣ末端若しくはその近傍でビオチンと結合している。
［００１２］ 上記態様のいくつかの実施態様において、レポーターは、抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させてから、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、２０、２４時間又は２４時間を超える時間のうちのいずれか１つ又は複数の時間が経過後したに検出される。
［００１３］ いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドが標的抗原と結合し且つＦｃ受容体結合ドメインを含むポリペプチド調製物の力価を決定するためのキットであって、固定化された標的抗原と食細胞とを含むキットを提供し、ここで、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含み、レポーターの発現が、ポリペプチドの力価を示す。
［００１４］ いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドが標的抗原と結合し且つＦｃ受容体結合ドメインを含むポリペプチド調製物の力価を定量化するためのキットであって、固定化された標的抗原と、食細胞と、標準試料とを含むキットを提供し、ここで、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含み、レポーターの発現が、ポリペプチドの力価を示し、標準試料は、力価が既知のポリペプチドの調製物を含む。
［００１５］ 本キットのいくつかの実施態様では、レポーターは、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質である。いくつかの実施態様において、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ又はナノルシフェラーゼである。いくつかの実施態様において、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列は、ＮＦκＢ応答配列、ＮＦＡＴ応答配列、ＡＰ－１応答配列又はＥＲＫ応答性転写因子（例：Ｅｌｋ１）である。
［００１６］ 本キットのいくつかの実施態様では、食細胞は、単球である。いくつかの実施態様において、食細胞は、細胞株からのものである。いくつかの実施態様において、細胞株は、ＴＨＰ－１細胞株又はＵ－９３７細胞株である。いくつかの実施態様において、Ｆｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）又はＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）又はＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。いくつかの実施態様において、食細胞は、Ｆｃγ受容体を過剰発現させるように操作される。いくつかの実施態様において、食細胞は、ＦｃγＲＩＩａを過剰発現させるように操作される。いくつかの実施態様において、食細胞は、ＦｃγＲＩＩＩを発現させない。
［００１７］ 本キットのいくつかの実施態様では、標的抗原は、ベータアミロイド（Ａβ）又はＣＤ２０である。いくつかの実施態様において、標的抗原は、ベータアミロイド（Ａβ）である。いくつかの実施態様において、Ａβは、ヒトＡβである。いくつかの実施態様において、Ａβは、モノマー及び／又はオリゴマーのＡβを含む。いくつかの実施態様において、ヒトＡβは、Ａβ１－４０又はＡβ１－４２である。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、全長Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインのＦｃＲ結合断片を含む。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、Ａβに特異的に結合する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、抗体又はイムノアドヘシンである。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、クレネズマブである。
本キットのいくつかの実施態様では、標的抗原は、表面に固定化される。いくつかの実施態様において、表面は、プレートである。いくつかの実施態様において、プレートは、マルチウェルプレートである。いくつかの実施態様において、抗原は、Ｎ末端若しくはその近傍で、Ｃ末端若しくはその近傍で、又はＮ末端若しくはその近傍とＣ末端若しくはその近傍で表面に固定化される。いくつかの実施態様において、標的抗原は、ビオチン－ストレプトアビジンシステムを用いて表面に固定化される。いくつかの実施態様において、標的抗原はビオチンに結合しており、表面は結合されたストレプトアビジンを含む。いくつかの実施態様において、標的抗原は、Ｎ末端若しくはその近傍で、Ｃ末端若しくはその近傍で、又はＮ末端若しくはその近傍とＣ末端若しくはその近傍でビオチンと結合している。いくつかの実施態様において、標的抗原は、ビオチン－ストレプトアビジンシステムを用いて表面に固定化される。いくつかの実施態様において、標的抗原はビオチンに結合しており、表面は結合されたストレプトアビジンを含む。
［００１８］ ＣＤ３２Ａ発現ベクターの構築を示すマップである。 ［００１９］ ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼ発現ベクターの構築を示すマップである。 ［００２０］ 食作用レポーター細胞における．ＦｃγＲの発現を示す。親Ｕ－９３７細胞、Ｕ－９３７食作用レポーター細胞、及びＴＨＰ－１食作用レポーター細胞におけるＣＤ１６、ＣＤ３２、及びＣＤ６４の発現を示す。影付きのヒストグラムは未染色の細胞であり（Ｕ－９３７のみに含まれる）、実線はＣＤ１６／ＣＤ３２／ＣＤ６４、破線はアイソタイプ対照である。Ｕ９３７細胞とＴＨＰ－１細胞は、異なる機器を使用して異なる日に検査された。 ［００２１］ 図４Ａ－Ｃは、Ａβペプチドを組み込むための異なるフォーマットの評価を示している。クレネズマブと異なる形態のＡβと試験プレートとを使用して、ＴＨＰ－１食作用レポーター細胞（ＴＨＰ－１）の活性がスクリーニングされた。図４Ａは、クレネズマブ及びＴＨＰ－１細胞とインキュベートされた、可溶性の非ビオチン化Ａβを示す。図４Ｂは、非ビオチン化Ａβを高結合プレートに吸着させた後、クレネズマブの希釈系列とインキュベートし、その後、細胞とインキュベートしたものを示す。図４Ｃは、Ａβペプチドを吸着させた高結合プレートと、ビオチン－Ａβを結合させたストレプトアビジン（ＳＡ）高結合プレートを比較したものである。陰性対照として、Ａβを含まないＳＡ高結合プレートを用いた。図４Ａと図４Ｂでは、異なるクローン（「ＸＸＸ株」）が評価された。図４Ｃでは、ＴＨＰ－１ ４１６株が利用された。 ［００２２］ 本力価試験の模式図である。 ［００２３］ クレネズマブの代表的な検量線を示す。 ［００２４］ 食作用レポーター細胞試験におけるオクレリズマブ活性を示す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現によって測定した場合の、ＣＤ２０ペプチドに結合するとＵ－９３７食作用レポーター細胞を活性化するオクレリズマブの能力を示す代表的な検量線が提示されている。 ［００２５］ 異なる播種密度でのＴＨＰ－１の増殖を示す。３日間の培養を目標に細胞を播種し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍを用いてモニターした。数字は播種密度×１０５細胞／ｍｌを表す。 ［００２６］ 組換えＡβと合成Ａβに対するＴＨＰ－１クローンの用量反応を示す。組換えＡβのエンドトキシン試験の結果、細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）が９１２ＥＵ／ｍｇのであったのに対し、合成ペプチドは検出限界を下回った。 ［００２７］ ＥＣ５０に影響を与える要因を示している。 ［００２８］ 勾配に影響を与える要因を示している。 ［００２９］ 応答倍率に影響を与える要因を示している。 ［００３０］ 力価（平均及び標準偏差）に影響を与える要因を示している。
［００３１］ いくつかの態様において、本発明は、標的抗原に結合し且つＦｃ受容体結合ドメインを含むポリペプチドの活性を決定する方法であって、ａ）固定化された標的抗原をポリペプチド調製物と接触させて、抗原－ポリペプチド複合体を形成すること、ｂ）抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させることであって、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含む、接触させることを含み；レポーターの発現がポリペプチドの活性を示す、ポリペプチドの活性を決定する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドが標的抗原と結合するポリペプチド調製物の力価を定量化する方法であって、ａ）固定化された標的抗原の複数の集団を異なる濃度のポリペプチド調製物と接触させて、抗原－ポリペプチド複合体を形成すること、ｂ）これらの抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させることであって、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含む、接触させること、ｃ）レポーターの発現を測定すること、及びｄ）ポリペプチド調製物のＥＣ５０を決定し、ポリペプチド調製物のＥＣ５０と、力価が既知のポリペプチドの標準試料のＥＣ５０とを比較することを含む、ポリペプチド調製物の力価を定量化する方法を提供する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、抗体又はイムノアドヘシンである。組成物及びキットも提供される。
定義
［００３２］ 用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、本明細書においては、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換可能に使用される。ポリマーは、直鎖状でも分岐状でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、自然に又は介入により修飾されたアミノ酸ポリマーも包含し；その例として、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識化成分又は毒素とのコンジュゲーションが挙げられる。この定義には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ又は複数のアナログを含有するポリペプチドだけではなく、当技術分野で知られているその他の修飾も含まれる。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において使用される場合、特に抗体を包含する。
［００３３］ 「精製された」ポリペプチド（例：抗体又はイムノアドヘシン）とは、そのポリペプチドの純度が増加したことを意味し、自然環境下で、或いは実験室条件下で最初に合成及び／又は増幅されたときよりも純度の高い形態で存在する。純度は相対用語であり、必ずしも絶対純度を意味するのではない。
［００３４］ 用語「アンタゴニスト」は最も広い意味で使用され、天然ポリペプチドの生物学的活性を部分的に又は完全に阻止、阻害又は中和する任意の分子を含む。同様に、用語「アゴニスト」も最も広い意味で使用され、天然ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は、具体的には、アゴニスト又はアンタゴニストの抗体又は抗体断片、天然ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列バリアント等を含む。ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するための方法は、ポリペプチドを候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子と接触させることと、ポリペプチドに通常関連する１つ又は複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することとを含み得る。
［００３５］ 目的抗原と「結合する」ポリペプチドとは、十分な親和性で該抗原と結合することから、該抗原を発現させる細胞又は組織の標的化における診断剤及び／又は治療剤として有用であり、他のポリペプチドとはそれほど交差反応しないような、ポリペプチドである。そのような実施態様において、「非標的」ポリペプチドへの該ポリペプチドの結合の程度は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）により決定した場合、該ポリペプチドのその特定の標的ポリペプチドへの結合の約１０％未満であろう。
［００３６］ 標的分子へのポリペプチドの結合に関して、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープへの「特異的結合」又はそれに「特異的に結合する」又はそれに対して「特異的である」という表現は、非特異的相互作用とは測定可能なほど異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、ある分子の結合を、一般に結合活性を持たない類似の構造の分子である対照分子の結合との比較で決定することによって測定することができる。特異的結合は、例えば、該標的と類似の対照分子、例えば過剰な非標識標的との競合により決定され得る。この場合、特異的結合は、標識標的のプローブへの結合が、過剰な非標識標的により競合的に阻害される場合に示される。
［００３７］ 用語「抗体」とは、本明細書では最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体と、ポリクローナル抗体と、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例：ＴＤＢを含む二重特異性抗体）と、所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片とを包含する。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書では抗体と互換可能に使用される。
［００３８］ 抗体は、すべて免疫グロブリンフォールドに基づく、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子である。例えば、ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されて機能性抗体を形成する、２つの「重」鎖及び２つの「軽」鎖を有する。各重鎖及び軽鎖自体は、「定常」（Ｃ）及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域は抗体の抗原結合特異性を決定し、一方、Ｃ領域は、構造的な支持体を提供し、免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用において機能を果たす。抗体又は抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性とは、抗体が特定の抗原と特異的に結合する能力のことである。
［００３９］ 抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特徴により決定される。可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸スパンにわたって均一に分布しているのではない。その代わり、Ｖ領域は、１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチで構成され、それぞれが９～１２アミノ酸長の「超可変領域」（ＨＶＲ）と呼ばれる極度に可変性の、より短い領域で区切られている。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がβシート構造を取る４つのＦＲを含み、これらは３つの超可変領域によって繋がれており、この３つの超可変領域は、βシート構造を繋ぐ（場合によってはβシート構造の一部を形成する）ループを形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲにより互いに極めて近接した状態で保持され、他の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md, (1991を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しているものではないが、例えば抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への抗体の関与といった、種々のエフェクター機能を呈する。
［００４０］ 各Ｖ領域は典型的には３つのＨＶＲ、例えば相補性決定領域（それぞれが「超可変ループ」を含む「ＣＤＲ」）と４つのフレームワーク領域とを含む。したがって、抗原結合部位は、特定の所望の抗原に十分な親和性で結合するのに必要な最小の構造単位であり、通常、３つのＣＤＲと、それらの間に組み入れられていて、ＣＤＲを適切な立体構造（conformation）に保持して提示する少なくとも３つ、好ましくは４つのフレームワーク領域とを含む。古典的な４本鎖抗体は、ＶＨドメインとＶＬドメインが協働して定める抗原結合部位を有している。ラクダ抗体及びサメ抗体などの特定の抗体は、軽鎖を欠いており、重鎖だけで形成される結合部位に依存している。ＶＨとＶＬの間の協働がなくても、重鎖又は軽鎖だけで結合部位が形成される単一ドメイン操作免疫グロブリンを調製することができる。
［００４１］ 用語「可変」とは、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範囲にわたって異なっており、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性に使用されるということを指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメイン双方の超可変領域と称される３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がβシート構造を取る４つのＦＲを含み、これらは３つの超可変領域によって繋がれており、この３つの超可変領域は、βシート構造を繋ぐ（場合によってはβシート構造の一部を形成する）ループを形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲにより互いに極めて近接した状態で保持され、他の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照のこと)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しているものではないが、例えば抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への抗体の関与といった、種々のエフェクター機能を呈する。
［００４２］ 「超可変領域」（ＨＶＲ）という用語は、本明細書において使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例：ＶＬでは残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）及び８９～９７（Ｌ３）辺り、並びにＶＨでは３１～３５Ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）辺り（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）及び／又は「超可変ループ」のアミノ酸残基（例：ＶＬでは残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）及び９１～９６（Ｌ３）、並びにＶＨでは２６～３２（Ｈ１）、５２Ａ～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）（Chothia and Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)）を含み得る。
［００４３］ 「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義している超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
［００４４］ 「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、線状抗体（例：米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)）；１アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、単鎖抗体分子；抗体断片から形成される多特異性抗体（例えば、限定されるものではないが、Ｄｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－ＣＨ３、（ｓｃＦＶ）４－Ｆｃ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｂｉ－ｓｃＦｖ又はタンデム（ｄｉ、ｔｒｉ）－ｓｃＦｖ）；及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）が挙げられる。
［００４５］ 抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を持つ「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、その名前が容易に結晶化する能力を反映している残りの「Ｆｃ」断片を生成する。ペプシン処置により、２つの抗原結合部位を有し、更に架橋抗原を結合する能力を持つＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
［００４６］ 「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが緊密に非共有結合した二量体で構成されている。このような構成で、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互に作用し、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体に比べて親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有している。
［００４７］ またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を有する。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域の１つ又は複数のシステインを含む数個の残基が付加されている点で、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、ヒンジシステインを間に持つＦａｂ’断片の対として製造された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
［００４８］ 任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に区別される型の１つに割り当てられ得る。
［００４９］ その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体は異なるクラスに割り当てられ得る。インタクトな抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ、及びＩｇＡ２に分けられる。抗体のこれらの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構造はよく知られている。
［００５０］ 「単鎖Ｆｖ」すなわち「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施態様において、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦＶが抗原結合に所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦｖの総説については、ＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照のこと。
［００５１］ 用語「ダイアボディ」は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでいる、２つの抗原結合部位を持つ小さな抗体断片を指す。同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成すること余儀なくされ、２つの抗原結合部位が作られる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ第４０４，０９７号；ＷＯ第９３／１１１６１号；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）に更に詳細に記載されている。
［００５２］ 用語「多重特異性抗体」は、最も広い意味で使用され、特にポリエピトープ特異性を有する抗体を包含する。このような多重特異性抗体には、限定されないが、ＶＨＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体、各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープに結合する２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する２つ以上の単一可変ドメインを有する抗体、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、及びトリアボディなどの抗体断片、共有結合又は共有結合している抗体断片が含まれる。「ポリエピトープ特異性」とは、同じ又は異なる標的（複数可）上で２つ以上の異なるエピトープと特異的に結合する能力を指す。「単一特異性」は唯一のエピトープに結合する能力を指す。一実施態様によれば、多重特異性抗体は、親和性が５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ、又は０．１μＭから０．００１ｐＭである各エピトープと結合するＩｇＧ抗体である。
［００５３］ 「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」なる表現は、単一可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）が抗原結合を付与することができる抗体を一般に指す。言い換えれば、単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために別の可変ドメインと相互作用する必要がない。単一ドメイン抗体の例には、ラクダ科の動物（ラマ及びラクダ）並びに軟骨魚類（例：コモリザメ）に由来するもの、並びに、ヒト及びマウス抗体からの組換え法によるものが含まれる（Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol(2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci(2001) 26:230-235; Trends Biotechnol(2003):21:484-490; WO第2005/035572号; WO第03/035694号; Febs Lett (1994) 339:285-290; WO第00/29004号; WO第02/05187号0）。
［００５４］ 本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の製造中に生じ得るバリアント（一般に、そのようなバリアントは微量存在する）を除いて、同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンで汚染されていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で作製しなければならないと解釈されるものではない。例えば、本明細書において提供される方法により使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されてもよく、又は組換えＤＮＡ法により作製されてもよい（例：米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されている手法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
［００５５］ 本明細書においては、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分は特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、鎖（複数可）の残りの部分は別の種に由来する抗体又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、所望の生物学的活性を呈するものである限り、そのような抗体の断片を特に含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。本明細書における目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長動物（例：旧世界サル、例えばヒヒ、アカゲザル又はカニクイザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む（米国特許第５，６９３，７８０号）。
［００５６］ 非ヒト（例：マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の超可変領域の残基を、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域の残基で置き換えたものである。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体にも、又はドナー抗体にも見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能を更に洗練させるためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、その超可変ループのすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのループに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてが、上記のＦＲ置換（複数可）を除き、ヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ２：５９３－５９６（１９９２）を参照のこと。
［００５７］ 本明細書において、「インタクトな抗体」は、重及び軽可変ドメイン、並びにＦｃ領域を含むものである。その定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例：ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列バリアントである。好ましくは、インタクトな抗体は、１つ又は複数のエフェクター機能を有する。
［００５８］ 「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。また、各重鎖と軽鎖は、一定の間隔で鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を持ち、その後に複数の定常ドメインが続く。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられる。
［００５９］ 「ネイキッド抗体」は、細胞傷害性部分又は放射性標識などの異種分子とコンジュゲートされない、（本明細書において定義する）抗体である。
［００６０］ 本明細書で使用される場合、用語「エフェクター機能」又は「Ｆｃ媒介性エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例には、限定されないが、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合親和性、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及びサイトカイン分泌が含まれる。
［００６１］ 「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例：ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）を発現させる非特異性細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて該標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現させるのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現させる。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号又は同第５，８２１，３３７号に記載されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏのＡＤＣＣ試験を実施してもよい。このような試験に有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで評価してもよい。
［００６２］ 「ヒトエフェクター細胞」とは、１つ又は複数のＦｃＲを発現させ、エフェクター機能を実行する白血球である。いくつかの実施態様において、該細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現させ、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。
［００６３］ 「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、分子が補体の存在下で標的を溶解する能力を指す。補体活性化経路は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が、同種抗原と複合体化された分子（例えばポリペプチド（例：抗体））と結合することにより開始される。補体活性化を検討評価するために、ＣＤＣ試験、例えばＧａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣ試験を実施してもよい。
［００６４］ 「抗体依存性細胞食作用」又は「ＡＤＣＰ」は、抗体でコーティングされた細胞が、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する食作用免疫細胞（例：マクロファージ、好中球又は樹状細胞）によって全体的又は部分的に内在化される過程を意味する。
［００６５］ 用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用される。いくつかの実施態様において、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子バリアント及び代替的にスプライスされた形態も含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制受容体」）が含まれ、これらは、その細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）；及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ． １２６：３３０－４１（１９９５）において総説されている。将来的に同定されることになるものを含め、他のＦｃＲは、本明細書においては用語「ＦｃＲ」に包含される。この用語には、母親のＩｇＧの胎児への移行を担う新生児の受容体、ＦｃＲｎも含まれる（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）。
［００６６］ 本明細書における「Ａβ（Ｘ－Ｙ）」という用語は、以下を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙまでのアミノ酸配列を指す。ＸとＹはいずれも、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１）のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙまでのアミノ酸配列又はその天然に存在する任意のバリアント、特に、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル型」）、Ｅ２２Ｇ（「北極型」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ型」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア型」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオア型」）、Ａ４２Ｔ、及びＡ４２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するものを指し、ここで、数字は、位置Ｘと位置Ｙの両方を含むＡβペプチドの開始位置、又は最大３つの追加のアミノ酸置換を伴う配列に対するものであり、これらはいずれもグロブロマーの形成を妨げるものではない。「追加の」アミノ酸置換とは、本明細書では、自然界には存在しない、カノニカル配列からの逸脱と定義される。
［００６７］ より具体的には、本明細書における「Ａβ（１－４２）」という用語は、１と４２の両方を含む、ヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置１からアミノ酸位置４２までのアミノ酸配列を指し、特に、アミノ配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１）（アミノ酸位置１から４２に対応）のアミノ酸位置１からアミノ酸位置４２までのアミノ酸配列又はその天然に存在するバリアントを指す。このようなバリアントは、例えば、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル型」）、Ｅ２２Ｇ（「北極型」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ型」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア型」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオア型」）、Ａ４２Ｔ、及びＡ４２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するものを指し、ここで、数字は、アミノ酸位置１とアミノ酸位置４２の両方を含むＡβペプチドの開始位置、又は最大３つの追加のアミノ酸置換を伴う配列に対するものであり、これらはいずれもグロブロマーの形成を妨げるものではない。同様に、本明細書における「Ａβ（１－４０）」という用語は、アミノ酸位置１とアミノ酸位置４０の両方を含む、ヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置１からアミノ酸位置４０までのアミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）のアミノ酸位置１からアミノ酸位置４０までのアミノ酸配列又はその天然に存在する任意のバリアントを指す。このようなバリアントは、例えば、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル型」）、Ｅ２２Ｇ（「北極型」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ型」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア型」）、及びＤ２３Ｎ（「アイオア型」）からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するものを指し、ここで、数字は、アミノ酸位置１とアミノ酸位置４０の両方を含むＡβペプチドの開始位置、又は最大３つの追加のアミノ酸置換を伴う配列に対するものであり、これらはいずれもグロブロマーの形成を妨げるものではない。
［００６８］ 「混入物」とは、所望のポリペプチド産物とは異なる物質を指す。本発明のいくつかの実施態様において、混入物は、ポリペプチドの電荷バリアントを含む。本発明のいくつかの実施態様において、混入物は、抗体又は抗体断片の電荷バリアントを含む。本発明の他の実施態様において、混入物は、限定されるものではないが：宿主細胞物質、例えばＣＨＯＰ；浸出されたプロテインＡ；核酸；所望のポリペプチドのバリアント、断片、凝集体又は誘導体；別のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス混入物；細胞培地成分等を含む。いくつかの例において、混入物は、例えば、限定されるものではないが、細菌細胞（大腸菌細胞など）、昆虫細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、真菌細胞に由来する宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）であってもよい。
［００６９］ 本明細書において使用される場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種ポリペプチドの結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせた抗体様の分子を指している。構造的に、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位以外の、所望の結合特異性を有するアミノ酸配列（すなわち「異種」である）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的には、少なくとも受容体又はリガンドの結合部位を含む連続するアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得ることができる。
［００７０］ 本明細書中で使用されている「レポーター分子」とは、その化学的性質により、抗体活性の検出を可能にする分析的に識別可能なシグナルを提供する分子を意味する。この種の試験で最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア又は放射性核種含有分子（すなわち放射性同位元素）と化学発光分子である。
［００７１］ 本明細書において使用される場合、「本質的に同じ」とは、値又はパラメーターが有意な効果によって変化していないことを示す。例えば、カラム出口のクロマトグラフィー移動相は、イオン強度が有意に変化していない場合、移動相の初期イオン強度と本質的に同じである。例えば、初期イオン強度の１０％、５％又は１％内のカラム出口のイオン強度は、初期イオン強度と本質的に同じである。
［００７２］ 本明細書で値又はパラメーターを「約」と言及することは、その値又はパラメーターそれ自体に対するバリエーションを含む（且つ記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述には、「Ｘ」の記述が含まれる。
［００７３］ 本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されているように、単数形の「ａ」、「ｏｒ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指さない限り、複数の指示対象を含む。本明細書に記載の本発明の態様及び変形例は、それら「からなる」及び／又はそれら「から本質的になる」ことを含む。
細胞ベースの力価試験
［００７４］ 本発明は、ポリペプチドが抗原結合ドメイン及びＦｃ受容体結合ドメインを含むポリペプチド調製物の活性又は力価を決定するための、細胞ベースの試験を提供する。ポリペプチドの抗原結合ドメインは、固定化された抗原に結合し、次に、Ｆｃ受容体を含む食細胞と接触し、Ｆｃ受容体がポリペプチドのＦｃドメインと結合すると、レポーターが活性化される。このレポーターの活性（レポーターの発現と相関している）を、既知の活性又は力価を持つポリペプチドによって活性化されたレポーターの活性と比較する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、抗体又はイムノアドヘシンである。細胞ベースの試験は、特に、組成物中のポリペプチドを検出するため、組成物中のポリペプチドの量を定量化するため、組成物中のポリペプチドの特異性を決定するため、及び／又はポリペプチド組成物の力価を決定するために有用である。
レポーター
［００７５］ レポーター試験とは、細胞内でのレポーターの発現誘導をモニターすることにより、ある刺激の生物学的生物学的特性評価を可能にする分析法である。刺激によって細胞内シグナル伝達経路が誘導され、その結果、典型的には遺伝子転写の調節を含む細胞応答が生じる。いくつかの例では、細胞内シグナル伝達経路が刺激されると、タンパク質産生につながるＲＮＡ転写の開始に必要なＤＮＡの上流非コード領域への転写因子の制御及び動員を介して、遺伝子発現が調節される。刺激に反応した遺伝子の転写と翻訳の制御は、細胞増殖、分化、生存、及び免疫応答などの生物学的応答の大部分を引き出すために必要である。ＤＮＡのこれらの非コード領域は、応答配列とも呼ばれ、遺伝子転写の効率、したがって刺激に反応して細胞によって生成されるタンパク質の量と種類を調節する転写因子の認識配列である特定の配列を含む。レポーター試験では、標準的な分子生物学的手法を用いて、ある刺激に反応する応答配列と最小プロモーターを操作し、レポーター遺伝子の発現を駆動する。その後、このＤＮＡを、刺激に特異的に応答するすべての機構を含む細胞にトランスフェクト又は形質導入し、レポーター遺伝子の転写、翻訳又は活性のレベルが、生物学的応答の代替的測定値として測定される。
［００７６］ いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドが標的抗原に結合し且つＦｃ受容体結合ドメイン（例：Ｆｃγ受容体結合ドメイン）を含むポリペプチド調製物の活性を決定する方法であって、ａ）固定化された標的抗原をポリペプチド調製物と接触させて、抗原－ポリペプチド複合体を形成すること、ｂ）抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させることであって、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に応答する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含む、接触させることを含み；レポーターの発現がポリペプチドの活性を示す、ポリペプチド調製物の活性を決定する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドが標的抗原と結合し且つＦｃ受容体結合ドメイン（例：Ｆｃγ受容体結合ドメイン）を含むポリペプチド調製物の力価を定量化する方法であって、ａ）固定化された標的抗原の複数の集団を異なる濃度のポリペプチド調製物と接触させて、抗原－ポリペプチド複合体を形成すること、ｂ）これらの抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させることであって、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に応答する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含む、接触させること、ｃ）レポーターの発現を測定すること、及びｄ）ポリペプチド調製物のＥＣ５０を決定し、ポリペプチド調製物のＥＣ５０と、力価が既知のポリペプチドの標準試料のＥＣ５０とを比較することを含む、ポリペプチド調製物の力価を定量化する方法を提供する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、抗体又はイムノアドヘシンである。レポーターは、刺激に反応して細胞が産生する分子の量を測定するための試験が開発できる分子であれば、どのような分子でもよい。例えば、レポーターは、刺激（例：Ｆｃ受容体へのポリペプチドの結合）に応答するレポーター遺伝子によってコードされるレポータータンパク質であってもよい。レポーター分子の一般的な例としては、基質の触媒作用の副産物として実験的に測定できる光を放出する、ルシフェラーゼなどの発光タンパク質が挙げられるが、これに限定されない。ルシフェラーゼは、多くの供給源から得られる発光タンパク質の一種であり、ホタルルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ種由来）、ウミシイタケ由来のウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、コメツキムシルシフェラーゼ（Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ ｔｅｒｍｉｔｉｌｌｕｍｉｎａｎｓ由来）、海生カイアシ類ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来）、及び深海エビ由来のナノルシフェラーゼ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ由来）が含まれる。ホタルルシフェラーゼは、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの酸素化を触媒して発光するが、ウミシイタケなどの他のルシフェラーゼは、セレンテラジンの酸素化を触媒することによって発光する。異なるルシフェラーゼの形態及びバリアントが発する光の波長は、異なるフィルターシステムを用いて読み取ることができ、多重化が容易になる。発光量は、細胞内で発現されているルシフェラーゼの量に比例し、ルシフェラーゼ遺伝子は、生体反応を誘発する刺激の効果を定量的に評価する高感度レポーターとして用いられていた。レポーター遺伝子試験は、基礎研究、ＨＴＳスクリーニング、及び力価測定など、幅広い目的で長年使用されてきたＲ（Brogan J, et al., 2012, Radiat Res. 177(4):508-513; Miraglia LJ, et al., 2011, Comb Chem High Throughput Screen. 14(8):648-657; Nakajima Y, and Ohmiya Y. 2010, Expert Opin Drug Discovery, 5(9):835-849; Parekh BS, et al., 2012, Mabs, 4(3):310-318; Svobodova K, and Cajtham L T., 2010, Appl Microbiol Biotechnol., 88(4): 839-847）。
［００７７］ いくつかの実施態様において、本発明は、ポリペプチド－抗原複合体を、レポーター複合体を含む操作された食細胞と接触させる、ポリペプチドの活性及び／又は力価を決定するための細胞ベースの試験を提供する。いくつかの実施態様において、レポーターコンストラクトは、ルシフェラーゼを含む。いくつかの実施態様において、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ（例：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ種由来）、ウミシイタケ由来のウミシイタケルシフェラーゼ（例：Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ種由来）、コメツキムシルシフェラーゼ（例：Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ ｔｅｒｍｉｔｉｌｌｕｍｉｎａｎｓ種由来）、海生カイアシ類ガウシアルシフェラーゼ（例：Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ種由来）又は深海エビ由来のナノルシフェラーゼ（例：Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ種由来）である。いくつかの実施態様において、操作された食細胞におけるルシフェラーゼの発現は、食細胞へのポリペプチド又はイムノアドヘシンの結合活性を示す。他の態様では、レポーターコンストラクトは、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの蛍光タンパク質若しくはそのバリアント；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）；β－ガラクトシダーゼ；β－ラクタマーゼ；又は分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする。
［００７８］ いくつかの実施態様において、レポーター分子（例：ルシフェラーゼなどのレポータータンパク質）をコードする核酸を含む操作された細胞が提供され、レポーター細胞は、該細胞の表面でＦｃドメインのＦｃへの結合に応答するプロモーター及び／又は配列を含む制御配列に作動可能に連結されている。プロモーター及び／又は配列は、ＦｃＲ活性化に応答することが当技術分野で知られているものの中から選択することができる。いくつかの実施態様において、核酸は細胞ゲノムに安定的に組み込まれている。
［００７９］ いくつかの実施態様において、１つ又は複数のＦｃＲ活性化応答配列に作動可能に連結された最小プロモーターの制御下でレポーター分子をコードする核酸を含む操作された細胞（例：食細胞）が提供される。いくつかの実施態様において、最小プロモーターは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）最小プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の最小プロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター又は伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）の最小プロモーターである。いくつかの実施態様において、最小プロモーターは、最小ＴＫプロモーターである。いくつかの実施態様において、最小プロモーターは、最小ＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施態様において、上記活性化応答配列は、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核内因子）応答配列、ＡＰ－１（Ｆｏｓ／Ｊｕｎ）応答配列、ＮＦＡＴ／ＡＰ１応答配列、ＮＦκＢ応答配列、ＦＯＸＯ応答配列、ＳＴＡＴ３応答配列、ＳＴＡＴ５応答配列又はＩＲＦ応答配列を含む。いくつかの実施態様において、ＦｃＲ活性化応答配列は、タンデムリピート（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上のタンデムリピートのいずれか）として配置される。ＦｃＲ活性化応答配列は、レポーターコード化配列に対して５’又は３’に配置されてもよい。いくつかの実施態様において、ＦｃＲ活性化応答配列は、最小プロモーターから５’の部位に位置している。いくつかの実施態様において、ＦｃＲ活性化応答配列は、ＮＦκＢ応答配列である。いくつかの実施態様において、上記レポーター分子は、ホタル又はウミシイタケルシフェラーゼなどのルシフェラーゼである。いくつかの実施態様において、上記核酸は、マクロファージゲノムに安定的に組み込まれている。
細胞
［００８０］ いくつかの実施態様において、ポリペプチド－抗原複合体を、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含む細胞の集団と接触させることにより、ポリペプチドが抗原結合ドメインとＦｃ受容体結合ドメイン（例：ＦｃγＲ結合ドメイン）とを含むポリペプチド調製物の活性及び／又は力価を決定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、上記細胞は、食細胞である。いくつかの実施態様において、食細胞は、単球である。いくつかの実施態様において、食細胞は、細胞株からのものである。いくつかの実施態様において、食細胞株は、ＴＨＰ－１細胞株又はＵ－９３７細胞株である。
［００８１］ いくつかの実施態様において、上記レポーター細胞は、Ｆｃ受容体を含む。いくつかの実施態様において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。いくつかの実施態様において、Ｆｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）及び／又はＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）又はＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のうちの１つ又は複数を発現させるように操作されている。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）又はＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のうちの１つ又は複数を過剰発現させるように操作されている。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、ＦｃγＲＩＩａを過剰発現させるように操作されている。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、ＦｃγＲＩＩＩを発現させない。
［００８２］ いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸を含む。いくつかの実施態様において、レポーターは、ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ又はナノルシフェラーゼである。いくつかの実施態様において、レポーター（例：ルシフェラーゼ）をコードするポリヌクレオチドは、ＦｃＲ活性化応答性調節配列（例：ＦｃＲ活性化応答性プロモーター及び／又は配列）に作動可能に連結されている。いくつかの実施態様において、ＦｃＲ活性化に応答するプロモーター及び／又は配列は、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター又はＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸を含み、且つ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ又はＦｃγＲＩＩＩの１つ又は複数を含む。
［００８３］ いくつかの実施態様において、本発明は、ＦｃＲ活性化に反応するプロモーター及び／又は配列を含む制御配列に作動可能に連結されたレポーター分子をコードするＦｃＲ活性化レポーターコンストラクトで操作された細胞の組成物を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、ＦｃγＲ活性化に反応するプロモーター及び／又は配列を含む制御配列に作動可能に連結されたレポーター分子をコードするＦｃγＲ活性化レポーターコンストラクトで操作された細胞の組成物を提供する。いくつかの実施態様において、レポーター分子は、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例：ＧＦＰ、ＹＦＰなど）、アルカリホスファターゼ又はベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施態様において、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ又はナノルシフェラーゼである。いくつかの実施態様において、ＦｃＲ（例：ＦｃγＲ）活性化に応答するプロモーター及び／又は配列は、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター又はＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施態様において、ＦｃＲシグナル伝達に反応する配列は、ＮＦκＢ配列を含む。
［００８４］ いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、１つ又は複数のＦｃ受容体を含み、且つ、ＦｃＲシグナル伝達によって活性化されるプロモーター及び／又は配列の制御下でレポーターをコードする核酸を更に含む食細胞である。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、１つ又は複数のＦｃ受容体を含み、且つ、ＦｃＲシグナル伝達によって活性化されるプロモーター及び／又は配列の制御下でレポーターをコードする核酸を更に含む単球である。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ又はＦｃγＲＩＩＩのうちの１つ又は複数を含み、且つ、ＦｃＲシグナル伝達によって活性化されるプロモーター及び／又は配列の制御下でレポーターをコードする核酸を更に含む単球である。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、１つ又は複数のＦｃ受容体を含み、且つ、ＮＦ－κＢプロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーターをコードする核酸を更に含む単球である。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ又はＦｃγＲＩＩＩのうちの１つ又は複数を含み、且つ、ＮＦ－κＢプロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーターをコードする核酸を更に含む単球である。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ及び／又はＦｃγＲＩＩＩを含み、且つ、ＮＦ－κＢプロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーターをコードする核酸を更に含むＴＨＰ－１細胞である。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ及び／又はＦｃγＲＩＩＩを含み、且つ、ＮＦ－κＢプロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーターをコードする核酸を更に含むＵ－９３７細胞である。
抗体活性又は力価試験
［００８５］ いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドが抗原結合ドメイン及びＦｃ受容体結合ドメインを含むポリペプチド調製物の活性又は力価のための方法を提供する。いくつかの実施態様において、上記方法は、固定化された抗原とポリペプチドの調製物を接触させることと、その後、固定化された抗原－ポリペプチド複合体を、Ｆｃ受容体と、Ｆｃ受容体活性化に反応するプロモーター及び／又は配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含む細胞の集団に接触させることとを含む。このレポーターの発現は、ポリペプチド調製物の活性又は力価を示す。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、抗体又はイムノアドヘシンである。いくつかの実施態様において、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ又はベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施態様において、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ又はナノルシフェラーゼである。いくつかの実施態様において、単球活性化に反応するプロモーター及び／又は配列は、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター又はＮＦκＢプロモーターである。いくつかの実施態様において、Ｆｃ受容体活性化に反応するプロモーター及び／又は配列は、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、及びＮＦκＢのうちのいずれか１つ又は複数からのＦｃ受容体活性化応答性配列を含む。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、食細胞である。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、単球である。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、細胞株からのものである。いくつかの実施態様において、細胞株は、ＴＨＰ－１細胞株又はＵ－９３７細胞株である。いくつかの実施態様において、標的抗原は、ベータアミロイド（Ａβ）又はＣＤ－２０である。いくつかの実施態様において、Ａβは、ヒトＡβである。いくつかの実施態様において、Ａβは、モノマー及び／又はオリゴマーのＡβを含む。本発明のいくつかの実施態様では、モノマーＡβとオリゴマーＡβの比率は、約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９；又は１：１０のいずれかである。いくつかの実施態様において、ヒトＡβは、Ａβ１－４０又はＡβ１－４２である。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、クレネズマブである。
［００８６］ 本発明のいくつかの実施態様では、抗原は、表面に固定化される。いくつかの実施態様において、表面は、プレートである。いくつかの実施態様において、表面は、ウェルを備えたプレートであるいくつかの実施態様において、表面は、約９６、１８２、２８８、３８４、４８０、５７６又は６７２ウェルを備えたプレートである。いくつかの実施態様において、抗原は、接着により表面に固定化される。いくつかの実施態様において、抗原は、ストレプトアビジン－ビオチンシステムを用いて表面に固定化される。いくつかの実施態様において、ストレプトアビジンは表面に連結され、ビオチンは抗原に連結され、その後、ストレプトアビジンに対するビオチンの高い親和性のために抗原が固定化される。いくつかの実施態様において、表面は、ストレプトアビジンコートプレート（例：市販のストレプトアビジンコートプレート）である。いくつかの実施態様において、表面は、ストレプトアビジンコート９６ウェルプレートである。
［００８７］ いくつかの実施態様において、抗原は、抗原のＮ末端又はその近傍の表面に固定化される。いくつかの実施態様において、抗原は、抗原のＣ末端又はその近傍の表面に固定化される。いくつかの実施態様において、抗原は、抗原が表面上で逆の向きになるように、抗原のＮ末端又はその近傍の表面と、抗原のＣ末端又はその近傍の表面に固定化される。いくつかの実施態様において、抗原は、抗原が表面上でループを形成するように、抗原のＮ末端又はその近傍の表面と、抗原のＣ末端又はその近傍の表面に固定化される。いくつかの実施態様において、ストレプトアビジンが表面に連結され、抗原はそのＮ末端にビオチンを含み、ビオチンがストレプトアビジンと結合して抗原をそのＮ末端で固定化する。いくつかの実施態様において、ストレプトアビジンが表面に連結され、抗原はそのＣ末端にビオチンを含み、ビオチンがストレプトアビジンと結合して抗原をそのＣ末端で固定化する。いくつかの実施態様において、ストレプトアビジンが表面に連結され、抗原は、抗原が表面上で逆の向きになるように、そのＮ末端とそのＣ末端にビオチンを含む。いくつかの実施態様において、ストレプトアビジンが表面に連結され、抗原はそのＮ末端とそのＣ末端にビオチンを含み、両方のビオチン部分がストレプトアビジンと結合して、抗原が表面上にループを形成するように、そのＮ末端及びＣ末端によって抗原を固定化する。
［００８８］ いくつかの実施態様において、抗原は、ビオチンとコンジュゲートして、ビオチン化抗原を形成する。いくつかの実施態様では、約０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．６μｇ／ｍＬ、０．７μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、０．９μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、３．０μｇ／ｍＬ、３．５μｇ／ｍＬ、４．０μｇ／ｍＬ、４．５μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬ、５．５μｇ／ｍＬ、６．０μｇ／ｍＬ、６．５μｇ／ｍＬ、７．０μｇ／ｍＬ、７．５μｇ／ｍＬ、８．０μｇ／ｍＬ、８．５μｇ／ｍＬ、９．０μｇ／ｍＬ、９．５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬのいずれかよりも低い濃度であるビオチン化抗原を、ストレプトアビジンでコーティングされた表面に接触させる。いくつかの実施態様では、各ウェルに約１０ｎｇ、２０ｎｇ、３０ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．６μｇ、０．７μｇ、０．８μｇ、０．９μｇ、１．０μｇ若しくは１．０μｇを超える、又はその間の任意の値のいずれかの量のビオチン化抗原が添加されているストレプトアビジンコートマルチウェルプレートとビオチン化抗原を接触させる。
［００８９］ いくつかの実施態様では、固定化された抗原を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約３０，０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約２０，０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０，０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約１０，０００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０，０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１０，０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０，０００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０，０００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１０，０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約４０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約３０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約２０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、又は約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬのいずれかの濃度範囲のポリペプチドを含む組成物と接触させる。
［００９０］ いくつかの実施態様では、固定化された抗原－ポリペプチド複合体を、レポーター細胞と接触させる。いくつかの実施態様では、固定化された抗原－ポリペプチド複合体を、約１×１０４、５×１０４、７．５×１０４、１×１０５、１．２５×１０５、１．５×１０５、１．７５×１０５、２×１０５、２．２５×１０５、２．５×１０５、２．７５×１０５、３×１０５、３．２５×１０５、３．５×１０５、３．７５×１０５、４×１０５、４．２５×１０５、４．５×１０５、４．７５×１０５、５×１０５、５．５×１０５、６×１０５、６，５×１０５、７×１０５、７．５×１０５、８×１０５、８．５×１０５、９×１０５、９．５×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、又は５×１０６のいずれかのレポーター細胞と接触させる。いくつかの実施態様では、固定化された抗原－ポリペプチド複合体を、約１×１０４から５×１０６まで、５×１０４から１×１０６まで、１×１０５から１×１０６まで、１×１０５から２×１０５まで、２×１０５から３×１０５まで、３×１０５から４×１０５まで、４×１０５から５×１０５まで、５×１０５から６×１０５まで、６×１０５から７×１０５まで、７×１０５から８×１０５まで、８×１０５から９×１０５まで、又は９×１０５から１×１０６までのいずれかのレポーター細胞と接触させる。いくつかの実施態様では、固定化された抗原－ポリペプチド複合体を、約１×１０５細胞／ｍｌ、２×１０５細胞／ｍｌ、３×１０５細胞／ｍｌ、４×１０５細胞／ｍｌ、５×１０５細胞／ｍｌ、６×１０５細胞／ｍｌ、７×１０５細胞／ｍｌ、８×１０５細胞／ｍｌ、９×１０５細胞／ｍｌ、１×１０６細胞／ｍｌ、２×１０６細胞／ｍｌ、２．５×１０６細胞／ｍｌ、３×１０６細胞／ｍｌ、４×１０６細胞／ｍｌ、５×１０６細胞／ｍｌ、６×１０６細胞／ｍｌ、７×１０６細胞／ｍｌ、７．５×１０６細胞／ｍｌ、８×１０６細胞／ｍｌ、９×１０６細胞／ｍｌ、又は１×１０７細胞／ｍｌのいずれかよりも低い濃度であるレポーター細胞と接触させる。いくつかの実施態様では、固定化された抗原－ポリペプチド複合体を、約１×１０５細胞／ｍｌから１×１０７細胞／ｍｌまで、１×１０５細胞／ｍｌから１×１０６細胞／ｍｌまで、５×１０５細胞／ｍｌから５×１０６細胞／ｍｌまで、又は１×１０６細胞／ｍｌから１×１０７細胞／ｍｌまでのいずれかの濃度であるレポーター細胞と接触させる。
［００９１］ いくつかの実施態様では、レポーターは、固定化された抗原－ポリペプチド複合体をレポーター細胞と接触させてから約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２４時間、２８時間、３０時間、又は３６時間のいずれか以上経過した後に検出される。いくつかの実施態様において、レポーターは、固定化された抗原－ポリペプチド複合体をレポーター細胞と接触させてから約１時間から約３６時間、約１時間から約２４時間、約１時間から約１２時間、約１時間から約８時間、約１時間から約６時間、約１時間から約４時間、約１時間から約２時間、約４時間から約２４時間、約４時間から約１２時間、約４時間から約８時間、約８時間から約２４時間、約８時間から約１２時間、約１６時間から約２４時間、約１６時間から約２０時間、又は約２０時間から約２４時間のいずれかの間に検出される。
［００９２］ いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドが標的抗原と結合するポリペプチド調製物の力価を定量化する方法であって、ａ）固定化された標的抗原の複数の集団を異なる濃度のポリペプチド調製物と接触させて、抗原－ポリペプチド複合体を形成すること、ｂ）これらの抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させることであって、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含む、接触させること、ｃ）レポーターの発現を測定すること、及びｄ）ポリペプチド調製物のＥＣ５０を決定し、ポリペプチド調製物のＥＣ５０と、力価が既知のポリペプチドの標準試料のＥＣ５０とを比較することを含む、ポリペプチド調製物の力価を定量化する方法を提供する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、抗体又はイムノアドヘシンである。いくつかの実施態様において、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ又はベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施態様において、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ又はナノルシフェラーゼである。いくつかの実施態様において、Ｆｃ受容体活性化（例：Ｆｃγ受容体活性化）に反応するプロモーター及び／又は配列は、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１又はＮＦκＢのうちのいずれか１つ又は複数に対するＦｃ受容体活性化応答性配列を含む。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、食細胞である。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、食細胞（複数）である。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、単球である。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、細胞株からのものである。いくつかの実施態様において、細胞株は、ＴＨＰ－１細胞株又はＵ－９３７細胞株である。いくつかの実施態様において、標的抗原は、ベータアミロイド（Ａβ）又はＣＤ－２０である。いくつかの実施態様において、Ａβは、ヒトＡβである。いくつかの実施態様において、Ａβは、モノマー及び／又はオリゴマーのＡβを含む。いくつかの実施態様において、ヒトＡβは、Ａβ１－４０又はＡβ１－４２である。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、クレネズマブである。
［００９３］ いくつかの実施態様では、ポリペプチド調製物のＥＣ５０を、活性又は力価が既知のポリペプチド調製物（例：標準試料又は標準調製物）のＥＣ５０と比較する。本明細書で使用する場合、ＥＣ５０とは、指定した曝露時間後にベースラインと最大値の中間の応答を誘発するポリペプチドの濃度を指す。いくつかの実施態様において、固定化された抗原－標準ポリペプチド複合体をレポーター細胞と接触させた後のレポーター活性の検量線を生成することにより、活性又は力価が既知のポリペプチド調製物のＥＣ５０が決定される。いくつかの実施態様において、検量線は、細胞の集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０，０００ｎｇ／ｍＬまでの範囲の複数の濃度の標準ポリペプチド調製物と接触させることによって生成される。いくつかの実施態様において、検量線は、細胞の集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約１０，０００ｎｇ／ｍＬまでの範囲の複数の濃度の標準ポリペプチド調製物と接触させることによって生成される。いくつかの実施態様において、検量線は、細胞の集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約１５，０００ｎｇ／ｍＬまでの範囲の複数の濃度の標準ポリペプチド調製物と接触させることによって生成される。いくつかの実施態様において、検量線は、細胞の集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約５，０００ｎｇ／ｍＬまでの範囲の複数の濃度の標準ポリペプチド調製物と接触させることによって生成される。いくつかの実施態様において、標準ポリペプチド調製物の複数の濃度としては、約０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ又は５００μｇ／ｍＬのうちのいずれか１つが挙げられる。いくつかの実施態様において、標準ポリペプチド調製物の複数の濃度としては、約１０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、７５０μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、１６００μｇ／ｍＬ、４０００μｇ／ｍＬ又は１００００μｇ／ｍＬのうちのいずれか１つが挙げられる。いくつかの実施態様において、標準ポリペプチド調製物の複数の濃度は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１５を超える濃度である。
［００９４］ いくつかの実施態様において、レポーターは、細胞を組成物と接触させてから約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間又は３６時間のいずれか以上経過した後に検出される。いくつかの実施態様において、レポーターは、細胞を組成物と接触させてから約１時間から約２４時間、約１時間から約１２時間、約１時間から約８時間、約１時間から約６時間、約１時間から約４時間、約１時間から約２時間、約４時間から約２４時間、約４時間から約１２時間、約４時間から約８時間、約８時間から約２４時間、約８時間から約１２時間、約１６時間から約２４時間、約１６時間から約２０時間、又は約２０時間から約２４時間のいずれかの間に検出される。
［００９５］ 本発明のいくつかの実施態様において、本方法は、標準試料に対するマルチパラメーター・ロジスティックフィットを使用して、ポリペプチド調製物のＥＣ５０に基づく力価を計算することを更に含む。いくつかの実施態様において、マルチパラメーター・ロジスティックフィットは、３パラメーター、４パラメーター又は５パラメーター・ロジスティックフィットである。このようなマルチパラメーター・フィットの方法は、当技術分野で既知である。
［００９６］ いくつかの実施態様において、ポリペプチド調製物の力価は、以下のように４パラメーター・ロジスティックフィットを使用するポリペプチド調製物のＥＣ５０に基づく。
［００９７］ 個々のウェルの相対発光量（ＲＬＵ）で測定された発光値を用いて、各標準品（ＳＴ）及び試験品（対照及び試料（複数可）；ＴＡ）濃度の平均ウェル値が計算され、複製ウェルが試験される。
［００９８］ 標準品、対照、及び試料の用量反応曲線が、各濃度の平均ウェル値をｙ軸（線形スケール）上に、濃度をｘ軸（対数スケール）上にプロットすることによって作製される。
［００９９］ ４パラメーター・ロジスティック曲線あてはめプログラムを使用して、ＳＴ及び各ＴＡの個別の曲線が作製される。４パラメーター・ロジスティック曲線あてはめ式は、以下の通りである。
Figure 2022528804000001
上式中、
ｘ＝ＳＴ又はＴＡの濃度
ｙ＝ウェルの応答平均値（average well value response）（ＲＬＵ）
Ａ＝用量反応なし（下方漸近線＝ＬＡ）：
Ｂ＝勾配
Ｃ＝ＥＣ５０（最大有効濃度の半分）
Ｄ＝最大用量反応（上方漸近線＝ＵＡ）
［０１００］ 各曲線の決定係数（Ｒ２）を計算する。
［０１０１］ 標準品、対照、及び試料の曲線の反応倍率を計算する。
反応倍率＝ＵＡ÷ＬＡ
［０１０２］ 勾配比は、以下のように計算される。
Figure 2022528804000002
［０１０３］ 上方漸近線のパーセント差は、次のように計算される。
Figure 2022528804000003
［０１０４］ 下方漸近線のパーセント差は、次のように計算される。
Figure 2022528804000004
［０１０５］ 試験品の相対的力価は、４パラメーターの平行曲線分析を使用して計算される。ＳＴと各ＴＡの制約付き４－Ｐ平行曲線を、共通のパラメーターセット：勾配（パラメーターＢ）、上方漸近線（パラメーターＤ）、及び下方漸近線（パラメーターＡ）を使用して生成する。結果として得られる、標準品（ＳＴ）と試験品（ＴＡ）の曲線数式は、以下のとおりである。
Figure 2022528804000005
上式中、
ｘ＝抗体の濃度
ｙＳＴ＝標準品ＲＬＵ
ｙＴＡ＝試験品ＲＬＵ
Ａ＝共通の下方漸近線
Ｂ＝共通の勾配
ＣＳＴ＝標準品ＥＣ５０
Ｄ＝共通の上方漸近線
ρ＝試料の相対的力価（相対的力価とは、ＴＡのＥＣ５０に対するＳＴのＥＣ５０の比率）
［０１０６］ 以下の式に従って試験品の力価を計算する。
力価＝ρ×標準試料の活性
キット
［０１０７］ 本発明のいくつかの態様において、ポリペプチド調製物の活性又は力価を決定するための試験で使用するためのキット又は製造品が提供され、これは、本明細書に記載のＦｃ受容体活性化に反応するプロモーター及び／又は配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸を含む操作された細胞を含む組成物を入れる容器を含む。いくつかの実施態様において、キットは、標準ポリペプチド調製物試験試料（reference polypeptide preparation assay standard）（活性又は力価が既知のポリペプチド調製物）が入る容器及び／又はポリペプチド調製物標準試料が入る容器を更に備える。いくつかの実施態様において、キットは、固定化された抗原を含む容器又は表面を更に備える。いくつかの実施態様において、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ又はベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施態様において、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ又はナノルシフェラーゼである。いくつかの実施態様において、Ｆｃ受容体活性化に反応するプロモーター及び／又は配列は、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちのいずれか１つ又は複数からのＦｃ受容体活性化応答性配列を含む。いくつかの実施態様において、レポーター細胞は、食細胞である。いくつかの実施態様において、食細胞は、単球である。いくつかの実施態様において、食細胞は、細胞株からのものである。いくつかの実施態様において、食細胞株は、ＴＨＰ－１細胞株又はＵ－９３７細胞株である。
［０１０８］ 容器には製剤が入り、容器上の又は容器に付随するラベルは、使用説明書を示し得る。製造品は、他のバッファー、希釈剤、培養用品、レポーター分子を検出するための試薬、及び使用説明書付きの添付文書など、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料を更に含み得る。
［０１０９］ 本発明のいくつかの態様において、ビオチンとコンジュゲートした抗原を含む組成物が入り、任意選択的に使用説明書を提供する容器を備えるキット又は製造品が提供される。いくつかの実施態様において、キットは、標準ポリペプチド試験試料（活性又は力価が既知のポリペプチド調製物）及び／又は抗原結合対照も更に提供する。上記容器には上記製剤が入り、容器上の又は容器に付随するラベルは、使用説明書を示し得る。製造品は、他のバッファー、希釈剤、培養用品、レポーター分子を検出するための試薬、及び使用説明書付きの添付文書など、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料を更に含み得る。
ポリペプチド
［０１１０］ 本明細書に記載の方法を使用して分析されるポリペプチドは、一般に、組換え技術を使用して生産される。組換えタンパク質を生産する方法は、例えば、参照により本明細書に具体的に援用されている米国特許第５，５３４，６１５号及び第４，８１６，５６７号に記載されている。いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は、ＣＨＯ細胞内で産生される（例：ＷＯ第９４／１１０２６号参照）。いくつかの実施態様において、目的のポリペプチドは、大腸菌細胞内で産生される。例えば、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）とシグナル配列を記載した米国特許第５，８４０，５２３号、米国特許第５，６４８，２３７号、及び米国特許第５，７８９，１９９号を参照されたい。また、大腸菌におけるポリペプチド断片の発現について記載したＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻（B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003）、２４５－２５４頁も参照されたい。組換え技術を使用した場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔内で細胞内に産生されるか又は、培地中に直接分泌され得る。
［０１１１］ ポリペプチドは、培地又は宿主細胞溶解物から回収されてもよい。ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、様々な物理的又は化学的手段、例えば凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤により破壊され得る。ポリペプチドが細胞内に産生される場合、最初の工程として、宿主細胞か又は溶解断片の何れかである微粒子片は、例えば遠心分離又は限外濾過により除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌されるポリペプチドを単離するための手順を記載している。手短に述べると、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下、細胞ペーストを約３０分にわたって解かす。細胞片は、遠心分離によって除去することができる。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、一般に、そのような発現系からの上清は、市販のポリペプチド濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ（登録商標）又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）限外濾過ユニットを使用して、最初に濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を、タンパク質分解を阻害するための前述の工程のいずれかに含めることができ、抗生物質を、偶発的混入物の増殖を防ぐために含めることもできる。
［０１１２］ いくつかの実施態様において、ポリペプチドと１種以上の混入物とを含む組成物中のポリペプチドは、本発明の方法により、分析前に精製されているか又は部分的に精製されている。例えば、本発明の方法のポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからの溶離液中にある。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶離液中にある。
［０１１３］本発明の方法により分析され得るポリペプチドの例には、限定されないが、免疫グロブリン、イムノアドヘシン、抗体、酵素、ホルモン、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、免疫コンジュゲート、サイトカイン、及びインターロイキンが挙げられる。
（Ａ）抗体
［０１１４］ 本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法によってポリペプチド及びポリペプチドを含む製剤を分析する方法のいずれかで使用するためのポリペプチドは、抗体又はイムノアドへシンである。いくつかの実施態様において、本発明のポリペプチドの抗原標的は、Ａベータ又はＣＤ２０である。
［０１１５］ その他の例示的な抗体としては、限定されないが、抗エストロゲン受容体抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗ｐ５３抗体、抗ＨＥＲ－２／ｎｅｕ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ－２抗体、抗Ｅカドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５－３抗体、抗ＣＡ１９－９抗体、抗ｃ－ｅｒｂＢ－２抗体、抗Ｐ糖タンパク質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽細胞腫タンパク質抗体、抗ｒａｓ腫瘍性タンパク質抗体、抗Ｌｅｗｉｓ Ｘ抗体、抗Ｋｉ－６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ユビキチン抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ｃ－ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ビメンチン抗体、抗ＨＰＶタンパク抗体、抗カッパ軽鎖抗体、抗ラムダ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異抗原抗体、抗Ｓ１００抗体、抗タウ抗原抗体、抗フィブリン抗体、抗ケラチン抗体、抗ＴｅｂＢ２抗体、抗ＳＴＥＡＰ抗体、及び抗Ｔｎ抗原抗体から選択されるものが挙げられる。
（ｉ）モノクローナル抗体
［０１１６］ いくつかの実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の製造中に生じ得るバリアント（一般に、そのようなバリアントは微量存在する）を除いて、同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、別々の抗体又はポリクローナル抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。
［０１１７］ 例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製されてもよく、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製されてもよい。
［０１１８］ ハイブリドーマ法では、マウスか又はハムスターなどのその他の適切な宿主動物を免疫して、免疫のために使用されたポリペプチドに特異的に結合する抗体を生産するか又は生産する能力のあるリンパ球を誘発する。或いは、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫してもよい。その後、リンパ球を、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。
［０１１９］ したがって、ハイブリドーマ細胞は、非融合の親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１種以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中で播種され、培養される。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）が含まれ、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。
［０１２０］ いくつかの実施態様において、骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生をサポートし、ＨＡＴ培地などの培地に感受性であるものである。このうち、いくつかの実施態様では、骨髄腫細胞株は、マウス骨髄種株、例えば、米国カリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒから入手可能なＭＯＰＣ－２１及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍に由来するもの及び米国メリーランド州ロックビルのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なＳＰ－２又はＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞である。ヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
［０１２１］ ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について試験される。いくつかの実施態様において、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法によって、又は放射免疫測定法（ＲＩＡ）若しくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ ｖｉｔｒｏの結合試験によって決定される。
［０１２２］ モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード解析により決定することができる。
［０１２３］ 所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後で、クローンを、限定希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させてもよい（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的のための好適な培地には、例えば、Ｄ－ＭＥＭ又はＲＰＭＩ－１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖させてもよい。
［０１２４］ サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えばポリペプチドＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーにより、培地、腹水又は血清から適切に分離される。
［０１２５］ モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。いくつかの実施態様において、ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として機能する。単離されたＤＮＡは、発現ベクターに入れられ、その後、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞など、他の方法では免疫グロブリンポリペプチドを産生しない宿主細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組み換え発現に関する総説としては、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５：２５６－２６２（１９９３）及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１－１８８（１９９２）が挙げられる。
［０１２６］ 更なる実施態様において、抗体又は抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）に記載の技術を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）とＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１－５９７（１９９１）には、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の単離についてそれぞれ記載されている。その後の出版物には、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭレンジ）ヒト抗体の産生（Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)）、並びに、非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてのコンビナトリアル感染及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)）が記載されている。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替手段である。
［０１２７］ ＤＮＡは、例えば相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部若しくは一部を共有結合することによっても修飾することができる。
［０１２８］ 典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換されるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原部位とを含むキメラ二価抗体が作製される。
［０１２９］ 本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施態様において、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭである。いくつかの実施態様において、抗体は、ＩｇＧモノクローナル抗体である。
（ｉｉ）ヒト化抗体
［０１３０］ いくつかの実施態様において、抗体は、ヒト化抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野で記載されている。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ又は複数のアミノ酸残基を有する。こうした非ヒトアミノ酸残基は、通常、「移入」残基と呼ばれ、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、基本的には、Ｗｉｎｔｅｒとその同僚の方法（Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science239:1534-1536 (1988)）の方法に従って、超可変領域の配列をヒト抗体の対応する配列と置換することにより実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが非ヒト種の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、通常、いくつかの超可変領域残基と場合によってはいくつかのＦＲ残基がげっ歯類の抗体の類似部位の残基で置換されているヒト抗体である。
［０１３１］ 抗原性を低下させるには、ヒト化抗体を作製する際に使用する軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、げっ歯類の抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメインの配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。その後、そのげっ歯類の配列と最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受け入れられる（Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)）。別の方法では、軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループの、すべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体について使用してもよい（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)）。
［０１３２］ 抗体が抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的特性を保持した状態でヒト化されることが、更に重要である。この目標を達成するために、本方法のいくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用する親配列及び多様な概念的ヒト化産物の分析プロセスを経て調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定される三次元立体構造（conformational structure）を描き、表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の推定役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原へ結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基をレシピエント配列及び移入配列から選択して組み合わせることができ、その結果、標的抗原に対する親和性の向上などの所望の抗体特性が得られる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を与えることに直接且つ最も実質的に関与している。
（ｉｉｉ）ヒト抗体
［０１３３］ いくつかの実施態様において、抗体は、ヒト抗体である。ヒト化の代替策として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、免疫の際に、内因性免疫グロブリン産生なしでヒト抗体の完全なレパートリーを生成する能力があるトランスジェニック動物（例：マウス）を作製することが現在可能になっている。例えば、キメラマウス及び生殖系列変異体マウスにおいて、抗体の重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は内因性抗体産生を完全に阻害することが記載されている。こうした生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ． ７：３３（１９９３）；並びに米国特許第５，５９１，６６９号；同第５，５８９，３６９号；及び同第５，５４５，８０７号参照。
［０１３４］ 或いは、ファージディスプレイ技術（(McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)）を使用して、免疫されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメインの遺伝子レパートリーから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト抗体及び抗体断片を産生することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ（Ｍ１３又はｆｄなど）の主働又は微働被膜ポリペプチド遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上で機能的抗体断片としてディスプレイされる。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡのコピーを含んでいるため、抗体の機能特性に基づく選択は、その特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択にもつながる。このように、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣している。ファージディスプレイは、様々なフォーマットで実施することができ、それらの総説については、例えばＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４－５７１（１９９３）を参照のこと。ファージディスプレイには、Ｖ遺伝子セグメントの複数の供給源を使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）は、免疫されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多種多様なアレイを単離した。免疫されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築し、抗原の多種多様なアレイに対する抗体（自己抗原を含む）を、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１－５９７（１９９１）又はＧｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５－７３４（１９９３）により記載された技術に基本的に従って単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号及び第５，５７３，９０５号も参照のこと。
［０１３５］ ヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞により産生されてもよい（米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号を参照のこと）。
（ｉｖ）抗体断片
［０１３６］ いくつかの実施態様において、抗体は、抗体断片である。いくつかの実施態様では、抗体は、Ｆｃ受容体結合ドメインを含む抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されてきた。従来、このような断片は、インタクトな抗体のタンパク分解消化を介して誘導された（例えばMorimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);及びBrennan et al., Science 229:81 (1985)を参照のこと）。しかし、このような断片は現在、組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリーから単離することができる。
［０１３７］ いくつかの実施態様において、本明細書に記載の抗体の断片が提供される。いくつかの実施態様において、抗体断片は、抗原結合断片である。いくつかの実施態様において、抗体断片は、Ｆｃ受容体結合ドメインを含む抗原結合断片である。いくつかの実施態様において、抗体断片は、Ｆｃγ受容体結合ドメインを含む抗原結合断片である。
（ｖ）二重特異性抗体
［０１３８］ いくつかの実施態様において、抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合してもよい。或いは、二重特異性抗体の結合アームは、白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞受容体分子（例：ＣＤ２又はＣＤ３）又はＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）と結合するアームと組み合わせることで、細胞防御機構を細胞に集中させることができる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例：Ｆ（ａｂ’）２二重特性抗体）として調製することができる。
［０１３９］ 二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で既知である。完全長の二重特異性抗体の従来の生産は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づいており、２つの鎖は異なる特異性を有する（Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖はランダムに取り合わされるため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の混合物を生成する可能性があり、そのうち１つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程により行われるが、かなり面倒であり、生成物の収率は低い。同様の手順は、ＷＯ第９３／０８８２９号及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５－３６５９（１９９１）に開示されている。
［０１４０］ 異なるアプローチでは、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体－抗原結合部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。いくつかの実施態様において、この融合は、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの間で行われる。いくつかの実施態様において、軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体のうちの少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望により免疫グロブリン軽鎖とをコードしているＤＮＡを別々の発現ベクター中に挿入し、好適な宿主生物の中にコトランスフェクトする。これにより、構築に使用する３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす実施態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合を調節する際に大きな柔軟性がもたらされる。しかしながら、等しい比率での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合、又はその比率に特に意味がない場合、２つ若しくは３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
［０１４１］ このアプローチのいくつかの実施態様において、二重特異性抗体は、第１の結合特異性を一方のアームに、複合免疫グロブリン重鎖－軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）を他方のアームに有する、複合免疫グロブリン重鎖から構成される。このような非対称的構造により、不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離が容易になることが見出された。これは、二重特異性分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在することで、分離が容易になるためである。このアプローチは、ＷＯ第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体生成の更なる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
［０１４２］ 米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている別のアプローチによれば、一対の抗体分子の分子間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージが最大になるように操作することができる。いくつかの実施態様において、界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つ又は複数の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えられる。大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、大きな側鎖（複数可）と同じ又は類似のサイズを有する代償性「空洞」が第２の抗体分子の界面に創出される。これは、ヘテロ二量体の収率をホモ二量体などの他の不要な最終生成物よりも高める機構を提供する。
［０１４３］ 二重特異性抗体には、架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方をアビジンに、他方をビオチンに結合させることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に標的化するために提案され（米国特許第４，６７６，９８０号）、また、ＨＩＶ感染症の治療としても提案されている（ＷＯ第９１／００３６０号、ＷＯ第９２／２００３７３号、及びＥＰ第０３０８９３６号）。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は、当技術分野でよく知られており、米国特許第４，６７６，９８０号において、いくつかの架橋手法と共に開示されている。
［０１４４］ 抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技術も、文献に記載されている。例えば、化学結合を用いて二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体をタンパク質分解で切断してＦ（ａｂ’）２断片を生成する手順を記載している。こうした断片をジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して隣接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィドの形成を防止する。その後、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。その後、Ｆａｂ’－ＴＮＢ誘導体の一方を、メルカプトエチルアミンを用いた還元によりＦａｂ’－チオールに再変換し、等モル量の他方のＦａｂ’－ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用薬剤として使用され得る。
［０１４５］ 組換え細胞培養から直接二重特異性抗体断片を作製及び単離するための様々な技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて製造されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。この抗体ホモ二量体は、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、その後再酸化されて抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の製造にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）で記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替機構を提供した。これらの断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、ある断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインと対形成することを余儀なくされることにより、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体断片を作製するための別の方策も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
［０１４６］ 三価以上の抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０（１９９１）。
（ｖ）多価抗体
［０１４７］ いくつかの実施態様において、抗体は、多価抗体である。多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現させる細胞により、二価抗体より速く内部移行（及び／又は異化）され得る。本明細書において提供される抗体は、３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラスの抗体以外である）であってもよく（例えば四価抗体）、そのような抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードしている核酸の組換え発現により、容易に産生され得る。多価抗体は、二量体化ドメイン及び３つ以上の抗原結合部位を含み得る。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域又はヒンジ領域を含む（又はそれからなる）。この場合、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端にある３つ以上の抗原結合部位とを含む。本明細書における好ましい多価抗体は、３つから約８つ、ただし好ましくは４つの抗原結合部位を含む（又はそれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、そのポリペプチド鎖（複数可）は、２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＤ１－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－（Ｘ２）ｎ－Ｆｃ（ここで、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の一方のポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２は、アミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは、０又は１である）を含んでもよい。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＨ－ＣＨ１－柔軟性リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖を含んでもよい。本明細書における多価抗体は、好ましくは、少なくとも２つ（好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドを更に含む。本明細書における多価抗体は、例えば、約２つから約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでもよい。ここで企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択的にＣＬドメインを更に含む。
［０１４８］ いくつかの実施態様において、抗体は、多重特異性抗体である。多重特異性抗体の例には、限定されないが、ＶＨＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体、各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープに結合する２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する２つ以上の単一可変ドメインを有する抗体、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖなどの抗体断片、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三官能性抗体、共有結合又は共有結合で結合された抗体断片が含まれる。いくつかの実施態様において、その抗体は、ポリエピトープ特異性；例えば、同じ又は異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を有する。いくつかの実施態様において、抗体は、単一特異性であり、例えば、１つのエピトープのみに結合する抗体である。一実施態様によれば、多重特異性抗体は、親和性が５μＭ～０．００１ｐＭ、３μＭ～０．００１ｐＭ、１μＭ～０．００１ｐＭ、０．５μＭ～０．００１ｐＭ、又は０．１μＭ～０．００１ｐＭである各エピトープに結合するＩｇＧ抗体である。
（ｖｉ）その他の抗体修飾
［０１４９］ 本明細書において提供される抗体を修飾することは、エフェクター機能、例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を強化するためのエフェクター機能に関して、望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域において１つ又は複数のアミノ酸置換基を導入することにより達成してもよい。代替的又は追加的に、システイン残基（複数可）をＦｃ領域に導入して、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成が可能になるようにしてもよい。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、内部移行能力が向上し、且つ／又は補体媒介性細胞殺傷及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増加する可能性がある。Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １７６：１１９１－１１９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：２９１８－２９２２（１９９２）を参照のこと。抗腫瘍活性が強化されているホモ二量体型抗体は、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０－２５６５（１９９３）に記載されているように、ヘテロ二官能性の架橋剤を使用して調製されてもよい。或いは、２つのＦｃ領域を有し、それにより補体媒介性溶解及びＡＤＣＣ能が強化され得る抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９－２３０（１９８９）を参照されたい。
［０１５０］ 抗体の血清半減期を延長させるために、米国特許出願公開第２００６／００６７９３０号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されているように抗体のアミノ酸に変更を加えることができる。
（Ｂ）ポリペプチドバリアントと修飾
［０１５１］ 本明細書に記載されているポリペプチド（抗体を含む）のアミノ酸配列の修飾（複数可）は、本明細書に記載のポリペプチド（例：抗体）を精製する方法で使用することができる。
（ｉ）バリアントポリペプチド
［０１５２］ 「ポリペプチドバリアント」は、ポリペプチドの全長天然配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、ポリペプチドの細胞外ドメイン（シグナルペプチドの有無を問わない）と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、本明細書で定義されるポリペプチド、好ましくは活性ポリペプチドを意味する。このようなポリペプチドバリアントには、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ又はＣ末端で１つ又は複数のアミノ酸残基が付加され又は欠失しているポリペプチドが含まれる。通常、ＴＡＴポリペプチドバリアントは、全長天然配列ポリペプチド配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、ポリペプチドの細胞外ドメイン（シグナルペプチドの有無を問わない）に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のいずれかのアミノ酸配列同一性を有する。場合により、バリアントポリペプチドは、天然ポリペプチド配列と比較して１つだけの保存的アミノ酸置換を有し、或いは、天然ポリペプチド配列と比較してわずか約２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のいずれかの保存的アミノ酸置換を有する。
［０１５３］ バリアントポリペプチドは、全長天然ポリペプチドと比較して、例えば、Ｎ末端又はＣ末端で切断されているか、又は内部残基を欠いている可能性がある。特定のバリアントポリペプチドは、所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている可能性がある。切断、欠失、及び挿入を伴うこれらのバリアントポリペプチドは、複数の従来技術のいずれによっても調製することができる。所望のバリアントポリペプチドは、化学合成されてもよい。別の好適な技術は、所望のバリアントポリペプチドをコードする核酸断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離及び増幅することを含んでいる。ＰＣＲの５’及び３’プライマーにおいては、核酸断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドが用いられる。好ましくは、バリアントポリペプチドは、本明細書で開始されている天然ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
［０１５４］ アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００又はそれ以上の残基を有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体又は細胞傷害性ポリペプチドと融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入バリアントには、抗体の血清半減期を延長させる酵素又はポリペプチドに対する抗体のＮ又はＣ末端への融合体が含まれる。
［０１５５］ 例えば、ポリペプチドの結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。ポリペプチドのアミノ配列バリアントは、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。このような修飾には、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれらへの挿入、及び／又はそれらの置換が含まれる。最終コンストラクトが所望の特性を保有することを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが行われて、最終コンストラクトに到達する。また、アミノ酸の変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化など、ポリペプチド（例えば抗体）の翻訳後プロセスを変化させる可能性がある。
［０１５６］ 所望の活性に悪影響を及ぼすことなくどのアミノ酸残基を挿入、置換又は欠失させ得るかを決定する際の指針は、ポリペプチドの配列を相同の既知のポリペプチド分子の配列と比較して、相同性の高い領域においてなされるアミノ酸配列変化の数を最小限にすることにより見出され得る。
［０１５７］ 突然変異誘発にとって好ましい位置である、ポリペプチド（例えば抗体）の特定の残基又は領域の特定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５（１９８９）により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的となる残基又は残基群が特定され（例：Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕなどの荷電残基）、中性の又は負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）により置き換えられ、抗原とアミノ酸との相互作用に影響を与える。その後、置換に対して機能的感受性を示すこれらのアミノ酸位置は、置換部位に又はそれに対して更なる又は他のバリアントを導入することによって改良される。このように、アミノ酸配列バリアントを導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決まっている必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の成果を分析するために、ａｌａスキャニング又はランダム突然変異誘発が標的コドン又は領域で行われ、発現された抗体バリアントが所望の活性についてスクリーニングされる。
［０１５８］ バリアントの別の種類には、アミノ酸置換バリアントがある。こうした置換バリアントは、異なる残基により置換された抗体分子に少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換型突然変異誘発で最も関心の高い部位としては超可変領域が挙げられるが、ＦＲの変更も企図される。保存的置換が、表１の「例示的置換」という見出しの下に示されている。次いで、このような置換が生物活性に変化をもたらす場合は、表１で「置換」と呼ばれる、又はアミノ酸クラスに関連して以下で更に説明されるような、より大幅な変更を導入し、生成物をスクリーニングすることができる。
Figure 2022528804000006
［０１５９］ ポリペプチドの生物学的特性の大幅な改変は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばシート若しくはへリックス構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性又は（ｃ）側鎖の嵩を維持する効果が大きく異なる置換を選択することによって達成される。アミノ酸は、側鎖の特性の類似性に従って、以下のようにグループ化することができる（A. L. Lehninger,Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)）。
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
［０１６０］ 或いは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、以下のグループに分けることができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
［０１６１］ 非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つの要素を別のクラスの要素と交換することを必然的に伴うものである。
［０１６２］ また、抗体の適切な立体構造の維持に関与しないシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐために、一般にセリンで置換することができる。逆に、システイン結合（複数可）をポリペプチドに付加して、その安定性を改善することもできる（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
［０１６３］ 特に好ましいタイプの置換型バリアントは、親抗体（例：ヒト化抗体）の１つ又は複数の超可変領域の残基を置換することを含む。一般に、更なる開発のために選択された結果として得られるバリアント（複数可）は、それらを生成する親抗体と比較して改善された生物学的特性を有するであろう。このような置換型バリアントを生成する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用した親和性成熟が含まれる。簡潔に言えば、いくつかの超可変領域部位（例：６～７部位）を変異させて、各部位で可能なすべてのアミノ置換を生成する。このようにして生成された抗体バリアントは、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として一価の様式でディスプレイされる。その後、ファージディスプレイされたバリアントは、本明細書において開示されているように、その生物学的活性（例：結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる超可変領域部位を特定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施して、抗原結合に大きく寄与する超可変領域残基を特定することができる。代替的又は追加的に、抗原－抗体複合体の結晶構造を解析して、抗体と標的との間の接触点を特定することが有益である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、本明細書において詳述した技術に従って置換の候補になる。このようなバリアントが生成されたら、本明細書に記載されているようにバリアントのパネルをスクリーニングし、１つ又は複数の関連する試験において優れた特性を持つ抗体を選択して、更なる開発を行うことができる。
［０１６４］ ポリペプチドの別のタイプのアミノ酸バリアントは、抗体の元のグリコシル化パターンを変える。ポリペプチドは、非アミノ酸部分を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、グリコシル化されていてもよい。このようなグリコシル化は、宿主細胞又は宿主生物におけるポリペプチドの発現中に自然に起きてもよく、又はヒトの介入にから生じる意図的な修飾であってもよい。変更とは、ポリペプチドに見られる１つ若しくは複数の炭水化物部分を欠失させること、及び／又はポリペプチド中に存在しない１つ若しくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
［０１６５］ ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ－結合型又はＯ－結合型のいずれかである。Ｎ－結合型は、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合のための認識配列である。よって、ポリペプチドにおけるこれらトリペプチド配列のいずれかの存在が、潜在的なグリコシル化部位を作る。Ｏ－結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つが結合することを指すが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンを用いてもよい。
［０１６６］ ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、上記のトリペプチド配列のうちの１つ又は複数を含むようにアミノ酸配列を変更することによって簡便に達成される（Ｎ－結合型グリコシル化部位の場合）。この変更は、１つ又は複数のセリン又はスレオニン残基を元の抗体の配列に付加又は置換することによってもなされ得る（Ｏ－結合型グリコシル化部位の場合）。
［０１６７］ ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的若しくは酵素的に、又はグリコシル化のための標的として機能するアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異置換によって達成され得る。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用により達成され得る。
［０１６８］ 他の修飾としては、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
（ｉｉ）キメラポリペプチド
［０１６９］ 本明細書に記載されているポリペプチドは、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したポリペプチドを含むキメラ分子を形成するように修飾されてもよい。いくつかの実施態様において、キメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープをもたらすタグポリペプチドとポリペプチドの融合体を含む。エピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に配置される。ポリペプチドのこのようなエピトープタグ付き形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。また、エピトープタグの提供により、抗タグ抗体を用いるか又はエピトープタグに結合する別の種類のアフィニティーマトリックスを用いるアフィニティー精製によって、ポリペプチドを容易に精製することができる。
［０１７０］ 代替的な実施態様において、キメラ分子は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域とポリペプチドの融合体を含んでもよい。二価の形態のキメラ分子は、「イムノアドヘシン」と称される。
［０１７１］ 本明細書において使用される場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種ポリペプチドの結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせた抗体様の分子を指している。構造的に、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位以外の、所望の結合特異性を有するアミノ酸配列（すなわち「異種」である）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的には、少なくとも受容体又はリガンドの結合部位を含む近接するアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得ることができる。
［０１７２］ Ｉｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、ポリペプチドの可溶性（膜貫通ドメインが欠失又は不活性化されている）形態の置換を含む。特に好ましい実施態様において、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。
（ｉｉｉ）ポリペプチドコンジュゲート
［０１７３］ ポリペプチド製剤における使用のためのポリペプチドは、化学療法剤などの細胞傷害剤；成長阻害剤；毒素（例：細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素活性毒素又はこれらの断片）；又は放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート（radioconjugate））にコンジュゲートしていてもよい。
［０１７４］ このようなコンジュゲートの生成に有用な化学療法剤が使用され得る。加えて、使用され得る酵素的に活性な毒素及びそれらの断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン、及びトリコテセンが含まれる。種々の放射性核種が、放射性コンジュゲートポリペプチドの製造のために利用され得る。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが挙げられる。ポリペプチドと細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（２，６－ジイソシアン酸トリレンなど）、及びビス活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）を使用して作られる。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載のようにして調製することができる。炭素－１４－標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドのポリペプチドへのコンジュゲートのためのキレート剤の例である。
［０１７５］ ポリペプチドと１種以上の低分子毒素、例えば、カリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコテセン及びＣＣ１０６５、並びに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体とのコンジュゲートもまた、本明細書において企図される。
［０１７６］ メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することにより作用する有糸***阻害剤である。メイタンシンは、東アフリカの低木マイテヌス・セルラタから最初に単離された。その後、特定の微生物がメイタンシノール及びＣ－３メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドも生成することが発見された。合成のメイタンシノール、並びにその誘導体及びアナログも企図される。ポリペプチド－メイタンシノイドコンジュゲートを作製するための、当技術分野において既知の多くの連結基（例えば米国特許第５，２０８，０２０号に開示されているものを含む）がある。連結基には、上で特定した特許において開示されているジスルフィド基、チオエーテル基、酸解離性基、光解離性基、ペプチダーゼ解離性基又はエステラーゼ解離性基が含まれ、ジスルフィド基及びチオエーテル基が好ましい。
［０１７７］ リンカーは、連結の種類に応じて、多様な位置でメイタンシノイド分子に結合させることができる。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技術を使用したヒドロキシル基との反応によって形成することができる。この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ－３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ－１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ－１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ－２０位で起こり得る。好ましい実施態様では、結合は、メイタンシノール又はメイタンシノールアナログのＣ－３位において形成される。
［０１７８］ 目的の別のコンジュゲートは、１つ又は複数のカリケアマイシン分子にコンジュゲートされたポリペプチドを含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡ破壊を生じさせる能力がある。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、例えば米国特許第５，７１２，３７４号を参照されたい。使用され得るカリケアマイシンの構造的ｉアナログとしては、限定されないが、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ－アセチル－γ１ Ｉ、ＰＳＡＧ、及びθ１ Ｉが挙げられる。抗体をコンジュゲートすることができる別の抗腫瘍薬は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシンアマイシン及びＱＦＡはいずれも、細胞内作用部位を有しており、原形質膜を容易に通過しない。したがって、細胞がポリペプチド（例：抗体）媒介性の内部移行を通じてこれらの薬剤を取り込むと、その細胞傷害効果は大きく強化される。
［０１７９］ 本明細書に記載されているポリペプチドにコンジュゲートすることができる他の抗腫瘍剤としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、及び５－フルオロウラシル、まとめてＬＬ－Ｅ３３２８８複合体として知られている薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシンが挙げられる。
［０１８０］ いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、ポリペプチドと、核酸分解活性を有する化合物（例：リボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間のコンジュゲートであってもよい。
［０１８１］ また別の実施態様において、ポリペプチド（例：抗体）は、腫瘍の事前標的化に利用するための「受容体」（ストレプトアビジンなど）にコンジュゲートしていてもよく、ポリペプチド受容体コンジュゲートが患者に投与され、続いて、クリアリング剤（clearing agent）を使用して、結合されていないコンジュゲートを循環から除去し、次いで、細胞傷害性剤（例：放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされている「リガンド」（例：アビジン）が投与される。
［０１８２］ いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、プロドラッグ（例：ペプチジル化学療法剤）を活性のある抗がん薬物に変換させるプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートされていてもよい。免疫コンジュゲートの酵素成分には、プロドラッグをより活性な細胞傷害性形態に変換させるような方法でプロドラッグに作用する能力がある任意の酵素が含まれる。
［０１８３］ 有用である酵素としては、限定されないが、ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離薬剤物変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性の５－フルオロシトシンを抗がん薬物の５－フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なプロテアーゼ（セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、及びカテプシン（例えばカテプシンＢ及びＬ）など）；Ｄ－アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ－アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な炭水化物切断酵素（β－ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼなど）；β－ラクタムで誘導体化されている薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ－ラクタマーゼ；並びに、アミン窒素の位置にてそれぞれフェノキシアセチル基又はフェニルアセチル基で誘導体化されている薬剤物を遊離物に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ（ペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼなど）が挙げられる。或いは、酵素活性を有する抗体は、当技術分野においては「アブザイム」としても知られているが、これを使用してプロドラッグを遊離活性薬物に変換することができる。
（ｉｖ）その他
［０１８４］ ポリペプチドの別のタイプの共有結合修飾は、ポリペプチドを様々な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーのうちの１つと連結させることを含む。ポリペプチドは、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタシレート）マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入されてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｅｄ．，（１９９０）に開示されている。
製剤及び方法において使用するためのポリペプチドの取得
［０１８５］ 本明細書に記載されている分析方法において使用されるポリペプチドは、組換え法を含め、当技術分野においてよく知られている方法を使用して取得することができる。次のセクションでは、これらの方法に関するガイダンスを提供する。
［０１８６］ （Ａ）ポリヌクレオチド
［０１８７］ 本明細書で互換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
［０１８８］ ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドｍＲＮＡを有し、それを検出可能なレベルで発現させると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーを含むがこれに限定されない、任意の供給源から得ることができる。したがって、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に取得できる。ポリペプチドをコードする遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は既知の合成手順（例：自動化された核酸合成）により取得されてもよい。
［０１８９］ 例えば、ポリヌクレオチドは、軽鎖又は重鎖などの免疫グロブリン分子鎖全体をコードし得る。完全な重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）だけでなく、典型的には３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と「ヒンジ」領域から構成される重鎖定常領域（ＣＨ）も含む。状況によっては、定常領域が存在することが望ましい。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドは、ＴＤＢの１つ又は複数の免疫グロブリン分子鎖をコードする。
［０１９０］ ポリヌクレオチドによりコードされ得るその他のポリペプチドとしては、抗原結合抗体断片、例えば単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、並びに「ミニボディ」が挙げられる。ミニボディは、ＣＨ１及びＣＫ又はＣＬドメインが切り出された（典型的には）二価の抗体断片である。ミニボディは従来の抗体より小さいため、臨床／診断用途においてより良好な組織穿通を達成するはずであるが、二価であることから、ｄＡｂなどの一価抗体断片よりも高い結合親和性を保持するはずである。したがって、文脈上でそうでないことが示されない限り、本明細書において使用される「抗体」という用語は、全抗体分子だけでなく、上述の種類の抗原結合抗体断片を包含する。好ましくは、コードされているポリペプチド中に存在する各フレームワーク領域は、対応するヒトアクセプターフレームワークに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。したがって、例えば、フレームワーク領域は、アクセプターフレームワーク領域に対して合計で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸置換基を含み得る。
例示的な実施態様
［０１９１］ １． 標的抗原に結合し且つＦｃ受容体結合ドメインを含むポリペプチドの活性を決定する方法であって、
ａ）固定化された標的抗原をポリペプチド調製物と接触させて、抗原－ポリペプチド複合体を形成すること、
ｂ）抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させることであって、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含む、接触させること
を含み；
レポーターの発現がポリペプチドの活性を示す、ポリペプチドの活性を決定する方法。
［０１９２］ ２． ポリペプチドが標的抗原と結合するポリペプチド調製物の力価を定量化する方法であって、
ａ）固定化された標的抗原の複数の集団を異なる濃度のポリペプチド調製物と接触させて、抗原－ポリペプチド複合体を形成すること、
ｂ）これらの抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させることであって、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含む、接触させること、
ｃ）レポーターの発現を測定すること、及び
ｄ）ポリペプチド調製物のＥＣ５０を決定し、ポリペプチド調製物のＥＣ５０と、力価が既知のポリペプチドの標準試料のＥＣ５０とを比較することを含む、
ポリペプチド調製物の力価を定量化する方法。
［０１９３］ ３． 標準試料に対するマルチパラメーター・ロジスティックフィットを使用して、ポリペプチド調製物のＥＣ５０に基づく力価を計算することを更に含む、実施態様２に記載の方法。
［０１９４］ ４． マルチパラメーター・ロジスティックフィットが３パラメーター、４パラメーター又は５パラメーター・ロジスティックフィットである、実施態様３に記載の方法。
［０１９５］ ５． 標準試料のＥＣ５０が、ポリペプチド調製物のＥＣ５０と同時に決定される、実施態様２から４のいずれか１つに記載の方法。
［０１９６］ ６． レポーターがルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質である、実施態様１から５のいずれか１つに記載の方法。
［０１９７］ ７． ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ又はナノルシフェラーゼである、実施態様６に記載の方法。
［０１９８］ ８． Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列が、ＮＦκＢ応答配列、ＮＦＡＴ応答配列、ＡＰ－１応答配列又はＥＲＫ応答性転写因子（例：Ｅｌｋ１）である、実施態様１から７のいずれか１つに記載の方法。
［０１９９］ ９． 食細胞が単球である、実施態様１から８のいずれか１つに記載の方法。
［０２００］ １０． 食細胞が細胞株からのものである、実施態様１から９のいずれか１つに記載の方法。
［０２０１］ １１． 細胞株がＴＨＰ－１細胞株又はＵ－９３７細胞株である、実施態様１０に記載の方法。
［０２０２］ １２． Ｆｃγ受容体がＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）又はＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）又はＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である、実施態様１から１１のいずれか１つに記載の方法。
［０２０３］ １３． 食細胞がＦｃγ受容体を過剰発現させるように操作される、実施態様１から１２のいずれか１つに記載の方法。
［０２０４］ １４． 食細胞がＦｃγＲＩＩａを過剰発現させるように操作される、実施態様１３に記載の方法。
［０２０５］ １５． 食細胞がＦｃγＲＩＩＩを発現させない、実施態様１から１４のいずれか１つに記載の方法。
［０２０６］ １６． 標的抗原がベータアミロイド（Ａβ）又はＣＤ２０である、実施態様１から１５のいずれか１つに記載の方法。
［０２０７］ １７． 標的抗原がベータアミロイド（Ａβ）である、実施態様１６に記載の方法。
［０２０８］ １８． ＡβがヒトＡβである、実施態様１７に記載の方法。
［０２０９］ １９． Ａβがモノマー及び／又はオリゴマーのＡβを含む、実施態様１７又は１８に記載の方法。
［０２１０］ ２０． ヒトＡβがＡβ１－４０又はＡβ１－４２である、実施態様１７に記載の方法。
［０２１１］ ２１． ポリペプチドが全長Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインのＦｃＲ結合断片を含む、実施態様１から２０のいずれか１つに記載の方法。
［０２１２］ ２２． ポリペプチドがＡβに特異的に結合する、実施態様１から２１のいずれか１つに記載の方法。
［０２１３］ ２３． ポリペプチドが抗体又はイムノアドヘシンである、実施態様１から２２のいずれか１つに記載の方法。
［０２１４］ ２４． ポリペプチドがクレネズマブである、実施態様２２又は２３に記載の方法。
［０２１５］ ２５． 標的抗原が表面に固定化される、実施態様１から２４のいずれか１つに記載の方法。
［０２１６］ ２６． 表面がプレートである、実施態様２５に記載の方法。
［０２１７］ ２７． プレートがマルチウェルプレートである、実施態様２６に記載の方法。
［０２１８］ ２８． 抗原が、Ｎ末端若しくはその近傍で、Ｃ末端若しくはその近傍で、又はＮ末端若しくはその近傍とＣ末端若しくはその近傍で表面に固定化される、実施態様２５から２７のいずれか１つに記載の方法。
［０２１９］ ２９． 標的抗原がビオチン－ストレプトアビジンシステムを用いて表面に固定化される、実施態様２５から２８のいずれか１つに記載の方法。
［０２２０］ ３０． 標的抗原がビオチンに結合しており、表面は結合されたストレプトアビジンを含む、実施態様２９に記載の方法。
［０２２１］ ３１． 標的抗原が、Ｎ末端若しくはその近傍で、Ｃ末端若しくはその近傍で、又はＮ末端若しくはその近傍とＣ末端若しくはその近傍でビオチンと結合している、実施態様２９又は３０に記載の方法。
［０２２２］ ３２． レポーターが、抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させてから、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、２０、２４時間又は２４時間を超える時間のうちのいずれか１つ又は複数の時間が経過した後に検出される、実施態様１から３１のいずれか１つに記載の方法。
［０２２３］ ３３． ポリペプチドが標的抗原と結合し且つＦｃ受容体結合ドメインを含むポリペプチド調製物の力価を決定するための、固定化された標的抗原と食細胞とを含むキットであって、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含み、
レポーターの発現がポリペプチドの力価を示す、
キット。
［０２２４］ ３４． ポリペプチドが標的抗原と結合し且つＦｃ受容体結合ドメインを含むポリペプチド調製物の力価を定量化するための、固定化された標的抗原と、食細胞と、標準試料とを含むキットであって；
食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含み、レポーターの発現がポリペプチドの力価を示し；且つ、
標準試料は、力価が既知のポリペプチドの調製物を含む、
キット。
［０２２５］ ３５． レポーターがルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質である、実施態様３３又は３４に記載のキット。
［０２２６］ ３６． ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ又はナノルシフェラーゼである、実施態様３５に記載のキット。
［０２２７］ ３７． レポーターの発現を検出する試薬を更に含む、実施態様３３から３６のいずれか１つに記載のキット。
［０２２８］ ３８． Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列が、ＮＦκＢ応答配列、ＮＦＡＴ応答配列、ＡＰ－１応答配列又はＥＲＫ応答性転写因子（例：Ｅｌｋ１）である、実施態様３３から３７のいずれか１つに記載のキット。
［０２２９］ ３９． 食細胞が細胞株からのものである、実施態様３３から３８のいずれか１つに記載のキット。
［０２３０］ ４１． 細胞株がＴＨＰ－１細胞株又はＵ－９３７細胞株である、実施態様３９に記載のキット。
［０２３１］ ４１． Ｆｃγ受容体がＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）又はＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である、実施態様３３から４０のいずれか１つに記載のキット。
［０２３２］ ４２． 食細胞がＦｃγ受容体を過剰発現させるように操作される、実施態様３３から４１のいずれか１つに記載のキット。
［０２３３］ ４３． 食細胞がＦｃγＲＩＩａを過剰発現させるように操作される、実施態様４２に記載のキット。
［０２３４］ ４４． 食細胞がＦｃγＲＩＩＩを発現させない、実施態様３３から４３のいずれか１つに記載のキット。
［０２３５］ ４５． 標的抗原がベータアミロイド（Ａβ）又はＣＤ２０である、実施態様３３から４４のいずれか１つに記載のキット。
［０２３６］ ４６． 標的抗原がベータアミロイド（Ａβ）である、実施態様３３から４５のいずれか１つに記載のキット。
［０２３７］ ４７． ＡβがヒトＡβである、実施態様４６に記載のキット。
［０２３８］ ４８． Ａβがモノマー及び／又はオリゴマーのＡβを含む、実施態様４６又は４７に記載のキット。
［０２３９］ ４９． ヒトＡβがＡβ１－４０又はＡβ１－４２である、実施態様４８に記載のキット。
［０２４０］ ５０． ポリペプチドが全長Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインのＦｃＲ結合断片を含む、実施態様３３から４９のいずれか１つに記載のキット。
［０２４１］ ５１． ポリペプチドがＡβに特異的に結合する、実施態様３３から５０のいずれか１つに記載のキット。
［０２４２］ ５２． ポリペプチドが抗体又はイムノアドヘシンである、実施態様３３から５１のいずれか１つに記載のキット。
［０２４３］ ５３． ポリペプチドがクレネズマブである、実施態様５２に記載のキット。
［０２４４］ ５４． 標的抗原が表面に固定化される、実施態様３３から５３のいずれか１つに記載のキット。
［０２４５］ ５５． 表面がプレートである、実施態様５４に記載のキット。
［０２４６］ ５６． プレートがマルチウェルプレートである、実施態様５５に記載のキット。
［０２４７］ ５７． 標的抗原が、Ｎ末端若しくはその近傍で、Ｃ末端若しくはその近傍で、又はＮ末端若しくはその近傍とＣ末端若しくはその近傍でビオチンと結合している、実施態様５５又は５６に記載のキット。
［０２４８］ ５８． 標的抗原がビオチン－ストレプトアビジンシステムを用いて表面に固定化される、実施態様５４からの５７いずれか１つに記載のキット。
［０２４９］ ５９． 標的抗原がビオチンに結合しており、表面は結合されたストレプトアビジンを含む、実施態様５８に記載のキット。
［０２５０］ 本明細書に開示されるすべての特徴は、任意の組み合せで組み合わされてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同一、同等又は類似の目的を果たす代替的な特徴により置き換えられてもよい。したがって、特に断らない限り、開示されている各特徴は、包括的な一連の同等又は類似の特徴の一例に過ぎない。
［０２５１］ 本発明の更なる詳細は、以下の非限定的な実施例により説明される。本明細書中のすべての引用文献の開示は、参照により本明細書に明示的に援用される。
［０２５２］ 以下の実施例は、単に本発明の例示であることが意図されており、したがって、決して本発明を限定するものと考えられるべきではない。以下の実施例及び詳細な記述は、説明のために提供されるものであり、限定のために提供されるものではない。
実施例１
材料及び方法
食作用レポーター細胞生成
［０２５３］ ヒトＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２Ａ）ｃＤＮＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｉｄ＝ＮＰ＿０６７６７４．２；ｃｏｄｅｄ ｂｙ＝ＮＭ＿０２１６４２．３；ＨＩＳ ｖａｒｉａｎｔ）を最初に化学合成した（ＧｅｎｅＡｒｔＴＭ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）。制限部位（ＥｃｏＲＩ、５’末端；ＮｏｔＩ、３’末端）をｃＤＮＡテンプレートに付加し、すぐにＡＴＧ開始コドンの５’にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を付加した。ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩを使用して、ｃＤＮＡをレンチウイルスベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏにサブクローニングした（図１）。得られたコンストラクト、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＣＤ３２Ａ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏの配列を決定し、ｃＤＮＡインサート全体を確認した。ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）遺伝子の上流で核内因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）応答配列（ＲＥ）をレンチウイルスベクターにクローニングすることにより、レポーターコンストラクトを作製した（図２）。これらのコンストラクトを用いてレンチウイルス粒子を作製し、これを用いてＵ－９３７及びＴＨＰ－１単球細胞株を形質導入した。１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で選択することにより親プールを作製し、ＮＦ－κＢも活性化するＴＮＦαを陽性対照として発光活性を確認した、限界希釈を行ってクローンを単離し、クレネズマブ及びアミロイドβ（Ａβ）を用いてクローンの活性をスクリーニングした。細胞は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＨＩ ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び１ｘ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）で培養し、９０％ＨＩ ＦＢＳ、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＡＴＣＣ）中で凍結させた。
試薬及びバッファー
［０２５４］ 非ビオチン化Ａβペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ又はＡｎａｓｐｅｃ）及びビオチンベータアミロイド１－４２ペプチド（ビオチン－Ａβ）（Ａｎａｓｐｅｃ）を、まず４０μＬの室温のＤＭＳをペプチドのバイアル（各０．５ｍｇ）に添加することによって再構成した。バイアルの壁を２～３回洗浄した後、ｐＨ８．０に調整したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）９６０μＬを添加した。試薬が溶解するまでバイアルを約１分間ボルテックスし、その後試薬をプールして分注し、使用するまで－６０℃以下で保存した。追加のペプチドには、各末端にビオチンを有するＣＤ２０の５１アミノ酸ペプチド（ＣＤ２０－ビオチン）（ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれていた。このペプチドをＤＭＳＯ中で同様に再構成し、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬのストック濃度にした。
［０２５５］ ＴＢＳ結合バッファーは、トリス緩衝食塩水（１０ｍＭ トリス ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で構成されている。洗浄バッファーは、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳで構成されている。試験培地は、１０％ＨＩ－ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び１ｘ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）である。開発初期及びオクレリズマブバージョンの試験では、ＨＩ－ＦＢＳの代わりにＬｏｗ－ＩｇＧ ＨＩ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ ＩｇＧ又はＧｉｂｃｏ）を使用した。ルシフェラーゼ発現の定量化には、発光試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ試験システム）を利用する。ＥＬＩＳＡブロックバッファーは、１ｍＭ ＣａＣｌ２と１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）に０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えたものであった。ＥＬＩＳＡ試験希釈剤は、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０であった。
［０２５６］ クレネズマブの標準試料及び試料は、ジェネンテックによって製造された。製剤バッファーは、２００ｍＭ アルギニンスクシネート（０．０５％（ｗ／ｖ））、ポリソルベート２０（ｐＨ５．５±０．３）である。光ストレス試料を作製するために、２５ｍＬのクレネズマブをガラスバイアルに入れ、キャリブレーション付きライトボックスにセットして、１６時間にわたって２４０万ルクス時間の累積露光を行った。調光（light control）は、露光に対してアルミ箔で包んで行った。
フローサイトメトリー
［０２５７］ 細胞をＰＢＳ又はＦＡＣＳ Ｗａｓｈ（０．５％ウシ血清アルブミン、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄し、ＦＡＣＳ Ｗａｓｈに再懸濁させた。Ｕ－９３７の実験では、まず細胞を生体色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、Ｆｃブロッキング抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、抗ＣＤ１６：１６－０１６６－８５、抗ＣＤ３２：１６－０３２９－８５、抗ＣＤ６４：１４－０６４９－８２）で１０～１５分プレインキュベートした。その後、以下の抗ＦｃγＲ抗体又はアイソタイプ対照で細胞を３０～６０分染色した：ＣＤ１６－フィコエリトリン（ＰＥ）（ｅＢｉｏ、１２－０１６７－４２）、ＣＤ３２－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５０５８６）、ＣＤ６４－ＰＥ（ｅＢｉｏ、１２－０６４９）、ＣＤ６４－ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏ、１１－０６４９－４２）、ＦＩＴＣ－マウスＩｇＧ１κ（ｅＢｉｏ、１１－４７１４－４２）、ＰＥ－マウスＩｇＧ１κ（ｅＢｉｏ、１２－４７１４－４２）、ＰＥ－マウスＩｇＧ２ｂκ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５７４３）。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ Ｗａｓｈに再懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ、ＬＳＲ ＩＩ又はＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ）で蛍光を検出した。
Ａβペプチドとプレートフォーマットの評価
［０２５８］ ５μｇ／ｍＬｍの可溶性非ビオチン化Ａβ（２５μＬ）を、組織培養処理を施した白色試験プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に入れた試験培地で、１対３希釈系列のクレネズマブ（２５μＬ、開始濃度６００，０００ｎｇ／ｍＬ）及びＴＨＰ－１食作用レポーター細胞（５０μＬ、５００，０００細胞／ｍＬ）と共に３７℃で５時間インキュベートした。発光試薬Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）（１００μＬ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、２０分間振とうした後、発光プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ、ＥｎＶｉｓｉｏｎ）を用いて発光を検出した。或いは、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの非ビオチン化Ａβ１００μＬを高結合白色プレート（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に４℃で一晩吸着させた。プレートをＰＢＳで洗浄し、２００μＬの試験培地で３０分間ブロックし、再度洗浄した。その後、プレートを、試験培地中１対３希釈系列のクレネズマブ（開始濃度５０，０００ｎｇ／ｍＬ）１００μＬと共に、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、２００，０００細胞／ｍＬのＴＨＰ－１食作用レポーター細胞１００μＬを３７℃で５時間インキュベートした。発光試薬Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）（１００μＬ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、２０分間振とうした後、発光プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ、ＥｎＶｉｓｉｏｎ）を用いて発光を検出した。本手順のこのバリエーションは、ビオチン－Ａβとストレプトアビジンの高結合能９６ウェル白色プレートを最初に評価するためにも使用された（図４）。
クレネズマブＡβ結合ＥＬＩＳＡ
［０２５９］ 組換えヒトアミロイドβ１－４２ペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）をＤＭＳＯで再構成し、使い捨てアリコートで凍結させた。試験のために、ペプチドをＤＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、１００ｖＬを高結合ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ）に加えた。プレートを２～８℃で１６～７２時間インキュベートした後、ダンプし、２００μＬのＥＬＩＳＡブロックバッファーで２５℃で１～２時間ブロックした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％ポリソルベート２０で洗浄し、ＥＬＩＳＡ試験希釈剤で希釈した１００μＬのクレネズマブ標準試料及び試料希釈液を加えた。プレートを２５℃で１時間インキュベートした後、再度洗浄した。２ｎｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）溶液（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）をプレートに加え、２５℃で４０分培養した後、洗浄した。比色ＴＭＢ検出試薬（ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＫＰＬ）を添加し、プレートを振とうしながら１０～３０分にわたって展開した後、０．６Ｎ硫酸を添加した。吸光度は、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎで検出し、６５０ｎｍの吸光度を標準吸光度として使用した。クレネズマブ標準試料と比較した力価は、平行線分析曲線あてはめプログラム（parallel line analysis curve-fitting program）を使用して計算した。
クレネズマブ食作用レポーター法
［０２６０］ ビオチン－ＡβをＴＢＳ結合バッファーで１．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、ストレプトアビジンコート高結合能９６ウェル白色プレート（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に２５℃で１６～７２時間結合させた。プレートウォッシャー（Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて洗浄バッファーで３回プレートを洗浄し、通気性のあるプレートシーラー（Ａｅｒａｓｅａｌ、Ｓｉｇｍａ）又は蓋で覆われた５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で１～２．５時間、温かい試験培地を３７℃で平衡化した。ＵＶ ＳｐｅｃＳｃａｎによるタンパク質の定量を行うために、標準試料及び試料を、製剤バッファーで希釈した。１０，０００、４０００、１６００、７５０、２５０、１００、４０、１０ｎｇ／ｍＬの濃度を目標に、温かい試験培地中の標準試料、試験対照（標準試料を独立して希釈）及び試料の８点希釈曲線を作製した。食作用レポーター細胞を、遠心分離によりフラスコから回収し、温かい試験培地に再懸濁させた後、カウントし、２．５×１０６細胞／ｍＬに希釈した。プレートを再度洗浄し、試料希釈液と細胞調製物を５０μＬずつ加えた。プレートを、通気性のあるプレートシーラー又は蓋で覆われた５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で、３７℃で３～５時間インキュベートした。その後、試験プレートを２５℃のインキュベーター内で１５～２０分間冷却し、続いて１００μＬの発光試薬を添加した。プレートを卓上シェーカーを使用して室温で振とうした後、発光シグナルを発光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｐａｒａｄｉｇｍ又はＬＵＭ９６カートリッジを備えたｉ３ｘ）で検出する。力価を、クレネズマブ標準試料に対する４Ｐ拘束適合（constrained fit）を用いて、ＥＣ５０比に基づいて算出した。プレート読み取りと力価の計算は、ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ ｖ６．５）を用いて行った。
オクレリズマブ食作用レポーター法
［０２６１］ オクレリズマブ試験方法は、以下の変更を加えたクレネズマブ試験方法と同様であった。ＣＤ２０－ビオチンペプチドを、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）で８μｇ／ｍＬに希釈し、２～８℃で１６～７２時間プレートに結合させた。洗浄バッファーは、ＰＢＳ＋０．０５％ポリソルベート２０であった。ペプチド結合後、プレートを６回洗浄し、試験培地を平衡化し、洗浄し、オクレリズマブの希釈液１００μＬと共に３７℃で１．５時間インキュベートした。オクレリズマブの濃度は、１００，０００、３０，０００、１５，０００、８０００、４０００、２０００、１０００、及び１００ｎｇ／ｍＬであった。その後、プレートを洗浄し、１．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で１００μＬのＵ－９３７食作用レポーター細胞を添加した。プレートを３７℃で２時間４０分間インキュベートした。試験培地にはＬｏｗ ＩｇＧ ＨＩ ＦＢＳを使用した。
結果
食作用レポーター細胞
［０２６２］ 食作用レポーター試験は、可溶性Ａβオリゴマーに結合し、ミクログリアによる免疫複合体の取り込みを促進するクレネズマブを対象に最初に開発された（Adolfsson et al.）。このメカニズムは、食細胞が関与し、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）が介在するという点で、抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）と類似している。ＡＤＣＰの生物学的特性を最もよく反映させるために、食作用ヒト単球細胞株であるＴＨＰ－１とＵ－９３７を親細胞株として選択し、食作用レポーター細胞株を作製した。ＴＨＰ－１及びＵ－９３７細胞株は、「材料及び方法」に記載したように、ＮＦ－κＢ応答配列の制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現させるように操作された。ＮＦ－κＢは、数ある免疫受容体の中でもＦｃγＲを介したシグナル伝達によって誘導される転写制御因子である。クレネズマブによるＡβのミクログリアクリアランスに関与する特定のＦｃγ受容体は不明だが、ＩｇＧ４であるクレネズマブは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）に最も高い親和性で結合する。ＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲＩＩａとしても知られる）は、モノマーのＩｇＧよりも免疫複合体を好むことから、ＡＤＣＰに関連すると考えられており、また、この受容体は、Ｆｃのガラクトシル化にも感受性があり、潜在的な抗体治療薬である。そのため、細胞は、潜在的な製品バリアントに対する感度を最大化するように、追加のＣＤ３２Ａコンストラクトで操作された。Ｕ－９３７及びＴＨＰ－１細胞は、ＣＤ６４も発現するが、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）はほとんど発現しない（図３）。Ｕ－９３７及びＴＨＰ－１レポーター細胞はいずれも食作用の作用機序を代表しており、細胞株の選択を含め、各特異的抗体及び標的に対する力価試験が最適化された。ＴＨＰ－１細胞は、この抗体／標的の試験精度と一貫性が優れているため、最終的にクレネズマブ力価試験に選択された。
Ａβペプチドとプレートフォーマットの評価
［０２６３］ Ａβペプチドオリゴマーを試験に導入するために、３つのアプローチが評価された（図４）。最初のものは、水溶液中でオリゴマー形成する可溶性Ａβペプチド調製物をクレネズマブ及びレポーター細胞と混合して利用したものだった。このアプローチでは、おそらくＡβオリゴマー複合体の不完全又は非効率的形成のために、発光シグナルが生じなかった。Ａβ複合体を模倣し、且つ／又は複合体の形成の種とするために、Ａβペプチドでコーティングされたプレート上にクレネズマブ及びレポーター細胞を層状に重ねたプレート結合フォーマットが調査された。高結合プレートに吸着したＡβペプチドは、レポーター細胞内で陽性であるが一貫性のないシグナルを示した。シグナル及びプレート表面へのＡβ結合の一貫性を改善するために、ビオチン化Ａβをストレプトアビジンコートプレートに結合させたストレプトアビジン（ＳＡ）－ビオチンシステムを利用した。
試験フォーマット及びクレネズマブ検量線
［０２６４］ 食作用レポーター細胞試験のフォーマットには、ストレプトアビジンコートプレートへのビオチン化ペプチドの結合が含まれる（図５）。ペプチド特異的抗体はペプチド標的に結合し、ＦｃγＲのクラスター化と活性化を誘発する。これにより、ＮＦ－κＢが活性化され、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼが発現し、基質を添加すると発光を定量化することができる。クレネズマブ標準試料の代表的な用量反応曲線を図６に示す。
クレネズマブ力価決定の例：劣化試料
［０２６５］ 本試験は、クレネズマブ試料の力価を決定するために使用された。食作用レポーター細胞試験が製品の劣化による力価の変化を検出できることを実証するために、光ストレス研究から得たクレネズマブのストレス試料の活性を試験した。これらの試料は、ＥＬＩＳＡで測定して、Ａβ結合活性の喪失を示し、食作用レポーター細胞試験を使用しても同様の喪失が観察された（表２）ことから、レポーター細胞試験はＡβ結合化活性の喪失による力価の喪失を検出できることを示している。
Figure 2022528804000007
結果は、クレネズマブ標準試料を１００％として割り当てた相対力価％であり、独立した３つの試験の平均値である。
試験フォーマットの他製品／標的への適用
［０２６６］ 食作用レポーター試験を他の抗体製品に適用できるかどうかを決定するために、フォーマットを他のペプチド標的／抗体の組み合わせに適合させた。オクレリズマブは、作用機序として提案されているＡＤＣＰを有するＣＤ２０結合抗体である。そこで、ビオチン化ＣＤ２０ペプチドをストレプトアビジンプレートに結合させ、このペプチドにオクレリズマブを結合させて、ＣＤ２０発現細胞の表面へのオクレリズマブの結合を模倣した。Ｕ－９３７食作用レポーター細胞を使用して、発光シグナルを観察し、用量反応曲線を作製した。これにより、オクレリズマブに対するＡＤＣＰの力価を評価することができる（図７）。
概要
［０２６７］ レポーター細胞株とプレート結合ペプチドを用いてクレネズマブの力価を測定する試験を開発した（図５）。この試験は、ＦｃγＲを介した免疫複合体の取り込み／ＡＤＣＰの代用として機能する。食作用単球細胞株を利用して、クレネズマブとＡβペプチドとの免疫複合体によるＦｃγＲの関与と活性化を測定するという点で、これは作用機序を反映している。この試験は、クレネズマブのストレス試料を使用して力価の喪失に感受性であることが実証された。更に、この試験フォーマットは、オクレリズマブ（ＣＤ２０結合）で実証されたように、他の標的及び製品にも適用することができる。
実施例２
［０２６８］ 食作用レポーター細胞の開発と試験フォーマットは前述のとおりである。ここでは、クレネズマブ試験の試験条件の最適化に関する追加データを記載する。
細胞株最適化
［０２６９］ ＴＨＰ－１及びＵ－９３７細胞株は、潜在的な製品バリアントに対する感受性を最大化するために、核内因子－（ＮＦ－κＢ）応答配列の制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現させて、ＣＤ３２を過剰発現させるように操作された。
［０２７０］ 操作されたＵ－９３７細胞株は、当初、より高い応答倍率及びより速い増殖に基づいて、クレネズマブ試験のために選択された。しかし、クレネズマブ試験性能の更なる比較の後、ＴＨＰ－１食作用レポーター細胞が選択された。ＴＨＰ－１食作用レポーター細胞の増殖に対する細胞播種密度の影響を評価する実験を行い、試験での細胞増殖と収率を向上させた。ＴＨＰ－１細胞は、より低い細胞播種密度で成長がより遅かったため（図８）、比較的高い播種濃度が細胞培養手順に取り入れられた。
試薬の選択と最適化
［０２７１］ ＮＦ－κＢは、いくつかの免疫受容体の下流で活性化されるため、組換えＡβペプチド調製物中の細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）などの混入物によるレポーター細胞のオフターゲット活性化が潜在的懸念であった。そこで、組換え源と合成源のＡβペプチドを、クレネズマブの非存在下でレポーター細胞を活性化するそれらの能力について比較した（図９）。合成Ａβペプチドが、レポーター細胞のエンドトキシン媒介性活性化の可能性を最小限に抑えるために選択された。
実験計画法 試験パラメーターの最適化
［０２７２］ 試験を更に最適化し、試験の読み出しに対する試験因子の影響を評価するために、Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ設計を使用した。評価した試験因子には、試験細胞濃度、Ａβペプチド濃度、インキュベーション時間、細胞増殖濃度（フラスコ内の播種密度）、ＳｔｅａｄｙＧｌｏ（登録商標）インキュベーション時間、及びＦＢＳの種類（ＨＩ又はｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳ）が含まれる（表３）。更に、Ａβペプチド調製物の２つのバッチと複数の分析者を設計に組み込んだ。試験因子は、ＥＣ５０、勾配、応答倍率、力価の平均値、及び力価標準偏差（ＳＤ）への影響について主効果分析で評価された（図１０～１３）。
Figure 2022528804000008

Claims (59)

  1. 標的抗原に結合し且つＦｃ受容体結合ドメインを含むポリペプチドの活性を決定する方法であって、
    ａ）固定化された標的抗原をポリペプチド調製物と接触させて、抗原－ポリペプチド複合体を形成すること、
    ｂ）抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させることであって、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含む、接触させること
    を含み；
    レポーターの発現がポリペプチドの活性を示す、
    ポリペプチドの活性を決定する方法。
  2. ポリペプチドが標的抗原と結合するポリペプチド調製物の力価を定量化する方法であって、
    ａ）固定化された標的抗原の複数の集団を異なる濃度のポリペプチド調製物と接触させて、抗原－ポリペプチド複合体を形成すること、
    ｂ）これらの抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させることであって、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含む、接触させること、
    ｃ）レポーターの発現を測定すること、及び
    ｄ）ポリペプチド調製物のＥＣ５０を決定し、ポリペプチド調製物のＥＣ５０と、力価が既知のポリペプチドの標準試料のＥＣ５０とを比較することを含む、
    ポリペプチド調製物の力価を定量化する方法。
  3. 標準試料に対するマルチパラメーター・ロジスティックフィットを使用して、ポリペプチド調製物のＥＣ５０に基づく力価を計算することを更に含む、請求項２に記載の方法。
  4. マルチパラメーター・ロジスティックフィットが３パラメーター、４パラメーター又は５パラメーター・ロジスティックフィットである、請求項３に記載の方法。
  5. 標準試料のＥＣ５０が、ポリペプチド調製物のＥＣ５０と同時に決定される、請求項２から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. レポーターがルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ又はナノルシフェラーゼである、請求項６に記載の方法。
  8. Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列が、ＮＦκＢ応答配列、ＮＦＡＴ応答配列、ＡＰ－１応答配列又はＥＲＫ応答性転写因子である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 食細胞が単球である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 食細胞が細胞株からのものである、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 細胞株がＴＨＰ－１細胞株又はＵ－９３７細胞株である、請求項１０に記載の方法。
  12. Ｆｃγ受容体がＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）又はＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）又はＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 食細胞がＦｃγ受容体を過剰発現させるように操作される、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 食細胞がＦｃγＲＩＩａを過剰発現させるように操作される、請求項１３に記載の方法。
  15. 食細胞がＦｃγＲＩＩＩを発現させない、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 標的抗原がベータアミロイド（Ａβ）又はＣＤ２０である、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 標的抗原がベータアミロイド（Ａβ）である、請求項１６に記載の方法。
  18. ＡβがヒトＡβである、請求項１７に記載の方法。
  19. Ａβがモノマー及び／又はオリゴマーのＡβを含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. ヒトＡβがＡβ１－４０又はＡβ１－４２である、請求項１７に記載の方法。
  21. ポリペプチドが全長Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインのＦｃＲ結合断片を含む、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. ポリペプチドがＡβに特異的に結合する、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. ポリペプチドが抗体又はイムノアドヘシンである、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. ポリペプチドがクレネズマブである、請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. 標的抗原が表面に固定化される、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 表面がプレートである、請求項２５に記載の方法。
  27. プレートがマルチウェルプレートである、請求項２６に記載の方法。
  28. 抗原が、Ｎ末端若しくはその近傍で、Ｃ末端若しくはその近傍で、又はＮ末端若しくはその近傍とＣ末端若しくはその近傍で表面に固定化される、請求項２５から２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 標的抗原がビオチン－ストレプトアビジンシステムを用いて表面に固定化される、請求項２５から２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 標的抗原がビオチンに結合しており、表面は結合されたストレプトアビジンを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 標的抗原が、Ｎ末端若しくはその近傍で、Ｃ末端若しくはその近傍で、又はＮ末端若しくはその近傍とＣ末端若しくはその近傍でビオチンと結合している、請求項２９又は３０に記載の方法。
  32. レポーターが、抗原－ポリペプチド複合体を食細胞と接触させてから、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、２０、２４時間又は２４時間を超える時間のうちのいずれか１つ又は複数の時間が経過した後に検出される、請求項１から３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. ポリペプチドが標的抗原と結合し且つＦｃ受容体結合ドメインを含むポリペプチド調製物の力価を決定するための、固定化された標的抗原と食細胞とを含むキットであって、食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含み、
    レポーターの発現が、ポリペプチドの力価を示す、
    キット。
  34. ポリペプチドが標的抗原と結合し且つＦｃ受容体結合ドメインを含むポリペプチド調製物の力価を定量化するための、固定化された標的抗原と食細胞と標準試料とを含むキットであって、
    食細胞は、Ｆｃγ受容体と、Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列に作動可能に連結されたレポーターをコードする核酸とを含み、レポーターの発現が、ポリペプチドの力価を示し、
    標準試料は、力価が既知のポリペプチドの調製物を含む、
    キット。
  35. レポーターがルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質である、請求項３３又は３４に記載のキット。
  36. ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ又はナノルシフェラーゼである、請求項３５に記載のキット。
  37. レポーターの発現を検出する試薬を更に含む、請求項３３から３６のいずれか１項に記載のキット。
  38. Ｆｃγ受容体による活性化に反応する応答配列が、ＮＦκＢ応答配列、ＮＦＡＴ応答配列、ＡＰ－１応答配列又はＥＲＫ応答性転写因子である、請求項３３から３７のいずれか１項に記載のキット。
  39. 食細胞が細胞株からのものである、請求項３３から３８のいずれか１項に記載のキット。
  40. 細胞株がＴＨＰ－１細胞株又はＵ－９３７細胞株である、請求項３９に記載のキット。
  41. Ｆｃγ受容体がＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）又はＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である、請求項３３から４０のいずれか１項に記載のキット。
  42. 食細胞がＦｃγ受容体を過剰発現させるように操作される、請求項３３から４１のいずれか１項に記載のキット。
  43. 食細胞がＦｃγＲＩＩａを過剰発現させるように操作される、請求項４２に記載のキット。
  44. 食細胞がＦｃγＲＩＩＩを発現させない、請求項３３から４３のいずれか１項に記載のキット。
  45. 標的抗原がベータアミロイド（Ａβ）又はＣＤ２０である、請求項３３から４４のいずれか１項に記載のキット。
  46. 標的抗原がベータアミロイド（Ａβ）である、請求項３３から４５のいずれか１項に記載のキット。
  47. ＡβがヒトＡβである、請求項４６に記載のキット。
  48. Ａβがモノマー及び／又はオリゴマーのＡβを含む、請求項４６又は４７に記載のキット。
  49. ヒトＡβがＡβ１－４０又はＡβ１－４２である、請求項４８に記載のキット。
  50. ポリペプチドが全長Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインのＦｃＲ結合断片を含む、請求項３３から４９のいずれか１項に記載のキット。
  51. ポリペプチドがＡβに特異的に結合する、請求項３３から５０のいずれか１項に記載のキット。
  52. ポリペプチドが抗体又はイムノアドヘシンである、請求項３３から５１のいずれか１項に記載のキット。
  53. ポリペプチドがクレネズマブである、請求項５２に記載のキット。
  54. 標的抗原が表面に固定化される、請求項３３から５３のいずれか１項に記載のキット。
  55. 表面がプレートである、請求項５４に記載のキット。
  56. プレートがマルチウェルプレートである、請求項５５に記載のキット。
  57. 標的抗原が、Ｎ末端若しくはその近傍で、Ｃ末端若しくはその近傍で、又はＮ末端若しくはその近傍とＣ末端若しくはその近傍でビオチンと結合している、請求項５５又は５６に記載のキット。
  58. 標的抗原がビオチン－ストレプトアビジンシステムを用いて表面に固定化される、請求項５４からの５７のいずれか１項に記載のキット。
  59. 標的抗原がビオチンに結合しており、表面は結合されたストレプトアビジンを含む、請求項５８に記載のキット。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023099788A1 (en) * 2021-12-03 2023-06-08 Neurimmune Ag Novel potency assay for antibody-based drugs and useful means therefor
CN117756892A (zh) * 2022-09-19 2024-03-26 康源博创生物科技(北京)有限公司 生物治疗药物的靶点结合特异性的高通量检测方法

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
CA1338518C (en) 1987-09-23 1996-08-13 Joyce M. Zarling Antibody heteroconjugates for the killing of hiv-infected cells
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
JPH06500011A (ja) 1990-06-29 1994-01-06 ラージ　スケール　バイオロジー　コーポレイション 形質転換された微生物によるメラニンの製造
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
ATE244763T1 (de) 1992-02-11 2003-07-15 Cell Genesys Inc Erzielen von homozygotem durch zielgerichtete genetische ereignisse
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
ATE149570T1 (de) 1992-08-17 1997-03-15 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5534615A (en) 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
CA2447832C (en) 2000-12-22 2012-09-25 Jamshid Tanha Phage display libraries of human vh fragments
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
PT1639011E (pt) 2003-06-30 2009-01-20 Domantis Ltd Anticorpos (dab) de domínio único peguilados
CA2577133A1 (en) 2004-08-19 2006-03-23 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2681556A2 (en) * 2011-03-04 2014-01-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Cd16a reporter assay for evaluation of adcc potential of biologics
TWI682941B (zh) * 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
PL3430397T3 (pl) * 2016-03-14 2022-04-04 Biogen International Neuroscience Gmbh Oznaczenie fagocytozy zależnej od przeciwciał do wiarygodnych pomiarów wychwytu zagregowanych białek

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